JP4308918B2 - (2,6)−STエピトープクラスターを有するα−O−結合複合糖質、その製造方法および使用 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明はα-O-結合糖ペプチドの分野にある。詳しくは本発明は、抗癌治療薬として有用な糖ドメインクラスター(clustered glycodomains)を有するα-O-結合複合糖質の製造方法に関する。本発明はまた、かかるα-O-結合複合糖質を含んでなる新規組成物、およびこれらの複合糖質(glycoconjugates)を用いる癌の治療方法に関する。
本出願において、本発明が属する現行の技術水準をさらに十分に記載するために種々の刊行物が引用されているが、その各々はそのまま出典明示して本出願の一部とみなされる。
発明の背景
最近、生物学的プロセスに関するシグナル分子としての炭水化物の役割が注目されている。文献:M.L. Phillips, et al., Science, 1990, 250, 1130; M.J. Polleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88, 6224: T.Takiら, J. Biol. Chem., 1996, 261, 3075; Y. Hirabayashi, A, Hyogo, T. Nakao, K. Tsuchiya, Y. Suzuki, M. Matsumoto, K. Kon, S. Ando, 同書, 1990, 265, 8144; O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R.U. Lemieux, Carbohydr. Res. 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemineux,同書, 1988, 174, 211.細胞の相互作用の仲介における炭水化物の関わりの範囲を解明することは、最新の生物医学的研究における重要な調査領域である。詳細な構造情報をもたらす炭水化物分子は、遊離物質としてではなくむしろ複合糖質(糖タンパク質および糖脂質参照)として存在する傾向がある。しばしば複合体を均質な形で単離することを伴う錯形成性、及び、これら天然に存在する複合体から完全な形の炭水化物を回収することの困難性があるとすれば、合成的アプローチの方が適切であることは明白である(グリコシル化の最近の概説に関しては、文献:Paulsen, H.; Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 1982, 21, 155; Schmidt, R.R., Angew. Chemie Int.Ed. Engl. 1986, 25, 212; Schmidt, R.R., Comprehensive Organic Synthesis, 第6巻,第1(2)章, Pergamon Press, Oxford, 1991; Schmidt, R.R., Carbohydrates, Synthetic Methods and Application in Medicinal Chemistry, 第1巻,第4章, VCH Publishers, Weinheim, New York, 1992を参照。グリコシド合成におけるグリコシル供与体としてのグリカール類の使用に関しては、文献:Lemieux, R.U., Can. J. Chem., 1964, 42, 1417; Lemieux, R.U., Fraiser-Reid, B., Can.J. Chem. 1965, 43, 1460; Lemieux, R.U.; Morgan, A.R.,Can.J. Chem.1965, 43, 2190; Thiem, J.ら, Synthesis 1978, 696; Thiem, J. Ossowski, P., Carbohydr. Chem., 1984, 3, 287; Thiem, J.ら, Liebigs Ann. Chem., 1986, 1044; Thiem, J. Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry, Horton, D.ら編, ACS Symposium Series No. 386, American Chemical Society, Washington, D.C., 1989,第8章を参照)。
糖タンパク質および糖脂質の双方に含まれる血液型物質の炭水化物ドメインは、赤血球、上皮細胞および種々の分泌物に分配される。これらの系に対する初期の焦点は、それらの中心を血液型の特異性を決定することに置かれていた。文献:R.R. Race; R. Sanger, Blood Groups in Man, 第6版, Blackwell, Oxford, 1975.しかしながら、かかる決定因子は概ね細胞の付着および結合現象に関わりがあることがわかっている(例えば、文献:M.L. Phillipsら, Science 1990, 250, 1130)。さらに、複合形態にある血液型物質に関する集合体は、種々の腫瘍の発生のマーカーとして見出される。文献:K.O. Lloyd, Am. J. Clinical Path., 1987, 87, 129; K.O. Lloyd, Cancer Biol., 1991, 2, 421。炭水化物に基づく腫瘍抗原性因子は、診断レベルで、ドラッグデリバリーにおいて、または理想的には免疫療法における供給源としての用途を持っている。文献:Toyokuni, T.ら, J. Am.Chem Soc. 1994, 116, 395; Dranoff, G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 3539; Tao, M-H.; Levy, R., Nature 1993, 362, 755; Boon, T., Int. J. Cancer 1993, 54, 177; Livingston, P.O., Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 624; Hakomori, S., Annu. Rev. Immunol. 1984, 2, 103; K. Shigetaら, J. Biol. Chem. 1987, 262, 1358.
本発明は、糖ペプチド合成の新しい戦略およびプロトコールを提供する。その目的は、複合体ドメインを比較的高い立体特異性で会合させ得るよう製法を簡略化することにある。主に複合糖質合成の進展には、高度の収斂とブロッキング基の操作と関連した負荷からの除去を達成することが必要である。もう1つの必要条件として、タンパク質または脂質を運ぶための適当な結合の提供を伴って炭水化物決定因子を送達することである。文献:Bernstein, M.A. ; Hall, L.D., Carbohydr. Res. 1980, 78, Cl; Lemieux, R.U., Chem. Soc. Rev. 1978, 7, 423; R.U. Lemieuxら, J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 4076.合成により得られた炭水化物を臨床用途に適した担体に組み込もうとするならば、このことは決定的な条件となる。
癌細胞に選択的な(または理想的には特異的な)抗原は、有効な免疫を惹起するのに有用であることがわかっている。文献:Hakomori, S., Cancer Res., 1985, 45, 2405-2414; Feizi, T., Cancer Surveys 1985, 4, 245-269.新規炭水化物パターンはしばしば、細胞表面糖タンパク質、または膜を足場とする糖脂質のいずれかとして形質転換細胞により提供される。原則として、抗体生産を刺激する合成複合糖質を十分に選択すれば、それらの細胞表面に同じタイプの構造が存在する癌に対して有効な免疫性を与えることが可能であった。文献:Dennis, J., Oxford Glycostems Glyconews,第2版, 1992; Lloyd, K.O., Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58頁.標的細胞に対する抗原の限定を増強することで治療を首尾よく改良する見込みがある。例えば、かかる特異的抗原の1つに、Hakomoriおよび共同研究者により、乳癌細胞系統MCF-7から単離され、モノクローナル抗体MBrlとして免疫同定されたグリコスフィンゴ脂質がある。文献:Bremer, E.G.ら, J. Biol. Chem. 1984, 259, 14773-14777; Menard. S.ら, Cancer Res. 1983, 43, 1295-1300.
糖タンパク質における注目されるサージ(文献:M.J. McPhersonら編, PCR A Practical Approach, 1994, Oxford University Press, Oxford, G.M. Blackburn; M.J Gait編, Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 1990, Oxford University press, Oxford; A.M. Bray; A.G. Jhingran; R.M. Valero; N.J. Maeji, J. Org. Chem. 1994, 59, 2197; G. Jung; A.G. Beck-Sickinger, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 367; M.A. Gallop; R.W. Barrett; W.J. Dower; S.P.A. Fodor; E.M. Gordon, J. Med. Chem. 1994, 37, 1233; H.P. Nestler; P.A. Bartlett; W.C. Still, J. Org. Chem. 1994, 59, 4723; M. Meldal, Curr. Opin. Struct. Biol. 1994, 4,673)は、細胞成長の調節、病原体の細胞への結合(文献:O.P. Bahl, Glycoconjugates: Composition, structure and function, H.J. Allen, E.C. Kisailus編, 1992, Marcel Dekker, Inc., New York, 1頁)、細胞内伝達および転移(文献:A. Kobata, Acc. Chem. Res. 1993, 26, 319)を含む種々の生物学的プロセスにおけるそれらの重要性がよく知られることからもたらされた。糖タンパク質は細胞分化マーカーとして働き、おそらくはタンパク質分解に対する保護を与えることにより、タンパク質の折りたたみおよび輸送に加わる。文献:G. Opdenakkerら, FASEB J. 1993, 7, 1330.単離技術および構造解明法の改良(文献:A. De; K-H. Khoo, Curr. Opin. Struct. Biol. 1993, 3, 687)により、天然で生産される糖タンパク質における高レベルの微細な不均一性が明らかとなった。文献:R.A. Dwekら, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 65.単一真核細胞系統がしばしば、所定のタンパク質配列のいずれかを多くの糖形態で産生する。例えば、貧血症に対して臨床上有効な赤血球刺激剤であるエリトロポエチン(EPO)は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)で発現させた場合、13を越える公知の種のオリゴ糖鎖によりグリコシル化される(文献:Y.C. Lee; R.T. Lee編, Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, 1994, Academic Press, London)。エリトロポエチンの効力は、グリコシル化のタイプおよび程度にもよるが強力である(文献:E. Watsonら, Glycobiology, 1994, 4, 227)。
ある糖タンパク質のオリゴ糖鎖の生物学的な適切性を解明するには、純品を入手する必要があり、これまでは単離によって得るしかなかった。糖タンパク質の不均一性はこの工程を特に集中的な労力の要るものする。しかしながら、特定の細胞系統を選択すれば、構造活性研究のため、より均一な糖タンパク質を生産することができる。米国特許第5,272,070号。しかしながら天然の供給源からの単離は依然、困難であるという問題がある。
受容体は通常、所定の高分子複合糖質の小断片しか認識しない。その結果として、より小さいが十分に定義された推定糖ペプチドリガンドの合成が、重要な構造情報のソースとしての単離と競合するものとしてもたらされた(文献:Y.C. Lee; R.T. Lee編,前記)。
すべて合成により製造された複合糖質は、ネズミ免疫系で体液性応答の起動を誘発することが知られている。文献:Ragupathi, G.ら, Angew. Cnem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125; Toyokuni, T.; Singhal, A.K., Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 231; Angew. Cnem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381.糖ペプチドは、大部分の糖脂質や炭水化物自体とは対照的に、好都合な場合では主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と結合し、T細胞を刺激することが知られている。文献:Deck, B.ら, J. Immunology 1995, 1074; Haurum, J.S.ら, L. Exp. Med. 1994, 180, 739; Sieling, P.A.ら, Science 1995, 269, 227(CD1に限定される微生物糖脂質のT細胞認識を示す)。適当に刺激されたT細胞は糖ペプチドの炭水化物部分を特異的に認識する受容体を発現する。本発明は、ペプチド結合の使用により炭水化物の免疫原性を増強させる手段を実証するものである。
糖ペプチドおよび糖タンパク質を含む、化学的に均一な複合糖質の製造は、極めて重要な挑戦である。文献:Bill, R.M.; Flitsch, S.L.; Chem. & Biol. 1996, 3, 145。これらの目的を達成するため、確立されたクローニングのアプローチの進展が意欲的に行われている。種々の発現系(細菌、酵母および細胞系統を含む)がこの目的に向けたアプローチを提供するが、前記のように不均一な糖タンパク質をもたらす。文献:Jenkins, N.ら, Nature Biotech. 1996, 14, 975。かくして化学合成が均一な形態にあるかかる2つのドメインからなる構築体への好ましい接近手段を示す。さらに、合成は、選択された糖形態がペプチド鎖の望ましいいずれの位置においても組み込まれる構築体の集合を可能とするものである。
主題の発明に先立ち、Kunz他により、液相および固相の双方において目的の均一系へ合成により接近することが可能となる、糖ペプチド合成法が開発された(文献:M. Meldal, Curr. Opin. Struct. Biol, 1994, 4, 710; M. Meldal, Neoglycoconjugates: Preparation and Applications,前記; S.J. Danishefsky; J.Y. Roberge, Glycopeptides and Related Compounds: Chemical Synthesis, Analysis and Applications, 1995, D.G. Large, C.D. Warren編, Marcel Dekker, New York; S.T. Cohen-Anisfeld and P.T. Lansbury, Jr., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10531; S.T. Anisfeld; P.T. Lansbury Jr. Org. Chem, 1990, 55, 5560; D. Vetterら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 1995, 34, 60-63). Cohen-AnisfeldおよびLansburyは、収斂溶液に基づく、選択されたすでに入手可能な糖類とペプチドとの結合を開示している。文献:S.T. Cohen-Anisfeld; P.T. Lansbury, Jr., J. Am. Chem. Soc.,前記。
このように、α-O-結合複合糖質の効果的な製造方法は、本発明に先行してはほとんど知られていない。文献:Nakahara, Y.ら, Synthetic Oligosaccharides, ACS Symp. Ser. 560, 1994, 249-266頁; Garg, H.G.ら, Adv. Carb. Chem. Biochem. 1994, 50, 277。ほとんどすべてのアプローチが、単糖段階でアミノ酸(セリンまたはトレオニン)を組み込むものであった。この構築の後にペプチジルおよび炭水化物ドメインの合成が漸次行われる。文献:Qui, D.; Koganty, R.R.; Tetrahedron Lett. 1997, 38, 45. Eloffson, M.ら, Tetrahedron 1997, 53, 369. Meinjohanns, E.ら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1996, 985. Wang, Z-G.ら、Carbohydr. Res. 1996, 295, 25. Szabo, L.ら, Carbohydr. Res. 1995, 274, 11.合成的な問題の範囲は当技術分野で十分公知であるが、ほとんど進展していない。本発明は、別の、より単純でよりよく収斂するアプローチを提供する(図2)。
文献:Toyokuniら, J.Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 395は、Tn発現糖タンパク質に対して免疫応答を惹起する効力を有する二量体Tn抗原-リポペプチド複合体を含んでなる合成ワクチンを製造した。しかしながら、本発明者らの研究の以前には、前立腺癌細胞の表面が、セリン残基ではなくトレオニンを介して結合したTnクラスターを含んでなる糖タンパク質を与えることは認識されていなかった。従って本発明は、予期されないほど高い抗癌効力を有するワクチンを提供する。
発明の概要
従って本発明の1つの目的は、糖ペプチドをはじめとする新規α-O-結合複合糖質および抗癌治療薬として有用な関連化合物を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、かかる複合糖質を製造する合成方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、本発明の製造方法によって得られる複合糖質のいずれかを、所望により医薬担体と組み合わせて含んでなる、癌患者の治療に有用な組成物を提供することにある。
本発明はまた、ヒトにおいて有効な免疫を惹起することができる完全合成炭水化物ワクチンを提供することを意図するものである。
