CN111760020B - 一种缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种缀合物及其制备方法和应用，属于抗肿瘤糖疫苗研制技术领域。本发明提供的一种缀合物，其含有双重激动剂与糖抗原Tn，所述双重激动剂为TLR4受体激动剂和NKT细胞激动剂，所述TLR4受体激动剂为单磷酸化的脂质A，所述NKT细胞激动剂为α‑半乳糖神经酰胺类似物。本发明所述的缀合物作为疫苗，能同时激活TLR4受体与NKT细胞，引起更强的针对糖抗原Tn的免疫反应，产生具有更高滴度、高亲和力和具有记忆力的T细胞调节免疫反应，从而达到特异性杀死肿瘤细胞的目的。

Description

一种缀合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种缀合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种双重激动剂与糖抗原Tn的缀合物及其制备方法和应用，所述双重激动剂为TLR4受体激动剂和NKT细胞激动剂，属于抗肿瘤糖疫苗研制技术领域。
背景技术
肿瘤相关的糖抗原(TACAs)在多种肿瘤细胞中有过量表达，其糖蛋白疫苗正处于临床研究中，具有较好的发展前景。其中Thomsennouveau(Tn)抗原在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤细胞表面均异常过量表达，是糖抗原肿瘤疫苗设计的优秀靶点。肿瘤相关的糖抗原(TACAs)一般属于T细胞非依赖性抗原，只产生低亲和力的IgM，具有免疫原性差和免疫耐受等缺点。因此，目前抗肿瘤糖疫苗面临的主要挑战是如何克服糖抗原的免疫耐受，增强其免疫原性，使机体产生高亲和力的IgG抗体和免疫记忆，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。经典的策略是将糖抗原与载体蛋白缀合来增强其免疫原性，但糖蛋白疫苗有偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点。
细菌脂多糖(Lipidpolysacchrides，LPS)疏水部分的Lipid A是Toll样受体4(TLR4)的激动剂，能靶向地结合TLR4并产生免疫反应，但其毒性过强。研究发现去掉LipidA结构中1位磷酸(反应式如下所示)后的Monophosphoryl lipid A(MPLA)依然能靶向地与TLR4结合，毒性明显降低而活性变化不明显(Microbes&Infection,2002,4(9):915-926.)。其作为内嵌佐剂与多种糖抗原结合来制备的抗肿瘤糖缀合物疫苗MPLA-Golob H和MPLA-STn和MPLA-GM2，在无外加佐剂的情况下，都能在小鼠体内更快速地产生高滴度的IgG抗体(Chemical Science,2015,6:7112；Scientific reports,2017,7:11403；BiomolecularChemistry,2014,12:3238)，
Figure BDA0002496698370000021
α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)，是从一种海绵中分离出的天然α-GalGSL类似物，能激活NKT细胞产生免疫反应。目前，KPN7000对非小细胞肺癌患者、恶性实体瘤综合治疗均进入Ⅱ期临床研究，其作为内嵌佐剂缀合糖抗原的全合成疫苗KRN7000-Tn，KRN7000-sTn，无需外部佐剂的条件下，在小鼠体内能更快速地产生特异性免疫应答，同时激活NKT细胞，高效地将IgM抗体同种型转换成IgG(Organic Letters,2017,19:456；Journal of medicinal chemistry,2018,61:4918.)
