JP3139957B2 - レクチンの固定化法及びそれを用いた細胞用基材 - Google Patents
レクチンの固定化法及びそれを用いた細胞用基材Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レクチンの固定化
法、特にレクチンと糖鎖との特異的結合性を利用した固
定化法、及びこの固定化法を用いてレクチンを固定化し
た細胞用基材に関する。
法、特にレクチンと糖鎖との特異的結合性を利用した固
定化法、及びこの固定化法を用いてレクチンを固定化し
た細胞用基材に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内には、酵素反応、抗原−抗体反応
等の様々な特異的反応が存在し、精致な生体系をかたち
づくっているが、今日それらの生体反応をモデルとする
バイオミメティックなシステムの研究が種々の分野で盛
んに行われている。
等の様々な特異的反応が存在し、精致な生体系をかたち
づくっているが、今日それらの生体反応をモデルとする
バイオミメティックなシステムの研究が種々の分野で盛
んに行われている。
【０００３】中でも、近年の糖鎖工学の進歩には目ざま
しいものがあり、例えば、糖鎖を有する生体高分子とし
ては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロ
テオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響
を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与
している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分
子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あ
るいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御す
る機構が次第に明らかにされつつある。
しいものがあり、例えば、糖鎖を有する生体高分子とし
ては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロ
テオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響
を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与
している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分
子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あ
るいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御す
る機構が次第に明らかにされつつある。
【０００４】その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖
-レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、ある
いはエイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に
関する研究が活発化してきている。また、細胞-細胞間
相互作用、細胞-マトリックス間相互作用における糖鎖
の関与に関する研究も、生体反応を理解する上で重要に
なってきている。
-レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、ある
いはエイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に
関する研究が活発化してきている。また、細胞-細胞間
相互作用、細胞-マトリックス間相互作用における糖鎖
の関与に関する研究も、生体反応を理解する上で重要に
なってきている。
【０００５】本発明者らは、従来から糖鎖の特異的な親
和力に着目し鋭意研究を行ってきており、例えば、アシ
アロ糖タンパク質（ＡＳＧＰと略記）レセプターに対す
るリガンドのモデルとして、ガラクトースを側鎖に有す
るポリマーであるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β
-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミ
ド］）（通称：ポリビニルベンジルラクトンアミド、以
後ＰＶ-ＬＡと略記）を設計・合成した。
和力に着目し鋭意研究を行ってきており、例えば、アシ
アロ糖タンパク質（ＡＳＧＰと略記）レセプターに対す
るリガンドのモデルとして、ガラクトースを側鎖に有す
るポリマーであるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β
-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミ
ド］）（通称：ポリビニルベンジルラクトンアミド、以
後ＰＶ-ＬＡと略記）を設計・合成した。
【０００６】上記のＰＶ-ＬＡを被覆したシャーレを用
いることにより、ＰＶ-ＬＡと肝実質細胞表面のアシア
ロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介して肝
実質細胞が選択的に接着され、しかもその接着形態が特
徴的であって三次元の自己集合体が導かれることを見い
だした。これらの現象は、例えばコラーゲン、ファイブ
ロネクチン等の従来の接着タンパク質を被覆したシャー
レでは観察されないものである（由良洋文、赤池敏宏、
「細胞培養」、第１９巻、３１７−３２２頁、１９９３
年）。
いることにより、ＰＶ-ＬＡと肝実質細胞表面のアシア
ロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介して肝
実質細胞が選択的に接着され、しかもその接着形態が特
徴的であって三次元の自己集合体が導かれることを見い
だした。これらの現象は、例えばコラーゲン、ファイブ
ロネクチン等の従来の接着タンパク質を被覆したシャー
レでは観察されないものである（由良洋文、赤池敏宏、
「細胞培養」、第１９巻、３１７−３２２頁、１９９３
年）。
【０００７】一方、主に植物を起源とするレクチンは、
多糖類や複合糖類を沈降させる等の糖鎖に対する特異的
結合性を有することがしられており、不溶化レクチンを
用いて複合糖類を分離する試みなどが行われている。し
かしながら従来は、レクチンを固定化する際に、基材に
レクチンを単純に吸着させるか、基材に共有結合させる
等の方法が用いられていた。単に吸着させただけでは、
レクチンを安定かつ強固に固定化することは困難であ
り、共有結合させる場合は、手間のかかる化学反応を経
なければならなかった。そこで本発明者らは、上記の事
情に鑑み、糖鎖高分子を用いてレクチンを安定かつ強固
に固定化する方法を見いだし本発明をなすに至った。
多糖類や複合糖類を沈降させる等の糖鎖に対する特異的
結合性を有することがしられており、不溶化レクチンを
用いて複合糖類を分離する試みなどが行われている。し
かしながら従来は、レクチンを固定化する際に、基材に
レクチンを単純に吸着させるか、基材に共有結合させる
等の方法が用いられていた。単に吸着させただけでは、
レクチンを安定かつ強固に固定化することは困難であ