本発明のさらなる目的は、本発明の製造方法によって得られる複合糖質のいずれかを、所望により医薬担体と組み合わせて用いて癌患者を治療する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
図1は、ムチン中に存在する場合のα-O-結合複合糖質の概略的構造を示している。
図2は、ムチン複合糖質への一般的な合成戦略を示している。
図3は、鍵となる中間体β-フェニルチオグリコシド11を製造するための合成経路を示している。反応条件:(a)(1)DMDO, CH2Cl2;(2)6-O-TIPS-ガラクタール, ZnCl2, -78℃ないし0℃;(3)Ac2O, Et3N, DMAP, 75%,(b)TBAF/AcOH/THT; 80%;(c)5(1.3当量), TMSOTf(0.1当量), THF:トルエン 1:1, -60℃ないし-45℃, 84%, α:β 4:1;(d)NaN3, CAN, CH3CN, -15℃, 60%;(e)LiBr, CH3CN, 75%;(f)(1)1PhSH, iPr2NEt, CH3CN,82% (2)CCl3CN, K2CO3, CH2Cl2, 80%;(g)(1)PhSH, iPr2NEt;(2)CIP(OEt2), iPr2NEt, THF,(不安定な化合物, 2段階で-72%);(h)(1)LiBr, CH3CN, 75%;(2)LiSPh, THF, 0℃, 70%)。
図4は、複合糖質ムチン1への合成経路を示している。
反応条件:(a)CH3COSH, 78%;(b)H2/10% Pd-C, MeOH, H2O,定量的;(c)H2N-Ala-Val-OBn, IIDQ, CH2Cl2, 85%;(d)KF, DMF, 18-クラウン-6, 95%;(e)15, IIDQ, 87%;(f)KF, DMF, 18-クラウン-6, 93%;(g)14, IIDQ,90%;(h)(1)KF, DMF,18-クラウン-6;(2)Ac2O, CH2Cl2;(i)H2/10% Pd-C, MeOH, H2O, 92%(3段階);(j)NaOH, H2O, 80%。
図5は、断片結合による複合糖質を製造する合成経路を示している。
試薬:(a)IIDQ, CH2Cl2, 室温, 80%;(b)H2/Pd-C, MeOH, H2O, 95%;(c)CF3COOH, CH2Cl2;(d)NaOH, H2O, MeOH。
図6は、ヨードスルホンアミノ化/4+2経路によるLeyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。
図7は、アジドニトロ化/4+2経路によるLeyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。
図8および9は、本発明の方法によって誘導された糖ペプチドの例を示している。
図10は、糖ペプチドSTNおよびT(TF)を製造する合成経路を示している。
図11は、糖ペプチド(2,3)STを製造する合成経路を示している。
図12は、糖ペプチドグリコホリンを製造する合成経路を示している。
図13は、糖ペプチド3-Leyおよび6-Leyを製造する合成経路を示している。
図14は、T抗原を製造する合成経路を示している。
図15は、T抗原のαクラスターを製造する合成経路を示している。
図16は、T抗原のβクラスターを製造する合成経路を示している。反応の順序は図15に示された通り。
図17、18および19は、Leyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。Rは図18に定義されている。
図20は、Tn三量体糖ペプチドのPamCysリポペプチドとの結合を示している;(B)新規ワクチン構築体の一般表示;(C)はPamCys Tn三量体。
図21では、(A)PamCys-Tn三量体の合成方法;(B)架橋結合を介するKLHとBSA複合体の製造方法(12,13)を示している。
図22では、(A)はムチンに関連するF1α抗原およびその製造方法のための逆合成的アプローチを;(B)は中間体5’および6’の製造方法を示している。条件:i)NaN3, CAN, CH3CN, -20℃,一晩, 40%, α(4a’);β(4b’)1:1; ii)PhSH, EtN(i-Pr)2, CH3, CN, 0℃, 1時間, 99.8%, iii)K2CO3, CCl3CN, CH2Cl2,室温, 5時間, 84%, 5a’:5b’1:5; iv)DAST, CH2Cl2, 0℃, 1時間, 93%, 6a’:6b’1:1。
図23は、中間体1’および2’の製造方法を示している。条件:i)TBAF, HOAc, THF,室温, 3d, 9’については収率100%, 10’については収率94%; ii)11’, BF3, Et2O, -30℃,一晩, iii)AcSH,ピリジン,室温,一晩, 11’の50%転化に基づき収率72%, 12’の48%転化に基づき収率58%(2段階); iv)80% HOAc水溶液,一晩,室温-40℃; v)Ac2O,ピリジン,室温,一晩; vi)10% Pd/C, H2, MeOH-H2O,室温, 4時間; vii)モルホリン, DMF,室温,一晩; viii)NaOMe, MeOH-THF,室温,一晩,1’については収率64%, 2’については収率72%(5段階)。
図24は、F1α抗原の合成における中間体の製造方法を示している。条件:i)(sym-コリジン)2ClO4, PhSO2NH2, 0℃; LiHMDS<EtSH, -40℃ないし室温, 2段階で収率88%; ii)MeOTf, DTBP, 0℃, 20’については収率86%およびα異性体の収率8%; 21’については収率85%およびα異性体の収率6%; iii)Na, NH3, 78℃; Ac2O2, Py,室温, 22’については2段階で59%; iv)NaN3, CAN, CH3CN, -20℃; v)PhSH, EtN(i-Pr)2; CCl3CN, K2CO3; 23’について, 3段階で2:7 α/βの収率17%;24’については3段階で3:1 α/βの収率30%; vi)LiBr, CH3CN, 25’についてはαのみ収率46%; vii)Ac2O, Py; Na-Hg, Na2HPO4, 2段階で収率94%, NaN3, CAN,収率26%, PhSH, EtN(i-Pr)2; K2CO3, CCl3CN, 2段階で収率53%(27’); viii)LiSPh, THF,収率60%,βのみ(26’)。
発明の詳細な説明
主題の発明は、癌の予防および治療に有用な、新規α−O-結合複合糖質を提供する。
本発明は、構造:
A-Bm-Cn-Dp-Eq-F
{式中、m、n、pおよびqは0、1、2または3であってm+n+p+q≦6であり;A、B、C、D、EおよびFは独立にアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基であり、AはNまたはO末端であり、Aがアミノアシルの場合には遊離アミンまたはアンモニウムの形態のいずれかであり、またはAがヒドロキシアシルの場合には遊離ヒドロキシであり、あるいはAはアルキル化、アリール化またはアシル化されており;Fは遊離カルボン酸、第1級カルボキシアミド、モノまたはジアルキルカルボキシアミド、モノまたはジアリールカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の(カルボキシ)アルキルカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の(アルコキシカルボニル)アルキル−カルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の(カルボキシ)アリールアルキルカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の(アルコキシカルボニル)アルキルカルボキシアミド、2ないし約20個のヒドロキシアシル残基を含んでなるオリゴエステル断片、2ないし約20個のアミノアシル残基を含んでなるペプチド断片、または直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールカルボン酸エステルのいずれかであり;1ないし約5個の当該アミノアシルまたはヒドロキシアシル残基は以下の構造を有する炭水化物ドメインで置換されており、
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に0、1、2または3であり;炭水化物ドメインはOH、COOHおよびNH2からなる群より選択される側鎖置換基の置換によってそれぞれアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基と結合しており;R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり;R’ 0 は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である}
を有する複合糖質を提供する。
ある具体例では、本発明は、少なくとも1つの炭水化物ドメインが細胞表面エピトープのオリゴ糖構造を有する、前記の複合糖質を提供する。特定の具体例では、本発明は、エピトープがLea、Leb、LexまたはLeyである複合糖質を提供する。もう1つの特定の具体例では、本発明は、エピトープがMBr1、末端切断型MBr1五糖類または末端切断型MBr1四糖類である場合糖質を提供する。
もう1つの具体例では、本発明は、アミノアシル残基が天然のアミノ酸に由来する複合糖質を提供する。もう1つの具体例では、本発明は、少なくとも1つのアミノアシル残基が式:-NH-Ar-CO-を有する複合糖質を提供する。特殊な具体例では、Ar部分はp-フェニレンである。
もう1つ具体例では、本発明は、少なくとも1つのアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基が構造:
{式中、M、NおよびPは独立に0、1または2であり;XはNHまたはOであり;YはOH、NHまたはCOOHであり;R’およびR”は独立に水素、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールである}を有する複合糖質を提供する。特殊な具体例では、炭水化物ドメインと結合したアミノアシル残基はSerまたはThrである。
もう1つの具体例では、本発明は、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14およびR15の1以上が1RS,2RS,3-トリヒドロキシ-プロピルである複合糖質を提供する。
本発明はまた、前記の複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、治療上有効量の前記複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。本治療方法は癌が固形腫瘍または上皮癌である場合に効果的である。
本発明はまた、構造:
{式中、R1、R3、R4、R5、R6およびR7はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、N3、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;RiはH、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R2は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R8は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;Riiは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;かつ、Xはハロゲン化物、トリハロアセトアミデート、アルキルもしくはアリールスルフィドまたはジアルキル亜リン酸塩である}を有する三糖類を提供する。好ましい具体例では、本発明は、Xがトリエチル亜リン酸塩である前記の三糖類を提供する。本発明はさらに、R7が1RS,2RS,3-トリヒドロキシプロピルまたは1RS,2RS,3-トリアセトキシプロピルである三糖類を提供する。さらに本発明は、R8がCOOHである三糖類を提供する。
本発明はまた、構造:
{式中、R1、R3、R4、R5、R6およびR7はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、N3、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;RiはH、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R2は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R8は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;Riiは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R0は塩基に不安定なN保護基であり;かつ、R’は水素または低級アルキル基である}を有する三糖類アミノ酸を提供する。種々のN保護基が、前記の三糖類アミノ酸の製造に許容される。R0は、好ましくは数種の塩基に影響を受けやすい保護基の1つであってよいが、さらに好ましくはフルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)であってもよい。
本発明は、ヒト患者において抗体を誘導する方法を提供し、抗体はヒト腫瘍細胞と特異的に結合することができ、それは抗体を誘導するために効果的な本明細書中に開示された複合糖質の一定量を患者に投与することを含んでなる。ある具体例では、本発明は、複合糖質が好適な担体タンパク質と結合している、抗体誘導法を提供する。特に、担体タンパク質の好ましい例としては、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHが挙げられる。
もう1つの具体例では、本発明は、さらに免疫アジュバントをともに投与することを含む、抗体誘導法を考案する。ある具体例では、アジュバントは細菌またはリポソームである。特に、好ましいアジュバントとしては、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21が挙げられる。誘導される抗体は典型的には、(2,6)-シアリルT抗原、Lea、Leb、Lex、Ley、GM1、SSEA-3およびMBr1抗体からなる群より選択される。抗体を誘導する方法は、患者が臨床上緩解にある場合、または患者が外科手術によって処置され、限定された切除できない疾患を有している場合に有用である。
本発明はまた、抗体を誘導するために有効な量の前記複合糖質を用いて患者にワクチン接種することを含んでなる、患者における上皮癌の再発を予防する方法を提供する。この方法を実施する際には、複合糖質を単独で使用してもよいし、または好適な担体タンパク質と結合させてもよい。本発明に用いられる担体タンパク質の特異な例としては、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHが挙げられる。ある具体例では、上皮癌の再発を予防する本方法には、免疫アジュバントをともに投与するさらなる工程が含まれる。特に、アジュバントは細菌またはリポソームである。好ましいアジュバントとしては、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21が挙げられる。本方法によって誘導される抗体は典型的には、(2,6)-シアリルT抗原、Lea、Leb、Lex、Ley、GM1、SSEA-3およびMBr1抗体からなる群より選択される。
本発明はさらに、構造:
{式中、XはOまたはNRであり;RはH、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアシルであり;A、BおよびCは独立に、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアシル、-CO-(CH2)p-OHまたはアリールであり、あるいは下記構造を有し、
式中、YはOまたはNRであり;DおよびEは構造:-(CH 2 ) p OHまたは-CO(CH 2 ) p OHを有し;nおよびpは独立に、0ないし12の整数であり;DおよびE、ならびにA、BおよびCは、これらのいずれか1つが-CO(CH 2 ) p OHである場合には、独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインによって置換されており、
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり;炭水化物ドメインは末端OH置換基の置換によってそれぞれのヒドロキシアシル残基と結合し;Roは水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり;R’ 0 は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である}を有する複合糖質を提供する。ある具体例では、本発明は、少なくとも1つの炭水化物ドメインが細胞表面エピトープのオリゴ糖構造を有している、前記の複合糖質を提供する。1つの具体例では、エピトープはLea、Leb、LexまたはLeyである。もう1つの具体例では、エピトープはMBr1、末端切断型MBr1五糖類または末端切断型MBr1四糖類である。特定の具体例では、本発明は、1つ以上のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14およびR15が1RS,2RS,3-トリヒドロキシ-プロピルである前記複合糖質を提供する。
本発明はまた、前記の複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、治療上有効量の前記の複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。本方法は癌が固形腫瘍または上皮癌である場合に効果的である。
本発明はまた、コア構造および炭水化物ドメインを含んでなる複合糖質であって、そのコア構造が、
{式中、Mは約2ないし約5,000の整数であり;Nは1、2、3または4であり;AおよびBは直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基を含む、好適な重合体の末端基であり;コア構造は、下記構造を有する炭水化物ドメインによって置換されており、
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり;炭水化物ドメインはOH置換基の置換によってコア構造と結合し;R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり;R’ 0 は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である}である複合糖質を提供する。
特殊な具体例では、本発明は、細胞表面糖タンパク質のムチンファミリーに関連する糖ペプチドを製造する方法を提供する。ムチンは、セリンおよびトレオニン残基にα-O-結合した炭水化物のクラスター配列を有する異常なα-O-グリコシデーションパターンによって特徴づけられている。図1。ムチンは上皮癌(例えば、前立腺癌および乳癌)ならびにある血液細胞癌の一般的マーカーである。文献:Finn,O.J.ら,Immunol.Rev.1995,145,61.
