CN110064050B - 含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用 - Google Patents

含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了含STn或F‑STn的糖缀合物及其制备方法和在制备抗肿瘤疫苗中的应用，属于糖类缀合物技术领域。含STn或F‑STn的糖缀合物，所述糖缀合物包括STn或F‑STn和载体；所述STn或F‑STn通过连接键与载体偶联；所述连接键包括酰胺键、肟键或C‑N键；所述载体包括蛋白质、两性离子多糖、脂质或核酸。所述糖缀合物在制备抗肿瘤或癌症的疫苗或制备提高细胞和/或体液免疫应答的药物中的应用。F‑STn的糖蛋白缀合物制备的疫苗能够提高体液免疫和细胞免疫应答，且产生的抗体能够有效地识别STn阳性肿瘤细胞，并且通过ADCC及CDC途径裂解STn阳性肿瘤细胞。

Description

含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的 应用
技术领域
本发明属于糖类缀合物技术领域，具体涉及含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用。
背景技术
近年来，基于糖抗原的抗肿瘤疫苗成为一个研究的热点(Keding,S.Carbohydratevaccines.Chem.Eng.News.2004,82,31-35.)。其中抗原STn是一个含有唾液酸的二糖结构，在人类肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌等多有表达，而在正常组织中表达极少(Holmberg,L.ExpertRev.Vaccines 2004,3,655-663.)，因而成为肿瘤免疫治疗的重要靶点。
Biomira公司将天然STn抗原与载体钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)结合构建用于预防结直肠癌和乳腺癌转移的疫苗STn-KLH
Figure BDA0002044965070000011
然而，III期临床试验的结果表明，
Figure BDA0002044965070000012
未能减少疾病进展时间并增加总生存率(Miles,D.Oncologist.2011,16,1092-1100)。当患者接受
Figure BDA0002044965070000013
与激素联合治疗时，临床疗效不明显(Ibrahim,N.K.J.Cancer.2013,4,577-584)。其中一个可能的原因是STn免疫原性不足，不能在体内产生满意的免疫应答。
目前对于基于肿瘤相关糖抗原设计的抗肿瘤糖疫苗，主要通过以下策略提高疫苗的免疫应答，分别是：1)用佐剂来辅助，延长免疫反应时间及增强免疫应答水平(Bonam,S.R.Trends Pharmacol.Sci.2017,38,771-793)；2)通过与免疫原性载体结合诱导T细胞依赖的免疫反应(Astronomo,R.D.Nat.Rev.Drug Discovery.2010,9,308-324)；3)簇状抗原模拟肿瘤细胞表面的糖抗原结构，促进B细胞表面受体交联(Richichi,B.Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.2014,53,11917-11920)。尽管在这一领域已经取得了进展，但迄今为止还没有一种以肿瘤相关糖抗原为基础的疫苗获得FDA的批准。因此，提高糖抗原的免疫原性仍有很大的需求。
改良肿瘤相关糖抗原结构以提高疫苗免疫原性的概念最早由Jennings于1986年提出(Jennings,H.J.J.Immunol 986,137,1708–1713)。影响这一策略的主要因素之一是结构修饰糖抗原的抗体与天然抗原的亲和力。研究发现对STn进行适当的结构修饰能够提高免疫原性，其中N-丙酰STn所产生的抗体是STn-KLH的两倍(Sahabuddin,S.Tetrahedron.2010,66,7510-7519)，N-丙酰triSTn疫苗诱导的抗triSTn的IgG抗体能有效识别表达STn簇的癌细胞(Chang,T.C.Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.2018,57,8219-8224)。目前发现F-STn-KLH(两个乙酰基被氟乙酰基取代)与STn-KLH相比，可以有效抑制肿瘤的生长，显著延长荷瘤小鼠的生存时间。F-STn-KLH疫苗较强的抗肿瘤活性主要体现在细胞和体液免疫应答的增加(Song,C.Oncotarget.2017,8,47330-47343)。但是载体蛋白KLH是一种具有高糖基化的大型异质蛋白复合物，KLH蛋白的复杂性导致其制备的重复性差，限制了其临床应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有较高免疫活性的含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用。
