CN105535955B - Globo h及含新颖糖脂质佐剂的相关抗癌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供免疫原性组合物、癌症疫苗、以及用以治疗癌症的方法。其提供组合物，包含：(a)一聚糖，诸如，Globo H，或其免疫原性片段，其中该聚糖经由一连接子(如，对‑硝基苯基)而与载体蛋白复合；及(b)一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d的糖脂质，诸如，α‑半乳糖苷基‑神经酰胺衍生物，其中该免疫原性组合物可诱发一免疫反应，该反应可诱发相较于IgM同工型抗体的较高相对含量IgG同工型抗体。其提供免疫原性组合物，包含载体蛋白白喉毒素交叉反应性材料197(DT‑CRM197)以及佐剂C34。由本文所公开的免疫原性组合物所产生的抗体可进一步中和抗原Globo H、阶段特异性胚胎抗原‑3(SSEA‑3)、阶段特异性胚胎抗原‑4(SSEA‑4)中的至少一种。也提供对抗乳癌干细胞的治疗剂，其包含免疫原性组合物，该些组合物包含与DT‑CRM197复合的Globo H、SSEA‑3、或SSEA‑4。

Description

GLOBO H及含新颖糖脂质佐剂的相关抗癌疫苗

本申请是申请人于2009年8月6日提交的、申请号为200980122743.3的、发明名称为“GLOBO H及含新颖糖脂质佐剂的相关抗癌疫苗”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参照

本申请是同在审查中的美国专利申请案序号12/485,546号(发明名称“Compositions for inducing immune responses specific to Globo H and SSEA-3anduses thereof in cancer treatment”，2009年6月16日申请)的部分继续申请案，该案主张美国临时专利申请案序号61/061,968号(2008年6月16日申请)的优先权。这些专利申请案的内容全文皆以参考数据方式纳入本说明书中。

发明的技术领域

本发明涉及癌症疫苗的领域。特定言之，本申请案涉及以糖为基础的疫苗，其含有与免疫原性载体DT-CRM197复合的B细胞抗原表位Globo H。更特定言之，本发明涉及与诸如C34的新颖糖脂质佐剂共同给予的抗癌Globo H-DT疫苗。

发明背景

为设计对抗癌症的疗法，想要寻求不存在于正常细胞中的癌或癌干细胞的分子标靶。异常的糖基化作用通常与肿瘤发展相关，且其首先在1969年由Meezan等人述及，说明癌聚糖与正常细胞不同(Meezan E,et al.(1969)Biochemistry 8:2518-2524)。异常的糖基化作用包括某些结构的丧失或过表达、切截结构的存留、以及新颖结构的出现。使用健康及恶性组织的凝集素染色比较，这些结构差异于后获得了诸多组织学证据的支持(Turner GA(1992)Clin Chim Acta 208:149-171；Gabius HJ(2000)Naturwissenschaften87:108-121)。

近来，已由单克隆抗体及质谱分析鉴定出肿瘤相关性糖抗原(Shriver Z,et al.(2004)Nat Rev Drug Disc 3:863-873；Pacino G,et al.(1991)Br J Cancer 63:390-398)。至今，诸多以糖脂质或糖蛋白的形式而表达在癌细胞上的肿瘤相关性抗原已获得定性并建立与某些类型的癌症相关(Bertozzi CR,Dube DH(2005)Nat Rev Drug Discovery4:477-488)。尽管对于表面糖类在恶性细胞中所扮演的角色所知相对极微，但已证实由被动给予或是由疫苗诱发的对抗这些抗原的抗体与较佳的预后相关。

在经报告的肿瘤相关性聚糖中，糖脂质抗原Globo H(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)首先在1984年由Hakomori等人自乳癌MCF-7细胞分离及鉴定(Bremer EG,et al.(1984)J Biol Chem259:14773–14777)。以抗-Globo H单克隆抗体所进行的进一步研究显示，Globo H存在于诸多其它癌症中，包括前列腺癌、胃癌、胰脏癌、肺癌、卵巢癌、及结肠癌，且其在无法由免疫系统轻易进入的正常分泌组织的管腔表面仅有微量的表达(Ragupathi G,et al.(1997)Angew Chem Int Ed36:125-128)。此外，已证实乳癌病患的血清含有高含量的抗-Globo H抗体(Gilewski T el al.(2001)Proc Natl Acad SciUSA 98:3270-3275；Huang C-Y,et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20；WangC-C,et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666)，且具Globo H-阳性肿瘤的病患显示相较于具Globo H-阴性肿瘤病患的较短存活期(Chang,Y-J,et al.(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304)。这些发现使得Globo H，一种六糖抗原表位，成为引人注目的肿瘤标记物以及癌症疫苗研发的可行标靶。

Globo H是一种在各种上皮癌中过表达的癌症抗原。已建议此种抗原可作为癌症免疫治疗的标靶。尽管已研发出可诱发对抗Globo H的抗体反应的疫苗，但因Globo H的低抗原性，其抗癌功效并不令人满意。因此仍需要可诱发靶向Globo H的高量免疫反应的新疫苗。

干细胞是定义为具有自我更新与分化成为不同类型细胞及组织的能力的细胞群(Reya T et al.,(2001)Nature 414:105-111)。由于恶性及正常组织两者都含有异质的细胞种群，癌干细胞可能在肿瘤生长及维持肿瘤的异质性中扮演关键角色。已自各种不同的实体肿瘤中鉴定出癌干细胞，诸如，脑瘤、乳癌、结肠癌、及前列腺癌。乳癌干细胞(BCSCs)首先由Al-Hajj等人根据其在异种移植进入NOD/SCID小鼠中时可产生表型多样性肿瘤的能力而证实存在于乳癌的CD24-CD44+亚群中(Al-Hajj M,et al.,(2003)Proc Natl Acad SciUSA 100:3983-3988)。乳癌病患骨髓中大部分的早期散布癌细胞皆显示具有CD24-CD44+表型(Balic M et al.,(2006)Clin Cancer Res 12:5615-5621)，此建议BCSCs可进行转移。根据其生长、分化、及转移的能力以及其对于辐射照射的抗性，BCSCs成为乳癌治疗的一主要标靶(Tang C.et al.,(2007)faseb J.21:1-9)。

在乳癌中，于>60％的腺管癌、乳叶癌、及管状癌中观察到Globo H表达，但并未在非上皮乳癌肿瘤中得见(Mariani-Constantini R et al.,(1984)Am.J.Pathol.115:47-56)。Globo H并不会在正常组织中表达，除了在管腔边缘的顶端上皮细胞有微弱表达，其似乎为免疫系统所无法进入的位点(Id.；Zhang S.et al.,(1997)Int.J.Cancer 73:42-49)。

Globo H也在乳癌干细胞(BCSCs)中表达。流式细胞计数显示Globo H在25/41的乳癌样本中(61.0％)表达。25/25的非BCSCs及8/40(20％)的BCSCs表达Globo H。阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)(Globo H的五糖前体)在31/40(77.5％)的肿瘤中表达。29/31的非BCSCs及25/40(62.5％)的BCSCs表达SSEA-3。(Chang W-W.et al.,(2008)Proc Natl AcadSci USA105(33):11667-11672.)

Danishefsky及Livingston先前曾报告了对抗多种癌症的Globo H-KLH疫苗(Gilewski T el al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275；Ragupathi G,etal.(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128；Kudryashov V,et al.(1998)GlycoconjJ.15:243-249；Slovin SF et al(1997)Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715)及七价疫苗(含个别与KLH复合的GM2、Globo H、Lewis Y、Tn、STn、TF、及Tn-MUC1；Sabbatini PJ etal(2007)Clin Cancer Res 13:4170-4177)的制备。然而，经该七价疫苗免疫的病患仅诱发了对抗该七种抗原中的五种的抗体反应，GM2及Lewis Y抗体除外。不同于诸如GM2的遍在表达性抗原，Globo H特别表达于肿瘤细胞上而仅在正常分泌组织上有极微量的表达，使其成为疫苗研发的理想标靶。在其研究中，在臭氧分解Globo H配糖基之后，以KLH载体蛋白进行还原氨基化作用，产生每蛋白约150个糖单元(Ragupathi G,et al.(1997)Angew Chem IntEd36:125-128)。通过使用MMCCH连接子，进一步的精制使糖复合率增加至约720:1(Wang S-K,et al.(2008).Proc Natl Acad Sci USA 105:3690-3695)。然而，该糖复合作用的精确定性极为困难。此外，结合免疫佐剂QS-21的该合成疫苗显示在前列腺及转移性乳癌病患两者体内都仅主要诱发IgM而诱发较低程度的IgG抗体。在一期临床试验中，该疫苗也显示微量的毒性，在疫苗接种位点产生短暂的局部皮肤反应。(Gilewski T el al.(2001)ProcNatl Acad Sci USA 98:3270-3275；Ragupathi G,et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128；Slovin SF et al(1997)Proc Natl Acad Sci USA96:5710-5715.)在部分病患身上所观察到的轻微类流感症状可能与QS-21的副作用相关。含有与经马来酰胺修饰的载体蛋白KLH复合的五种前列腺及乳癌相关糖抗原(Globo-H、GM2、STn、TF、及Tn)的五价疫苗已经报告可产生在ELISA分析中具有高于IgM的IgG效价的抗-Globo H血清(Zhu J.et al.(2009)J.Am.Chem.Soc.131(26):9298-9303)。

因此，想要鉴定出替代的载体以及佐剂，以提升对于Globo H的抗体反应，特别是具有较高的IgG效价的，以及改良疫苗功效同时具有极微的副作用。

发明内容

本发明涉及一种以糖为基础的疫苗，其含有经由对-硝基苯基连接子而与免疫原性载体白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)(Th抗原表位)化学复合的Globo H(B细胞抗原表位)。该合成疫苗结合糖脂质佐剂可在乳癌模型中诱发IgG、IgG1、及IgM抗体，并提供绝佳的免疫原性，其在异种移植研究中显示延迟的肿瘤发生。针对该些由Globo H-DT及糖脂质C34所诱发的抗体的聚糖阵列分析显示，该些抗体不仅可鉴定Globo H，也可鉴定SSEA-3(Gb5)及SSEA-4(唾液酸化Gb5)聚糖，其皆为癌细胞及癌干细胞特异性的。

本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含：(a)一聚糖，其基本上由Globo H或其免疫原性片段构成，其中该聚糖经由一连接子而与载体蛋白复合；及(b)一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质，其中该免疫原性组合物可诱发一免疫反应，该反应可诱发相较于IgM同工型抗体的较高相对含量IgG同工型抗体。

在部分方面中，该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)。在部分方面中，该连接子是对-硝基苯基连接子。

在部分方面中，该佐剂是α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物。在部分具体实例中，该佐剂是C34，其中C34包含结构：

在部分方面中，该免疫反应较佳是导向IgG同工型抗体的生成。在部分方面中，该免疫原性组合物包含至少一种可诱发体液或细胞免疫反应的佐剂。

在部分方面中，由该免疫反应所产生的抗体可中和于癌细胞或癌干细胞上表达的抗原。在部分具体实例中，由该免疫反应所产生的抗体可中和抗原Gb4、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)中的至少一种。在部分具体实例中，该可中和抗原Gb4、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)中的至少一种的抗体包含相较于IgM同工型抗体的较高相对含量IgG同工型抗体。

本发明涉及一种癌症疫苗，其包含可在一对象体内诱发抗癌免疫反应的免疫原性组合物。在部分方面中，该癌症疫苗适用于治疗选自由下列所组成的群的癌症：乳癌、肺癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、皮肤癌、肾癌、脑瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肠癌、及膀胱癌。