Figure BDA0002496698370000022
为了解决上述糖蛋白疫苗的缺点，本发明选择有发展潜力TACAs中的Tn为研究靶点，选用TLR4激动剂MPLA和NKT细胞激动剂KRN7000类似物作为内源性佐剂，制备一种含有TLR4受体和NKT细胞的双重激动剂(MPLA和KRN7000)与Tn缀合的三组分疫苗(MPLA-Tn-KRN7000)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种双重激动剂与糖抗原Tn的缀合物，所述双重激动剂为TLR4受体激动剂单磷酸化的脂质A(MPLA)和NKT细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种缀合物，其特征在于，所述缀合物含有双重激动剂与糖抗原Tn，所述双重激动剂为TLR4受体激动剂和NKT细胞激动剂，所述TLR4受体激动剂为单磷酸化的脂质A，所述NKT细胞激动剂为α-半乳糖神经酰胺类似物；
所述缀合物的结构通式如下式(A)、式(B)、式(C)或式(D)所示：
Figure BDA0002496698370000031
其中：
MPLA为单磷酸化的脂质A；
KRN7000为α-半乳糖神经酰胺类似物；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数。
有研究表明，内源性佐剂如TLR4激动剂单磷酸化的脂质A(MPLA)和NKT细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)，可以帮助糖抗原提呈至相应的免疫细胞，从而产生疫苗应答；将其代替载体蛋白，与TACAs糖抗原偶联得到两组分疫苗具有非常好的免疫效果。因此，本发明选择有发展潜力TACAs中的Tn为研究靶点，选用TLR4激动剂MPLA和NKT细胞激动剂KRN7000作为内源性佐剂。为了克服了糖蛋白疫苗偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点，本发明制备一种含有TLR4激动剂单磷酸化的脂质A(MPLA)和NKT细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)以及糖抗原Tn三组分的缀合物(MPLA-Tn-KRN7000)。该缀合物作为疫苗，通过同时激活TLR4受体和NKT细胞，以期产生更强的免疫应答，克服Tn免疫原性差的弱点，并且产生具有更高滴度、高亲和力和具有记忆力的T细胞调节免疫反应，达到杀死肿瘤细胞的目的。
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式，所述的缀合物包括为通式(Ⅰ)的化合物或通式(Ⅰ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000041
其中：
R1和R3为-(CH2)mCH3，m为10-14的整数；
R2、R4和R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或-(CH2)rCH3，r为8-14的整数；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数；
n为9-25的整数；
R为-CH3或
Figure BDA0002496698370000042
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式，所述的缀合物为结构式(Ⅱ)的化合物或结构式(Ⅱ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000043
其中：a为1-5的整数，b为1-10的整数。
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式，所述的缀合物为结构式(Ⅲ)的化合物或结构式(Ⅲ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000051
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式，所述单磷酸化的脂质A为通式(Ⅳ)的化合物或通式(Ⅳ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000052
其中：
R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或-(CH2)rCH3，r为8-14的整数。
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式，所述α-半乳糖神经酰胺类似物为通式(Ⅴ)的化合物或通式(Ⅴ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000061
/>
其中：
n为9-25的任意整数；
R为-H或
Figure BDA0002496698370000062
另外，本发明的另一目的是提供所述的缀合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取化合物1溶解于有机溶剂中，加入催化剂，得到化合物2；
(2)取步骤(1)所述的化合物2溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，与Linker链接，得到化合物3；
(3)取化合物4与步骤(2)所述的化合物3溶解于有机溶剂中，加入缩合剂，进行酯化反应，得到化合物5；
(4)取步骤(3)所述的化合物5溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，脱去保护基团三甲基硅烷，得到化合物6；
(5)取步骤(4)所述的化合物6溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱乙酰化反应，得到化合物7；
(6)取化合物与步骤(5)所述的化合物7溶解于有机溶剂中，加入催化剂反应，得到化合物9；
(7)取步骤(6)所述的化合物9溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱苄基反应，即可得到所述的缀合物；
所述化合物1至所述化合物9的结构式如下所示：
Figure BDA0002496698370000071
/>
Figure BDA0002496698370000081
/>
Figure BDA0002496698370000091
其中，
R1和R3为-(CH2)mCH3，m为10-14的整数；
R2、R4和R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或-(CH2)rCH3，r为8-14的整数；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数；
n为9-25的整数；
R为-CH3或
Figure BDA0002496698370000092
本发明所述的制备方法的反应式如下所示：
Figure BDA0002496698370000093
/>
Figure BDA0002496698370000101
其中，
R1和R3为-(CH2)mCH3，m为10-14的整数；
R2、R4和R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或-(CH2)rCH3，r为8-14的整数；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数；
n为9-25的整数；
R为-CH3或
Figure BDA0002496698370000102