り、共有結合させる場合は、手間のかかる化学反応を経
なければならなかった。そこで本発明者らは、上記の事
情に鑑み、糖鎖高分子を用いてレクチンを安定かつ強固
に固定化する方法を見いだし本発明をなすに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】よって、本発明の課題
は、レクチンを効率よく安定に固定化または濃縮できる
新規な方法を提供し、加えてその固定化法を用いてレク
チンを固定化した細胞用基材を提供することにある。
は、レクチンを効率よく安定に固定化または濃縮できる
新規な方法を提供し、加えてその固定化法を用いてレク
チンを固定化した細胞用基材を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】かかる課題は、固定化す
べきレクチンと特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖高分
子を基材に吸着させ、その糖鎖高分子を介して該レクチ
ンを固定化することからなるレクチンの固定化法によっ
て解決できる。
べきレクチンと特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖高分
子を基材に吸着させ、その糖鎖高分子を介して該レクチ
ンを固定化することからなるレクチンの固定化法によっ
て解決できる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に、本発明のレクチン固定化
法を図面を参照して詳細に説明する。図１に示すよう
に、本発明の固定化法では、まず基材１表面に、糖鎖２
１が高分子主鎖２２に結合されてなる糖鎖高分子２を吸
着させる。ここで用いられる糖鎖高分子２は、合成高分
子主鎖２２とそれに結合された糖鎖２１とから構成され
ている。次に、糖鎖高分子２の糖鎖２１に固定化すべき
レクチン３を特異的に結合させる。
法を図面を参照して詳細に説明する。図１に示すよう
に、本発明の固定化法では、まず基材１表面に、糖鎖２
１が高分子主鎖２２に結合されてなる糖鎖高分子２を吸
着させる。ここで用いられる糖鎖高分子２は、合成高分
子主鎖２２とそれに結合された糖鎖２１とから構成され
ている。次に、糖鎖高分子２の糖鎖２１に固定化すべき
レクチン３を特異的に結合させる。
【００１１】本発明で使用される糖鎖高分子の主鎖は、
側鎖として糖鎖を導入でき、通常の方法で重合可能なも
のならば特に限られないが、例えばポリスチレン、塩化
ビニル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、
ポリプロピレン、またはそれらの誘導体等のビニル系の
高分子を用いるのが好ましい。特に、シャーレ等の材料
として広く使用されているポリスチレンまたはその誘導
体からなる合成高分子を使用した場合には、そのシャー
レ等の表面に対する吸着性が向上するので好ましい。
側鎖として糖鎖を導入でき、通常の方法で重合可能なも
のならば特に限られないが、例えばポリスチレン、塩化
ビニル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、
ポリプロピレン、またはそれらの誘導体等のビニル系の
高分子を用いるのが好ましい。特に、シャーレ等の材料
として広く使用されているポリスチレンまたはその誘導
体からなる合成高分子を使用した場合には、そのシャー
レ等の表面に対する吸着性が向上するので好ましい。
【００１２】また、この糖鎖高分子をなす糖鎖として
は、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マンノー
ス、Ｎ-アセチルグルコサミン、ラミナリビオース、ウ
ロン酸関連物質、硫酸糖等の単糖類、オリゴ糖類等がい
ずれも使用でき、上記合成高分子に側鎖として結合した
状態で、レクチンと特異的に結合する糖残基を保持でき
るものならば、特に限定されるものではない。
は、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マンノー
ス、Ｎ-アセチルグルコサミン、ラミナリビオース、ウ
ロン酸関連物質、硫酸糖等の単糖類、オリゴ糖類等がい
ずれも使用でき、上記合成高分子に側鎖として結合した
状態で、レクチンと特異的に結合する糖残基を保持でき
るものならば、特に限定されるものではない。
【００１３】本発明で用いる糖鎖高分子２において、高
分子主鎖２２と糖鎖２１との結合方法は、アミド結合、
エーテル結合、エステル結合等の共有結合とするのが好
ましい。例えば、ｐ-アミノメチルスチレンのアミノ基
と、ラクトン化した糖の末端カルボニル基間でアミド結
合を形成するのが好ましい。また、この高分子主鎖と糖
鎖とは、合成高分子をなすモノマーと糖鎖分子とを結合
させてから重合してもよいし、結合可能な官能基を有す
るモノマーを重合した後に糖鎖を結合させてもよい。但
し、１分子中に導入される糖鎖の数を制御できることか
ら、糖鎖を結合させたモノマーを重合するのが好まし
い。
分子主鎖２２と糖鎖２１との結合方法は、アミド結合、
エーテル結合、エステル結合等の共有結合とするのが好
ましい。例えば、ｐ-アミノメチルスチレンのアミノ基
と、ラクトン化した糖の末端カルボニル基間でアミド結
合を形成するのが好ましい。また、この高分子主鎖と糖
鎖とは、合成高分子をなすモノマーと糖鎖分子とを結合
させてから重合してもよいし、結合可能な官能基を有す
るモノマーを重合した後に糖鎖を結合させてもよい。但
し、１分子中に導入される糖鎖の数を制御できることか
ら、糖鎖を結合させたモノマーを重合するのが好まし
い。
【００１４】また、この糖鎖高分子は、レクチンを高濃
度に固定化、濃縮する場合は、糖鎖を結合させたモノマ
ーを単独重合させたホモポリマーとし、吸着する糖鎖密
度を高くするのが好ましく、逆に、レクチンを疎に固定
化したい場合は、他のモノマーと共重合体として糖鎖の
数を減らしてもよい。さらに、親水性等の他の性質を有
する他のモノマーとの共重合体とすることにより、吸着
した基材表面に親水性等の他の性質を付与するようにし
てもよい。
度に固定化、濃縮する場合は、糖鎖を結合させたモノマ
ーを単独重合させたホモポリマーとし、吸着する糖鎖密
度を高くするのが好ましく、逆に、レクチンを疎に固定
化したい場合は、他のモノマーと共重合体として糖鎖の
数を減らしてもよい。さらに、親水性等の他の性質を有
する他のモノマーとの共重合体とすることにより、吸着
した基材表面に親水性等の他の性質を付与するようにし
てもよい。
【００１５】本発明の固定化法にあっては、上記のよう
な糖鎖高分子の中で、例えば、下記式（１）から（１
０）で表される糖鎖高分子が特に好適に用いられる。
な糖鎖高分子の中で、例えば、下記式（１）から（１
０）で表される糖鎖高分子が特に好適に用いられる。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】
【化９】
【００２５】
【化１０】
【００２６】上記式（１）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡと略記
する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとか
ら合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、
β-ガラクトース残基を有する。
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡと略記