在部分方面中，该癌组织在细胞表面表达Globo H抗原。在部分方面中，该Globo H抗原在乳癌肿瘤的上皮细胞上表达。

在部分具体实例中，该癌症疫苗可产生能够中和抗原Globo H、Gb4、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)中的至少一种的抗体。在部分方面中，该些抗原在乳癌干细胞上表达。

本发明涉及一种包含抑制肿瘤生长的治疗方法，该方法包括：(a)对需要其的对象给予一免疫原性组合物，该组合物包含：一聚糖，其基本上由Globo H或其免疫原性片段构成，其中该聚糖经由一连接子而与载体蛋白复合；及一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质；以及(b)诱发一免疫反应，该反应可诱发相较于IgM同工型抗体的较高相对量的IgG同工型抗体。

在该方法的部分具体实例中，该连接子是对-硝苯酚，该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)，且该佐剂是α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物。在一具体实例中，该佐剂是C34。

在该方法的部分具体实例中，该免疫原性组合物还包含一癌症疫苗，且同时其中以有效量的该癌症疫苗所进行的一或多种治疗可抑制肿瘤生长。在部分具体实例中，该癌症疫苗的给予可使肿瘤尺寸减少。

在该方法的部分具体实例中，该免疫反应较佳是导向IgG同工型抗体的生成，该些抗体可中和抗原Globo H、Gb4、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)中的至少一种。在部分方面中，该些抗原Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)中的至少一种在乳癌干细胞上表达。在部分方面中，该Globo H抗原在乳癌肿瘤的上皮细胞上表达。

本发明涉及一种癌症疫苗，其包含：(a)一免疫原性组合物，该组合物包含：一聚糖，其基本上由Globo H或其免疫原性片段构成，其中该聚糖经由一连接子而与载体蛋白复合；及一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质，其中该免疫原性组合物可诱发一免疫反应，该反应可诱发相较于IgM同工型抗体的较高相对含量IgG同工型抗体；以及(b)一医药可接受的赋形剂。

在部分方面中，该癌症疫苗包含一免疫原性组合物，其中该连接子是对-硝苯酚，该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)，且该佐剂是α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物。在一具体实例中，该佐剂是C34。

在部分方面中，该癌症疫苗用于治疗癌症，其中以有效量的该癌症疫苗所进行的一或多种治疗可抑制肿瘤生长。在部分具体实例中，该癌症疫苗的给予可使肿瘤尺寸减少。在部分具体实例中，该癌症选自由下列所组成的群：乳癌、肺癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、皮肤癌、肾癌、脑瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肠癌、及膀胱癌。

本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含：(a)一聚糖，其基本上由Globo H-相关性聚糖或其免疫原性片段构成，其中该聚糖经由一连接子而与载体蛋白复合；及(b)一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质，其中该Globo H-相关性聚糖选自由SSEA-3及SSEA-4所组成的群，且其中该免疫原性组合物可诱发一免疫反应，该反应可诱发相较于IgM同工型抗体的较高相对含量IgG同工型抗体。

在该免疫原性组合物的部分方面中，该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)，该佐剂是α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物，且该连接子是对-硝基苯基连接子。在一具体实例中，该佐剂是C34。

本发明涉及一种对抗乳癌干细胞的治疗剂，该治疗剂包含：经由对-硝基苯基连接子而与白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)载体蛋白复合的Globo H；及一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质。在该治疗剂的部分具体实例中，该佐剂是C34。

本发明涉及一种对抗乳癌干细胞的治疗剂，该治疗剂包含：经由对-硝基苯基连接子而与白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)载体蛋白复合的SSEA-3；及一佐剂，其包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质C34。

本发明涉及一种对抗乳癌干细胞的治疗剂，该治疗剂包含：经由对-硝基苯基连接子而与白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)载体蛋白复合的SSEA-4。在部分具体实例中，该治疗剂还包含一佐剂，该佐剂包含可结合树状细胞上的CD1d分子的糖脂质。

该些本发明的治疗剂对于一对象的给予可诱发抗体生成，该些抗体可鉴定表达在乳癌干细胞(BCSC)上的抗原，其中该抗原选自由Globo H、SSEA-3、及SSEA-4所组成的群。本发明涉及一种治疗乳癌的方法，其包含给予本发明的治疗剂。

附图简要说明

下列的附图形成本说明书的一部份，且其为进一步说明本公开内容的部分方面而包括，该些方面所述的发明将可在参照一或多张这些图并结合本文所呈现的特定具体实例时而更为明了。就说明本发明的目的，在图中显示目前为较佳的具体实例。然而，应明了，本发明并不限于所示的明确安排及手段。本专利或专利申请文件含有至少一张彩色制图。本专利或专利申请公开案(含彩色图)的复印件将依请求及缴付必要费用后由专利局提供。

图1显示Globo H及切截衍生物的结构。

图2A-2C分别显示单克隆抗体VK9及Mbr1(针对Globo H)及抗-SSEA-3的结合特异性。

图3A-3B显示经各种Globo H复合物及α-GalCer进行疫苗接种的小鼠的血清反应。对三只C57BL/6小鼠组，在有或无2μg糖脂质的情形下，以1μg的糖复合物，由s.c.进行疫苗接种。将小鼠血清分别稀释1:60及1:240以进行IgM(图3A)及IgG(图3B)抗体分析。在532nm，PMT 500下，使用Cy3-抗-小鼠IgG或IgM次级抗体进行荧光侦测。数据以三只小鼠的平均荧光强度±SEM表示。

图4显示α-GalCer及类似物的结构。

图5显示经Globo H复合物及α-GalCer衍生物进行疫苗接种的小鼠的IgM含量。收集小鼠血清，并在第二及第三次疫苗接种后进行分析，如其所示。在532nm，PMT 400下，使用Cy3次级抗-小鼠IgM进行侦测。结果以三只小鼠的平均荧光强度±SEM表示。

图6显示疫苗接种后小鼠多株抗体(抗-Globo H、抗-Gb5、抗-SSEA-4、及抗-Gb4)的良好特异性。在有或无2μg糖佐剂的情形下，以1.6μg GH-DT，进行第三次疫苗接种两周后取得小鼠血清(母鼠，Balb/c，i.m.)。以聚糖微阵列分析IgG效价，并将其定义为产生大于1000的MFI(背景值的10倍)，PMT 400的最高稀释度。各点代表个别小鼠效价。

图7显示Globo H-DT与不同佐剂所产生的IgM对IgG抗体效价。

图8显示针对佐剂对于GH-KLH疫苗的活性的评估。对母Balb/c小鼠，以1.6μg GH-KLH与2μg所示佐剂由i.m.进行疫苗接种，并在疫苗接种后每两周取血一次。稀释血清，并将其引入微阵列分析。

图9显示免疫后的抗体同工型谱剖析。如所述对小鼠进行疫苗接种。将血清(1:60稀释物)引入微阵列以进行抗体亚群分析(532nm，PMT 300)。数据以三只小鼠的平均荧光±SEM表示。

图10显示由SSEA-3-DT或SSEA-4-DT与不同类型糖脂质佐剂所诱发的IgM对IgG抗体效价。

图11显示细胞表面24种聚糖的结构。

图12A-12C显示针对不同疫苗所诱发的IgG的交叉反应性研究。图12A：由Globo H-DT与C1佐剂所诱发的抗-Globo H IgG；图12B：由Gb5-DT与C1佐剂所诱发的抗-Gb5IgG；图12C：由SSEA-4-DT与C1佐剂所诱发的抗-SSEA-4IgG。

图13显示小鼠异种移植模式。在无菌PBS中制备2x 10⁵个4T1小鼠转移性乳腺种瘤细胞，并由皮下注射以对Balb/c小鼠进行疫苗接种。以Vernier卡尺测量小鼠肿瘤尺寸，并将其定义为(长度x高度x宽度)/2(mm³)。

图14显示合成Globo H半酯及糖复合物的流程。

图15显示对于原始乳癌干细胞中SSEA-4表达的流式细胞计数分析。以四色免疫荧光染色及后续的流式细胞计数分析，对BCSCs及非-BCSCs表面的SSEA-4表达。BCSCs定义为CD45^-/CD24^-/CD44⁺细胞，而非-BCSCs则定义为该CD45^-细胞的其余种群，如左栏所示。BCSCs及非-BCSCs表面的目标抗原表达分别示于中及右栏。虚线代表同工型对照组，而数字代表阳性细胞的百分比。

图16显示正常组织中SSEA-4的局限表达。使用正常组织阵列的免疫组织化学染色，检验乳房、小肠、及直肠中的SSEA-4表达。SSEA-4的阳性染色局限在上皮细胞的顶表面。

具体实施方式

本发明涉及令人惊讶的发现DT-CRM197是对于Globo H及SSEA-4的有望载体蛋白，这不仅是因为其已广泛用于对抗白喉的人类疫苗接种长达数十年，也是因为其高度免疫原性。最重要的是，其已由FDA核准用于各种糖复合物疫苗。白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)是一种DT的无毒性突变物(G52E)，其与该原始分子共同享有免疫原性以及其结合肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的能力，该肝素结合性表皮生长因子是DT的特异性细胞膜受体，其常在癌症中过表达(Buzzi S.et al.,Cancer Immunology,Immunotherapy(2004),53(11):1041-1048)。

使用C34作为佐剂，GH-DT及SSEA-4-DT两者都显示出最为有效的免疫反应，诱发相较于IgM抗体的较多IgG抗体对抗肿瘤抗原。GH-DT结合C34可诱发出不仅可中和Globo H而且也可中和SSEA-3(Gb5)及SSEA-4的抗体，其皆为乳癌细胞及癌干细胞特异性的。

同时，本发明所公开的聚糖微阵列可提供用于进行抗体特异性试验的强力平台，并可用于鉴定病患而进行疫苗试验以及监测其在免疫接种后的免疫反应。

在下列的详述中，其参照附图，该些图形成本发明叙述的一部分，且其中以说明方式显示可予实施的特定具体实例。这些具体实例以细节进行叙述，以使本领域技术人员可实施本发明，且需明了者，可使用其它具体实例，且可在不偏离本发明范围的情形下进行结构、逻辑、及电学的改变。下文对于例示具体实例的详述因此不应被视为任何限制，而本发明的范围由附呈的权利要求范围定义。

除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有本领域熟练技术人员所通常明了的相同意义。尽管与本文所述类似或相当的任何方法或材料皆可用于实施或试验本发明，现叙述较佳的方法及材料。所有本文所提及的刊物及专利皆为了所有目的纳入作为参考，包括叙述及公开该些刊物中所报告的可结合本发明使用的化学品、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析、及方法。本专利说明书中所引述的所有参考文献皆被视为本领域的技术水准指标。本文中并无任何事物被视为承认本发明不符合以较早的发明而居先于这些公开。

在叙述本发明的材料及方法之前，须明了本发明并不限于所述的特定方法、流程、材料、及试剂，因其可变化。也须明了，本文所用的术语仅为叙述特定的具体实例，且其并不欲用以限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书的范围限制。

定义

必须指出，在本文且在所附权利要求中，单数形式“一”及“该”包括其复数的参照，除非该内容明确指出并非如此。同时，“一种”、“一或多种”、及“至少一种”可在本文中交换使用。也需指出，名词“包含”、“包括”、及“具有”可交换使用。

除非另有明示，本发明的实施将使用分子生物学、微生物学、重组DNA、及免疫学的常规技术，其属于本领域的技术。这些技术在文献中有完整说明。参见，例如，MolecularCloning A Laboratory Manual,2nd Ed,Sambrook ed.,Fritsch and Maniatis(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glovered.,1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology,Vols.154and155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayerand Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；及Handbook OfExperimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)。