本发明提供了含STn或F-STn的糖缀合物，所述糖缀合物包括STn或F-STn和载体；所述STn或F-STn通过连接键与载体偶联；所述连接键包括酰胺键、肟键或C-N键；
所述载体包括蛋白质、两性离子多糖、脂质或核酸；
所述STn或F-STn的结构式如I所示；
Figure BDA0002044965070000021
其中，所述式I为STn时，R1＝R2＝AcNH；
所述式I为F-STn时，R1＝R2＝FCH2CONH。
优选的，所述蛋白质包括白喉类毒素、破伤风类毒素或牛血清白蛋白；
所述两性离子多糖包括衍生自共生厌氧菌脆弱拟杆菌的荚膜多糖或肺炎链球菌4型荚膜多糖；
所述脂质包括α-半乳糖苷基-神经酰胺或单磷酰脂A；
所述核酸包括寡脱氧核苷酸CPG1826。
优选的，当载体为蛋白质时，所述糖缀合物的结构如式Ⅱ所示；
Figure BDA0002044965070000031
其中，m为蛋白质中赖氨酸的个数；所述NH-是蛋白质中赖氨酸上的氨基。
优选的，所述蛋白质为白喉毒素交叉反应性材料197或牛血清白蛋白。
本发明提供了所述糖缀合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将如式Ⅲ所示的一种化合物经臭氧氧化，得到含有醛基的二糖；
Figure BDA0002044965070000032
(2)将步骤(1)所得到的含有醛基的二糖在还原胺化的条件下与载体进行偶联，得到含STn或F-STn的糖缀合物。
优选的，所述臭氧的浓度为30～50mg/L，所述臭氧氧化的温度为-72℃，所述臭氧氧化的时间为10～30min。
优选的，所述还原胺化的条件添加NaBH3CN；所述含有醛基的二糖、载体和NaBH3CN的质量比为4：2：3；所述偶联的反应体系是PBS缓冲液；NaBH3CN的浓度为3.75mg/mL；
所述偶联的温度包括20～25℃；所述偶联的时间为24h。
本发明提供了所述糖缀合物或所述制备方法制备的糖缀合物在制备抗肿瘤或癌症的疫苗或制备提高细胞和/或体液免疫应答的药物中的应用。
本发明提供了一种抗肿瘤或癌症的疫苗，包括所述糖缀合物或所述制备方法制备的糖缀合物。
优选的，所述疫苗包括佐剂；所述佐剂包括油乳状佐剂；所述油乳状佐剂包括弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂。
本发明提供的含STn或F-STn的糖缀合物，所述糖缀合物包括STn或F-STn和载体；所述STn或F-STn通过连接键与载体偶联；所述连接键包括酰胺键、肟键或C-N键；所述载体包括蛋白质、两性离子多糖、脂质或核酸。小鼠实验表明，基于F-STn的糖蛋白缀合物疫苗在没有佐剂辅助的情况下，能够提高体液免疫应答，且产生的抗体能够有效的识别STn阳性肿瘤细胞，并且通过ADCC及CDC途径裂解STn阳性肿瘤细胞。在C34佐剂辅助下，F-STn糖蛋白缀合物疫苗能够轻微提高细胞免疫应答及明显提高抗体应答，在弗氏佐剂辅助下，F-STn糖蛋白缀合物疫苗能够同时提高细胞和体液免疫应答反应。总之，F-STn糖蛋白缀合物疫苗与STn原型相比，能够有效的识别并杀伤STn阳性肿瘤细胞，从而达到对抗肿瘤的作用。由于STn抗原表达在多种肿瘤上，例如在人类乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌，本发明提供的糖缀合物的应用范围广泛，由于STn表达在肿瘤细胞表面，属于自身抗原，在机体内易引起免疫耐受，所以结构修饰的F-STn的糖蛋白缀合物能够诱导机体产生的抗体是针对F-STn的，这样就克服了免疫耐受，同时F-STn的糖蛋白缀合物产生的抗体能够识别肿瘤细胞表面的STn，提高了免疫应答，所以STn的糖蛋白缀合物与F-STn的糖蛋白缀合物相比，具有相似的功能，但是免疫原性不如F-STn的糖蛋白缀合物。
附图说明
图1为本发明F-STn-CRM197及STn-CRM197的合成路线；
图2为小鼠脾淋巴细胞增殖结果；