する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとか
ら合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、
β-ガラクトース残基を有する。
【００２７】上記式（２）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-
Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭＡと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマルトースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、グルコ
ース残基を有する。
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-
Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭＡと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマルトースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、グルコ
ース残基を有する。
【００２８】上記式（３）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノシル-（１→４）-
Ｄ-マンナミド］）（以後、ＰＶ-Ｍａｎと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマンノビオースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、マ
ンノース残基を有する。
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノシル-（１→４）-
Ｄ-マンナミド］）（以後、ＰＶ-Ｍａｎと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマンノビオースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、マ
ンノース残基を有する。
【００２９】上記式（４）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
６）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭｅＡと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとＯ-α-Ｄ-ガタ
クトピラノシル-（１→６）-Ｄ-グルコースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、α-ガ
ラクトース残基を有する。
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
６）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭｅＡと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとＯ-α-Ｄ-ガタ
クトピラノシル-（１→６）-Ｄ-グルコースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、α-ガ
ラクトース残基を有する。
【００３０】上記式（５）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチル-β-Ｄ-ガラクト
ピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カルボキシメチル-グ
ルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡＣＯＯＨと略記す
る）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られたＰＶ-ＬＡ
をカルボキシルメチル化したもので、カルボキシメチル
化-β-ガラクトース残基を有する。
ルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチル-β-Ｄ-ガラクト
ピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カルボキシメチル-グ
ルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡＣＯＯＨと略記す
る）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られたＰＶ-ＬＡ
をカルボキシルメチル化したもので、カルボキシメチル
化-β-ガラクトース残基を有する。
【００３１】上記式（６）で表されるポリ（３-Ｏ-４’
-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）（以後、ＰＶ-Ｇと略
記する）は、ｐ-クロロメチルスチレンとグルコースと
から合成されたモノマーを単独重合して得られるもの
で、グルコース残基を有する。
-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）（以後、ＰＶ-Ｇと略
記する）は、ｐ-クロロメチルスチレンとグルコースと
から合成されたモノマーを単独重合して得られるもの
で、グルコース残基を有する。
【００３２】上記式（７）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-
Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミ
ド］）、上記式（８）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベ
ンジル-［Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、またはそれら
の混合物（以後、いずれもＰＶ-ＧｌｃＮａｃと略記す
る）は、ともにＮ-アセチルグルコサミン残基を有す
る。
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-
Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミ
ド］）、上記式（８）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベ
ンジル-［Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、またはそれら
の混合物（以後、いずれもＰＶ-ＧｌｃＮａｃと略記す
る）は、ともにＮ-アセチルグルコサミン残基を有す
る。
【００３３】上記式（９）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）（以後、ＰＶ-ＧＡと
略記する）は、Ｄ-グルコースを開環させてｐ-アミノメ
チルスチレンと結合させたモノマーを単独重合して得ら
れるものである。
ルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）（以後、ＰＶ-ＧＡと