(2,6)-シアリルT抗原(ST抗原)は、α-O-結合糖ペプチドの「グリコホリンファミリー」の例である(図2)。それは骨髄性白血病細胞で選択的に発現する。文献:Fukuda,M.ら,J.Biol.Chem.1986,261,12796.Saitoh,O.ら,Cancer Res.1991,51,2854.従って、特殊な具体例では、本発明は、CD43(ロイコシアリン)糖タンパク質のN末端に由来する、ペンタペプチド1への合成経路を提供する。文献:Pallant,A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,1328.
特に、本発明は、ブロックアプローチによるα-O-結合(2,6)-STグリコシルセリンおよびトレオニンの立体選択的製剤を提供する。さらに本発明は、STエピトープクラスター(1,20)を有するかかるグリコシル単位を組み込むO-結合糖ペプチドを提供する。
広範囲の炭水化物ドメインが、本発明によって考案されている。特に記載すれば、以下の細胞表面エピトープおよび抗原に由来する炭水化物ドメインがある:MBr1エピトープ;
Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glu→Ocer末端切断型
MBr1エピトープ五糖類:Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Gala1→4Galβ1末端切断型MBr1エピトープ四糖類:Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1SSEA-3抗原:2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1Leyエピトープ:
Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GalNAcβ1GM1エピトー
プ:Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4(NeuAcα2→3)Glu→Ocer
固相方式に基づく炭水化物ドメインの製造方法は、米国特許第5,543,505号および同第5,708,163号、ならびにPCT国際出願第PCT/US96/10229号に開示されており、それらの内容は出典明示して本明細書の一部とみなす。
本発明はまた、構造:
{式中、m、nおよびpは役8ないし約20の整数であり;qは約1ないし約8の整数であり;RV、RW、RXおよびRYは独立に、水素、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、あるいは所望により置換されていてもよいフェニルであり;RA、RBおよびRCは独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインであり、
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり;R0は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;Riは水素、CHO、COORii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり;R’ 0 は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリール基であり;Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立に、水素、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基である}を有する複合糖質を提供する。ある具体例では、本発明は、RV、RW、RXおよびRYがメチルである複合糖質を提供する。
ある他の具体例では、炭化水素ドメインは独立に、単糖類または二糖類であってもよい。1つの具体例では、本発明は、yおよびzが0であり;xが1であり;かつ、R3がNHAcである複合糖質を提供する。もう1つの具体例では、本発明は、hが0であり;gおよびiが1であり;R7がOHであり;R0が水素であり;かつ、R8がヒドロキシメチルである複合糖質を提供する。さらにもう1つの具体例では、m、nおよびpは14であり;かつ、qは3である。好ましい具体例では、複合糖質の各アミノアシル残基がその中にL-配置を有する。
特殊な例では、複合糖質の炭水化物ドメインは、独立に、
である。
もう1つの例では、炭水化物ドメインは、独立に、
である。
さらに、炭水化物ドメインは、独立に、
である。
炭水化物ドメインはまた、独立に、
である。
炭水化物ドメインは、独立に、
である。
また、炭水化物ドメインは、独立に、
であってもよい。
炭水化物ドメインはまた、独立に、
である。
本発明は、構造:
{式中、担体はタンパク質であり;架橋剤は担体およびチオールの表面アミンと結合することができる架橋剤に由来する部分であり;m、nおよびpは約8ないし約20の整数であり;jおよびqは独立に、約1ないし約8の整数であり;RV、RW、RXおよびRYは独立に、水素、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、あるいは所望により置換されていてもよいフェニルであり;RA、RBおよびRCは独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインであり、
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり;R0は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;Riは水素、CHO、COORii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり;R’ 0 は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリール基であり;Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立に、水素、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基である}を有する複合糖質を提供する。
種々のタンパク質が好適であると考えられ、ウシ血清アルブミン、KLH、およびヒト血清アルブミンが含まれる。本発明に適する架橋剤は当技術分野において広く知られており、ブロモ酢酸NHSエステル、6-(ヨードアセトアミド)カプロン酸NHSエステル、マレイミド酢酸NHSエステル、マレイミド安息香酸NHSエステルなどが含まれる。1つの具体例では、複合糖質は、構造:
を有する。
1つの具体例では、本発明は、Rv、RW、RXおよびRYがメチルである複合糖質を提供する。もう1つの具体例では、本発明は、炭水化物ドメインが単糖類または二糖類である複合糖質を提供する。もう1つの具体例では、本発明は、yおよびzが0であり;xが1であり;R3がNHAcである複合糖質を提供する。さらなる具体例では、本発明は、hが0であり;gおよびiが1であり;R7がOHであり;R0が水素であり;m、nおよびpが14であり;qが3であり;かつ、R8がヒドロキシメチルである複合糖質を提供する。
ある具体例では、本発明は、タンパク質がBSAまたはKLHである、開示されたような複合糖質を提供する。好ましい具体例では、複合糖質のそれぞれのアミノアシル残基はL-配置を有する。
複合糖質の特殊な例には、以下の炭水化物ドメインのいずれもが含まれ、それはいずれの具体例においても同一であっても異なっていてもよい。
本発明はさらに、前記で開示した複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はまた、治療上有効量の前記で開示した複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。ある具体例では、本発明は癌が固形癌である場合の方法を提供する。特に明示すれば、本方法は癌が上皮癌である場合に適用できる。特に、前立腺癌の治療への適用が効果的である。
本発明はまた、抗体を誘導するのに効果的な前記で開示した複合糖質の一定量を患者に投与することを含んでなる、ヒト患者において抗体を誘導する方法を提供し、ここで抗体はヒト腫瘍細胞と特異的に結合できる。ある具体例では、本発明は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである方法を提供する。
さらに本発明は、免疫アジュバントをともに投与することをさらに含んでなる、関連の抗体誘導法を提供する。アジュバントは、好ましくは細菌またはリポソームである。特に、アジュバントは、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21である。誘導される抗体は好ましくは、Tn、STN、(2,3)ST、グリコホリン、3-Lyy、6-Ley、T(TF)およびT抗体からなる群より選択される。
本発明はさらに、患者が臨床上緩解にある場合に、または患者が外科手術により処置され、限定された切除できない疾病を有している場合に抗体を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、抗体を誘導するのに効果的な量で前記で開示した複合糖質を用いて患者にワクチン接種することを含んでなる、患者における上皮癌の再発を予防する方法を提供する。担体タンパク質がウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである本方法が実施され得る。さらに本発明は、免疫アジュバントをともに投与することをさらに含んでなる、関連の上皮癌再発予防方法を提供する。好ましくは、アジュバントは細菌またはリポソームである。特に明示すれば、好ましいアジュバントは、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21である。本方法の実施において誘導される抗体は、Tn、STN、(2,3)ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T(TF)およびT抗体からなる群より選択される。
本発明はまた、保護されたO-結合Ley複合糖質を形成するのに好適な条件下で、構造:
{式中、Rは水素、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいアリールであり;R1はt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチレンオキシカルボニル、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールであり;R2は直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールである}を有する保護されたO-結合Ley複合糖質を製造する方法であって、該方法は構造:
(式中、R3は直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールであり、かつ、R 4 は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいアリールまたはベンジルであり、あるいは所望により置換されていてもよいアリールスルホニルである)を有する硫化四糖類と、構造:
を有するO-結合グリコシルアミノアシル成分を結合させることを含んでなる、方法を提供する。
本発明の1つの具体例においては、前記の硫化四糖類は、(a)ハロスルホンアミノ化四糖類を形成するのに好適な条件下で、構造:
を有する四糖類グリカールをハロスルホンアミノ化し、次いで(b)メルカプタンおよび硫化四糖類を形成するのに好適な塩基で、ハロスルホンアミノ化物を処理することによって製造してもよい。特に、メルカプタンが直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールであり;かつ、塩基が水素化ナトリウム、水素化リチウム、水素化カリウム、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、またはリチウムヘキサメチルジシラジドである本方法が実施され得る。
本発明はまた、開示された方法によって製造されたO-結合複合糖質を提供する。
特に、本発明は、構造:
{式中、R4は直鎖または分枝鎖の低級アシルであり;かつ、Rは水素、あるいは直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールである}を有するO-結合複合糖質を提供する。糖ペプチドのペプチド部分の変更は本発明の範囲内である。特殊な具体例では、本発明は、R4がアセチルであるO-結合糖ペプチドを提供する。
本発明は、保護されたO-結合Ley複合糖質を形成するのに好適な条件下で、構造:
{式中、Rは水素、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいアリールであり;R1はt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチレンオキシカルボニル、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールであり;かつ、R2は直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールである}を有する保護されたO-結合Ley複合糖質を製造する方法であって、該方法は構造:
を有するアジドイミノ化四糖類と、構造:
を有するO-結合グリコシルアミノアシル成分を結合させることを含んでなる方法を提供する。
好ましくは、アジゾイミノ化四糖類は、(a)アジドアルコールを形成するのに好適な条件下で、構造:
を有するアジドニトロ化四糖類を処理し、次いで(b)アジゾイミノ化物を形成するのに好適な条件下で、アジドアルコールをイミドアシル化剤と反応させることにより製造する。アジドニトロ化四糖類は、(a)好適な条件下で、構造:
を有する四糖類グリカールを、構造:
を有する過アセチル化四糖類グリカールに変換し、次いで(b)アジドニトロ化四糖類を形成するのに好適な条件下で、工程(a)で生じたグリカールをアジドニトロ化することにより製造してもよい。工程(b)は好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化リチウム、アジ化カリウム、アジ化テトラメチルアンモニウムおよびアジ化テトラエチルアンモニウムからなる群より選択されるアジ化塩の存在下で、ニトロ化セリウムアンモニウムを用いて達成される。
さらに本発明は、前記した通りに製造したO-結合複合糖質を提供する。
一旦、O-保持アミノアシル側鎖と共有結合した炭水化物ドメインを製造すれば、主題の発明の複合糖質は、液相または固相合成プロトコールのいずれかを用いて製造してもよく、それら双方は簡単なペプチドを合成する技術分野では十分に公知である。他の方法の中で、本発明において有用な広く用いられている液相ペプチド合成法は、FMOC保護基を除去するための、α-アミノ置換基;アンモニア、第1級または第2級アミン(モルホリンなど)に対する保護基としてのFMOC(または関連するカルバミン酸塩)、および好適な有機溶媒中でペプチドまたはペプチド誘導体のCからNへの合成用カップリング剤としての置換カルボジイミド(N,N’-ジシクロヘキシル-または-ジイソプロピルカルボジイミドなど)を使用する。NからC方向でのO-結合複合糖質の液相および固相合成もまた、本発明の範囲内である。