图3为小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ及IL-4结果；图3a为小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ结果；图3b为小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-4结果；
图4为第三次免疫后及第四次免疫后每只小鼠血清的IgG滴度；其中图4a为第三次免疫后血清抗STn的抗体滴度；图4b为第四次免疫后血清抗STn的抗体滴度；
图5为第三次免疫后及第四次免疫后每组小鼠混合血清的IgG亚型；
图6为第四次免疫后测定小鼠血清与肿瘤细胞的结合；
图7为第四次免疫后测定小鼠血清杀伤肿瘤细胞。
具体实施方式
本发明提供了含STn或N-酰基修饰的唾液酸(α-(2→6))-D-氨基吡喃糖(F-STn)的糖缀合物，所述糖缀合物包括STn或F-STn和载体；所述STn或F-STn通过连接键与载体偶联；所述连接键包括酰胺键、肟键或C-N键；
所述载体包括蛋白质、两性离子多糖、脂质或核酸；
所述STn或F-STn的结构式如I所示；
Figure BDA0002044965070000051
其中，所述式I为STn时，R1＝R2＝AcNH；
所述式I为F-STn时，R1＝R2＝FCH2CONH。
在本发明中，所述蛋白质优选包括DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)、BSA等；两性离子多糖如PS A1(衍生自共生厌氧菌脆弱拟杆菌的荚膜多糖)、CPS4(肺炎链球菌4型荚膜多糖)等；脂质如α-GalCer(α-半乳糖苷基-神经酰胺)、MPLA(单磷酰脂A)等；核酸如寡脱氧核苷酸CPG1826等。本发明对所述载体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的载体的来源即可。本发明对所述STn或F-STn的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的STn或F-STn的来源即可。在本发明实施例中，所述F-STn的合成方法参见CN 102276662 A专利合成方法。
在本发明中，所述连接键包括酰胺键、肟键或C-N键，所述连接键的种类根据载体的种类不同选择不同的连接键。所述STn或F-STn的连接位置为
Figure BDA0002044965070000061
所述载体的连接基团优选为NH2-。
在本发明中，当载体为蛋白质时，所述糖缀合物的结构优选如式Ⅱ所示；
Figure BDA0002044965070000062
其中，m为蛋白质中赖氨酸的个数；所述-NH-是蛋白质中赖氨酸上的氨基。所述连接键为-O-CH2-CH2-NH-，其中-CH2-CH2-为糖和蛋白质之间的Linker，具体通过-C-N-连接。所述蛋白质优选为白喉毒素交叉反应性材料197(DT-CRM197)或牛血清白蛋白(BSA)。所述BSA中有60个赖氨酸，m＝60；所述DT-CRM197中有39个赖氨酸，m＝39。
在本发明中，所述糖缀合物还包括药学上可接受的盐形式。
本发明提供了所述糖缀合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将如式Ⅲ所示的一种化合物经臭氧氧化，得到含有醛基的二糖；
Figure BDA0002044965070000063
(2)将步骤(1)所得到的含有醛基的二糖在还原胺化的条件下与载体进行偶联，得到含STn或F-STn的糖缀合物。
在本发明中，所述臭氧的浓度优选为30～50mg/L，更优选为40mg/L。所述臭氧氧化的温度优选为-72℃。所述臭氧氧化的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，最优选为20min。所述臭氧氧化将式Ⅲ中烯烃基氧化成醛基。
在本发明中，所述还原胺化的条件优选添加NaBH3CN；所述含有醛基的二糖、载体和NaBH3CN的质量比优选为4：2：3；所述偶联的反应体系优选是PBS缓冲液；NaBH3CN的浓度为3.75mg/mL。所述偶联的温度优选为20～25℃；所述偶联的时间优选为24h。在所述还原胺化的条件将含有醛基的二糖和蛋白质中NH2-发生脱水同时还原形成-CH2-NH-连接键。
本发明提供了所述糖缀合物或所述制备方法制备的糖缀合物在制备抗肿瘤或癌症的疫苗或制备提高细胞和/或体液免疫应答的药物中的应用。