略記する）は、Ｄ-グルコースを開環させてｐ-アミノメ
チルスチレンと結合させたモノマーを単独重合して得ら
れるものである。
【００３４】上記式（１０）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビ
ニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→
３）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-Ｌａｍと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラミナリビオ
ースとから合成されたモノマーを単独重合して得られる
もので、β１→３グルコース残基を有する。
ニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→
３）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-Ｌａｍと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラミナリビオ
ースとから合成されたモノマーを単独重合して得られる
もので、β１→３グルコース残基を有する。
【００３５】本発明の固定化法では、これらの糖鎖高分
子の中で、固定化したいレクチンと特異的結合する糖鎖
を有する糖鎖高分子を選択して吸着させる。用いる糖鎖
高分子は、１種のみでも２種以上を混合して用いてもよ
く、その使用目的に応じて適宜選択できる。
子の中で、固定化したいレクチンと特異的結合する糖鎖
を有する糖鎖高分子を選択して吸着させる。用いる糖鎖
高分子は、１種のみでも２種以上を混合して用いてもよ
く、その使用目的に応じて適宜選択できる。
【００３６】これらの糖鎖高分子を基材に吸着させるに
は、シャーレ等の基材１表面に糖鎖高分子溶液を適用
し、溶媒を留去することにより容易に吸着させることが
できる。例えば、蒸留水を溶媒とする糖鎖高分子溶液
を、ろ過、滅菌した後、シャーレ等に注入し、室温で２
時間程度放置するだけでよい。吸着後、好ましくは、蒸
留水で数回洗浄し、平衡塩溶液等で置換しておく。糖鎖
高分子を溶解する溶媒としては水が好ましいが、用いる
糖鎖高分子によっては、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、エタノール、メタノール等の有機溶媒
やそれらと水との混合溶媒も使用できる。
は、シャーレ等の基材１表面に糖鎖高分子溶液を適用
し、溶媒を留去することにより容易に吸着させることが
できる。例えば、蒸留水を溶媒とする糖鎖高分子溶液
を、ろ過、滅菌した後、シャーレ等に注入し、室温で２
時間程度放置するだけでよい。吸着後、好ましくは、蒸
留水で数回洗浄し、平衡塩溶液等で置換しておく。糖鎖
高分子を溶解する溶媒としては水が好ましいが、用いる
糖鎖高分子によっては、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、エタノール、メタノール等の有機溶媒
やそれらと水との混合溶媒も使用できる。
【００３７】上記の糖鎖高分子溶液の濃度は、固定化し
たいレクチンの密度に応じて適宜選択されるが、通常
は、０．００１から１．０ｍｇ／ｍｌ程度とされる。ま
た、この糖鎖高分子溶液は、その都度調整してもよい
が、ストック溶液として保存しておいたものを使用すれ
ば、さらに手間を省くことができる。その場合は、スト
ック溶液中の糖鎖高分子が会合している場合があるの
で、使用前に適度な超音波処理等を施すのが好ましい。
たいレクチンの密度に応じて適宜選択されるが、通常
は、０．００１から１．０ｍｇ／ｍｌ程度とされる。ま
た、この糖鎖高分子溶液は、その都度調整してもよい
が、ストック溶液として保存しておいたものを使用すれ
ば、さらに手間を省くことができる。その場合は、スト
ック溶液中の糖鎖高分子が会合している場合があるの
で、使用前に適度な超音波処理等を施すのが好ましい。
【００３８】このようにして糖鎖高分子２を吸着させた
基材１表面は、選択した糖鎖高分子２に固有の糖鎖２１
で修飾されている。次に、この糖鎖２１で修飾された基
材１にレクチン３を固定化する。これを行うには、レク
チンの水溶液を糖鎖高分子吸着させた基材に適用し、溶
媒を留去すればよい。
基材１表面は、選択した糖鎖高分子２に固有の糖鎖２１
で修飾されている。次に、この糖鎖２１で修飾された基
材１にレクチン３を固定化する。これを行うには、レク
チンの水溶液を糖鎖高分子吸着させた基材に適用し、溶
媒を留去すればよい。
【００３９】レクチン水溶液を糖鎖高分子修飾基材に適
用すると、水溶液中のレクチン３が、基材１表面に吸着
された糖鎖高分子２の糖鎖２１に到達する。この糖鎖２
１は、該レクチンと特異的に結合するものが選択されて
いるため、該レクチン３は、この糖鎖２１と強固に結合
して固定化される。
用すると、水溶液中のレクチン３が、基材１表面に吸着
された糖鎖高分子２の糖鎖２１に到達する。この糖鎖２
１は、該レクチンと特異的に結合するものが選択されて
いるため、該レクチン３は、この糖鎖２１と強固に結合
して固定化される。
【００４０】本発明で固定化されるレクチンは、何ら限
定されるものではなく、各レクチンと特異的に結合する
糖鎖を有する糖鎖高分子を介して良好に固定化される。
例えば、ガラクトース残基を有するＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた基材には、ガラクトース結合性レクチンであるＳＢ
Ａ、ＥＣＬ、Ａｌｌｏ Ａ、ＶＡＡ等のレクチンを選択
的に固定化することができ、グルコース残基を有するＰ
Ｖ-ＭＡを吸着させた基材には、ＧＮＬ、ＬｃＨ、ＰＳ
Ａ等のレクチンを、マンノース残基を有するＰＶ-Ｍａ
ｎを吸着させた基材には、ＬＣＡ、ＧＮＡ、ＣＰＡ等の
レクチンを選択的に固定化できる。即ち、異なる種類の
レクチンを含む溶液を適用したとしても、吸着させた糖
鎖に特異的に結合するレクチンのみを選択的に固定化す
ることも可能である。
定されるものではなく、各レクチンと特異的に結合する
糖鎖を有する糖鎖高分子を介して良好に固定化される。
例えば、ガラクトース残基を有するＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた基材には、ガラクトース結合性レクチンであるＳＢ
Ａ、ＥＣＬ、Ａｌｌｏ Ａ、ＶＡＡ等のレクチンを選択
的に固定化することができ、グルコース残基を有するＰ
Ｖ-ＭＡを吸着させた基材には、ＧＮＬ、ＬｃＨ、ＰＳ
Ａ等のレクチンを、マンノース残基を有するＰＶ-Ｍａ
ｎを吸着させた基材には、ＬＣＡ、ＧＮＡ、ＣＰＡ等の
レクチンを選択的に固定化できる。即ち、異なる種類の
レクチンを含む溶液を適用したとしても、吸着させた糖
鎖に特異的に結合するレクチンのみを選択的に固定化す
ることも可能である。
【００４１】本発明は、上記の固定化法で表面にレクチ
ンを固定化した細胞用基材にも関する。レクチンを固定
化する基材としては、シャーレ、フラスコ、プレート、
キュベット、フィルム、ファイバー、またはビーズ等の
従来から細胞培養に用いられている基材が好ましいが、
それらに限られず、用途に応じていかなる形状の基材も
使用できる。これらの基材は、ガラス、石英等の無機材
料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の