固相合成については、数種の異なる樹脂支持体が当分野で標準として採用されている。オリジナルのMerrifieldのクロロメチル化ポリスチレンの他にも、他の種の樹脂がペプチドアミドおよび酸を製造するために広く用いられており、ベンズヒドリルアミンおよびヒドロキシメチル樹脂(文献:Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., 1984, Rockford, IL; Piettaら, J. Chem. Soc. D., 1970, 650-651; Orlowskiら, J. Org. Chem., 1976, 50, 3701-5; Matsuedaら, Peptides, 1981, 2, 45-50; およびTam, J. Org. Chem., 1985, 50, 5291-8)ならびに官能化ポリスチレンでグラフトした重合体基質からなる樹脂(米国特許第5,258,454号)が含まれる。これらの固相は酸に不安定である(文献:Albericioら, Int. J. Peptide Research. 1987, 30, 206-216)。本発明を実施する際に容易に利用できる別の酸に不安定な樹脂は、FMOCで保護したアミノ酸との結合におけるトリアルコキシジ-フェニルメチルエステル部分を使用する(文献:Rink, Tetrahedron Letters, 1987, 28, 3787-90; 米国特許第4,859,736号および米国特許第5,004,781号)。ペプチドは結局、トリフルオロ酢酸での切断によって放出される。酸に不安定なN保護基であれ塩基の影響を受けやすいN保護基であれ、本発明の方法の特定の樹脂プロトコールへの適用には適合する保護基の選択が含まれ、それは化学分野の当業者の技術の範囲内である。
本明細書に開示されたように製造された複合糖質は、種々の形態の癌の治療および予防において有用である。従って、本発明は、治療上有効量の本明細書に開示されたα-O-結合複合糖質のいずれかを、所望により医薬上好適な担体と組み合わせて患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。癌が固形癌または上皮癌、または白血病である場合に、本方法を適用してもよい。特に、癌が乳癌であり、適切なエピトープがMBr1である場合に、本方法を適用できる。
主題の発明はまた、有効成分として前記で開示したα-O-結合複合糖質のいずれかを、所望によるが典型的には、医薬上好適な担体と組み合わせて含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、他の治療上有効な成分をさらに含んでなってもよい。
主題の発明はさらに、前記α-O-結合複合糖質のいずれかの治療上有効量と、医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。
α-O-結合複合糖質に関連する前記で教示された化合物は、in vivoおよびin vitroの双方での癌の治療に有用である。これらの化合物が組織培養において癌細胞の増殖を阻害し、腫瘍の大きさを小さくすることができることは、本化合物が癌患者において癌を治療、予防または改善するために有用であることを示す。
さらに、本明細書に開示された方法によって製造された複合糖質は、アジュバント治療において種々の上皮癌および白血病細胞で抗体を免疫反応性とすることができるワクチンとして有用な抗原である。かかるアジュバント治療によって、上皮癌および白血病の再発率を小さくし、外科手術後の生存率を上昇させる可能性がある。癌を外科的に処置した患者に、次いで免疫化に先立って抗体を欠く患者において見出された細胞表面分化抗原から作成したワクチンで処置する臨床上の試みで、無病間隔が極めて著しく長くなることが認められる可能性がある。文献:P.O. Livingstonら, J. Clin. Oncol., 1994, 12, 1036を参照。
本発明の化合物の治療用量は、治療すべき病状の性質および重篤さにより、また特定の化合物およびその投与経路により異なると考えられる。一般に、抗癌活性に対する1日用量範囲は、1回または複用量で、哺乳類の体重の0.001ないし25mg/kg、好ましくは0.001ないし10mg/kg、最も好ましくは0.001ないし1.0mg/kgの範囲内である。特殊な場合には、25mg/kgより多い量を投与する必要があるかも知れない。
本明細書で開示された化合物の有効用量を、哺乳類、特にヒトに与えるには、いずれの好適な投与経路を使用してもよい。例えば、経口、直腸、局所、非経口、目、肺、鼻などの経路を使用してもよい。投与形態としては、錠剤、トローチ剤、分散液、懸濁液、水剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エアゾル剤などが挙げられる。
組成物には、経口、直腸、局所(経皮装置、エアゾル、クリーム、軟膏、ローションおよび散剤を含む)、非経口(皮下、筋肉内および静脈内を含む)、目(眼)、肺(鼻または口腔内吸入)または鼻腔投与に好適な組成物が含まれる。所定の場合のいずれかにおいて最も好適な経路は、治療すべき病状の性質および重篤さならびに有効成分の性質に依存するところが大きい。便宜にはそれらを単位投与形で提供してもよく、製薬分野で十分公知のいずれの方法によって調製してもよい。
経口投与形態を調製する際、経口液体製剤(例えば、懸濁液、エリキシル剤および水剤)の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤などの通常でない薬剤媒体を用いてもよく;また、散剤、カプセル剤および錠剤などの経口固形製剤の方が、液体経口製剤よりも好ましい場合には、デンプン、糖類、微晶質セルロース、賦形剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など担体のような特殊な医薬媒質を使用してもよい。所望であれば、カプセルを標準的な水性または非水性法によって被覆してもよい。前記の投与形態に加えて、本発明の化合物を徐放手段および装置によって投与してもよい。
経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、所定量の有効成分を粉末または顆粒形態でそれぞれ含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤、あるいは溶液、または水溶液もしくは非水溶液中の懸濁液、または油中水型もしくは水中油型エマルションのような個別単位として調製してもよい。かかる組成物は製薬分野で公知のいずれの方法によって調製してもよい。一般に、組成物は有効成分を、液体担体、細かく砕いた固形担体、またはその双方と均一かつ十分に混合することにより調製し、次いで必要であれば生成物を成形して所望の形態にする。例えば、錠剤は、所望により1以上の補助成分とともに圧縮または成形することにより調製してもよい。圧縮錠剤は、所望により結合剤、滑沢剤、不活性賦形剤または界面活性剤もしくは分散剤と混合した粉末または細粒などのさらさらした形態の有効成分を好適な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠剤は、不活性な液体賦形剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することにより製造してもよい。
本発明は、以下の実験の詳細からさらに理解されるであろう。しかしながら、当業者ならば、議論された特異な方法および結果がその後に続く請求の範囲に記載されている発明の単なる例示であることが容易に理解できるであろう。α-O-結合複合糖質を調製するための本発明の方法は当技術分野で公知の種々の代替保護基の使用を包含することが理解されるであろう。下記実施例を含む開示の中で用いられた保護基は単なる例示である。
実験の詳細:一般法
空気および湿気の影響を受けやすい反応は、特に断らない限り、アルゴン雰囲気下で火炎乾燥した装置で実施した。空気に影響を受けやすい液体および溶液はシリンジまたはカニューレで移した。可能な限り、反応は、薄層クロマトグラフィー(TLC)で監視した。大まかな溶媒除去は、”Buchi”式ロータリーエバポレータにおいて吸引真空下の真空中で行い、痕跡溶媒は高真空ポンプにより0.1-0.5mmHgで除去した。
融点(mp)は補正せず、”Electro thermal”シリーズIA9100デジタル融点装置を用いて軟質ガラス製の毛細管中で行った。赤外線(IR)は、”Perkin-Elmer 1600”シリーズフーリエ変換装置を用いて記録した。特に断らない限り、サンプルは、NaClプレート上のニートの膜として調製した。吸収バンドは波数(cm1)で報告する。適切なで妥当なバンドのみを報告する。
プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトルは、”Bruker AMX-400”型分光計を用いて400MHzを用いて測定した。化学シフトは、ロック標準(δ=7.25ppm)として残留CHCl3を用い、テトラメチルシラン(TMS;δ=0ppm)からの100万分の1(ppm)の低磁場で報告する。多重度は通常の様式で、s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線、br=幅広して略記する。炭素核磁気共鳴(13C NMR)スペクトルは、”Bruker AMX-400”型分光計にて、合成パルスデカップリングにより100MHzで行った。サンプルは1H NMRスペクトルの場合と同様に調製し、化学シフトはTMS(0ppm)と比較して報告し、残留CHCl3は内部標準(δ=77.0ppm)として用いた。高分解能質量スペクトル(HRMS)分析は、内部標準としてペルフルオロケロセン(PFK)を用い、”JEOL JMS-DX 303HF”型質量分析計にて電子衝撃イオン化(EI)により測定した。低分解能質量スペクトル(MS)は、”Delsi-Nermag R-10-10”型質量分析計にて、指示されたキャリヤーガス(アンモニアまたはメタン)を用い、電子衝撃イオン化(EI)または化学イオン化(CI)のいずれかによって測定した。ガスクロマトグラフィー/質量スペクトル(GCMS)については、キャリヤーガスとしてのヘリウムとともに、DB-5接合毛細管カラム(30m, 厚さ0.25mm)を使用した。典型的な条件としては、40℃/分で60ないし250℃の温度プログラムを使用した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、プレコートガラスプレート(シリカゲル60、厚さ0.25mm)を用いて行った。視覚化は、254nm UVランプを照射することにより、またはアニスアルデヒド染料(3.5mLの酢酸、12.5mLの濃硫酸および338mLの95%エタノール(EtOH)中の9.2mLのp-アニスアルデヒド)中に浸漬し、加熱して発色させることにより行った。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーは、標準プロトコールに従って行った。
特に断らない限り、すべての溶媒および試薬は市販の等級であり、以下、括弧内に挙げた乾燥方法を用いてアルゴン下で溶媒を蒸留することを示した場合以外は、受け取ったまま使用した:CH2Cl2(CaH2);ベンゼン(CaH2);THF(Na/ケチル);Et2O(Na/ケチル);ジイソプロピルアミン(CaH2)。
略号
TLC 薄層クロマトグラフィー
EtOAc 酢酸エチル
TIPS トリイソプロピルシリル
PMB p-メトキシベンジル
Bn ベンジル
Ac 酢酸塩
hex ヘキサン
THF テトラヒドロフラン
coll コリジン
LiHMDS リチウムヘキサメチルジシラジド
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DMAP 2-ジメチルアミノピリジン
DDQ 2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノリン
TBAF テトラ-n-ブチルアンモニウムフロリド
M.S. モレキュラーシーブス
r.t. 室温
r.b. 丸底フラスコ
実施例1
2,6−ジ−O−アセチル−3,4−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル−(1−3)−6−O−(トリイソプロピルシリル)−4−O−アセチル−ガラクタール(3)。
ガラクタール2(1.959g,9.89mmol,1.2当量)を100mLの無水ジクロロメタンに溶解し、0℃に冷却した。ジメチルジオキシラン(アセトン中約0.06M溶液、200mL)をカニュレを経由して反応フラスコに添加した。1時間後、出発原料が消費されたことをTLCで確認した。溶媒を窒素気流によって除去し、粗エポキシドを真空下、1時間室温で乾燥した。粗残さ(TLCでは1つのスポット)を33mLのTHFに取り込み、20mLのTHF中の6−O−トリイソプロピル−ガラクタールアクセプタ(2.50g,8.24mmol)を添加した。反応混合物を−78℃に冷却し、ZnCl2(9.8mLのエーテル中の1M溶液)を滴下した。反応混合物をゆっくりと室温まで昇温し、一昼夜撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次いで食塩水で洗浄し、最後に硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒蒸発後、粗材料をフラッシュクロマトグラフィー(40−45−50−60%酢酸エチル/ヘキサン)で精製すると、直ちにアセチル化される純粋な生成物が得られた。3.36gを乾燥したジクロロメタン、50mLに溶解し、トリエチルアミン(19.2mL)、触媒量のDMAP(約20mg)を添加し、溶液を0℃に冷却した。無水酢酸(9.9mL)を0℃で滴下した。反応混合物を一昼夜、室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗材料をクロマトグラフにかける(50%酢酸エチル/ヘキサン)と、グリカール3(3.3g,75%)が得られた:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.42(d,J=6.3Hz,1H,H−1,グリカール),4.35(1/2AB,dd,J=6.8Hz,11.5Hz,1H,H−6’a),4.28(1/2AB,dd,J=6.1,11.5Hz,1H,H−6’b)。
実施例2
2,6−ジ−O−アセチル−3,4−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル−(1−3)−4−O−アセチル−ガラクタール(4)。
化合物3(1.5g,2.43mmol)を24mLのTHFに溶解し、0℃に冷却した。TBAF(5.8mL,5.83mmol,2.4当量)と酢酸(336mL,2.4当量)の混合物を0℃で先の混合物に添加した。反応混合物を30℃で5時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄し、次いで、硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物をクロマトグラフィー(80−85−90%酢酸エチル/ヘキサン)で精製すると、化合物4が得られた(0.9g,80%):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.38(dd,J=1.8,6.3Hz,1H,H−1,グリカール),5.39(m,1H,H−4),2.22(s,3H,アセテート),2.16(s,3H,アセテート),2.13(s,3H,アセテート)。
実施例3
[(メチル=5−アセタミド−4,7,8,9−O−アセチル−3,5−ジデオキシ−O−グリセロ−α−D−ガラクト−2−ノヌロピラノシロナート)−(2−6)]−(2,6−ジ−O−アセチル−3,4−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル)−(1−3)−4−O−アセチル−ガラクタール(6)。
火炎乾燥したフラスコに、シアリルホスファイトドナー5(69mg,0.11mmol,1.3当量)とアクセプタ4(40mg,0.085mmol)を、ドライボックス(アルゴン雰囲気)中で充填した。混合物を0.6mLの乾燥THFに溶解した。0.6mLの乾燥トルエンを添加し、溶液をゆっくり−60℃まで冷却し、沈殿を避けた。トリメチルシリル=トリフラート(2.4μL,0.11当量)を添加し、混合物を−45℃で撹拌した。2時間後(TLCで反応完了確認後)、−45℃で、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、2mLで反応を止め、水が溶解するまで昇温し、混合物を過剰の酢酸エチルに注いだ。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物の1H NMRから、α:β異性体が4:1の比率であることが判明した(66.4mg,84%)。混合物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー(2−2.5−3−3.5−4%(メタノール/ジクロロメタン)で精製すると、化合物6(50mg,63%収率)が得られた。
実施例4