在本发明中，所述疫苗通过肌肉注射或者皮下给药，通过调动机体自身的免疫应答发挥肿瘤免疫治疗和/或预防的作用。所述疫苗优选还包括佐剂。所述佐剂优选包括油乳状佐剂；所述油乳状佐剂优选包括弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂。所述佐剂优选为α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物C34；所述C34的结构式如式Ⅳ所示：
Figure BDA0002044965070000071
在本发明中，所述提高细胞和/或体液免疫应答的药物通过提高免疫细胞的增殖和/或免疫细胞分泌相关细胞因子和/或抗体应答等发挥作用。
本发明提供了一种抗肿瘤或癌症的疫苗，包括所述糖缀合物或所述制备方法制备的糖缀合物。以糖浓度计算，每只小鼠免疫100μL糖缀合物，糖浓度是10～50μg/mL，更优选为20μg/mL。
在本发明中，所述疫苗优选包括佐剂；所述佐剂优选包括油乳状佐剂；所述油乳状佐剂优选包括弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂。所述佐剂优选为α-半乳糖苷基-神经酰胺(α-GalCer)的合成类似物C34。所述C34在所述疫苗中的浓度为20μg/mL。每只小鼠免疫2μg的C34。
在本发明中，所述疫苗还包含药学上可接受的载体或辅料。
下面结合实施例对本发明提供的含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
FITC-抗鼠IgG购自Jackson，HRP-抗鼠IgG,IgG1,IgG2a,IgG2b及IgG3购自Southern Biotechnology Associates，IL-4及IFN-γMouse ELISPOT Kits购自Mabtech，LDH试剂盒购自Promega，弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂购自Sigma。
实施例1
半抗原F-STn或STn与载体蛋白质偶联形成缀合物的制备方法
将半抗原(F-STn或STn，10mg)溶解于2mL无水甲醇中，-72℃下通入含有臭氧的空气(臭氧浓度为50mg/L)，当体系变成蓝色(约需10～30min)后，停止通臭氧，10min后体系仍然为蓝色。向反应体系通入氮气约10min，以便除去过量的臭氧。滴加二甲硫醚0.5mL，之后让反应体系温度自然升至室温，2h后将反应体系在真空下除去溶剂，即得到了含有醛基的半抗原。后者与5mg蛋白质CRM197共同溶解于pH值7.2、10mM的磷酸盐缓冲液中，加入氰基硼氢化钠7.5mg，室温下在摇床上反应24h。透析(透析膜截留分子量为14,000Da)后得到所需的糖蛋白缀合物STn-CRM197或F-STn-CRM197。图1为F-STn-CRM197及STn-CRM197合成路线。
实施例2
糖蛋白缀合物STn-CRM197或F-STn-CRM197免疫学活性试验
一、试验材料及来源
1、供试化合物：本发明实施例1所制备的糖蛋白缀合物。
二、试验方法
(一)小鼠免疫
每组6只Balb/c雌性小鼠，6～8周龄(Number:SCXKjing2012-0001,SPF/VAF)，购自北京大学医学部动物科学部并于动物部饲养。用STn-CRM197以及衍生的F-STn与CRM197的缀合物免疫小鼠，每次免疫的糖蛋白中含有2μg的糖(溶解于PBS)，每2周免疫一次，免疫途径根据佐剂不同采用不同方式，C34佐剂组采用肌肉注射，弗氏佐剂组及不加佐剂组采用皮下注射方式，共免疫4次。分别于免疫前、第3次免疫后13天及第4次免疫后14天取血，分离血清，于-80℃冰箱冻存待测。
(二)小鼠脾淋巴细胞增殖实验
1.脾淋巴细胞获取：第四次免疫后14天，处死小鼠，取脾脏置于2mL的RPMI-1640培养基中，纱布研磨脾脏使其成为单细胞，200目细胞筛过滤细胞。
2.裂解红细胞：1500rpm离心6min，弃上清，1mL培养基重悬细胞，加入4mL的0.84％氯化氨红细胞裂解液，冰上裂解4min。
3.清洗脾淋巴细胞：1500rpm离心6min，弃上清，5mL培养基洗两遍。
4.脾淋巴细胞计数：1500rpm离心6min，弃上清，1mL培养基重悬细胞，计数，配制细胞悬液，密度为5×106个/mL。
5.体外加样品刺激：配制刺激细胞增殖的抗原样品，糖抗原浓度为2μg/mL。每孔100μL细胞+100μL对应的抗原。于37℃、含5％CO2的条件下培养48h。
6.检测：加CCK-8后原条件下孵育3h，酶标仪450nm下读数。