有機材料のいずれからなっていてもよいが、滅菌可能な
程度の耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが
好ましい。
ンを固定化した細胞用基材にも関する。レクチンを固定
化する基材としては、シャーレ、フラスコ、プレート、
キュベット、フィルム、ファイバー、またはビーズ等の
従来から細胞培養に用いられている基材が好ましいが、
それらに限られず、用途に応じていかなる形状の基材も
使用できる。これらの基材は、ガラス、石英等の無機材
料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の
有機材料のいずれからなっていてもよいが、滅菌可能な
程度の耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが
好ましい。
【００４２】特に合成高分子材料は、価格や成形性の点
から好ましく、糖鎖高分子の吸着性から疎水性のものが
好ましい。例えば、ポリスチレンやその誘導体を主鎖と
する糖鎖高分子を用いる場合には、ポリスチレン及びそ
の誘導体を主原料とする基材を使用するのが好ましい。
から好ましく、糖鎖高分子の吸着性から疎水性のものが
好ましい。例えば、ポリスチレンやその誘導体を主鎖と
する糖鎖高分子を用いる場合には、ポリスチレン及びそ
の誘導体を主原料とする基材を使用するのが好ましい。
【００４３】本発明の細胞用基材は、例えば図１に示す
ように、基材１表面に糖鎖高分子２が吸着され、その糖
鎖高分子２の糖鎖２１にレクチン３が固定化されてい
る。従って、この細胞用基材表面は、固定化されたレク
チンの種類によって異なる糖への特異的結合性を有して
いる。例えば、ガラクトース残基を有する糖鎖高分子で
あるＰＶ-ＬＡを介してガラクトース結合性レクチンを
固定化した細胞用基材上には、表面にガラクトースを表
現している成熟Ｔ-細胞等を選択的に接着させることが
できる。
ように、基材１表面に糖鎖高分子２が吸着され、その糖
鎖高分子２の糖鎖２１にレクチン３が固定化されてい
る。従って、この細胞用基材表面は、固定化されたレク
チンの種類によって異なる糖への特異的結合性を有して
いる。例えば、ガラクトース残基を有する糖鎖高分子で
あるＰＶ-ＬＡを介してガラクトース結合性レクチンを
固定化した細胞用基材上には、表面にガラクトースを表
現している成熟Ｔ-細胞等を選択的に接着させることが
できる。
【００４４】このような細胞用基材にあっては、例え
ば、吸着させる糖鎖高分子の濃度や組成を変えることに
よって、固定化するレクチンの密度を容易に調整するこ
とができる。また、レクチンは基材表面に濃縮され、そ
の活性サイトが集中しているので、例えば細胞を効果的
に凝集させたり活性化したりすることができる。
ば、吸着させる糖鎖高分子の濃度や組成を変えることに
よって、固定化するレクチンの密度を容易に調整するこ
とができる。また、レクチンは基材表面に濃縮され、そ
の活性サイトが集中しているので、例えば細胞を効果的
に凝集させたり活性化したりすることができる。
【００４５】
（実施例１）上記式（１）に示す糖鎖高分子（ＰＶ-Ｌ
Ａ）を合成し、それに黄色蛍光色素であるフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣと略記）を導入した。
即ち、３滴のピリジンを添加した５ｍｌの乾燥ジメチル
スルホキシドに５００ｍｇのＰＶ-ＬＡ（１０×１０-3
モルのモノマーユニットに対応する）を溶解した。その
溶液に５０ｍｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さ
らに１５ｍｇのジブチルスズジラウレートを加えた後、
９０℃で２時間加熱した。得られた反応混合液からエタ
ノール中で数回再結晶させて濾過することにより、ＦＩ
ＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを得た。
Ａ）を合成し、それに黄色蛍光色素であるフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣと略記）を導入した。
即ち、３滴のピリジンを添加した５ｍｌの乾燥ジメチル
スルホキシドに５００ｍｇのＰＶ-ＬＡ（１０×１０-3
モルのモノマーユニットに対応する）を溶解した。その
溶液に５０ｍｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さ
らに１５ｍｇのジブチルスズジラウレートを加えた後、
９０℃で２時間加熱した。得られた反応混合液からエタ
ノール中で数回再結晶させて濾過することにより、ＦＩ
ＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを得た。
【００４６】上記ＦＩＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを１００μｇ
／ｍｌ含む水溶液を作製し、その水溶液中に直径０．６
μｍのポリスチレン製ビーズラテックス（Polybead、ポ
リサイエンス社製）を加え、室温で２時間処理して、ポ
リスチレン製ビーズにＦＩＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた。次に、上記液にガラクトース認識性レクチンであ
るＳＢＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で保存し、Ｐ
Ｖ-ＬＡのガラクトース残基にＳＢＡを結合させてＳＢ
Ａ修飾ビーズとした。
／ｍｌ含む水溶液を作製し、その水溶液中に直径０．６
μｍのポリスチレン製ビーズラテックス（Polybead、ポ
リサイエンス社製）を加え、室温で２時間処理して、ポ
リスチレン製ビーズにＦＩＴＣ標識ＰＶ-ＬＡを吸着さ
せた。次に、上記液にガラクトース認識性レクチンであ
るＳＢＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で保存し、Ｐ
Ｖ-ＬＡのガラクトース残基にＳＢＡを結合させてＳＢ
Ａ修飾ビーズとした。
【００４７】上記の液を、蒸留水を加えて１５００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して上清みを取り除く操作により洗浄
し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＢＡ修飾ビーズを含む液を作
製した。別に調整したヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）
懸濁液（１×１０6細胞）に、ＳＢＡ修飾ビーズ液５０
μｌを添加し、冷暗所で３０分間インキュベーションし
た。さらに、ＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで１０分間
遠心して上清みを取り除く操作により洗浄した後、赤色
蛍光物質であるピコエリスリン（ＰＥ）を導入した抗Ｃ
Ｄ３抗体を添加し、ＣＤ３細胞をＰＥ標識して試料とし
た。
ｍで１０分間遠心して上清みを取り除く操作により洗浄
し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＢＡ修飾ビーズを含む液を作
製した。別に調整したヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）
懸濁液（１×１０6細胞）に、ＳＢＡ修飾ビーズ液５０