アジノニトラートのα/β混合物(7)。
化合物6(370mg,0.396mmol)を2.2mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、溶液を−20℃に冷却した。アジドナトリウム(NaN3,38.6mg,0.594,1.5当量)とセリウム=アンモニウム=ニトラート(CAN,651.3,1.188mmol,3当量)を添加し、混合物を激しく−15℃で12時間撹拌した。不均一混合物を酢酸エチルで希釈し、2回、氷水で洗浄して、硫酸ナトリウムで乾燥すると、400mgの粗性生物が得られた。フラッシュクロマトグラフィーで精製すると、混合物7(246mg,60%収率)が得られた:
実施例5
α−アジドブロミド(8)。
化合物7(150mg,0.145mmol)の0.6mLの乾燥アセトニトリル中の溶液を、臭化リチウム(62.7mg,0.725mmol,5当量)と混合し、暗所で室温で3時間撹拌した。不均一混合物をジクロロメタンで希釈し、2回、水で洗浄して、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を加熱することなく蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー(5%メタノール,ジクロロメタン)で精製すると、α−ブロミド8(120mg,75%収率)が単離され、−80℃のアルゴン雰囲気下で保存した:
実施例6
アジド−トリクロロアセタミダート(9)。
化合物7(600mg,0.578mmol)を3.6mLのアセトニトリルに溶解し、溶液をチオフェノール(180μL)とジイソプロピルエチルアミン(100μL)で処理した。10分後、溶媒を窒素気流で除去した。粗性生物をクロマトグラフィー(2−2.5−3−3.5%メタノール/ジクロロメタン)で精製すると、472mg(82%)の中間ヘミアセタールが得られた。60mg(0.06mmol)のこの中間体を200mLのジクロロメタンに取り込み、トリクロロアセトニトリル(60μL)と60mgの炭酸カリウムで処理した。6時間後、混合物をジクロロメタンで希釈し、溶液をピペットで除去し、過剰の炭酸カリウムをジクロロメタンで3回洗浄した。溶媒蒸発後、粗性生物をフラッシュクロマトグラフィー(5%メタノール/ジクロロメタン)で精製すると、9(53.2mg,64%収率(2工程),α/βアノマー1:1混合物)が得られた。アノマーをフラッシュクロマトグラフィーで、勾配溶媒系(85−90−95−100%酢酸エチル/ヘキサン)で分離可能である。
実施例7
グリコシルブロミド8を用いたAgClO4−プロモート化グリコシド化によるグリコシル−L−スレオニン13の調製。
火炎乾燥したフラスコに、銀パークロラート(27.3mg,2当量)と115mgの4Åモレキュラーシーブと、N−FMOC−L−スレオニンベンジルエステル(37.3mg,0.086mmol,1.2当量)を、ドライボックス中で充填した。0.72mLのジクロロメタンをフラスコに添加し、混合物を室温で10分間撹拌した。460μLジクロロメタン中のドナー8(76mg,0.072mmol)をゆっくり40分かけて添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。混合物を次いでジクロロメタンで希釈し、セライトでろ過した。沈殿をジクロロメタンで完全に洗浄し、ろ液を蒸発させて、粗材料をシリカゲルカラムで精製する(1−1.5−2−2.5%メタノール/ジクロロメタン)と、13(74mg,74%収率)が得られた。所望しないβ−アノマーは、粗材料の1H NMRおよびHPLC分析からは検出されなかった。
実施例8
グリコシル−L−セリン(12)。
トリクロロアセタミダート9を用いたBF3・OEt2プロモート化グリコシド化。
火炎乾燥したフラスコに、ドナー9(50mg,0.044mmol)、80mgの4Åモレキュラーシーブ、N−FMOC−L−セリンベンジルエステル(27.5mg,0.066mmol)を、ドライボックス中で充填した。0.6mLのTHFをフラスコに添加し、混合物を−30℃に冷却した。BF3・OEt2(2.8mL,0.022mmol,0.5当量)を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で撹拌した。3時間中で、混合物を−10℃まで昇温し、次いで酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で冷却したまま洗浄した。粗材料をシリカゲルカラムで精製する(2−2.5−3%メタノール/ジクロロメタン)と、12(40mg,66%収率)が4:1のα:β異性体比で得られた。純粋なα−アノマーは、フラッシュクロマトグラフィーで分離した(80−85−90−100%酢酸エチル/ヘキサン)。
実施例9
グリコシル−L−スレオニン(15)。
化合物13(47mg,33.42μmol)をチオール酢酸(3mL,3回蒸留)で27時間、室温で処理した。チオール酢酸を窒素気流で除去し、次いでトルエン蒸発(4回)した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(1.5−2−2.5−3−3.5%メタノール/ジクロロメタン)で精製すると、37mg(78%)の中間体が得られ、これを7.6mLのメタノールと0.5mLの水に直ちに溶解した。アルゴンで反応系を浄化した後、6.5mgのパラジウム触媒(10%Pd−C)を添加し、水素のバルーンを取り付けた。8時間後、水素をアルゴンによって除去し、触媒をろ紙で除去して、溶媒蒸発させると粗材料が得られた。フラッシュクロマトグラフィー(10%メタノール/ジクロロメタン)にかけると、純粋な化合物15(36mg,78%)が得られた:
実施例10
グリコシル−L−セリン(14)。
化合物14は、12から、以下の15の方法と同様にして80%の収率で得られた。
実施例11
ペプチドカップリングの一般方法:
グリコシルアミノ酸14または15(1当量)とフリーのアミノ基を有するペプチド(1.2当量)をジクロロメタン(22mL/1mmol)に溶解した。溶液を0℃に冷却し、IIDQ(1.15−1.3当量)を添加した(約20mLジクロロメタン中の1mg)。反応混合物を室温で8時間撹拌した。混合物を直接シリカゲルカラムに添加した。
実施例12
FMOC脱保護の一般方法:
サブストレート(36mLのDMF中1mmol)を無水DMFに溶解し、次いでKF(10当量)と18−クラウン−6エーテル(触媒量)を添加した。混合物を次いで室温で48時間撹拌した。DMFを真空中で除去し、次いでシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにふした。
実施例13
グリコペプチド(16)。
実施例14
グリコペプチド(1)。
実施例15
グリコペプチド(19)。
MS(EI)計算値(C178H249N15O94Na2)4146(M+2Na),実測値4147,負イオンモードから正確な分子量を確かめた;MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)から、質量4131,4163。
実施例16
グリコペプチド(20)。
MS(FAB)C119H193N15O70N 2975(M+Na)
実施例17
アジドニトラート(4’)の調製:
保護されたガラクタール3’(4.14g,12.1mmol)の−20℃の無水アセトニトリルの60mL中の溶液に、NaN3(1.18g,18.1mmol)とCAN(19.8g,36.2mmol)の混合物を添加した。反応混合物を−20℃で一昼夜、激しく撹拌した。次いで反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、冷水、次いで食塩水で洗浄した。最後に、溶液を無水の硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグラフィーで分離した。α及びβ異性体(4’)の混合物(2.17g,40%収率)が得られた。α異性体とβ異性体の比率は、1H NMRに基づくと、ほぼ1:1であった。
実施例18
トリクロロアセチミダート(5a’)および(5b’)の調製:
アジドニトラート(4’)の混合物(1.36g,3.04mmol)の0℃での無水アセトニトリル、10mL中の溶液に、ゆっくりと、ジイソプロピルエチルアミン(0.53mL,3.05mmol)とPhSH(0.94ml,9.13mmol)を順次、添加した。反応混合物を0℃で1時間撹拌し、次いで溶媒を真空下で室温で蒸発させた。残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ヘミアセタール(1.22g,99.8%収率)が得られた。このヘミアセタール(603mg,1.50mmol)の0℃での15mLの無水ジクロロメタン溶液に、炭酸カリウム(1.04g,7.50mmol)およびCCl3CN(1.50ml,15.02mmol)を添加した。反応混合物を室温で0℃で5時間撹拌した。懸濁液をセライトのパッドを通過させてろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。ろ液を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−トリクロロアセチミダート5a’(118mg,14%収率)、β−トリクロロアセチミダート5b’(572mg,70%収率)が得られ、ヘミアセタール(72mg)が回収された。
実施例19
グリコシルフルオリド6a’および6b’の調製:
先に調製したヘミアセタール(68.0mg,0.169mmol)の0℃での3mLの無水ジクロロメタン溶液に、DAST(134ml,1.02mmol)をゆっくりと添加した。反応混合物を0℃で1時間撹拌した。次いで、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で順次洗浄した。最後に、溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−フルオリド6a’(30.2mg,44%収率)およびβ−フルオリド6b’(33.7mg,49%収率)が得られた。
実施例20
保護されたセリン誘導体7’とのβ−トリクロロアセチミダート5b’のカップリング:
9a’および9b’の合成:
β−トリクロロアセチミダート5b’(52.3mg,0.096mmol)、セリン誘導体7’(44.0mg,0.105mmol)、および200mgの4Åモレキュラーシブの、−78℃での2mLの無水ジクロロメタンと2mLの無水ヘキサンとの混合物中の懸濁液に、TMSOTf(1.91μl,0.01mmol)の36μLのジクロロメタン溶液を添加した。反応混合物を−78℃で30分間撹拌し、次いで、3時間、室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止めた。懸濁液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物9a’(55mg,71%収率)およびβ−生成物9b’(22mg,29%収率)が得られた。
実施例21
TMSOTf(0.5当量)によってプロモートされたTHF中の保護されたセリン誘導体7’とのβ−トリクロロアセチミダート5b’のカップリング:
トリクロロアセチミダート5b’(14.4mg,0.027mmol)、セリン誘導体7’(16.7mg,0.040mmol)、および50mgの4Åモレキュラーシブの、−78℃での0.2mLの無水THF中の懸濁液に、TMSOTf(2.7μl,0.013mmol)の50μLのTHF溶液を添加した。反応混合物を−78℃で2時間撹拌し、トリエチルアミンで中性化した。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物9a’(18.5mg,86%収率)が得られた。
実施例22
TMSOTf(0.5当量)によってプロモートされたTHF中の保護されたセリン誘導体7’とのα−トリクロロアセチミダート5aのカップリング:
トリクロロアセチミダート5a’(12.3mg,0.023mmol)、セリン誘導体7’(14.1mg,0.034mmol)、および50mgの4Åモレキュラーシブの、−78℃での0.2mLの無水THF中の懸濁液に、TMSOTf(2.2μl,0.011mmol)の45μLのTHF溶液を添加した。反応混合物を−78℃で4時間撹拌し、トリエチルアミンで中性化した。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物9a’(11.8mg,66%収率)が得られた。
実施例23
保護されたスレオニン誘導体8とβ−トリクロロアセチミダート5b’のカップリング:
10a’および10b’の合成:
β−トリクロロアセチミダート5b’(50.6mg,0.093mmol)、スレオニン誘導体8’(44.0mg,0.102mmol)、および200mgの4Åモレキュラーシブの、−78℃での2mLの無水ジクロロメタンおよび2mLの無水ヘキサンの混合物中の懸濁液に、TMSOTf(1.85μl,0.009mmol)の35μLのジクロロメタン溶液を添加した。反応混合物を−78℃で半時間撹拌し、4時間室温に昇温した。反応をトリエチルアミンで止めた。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、スレオニン誘導体7’(28.0mg)、α−生成物10a’(22.0mg,29%収率)、及びβ−生成物10b’(3.0mg,4%収率)が得られた。
実施例24
(Cp)2ZrCl2−AgClO4によってプロモートされたジクロロメタン中の保護されたスレオニン誘導体8’とα−グリコシルフルオリド6a’のカップリング:
AgClO4(25.1mg,0.121mmol)、(Cp)2ZrCl2(17.8mg,0.06mmol)、および150mgの4Åモレキュラーシブの、−30℃での1mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、α−グリコシルフルオリド6a’(16.3mg,0.004mmol)およびスレオニン誘導体8’(19.2mg,0.045mmol)の4.0mLの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−30℃で6時間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。溶液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物10a’(24.8mg,75%収率)及びβ−生成物10b’(3.9mg,12%収率)が得られた。
実施例25
(Cp)2ZrCl2−AgClO4によってプロモートされたジクロロメタン中の保護されたスレオニン誘導体8’とβ−グリコシルフルオリド6b’のカップリング:
AgClO4(24.4mg,0.118mmol)、(Cp)2ZrCl2(17.2mg,0.059mmol)、および200mgの4Åモレキュラーシブの、−30℃での1mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、β−グリコシルフルオリド6b’(15.8mg,0.03918mmol)およびスレオニン誘導体8’(20.3mg,0.04702mmol)の4.0mLの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−30℃で10時間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物10a’(22.3mg,70%収率)及びβ−生成物10b’(3.9mg,12%収率)が得られた。
実施例26
9a’のシリル基の脱保護:
α−生成物9a’(15.0mg,0.01873mmol)の0℃での2mLのTHF溶液に、HOAc(56μl,0.978mmol)および1MのTBAF(240μl,0.240mmol)を添加した。反応を0℃で1時間行い、3日間、室温まで昇温した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望の生成物11’(12.4mg,100%収率)が得られた。11’:
実施例27
10a’のシリル基の脱保護:
