CN106620682A - 一种脂质体疫苗制剂及其用途和生产IgG抗体的方法 - Google Patents

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CN106620682A CN201710043961.4A CN201710043961A CN106620682A CN 106620682 A CN106620682 A CN 106620682A CN 201710043961 A CN201710043961 A CN 201710043961A CN 106620682 A CN106620682 A CN 106620682A
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Abstract

本发明涉及脂质体疫苗领域，公开了一种脂质体疫苗制剂及其用途，以及一种生产IgG抗体的方法。所述脂质体疫苗制剂包括：(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原；(b)连接单元；(c)式(1)‑(3)所示的佐剂。采用本发明的技术方案，在简化疫苗分子结构的同时保证产生高滴度，高亲和力的IgG抗体。此外，疫苗分子热稳定性好，更易保存和运输。

Description

一种脂质体疫苗制剂及其用途和生产IgG抗体的方法
技术领域
本发明涉及脂质体疫苗领域，具体地，涉及一种脂质体疫苗制剂及其用途，以及一种生产IgG抗体的方法。
背景技术
相比较于传统疫苗，合成疫苗安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应。因此，合成疫苗更符合未来疫苗的发展方向。另外，近年来迅速发展起来的免疫分析方法具有特异性强，灵敏度高，分析容量大，方便快捷，成本低廉，适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学，农学等各个领域。免疫分析是基于抗原、抗体的特异性识别反应的一种分析方法，核心是高质量的特异性抗体。建立免疫分析方法，制备出针对半抗原特异性强，亲和力高的抗体是关键。所以，产生高特异性，高滴度，高亲和力的IgG抗体是疫苗研究和免疫分析方法的核心。
合成疫苗包括两种类型：半合成疫苗和全合成疫苗。
半抗原-蛋白复合物(hapten-protein)的半合成疫苗是目前产生IgG抗体最常见的方法。将半抗原与含有T细胞表位的蛋白共价连接，可以使半抗原被免疫系统识别，从而产生高亲和力的IgG抗体。其中，蛋白载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)，鸡卵白蛋白(OVA)，白喉CRM197蛋白等。半合成疫苗存在着一些缺点，比如偶联位点不确定、偶联率不稳定以及蛋白本身也会引起一定的免疫反应等。另外，半抗原-蛋白复合物的热稳定性差，带来保存和运输的额外负担。
全合成的疫苗分子的研究近年来受到广泛关注。经典的全合成疫苗分子由半抗原，辅助T细胞表位(Th epitope)肽和Toll样受体(Toll like receptor,TLR)激动剂等三组分共价偶联组成。TLR激动剂有激活抗原呈递细胞和脂质体载体的作用。辅助T细胞表位用来获得CD4T细胞的帮助，实现抗体类型从IgM到高亲和力IgG的转换。如果没有辅助T细胞表位，疫苗分子只能引起一个短暂的、低亲和力的、无免疫记忆的IgM抗体应答。
据报道，将几种不同Th表位构建在同一疫苗分子中，可以提高疫苗分子的免疫性能。另外，主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)具有多形性，不同的个体需要不同的Th表位肽和MHC结合，所以普适的疫苗分子需要引入多个Th表位肽。细胞毒性T细胞表位(Tc)的共价引入也可以提高疫苗分子的免疫性能。但是，随着组分的增加，有机合成的难度也增加，对于工业化生产造成巨大挑战。
近年来，α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide，简称αGalCer或者KRN7000)作为疫苗佐剂的研究逐渐受到关注。αGalCer是自然杀伤T细胞(Nature Killer T cell，NKT cell)激动剂。通常认为，构成机体免疫系统的淋巴细胞由三种细胞系组成，一是由胸腺产生的T细胞，二是由骨髓分化而来的产生抗体的B细胞，三是自然杀伤细胞(NK细胞)。NKT细胞是一类新型免疫T细胞，可以沟通先天性免疫和获得性免疫，起到桥梁作用，在功能上既具有T细胞免疫调节功能，同时又兼具自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK cell)的自然杀伤作用。T细胞识别的抗原是蛋白质，而NKT细胞识别的抗原是αGalCer等糖脂质。这是该免疫系统与通常的免疫系统重要的不同点。
发明内容
现有技术中针对NKT细胞的脂质体疫苗是将半抗原与T细胞表位的蛋白或肽共价连接，T细胞表位不可或缺，但是上述连接方式偶联位点不确定、效率低、存在一定毒性，为了克服上述缺陷，本发明提供了一种脂质体疫苗制剂，本发明的脂质体疫苗制剂能够简化疫苗分子结构同时保证产生高滴度、高亲和力的IgG抗体，同时该疫苗制剂热稳定好。