本文所用术语“脂质”指参与细胞信号传导途径的任何脂溶性(亲脂性)分子。

本文所用术语“糖脂质”指连附糖的脂质，其可作为细胞鉴定的标记物。

本文所用术语“α-半乳糖苷基神经酰胺”或“α-GalCer”指一种糖脂质，其可刺激天然杀手T细胞产生T辅助细胞(TH)1及TH2细胞因子两者。本文所用的糖脂质衍生物C34具有下列结构：

本公开内容的α-GalCer类似物包括细菌来源的α-GalCer类似物(第I组：C2、C3、及C14)，经磺化作用修饰的α-GalCer类似物(第II组：C4、C5、及C9)，苯基-烷基链α-GalCer类似物(第III组：C6-C8、C10-C11、C15-C16、C18-C34、C8-5、及C8-6)，以及植物鞘胺醇(phytosphingosine)切截的α-GalCer类似物(第IV组：C12、C13、及C17)。C34及其它α-半乳糖苷基神经酰胺类似物的结构以及其作为佐剂的用途详细公开于PCT专利申请PCT/US2008/060275(2008年4月14日申请)。

合成的α-GalCer类似物(包括C34)可与CD1d分子形成复合物。合成的α-GalCer类似物可由NKTs T细胞受体鉴定。合成的α-GalCer类似物可激发TH1-型、TH2-型、或TH1-型、以及TH2-型反应。α-GalCer类似物可在试管中活化NKTs。α-GalCer类似物可在活体内活化NKTs。

本文所用术语“聚糖”指多糖或寡糖。聚糖也在本文中用以指称糖复合物的糖部分，诸如，糖蛋白、糖脂质、糖肽、糖蛋白质组、肽聚糖、脂多糖、或蛋白聚糖。聚糖通常仅由单糖间的O-糖苷键构成。举例而言，纤维素是一种聚糖(或者更特定言之为葡聚糖)，其由β-1,4-连结性D-葡萄糖构成，而几丁质是由β-1,4-连结性N-乙酰基-D-葡糖胺构成。聚糖可为单糖残基的同或异聚物，且其可为直链或支链。聚糖可被发现连附于蛋白上，诸如在糖蛋白及蛋白聚糖中。其一般而言见于细胞的外表面。O-及N-连结性聚糖极常见于真核细胞，但尽管较不常见，其也可见于原核细胞。N-连结性聚糖可被发现连附于序列子中天冬酰胺的R-基氮原子(N)上。序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。

本文所用术语“糖蛋白”指经聚糖共价修饰的蛋白。共有四种类型的糖氮白：1)N-连结性糖氮白，2)O-连结性糖氮白(黏蛋白)，3)葡糖胺聚糖(GAGs，其也称为蛋白聚糖)，4)GPI-锚定蛋白。大部分的糖蛋白具有结构微异质性(在相同糖基化位点连附多种不同的聚糖结构)以及结构巨异质性(多重位点及类型的聚糖连附)。

本文所用术语“抗原”定义为任何可激发免疫反应的物质。

本文所用术语“免疫原”指抗原或可诱发抗原生成的物质，诸如，DNA疫苗。

本文所用术语“免疫原性”指免疫原、抗原、或疫苗刺激免疫反应的能力。

本文所用术语“免疫疗法”指根据调节免疫系统的概念而达成预防和/或治疗目标的一组治疗策略。

本文所用术语“CD1d”指一种表达在各种人类抗原呈递细胞表面的CD1(分化群1)糖蛋白家族的成员。经CD1d呈递的脂质抗原可活化天然杀手T细胞。CD1d具有一个深抗原结合沟槽，其中结合糖脂质抗原。表达在树状细胞上的CD1d分子可结合及呈递糖脂质，包括α-GalCer类似物，诸如，C34。

本文所用术语“适应性免疫系统”指可排除病原挑战的高度特化性、系统性的细胞及反应。适应性免疫系统的细胞是一种类型的白细胞，称为淋巴细胞。B细胞及T细胞是主要类型的淋巴细胞。

本文所用术语“T细胞”及“Ts”指一群称为淋巴细胞的白血球细胞，其在细胞中介性免疫力中扮演中心角色。通过其细胞表面存在称为T细胞受体(TCR)的特殊受体，T细胞可与其它淋巴细胞类型区隔，诸如，B细胞及NKs。已描述出数种不同亚群的T细胞，各自具有独特的功能。辅助T(TH)细胞系适应性免疫系统的“中间人”。一旦受到活化，其便快速分裂并分泌称为细胞因子的小分子蛋白，该些蛋白可调控或“协助”免疫反应。根据所接收到的细胞因子信号，这些细胞会分化成为TH1、TH2、TH17、或其它亚群之一，其可分泌不同的细胞因子。

本文所用术语“抗原呈递细胞”(APC)指以其表面的主要组织兼容性复合体(MHC)展示外源抗原复合物的细胞。T细胞可使用其TCR而鉴定此种复合物。树状细胞(DCs)属于此种作用类型，且其可以CD1对T细胞呈递抗原。在一例示性的实施中，用于本发明方法中的DCs可为数种DC亚群中的任何一者，其在一实施中是由淋巴分化产生，或者，在另一实施中是由骨髓祖细胞分化产生。

本文所用术语“原初细胞”指未分化的免疫系统细胞，例如，CD4T细胞，其尚未经特化以鉴定特定病原。

本文所用术语“天然杀手细胞”及“NKs”指一种类型的淋巴细胞，其由干扰素活化，以参与对抗病毒及其它胞内病原的先天性宿主防御。

本文所用术语“天然杀手T细胞”(NKTs)指一种T细胞亚群，其与常规的Ts及NKs两者共有相同的特征/受体。诸多这些细胞可鉴定非多形性的CD1d分子，该分子是一种可结合自体及外源脂质及糖脂质的抗原呈递分子。NKTs的TCR可鉴定由CD1d分子呈递(伴随)的糖脂质分子。NKTs的主要反应之一为在刺激之后快速分泌细胞因子，包括IL-4、IFN-γ、及IL-10，并因此影响多种免疫反应及病原作用。NKTs可为同质种群或异质种群。在一例示性的实施中，该种群可为“非不变性NKTs”，其可包含人类及小鼠骨髓以及人类肝脏T细胞种群，其是，例如，表达各种TCRs的CD1d-反应性非不变性T细胞，且其也可产生大量的IL-4及IFN-γ。最为所知的CD1d-依赖性NKTs亚群表达不变的TCR-α链。这些被称为I型或不变NKTs(iNKTs)。这些细胞在人类(Vα24i NKTs)及小鼠(Vα14i NKTs)间具保守性，且其涉及诸多免疫作用。

本文所用术语“细胞因子”指诸多小型、经分泌蛋白中的任一种，其可通过影响免疫细胞的分化作用(通常涉及基因表达的改变，该些基因表达使前驱细胞成为迥异的特化细胞类型)而调控免疫反应的强度及持续时间。细胞因子已根据其推测功能、分泌细胞、或作用目标而各命名为淋巴因子、白介素、及趋化因子。举例而言，部分常见的白介素包括，但不限于，IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、及TGF-β。

本文所用术语“趋化因子”指在感染位点所释出的各种小型趋化性细胞因子中的任何一种，其可提供一种使淋巴细胞移动及活化的工具。趋化因子可将白细胞吸引至感染位点。趋化因子具有保守性的半胱氨酸残基，其可使其区分为四组。该些组群及代表性的趋化因子为C-C趋化因子(RANTES、MCP-1、MIP-1α、及MIP-1β)、C-X-C趋化因子(IL-8)、C趋化因子(淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin))、及CXXXC趋化因子(分形素(Fractalkine))。

本文所用术语“TH2-型反应”指一种表达细胞因子以使某些类型的细胞因子、干扰素、趋化因子产生的模式。典型的TH2细胞因子包括，但不限于，IL-4、IL-5、IL-6、及IL-10。

本文所用术语“TH1-型反应”指一种表达细胞因子以使某些类型的细胞因子、干扰素、趋化因子产生的模式。典型的TH1细胞因子包括，但不限于，IL-2、IFN-γ、GMCSF、及TNF-β。

本文所用术语“TH1偏性”指一种免疫原反应，其中使TH1细胞因子和/或趋化因子的生成的增加程度大于TH2细胞因子和/或趋化因子的生成。

本文所用术语“抗原表位”定义为抗原分子与抗体或T细胞受体的抗原结合位点接触的部分。

本文所用术语“疫苗”指一种制剂，含有抗原，该抗原是由造成疾病的全生物体(经杀死或弱化者)或是这些生物体的组成分(诸如，蛋白、肽、或多糖)所构成，用以产生对抗由该生物体所造成的疾病的免疫力。疫苗制剂可为天然、合成、或是由重组DNA技术所衍生。

本文所用术语“免疫佐剂”指一种结合免疫原使用的物质，其可增强或修饰对于该免疫原的免疫反应。本发明的α-GalCer类似物是作为免疫佐剂以修饰或提升疫苗的作用，刺激经该疫苗给予的病患的免疫系统，使其对该疫苗产生更剧烈的反应。在一例示性的实施中，其使用类似物C34作为佐剂。

本文所用术语“明矾佐剂”指一种具有免疫佐剂活性的铝盐。此种试剂可吸收溶液中的蛋白抗原并使其沉淀；该所得的沉淀物可借着协助抗原由在接种位点所形成的疫苗贮集处缓慢释出而改良疫苗的免疫原性。

本文所用术语“抗肿瘤免疫治疗活性剂”指由本发明的疫苗所产生的抗体，其可抑制、减少、或消除肿瘤。

本文所用术语“抗原特异性”指一种细胞种群的特性，使其可通过提供特定的抗原或抗原片段而造成特定细胞的增殖。

本文所用术语“流式细胞计数”或“FACS”意谓一种技术，经由光学及电子侦测装置，用以检验悬浮于液流中的颗粒或细胞的物理或化学特性。

肽中的氨基酸残基将在后文中如下缩写：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；且甘氨酸为Gly或G。关于氨基酸的进一步叙述，请参见Proteins:Structure and Molecular Properties,Creighton,T.E.,W.H.Freeman&Co.,New York 1983。

本文所公开的该些组合物可被包括在医药或营养医学(nutraceutical)组合物中，结合本领域技术人员在阅读本公开内容时可鉴定的其它活性剂、载体、载剂、赋形剂、或佐剂。

该些医药或营养医学组合物较佳包含至少一种医药可接受的载体。在这些医药组合物中，本文所公开的组合物形成其“活性化合物”，也称为“活性剂”。本文所用术语“医药可接受的载体”包括溶剂、分散基质、包衣剂、抗菌及抗真菌剂、等张及吸收延迟剂、及其类似物，其可与医药给予相容。也可将补充的活性化合物纳入该些组合物中。医药组合物是经调配而使其与所欲的给予途径相容。给予途径的实例包括肠外(如，静脉内、皮内、皮下)、口服(如，吸入)、穿皮(局部)、穿黏膜、及直肠给予。用于肠外、皮内、或皮下施予的溶液或悬浮液可包括下列的组成：无菌稀释剂，诸如，注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如，苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如，抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如，乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如，醋酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；以及用以调节渗透度的试剂，诸如，氯化钠或葡萄糖。pH可以酸或碱调整，诸如，盐酸或氢氧化钠。该些肠外制剂可以装在玻璃或塑料制的安瓿、抛弃式针筒、或多剂量小瓶中。