本发明提供的制备方法，合成路线简短、反应条件温和、产率高、操作方便，能够广泛地应用于工业化制备。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(1)中，取化合物1溶解于有机溶剂中，加入催化剂，得到化合物2；所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为锌粉与乙酸的混合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(2)中，取步骤(1)所述的化合物2溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，与Linker链接，得到化合物3；所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为N,N-二异丙基乙胺。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(3)中，取化合物4与步骤(2)所述的化合物3溶解于有机溶剂中，加入缩合剂，进行酯化反应，得到化合物5；所述有机溶剂为二氯甲烷溶液，所述缩合剂选自为N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)的混合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(4)中，取步骤(3)所述的化合物5溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，脱去保护基团三甲基硅烷，得到化合物6；所述有机溶剂为乙腈与二氯甲烷的混合溶液，所述乙腈与所述二氯甲烷的体积比为1.5:1，所述的催化剂为三氟化硼乙醚络合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(5)中，取步骤(4)所述的化合物6溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱乙酰化反应，得到化合物7；所述有机溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶液，所述甲醇与所述二氯甲烷的体积比为2:1；所述的催化剂为甲醇钠。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(6)中，取化合物与步骤(5)所述的化合物7与化合物8溶解于有机溶剂中，加入催化剂反应，得到化合物9；所述溶剂为二氯甲烷、甲醇与水的混合溶液，所述催化剂为碘化亚铜、N,N-二异丙基乙胺与冰乙酸的混合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，步骤(7)中，取步骤(6)所述的化合物9溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱苄基反应，即可得到所述的缀合物10；所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇与水的混合溶液，所述催化剂为氢气、钯碳与氢氧化钯的混合物。
另外，本发明的再一目的是提供所述的缀合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述癌症为乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、甲腺癌、脑癌、胃癌或白血病。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)为了克服了糖蛋白疫苗偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点，本发明选择有发展潜力肿瘤相关的糖抗原(TACAs)中的Tn为研究靶点，选用TLR4激动剂单磷酸化的脂质A(MPLA)和NKT细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)作为内源性佐剂，制备一种含有TLR4激动剂MPLA和NKT细胞激动剂KRN7000以及糖抗原Tn三组分的缀合物(MPLA-Tn-KRN7000)，该缀合物作为疫苗，通过同时激活TLR4受体和NKT细胞，引起更强的针对糖抗原Tn的免疫反应，产生具有更高滴度、高亲和力和具有记忆力的T细胞调节免疫反应，从而达到特异性杀死肿瘤细胞的目的。
(2)本发明提供的所述缀合物的制备方法，其合成路线简短、反应条件温和、产率高、操作方便，能够广泛地应用于工业化制备。
附图说明
图1为MPLA-Tn-KRN7000三组分糖疫苗免疫活性评价图；
图2为MPLA-Tn-KRN7000三组分糖疫苗诱导小鼠产生的抗体血清特异性识别肿瘤细胞MCF-7的流式细胞实验评价图；
图3为MPLA-Tn-KRN7000三组分糖疫苗诱导小鼠产生的抗体血清特异性杀死肿瘤细胞MCF-7的补体依赖性细胞毒性评价图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例为本发明提供的一种缀合物，所述缀合物为结构式(Ⅲ)的化合物或结构式(Ⅲ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物；
Figure BDA0002496698370000131
上述缀合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取化合物1溶解于有机溶剂中，加入催化剂，得到化合物2；得到化合物2的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000132
步骤(1)的具体操作为：二氯甲烷溶液(10.0mL)溶解化合物1(700.0mg，0.5mmol)与锌粉(658.0mg，10.1mmol)，加入乙酸(0.6mL，10.1mmol)，室温条件下搅拌12小时；硅藻土过滤，饱和碳酸氢钠水溶液洗3次，收集有机层，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液减压蒸馏除去有机溶剂得粗品；硅胶柱分离纯化得到无色油状液体化合物2(503.0mg，产率为73.2％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.26(m,15H,Ar-H),6.06(d,J＝7.7Hz,1H,-NHCO-),4.96(d,J＝11.4Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.86(d,J＝3.7Hz,1H,H-1),4.82–4.62(m,5H,Ar-CH2-O-),4.18(m,J＝8.4,4.2Hz,1H),4.05(m,J＝10.6,9.8,4.0Hz,2H),3.91–3.78(m,4H),3.65(t,J＝6.2Hz,2H),2.93(m,1H,H-6),2.75(m,1H,H-6),2.04(t,J＝7.7Hz,2H,-CH2-CONH-),1.63–1.44(m,4H,-CH2-),1.25(d,J＝3.9Hz,68H,-CH2-),0.89(m,J＝7.9,4.2Hz,24H,-CH3),0.07(d,J＝5.0Hz,12H,Si-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.22,138.57,138.39,138.20,128.56,128.43,128.40,128.02,127.96,127.86,127.78,127.61,127.45,127.38,100.41(C-1),79.38,76.75,76.41,76.20,76.07,74.97,74.55,73.63,73.23,71.34,69.74,51.85,42.02,36.95,33.88,31.96,29.85,29.76,29.74,29.70,29.67,29.64,29.61,29.49,29.40,26.14,26.08,25.73,25.66,22.73,18.31,18.19,14.16,-3.59,-3.86,-4.58,-4.89.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C83H146N2O8Si2,[M+H]+:1356.069,found:1356.0687.