α−生成物10a’(16.0mg,0.02mmol)の0℃での3mLのTHF溶液に、HOAc(67μl,1.18mmol)および1MのTBAF(300μl,0.3000mmol)を添加した。反応を0℃で1時間行い、次いで、3日間、室温まで昇温した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望の生成物12’(12.1mg,94%収率)が得られた。12’:
実施例28
化合物14’の調製:
トリクロロアセチミダート13’(332.0mg,0.435mmol)、アクセプター11’(140.2mg,0.218mmol)、および1.0gの4Åモレキュラーシブの、−30℃での4mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、BF3・Et2O(13.8μl,0.109mmol)の120μlの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−30℃で一昼夜撹拌し、次いで3時間室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止め、反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗の回収アクセプター11’(これはさらに化合物9a’に変換した)(87.0mg,0.109mmol)と粗カップリング生成物が得られ、カップリング生成物はピリジンおよびチオール酢酸によって化合物14’に還元された。粗カップリング生成物を1mLのピリジンおよび1mLのチオール酢酸に0℃で溶解した。反応混合物を一昼夜室温で撹拌した。溶媒を室温で真空下に蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物14’(99.6mg,72%収率、アクセプター11’の50%変換に基づく)が得られた。14’:
実施例29
化合物15’の調製:
トリクロロアセチミダート13’(305.0mg,0.3996mmol)、アクセプター12’(131.6mg,0.1998mmol)、および1.0gの4Åモレキュラーシブの、−30℃での4mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、BF3・Et2O(12.7μl,0.10mmol)の115μlの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−30℃で一昼夜撹拌し、次いで3時間室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止め、反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗の回収アクセプター12’(これはさらに化合物10a’に変換した)(85.0mg,0.104mmol)と粗カップリング生成物が得られ、カップリング生成物はピリジンおよびチオール酢酸によって化合物15’に還元された。粗カップリング生成物を1mLの無水ピリジンおよび1mLのチオール酢酸に0℃で溶解した。反応混合物を一昼夜室温で撹拌した。溶媒を室温で真空下に蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物15’(71.1mg,58%収率、アクセプター12’の48%変換に基づく)が得られた。15’:
実施例30
化合物1’の合成:
トリサッカリド14’(105.8mg,0.083mmol)を室温で、80%HOAc水溶液、5mLに溶解した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、次いで40℃で3時間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ジオール(93.0mg,91%収率)が得られた。このジオール(91.5mg,0.074mmol)の10mLの無水ジクロロメタンの0℃での溶液中に、触媒のDMAP(4.5mg,0.037mmol)、トリエチルアミン(103μl,0.74mmmol)およびAc2O(28μl,0.30mmol)を順次添加した。反応を室温で一昼夜行った。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化化合物(88.8mg,91%収率)が得られた。10%Pd/C(5.0mg)の1mLメタノール及び0.1mL水の混合物中の懸濁液に、過アセチル化化合物(38.5mg,0.03mmol)の4.0mLのメタノール溶液を添加した。反応を水素雰囲気下、室温で4時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのショートカラムに通し、触媒を除去して、メタノールで洗浄した。溶媒除去後、残さを1.5mLのDMFに溶解し、この溶液に0.5mLのモルホリンを0℃でゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。溶媒を真空下で除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、29.0mgの材料が得られ、これは、塩基性条件化で脱アセチル化した。この予め得られた材料を50mLの無水THFおよび5mLの無水メタノール中に溶解した。溶液を0℃に冷却し、NaOMe(14.0mg,0.26mmol)の5mL無水メタノール溶液を添加した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、50%HOAc水溶液で止めた。溶媒蒸発後、残さを逆相シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗生成物が得られ、これをさらに、”Sephadex LH-20”でゲルパーミエーションろ過して精製すると、最終生成物1’(15.1mg,77%収率)が得られた。
実施例31
化合物2’の合成:
トリサッカリド15’(70.2mg,0.054mmol)を室温で、80%HOAc水溶液、5mLに溶解した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、次いで40℃で3時間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ジオール(67.1mg,99%収率)が得られた。このジオール(65.1mg,0.052mmol)の8mLの無水ジクロロメタンの0℃での溶液中に、触媒のDMAP(3.2mg,0.026mmol)、トリエチルアミン(72μl,0.52mmol)およびAc2O(20μl,0.21mmol)を順次添加した。反応を室温で一昼夜行った。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化化合物(66.0mg,95%収率)が得られた。10%Pd/C(5.0mg)の1mLメタノール及び0.1mL水の混合物中の懸濁液に、過アセチル化化合物(22.1mg,0.017mmol)の4.0mLのメタノール溶液を添加した。反応混合物を水素雰囲気下、室温で4時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのショートカラムに通し、触媒を除去して、メタノールで洗浄した。溶媒除去後、残さを1.5mLのDMFに溶解し、この溶液に0.5mLのモルホリンを0℃でゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。溶媒を真空下で除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、29.0mgの材料が得られ、これは、塩基性条件化で脱アセチル化した。この予め得られた材料を50mLの無水THFおよび5mLの無水メタノール中に溶解した。溶液を0℃に冷却し、NaOMe(14.9mg,0.276mmol)の5mL無水メタノール溶液を添加した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、50%HOAc水溶液で止めた。溶媒蒸発後、残さを逆相シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗性生物が得られ、これをさらに、”Sephadex LH-20”でゲルパーミエーションろ過によって精製すると、最終生成物2’(8.4mg,74%収率)が得られた。
実施例32
チオグリコシド17’の調製:
過ベンジル化ラクタール16’(420mg,0.49mmol)および600mgの4Åモレキュラーシブの、5mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、ベンゼンスルホンアミド(116mg,0.74mmol)を室温で添加した。10分後、懸濁液を0℃に冷却し、I(sym−コリジン)2ClO4を一部添加した。15分後、溶液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。有機溶液をNa2S2O3、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、500mgのヨードスルホンアミダート誘導体(90%収率)が得られた。−40℃の、エタンチオール(150μl,1.98mmol)の4mLの無水DMF中の溶液に、LiHMDS(0.88ml,0.88mmol)溶液を添加した。15分後、ヨードスルホンアミダート(450mg,0.397mmol)の6mLの無水DMF中の溶液を、ゆっくりと室温で添加した。反応混合物を−40℃で4時間撹拌し、水で反応を止めた。水溶液を酢酸エチルで3回抽出し、合わせた有機層を水、食塩水で洗浄して、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望のチオグリコシド17’(350mg,83%収率)が得られ、ヨードスルホンアミダート(60mg)が回収された。
実施例33
トリサッカリド20’の調製:
丸底フラスコに、チオグリコシド17’(2.10g,1.97mmol)、アクセプター18’(964mg,2.95mmol)、ジ−t−ブチルピリジン(2.65ml,11.81mmol)および7.0gの4Åモレキュラーシブを入れた。混合物を10mLの無水ジクロロメタンおよび20mLの無水エチルエーテルに溶解した。溶液を0℃に冷却し、次いでMeOTf(1.11mL,8.85mmol)をゆっくりと添加した。反応混合物を0℃で一昼夜撹拌した。セライトにパッドでろ過し、有機相を水性ワークアップした。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、20α’(206mg,8%)および20β’(2.26g,86%)が得られた。
実施例34
トリサッカリド21’の調製:
丸底フラスコに、チオグリコシド17’(966mg,0.906mmol)、アクセプター19’(219mg,1.18mmol)、ジ−t−ブチルピリジン(1.22ml,5.44mmol)および2.5gの4Åモレキュラーシブを入れた。混合物を5mLの無水ジクロロメタンおよび10mLの無水エチルエーテルに溶解した。溶液を0℃に冷却し、次いでMeOTf(0.51mL,4.53mmol)をゆっくりと添加した。反応混合物を0℃で5時間撹拌した。セライトのパッドでろ過し、有機層を水性ワークアップした。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、21α’(59mg,6%)および21β’(910mg,84%)が得られた。
実施例35
トリサッカリド22’の調製:
火炎乾燥フラスコに、−78℃で30mLの無水アンモニアを凝縮させた。この液体アンモニアに、金属ナトリウム(320mg,13.95mmol)を一部入れた。15分後、ドライアイス−エタノール浴をはずし、暗青色溶液を20分間還流した。再度、−78℃に冷却し、トリサッカリド20’(619mg,0.47mmol)の6mLの無水THF溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を30分間、−30℃で還流し、10mLのメタノールで反応を止めた。アンモニアを蒸発させた後、塩基性溶液をDowexレジンによって中性化した。有機溶液をろ過し、蒸発させて粗生成物を得て、これをアセチル化にふした。粗生成物を、3.0mLのピリジンと2.0mLのAc2Oに、0℃で10mgのDMAPの存在下に溶解させた。反応混合物を0℃から室温まで、一昼夜かけて撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化トリサッカリド22’(233mg,59%)が得られた。
実施例36
トリサッカリドドナー23’の調製:
−25℃の、トリサッカリドグリカール20’(460mg,0.346mmol)の3mLの無水アセトニトリル中の溶液に、NaN3(34mg,0.519mmol)およびCAN(569mg,1.4mmol)を順次添加した。混合物を−25℃で8時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、アジドニトラート誘導体(134mg,27%)の混合物が得られた。このアジドニトラート混合物を還元条件下において加水分解した。アジドニトラートを2mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(16μl,0.091mmol)およびPhSH(28μl,0.272mmol)を順次添加した。15分後、反応は完了し、溶媒を室温で蒸発させた。ヘミアセタール誘導体(103mg,74%)がシリカゲルクロマトグラフィー後に得られた。このヘミアセタール(95mg,0.068mmol)を2mLの無水ジクロロメタンに溶解した。この溶液に、1mLのCCl3CNと0.5gのK2CO3を室温で添加した。反応を一昼夜行った。セライトのパッドでろ過した後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、23α’(18mg,17%)および23β’(70mg,67%)が得られた。
実施例37
トリサッカリドドナー24’の調製:
−15℃の、トリサッカリドグリカール21’(225mg,0.264mmol)の2mLの無水アセトニトリル中の溶液に、NaN3(26mg,0.40mmol)およびCAN(436mg,0.794mmol)を順次添加した。混合物を−15℃で一昼夜撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、アジドニトラート誘導体(130mg,51%)の混合物が得られた。このアジドニトラート混合物を還元条件下において加水分解した。アジドニトラート(125mg,0.129mmol)を5mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(25μl,0.147mmol)およびPhSH(45μl,0.441mmol)を順次添加した。15分後、反応は完了し、溶媒を室温で蒸発させた。ヘミアセタール誘導体(92mg,77%)がシリカゲルクロマトグラフィー後に得られた。このヘミアセタール(80mg,0.087mmol)を5mLの無水ジクロロメタンに溶解した。この溶液に、0.9mLのCCl3CNと0.12gのK2CO3を室温で添加した。反応を一昼夜行った。セライトのパッドでろ過した後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、24’のαおよびβ異性体の混合物(71mg,77%,α:β=3:1)が得られた。
24’:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.55(s,1H,β異性体のNH),8.71(s,1H,α異性体のNH),6.54(d,J=3.6Hz,α異性体のアノマーH).
実施例38
トリサッカリドドナー25’の調製:
過アセチル化トリサッカリド21’からのアジドニトラート誘導体(100mg,0.103mmol)を0.5mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。この溶液に、無水LiBr(45mg,0.52mmol)を添加した。混合物を3時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物25’(91mg,90%)が得られた。
25’:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.04(d,J=3.6Hz,1H,アノマーH).