本文所用的对象指人类及非人类灵长类(如，大猩猩、猕猴、狨猿)、家畜(如，绵羊、牛、马、驴、及猪)、宠物(如，狗、猫)、实验室试验动物(如，小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、仓鼠)、圈养的野生动物(如，狐狸、鹿)、以及任何其它可由本发明的试剂获益的生物。对于可由本发明的试剂获益的动物类型并无限制。不论其为人类或非人类生物，对象可被称为病患、个体、动物、宿主、或接受者。

适用于注射用途的医药组合物包括无菌水溶液(其为水溶性)或分散液，以及用于实时制备无菌可注射性溶液或分散液的无菌粉末。就静脉内的给予而言，适当的载体包括生理盐水、制菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)、或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情形下，该组合物应为无菌，且应为具有可轻易注射性程度的液态。其应在制造及贮存条件下为安定，并防腐对抗微生物(诸如细菌及真菌)的污染作用。该载体可为溶剂或分散基质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液态聚乙二醇、及其类似物)、以及其适当混合物。适当的流度可由，例如，使用包衣剂(诸如，卵磷脂)，在分散液的情形下维持所需的颗粒大小，以及使用界面活性剂而维持。微生物作用的防止可由各种抗菌及抗真菌剂达成，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙汞硫柳酸钠、及其类似物。在诸多情形下，其较佳在该组合物中将包括等张剂，例如，糖类、多元醇(诸如，甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化钠。可注射性组合物的延长吸收可借着在该组合物中包括可延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝及明胶。

无菌可注射性溶液可借着将所需量的活性化合物纳入适当的溶剂中，如所需结合上述成分中之一或组合，再进行过滤灭菌而制备。一般而言，分散液是借着将活性化合物纳入含有基础分散基质及选自上述的所需其它成分的无菌载剂中而制备。就用以制备无菌可注射性溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥或冷冻干燥，其可产生活性成分加上来自于其先前经无菌过滤溶液的任何其它所欲成分的粉末。

口服组合物一般而言包括钝性稀释剂或可食载体。就口服治疗性给予的目的而言，可使活性化合物与赋形剂混合，并以锭剂、片剂、或胶囊(如，明胶胶囊)的形式使用。也可使用液态载体制备口服组合物以作为漱口液。可将医药可兼容性黏合剂或是佐剂材料包括作为组合物的部分。锭剂、丸剂、胶囊、片剂、及其类似物可含有任何下列成分，或是具有类似性质的化合物：黏合剂，诸如，微晶纤维素、黄蓍胶、或明胶；赋形剂，诸如，淀粉或乳糖；崩解剂，诸如，藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂，诸如，硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如，胶体二氧化硅；甜味剂，诸如，蔗糖或糖精；或是调味剂，诸如，薄荷、水杨酸甲酯、或柑橘调味剂。

就吸入给药而言，化合物以气溶胶喷雾的形式，由含有适当推进剂(如，气体，诸如，二氧化碳)的加压容器或分配器中，或是由喷雾器传递。

全身性给药也可为穿黏膜或穿皮者。就穿黏膜或穿皮给予而言，其在调配物中使用适用于该待穿透屏障的穿透剂。这些穿透剂是本领域通常已知的，且包括，例如，就穿黏膜给予而言，清洁剂、胆盐、及梭链孢酸衍生物。穿黏膜的给予可经由使用鼻喷雾或栓剂而完成。就穿皮给予而言，可将活性化合物调配为油膏、软膏、凝胶、或乳霜，如本领域通常已知的。也可将该些化合物制备为栓剂形式(如，以常规栓剂基体，诸如，可可脂或其它甘油酯)或是保留灌肠剂以进行直肠传递。

根据实施，可将该些活性化合物与可保护该化合物不会自体内快速排除的载体而共同制备，诸如，控释调配物，包括植入物及微胶囊传递系统。可使用具生物可降解性、生物可兼容性的聚合物，诸如，乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、及聚乳酸。用以制备这些调配物的方法将是本领域技术人员明显可知。该些材料也可以商业方式而自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals,Inc.取得。也可使用脂质体悬浮液(包括可靶向感染细胞的具有对抗细胞特异性抗原的单克隆抗体的脂质体)作为医药可接受的载体。这些悬浮液可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利第4,522,811号所述，其于此并入本文作为参考。

较佳以剂量单元形式调配口服或肠外组合物，以便利给予并统一剂量。在本文中，剂量单元形式指物理不连续性的单元，其适合作为该待治疗对象的单一剂量；各个单位含有预定量的活性化合物(该量是经计算以产生所欲的治疗效应)，结合所需的医药载体。

这些化合物的毒性及治疗功效可以标准的医药流程而在细胞培养物或实验动物体内测定，如，测定LD50(可使50％的种群致死的剂量)以及ED50(对于50％的种群具治疗有效性的剂量)。毒性及治疗功效间的剂量比例是其治疗指数，且其可表示为比例LD50/ED50。具有高治疗指数的化合物是较佳的。尽管可使用具有毒性副作用的化合物，也应小心设计可使这些化合物靶向至经影响位置点的传递系统，以使对于未经感染细胞的潜在损伤降至最低，并因而减少副作用。

可使用取自细胞培养分析及动物实验的数据而调配用于人体的剂量范围。这些化合物的剂量较佳地落在某一循环浓度范围内，该范围包括ED50并具有极小的毒性或无毒性。剂量可在此范围内根据所用的剂形及所用的给予途径而变化。就任何用于本发明方法中的化合物而言，最初可自细胞培养分析估计治疗有效剂量。可在动物模式中调配某一剂量，以达成某一循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养物中所测定的IC50(即，可达成一半的最大症状抑制的试验化合物浓度)。这些信息可用以更精确判定人体内的可用剂量。可以，例如，高效液相层析测量血浆中的含量。

如本文所定义，活性化合物的治疗有效量(即，有效剂量)可介于自约0.001至100g/kg体重的范围，或是本领域技术人员在不须过度实验情形下即明显可知且可明了的其它范围。本领域技术人员将可明了，某些因子可影响有效治疗对象所需的剂量及时机，其包括，但不限于，该疾病或病症的严重性、先前的治疗、该对象的一般健康情形或年龄、以及其它存在的疾病。

根据另一方面，本领域技术人员可预期一或多种部件套组，该部件套组可执行至少一种本文所公开的方法，该部件套组包含二或更多种组合物，该些组合物包含单独或结合的根据至少一种上述方法的有效量的本发明组合物。

该些套组可能也包括组合物，包含活性剂、生物事件鉴定剂、或是其它可由本领域技术人员在阅读本公开内容时所鉴定的化合物。套组也可包含至少一种包含有效量的本发明组合物或细胞系的组合物。该些部件套组的组合物及细胞系可根据可由本领域技术人员所鉴定的流程而用以执行至少一种本文所公开的方法。

本文所用术语“多肽”指任何氨基酸残基的多聚体或聚合物。多肽可由二或更多种多肽链所构成。多肽包括蛋白、肽、或寡肽。多肽可为直链或支链。多肽可包含经修饰的氨基酸残基、氨基酸类似物、或非天然存在的氨基酸残基，且可由非氨基酸残基中断。包括在此定义中者如经修饰的氨基酸聚合物，不论该修饰为天然或是通过介入，如，形成双硫键、糖基化、脂化、甲基化、乙酰化、磷酸化，或是通过操纵。诸如，复合标记组成分。

本文所用术语“特异结合”指结合配对(如，抗体及抗原)间的交互作用。在各种情形下，特异结合可由约10-6摩尔/升、约10^-7摩尔/升、或约10^-8摩尔/升、或以下的亲和常数实施。

本发明的癌症疫苗

本发明的实施例之一是一种治疗癌症的方法，其对需要其的对象给予一有效量的免疫原性组合物，该组合物包含Globo H或其片段(如，阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3，也称为Gb5)或SSEA-4)以及一佐剂。目标癌症的类型包括，但不限于，乳癌(包括1-4期)、肺癌(如，小细胞肺癌)、肝癌(如，肝细胞癌)、口腔癌、胃癌(包括T1-T4)、结肠癌、鼻咽癌、皮肤癌、肾癌、脑瘤(如，星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、及脑脊髓膜瘤)、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、以及子宫内膜瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、及胃肠道基质瘤。

由位点分类的癌症包括口腔及咽的癌症(唇、舌、唾腺、口底、牙龈、及其它口部、鼻咽、扁桃腺、口咽、下咽、其它口/咽部)；消化系统的癌症(食道；胃；小肠；结肠及直肠；肛门、肛管、及肛门直肠；腹膜、网膜、及肠系膜；其它消化系统)；呼吸系统的癌症(鼻腔、中耳、及鼻窦；喉；肺及枝气管；胸膜；气管、纵隔、及其它呼吸系统)；间皮瘤；骨及关节；以及软组织(包括心脏)的癌症；皮肤癌，包括黑素瘤及其它非上皮性皮肤癌；卡波西氏肉瘤及乳癌；女性生殖系统的癌症(子宫颈；子宫体；子宫，未明示(NOS)；卵巢；阴道；阴门；及其它女性生殖系统)；男性生殖系统的癌症(前列腺；睪丸；阴茎；及其它男性生殖系统)；泌尿系统的癌症(膀胱；肾脏及肾盂；输尿管；及其它泌尿系统)；眼及眼眶的癌症；脑及神经系统的癌症(脑；以及其它神经系统)；内分泌系统的癌症(甲状腺及其它内分泌系统，包括胸腺)；淋巴瘤(何杰金氏(Hodgkin)病及非何杰金氏淋巴瘤)，多发性骨髓瘤，及白血病(淋巴细胞性白血病；骨髓性白血病；单核细胞性白血病；及其它白血病)。

可为本发明癌症疫苗适当目标的其它由组织学类型分类的癌症包括，但不限于，肿瘤，恶性；癌，NOS；癌，未分化型，NOS；巨细胞及纺缍细胞癌；小细胞癌，NOS；乳突癌，NOS；鳞状细胞癌，NOS；淋巴上皮癌，NOS；基底细胞癌，NOS；毛母质癌；移形上皮细胞癌，NOS；乳突状移形上皮细胞癌；腺癌，NOS；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌，NOS；结合性肝细胞癌及胆管癌；小梁腺瘤；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉症；实体癌，NOS；类癌，恶性；细支气管-肺泡腺癌；乳突状腺癌，NOS；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌，NOS；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌，NOS；乳突状及滤泡状腺癌，NOS；非包囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；类子宫内膜癌；皮肤附器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌，NOS；乳突状囊腺癌，NOS；乳突状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌，NOS；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性腺管癌；髓样癌，NOS；乳叶癌；炎性癌；柏哲氏(Paget)病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞状细胞癌；具鳞状细胞化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；卵巢颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；赛托利(Sertoli)细胞瘤；莱迪希氏(Leydig)细胞瘤，恶性；脂细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤，NOS；无黑色素性黑素瘤；表浅散播型黑素瘤；，NOS；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；类上皮细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤，NOS；纤维肉瘤，NOS；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤，NOS；子宫肌肉瘤，NOS；横纹肌肉瘤，NOS；胚胎型横纹肌肉瘤；腺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤，NOS；混合肿瘤，恶性，NOS；米勒氏(Mullerian)混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤，NOS；间充细胞瘤，恶性；布雷纳氏(Brenner)肿瘤，恶性；叶状茎肿瘤，恶性；滑膜肉瘤，NOS；间皮瘤，恶性；恶性胚胎瘤；胚胎癌，NOS；畸胎瘤，恶性，NOS；甲状腺肿样卵巢瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管瘤；血管内皮细胞瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管周围细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤，恶性；骨肉瘤，NOS；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤，NOS；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨的巨细胞瘤；尤文氏(Ewing)肉瘤，恶性；牙原性瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤，NOS；星形细胞瘤，NOS；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤，NOS；寡树突胶质细胞瘤，NOS；寡树突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤，NOS；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤，NOS；视网膜母细胞瘤，NOS；嗅神经生成性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤，NOS；何杰金氏病，NOS；何杰金氏副肉芽肿，NOS；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性，NOS；蕈状肉芽肿；其它特定的非何杰金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病，NOS；淋巴细胞性白血病，NOS；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病，NOS；嗜碱细胞性白血病；嗜伊红性白血病；单核细胞性白血病，NOS；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；骨髓性肉瘤；及多毛状细胞白血病。