(2)取步骤(1)所述的化合物2溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，与Linker链接，得到化合物3；得到化合物3的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000141
步骤(2)的具体操作为：二氯甲烷溶液(6.0mL)溶解化合物2(300.0mg，0.2mmol)与己二酸酐(170.0mg，1.3mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(73.0μL，0.4mmol)调节pH＝8，室温条件下搅拌6小时；二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗2次，盐水洗1次，除去水层收集有机层，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液减压蒸馏除去有机溶剂，硅胶柱分离纯化得到无色油状液体化合物3(235.4mg，产率为71.7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41–7.28(m,15H,Ar-H),6.14(d,J＝7.8Hz,2H,-NHCO-),4.94(d,J＝10.7Hz,1H),4.86–4.58(m,6H,J＝3.7Hz,H-1,Ar-CH2-O-),4.22(m,1H),4.03(m,J＝10.1,3.6Hz,2H),3.88–3.76(m,4H,H-3,H-5),3.68(d,J＝10.8Hz,3H),3.14(s,1H,H-6),2.33(q,J＝5.5,4.7Hz,2H,-CH2-COOH-),2.20–1.96(m,4H,-CH2-CONH-),1.75–1.40(m,8H,-CH2-),1.25(d,J＝4.8Hz,68H,-CH2-),0.88(m,J＝9.9,7.5Hz,24H,-CH3),0.12–0.01(m,12H,Si-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.94,173.81,172.80,138.58,138.44,138.34,128.77,128.39,128.36,127.97,127.77,127.75,127.57,127.42,99.70,79.38,76.17,75.91,74.95,74.77,73.61,73.14,69.33,68.53,51.94,39.77,36.93,35.86,33.71,33.52,31.94,29.84,29.74,29.71,29.67,29.62,29.60,29.48,29.44,29.38,26.11,26.06,25.74,24.85,24.15,22.70,18.28,18.17,14.14,-3.55,-3.89,-4.61,-4.94.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C89H154N2O11Si2，[M+H]+:1484.1164，found 1484.1161.
(3)取化合物4与步骤(2)所述的化合物3溶解于有机溶剂中，加入缩合剂，进行酯化反应，得到化合物5；得到化合物5的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000151
步骤(3)的具体操作为：二氯甲烷溶液(3.0mL)溶解化合物3(160.0mg，107.9μmol)、化合物4(74.0mg，129.5μmol)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(48.0mg，233.0μmol)与Hobt(14.0mg，103.7μmol)，室温下搅拌反应3个小时；二氯甲烷稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液洗2次，盐水洗1次，除去水层收集有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏除去有机溶剂得粗品；硅胶柱分离纯化得到白色固体化合物5(172.0mg，产率：78.5％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.28(m,15H,Ar-H),6.88(t,J＝5.4Hz,1H,-NHCO-),6.82(d,J＝8.7Hz,1H,-NHCO-),6.71(d,J＝9.4Hz,1H,-NHCO-),6.28(d,J＝6.8Hz,1H,-NHCO-),6.05(d,J＝7.7Hz,1H,-NHCO-),5.36(d,J＝3.1Hz,1H,Ar-CH2-O-),5.10(m,J＝11.4,3.2Hz,1H,H-1),4.98–4.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.96–4.94(d,J＝3.2Hz,1H,H’-1),4.87–4.63(m,5H,Ar-CH2-O-),4.57(m,J＝12.9,8.5,4.3Hz,2H),4.30–4.15(m,5H),4.05(m,J＝14.6,9.0,4.6Hz,4H),3.89–3.76(m,4H),3.72–3.59(m,7H),3.52(m,3H),3.40(m,J＝13.0,6.3Hz,1H),3.23–3.11(m,1H),2.52(d,J＝2.4Hz,1H,-C≡CH),2.35(t,2H,-CO-CH2-),2.16(s,3H,-CO-CH3),2.13–2.03(m,4H,-CO-CH2-),2.01(s,6H,-CO-CH3),1.96(s,3H,-CO-CH3),1.70–1.46(d,J＝6.2Hz,8H,-CH2-),1.25(d,J＝4.7Hz,71H,-CH2-,-CH3),0.88(m,24H,-CH3),0.05(d,J＝8.5Hz,12H,Si-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3))δ173.37,173.32,173.04,170.90,170.80,170.41,170.08,138.52,138.45,138.26,128.63,128.55,128.40,128.38,127.99,127.79,127.59,127.34,100.23,100.06,79.43,79.37,77.47,76.12,75.94,75.89,75.48,75.15,74.75,73.64,73.19,69.94,69.30,69.20,69.10,68.82,67.42,67.18,62.22,58.38,56.41,51.93,47.51,40.10,39.32,36.89,35.85,35.80,33.72,31.93,29.78,29.74,29.71,29.67,29.66,29.62,29.49,29.46,29.37,26.11,26.06,26.01,25.73,25.09,24.78,23.04,22.69,20.82,20.78,20.66,18.29,18.17,18.06,14.14,-3.60,-3.90,-4.60,-4.90.ESI-TOF HRMS m/z:calcdforC114H191N5O22Si2,[M+H]+:2039.3592,found:2039.3583.