μｌを添加し、冷暗所で３０分間インキュベーションし
た。さらに、ＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで１０分間
遠心して上清みを取り除く操作により洗浄した後、赤色
蛍光物質であるピコエリスリン（ＰＥ）を導入した抗Ｃ
Ｄ３抗体を添加し、ＣＤ３細胞をＰＥ標識して試料とし
た。
【００４８】比較のため、ＰＶ-ＬＡの代わりにＰＶ-Ｍ
Ａを吸着させたビーズ、またはＰＶ-ＬＡを吸着させた
後にＳＢＡを添加しなかったビーズを用いた以外は上記
と同様の処理を施して比較用の試料を用意した。各試料
の蛍光強度を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａ
ｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー
・システム社製）で測定した。結果を図３に示す。
Ａを吸着させたビーズ、またはＰＶ-ＬＡを吸着させた
後にＳＢＡを添加しなかったビーズを用いた以外は上記
と同様の処理を施して比較用の試料を用意した。各試料
の蛍光強度を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａ
ｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー
・システム社製）で測定した。結果を図３に示す。
【００４９】図３において、（Ａ）はＰＶ-ＬＡで処理
した後、ＳＢＡを添加しなかったビーズで処理した細胞
試料、（Ｂ）は本発明に従ってＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡを
固定化したビーズで処理した細胞試料、（Ｃ）はＰＶ-
ＭＡとＳＢＡで処理したビーズで処理した細胞試料から
得られた結果である。縦軸は、抗ＣＤ３抗体に導入した
蛍光物質（ＰＥ）に基づく赤色蛍光強度を示し、横軸
は、ＰＶ-ＬＡまたはＰＶ-ＭＡに導入した蛍光物質（Ｆ
ＩＴＣ）に基づく黄色蛍光強度である。
した後、ＳＢＡを添加しなかったビーズで処理した細胞
試料、（Ｂ）は本発明に従ってＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡを
固定化したビーズで処理した細胞試料、（Ｃ）はＰＶ-
ＭＡとＳＢＡで処理したビーズで処理した細胞試料から
得られた結果である。縦軸は、抗ＣＤ３抗体に導入した
蛍光物質（ＰＥ）に基づく赤色蛍光強度を示し、横軸
は、ＰＶ-ＬＡまたはＰＶ-ＭＡに導入した蛍光物質（Ｆ
ＩＴＣ）に基づく黄色蛍光強度である。
【００５０】各細胞試料ともＰＥに基づく蛍光強度は強
く、即ちこれらの細胞がＴ細胞のＣＤ３細胞であること
が確認される。しかし、ＦＩＴＣに基づく蛍光強度は、
ＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡで処理した細胞試料では強いが、
ＰＶ-ＬＡのみ、あるいはＰＶ-ＭＡ及びＳＢＡで処理し
た細胞試料ではほとんど観測されなかった。
く、即ちこれらの細胞がＴ細胞のＣＤ３細胞であること
が確認される。しかし、ＦＩＴＣに基づく蛍光強度は、
ＰＶ-ＬＡ及びＳＢＡで処理した細胞試料では強いが、
ＰＶ-ＬＡのみ、あるいはＰＶ-ＭＡ及びＳＢＡで処理し
た細胞試料ではほとんど観測されなかった。
【００５１】成熟したＴ細胞は、その表面にガラクトー
スを表現していることが知られている。図２に示すよう
に、本発明の固定化法によって、ビーズ６０にＰＶ-Ｌ
Ａを介してＳＢＡ３０を固定化させたＳＢＡ修飾ビーズ
は、ＳＢＡのガラクトース認識性によってＣＤ３細胞５
０の表面に存在するガラクトース残基２５に特異的に結
合する。従って、このような細胞試料では、抗ＣＤ３抗
体５１に導入したＰＥ及びＰＶ-ＬＡに導入したＦＩＴ
Ｃの両方に基づく蛍光が観察されることが証明された。
スを表現していることが知られている。図２に示すよう
に、本発明の固定化法によって、ビーズ６０にＰＶ-Ｌ
Ａを介してＳＢＡ３０を固定化させたＳＢＡ修飾ビーズ
は、ＳＢＡのガラクトース認識性によってＣＤ３細胞５
０の表面に存在するガラクトース残基２５に特異的に結
合する。従って、このような細胞試料では、抗ＣＤ３抗
体５１に導入したＰＥ及びＰＶ-ＬＡに導入したＦＩＴ
Ｃの両方に基づく蛍光が観察されることが証明された。
【００５２】一方、ＰＶ-ＬＡを吸着させたのみでＳＢ
Ａを欠くビーズ（図３（Ａ））、及びグルコース残基を
有するＰＶ-ＭＡを吸着させ、よってＳＢＡが固定化さ
れていないビーズ（図３（Ｃ））は、ＣＤ３細胞に結合
せず、ＦＩＴＣに基づく蛍光が観察されなかったものと
考えられる。言い換えれば、本発明に従ってレクチンを
固定化した蛍光性ビーズは、表面にガラクトースを表現
している細胞に対し、そのガラクトースに特異的に結合
する標識剤として利用できることが示唆されている。
Ａを欠くビーズ（図３（Ａ））、及びグルコース残基を
有するＰＶ-ＭＡを吸着させ、よってＳＢＡが固定化さ
れていないビーズ（図３（Ｃ））は、ＣＤ３細胞に結合
せず、ＦＩＴＣに基づく蛍光が観察されなかったものと
考えられる。言い換えれば、本発明に従ってレクチンを
固定化した蛍光性ビーズは、表面にガラクトースを表現
している細胞に対し、そのガラクトースに特異的に結合
する標識剤として利用できることが示唆されている。
【００５３】（実施例２）ポリスチレン製キュベット
に、糖鎖高分子であるＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡを各々
１．０ｍｇ／ｍｌまでの種々の濃度で含む水溶液を一定
量注入し、室温で２時間放置することによりキュベット
表面に糖鎖高分子を吸着させた。洗浄後、ＦＩＴＣ標識
したガラクトース認識性レクチンであるＰＮＡの水溶液
（０．１％のＢＳＡ、及びＰＢＳを含む）を、各キュベ
ットに同量注入した。
に、糖鎖高分子であるＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡを各々
１．０ｍｇ／ｍｌまでの種々の濃度で含む水溶液を一定
量注入し、室温で２時間放置することによりキュベット
表面に糖鎖高分子を吸着させた。洗浄後、ＦＩＴＣ標識
したガラクトース認識性レクチンであるＰＮＡの水溶液
（０．１％のＢＳＡ、及びＰＢＳを含む）を、各キュベ
ットに同量注入した。
【００５４】２時間経過後に洗浄し、２０ｍＭのガラク
トース及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加して３
０分間放置した。その後、キュベット表面から脱離した
ＰＮＡ量を蛍光光度計で測定し、固定化されたＰＮＡ量
を見積もった。結果を図４に示す。横軸は、糖鎖高分子
吸着時の糖鎖高分子水溶液濃度を示し、縦軸は、単位面
積当たりに固定化されたＰＮＡ量を示す。
トース及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加して３
０分間放置した。その後、キュベット表面から脱離した
ＰＮＡ量を蛍光光度計で測定し、固定化されたＰＮＡ量
を見積もった。結果を図４に示す。横軸は、糖鎖高分子
吸着時の糖鎖高分子水溶液濃度を示し、縦軸は、単位面
積当たりに固定化されたＰＮＡ量を示す。
【００５５】同じくガラクトース認識性レクチンである
ＥＣＬを用い、上記と同様にしてキュベット表面に固定
化されたＥＣＬ量を見積もった。結果を図５に示す。図
４及び図５から明らかなように、ガラクトース認識性レ