小鼠脾淋巴细胞增殖结果见图2。脾细胞增殖实验用于评价抗原特异性的细胞免疫反应。糖蛋白复合物在无佐剂或者C34佐剂辅助时，F-STn-CRM197组与STn-CRM197组淋巴细胞增殖无显著差异。在弗氏佐剂存在的情况下，F-STn-CRM197组比STn-CRM197组淋巴细胞增殖效果更好，且统计学上有显著差异。说明免疫F-STn-CRM197能够更好的引起T细胞的激活，导致抗原特异性的T细胞的增殖。
(三)小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测
IFN-γ及IL-4分别是Th1及Th2型细胞应答标志物，这两种试剂盒均购买自Mabtech公司。
1.包被抗体：96孔板内的PVDF膜需要用乙醇预活化(70％的乙醇50μL润湿2min)，弃掉乙醇，用无菌水洗板5次(200μL/孔)。稀释预包被的IFN-γ及IL-4单克隆抗体，用无菌的现配制的PBS稀释至15μg/mL，100μL/孔的包被抗体，4℃过夜孵育。
2.封闭：用无菌PBS洗板五次，200μL/孔，加入含有10％FBS的RPMI-1640培养基，室温孵育30min。
3.加入刺激物及脾淋巴细胞：弃去培养基，加入细胞悬液和刺激物。首先取第五次免疫后14天的小鼠脾细胞，制备脾细胞悬液，1×106个细胞/孔，每组加入对应的糖蛋白复合物(0.2μg糖/孔)。将培养板放入37℃，5％CO2培养箱中，培养19h。
4.加入检测抗体：用PBS洗板5次，200μL/孔。用含0.5％胎牛血清的PBS(需要0.2μm滤膜过滤)稀释酶标检测抗体1μg/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
5.用PBS洗板5次，200μL/孔，用含0.5％FBS的PBS稀释链霉亲和素-ALP，100μL/孔，室温孵育1h。
6.显色：加入100μL/孔底物显色液BCIP/NBT，直至斑点出现。
7.检测：用去离子水终止反应，洗板，自然风干后计数，斑点数目可以通过酶标仪计数。
小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子结果见图3。
通过ELISPOT实验检测脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ的水平及脾淋巴细胞对抗原的特异性应答能力。结果如图3a所示：在无佐剂或者C34佐剂辅助时，F-STn-CRM197组与STn-CRM197组分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数目无显著差异。在弗氏佐剂存在下，F-STn-CRM197免疫的小鼠较STn-CRM197免疫的对照组分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数目增多。表明免疫F-STn-CRM197及弗氏佐剂，在健康小鼠中能够提高产生IFN-γ特异性T淋巴细胞的数量，引起机体产生抗原特异性的T细胞介导的免疫应答。IFN-γ的产生能够促进Th1型免疫应答，与T细胞的细胞毒相关，对肿瘤的免疫治疗至关重要。
IL-4是Th2型免疫应答标志分子，结果如图3b所示：在无佐剂或者C34佐剂辅助时，F-STn-CRM197组与STn-CRM197组分泌IL-4的脾淋巴细胞数目无显著差异。在弗氏佐剂存在下，F-STn-CRM197免疫的小鼠较STn-CRM197免疫的对照组分泌IL-4的脾淋巴细胞数目增多，且在统计学上有显著差异。
(四)小鼠免疫前后血清中抗体滴度的测定
F-STn、STn的缀合物免疫各组小鼠混合血清的滴度及每只小鼠血清的滴度均采用ELISA方法检测
1.包被抗原：酶标板上包被100μL的STn-BSA(包含0.02μg的STn)4℃过夜。STn-BSA的制备方法与实施例1中STn-CRM197的制备方法相同。
2.洗涤与封闭：每孔加入200μL洗涤缓冲液PBS-Tween20(0.05％)洗板，洗3次，然后每孔加入200μL封闭液(3％BSA-PBS)，37℃，1h。
3.加一抗(即免疫血清)：洗涤3次(具体方法同上)。血清用抗体稀释液(1％BSA-PBS)从某一稀释度开始倍比稀释，每孔加100μL，37℃，1小时。
4.加酶标二抗：洗涤3次，每孔加入用抗体稀释液5000倍稀释的100μL的二抗(为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgM，37℃，1h。