本文所用术语“治疗”指对一对象施用或给予包括一或多种活性剂的组合物，该对象具有癌症、癌症的症状、或是倾向癌症的素因，该施用及给予的目的为治愈、治疗、缓和、减轻、改变、补救、改善、改进、或影响该癌症、癌症的症状、或是倾向癌症的素因。本文所用的“有效量”指在单独使用或是结合一或多种其它活性剂的情形下，欲对该对象产生治疗作用所需的各活性剂的量。如本领域技术人员所知，有效量会根据给予的途径、赋形剂的使用、以及其它活性剂的共使用而各有不同。

用于上述方法中的免疫组合物可含有一聚糖(即，含有糖分子部分的分子)，其是Globo H或其片段，以及一佐剂。Globo H含有六糖抗原表位(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)，并视情形含有一非糖分子部分的聚糖。其片段含有该六糖抗原表位以及，如适用，该非糖分子部分的片段的聚糖。这些寡糖可由惯常方法制备(参见，Huanget al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:15-20(2006))。如需要，其可与非糖分子部分连结。

母申请案美国专利申请案序号12/485,546是根据无法预见的发现：(1)SSEA-3，Globo H的立即前驱物，在乳癌干细胞中有高量的表达，并因此可作为乳癌治疗的适当标靶，以及(2)α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)是一种有效的佐剂，其可促进抗-Globo H及抗-SSEA-3抗体的生成。

美国专利申请案序号12/485,546提出一种免疫组合物，其含有Globo H或其片段(如，SSEA-3)以及一佐剂(如，α-GalCer)。Globo H或其片段可与匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)复合。在给予至对象(如，人类)体内时，此种免疫组合物可激发靶向Globo H或其片段的免疫反应(如，抗体生成)，并因此可有效治疗癌症(如，乳癌、前列腺癌、卵巢癌、及肺癌)。

美国专利申请案序号12/485,546涉及一种制备对于Globo H或其片段具有特异性的抗体的方法，其是对一非人类哺乳动物(如，小鼠、兔、山羊、绵羊、或马)给予上述的免疫组合物，并自该哺乳动物分离可结合Globo H或其片段的抗体。

本公开内容中所述的Globo H或其它聚糖是与蛋白载体复合，诸如，DT-CRM197。其接着可与佐剂(诸如，C34)及视情形的医药可接受性载体(如，磷酸缓冲盐水，或碳酸氢盐溶液)混合，以经由常规方法而形成免疫组合物(如，疫苗)。参见，如，美国专利第4,601,903；4,599,231；4,599,230；及4,596,792号。该组合物可被制备为可注射物、液态溶液、或乳液，且该载体是根据给予的方式及途径并根据标准医药实务而选择。适当的医药载体及稀释剂，以及为使用其的医药辅料，述于Remington's Pharmaceutical Sciences。该免疫组合物较佳含有α-GalCer作为佐剂。佐剂的其它实例包括，但不限于，霍乱毒素、大肠杆菌忌热性肠毒素(LT)、脂质体、免疫刺激性复合物(ISCOM)、或免疫刺激性序列寡脱氧核苷酸(ISS-ODN)。该组合物也可包括可协助体内输送的聚合物。参见，Audran R.et al.Vaccine21:1250-5,2003；以及Denis-Mize et al.Cell Immunol.,225:12-20,2003。在需要时，其还可含有少量的辅助物质，诸如，湿润及乳化剂，或pH缓冲剂，以增进该组合物激发免疫反应对抗Globo H或其片段中的糖分子部分的能力。本文所述的免疫组合物可由肠外给予(如，静脉注射、皮下注射、或肌内注射)。或者，可能需要其它给予模式，包括栓剂及口服调配物。就栓剂而言，黏合剂及载体可包括，例如，聚烯烃基二醇或三酸甘油脂。口服调配物可包括正常使用的赋形剂，诸如，举例而言，医药级的糖精、纤维素、碳酸镁、及其类似物。这些组合物可为溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物、或粉末的形式，且其含有10-95％的本文所述免疫组合物。

该免疫组合物是以可与该投剂调配物兼容的方式进行给予，且其给予量为具有治疗有效性、保护性、及免疫原性的量。给予的量取决于该待治疗的对象，包括，例如，该个体的免疫系统合成抗体及(如需要)产生细胞中介性免疫反应的能力。给予所需活性成分的精确量由执业医师的判断决定。然而，适当的剂量范围可由本领域技术人员轻易决定。起始给予及强化剂的适当方案也是可变的，但可包括一起始的给予再接续后续的给予。该疫苗的剂量也可能取决于给予途径，并根据该宿主的尺寸而变化。

本发明的免疫组合物也可用于在动物体内产生抗体以进行抗体的制备，该些抗体可用于癌症的治疗及诊断两者。在动物(如，小鼠、兔、山羊、绵羊、或马)体内制备单株及多株抗体及其片段的方法为本领域已知的。参见，例如，Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子以及其片段，诸如，Fab、F(ab')2、Fv、scFv(单链抗体)、及dAb(域抗体；Ward,et.al.(1989)Nature,341,544)。

Globo H-DT-CRM197及相关疫苗

以本文所述的方法合成Globo H(1)及其片段2-10。为进行蛋白复合，使纯化的Globo H半酯12与个别载体蛋白进行共置，如图14所示。

以MALDI-TOF分析定性该些Globo H-蛋白，以测定各个载体蛋白上的Globo H分子数目。Globo H纳入的平均数目列于表1。

表1. Globo H纳入的MALDI-TOF分析

^a MALDI-TOF中的峰m/z；N.D.:未测定；*GH-KLH由Optimer Inc.提供

GH-KLH复合物显示最大数目的Globo H纳入，大部分是因为KLH的较大尺寸以及较多Lys残基。也将使用对-硝基苯基连接子的相同流程应用于竹嵌纹病毒，其在病毒外壳上含有超过100,000个离氨酸残基。然而，该病毒在4℃下于磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)中反应时的不安定性为进一步研发的主要担忧。此外，GH-BaMV 16因其巨大的尺寸而限制了其由MALDI-TOF分析的侦测。

使合成的Globo H及切截片段(图1)以戊胺连接子连附于还原端，并共价固定于经NHS涂覆的玻璃玻片上。在该十一种寡糖中，选择九种压印在微阵列上。分别以50μM的九种Globo H类似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2)，使用12重复，对各个微阵列玻片进行点渍。

为验证微阵列上的糖类，使用小鼠单克隆抗体(针对Globo H的VK9及Mbr1，以及抗-SSEA-3)并使用对应的次级抗体(山羊抗-小鼠IgG及IgM)以检验集合特异性，而该些结果示于图2A-2C。该数据建议，VK9及Mbr1两者皆可鉴定Globo H以及外侧的四糖BB4，但MBr1也可轻微鉴定BB3。此外，抗-SSEA-3抗体可特异鉴定SSEA-3抗原(Gb5)而无任何交叉反应性。该些结果指出，Globo H微阵列可用于描绘取自经免疫小鼠的多株抗体的特异性及效价。

如先前所报告，以完全合成的Globo H疫苗及共给予的QS-21免疫小鼠可造成对抗人类乳癌细胞的抗体的生成；然而，尽管在数次加强免疫接种之后，该些小鼠抗体仍主要是IgM(Ragupathi G,et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128)。

以1μg的合成性Globo H-复合物，在有或无糖脂质佐剂α-GalCer(C1)的情形下，由皮下免疫一群小鼠。发现GH-KLH、GH-DT、及GH-BV是IgM诱发的最有效免疫原，其次为GH-TT及GH-BSA，如图3A所摘述，而α-GalCer可刺激免疫反应以诱发高量的IgM抗体。也在小鼠IgG抗体上观察到类似的倾向(图3B)，而该相对IgG含量高于IgM含量。简言之，尽管合成性糖复合物具有较低的糖密度，GH-DT具有与GH-KLH类似的免疫原性，而α-GalCer佐剂经显示可增强该免疫反应。

由于α-GalCer已经显示为GH-DT的有效佐剂，针对具有高于C1的较佳佐剂活性的其它糖脂质进行检验，如图4所示。以GH-DT及GH-BV在有或无糖脂质的情形下免疫小鼠群。取得血清，并将其引入聚糖微阵列分析。一般而言，小鼠抗-Globo H IgG效价随着免疫流程的进行而增加，但IgM含量则几乎与免疫接重次数无关(图5)。在GH-BV免疫接种组中，糖脂质-疫苗处理及单独疫苗处理间的IgM含量并无显着差异。尽管这些结果建议，GH-BV结合糖脂质并非一种有效的免疫方案，该不良的免疫原性可能是由BaMV的不安定性所造成。然而，α-GalCer类似物，特别是7DW8-5，则可与GH-DT合作良好而诱发小鼠免疫反应。

有趣的是，由GH-DT及各种糖脂质佐剂所产生的小鼠多株IgG抗体不仅可中和Globo H，也可与Gb5、SSEA-4、及Gb4交叉反应，而C34似乎为最有效的糖脂质佐剂(图6)。为寻找可诱发较IgM有高出许多的效价的IgG的新颖疫苗组合物，试验Globo H-DT复合物与糖脂质C1或C34或是市售可得的佐剂AlPO₄(磷酸铝)或MF59。

令人意外的，在第三次疫苗接种后，Globo H-DT与糖脂质C34可几乎完全专一的诱发IgG抗体(图7)。摘述之，新颖的糖脂质佐剂7DW8-5结合GH-DT复合物可增强抗-Globo HIgG及IgM抗体两者，而糖脂质佐剂C34结合GH-DT可诱发较IgM高出许多的IgG抗体效价。其对于SSEA-3(Gb5)及SSEA-4抗原也具有不同的结合亲和力，该两种抗原皆特异表达于乳癌干细胞的表面。

为进一步比较不同糖脂质佐剂对于Globo H疫苗的作用，兹以GH-KLH免疫七组小鼠。该些结果建议，与糖脂质一同进行疫苗接种的小鼠可诱发较高含量的抗-Globo H抗体(图8)。尽管MF59是一种强效佐剂，其无法与GH-KLH协作以诱发对抗Globo H的抗体。AlPO₄(磷酸铝)也显示对于抗体诱发无明显效应。另一方面，GH-KLH结合C34在第一及第二次免疫接种后显示较佳的免疫原性，但在第三次免疫接种后则显示与C1并无显着差异。整体而言，这些发现建议该些新颖糖脂质衍生物作为以糖为基础的疫苗佐剂的潜力。

细胞及体液免疫反应的性质不仅会由抗原及佐剂的组合影响，也会由载体及免疫途径影响。如Sesardic及其同事所述，DT-CRM197，一种无毒性的突变毒素，可诱发抗原特异性的T细胞增殖，并增加脾细胞的IL-2、IFN-γ、及IL-6生成，因此建议其在由Th1驱动的途径中所扮演的角色(Miyaji EN et al.(2001)Infect Immun 69:869-874；Godefroy S,etal.(2005)Infect Immun 73:4803-4809；Stickings P,et al.(2008)Infect Immun76:1766-1773)。尽管其细胞因子内容主要是Th1，抗-CRM197抗体的亚群为IgG1且无可侦测的IgG2a，其建议混合的Th1/Th2反应。这些结果促成针对Globo H疫苗的抗体同工型谱的评估，而本研究显示，GH-DT或GH-KLH结合糖脂质佐剂可主要诱发IgG1抗体及微量的IgG2a(图9)。