実施例39
トリサッカリドドナー26’の調製:
トリサッカリドドナー25’(91mg,0.093mmol)を2mLの無水THFに0℃で溶解した。この溶液に、LiSPh(100mL,0.103mmol)を添加した。反応を0℃で30分間行った。溶媒を除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物26’(61mg,66%)が得られた。
実施例40
トリサッカリドドナー27’の調製:
トリサッカリドドナー21’(860mg,0.722mmol)を、2mLのピリジンと1mLのAc2Oに、10mgのDMAPの存在下に溶解させた。反応混合物を0℃から室温まで、一昼夜かけて撹拌した。水性ワークアップ後、溶媒を除去し、残さを室温で10mLのメタノールおよび5mLの酢酸エチルに溶解した。この溶液に、Na2HPO4(410mg,2.89mmol)および20%NaHg(1.0g,4.35mmol)を添加した。反応を2時間行って、水性ワークアップイした。有機溶媒を除去後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、N−アセチルトリサッカリドグリカール(740mg,94%)が得られた。トリサッカリドグリカール(624mg,0.571mmol)を3mLの無水アセトニトリルに−40℃で溶解した。この溶液に、NaN3(56mg,0.86mmol)およびCAN(939mg,1.71mmol)を順次添加した。混合物を−40℃で4時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機溶媒を除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、αおよびβアジドニトラートアノマーの混合物(191mg,27%)が得られた。アノマーのこの混合物(172mg,0.137mmol)を室温で1mLのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(24μl,0.137mmol)とPhSH(42μl,0.410mmol)を順次添加した。反応は30分で完了し、溶媒を蒸発させた。カラムによる分離によって、所望のヘミアセタール(170mg)が得られた。このヘミアセタールを1mLのジクロロメタンに室温で溶解した。この溶液に、1mLのCCl3CNおよび500mgの炭酸カリウムを添加した。反応を室温で一昼夜行った。セライトのパッドでろ過後、有機溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望のα−トリクロロアセチミダート27’(70mg,42%)が得られた。
実施例41
メチル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー23α’のカップリング:
トリサッカリドドナー23α’(70mg,0.046mmol)、メチル=N−Fmocセリナート(23.4mg,0.068mmol)および300mgの4Åモレキュラーシーブの、−78℃での0.5mLのTHF溶液に、TMSOTf(4.6μl,0.023mmol)を添加した。反応を−35℃で一昼夜撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、溶液をセライトのパッドでろ過した。ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、29α’(70mg,90%)および29β’(7.0mg,9.0%)が得られた。
実施例42
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー24’のカップリング:
トリサッカリドドナー24’(33mg,0.030mmol)、ベンジル=N−Fmocセリナート(33.0mg,0.075mmol)および100mgの4Åモレキュラーシーブの、−78℃での0.3mLのTHF溶液に、TMSOTf(6.0μl,0.030mmol)を添加した。反応を−78℃から室温まで、2時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、溶液をセライトのパッドでろ過した。ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、30’(8.6mg,22%,α:β=2:1)が得られた。
実施例43
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー25α’のカップリング:
ベンジル=N−Fmocセリナート(45mg,0.107mmol)、AgClO4(37.0mg,0.179mmol)および200mgの4Åモレキュラーシーブの、0.6mLの無水ジクロロメタン溶液に、トリサッカリドドナー25α’(88mg,0.0893mmol)の0.5mLのジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。セライトのパッドでろ過後、溶媒を除去し、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、カップリング生成物30’(66mg,56%,α:β=3.5:1)が得られた。
実施例44
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー26β’のカップリング:
ベンジル=N−Fmocセリナート(45mg,0.107mmol)、トリサッカリドドナー26β’(23mg,0.023mmol)、および50mgの4Åモレキュラーシーブの、0℃での1.0mLの無水ジクロロメタン溶液に、NIS(6.2mg,0.027mmol)およびTfOH(0.24μl,0.003mmol)の0.5mLジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応を0℃で1時間行った。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。有機溶媒を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒除去後、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、カップリング生成物30’(12.1mg,40%,α:β=2:1)が得られた。
実施例45
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー27α’のカップリング:
トリサッカリドドナー27α’(40.1mg,0.029mmol)、ベンジル=N−Fmocセリナート(18.0mg,0.044mmol)、および200mgの4Åモレキュラーシーブの、−20℃での2.0mLのTHF溶液に、TMSOTf(1.8μl,0.009mmol)を添加した。反応混合物を−20℃から室温まで3時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、31’(24mg,51%)が得られた。
実施例46
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー28’のカップリング:
トリサッカリドドナー28’(α:β=1:1)(162mg,0.163mmol)、ベンジル=N−Fmocセリナート(48.0mg,0.097mmol)、および300mgの4Åモレキュラーシーブの、−78℃での2.0mLのTHF溶液に、ジクロロメタン中のBF3・Et2O(0.5当量,0.082mmol)を添加した。反応混合物を−78℃から室温まで2時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、32’(81mg,67%)が得られた。
実施例47
ベンジル=N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー28β’のカップリング:
トリサッカリドドナー28β’(12mg,0.012mmol)、ベンジル=N−Fmocセリナート(9.0mg,0.022mmol)、および100mgの4Åモレキュラーシーブの、−40℃での0.5mLのTHF溶液に、ジクロロメタン中のBF3・Et2O(1.5当量,0.018mmol)を添加した。反応混合物を−40℃から室温まで2時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、32’(5.2mg,35%)が得られた。
2,3-ST抗原前駆体
チオエチルグリコシル供与体30(52mg,0.064mmol)および6-TBDMS受容体31(94mg,0.13mmol)混合物をベンゼン(4x50mL)とともに共沸混合し、次いで高真空下に1時間置いた。この混合物を窒素下に置き、その時点で4Åモレキュラーシーブス(0.5g)、CH2Cl2(5mL)、およびNIS(36mg,0.16mmol)を加えた。混合物を0℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸(CH2Cl2中1%,0.96mL,0.064mmol)を5分間にわたって滴下した。懸濁液を添加後直ちに周囲温度まで温め、20分攪拌した。この混合物をEtOAc(50mL)と飽和NaHCO3(50mL)で分液した。これらの相を分離し、有機相を食塩水(50mL)で洗浄、乾燥(Na2SO4)、濃縮した。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(4:1、EtOAc:ヘキサン)により精製し、無色の結晶性固体として三糖類32、59mg(62%)を得た。
Ley抗原前駆体
チオ供与体32(44.0mg,29.5μmol)および受容体31(42.4mg,59.0μmol)(トルエンとともに3度共沸混合)にCH2Cl2および新たに活性化した4Åモレキュラーシーブスを加えた。この混合物を20分間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。N-ヨードスクシンイミド(16.6mg,73.8μmol)を加え、次いでCH2Cl2中のTfOHの1%溶液を滴下した。この赤色混合物を0℃で5分間攪拌し、さらにEtOAcで希釈した。有機相を飽和NaHCO3、飽和Na2S2O3、および食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、さらに真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(1:1 EtOAc:CH2Cl2から2:1 EtOAc:CH2Cl2)により、カップリング生成物34、43.2mg(68%)を得た。
b-トリクロロアセトイミデートの保護トレオニンとのカップリング
無水CH2Cl26ml中のトリクロロアセトイミデート35(98mg,0.13mmol)、トレオニン誘導体36(70mg,0.167mmol)および4Åモレキュラーシーブス100mgの溶液に−30℃でTMSOTf(14mL,0.07mmol)を加えた。この反応物を−30℃で1時間攪拌し、次いでEt3Nで中和した。反応混合物をセライトのパッドで濾過し、EtOAcで洗浄した。濾過物をH2Oおよびブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより分離し、β生成物37β(56mg,42%)およびα生成物37α(57mg,42%)を得た。
考察
本発明で採用される合成アプローチは、4段階を包含する(図2)。まず、全糖ドメインを改良型グリカールの形で構築する。次ぎに、セリン、トレオニンまたは類似の残基との効率的なカップリングを行う。第3段階として、全グリコシルドメインアミノ酸をペプチド主鎖に組み込むペプチドの構築を含む。最終の段階として、同時にかまたは逐次かのいずれかでの全体の脱保護を含む。
合成開始点は、容易に入手可能なグリカール2(図3)であった。この化合物のジメチルジオキシランによる酸化および続いて起こる得られたエポキシドの6-O-TIPS-ガラクタールとのカップリングは標準的な方法でZnCl2により促進させた。文献:Toyokuni, T.; Singhal, A. K.; Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 231.粗生成物のアセチル化により高収率および立体選択性のある二糖類3を得た。緩やかな条件下でのTIPS保護基の除去により、シアル酸の受容体4への結合のための準備をする。触媒量のTMSOTfによる促進下、供与体として亜リン酸シアリル5を使用すると、一貫して高収率(80ないし85%)の生成物の4:1混合物が得られた。文献:Martin, T. J.ら, Glycoconjugate J. 1993, 10, 16. Sim, M. Mら, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 2260.かくして、改良型グリカール6(「2,6-STグリカール」)は4工程で非常に効率よく入手できる。
三糖類グリカール6は示されるように(図3)アジドニトロ化させた。このようにして収率60%で得られた化合物7は種々の供与体構築物への変換に有用であった(8から11を参照)。例えば、α-ブロミド8は供与体として直接使用できるか、またはリチウムチオフェノキシドにより立体選択的にβ-フェニルチオグリコシド11へ変換され得る。別法としては、硝酸塩7の混合物を加水分解し、得られたヘミアセタールをα:βトリクロロアセトアミデート(9)と亜リン酸ジエチル(10)の1:1混合物へ高収率で変換した(図3)。(硝酸塩加水分解: 文献:Gauffeny, F.ら, Carbohydr. Chem. 1991, 219, 237.トリクロロアセトアミデートの製造および使用:文献:Schmidt, R. R.およびKinzy, W.: Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, 21.亜リン酸塩供与体:文献:Kondo, H.ら;J. Org. Chem. 1994, 59, 864.)
種々の供与体タイプ(8から11)の入手が可能となったことにより、(2,6)-ST三糖類のN-Fmoc-保護L-セリンおよびL-トレオニンのベンジルエステルへの直接的なカップリングの研究が可能になった。結果は表1に要約する。受容体としてFmoc保護L-トレオニンを用い、あらゆる供与体が高い立体選択性でα-Oグリコシルトレオニン系を提供した。これに対し、同様な保護L-セリン受容体とのカップリング反応の結果は、その供与体の特徴および反応条件に依存していた。あらゆる場合において、所望のα-アノマー12が主生成物であった(β-アノマーが主生成物として単離される、三糖類供与体をセリンへ結合させる先の試みについては、文献:Paulsen, H.ら, Liebigs. Ann. Chem. 1988, 75; Iijima, H.; Ogawa, T.,Carbohydr. Res. 1989, 186, 95.を参照)。供与体10を用いる場合の所望のα-生成物:所望でないβ−グリコシドの比率は約30:1であった。
構築単位14および15を用いて糖ペプチド構築段階に入り、これにより最終の糖ペプチドに対して実施されるはずの必要な化学操作数が減る。このように、化合物14および15は、12および13それぞれから2段階で得られた。アジド官能基はCH3COSHの作用により、収率78-80%で、直接N-アセチル基に変換し、ベンジルエステルを水素添加分解により定量的に除去した(図4)。文献:Paulsen, H.ら, Liebigs. Ann. Chem. 1994, 381.
糖ペプチド主鎖はC→N末端方向に構築した(図4)。ペプチドのN末端および保護グリコシルアミノ酸間のカップリング工程の反復、次いでFMOC保護基の除去により、保護されたペンタペプチド16を得た。12および13のようなブロック構造のペプチドカップリング工程は優れた収率で進行した。IIDQおよびDICDの両カップリング試薬は十分に作用した(85ないし90%)。FMOC脱保護は18-クラウン-6の存在下でDMF中のKFを用い、緩やかな処理の下で行った。文献:Jiang, J.ら, Synth. Commun. 1994, 24, 187.糖ペプチドの16の2回の脱ブロッキングは3段階:(i)KFによるFmoc除去およびアセチル基を有するアミノ末端の保護;(ii)ベンジルエステルの水素添加分解;および(iii)糖ペプチドムチンモデル1へ導くNaOH水溶液による3のメチルエステル、環式カーボネートおよびアセチル保護物の加水分解で完了した(図4)。
NおよびC両末端のオルト位の露出により、断片連結による糖ペプチド構築体のさらなる伸長の機会が得られた。かかる請求の範囲の可能性を実証する目的で、ST三価元素19を持つノナペプチドは、トリペプチド18とヘキサペプチド17とのカップリングにより作製した(図5参照)。前記の脱保護プロトコールにより、O-グリコシル化セリン−トレオニン三価元素がペプチドの中央に組み込まれたノナペプチドムチンモデル20が得られた。
マウスにおけるTnクラスター構築体のワクチン接種
本発明は、本明細書に開示された糖ペプチド抗原はリポペプチド担体PamCysへ結合している抗癌ワクチンを提供する。抗原の新たな担体への結合は、従来のタンパク質担体と比較して主要には簡略化される。表2および3では、新しい構築体の免疫原性をマウスのタンパク質担体ワクチンと比較する。これらの新規構築体はマウスに免疫原性をもたらした。表に示されるように、マウスの3度目の予防接種後、Tn-PamCys構築体は高力価のIgMおよびIgG双方を惹起する。5度目の予防接種後、いっそう高い力価が誘導される。Tn-KLHワクチンはより強力な全体的な応答をもたらす。しかしながら、IgM/IgG比率は2種のワクチン間で異なる。Tn-KLHはTn PamCysより高いIgM/IgG比率をもたらす。相対的に、新規Tn-PamCysはより強いIgG応答を惹起する。タンパク質担体ワクチンに比べ、アジュバントQS-21では免疫原性のさらなる増大はもたらされない。従って、PamCysポリペプチド担体は、「組み込まれた」免疫刺激剤/アジュバントと考えられるであろう。さらに、QS-21がIgG力価を犠牲にして、Tn-PamCysに対するIgM応答を増大させることが示されよう。PamCys担体を基にしたワクチンは前立腺癌に向けられる。
抗原0.3μg/ウェルをアルコール中で平板培養; 3度目のワクチン接種後11日に抜き取った血清
ムチン関連F1α抗原の全合成