5.显色：洗涤3次，每孔加入现配的显色底物邻苯二胺(OPD)100μL，室温避光显色15min，每孔加入2M H2SO4终止显色。
6.结果判断：用酶标仪于490nm波长读取OD值。把减去空白血清孔读数后的OD值为0.1时的血清稀释倍数作为抗体滴度。
检测第三及第四次免疫之后的混合血清抗STn或抗F-STn抗体滴度。结果如表1所示。不论是不加佐剂(F-STn-CRM197组与STn-CRM197组相比，三免后及四免后的混合血清滴度相差分别是68倍，18倍)还是加C34佐剂(三免后及四免后的混合血清滴度相差分别521倍，169倍)或弗氏佐剂(三免后及四免后的混合血清滴度相差分别4倍，3倍)，F-STn-CRM197均能够引起较强的针对STn的特异性免疫应答，诱发了比STn-CRM197更高的抗STn的IgG抗体滴度。同时，检测针对F-STn的抗体滴度，F-STn-CRM197产生较高的抗修饰的F-STn抗体滴度，说明结构修饰后能够提高免疫原性。在两次免疫后，F-STn-CRM197组及STn-CRM197组的血清在1:100稀释倍数下均未检测到抗STn的IgM抗体。
表1糖蛋白缀合物免疫学评价结果
Figure BDA0002044965070000111
第三次免疫后及第四次免疫后每只小鼠血清的滴度见图4。
检测单只小鼠的抗STn的IgG抗体滴度，发现与STn-CRM197相比，在有佐剂辅助的情况下，F-STn-CRM197引起的IgG水平显著提高，第三次免疫及第四次免疫后血清抗STn的抗体滴度在统计学上均有显著差异(图4a和图4b)，在没有佐剂辅助时，F-STn-CRM197同样能够提高针对STn的抗体滴度，但统计学上无显著差异。
(五)流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞情况
1.制备肿瘤细胞单细胞悬液：5×105个细胞/管，3％FBS的PBS洗一遍。
2.加入混合血清：每管加入25μL的1：20稀释的血清，冰上孵育30min。
3.加入检测抗体：含3％FBS的PBS洗两遍，每管加入25μL的1：25稀释的FITC-羊抗鼠IgG，冰上孵育30min。
4.检测：含3％FBS的PBS洗两遍，弃上清，最后用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测平均荧光强度及阳性细胞数。
为了进一步揭示所研究的糖疫苗抗肿瘤转移的作用机制，检测了第三次及第四次免疫后混合血清的IgG亚型。第三次免疫后及第四次免疫后每组小鼠混合血清的IgG亚型见图5。在无佐剂或佐剂是C34时，F-STn-CRM197组只在第四次免疫后检测到少量的IgG2a和IgG2b。在弗氏佐剂存在的情况下，疫苗F-STn-CRM197诱发较强的IgG抗体应答，并且IgG亚型显示诱发了Th1/Th2应答且倾向于Th1型应答。以上结果说明疫苗F-STn-CRM197与STn-CRM197相比，能够从根本上提高IgG免疫应答。
为了评估在小鼠中引发的抗体的抗肿瘤免疫治疗潜力，使用流式细胞术来分析它们特异性识别肿瘤细胞的能力。第四次免疫后14天测定小鼠血清与肿瘤细胞的结合见图6。免疫前血清用作阴性对照，几乎没有发现识别反应。不论佐剂存在与否，F-STn-CRM197和STn-CRM197引起的抗血清均能够识别LS-C细胞表面抗原。F-STn-CRM197组的血清与STn-CRM197组相比，识别LS-C肿瘤细胞的阳性细胞数及平均荧光强度均提高。说明F-STn-CRM197具有肿瘤免疫治疗的潜力。
(六)ADCC分析
1.靶细胞与血清预孵育：将靶细胞(25μL，2×105个细胞/mL)接种在U型底96孔板中，并在37℃下与免疫后小鼠血清(25μL，在RPMI-1640中稀释10倍)孵育2h。
2.加入效应细胞：PBS洗去未结合的抗体，按效应细胞与靶细胞比率为10：1加入腹腔巨噬细胞，37℃下再孵育18h。
3.上清处理：在吸取上清前45min，靶细胞最大释放组加入10μL的裂解液，体积校正组也加入裂解液。45min后96孔细胞培养板于4℃，1100rpm离心4min。取50μL的上清加入对应的96孔酶标板中。
4.加入底物：取50μL的1：5000稀释的LDH作为阳性对照组，然后每孔加入50μL的底物，室温避光30min。
5.检测：每孔加入50μL的终止液，490nm下读数。
裂解率％＝(实验组-靶细胞自发-效应细胞自发)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发-体积校正)×100％