尽管糖脂质佐剂在经静脉(i.v.)单独给予时可增强TH1偏性细胞因子分泌，并未观察到抗体类型转换(IgG2a)。整体言之，糖脂质在增强细胞及体液免疫反应两方面皆扮演关键角色。

Globo H、SSEA-3、及SSEA-4癌症疫苗

合成并试验与DT复合的SSEA-3(Gb5)及SSEA-4。在第三次疫苗接种后，比较IgM及IgG的抗体效价，并发现SSEA-3-DT及SSEA-4-DT也可诱发较IgM高出许多的IgG效价(图10)。

由于GH-DT及C34可诱发抗体鉴定Globo H、Gb5、及SSEA-4，使用24种聚糖的阵列，在佐剂的存在下，针对SSEA-3-DT及SSEA-4-DT疫苗的特异性进行检验，将焦点放在IgG的研究(图11)。

如图12所示，以Globo H-DT及C34佐剂免疫的小鼠可诱发能够以高选择性鉴定Globo H、SSEA-3(Gb5)、及SSEA-4的抗体，而疫苗SSEA-3-DT与佐剂MF59则可诱发低选择性的高免疫反应。另一方面，SSEA-3-DT结合佐剂C34仅可诱发对抗Globo H、SSEA-3、及SSEA-4的抗体。

有趣的是，在有或无佐剂的情形下，SSEA-4-DT(唾液酸化-Gb5)可诱发特异鉴定SSEA-4及其切截结构(具有前端乳糖缺失的SSEA-4)的IgG及IgM抗体，在不由理论限制的情形下，假设唾液酸具高度免疫原性，且可诱发高度特异性的免疫反应。

以SSEA-3-DT-C34免疫小鼠可诱发具Globo H、SSEA-3、及SSEA-4反应性的抗体，此建议以Globo H为基础的疫苗可靶向表达Globo H、SSEA-3、及SSEA-4的肿瘤细胞及乳癌干细胞。

以Globo H-DT-C34免疫小鼠可诱发具Globo H、SSEA-3、及SSEA-4反应性的抗体，此建议以Globo H为基础的疫苗可靶向表达Globo H、SSEA-3、及SSEA-4的肿瘤细胞及乳癌干细胞。

以SSEA-4-DT免疫小鼠可诱发具SSEA-4反应性的抗体，此建议以SSEA-4-DT为基础的疫苗可靶向表达SSEA-4的肿瘤细胞及乳癌干细胞。

由肿瘤疫苗所造成的肿瘤尺寸缩减

为直接评估合成性糖复合物疫苗的功效，每周测量肿瘤尺寸3次，如图13所示。一般而言，使肿瘤在注射4T1(一种带有Globo H的乳癌细胞系)后生长2周。在第24天，所有结合糖脂质佐剂的疫苗接种组仍显示相较于单独使用GH-DT组及PBS对照组的较小肿瘤进程。该数据建议，以GH-DT及糖脂质佐剂进行的疫苗接种可在活体内延迟部分程度的肿瘤进程。

SSEA-3及SSEA-4在乳癌及BCSCs中的表达

已证实Globo H在BCSCs中表达，但其频率低于非-BCSCs，且在乳癌及BCSCs中，SSEA-3以高于Globo H的频率表达(Chang W-W.et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672，其以全文纳入本文作为参考)。

表2摘述35名乳癌病患的临床特征，其中测量其体内的SSEA-3或SSEA-4表达。中数年龄为48岁(介于自31至82岁)。其由一名0期、10名I期、19名II期、及5名III期构成。大部分的肿瘤样本具有浸润性腺管癌的病理(80.0％)，其中51.4％为ER阳性，且65.7％为淋巴结转移阳性。在表2中，SSEA-3或SSEA-4表达的范围是以总癌细胞中的阳性细胞百分比表示。使用t试验，针对相对于HER-2或淋巴结转移状态的SSEA-3或SSEA-4表达进行统计分析。HER-2表达是由免疫组织化学测定。在SSEA-3或SSEA-4在肿瘤上的表达量与各种临床病理因子之间并无显着相关，诸如，分期(SSEA-4:P＝0.3498；SSEA-3:,P＝0.9311)，或HER-2(SSEA-4:P＝0.0142；SSEA-3:,P＝0.0128)(表2)。

表2.乳癌病患的临床特征

以对于CD45、CD24、CD44的特异性抗体染色由参与病患以酶切消化分离的原始肿瘤细胞，并首先闸控出CD45⁺细胞以除去白细胞。为比较BCSCs与非-BCSCs间的SSEA-3或SSEA-4表达，根据其表面标记物的表达，将CD45^-肿瘤细胞进一步分离成为BCSCs与非-BCSCs。BCSCs是以CD45^-/CD24^-/CD44⁺细胞鉴定；而该CD45^-种群的其它部分则视为非-BCSCs。

使用此种方法，在35份肿瘤样本中评估BCSCs及非-BCSCs中的SSEA-3或SSEA-4表达。整体而言，在34/35(97.1％)的该些肿瘤中侦测到SSEA-4，并在27/35(77.1％)的该些肿瘤中侦测到SSEA-3(表3)。以流式细胞计数判定SSEA-3或SSEA-4表达。将BCSCs定义为CD45^-CD24^-CD44⁺细胞鉴定，而非-BCSCs则定义为剩余的该CD45^-细胞种群。范围是以总细胞中的阳性细胞百分比计算。

如表3所摘述，27/35(77.1％)的样本表达SSEA-3，其阳性细胞百分比的范围是自1.4％至66.4％。由25/35的肿瘤中分离的非-BCSCs表达SSEA-3，其阳性细胞百分比的范围是自24.3％至70.4％。相较言之，取自35个肿瘤中的23个(65.7％)的BCSCs显示具有SSEA-3的阳性染色，其阳性细胞百分比的范围是自5.0％至58.4％。

在表达SSEA-4的34/35(97.1％)个样本中，其阳性细胞百分比的范围是自0.5％至77.1％。由32/35的肿瘤中分离的非-BCSCs表达SSEA-4，其阳性细胞百分比的范围是自24.0％至78.1％。相较言之，取自35个肿瘤中的31个(88.6％)的BCSCs显示具有SSEA-4的阳性染色，其阳性细胞百分比的范围是自5.6％至83.6％。

表3. BCSCs与非-BCSCs中的SSEA4及SSEA3表达的比较

SEA-4在BCSCs中的表达

为比较BCSCs与非-BCSCs间的SSEA-4表达，根据其表面标记物的表达，将CD45⁺肿瘤细胞进一步分离成为BCSCs与非-BCSCs。BCSCs是以CD45^-/CD24^-/CD44⁺细胞鉴定；而该CD45^-种群的其它部分则视为非-BCSCs。此两种经闸控种群的各者中的SSEA-4表达随肿瘤样本而有不同，如图15所示。举例而言，病患BC0264的BCSCs，其占该总分离种瘤细胞中的5.7％，为SSEA-4阴性，而60.3％的非-BCSCs则表达SSEA-4。就病患BC0266而言，其仅在59.4％的非-BCSCs及55.7％的BCSCs中侦测到SSEA-4表达。就病患BC0313而言，其在32.4％的非-BCSCs及83.6％的BCSCs中侦测到SSEA-4表达。共计言在34/35(97.1％)的试验样本中侦测到SSEA-4，其阳性细胞百分比的范围是自0.5％至77.1％。(表3)。

SSEA-3及SSEA-4在正常组织中的表达

使用组织微阵列，以免疫组织化学染色，在20种不同器官中分析SSEA-4表达，如表4所示(E，上皮；C，结缔组织)。

表4.SSEA4在正常组织中的表达

SSEA-4在数种腺体组织的上皮细胞上表达，诸如，乳房、结肠、胃肠道、肾、肺、卵巢、胰、直肠、胃、睪丸、胸腺、及子宫颈(表4)。同时，以类似Globo H及SSEA-3的方式(ChangW-W.et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672)，SSEA-4的表达主要局限在上皮细胞的细胞质或顶表面，其基本上是免疫系统所无法进入的，如图16所示。

比较言之，Globo H在数种腺体组织的上皮细胞上表达，诸如，乳房、胃肠道、胰、前列腺、及子宫颈。SSEA3的分布类似Globo H，唯其不存在正常的乳房组织中，但存在于肾、直肠、睪丸、及胸腺中，该些组织为Globo H阴性(Chang W-W.et al.,(2008)Proc Natl AcadSci USA105(33):11667-11672)。

实例

纳入下列实例以说明本发明的较佳具体实例。本领域技术人员应可明了，该些实例中所公开的技术是根据发明人所发现可优良作用实施本发明的代表性技术，并因此可被视为构成其实施的较佳模式。然而，根据本揭示内容，本领域技术人员应可明了，可在所公开的特定具体实例中进行诸多改变并仍取得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神及范围。

一般性方法、材料、及仪器

材料

市售溶剂及试剂不经进一步纯化而以其收到状态使用，且购自Sigma-Aldrich、Acros、Merck、Echo chemical、及Senn Chemical。单克隆抗体Mbr1购自ALEXISbiochemicals，Cy3-复合性抗-小鼠IgG(IgG、IgG1、及IgG2a)以及IgM抗体购自JacksonImmuno Research。DT-CRM197蛋白及破伤风类毒素分别购自Merck及Adimmune。磷酸铝凝胶佐剂(AlPO₄)购自Brenntag Biosector。竹病毒及VK9单克隆抗体分别自林(Lin)及尤(Yu)博士的实验室制备。糖脂质衍生物由王(Wong)博士的实验室合成及提供。

一般性方法

在使用之前，研碎并活化用于糖基化作用的分子筛(MS,AW-300)。以分析性TLC盘(PLC硅胶-60,F254,2mm,Merck)监测反应，并在UV(254nm)下或以对-茴香醛染色而显影。在硅胶(40-63μm)或LiChroprep RP18(40-63μm)上进行闪蒸管柱层析。在使用前以ddH₂O清洗透析膜(Cellulose Ester,MCCO＝10,000)。

仪器

以Bruker Advance 600(600MHz/150MHz)NMR光谱仪，记录质子核磁共振(1H NMR)光谱，碳核磁共振(13C NMR)光谱。质子的化学位移以ppm单位(δ级)报告，并参照四甲基硅烷(δ＝0)。碳的化学位移也以百万分率(ppm单位，δ级)报告。使用DEPT 135(无畸变极化转移增强)测定多重性。数据如下表示：化学位移，多重性(s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝宽阔峰)，积分及偶合系数(J)为Hz单位。以BioTOF III取得高解析质谱，并以Ultraflex II TOF/TOF200使用MALDI-TOF MS。

实例1：与不同载体蛋白复合的Globo H的合成

使用过程控制的一锅化策略(programmable one-pot strategy)，合成Globo H(1；参见图11)及其片段2-10(Huang C-Y,et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20)。1的反应是以足够的同质双功能性(homobifunctional)连接子，于无水DMF溶液中，在室温下进行(Wu X,et al.(2004)Org Lett 6:4407-4410；Wu X,Bundle DR(2005)J OrgChem70:7381-7388)。反应可以TLC轻易监测。一旦自由胺消失并出现较大Rf产物，即蒸发该反应混合物以除去DMF，并以二氯甲烷及水清洗，以除去过量的连接子。最后，以反相(C18)管柱层析纯化产物，并以含有1％醋酸至40％甲醇于水中的水渐进溶析。接着对该溶液进行冻干，以产生浅黄色的产物12。最后，为进行蛋白复合，使纯化的Globo H半酯12(30-40当量)，与个别的载体蛋白，于磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.2)中，在室温下进行共置24小时(图14)。重要的是，必须将蛋白浓度调整至～5mg/mL，以使离氨酸残基与Globo H半酯的偶合达到最大程度。24小时后，稀释该糖复合物，并对去离子水进行透析，以除去剩余的对-硝基苯基。接着将该溶液冻干成为白色粉末，以产生13、14、及15。