クチンであるＰＮＡ及びＥＣＬは、ガラクトース残基を
有するＰＶ-ＬＡを吸着させたキュベットに優先的に固
定化される。さらに、ＰＶ-ＬＡ吸着量が多くなるにし
たがい、固定化されるレクチンの量も増加する。
ＥＣＬを用い、上記と同様にしてキュベット表面に固定
化されたＥＣＬ量を見積もった。結果を図５に示す。図
４及び図５から明らかなように、ガラクトース認識性レ
クチンであるＰＮＡ及びＥＣＬは、ガラクトース残基を
有するＰＶ-ＬＡを吸着させたキュベットに優先的に固
定化される。さらに、ＰＶ-ＬＡ吸着量が多くなるにし
たがい、固定化されるレクチンの量も増加する。
【００５６】次に、１２穴マルチウェル（住友ベークラ
イト社製）に、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＬＡ水溶液を
注入して室温で２時間放置することにより、各ウェルに
ＰＶ-ＬＡを吸着させた後、１００ｎｇ／ｍｌのＥＣＬ
水溶液で処理した。それらのウェルに、５０、１００、
及び２００×１０4細胞／ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液（１０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０
中）を各々１ｍｌずつ添加し、３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。洗浄後、蛍光標識した抗体で処理
し、細胞の接着率を算出した。標識剤としては、ＦＩＴ
Ｃ標識抗ＣＤ１６抗体、及びＰＥ標識抗ＣＤ３抗体を用
いた。
イト社製）に、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＬＡ水溶液を
注入して室温で２時間放置することにより、各ウェルに
ＰＶ-ＬＡを吸着させた後、１００ｎｇ／ｍｌのＥＣＬ
水溶液で処理した。それらのウェルに、５０、１００、
及び２００×１０4細胞／ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液（１０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０
中）を各々１ｍｌずつ添加し、３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。洗浄後、蛍光標識した抗体で処理
し、細胞の接着率を算出した。標識剤としては、ＦＩＴ
Ｃ標識抗ＣＤ１６抗体、及びＰＥ標識抗ＣＤ３抗体を用
いた。
【００５７】同様に０．１ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＬＡ及び
０．１ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＭＡの混合水溶液から吸着さ
せたウェル、及び未被覆のウェルにおけるＰＢＭＣの接
着率を測定した。結果を表１に示す。但し、ＣＤ１６は
ナチュラル・キラー細胞、ＣＤ３はＴ細胞である。
０．１ｍｇ／ｍｌのＰＶ-ＭＡの混合水溶液から吸着さ
せたウェル、及び未被覆のウェルにおけるＰＢＭＣの接
着率を測定した。結果を表１に示す。但し、ＣＤ１６は
ナチュラル・キラー細胞、ＣＤ３はＴ細胞である。
【００５８】
【表１】
【００５９】以上の結果から、ＰＶ-ＬＡを介してＥＣ
Ｌを固定化したウェルには、表面にガラクトースを表現
したＴ細胞が選択的に接着されることがわかる。即ち、
本発明の固定化法に従ってレクチンを固定化された基材
は、細胞が選択的に接着する高機能な細胞培養基材とし
て使用できる。さらに、ＰＶ-ＬＡとＰＶ-ＭＡとを混合
して被覆したものでは、ナチュラル・キラー細胞の接着
が完全に阻害されており、本発明の固定化法を用いた細
胞培養基材が、細胞の接着性を高度にコントロールでき
る可能性が示唆されている。
Ｌを固定化したウェルには、表面にガラクトースを表現
したＴ細胞が選択的に接着されることがわかる。即ち、
本発明の固定化法に従ってレクチンを固定化された基材
は、細胞が選択的に接着する高機能な細胞培養基材とし
て使用できる。さらに、ＰＶ-ＬＡとＰＶ-ＭＡとを混合
して被覆したものでは、ナチュラル・キラー細胞の接着
が完全に阻害されており、本発明の固定化法を用いた細
胞培養基材が、細胞の接着性を高度にコントロールでき
る可能性が示唆されている。
【００６０】（実施例３）直径３５ｍｍのポリスチレン
製シャーレに、ＰＶ-ＬＡを１００μｇ／ｍｌ含む水溶
液を加え、室温で２時間処理してＰＶ-ＬＡを吸着させ
た。次に、ガラクトース認識性レクチンであるＡｌｌｏ
Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添加して室温で２
時間保存した後洗浄し、本発明によるＡｌｌｏ Ａの固
定化を行った。
製シャーレに、ＰＶ-ＬＡを１００μｇ／ｍｌ含む水溶
液を加え、室温で２時間処理してＰＶ-ＬＡを吸着させ
た。次に、ガラクトース認識性レクチンであるＡｌｌｏ
Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添加して室温で２
時間保存した後洗浄し、本発明によるＡｌｌｏ Ａの固
定化を行った。
【００６１】比較のため、同様のポリスチレン製シャー
レに、Ａｌｌｏ Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添
加して室温で２時間保存した後洗浄し、従来法によるＡ
ｌｌｏ Ａの固定化を行った。さらに、未被覆のポリス
チレン製シャーレ、及びＰＶ-ＬＡのみを吸着させ、Ａ
ｌｌｏ Ａで処理しなかったシャーレも用意した。
レに、Ａｌｌｏ Ａ（２０μｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添
加して室温で２時間保存した後洗浄し、従来法によるＡ
ｌｌｏ Ａの固定化を行った。さらに、未被覆のポリス
チレン製シャーレ、及びＰＶ-ＬＡのみを吸着させ、Ａ
ｌｌｏ Ａで処理しなかったシャーレも用意した。
【００６２】各シャーレに、２００×１０4細胞のヒト
赤血球（ＲＢＣ）を懸濁したＰＢＳ（0.2%ＢＳＡを含
む）を１．５ｍｌずつ添加し、３７℃で６０分間インキ
ュベーションした。その後、非接着ＲＢＣ数をコールタ
ーカウンターで計数し、ＲＢＣの接着率を算出した。こ
こで、接着率は下式に従って計算し、結果を表２に示
す。接着率（％）＝｛（播き込み数（200×104）−非接
着細胞数）／播き込み数｝×１００
赤血球（ＲＢＣ）を懸濁したＰＢＳ（0.2%ＢＳＡを含
む）を１．５ｍｌずつ添加し、３７℃で６０分間インキ
ュベーションした。その後、非接着ＲＢＣ数をコールタ
ーカウンターで計数し、ＲＢＣの接着率を算出した。こ
こで、接着率は下式に従って計算し、結果を表２に示
す。接着率（％）＝｛（播き込み数（200×104）−非接
着細胞数）／播き込み数｝×１００
【００６３】
【表２】
【００６４】糖鎖高分子（ＰＶ-ＬＡ）を介してレクチ
ン（Ａｌｌｏ Ａ）を固定化したシャーレ上には、まき
込んだ細胞のほとんど全部が接着したが、シャーレ表面
にＡｌｌｏ Ａを吸着させただけのシャーレでは、Ａｌ
ｌｏ Ａを固定化していないシャーレと同程度の接着率
しか得られなかった。即ち、本発明の固定化法で固定化
したレクチンは、従来法に比較して強固に固定化するこ
とが可能であり、さらにその活性も向上しているものと
考えられる。
ン（Ａｌｌｏ Ａ）を固定化したシャーレ上には、まき
込んだ細胞のほとんど全部が接着したが、シャーレ表面