F-STn-CRM197和STn-CRM197引发的抗STn抗体在体外通过ADCC杀伤肿瘤细胞的能力。第四次免疫后14天测定小鼠血清杀伤肿瘤细胞结果见图7。免疫前血清用作阴性对照。用STn阳性的肿瘤细胞LS-C细胞进行试验，结果如图7a显示：在无佐剂或佐剂为C34时，用F-STn-CRM197免疫产生的抗血清与免疫前血清或STn-CRM197组相比均提高了对肿瘤细胞的裂解率；在弗氏佐剂存在的情况下，用F-STn-CRM197或STn-CRM197免疫产生的抗血清与免疫前血清相比均显著提高了对肿瘤细胞的裂解率，且统计上有显著差异，F-STn-CRM197组与STn-CRM197组之间差异不明显。
(七)CDC分析
1.靶细胞与血清预孵育：将靶细胞(25μL，4×105个细胞/mL)接种在U型底96孔板中，并在37℃下与血清(25μL，在RPMI-1640中稀释10倍)孵育2h。
2.加入补体：用PBS洗去未结合的抗体后，加入20倍稀释的兔补体血清。
3.上清处理：在吸取上清前45min，靶细胞最大释放组加入10μL的裂解液，体积校正组也加入裂解液。45min后96孔细胞培养板于4℃，1100rpm离心4min。取50μL的上清加入对应的96孔酶标板中。
4.加入底物：取50μL的1：5000稀释的LDH作为阳性对照组，然后每孔加入50μL的底物，室温避光30min。
5.检测：每孔加入50μL的终止液，490nm下读数。
裂解率％＝(实验组-靶细胞自发-效应细胞自发)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发-体积校正)×100％
评估F-STn-CRM197和STn-CRM197引发的抗STn抗体在体外通过CDC杀伤肿瘤细胞的能力。结果如图7b显示：在无佐剂时，用F-STn-CRM197或STn-CRM197免疫产生的抗血清与免疫前血清相比均提高了对肿瘤细胞的裂解率，但统计上无显著差异；用F-STn-CRM197免疫产生的抗血清与STn-CRM197组相比无明显差异；在C34或弗氏佐剂存在的情况下，用F-STn-CRM197免疫产生的抗血清与免疫前血清相比显著提高了对肿瘤细胞的裂解率，且统计上有显著差异，F-STn-CRM197组与STn-CRM197组比较提高了对肿瘤细胞的裂解率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.含F-STn的糖缀合物，其特征在于，所述糖缀合物包括糖和载体；所述糖为F-STn；所述F-STn通过连接键与载体偶联；所述连接键含有C-N键；
所述F-STn的结构式如I所示；
Figure FDA0002636617930000011
其中，R1＝R2＝FCH2CONH；
所述载体为白喉毒素交叉反应性材料197。
2.权利要求1所述糖缀合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将如式Ⅲ所示的一种化合物经臭氧氧化，得到含有醛基的二糖；
Figure FDA0002636617930000012
(2)将步骤(1)所得到的含有醛基的二糖在还原胺化的条件下与载体进行偶联，得到含F-STn的糖缀合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述臭氧的浓度为30～50mg/L，所述臭氧氧化的温度为-72℃，所述臭氧氧化的时间为10～30min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述还原胺化的条件添加NaBH3CN；所述含有醛基的二糖、载体和NaBH3CN的质量比为4：2：3；所述偶联的反应体系是PBS缓冲液；NaBH3CN的浓度为3.75mg/mL；
所述偶联的温度为20～25℃；所述偶联的时间为24h。
5.权利要求1所述糖缀合物或权利要求2～4任意一项所述制备方法制备的糖缀合物在制备抗肿瘤或癌症的疫苗或制备提高细胞和/或体液免疫应答的药物中的应用。
6.一种抗肿瘤或癌症的疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述糖缀合物或权利要求2～4任意一项所述制备方法制备的糖缀合物。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括佐剂；所述佐剂包括油乳状佐剂；所述油乳状佐剂包括弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂。
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