以MALDI-TOF分析定性该些Globo H-蛋白复合物，以测定各个载体蛋白上的GloboH分子数目。Globo H纳入的平均数目列于上文所示的表1。

将糖复合物13、14、及15溶于ddH₂O中，产生约1pmol/μL的终浓度。选择芥子酸作为基质，并与新鲜制备的乙腈及去离子水(1:1v/v)混合，以产生含0.1％TFA的10mg/mL终基质浓度。在线性正离子模式下侦测各个样本，以取得m/z光谱。以m/z测定各糖复合物的分子量。糖复合物14显示异质性，指出平均2～4个纳入。GH-KLH复合物显示最大数目的Globo H纳入，大部分是因为KLH的较大尺寸以及较多Lys残基。也将使用对-硝基苯基连接子的相同偶合流程应用于竹嵌纹病毒，其在病毒外壳上含有超过100,000个离氨酸残基。然而，该病毒在4℃下于磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)中反应时的不安定性为进一步研发的主要担忧。此外，GH-BaMV 16因其巨大的尺寸而限制了其由MALDI-TOF分析的侦测。最后，将冻干的糖复合物贮存在-30℃，并在使用前以无菌水进行重构。

实例2：聚糖微阵列的制造及验证

使合成的Globo H及切截片段(图1)以戊胺连接子连附于还原端，并共价固定于经NHS涂覆的玻璃玻片上。在该十一种寡糖中，选择九种压印在微阵列上。对系列寡糖浓度(1、5、10、20、40、50、80、100μM)进行试验，以使结合亲和力及荧光强度最适化。分别以50μM的九种Globo H类似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2)，使用12重复，对各个微阵列玻片进行点渍。在80％湿度大气下反应后，将该些玻片在使用前贮存于室温下的干燥器中。

为验证微阵列上的糖类，使用小鼠单克隆抗体(针对Globo H的VK9及Mbr1，以及抗-SSEA-3)及对应的次级抗体(山羊抗-小鼠IgG及IgM)以检验集合特异性，而该些结果示于图2A-2C。该数据建议，VK9及Mbr1两者皆可鉴定Globo H以及外侧的四糖BB4，但MBr1也可轻微鉴定BB3。(Gilewski T el al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275；HuangC-Y,et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20.)此外，抗-SSEA-3抗体可特异鉴定SSEA-3抗原(Gb5)而无任何交叉反应性。该些结果指出，Globo H微阵列可用于描绘取自经免疫小鼠的多株抗体的特异性及效价。

实例3：小鼠免疫

在此实验中，以1μg的合成性Globo H(GH)-复合物，在有或无糖脂质佐剂α-GalCer(C1)的情形下，由皮下免疫一群小鼠。在每周间隔的三次免疫接种10天后，收集小鼠血清，并接着引入聚糖微阵列中，以评估抗体含量。兹发现GH-KLH、GH-DT、及GH-BV是IgM诱发的最有效免疫原，其次为GH-TT及GH-BSA，如图3A所摘述，而α-GalCer可刺激免疫反应以诱发高量的IgM抗体。也在小鼠IgG抗体上观察到类似的倾向(图3B)，而该相对IgG含量高于IgM含量。简言之，尽管合成性糖复合物具有较低的糖密度，GH-DT具有与GH-KLH类似的免疫原性，而α-GalCer佐剂经显示可增强该免疫反应。

由于C1已经显示为GH-DT的有效佐剂，针对具有高于C1的较佳佐剂活性的其它糖脂质进行检验，如图4所示。(Fujio M,et al.(2006)J Am Chem Soc 128:9022-9023.)

以1.6μg的GH-DT及GH-BV，在有或无2μg糖脂质的情形下，每周两次由肌内免疫小鼠群。在第三次疫苗接种两周后取得血清，并将其引入聚糖微阵列分析。一般而言，小鼠抗-Globo H IgG效价随着免疫流程的进行而增加，但IgM含量则几乎与免疫接重次数无关(图5)。在GH-BV免疫接种组中，糖脂质-疫苗处理及单独疫苗处理间的IgM含量并无显着差异。尽管这些结果建议，GH-BV结合糖脂质并非一种有效的免疫方案，该不良的免疫原性可能是由BaMV的不安定性所造成。然而，α-GalCer类似物，特别是7DW8-5，则可与GH-DT合作良好而诱发小鼠免疫反应。

有趣的是，由GH-DT及各种糖脂质佐剂所产生的小鼠多株IgG抗体不仅可中和Globo H，也可与Gb5、SSEA-4、及Gb4交叉反应，而C34似乎为最有效者(图6)。为寻找可诱发较IgM有高出许多的效价的IgG的新颖疫苗组合物，试验Globo H-DT复合物与糖脂质C1或C34或是市售可得的佐剂AlPO₄(磷酸铝)或MF59。令人意外的，在第三次疫苗接种后，GloboH-DT与糖脂质C34可几乎诱发IgG抗体(图7)。摘述之，新颖的糖脂质佐剂7DW8-5结合GH-DT复合物可增强抗-Globo H IgG及IgM抗体两者，而糖脂质佐剂C34结合GH-DT可诱发较IgM高出许多的IgG抗体效价。其对于Gb5及SSEA-4抗原也具有不同的结合亲和力，该两种抗原都特异表达于乳癌干细胞的表面。

为进一步比较不同糖脂质佐剂对于Globo H疫苗的作用，以GH-KLH免疫七组小鼠。该些结果建议，与糖脂质一同进行疫苗接种的小鼠可诱发较高含量的抗-Globo H抗体(图8)。尽管MF59是一种强效佐剂，其无法与GH-KLH协作以诱发对抗Globo H的抗体。AlPO₄(磷酸铝)也显示对于抗体诱发无明显效应。另一方面，GH-KLH结合C34在第一及第二次免疫接种后显示较佳的免疫原性，但在第三次免疫接种后则显示与C1并无显着差异。

DT-CRM197，一种无毒性的突变毒素，可诱发抗原特异性的T细胞增殖，并增加脾细胞的IL-2、IFN-γ、及IL-6生成，因此建议其在由Th1驱动的途径中所扮演的角色(MiyajiEN et al.(2001)Infect Immun 69:869-874；Godefroy S,et al.(2005)Infect Immun73:4803-4809；Stickings P,et al.(2008)Infect Immun 76:1766-1773)。尽管其细胞因子内容主要是Th1，抗-CRM197抗体的亚群为IgG1且无可侦测的IgG2a，其建议混合的Th1/Th2反应。这些结果促成针对Globo H疫苗的抗体同工型谱的评估，而本研究显示，GH-DT或GH-KLH结合糖脂质佐剂可主要诱发IgG1抗体及微量的IgG2a(图9)。

尽管糖脂质佐剂在经静脉(i.v.)单独给予时可增强Th1偏性细胞因子分泌，并未观察到抗体类型转换(IgG2a)。整体言之，糖脂质在增强细胞及体液免疫反应两方面皆扮演关键角色。

也以相同策略合成与DT复合的Gb5及SSEA-4。在第三次疫苗接种后，比较IgM及IgG的抗体效价，并发现Gb5-DT及SSEA-4-DT也可诱发较IgM高出许多的IgG效价(图10)。

实例4：由不同疫苗组合物所诱发的抗体的特异性研究

由于GH-DT及C34可诱发抗体鉴定Globo H、Gb5(SSEA-3)、及SSEA-4，使用24种聚糖的阵列，在佐剂存在下，针对SSEA-3-DT及SSEA-4-DT疫苗的特异性进行检验，将焦点放在IgG的研究(图11)。

如图12所示，以Globo H-DT及C34佐剂免疫的小鼠可诱发能够以高选择性鉴定Globo H、SSEA-3(Gb5)、及SSEA-4的抗体，而疫苗SSEA-3-DT与佐剂MF59则可诱发低选择性的高免疫反应。另一方面，SSEA-3-DT结合佐剂C34仅可诱发对抗Globo H、SSEA-3、及SSEA-4的抗体。

有趣的是，在有或无佐剂的情形下，SSEA-4-DT可诱发特异鉴定SSEA-4及其切截结构(具有前端乳糖缺失的SSEA-4)的IgG及IgM抗体。然而并不清楚该选择性的来源。

为直接评估合成性糖复合物疫苗的功效，每周测量肿瘤尺寸3次，如图13所示。一般而言，使肿瘤在注射4T1(一种带有Globo H的乳癌细胞系)后生长2周。在第24天，所有结合糖脂质佐剂的疫苗接种组仍显示相较于单独使用GH-DT组及PBS对照组的较小肿瘤进程。该初步数据建议，以GH-DT及糖脂质佐剂进行的疫苗接种可在活体内延迟部分程度的肿瘤进程。

实例5：Globo H半酯的制备

如下制备Globo H半酯：

Globo H半酯(12)

将Globo H胺1(5mg，4.54μmol)溶于无水DMF溶液中。接着加入对-硝基苯基醚连接子(8.8mg，22.7μmol)，并在室温下搅拌1～3小时。以TLC(1％AcOH于甲醇中)及宁海准试验(Ninhydrin test)监测反应。自由胺的消失及较大Rf产物的出现指出反应完成。在减压条件下并不予加热而蒸发该反应混合物以除去DMF，接着以CH₂Cl₂及含有1％醋酸的水萃取两次。以反相(C18)管柱层析浓缩及纯化该水溶液，并以含有1％醋酸的H₂O至MeOH:H₂O＝4:6渐进溶析。接着将该溶液冻干为浅黄色的固体产物12(5.4mg，产率88％)1H NMR(600MHz,D₂O)δ8.25(d,2H,J＝9.0Hz),7.28(d,2H,J＝9.0Hz),5.12(d,1H,J＝3.9Hz),4.79(d,1H,J＝3.7Hz),4.51(d,1H,J＝7.7Hz),4.44(d,1H,J＝7.7Hz),4.39(d,1H,J＝7.7Hz),4.31-4.28(t,2H,J＝7.7Hz),4.15-4.11(m,2H),3.99(d,1H,J＝2.0Hz),3.92(d,1H,J＝2.8Hz),3.89-3.44(m,33H),3.16(t,1H,J＝8.6Hz),3.10(t,2H,J＝6.7Hz),2.62(t,2H,J＝6.9Hz),2.20(t,2H,J＝6.6Hz),1.93(s,3H),1.62-1.49(m,4H)1.54-1.48(m,2H),1.45-1.40(m,2H),1.30-1.24(m,2H),1.11(d,3H,J＝6.5Hz)13C NMR(150MHz,D₂O)δ178.0,176.1,176.0,156.9,147.1,127.3,124.5,105.7,105.0,103.7,103.6,102.2,101.0,80.5,80.0,78.9,78.0,77.8,77.1,76.7,76.4,76.3,76.2,75.2,74.6,73.8,73.5,72.5,72.1,71.8,71.2,70.9,70.8,70.1,69.7,69.5,68.5,62.6,62.6,62.0,62.0,61.7,53.3,40.8,37.1,35.0,30.0,29.7,26.4,25.0,24.1,23.9,17.0HRMS:C₅₅H₈₇N₃O₃₅Na[M+Na]+计算值：1372.5018；实验值：1372.5016。