にＡｌｌｏ Ａを吸着させただけのシャーレでは、Ａｌ
ｌｏ Ａを固定化していないシャーレと同程度の接着率
しか得られなかった。即ち、本発明の固定化法で固定化
したレクチンは、従来法に比較して強固に固定化するこ
とが可能であり、さらにその活性も向上しているものと
考えられる。
【００６５】
【発明の効果】本発明のレクチン固定化法によれば、吸
着性の良好な糖鎖高分子を基材に吸着させ、その糖鎖高
分子の糖鎖にレクチンを結合させるため、極めて安定
に、なおかつ強固にレクチンを固定化することができ
る。また、糖鎖とレクチンとの特異的結合性を利用して
固定化するため、例えば複数のレクチンを含む混合溶液
からでも、目的とするレクチンを選択的に固定化でき
る。
着性の良好な糖鎖高分子を基材に吸着させ、その糖鎖高
分子の糖鎖にレクチンを結合させるため、極めて安定
に、なおかつ強固にレクチンを固定化することができ
る。また、糖鎖とレクチンとの特異的結合性を利用して
固定化するため、例えば複数のレクチンを含む混合溶液
からでも、目的とするレクチンを選択的に固定化でき
る。
【００６６】本発明の固定化法に従ってレクチンを固定
化した細胞用基材では、固定化、濃縮されたレクチンに
よって効果的に機能が発揮され、例えば選択的に細胞を
凝集させたり活性化させることができる。
化した細胞用基材では、固定化、濃縮されたレクチンに
よって効果的に機能が発揮され、例えば選択的に細胞を
凝集させたり活性化させることができる。
【図１】 本発明のレクチンの固定化法を説明するため
の模式図である。
の模式図である。
【図２】 実施例１の細胞の標識法を説明するための図
である。
である。
【図３】 実施例１で処理した細胞のフローサイトメト
リーの結果を示すグラフである。
リーの結果を示すグラフである。
【図４】 糖鎖高分子の吸着量と、それに対するＰＮＡ
固定化量の関係を示すグラフである。
固定化量の関係を示すグラフである。
【図５】 糖鎖高分子の吸着量と、それに対するＥＣＬ
固定化量の関係を示すグラフである。
固定化量の関係を示すグラフである。
１…基材、２…糖鎖高分子、３…レクチン、２１…糖
鎖、２２…高分子主鎖、２５…ガラクトース残基、３０
…ＳＢＡ、４０…細胞、５０…ＣＤ３細胞、５１…抗Ｃ
Ｄ３抗体、６０…ポリスチレン製ビーズ。
鎖、２２…高分子主鎖、２５…ガラクトース残基、３０
…ＳＢＡ、４０…細胞、５０…ＣＤ３細胞、５１…抗Ｃ
Ｄ３抗体、６０…ポリスチレン製ビーズ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平８−317786（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−176753（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−301786（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−116692（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−279787（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−287067（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−234799（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−503224（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．184, Ｎｏ．１（1992）ｐ．225−230 高分子論文集，Ｖｏｌ．45，Ｎｏ．12 （1988）ｐ．919−924 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 - 3/00 C12N 5/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 固定化すべきレクチンと特異的に結合す
る糖鎖を有する一の糖鎖高分子と、少なくとも１種の他
の糖鎖高分子とを基材に吸着させ、それらの糖鎖高分子
を介して該レクチンを固定化してなり、前記糖鎖高分子
がポリスチレンを主鎖とし、側鎖として糖鎖を導入した
ものであることを特徴とする細胞培養基材。 - 【請求項２】 前記糖鎖高分子が、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラ
ノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノ
シル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノ
シル-（１→４）-Ｄ-マンナアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラ
ノシル-（１→６）-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチ
ル-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カ
ルボキシメチル-グルコンアミド］）、 ポリ（３-Ｏ-４’-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２
-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-
２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル
-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-
Ｄ-グルコンアミド］）及び／またはポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）、及
び、 ポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノ
シル-（１→３）-Ｄ-グルコンアミド］から選択される
ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養基材。 - 【請求項３】 前記基材が、シャーレ、フラスコ、プレ
ート、キュベット、フィルム、ファイバー、またはビー
ズから選択されることを特徴とする請求項１または２記
載の細胞培養基材。
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-
1996
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Non-Patent Citations (2)
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| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１８４，Ｎｏ．１（１９９２）ｐ．２２５−２３０ |
| 高分子論文集，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１２（１９８８）ｐ．９１９−９２４ |
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