(4)取步骤(3)所述的化合物5溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，脱去保护基团三甲基硅烷，得到化合物6；得到化合物6的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000161
步骤(4)的具体操作为：乙腈/二氯甲烷(1.5：1，2.5mL)溶解化合物5(160.0mg，69.3μmol)，加入三氟化硼乙醚络合物(19.0μL，152.5μmol)，室温下搅拌反应2小时；减压蒸馏除去有机溶剂得粗品，硅胶柱分离纯化得到白色固体化合物6(107.0mg，产率为75.3％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.28(m,15H,Ar-H),7.22(d,J＝5.7Hz,1H,-NHCO-),7.09(d,J＝8.8Hz,1H,-NHCO-),6.69(m,J＝9.4,2.7Hz,1H,-NHCO-),6.57(d,J＝8.5Hz,1H,-NHCO-),5.86(s,1H,-NHCO-),5.35(d,J＝3.2Hz,1H),5.08(m,J＝11.3,3.2Hz,1H),4.95(d,J＝7.3Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.94(s,1H,H-1),4.86(d,J＝3.0Hz,1H,H-1),4.84–4.59(m,5H,Ar-CH2-O-),4.53(m,J＝11.7,9.3,3.3Hz,2H),4.31–4.20(m,3H),4.19(d,J＝2.4Hz,2H),4.14–3.99(m,3H),3.89–3.71(m,5H),3.71–3.58(m,4H),3.58–3.44(m,5H),3.36(m,J＝19.3,14.3,5.0Hz,2H),3.17(m,J＝13.2,8.3,4.7Hz,1H),2.52(t,J＝2.4Hz,1H,-C≡CH),2.32(m,J＝18.5,6.8Hz,2H,-CO-CH2-),2.21–2.05(m,7H,2x-CO-CH2-,-CO-CH3),2.04–1.94(m,9H,3x-CO-CH3),1.72–1.49(m,8H,4x-CH2-),1.25(s,71H,34x-CH2-,-CH3)0.88(t,J＝6.7Hz,6H,2x-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.86,173.39,173.33,170.95,170.82,170.54,170.51,170.36,138.24,138.10,137.77,128.73,128.69,128.53,128.49,128.45,128.06,127.98,127.93,127.74,127.49,100.04,98.75,79.35,77.27,76.17,75.77,75.17,74.54,74.48,73.92,73.15,72.92,69.87,69.31,69.03,68.90,67.48,67.08,62.28,58.35,56.85,49.50,47.48,40.28,39.27,36.77,35.84,35.63,33.50,31.92,29.84,29.80,29.75,29.73,29.70,29.65,29.62,29.46,29.37,25.87,25.81,25.01,24.87,23.05,22.69,20.82,20.77,20.69,18.27,14.13,-0.00.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C102H163N5O22,[M+H]+:1811.1862,found:1811.1831.
(5)取步骤(4)所述的化合物6溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱乙酰化反应，得到化合物7；得到化合物7的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000171
步骤(5)的具体操作为：制备甲醇钠溶液：称取金属钠(5.4mg)，加入到的甲醇溶液(10.0mL)中，冷却至室温待用；甲醇/二氯甲烷(2：1，3.0mL)溶解化合物6(105.0mg，58.0μmol)，室温下加入已制备好的甲醇钠溶液(0.1mL)调节pH＝8，搅拌反应3个小时；加入适量的离子交换树脂调节pH至7终止反应；硅藻土过滤，收集滤液，除去有机溶剂得到白色固体化合物7(89.0mg，产率为91.1％)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3(1:30,v/v,0.6mL))δ7.42–7.29(m,15H,Ar-H),4.96(d,J＝11.3Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.90(d,J＝3.6Hz,1H,H-1),4.86(d,J＝3.8Hz,1H,H-1),4.84–4.58(m,5H,Ar-CH2-O-),4.53(d,J＝2.3Hz,1H),4.22(m,J＝5.3,2.7Hz,4H),4.15(m,J＝6.5,2.3Hz,1H),4.06–4.00(m,2H),3.94–3.85(m,4H),3.78–3.78–3.72(m,4H),3.69(t,J＝4.3Hz,3H),3.63(m,J＝6.4,3.1Hz,2H),3.55–3.45(m,5H),3.43–3.32(m,2H),3.19(m,J＝13.9,8.3Hz,1H),2.58(q,J＝2.3Hz,1H,-C≡CH),2.39–2.28(m,2H,-CO-CH2-),2.17(t,J＝7.7Hz,2H,-CO-CH2-),2.10(d,J＝5.6Hz,5H,-CO-CH2-,-CO-CH3),1.72–1.51(m,8H,4x-CH2-),1.26(d,J＝2.3Hz,71H,34x-CH2-,-CH3)0.88(t,J＝6.7Hz,6H,2x-CH3).13C NMR(100MHz,MeOD/CDCl3(1:30,v/v,0.6mL))δ174.53,174.45,174.30,171.15,171.07,138.43,138.26,137.76,128.64,128.60,128.34,128.19,128.13,127.90,127.65,99.72,98.28,79.39,79.29,77.26,76.07,75.58,75.52,75.36,74.90,74.06,73.28,72.66,71.01,70.23,70.07,69.54,69.48,69.24,69.17,67.40,58.56,50.72,49.95,40.52,39.45,36.69,35.78,35.68,33.47,32.07,30.00,29.96,29.89,29.87,29.84,29.81,29.80,29.76,29.61,29.57,29.51,26.08,26.04,25.34,25.24,22.83,22.70,18.49,14.18.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C96H157N5O19,[M+H]+:1685.1546,found:1685.1545.