本発明は、主として糖タンパク質のムチンファミリーに基づく腫瘍組織表面の誘導模擬物を提供する(文献:Ragupathi, G.ら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125.(この分野の概説としては、文献:Toyokuni, T.; Singhal, A.K. Chem. Soc. Rev.1995, 24, 231; Dwek, R.A. Chem. Rev. 1996, 96, 683.を参照)。上皮細胞表面で発現が高く、かつ、O-結合炭水化物クラスターが高含量であるため、ムチンは抗癌免疫学的研究に関する重要な標的となる。上皮癌におけるムチンはしばしば異常型α-O-結合炭水化物を有する。文献:Finn, O.J.ら,Immunol. Rev. 1995, 145, 61; Saitoh, O.ら, Cancer Res. 1991, 51, 2854; Carlstedt, I.; Davies, J.R. Biochem. Soc. Trans. 1997, 25, 214.同定されたF1α抗原1’および2’は、胃腺癌と関連するムチン上で見い出された異常型炭水化物エピトープの例を示す(図22A)。文献:Yamashita, Y.ら, J. Nat. Cancer Inst. 1995, 87, 441; Yamashita, Y.ら,Int. J. Cancer. 1994, 58, 349.従って本発明は、合成によりF1αエピトープを構築する方法を提供する。F1αの前記合成は、文献:Qui, D.; Koganty, R.R. Tetrahedron Lett. 1997, 38,45によるものである。先行するα-O-結合糖ペプチドへの他のアプローチとしては、文献:Nakahara, Y.ら,ライフサイエンスに関わる合成オリゴ糖類において不可欠なプローブ ACS Symp. Ser. 560, 249-266頁(1994); Garg, H.G.ら,Adv. Carb. Chem. Biochem. 1994, 50, 277; Paulsen, H.ら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 281,; Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618; Elofsson,M.ら, Tetrahedron 1997, 53, 369; Meinjohanns, E.ら,J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1996, 985; Wang, Z.G.ら, Carbohydr. Res. 1996, 295, 25; Szabo, L.ら, Carbohydr. Res. 1995, 274, 11が挙げられる。
F1α構造は、3つの主要な構成単位I-IIIより構築され得る(図22A)。かかる一般的なプランにより、2つの選択的実行モデルが可能となる。(グリカール構築体の包括的な総論については、文献:Bilodeau, M.T.; Danishefsky, S.J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381.を参照。炭水化物腫瘍抗原に基づくワクチンの合成への応用については、文献:Sames, D.ら, Nature 1997, 389, 587; Park, T.K.ら, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488;およびDeshpande,P.P.; Danishefsky, S.J. Nature 1997, 387, 164.を参照。)まず、GalNAc-セリン/トレオニン構築物は最初の段階で構築してよい。これに次いで「非還元末端」で伸長が起こる(II+III、次いでI)。別法としては、まず全糖ドメインを三糖類グリカールの形で構築することが可能であろう(I+II)。この工程に次いで得られた三糖類供与体とセリンまたはトレオニンアミノ残基とのカップリングが行われるであろう(II参照)。両方法は本明細書で開示される。
第1の合成アプローチは、単糖類供与体5a’/b’および6a’/b’の製造で開始した(図22B)。ガラクタールの保護基(II参照)はいくつかの必要条件を満たすように慎重に選択した。それらは試薬およびアジドニトロ化プロトコール(下記参照)の条件に安定でなければならない。また、保護官能基はグリコシルアミノ酸へと導くカップリング工程を低下させてはならない。いくつかの開始試験の後、ガラクタール3’が出発物質として選択された。アジドニトロ化プロトコール(NaN3,CAN CH3CN,-20℃)により4a’および4b’の1:1混合物が40%の収率で得られる。文献:Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244.両アノマーを加水分解し、次いで十分な収率(84%)でトリクロロアセトイミデート5a’および5b’の1:5混合物へと変換した。文献:Schmidt, R.R.; Kinzy, W. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.1994, 50, 84.別法としては、硝酸塩4’の加水分解、次いでDAST試薬の使用(文献:Rosenbrook, Jr. W.ら, Tetrahedron Lett., 1985, 26, 3; Posner, G. H.; Haines, S. R. Tetrahedron Lett. 1985, 26,5)により、フルオリド供与体6a’および6b’の1:1混合物が得られた。両場合においてα/βアノマーは分離でき、かくしてカップリング事象におけるそれらの挙動について一連の研究がなされた。保護されたカルボキシおよびアミノ部分を持つ、遊離側鎖アルコールを有する供与体5’-6’のセリンまたはトレオニン受容体とのカップリングにより得られた最良の結果を表5aで要約する。
トリクロロアセトイミデート供与体タイプ5’は、セリン誘導アルコール7’とのカップリング反応で優れた収率をもたらした。最適化した後、THF中のTMSOTfの存在下での供与体5b’(エントリー2、表5a)により、86%の収率で純粋なα-生成物9’を得られた。興味深いことに、供与体5a’はまた、α-グリコシド9’のみを独占してもたらした。供与体5b’のトレオニンとのカップリングは立体選択性にもかかわらず、低収率であった。この場合、幾分低下した選択性によるにもかかわらず、フルオリド供与体6a’および6b’はCp2ZrCl2/AgClO4により促進させると、所望のグリコシルトレオニン10’が優れた収率(82ないし87%)で得られた(6:1, α:β)。文献:Ogawa, t. Carbohydrate Res. 1996, 295, 25.このように、互いの相補性を与える供与体セットとグリコシルトレオニン10’ならびにグリコシルセリン9’が高収率、かつ優れた立体選択性限界をもって得られた。これらの供与体のアノマー中心での配座による、それらのカップリング工程の立体化学的な結果への実質的な影響はないということがわかった。この結果は一般に2-デオキシ-2-アジド-トリ-O-アセチルガラクトース-1-O-トリクロロアセトイミデートを用いる試験結果とは異なる。文献:Schmidt, R. R.; Kinzy, W., id.を参照。その場合、各アノマーにより異なる比率のα/β生成物が得られる(下記参照)。
6位のTIPS基をTBAFおよびAcOHで定量的に除去し、受容体11’および12’を得た(図23)。ラクトサミン供与体13’への最終カップリングは、THF中のBF3OEt2の存在下で行った。この見かけの立体選択的カップリング工程からの粗生成物をチオール酢酸によりそれぞれ化合物14’および15’へと変換した。文献:Paulsen, H.ら, Liebigs Ann. Chem. 1994,381.これらのグリコシルアミノ酸は、糖ペプチド構築体の好適な単位を示す。それらの構造を確認するために、発明者らは、全体的な脱保護を行った。これは遊離F1α抗原1’および2’がそれぞれ70%および73%の収率で得られる5工程で完了した(図23)。グリコシド結合は、酸性および塩基性脱保護プロトコールの条件下では妥協点はなかった。
直接的カップリングはグリカール構築体により、適切に保護されたセリンまたはトレオニンアミノ酸を用いて合成される三糖類供与体(文献:Bilodeau, M. T.; Danishefsky, S. J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381)から提供される。この論理は式I+II、ついでIIIとのカップリングのもとで初期に検討された。図24で概説するように、三糖類供与体23’-27’を製造した。容易に入手可能なラクタール16’(文献:Kinzy, W.; Schmidt, R. R. Carbohydrate Res. 1987, 164, 265)を一連のヨード−スルホンアミノ化、次いでLiHMDSの存在におけるエタンチオールでの後の再配置によりチオ-供与体17’へと変換した。文献:Park, T. K.ら, J. Amer. Chem. Soc., 1996, 118, 11488.ガラクタール18’および19’へのMeOTfにより促進されるカップリングにより、優れた収率かつ立体選択性で三糖類グリカール20’および21’が得られた。20’のベンジル基およびスルホンアミドの還元脱保護および粗生成物の一連の均一なアセチル化によりグリカール22’が得られた。グリカール20’-22’のアジドニトロ化により中間体アジドニトレートが得られ、それを対応する供与体23’-27’へと変換した。
これらの三糖類供与体の適切なセリン/トレオニン誘導受容体とのカップリングの結果を表6に要約する。さらに保護パターンは、カップリングの反応性および立体選択性へ大きな影響を及ぼした。アノマー中心のラクトースドメインのヒドロキシル基および他の官能基間の距離が見かけ上離れているにもかかわらず、これらの置換基は立体化学的な結果へ多大な影響を及ぼす。定性的に電子供与基(ベンジル参照)による官能基の均一な保護が、推定されるオキソニウム陽イオンを安定化させることにより、非常に反応性のある供与体が得られる。これに対し、電子吸引性保護基はカップリング工程において供与体を失活させる傾向がある。文献:Andrews, C. W.ら, J. Org. Chem. 1996, 61, 5280; Halcomb, R. L.; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6656.かかる失活はまた、アノマー中心の供与体官能基の元の立体化学へのカップリングの感受性に関して供与体にいくらかの立体化学的復元力を与える可能性がある。表6で示されるように、ペル-O-ベンジル-保護供与体23’は−78℃で高い反応性があり、90%の収率で、高い選択性(10:1,第1エントリー、表6)をもって生成物28’が得られた。供与体24’の場合において実証されたように、ペル-O-ベンジルからペル-O-アセチル基までの全体的な保護の変化において劇的な差が見られた。カップリング工程の収率および立体選択性は低下した。これに匹敵する結果が供与体25’および26’でも得られた。
化合物27’および28’の場合、ガラクトサミン環は環状アセトニドの3-および4-位の結合により、コンホメーションが制限され、さらに驚くべき知見が示された。ペル-O-ベンジル保護ラクトサミン二糖類を有する供与体27α’によっては、所望のα-アノマー31’のみが得られた。しかしながら、純粋な28’のβ-アノマーとトリクロロアセトイミデートの混合物によっては、所望されないβ-アノマー32’のみが生じた。従って、(供与体官能基を含む環の)第2および第3炭水化物単位上の比較的離れた部位での保護パターンの修飾により、グリコシド化の立体選択性へ大きな逆作用が働いた。環状保護基により供与体集団内の環に強いられるコンホメーションの制限は、加水分解速度により判断されるように供与体反応性に影響を及ぼし得る。文献:Wilson, B. G.; Fraser-Reid, B. J. Org. Chem. 1995, 60, 317; Fraser-Reid, B.ら,J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 1434.保護基は、それらの電子的、立体的およびコンホメーション的影響により、溶媒和合作用とともにグリコシル供与体の特性を著しく変調する。従ってより長期の作用はセリンおよびトレオニン側鎖ヒドロキシル基のグリコシド化に先立っては厳密に推定できない。
従って本発明は、予め構築した立体特異的合成α-O-結合セリンまたはトレオニングリコシド(例えば9’および10’)を使用して糖質構築体を完成させるカセットアプローチに対する予期されないほどの優位性を実証するものである。
Claims (30)
- 構造:
{式中、リンカーは、−O−、−NH−アルキル−C(=O)−NH−、−NH−、−NRG−アルキル−、−NRH−アリール−、−アルキル−C(=O)−NH−、−アリールアルキル−C(=O)−NH−、−NH(CH2)qNH−、−NH(CH2)qNH(C=O)(CH2)jS−、2から20のヒドロキシアシル残基を含んでなるオリゴエステルフラグメント、2から20のアミノアシル残基を含んでなるペプチドフラグメント、または直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールカルボン酸エステルであり;jおよびqは独立して1−8の整数であり;および、各RGは、水素、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換、環状または非環状のアルキル部分であり;およびRHは、水素またはアリールであり;
クロスリンカーは、リンカーのチオールとキャリアの表面アミンを結合することができる架橋剤に由来する部分であり;
キャリアはタンパク質または脂質であり;
nは1、2、または3であり;
s’は0または1であり;
RA、RB、およびRCの各々は独立に、Hまたはメチルであり;および
RD、RE、およびRFの各々は独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインを含有し;
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは各々独立に0、1、2または3であり、ただし、RD、RE、およびRFが、独立してフラノースまたはピラノース部分からなる炭水化物であり、bおよびcの合計が1または2であり、dおよびfの合計が1または2であり、gおよびiの合計が1または2であり、および、ただし、x、y、およびzが同時に0であることはなく;R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり;各R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;各Riは独立して水素、CHO、COORii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり;k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり、ただし、vおよびwの続きの構造は、フラノースまたはピラノース部分を示し、lおよびkの合計は1または2であり、sおよびuの合計は1または2であり、および、ただし、vおよびwは同時に0ではなく;R’0は水素、直鎖または分枝鎖アルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり;R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に、水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、(モノ、ジまたはトリ)ヒドロキシアルキル、(モノ、ジまたはトリ)アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり;各Riiiは独立して、水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり;
ここで、RD、RE、およびRFの各々は、炭水化物ドメイン、または、腫瘍細胞に存在する、その先端を切断したまたは伸長した変形体を含有する、
ただし、(i)s’が0であり、リンカーが−NH(CH2)2-O-(CH2)2NH-であり、かつ、キャリアがKLHまたはヒト血清アルブミンである場合、RD、RE、及びRFは同時にSTnであることはない、および、(ii)s’が0であり、リンカーが−NH(CH2)3(C=O)-であり、かつ、キャリアがヒツジ血清アルブミンである場合、RD、RE、及びRFは同時にTnであることはない}
を有する複合糖質。 - クロスリンカーがなく、リンカーが、−NH(CH2)qNH−であり、式中、qは1−8の整数であり、キャリアが脂質である、請求項1記載の複合糖質。
- 炭水化物ドメインが独立して、単糖類または二糖類である、請求項1および3ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質。
- m’、n’、およびp’は各々14であり;およびqは3である、請求項7記載の複合糖質。
- 各アミノアシル残基がL体を有する、請求項1および3ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質。
- RA、RB、およびRCは各々独立に、Hである、請求項1および3ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質。
- RA、RB、およびRCは各々独立に、Meである、請求項1および3ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質。
- キャリアはタンパク質であり、タンパク質は、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである、請求項1および3ないし5のいずれか1項に記載の複合糖質。
- キャリアは脂質であり、脂質は、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニルセリンである、請求項1および3ないし5のいずれか1項に記載の複合糖質。
- 請求項1ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質と、医薬上許容されるキャリアを含有する医薬組成物。
- さらに免疫アジュバントを含有する、請求項19記載の医薬組成物。
- アジュバントがバクテリアまたはリポソームである、請求項20記載の医薬組成物。
- アジュバントがサルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)細胞、BCG(bacille Calmette-Guerin)、またはQS21である、請求項21記載の医薬組成物。
- 患者に抗体を誘導するための医薬品の製造における、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、複合糖質が、前記抗体がヒト腫瘍細胞と特異的に結合でき、抗体を誘導するのに効果的な量で使用される、使用。
- 誘導された抗体が、Tn、STn、2,3−ST、2,6−ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T(TF)、TおよびGlobo−H六糖類からなる群より選択される抗原に結合するものである、請求項23記載の使用。
- 患者が臨床上緩解にあるか、または患者が外科手術により処置され、限定された切除できない疾病を有している請求項23記載の使用。
- 癌患者において癌を治療するための医薬組成物の製造における、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、前記医薬組成物が、治療に有効量の前記複合糖質、および任意に医薬上許容されるキャリアを含む、使用。
- 癌が固形癌である請求項26記載の使用。
- 癌が上皮癌である請求項26記載の使用。
- 患者における上皮癌の再発を予防するための医薬品の製造における、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、上皮癌細胞抗原に対する抗体を誘導するのに有効量の前記複合糖質が使用される、使用。
- 誘導された抗体が、Tn、STn、2,3−ST、2,6−ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T(TF)、TおよびGlobo−H六糖類からなる群より選択された抗原に結合するものである、請求項29記載の使用。
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