具体地，本发明提供了一种脂质体疫苗制剂，所述制剂包括：
(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原；
(b)连接单元；
(c)式(1)-(3)所示的佐剂，
其中，组分(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原与组分(c)式(1)-(3)所示的佐剂在脂质体疫苗制剂中的共存关系有两种：第一种为组分(a)与组分(c)通过组分(b)连接单元共价连接形成组分a-b-c，第二种为组分(a)与组分(b)共价连接，组分(a)与组分(b)共价连接形成的分子组分a-b与组分(c)通过混合自组装为脂质体；
在第一种以共价连接形成组分a-b-c的方式中，所述X为-O-、-NH-、-CH2-或-S-；在第二种混合自组装的方式中，所述X为-OR1、-NHR2或-[-OCH2CH2O-]n1-OCH3，R1为-H、-(CH2)n2CH3、取代或未取代的苯环、取代或未取代的萘环，R2为R1、-COR1或-CONHR1，n1为0-20的整数，n2为0-10的整数；
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
本发明还提供了上述脂质体疫苗制剂在制备肿瘤相关药物中的用途。
本发明还提供了一种生产IgG抗体的方法，该方法包括使用上述脂质体疫苗制剂进行免疫反应。
本发明具有以下优点：1)在简化疫苗分子结构的同时保证产生高滴度，高亲和力的IgG抗体。(2)该疫苗分子热稳定性好，更易保存和运输。本发明具有上述优点的原因可能是NKT细胞激动剂起到了以下三个作用：(1)脂质体载体；(2)激活抗原呈递细胞(APCs)；(3)通过激活NKT细胞，提供B细胞帮助，产生与Th表位的相似的功能。和经典三组分全合成疫苗分子相比，NKT细胞激动剂可以起到Th表位和TLR激动剂的双重功能；(4)本发明的疫苗设计方法对肿瘤相关糖抗原是有效的。值得指出的是，非人源糖类(比如：细菌多糖)用作疫苗抗原时，免疫系统能轻易的识别，随后引发强烈的免疫反应。所以，非人源糖类的疫苗的研制难度比较容易。但是，人源糖类(比如：肿瘤相关糖)通常会产生免疫耐受，难以被免疫系统识别，无法刺激免疫系统产生相应的抗体。而本发明中的抗原端为肿瘤相关糖，它是肿瘤细胞表面异常表达的糖，与正常细胞表面的糖相比，仅存在链长变短，过度唾液酸化等区别，不易被免疫系统识别，不易引发免疫反应。本发明的脂质体疫苗制剂克服了上述免疫耐受的缺陷，能够刺激免疫系统，实现IgM到IgG的抗体类型转换，迅速产生高滴度的IgG抗体。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1-图3为实施例4中通过共价连接方式制备的脂质体疫苗的测试结果图；
图4-图5为实施例7中通过混合自组装方式制备的脂质体疫苗的测试结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种脂质体疫苗制剂，所述制剂包括：
(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原；
(b)连接单元；
(c)式(1)-(3)所示的佐剂，
其中，组分(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原与组分(c)式(1)-(3)所示的佐剂在脂质体疫苗制剂中的共存关系有两种：第一种为组分(a)与组分(c)通过组分(b)连接单元共价连接形成组分a-b-c，第二种为组分(a)与组分(b)共价连接，组分(a)与组分(b)共价连接形成的分子组分a-b与组分(c)通过混合自组装为脂质体；
在第一种以共价连接形成组分a-b-c的方式中，所述X为-O-、-NH-、-CH2-或-S-；在第二种混合自组装的方式中，所述X为-OR1、-NHR2或-[-OCH2CH2O-]n1-OCH3，R1为-H、-(CH2)n2CH3、取代或未取代的苯环、取代或未取代的萘环，R2为R1、-COR1或-CONHR1，n1为0-20的整数，n2为0-10的整数。
其中，在X基团中，所述取代的苯环和取代的萘环上的取代基的种类可以为C1-C5的烷基，苯环上取代基的个数可以为1个、2个、3个、4个或5个，萘环上的取代基的个数可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个。
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
需要说明的是，本发明中，基团一端或两端的“-”表示化学键，可以与其它结构相连接。
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构。
R*和R#各自独立地表示含有1-30个碳原子的碳残基，碳残基可以为线性的碳链或带支链的碳链，碳残基中也可以含有碳环结构或杂环结构。碳残基中也可以进一步含有杂原子例如N、O、S和/或功能性基团像卤素F、Cl、Br或包含有杂原子N、O和/或S的功能性基团或功能性基团例如双键和三键。
所述碳残基或碳链中可以含有一个或多个碳碳双键和/或一个或多个碳碳三键。碳环结构可以出现在碳残基或碳链中。杂环结构可以出现在碳残基或碳链中。