(6)取化合物与步骤(5)所述的化合物7溶解于有机溶剂中，加入催化剂反应，得到化合物9；得到化合物9的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000181
步骤(6)的具体操作为：四氢呋喃与甲醇(1：2，3.0mL)溶解化合物8(52.2mg，23.2μmol)、化合物7(20.0mg，11.9μmol)、碘化亚铜(113.0mg，595.0μmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(97.0μL，595.0μmol)，室温下搅拌反应12小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶柱分离纯化得到白色固体化合物9(14.0mg，产率为30.4％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.44–7.16(m,40H,Ar-H),6.73(s,1H),6.60(s,1H),5.42(t,J＝9.5Hz,1H),5.12(m,J＝25.6,13.8,8.5Hz,3H),5.03–3.97(m,32H),3.97–3.27(m,30H),3.27–3.00(m,2H),2.60–1.94(m,21H,9x-CO-CH2-,-CO-CH3),1.75–1.45(m,20H,10x-CH2-),1.25(s,185H,91x-CH2-,-CH3-),0.88(t,J＝6.8Hz,24H,8x-CH3).ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C229H371N10O40P,[M+NH4++2K+]2+:1342.8881,found:1342.9264.MOLDI-TOF HRMSm/z:calcdfor C229H371N10O40P,[M+Na]+:found:3956.819.
(7)取步骤(6)所述的化合物9溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱苄基反应，即可得到所述的缀合物；得到缀合物(Ⅴ)的反应式如下式所示：
Figure BDA0002496698370000191
步骤(6)的具体操作为：二氯甲烷/甲醇/水(5：5：1，10.0mL)溶解化合物9(8.0mg，2.0μmol)，加入氢氧化钯(5.0mg)与钯碳(5.0mg)，通入氢气，密封搅拌24个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂，得到白色固体化合物39，目标产物MPLA-Tn-KRN7000(5.6mg，85.8％)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3/D2O(20:20:1,v/v/v,0.6mL))δ5.44(s,1H),3.51(s,32H),3.26–2.51(m,36H),2.41–1.81(m,21H-CO-CH2-,-CO-CH3),1.61(s,20H,-CH2-),1.53–1.01(m,179H,-CH2-),0.90(m,J＝5.8Hz,24H,-CH3).ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C173H323N10O40P,[M+2K+]2+:1645.1274,found:1645.1233.