实例6：产生糖复合物的一般性流程

如下制备糖复合物：

将BSA、DT-CRM197、及破伤风类毒素(Adimmune,Taiwan)溶于100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中(～5mg/ml)，并在该溶液中加入30至40当量的Globo H半酯35。在室温下温和搅拌该混合物24小时。接着以去离子水稀释该混合物，并对去离子水进行5次更换的透析。接着将该溶液冻干成为白色粉末。以MALDI-TOF分析定性取得的Globo H-蛋白复合物，以测定糖纳入率。产生13、14、及15。41(GH-BSA)，MALDI-TOF发现76029、42(GH-DT-CRM197)发现62138、43(GH-TT)发现162902、44(GH-BaMV)并未测定。

实例7：

以ddH₂O重构糖复合物41、42、43及原始载体蛋白(～1μg/μL)。以乙腈及去离子水1:1新鲜制备基质芥子酸，以产生包括0.1％TFA的10mg/mL终基质浓度。温和加样并混合基质溶液及糖复合物，接着风干试验盘。在测量前须使用牛血清白蛋白进行校正。在线性正离子模式下侦测各个糖复合物及原始载体蛋白样本。使用平均分子量可计算出载体蛋白上的平均糖纳入数目。

实例8：聚糖微阵列的制备

以机器针(SMP3,TeleChem International Inc.,USA)，将～0.7nL的于压印缓冲液(含0.005％Tween-20的300mM磷酸缓冲液，pH 8.5)中的各种浓度含胺聚糖，自96孔沉积至涂覆NHS的玻璃玻片上，以印制微阵列(BioDot,Cartesian Technologies,USA)。分别以50μM的九种Globo H类似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2)，使用12重复，对各个微阵列玻片进行点渍。使经印制的玻片在80％湿度的大气中反应一小时，接着隔夜干燥。将该些玻片在使用前贮存于室温下的干燥器中。

实例9：血清学分析(聚糖微阵列)

以3％BSA/PBS缓冲液(pH 7.4)中的0.05％Tween 20对小鼠血清进行1:60的稀释以作为初步筛选。以50mM的乙醇胺对聚糖微阵列进行阻断1h，并在使用前以ddH₂O及PBS缓冲液清洗两次。接着将该些血清稀释物引入Globo H微阵列中，并在室温下共置1h。分别以PBST(PBS缓冲液中的0.05％Tween-20)及PBS缓冲液进一步清洗该些微阵列玻片三次。下一步，在该些微阵列玻片中加入Cy3-affiniPure山羊抗-小鼠IgG(H+L)、IgG1、IgG2a或抗-小鼠IgM，并接着密封以在室温下进行1小时的共置。最后，顺序以PBST、PBS、及ddH₂O清洗该些玻片三次。干燥该些微阵列玻片，接着以微阵列荧光芯片视读器(Genepix 4000B)，在532nm进行扫描。以软件GenePix Pro 6.0(Axon Instruments,Union City,CA,USA)分析数据。为取得精确的测量，将光电倍增管增益值(PMT Gain)调整至400避免荧光饱和。自各个聚糖点的信号中减去局部背景值。略去具有明显缺点或无可侦测信号的点。最终的荧光强度定义为重复实验点的“F532nm–B532nm的中数”的平均值。

实例10：血清学分析(酶连免疫吸附分析)

在4℃下，将100μl碳酸氢钠缓冲液(pH 10)中的0.2μg Globo-H神经酰胺涂覆于96-孔板(NUNC)中隔夜。以PBS清洗，并以3％胎牛血清白蛋白在室温下进行阻断30分钟。在各孔中加入小鼠血清的系列稀释物，并在室温下共置1h，接着以DPBST(杜氏(Dulbecco)磷酸缓冲盐水，0.05％Tween20)清洗。加入山羊抗-小鼠IgG-AP(1:200,Southern Biotech.,USA)，并在室温下共置45分钟。以PBST清洗试验盘五次，接着在37℃下与碱性磷酸酶受质对-硝基苯磷酸(Sigma)进行共置8分钟。在共置之后，加入3M NaOH溶液以中止反应，并在ELISA视读器(SpectraMax,Molecular Devices)上，以405nm视读试验盘。效价定义为产生大于0.1的光学密度的最高稀释度。

实例11：剂量及免疫

(1)对三只小鼠组(6周龄母C57BL/6小鼠,BioLASCO,Taiwan)，在有或无糖脂质佐剂C1或7DW8-5的情形下，分别将GH-KLH(Optimer Inc.)、GH-BSA、GH-TT、GH-CRM197、及GH-BaMV，由皮下给予至腹部区域，以每周的间隔给予三次。各次疫苗接种含有1μg的Globo H以及有或无2μg的糖脂质佐剂。对照组小鼠仅注射磷酸缓冲盐水(PBS)。在第一次免疫(免疫前)及第三次免疫10天后对小鼠进行取血。(2)对三只小鼠组(8周龄母Balb/c小鼠,BioLASCO,Taiwan)，在有或无C1、C23、或7DW8-5的情形下，分别将GH-BaMV或GH-CRM197，以两周的间隔由肌内免疫三次。各次疫苗接种含有1.6μg的Globo H以及有或无2μg的佐剂。对照组小鼠注射磷酸缓冲盐水(PBS)。在免疫前及各次免疫2周后对小鼠进行取血。(3)对三只小鼠组(8周龄母Balb/c小鼠,BioLASCO,Taiwan)，在有或无佐剂C1、C17、7DW8-5、C30、AlPO₄、MF59(1:1混合物)的情形下，如(2)所述进行免疫。所有的血清都是借着在4000g下离心10分钟而取得。以聚糖微阵列分析血清学反应分析血清学反应或与常规的ELISA分析比较。

实例12：异种移植模式

(1)对五群经免疫的母Balb/c小鼠(分别为PBS，单独或结合C1、C23、及7DW8-5的GH-CRM197)，在最终的免疫接种8周后，由皮下注射2x 10⁵个转移性小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1(于无菌PBS中)。(2)对七群经免疫的母Balb/c小鼠(分别为单独或结合C1、C17、8-5、C30、AlPO₄、及MF59的GH-KLH)，在最终的免疫接种6周后，由皮下注射2x 10⁵个转移性小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1(于无菌PBS中)。在肿瘤异种移植之前及之后监测小鼠抗-Globo H血清。每周以Vernier卡尺测量小鼠肿瘤尺寸三次，并将其定义为(长度x高度x宽度)/2(mm³)。

实例13：自人类乳癌样本分离原始肿瘤细胞

由已在三军总医院(台北，台湾)进行初次手术的病患取得人类乳癌样本。将样本完全编码以保护病患的隐私权，并将其以中央研究院医学研究伦理委员会(台北，台湾)所核准的操作流程使用。将肿瘤样本切片为1mm²的正方形片段，再使其于含有胶原酶(1,000U/ml)、玻尿酸酶(300U/ml)、及DNase I(100μg/ml)的RPMI1640培养基中，在37℃下共置2小时，而对其进行酶切消化。过滤通过100-μm细胞滤器(BD Biosciences)而收集原始乳癌细胞，并再悬浮于添加5％FBS的RPMI1640培养基中。

实例14：流式细胞计数分析

将原始乳癌细胞制备为含有2％FBS及0.1％NaN₃的PBS中的1×10⁵个细胞。以抗-CD24-PE、抗-CD44-APC、及抗-CD45-PerCP-Cy5.5的抗体混合物(各1μl)标记细胞。以复合Alexa488的单株抗-Globo H抗体(VK-9)染色以侦测Globo H的表达。分析是在FACSCanto流式细胞计数器(Becton Dickinson)上进行。BCSCs定义为CD45^-/CD24^-/CD44⁺细胞，而非-BCSCs则定义为该CD45^-细胞的其余种群。在闸控区域进一步分析Globo H的表达。

实例15：细胞分选

将移植进入小鼠体内的由人类乳癌取得的细胞，以抗-CD24-PE、抗-CD44-APC、及抗-H2K^d-FITC的抗体混合物(BD Biosciences)染色。在FACSAria细胞分选器(BectonDickinson)上进行经抗体标记细胞的荧光活化细胞分选。将H2K^d-/CD24^-/CD44⁺细胞分选为BCSCs；而其它的H2K^d-种群则分选为非-BCSCs。BCSCs及非-BCSCs的典型纯度分别为>85％及>90％。

实例16：免疫组织化学

针对SSEA-4在正常组织上的表达，使用含有20种不同器官的组织微阵列玻片(Biomax)，其中各器官衍生自五名个体。在56℃下隔夜干燥玻片，再根据标准的组织病理学流程进行复水，接着再以AR-10溶液pH 9.0(BioGenex Laboratories)进行抗原修复。使用抗-SSEA-4抗体(eBioscience)测定SSEA-4的表达。使用抗-大鼠IgM作为次级抗体侦测SSEA-4的染色，并以DAB受质显色。以苏木精对玻片进行对比染色。将原始乳癌BC0145及来自NOD/SCID小鼠的肿瘤异种移植物固定在10％磷酸缓冲福尔马林中，并包埋于石蜡中。以2μM的厚度切割石蜡切片，置于SuperFrost Plus显微检验玻片上(Menzel-)，再在55℃下隔夜干燥。在二甲苯中对该些切片进行脱蜡，再根据标准的组织病理学流程进行复水，接着以苏木精及曙红(H&E)染色。在进行免疫染色前，首先将该些玻片置于10mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中并微波15分钟。接着使该些玻片与抗-ER或抗-PR抗体隔夜共置。以超敏聚合物-HRP IHC侦测系统(Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System)(BioGenex)进行免疫侦测。

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尽管前文的发明已以说明及实例的方式，为明确明了的目的而以部分细节叙述，本领域技术人员将可轻易明了，根据本发明的教导，可对其进行变化及修饰而不偏离所附权利要求的精神或范围。

为符合37C.F.R.§1.72(b)的规定提供发明摘要，以使读者可快速确认本发明技术公开的性质及要旨。应明了发明摘要的提呈并不会用于解释或限制权利要求的范围或意义。

Claims (12)

1.一种免疫原性组合物，其包含：

(a)聚糖复合物，包括载体蛋白和聚糖，所述聚糖包括Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3或阶段特异性胚胎抗原-4，其中所述聚糖经由一连接子而与载体蛋白复合；及

(b)一佐剂，包含α-半乳糖苷基-神经酰胺的类似物，

其中该免疫原性组合物所产生的抗体可中和抗原Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3、及阶段特异性胚胎抗原-4中的至少一种；

其中该α-半乳糖苷基-神经酰胺的类似物其具有结构：

其中R选自(CH₂)₇PhF或(CH₂)₁₀PhF。

2.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197、白喉类毒素、破伤风类毒素、匙孔虫戚血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该连接子是对-硝基苯基连接子。

4.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197。

5.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该聚糖是Globo H。

6.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该聚糖是阶段特异性胚胎抗原-3。

7.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中该聚糖是阶段特异性胚胎抗原-4。

8.根据权利要求1的免疫原性组合物，进一步包括医药可接受的赋形剂。

9.根据权利要求1-8中任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗或抑制表达Globo H的肿瘤生长的药物中的应用，其中给予所述组合物诱发一免疫反应，其中所产生的抗体可中和抗原Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3、及阶段特异性胚胎抗原-4中的至少一种。

10.根据权利要求9的应用，其中该表达Globo H的肿瘤是乳肿瘤。

11.根据权利要求9的应用，其中该聚糖是Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3或阶段特异性胚胎抗原-4。

12.根据权利要求9的应用，其中该载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197。