实验例1
本实验例对实施例1制备的缀合物(全合成糖疫苗)进行免疫小鼠，通过ELSA实验初步评价其免疫作用，通过荧光激活细胞分选(FACS)技术证明抗体血清能特异性识别肿瘤细胞(MCF-7)，同时通过抗体介导的互补依赖细胞毒性(CDC)实验表明抗体血清在补体的介导下具有杀死肿瘤细胞的能力。
1.ELISA免疫分析
1)小鼠免疫：
取6-8周龄的C57BL/6小鼠，分成免疫组以及对照组(PBS)，每组6只。将糖疫苗制备成脂质体后，通过小鼠皮下注射的方式进行免疫试验，采用一次初始免疫和三次增强免疫方案，分别在第0、14、21、28天注射制备的疫苗，每只每次注射量0.1mL；第38天每只小鼠取血取0.1mL到0.2mL，在0℃放置60分钟，4000转/分钟离心15分钟，取上层清亮血清用于ELISA检测分析。
2)ELISA免疫分析：
0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)溶解Tn-BSA，配置成2.0μg/mL溶液，以每孔100.0μL的量加入96孔板，放入4℃孵育过夜；第二天37℃培养箱孵育一小时；用PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗板3次(300μL/孔/次)。洗板后，加入PBS/1％BSA；每孔加入250.0μl；常温孵育一小时，用PBST洗板3次。同组6只小鼠血清样品分别用PBS稀释300、900、2700、8100、24300、72900、218700与656100倍；将稀释好的血清以每孔100.0μL加入96孔板，每个稀释梯度平行做三个副孔；放置在37℃培养箱孵育两个小时，洗板3次。将HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG(稀释2000倍)，每孔加入100.0μL，室温孵育一小时；洗板3次。加入TMB溶液，每孔加入100.0μL，室温避光显色20分钟。加入0.5M H2SO4溶液，每孔加100.0μL。立即用酶标仪检测吸光度，检测波长为450nm，570nm作为背景波长。
3)将吸光度(OD)值相对于抗血清稀释值作图，并获得最佳拟合线。使用该线的方程式来计算OD值达到0.2时的稀释度值，并且根据稀释值的倒数计算抗体滴度如图1所示。
4)实验结果：
从图1可看出，本发明实施例1合成的MPLA-Tn-KRN7000三组份糖疫苗，在无外部佐剂的情况下，在小鼠体内诱导产生高滴度的Kappa与IgG抗体，说明MPLA-Tn-KRN7000三组分疫苗的双重佐剂的设计能有效提高Tn糖抗原的免疫原性。
2.流式细胞实验(FACS)
实验方法：取过量表达Tn糖抗原的乳腺癌细胞MCF-7和不表达Tn糖抗原的肿瘤细胞MDA231分别在含10％胎牛血清(FBS)的MEM培养基中培养(37℃，5％CO2)；胰酶消化，收集细胞，显微镜下数细胞数，每个试管分装2.0×105个细胞，加1mL的含3％的FBS的PBS缓冲液(FACS缓冲液)重悬，离心2分钟，去掉上清液，用FACS缓冲液清洗两次；加入制备好的小鼠血清，在冰中孵育1个小时，FACS缓冲液清洗两次，加入荧光标记的二抗，在冰中避光孵育一个小时，FACS缓冲液清洗两次，重悬于0.8mL的FACS缓冲液中，用流式细胞仪检测。
实验结果：如图2所示，MCF-7是过度表达Tn抗原的乳腺癌细胞，把不表达Tn抗原的MDA-231肿瘤细胞为阴性对照。在MCF-7细胞中，与免疫前血清相比，MPLA-Tn-KRN7000三组分糖疫苗诱导小鼠产生的抗体血清的荧光峰明显向右偏移。在MDA-231细胞中，免疫前血清与抗体血清无明显差别。结果表明，实施例1制备的MPLA-Tn-KRN7000糖抗原疫苗诱导的抗体能特异性识别表达Tn抗原的MCF-7细胞。
3.抗体介导的互补依赖细胞毒性(CDC)
实验方法：取过量表达Tn糖抗原的乳腺癌细胞MCF-7和不表达Tn糖抗原的肿瘤细胞MDA-231分别在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养；将对数生长期的细胞配置成1.0×105cell/mL密度的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔100μL，约10000个细胞，放置到培养箱中培养过夜。除去培养基，无血清的MEM培养液洗三次，加入MEM稀释的小鼠血清，37℃孵育2小时。无血清的MEM洗三次，加入一定比例(1：10)稀释的补体溶液，在37℃培养1小时。同时设置低参照(仅用无血清培养基)和高参照(5％triton-100处理)组。孵育结束后，离心细胞，取20μL的细胞上清液用PBS稀释至100μL，用100μL的LDH细胞毒性检测试剂显色30分钟。在490nm测量每孔的吸光值，根据低参照和高参照孔，计算细胞的裂解率。
实验结果：如图3所示，MCF-7是过度表达Tn抗原的乳腺癌细胞，把不表达Tn抗原的MDA-231肿瘤细胞为阴性对照。MPLA-Tn-KRN7000三组分糖抗原疫苗对小鼠产生的抗血清介导的MCF-7细胞裂解率显著高于空白血清。而在相同条件下，抗体介导的免疫前血清和抗体血清对MDA-231细胞的细胞毒性差异无统计学意义。结果证实实施例1制备的MPLA-Tn-KRN7000三组分糖抗原疫苗具有一定的特异性抗癌作用。
综上，实验结果表明，本发明制备的一种含有TLR4激动剂MPLA和NKT细胞激动剂KRN7000以及糖抗原Tn三组分的缀合物(MPLA-Tn-KRN7000)，该缀合物作为糖抗原疫苗，通过同时激活TLR4受体和NKT细胞，比单一激活免疫系统产生更强的免疫应答，引起更强的针对糖抗原Tn的免疫反应，产生具有更高滴度、高亲和力和具有记忆力的T细胞调节免疫反应，从而达到特异性杀死肿瘤细胞的目的。
最后所应当说明的是，上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物含有双重激动剂与糖抗原Tn，所述双重激动剂为TLR4受体激动剂和NKT细胞激动剂，所述TLR4受体激动剂为单磷酸化的脂质A，所述NKT细胞激动剂为α-半乳糖神经酰胺类似物；
所述缀合物的结构通式如下式（A）、式（B）、式（C）或式（D）所示：
Figure QLYQS_1
、/>
Figure QLYQS_2
、
Figure QLYQS_3
、/>
Figure QLYQS_4
，
其中：
MPLA为单磷酸化的脂质A；
KRN7000为α-半乳糖神经酰胺类似物；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数。
2.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述的缀合物为通式（Ⅰ）的化合物或其可药用盐；
Figure QLYQS_5
其中：
R1和R3为-(CH2)mCH3，m为10-14的整数；
R2、R4和R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或- (CH2)rCH3，r为8-14的整数；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数；
n为9-25的整数；
R为-CH3或
Figure QLYQS_6
。
3.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于，所述的缀合物为结构式（Ⅱ）的化合物或其可药用盐；
Figure QLYQS_7
其中：a为1-5的整数，b为1-10的整数。
4.如权利要求1-3任一所述的缀合物，其特征在于，所述的缀合物为结构式（Ⅲ）的化合物或其可药用盐；
Figure QLYQS_8
。
5.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述单磷酸化的脂质A为通式（Ⅳ）的化合物或其可药用盐；
Figure QLYQS_9
其中：
R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或- (CH2)rCH3，r为8-14的整数。
6.如权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺类似物为通式（Ⅴ）的化合物或其可药用盐；
Figure QLYQS_10
，
其中：
n为9-25的任意整数；
R为-H或
Figure QLYQS_11
。
7.如权利要求1-6任一所述的缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取化合物1溶解于有机溶剂中，加入催化剂，得到化合物2；
（2）取步骤（1）所述的化合物2溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，与Linker链接，得到化合物3；
（3）取化合物4与步骤（2）所述的化合物3溶解于有机溶剂中，加入缩合剂，进行酯化反应，得到化合物5；
（4）取步骤（3）所述的化合物5溶解于有机溶剂中，在催化剂的作用下，脱去保护基团三甲基硅烷，得到化合物6；
（5）取步骤（4）所述的化合物6溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱乙酰化反应，得到化合物7；
（6）取化合物与步骤（5）所述的化合物7溶解于有机溶剂中，加入催化剂反应，得到化合物9；
（7）取步骤（6）所述的化合物9溶解于有机溶剂中，加入催化剂，进行脱苄基反应，即可得到所述的缀合物；
所述化合物1至所述化合物9的结构式如下所示：
Figure QLYQS_13
、/>
Figure QLYQS_16
、/>
Figure QLYQS_19
、 />
Figure QLYQS_14
、
Figure QLYQS_15
、
Figure QLYQS_17
、
Figure QLYQS_20
、/>
Figure QLYQS_12
、
Figure QLYQS_18
，
其中，
R1和R3为-(CH2)mCH3，m为10-14的整数；
R2、R4和R5为-(CH2)pCH3，p为8-12的整数；
R6为-CO(CH2)rCH3或- (CH2)rCH3，r为8-14的整数；
a为1-5的整数，b与c均为1-10的整数；
n为9-25的整数；
R为-CH3或
Figure QLYQS_21
；
步骤（1）中，所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为锌粉与乙酸的混合物；
步骤（2）中，所述溶剂为二氯甲烷，所述催化剂为N,N-二异丙基乙胺；
步骤（3）中，所述有机溶剂为二氯甲烷溶液，所述缩合剂为N,N’-二环己基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的混合物；
步骤（4）中，所述有机溶剂为乙腈与二氯甲烷的混合溶液，所述乙腈与所述二氯甲烷的体积比为1.5:1，所述的催化剂为三氟化硼乙醚络合物；
步骤（5）中，所述有机溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶液，所述甲醇与所述二氯甲烷的体积比为2:1，所述的催化剂为甲醇钠；
步骤（6）中，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇与水的混合溶液，所述催化剂为碘化亚铜、N,N-二异丙基乙胺与冰乙酸的混合物；
步骤（7）中，所述有机溶剂二氯甲烷、甲醇与水的混合溶液，所述催化剂为氢气、钯碳与氢氧化钯的混合物。
8.如权利要求1-6任一所述的缀合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述癌症为乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、甲腺癌、脑癌、胃癌或白血病。
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