所述“1-30个碳原子的碳残基”指的是一个碳原子或2-30个碳原子的链，上述碳原子可以为链状，也可以成环状，也可以含有碳碳双键或碳碳三键。进一步地，所述“1-30个碳原子的碳残基”可以进一步被1-5个取代基Z1、Z2、Z3、Z4、Z5取代。如果所述1-30个碳原子的碳残基不含有其它额外的取代基Z1、Z2、Z3、Z4、Z5，则认为是未取代。
优选地，R*和R#各自独立地为线性或支链状的C1-C30的烷基残基、线性或支链状的C2-C30的烯基残基、线性或支链状的C2-C30的炔基残基、C3-C30的碳环烷基残基、C4-C30的环烷基残基、C2-C30的杂环烷基残基、或者是取代的含有1-5个取代基Z1、Z2、Z3、Z4、Z5的C1-C30的碳残基。
其中，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地表示为：-OH、-OCH3、-OC2H5、-OC3H7、-O-cyclo-C3H5、-OCH(CH3)2、-OC(CH3)3、-OC4H9、-OPh、-OC2Ph、-OCPh3、-CH2-OCH3、-C2H4-OCH3、-C3H6-OCH3、-CH2-OC2H5、-C2H4-OC2H5、-C3H6-OC2H5、-CH2-OC3H7、-C2H4-OC3H7、-C3H6-OC3H7、-CH2-O-cyclo-C3H5、-C2H4-O-cyclo-C3H5、-C3H6-O-cyclo-C3H5、-CH2-OCH(CH3)2、-C2H4-OCH(CH3)2、-C3H6-OCH(CH3)2、-CH2-OC(CH3)3、-C2H4-OC(CH3)3、-C3H6-OC(CH3)3、-CH2-OC4H9、-C2H4-OC4H9、-C3H6-OC4H9、-CH2-OPh、-C2H4-OPh、-C3H6-OPh、-CH2-OC2Ph、-C2H4-OC2Ph、-C3H6-OC2Ph、-NO2、-F、-Cl、-Br、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-CO-cyclo-C3H5、-COCH(CH3)2、-COC(CH3)3、-COOH、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COO-cyclo-C3H5、-COOCH(CH3)2、-COOC(CH3)3、-OOC-CH3、-OOC-C2H5、-OOC-C3H7、-OOC-cyclo-C3H5、-OOC-CH(CH3)2、-OOC-C(CH3)3、-CONH2、-CONHCH3、-CONHC2H5、-CONHC3H7、-CONH-cyclo-C3H5、-CONH[CH(CH3)2]、-CONH[C(CH3)3]、-CON(CH3)2、-CON(C2H5)2、-CON(C3H7)2、-CON(cyclo-C3H5)2、-CON[CH(CH3)2]2、-CON[C(CH3)3]2、-NHCOCH3、-NHCOC2H5、-NHCOC3H7、-NHCO-cyclo-C3H5、-NHCOCH(CH3)2、-NHCOC(CH3)3、-NH2、-NHCH3、-NHC2H5、-NHC3H7、-NH-cyclo-C3H5、-NHCH(CH3)2、-NHC(CH3)3、-N(CH3)2、-N(C2H5)2、-N(C3H7)2、-N(cyclo-C3H5)2、-N[CH(CH3)2]2、-N[C(CH3)3]2、-N(CH3)2、-OCF3、-CH2-OCF3、-C2H4-OCF3、-C3H6-OCF3、-OC2F5、-CH2-OC2F5、-C2H4-OC2F5、-C3H6-OC2F5、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2-CH2F、-CH2-CHF2、-CH2-CF3、-CH2-CH2Cl、-CH2-CH2Br。
根据一种优选的实施方式，R*和R#各自独立地为：乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，癸基，十二烷基，十四烷基，顺-9-十六碳烯基，顺-9-十六碳烯基，顺-6-十八烯基，顺-9-十八烯基，顺-11-十八烯，顺-9-二十碳烯，顺-11-二十碳烯，顺-13-二十二烯基，顺-15-二十四烯基，反-9-十八烯基，反-11-十八烯基，反-3-十九碳烯-1,9,12-十八碳二烯基，6,9,12-十八碳三烯基，8,11,14-二十碳三烯基，5,8,11,14-二十碳四烯基，7,10,13,16-二十二碳四烯基，4,7,10,13,16-二十二碳五烯基，9,12,15-十八碳三烯基，6,9,12,15-十八碳四烯基，8,11,14,17-二十碳四烯基，5,8,11,14,17-二十碳五烯基，7,10,13,16,19-二十二碳五烯基，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯基，顺-9-十六碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-11-十八碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-9-十八碳烯基，顺-9-二十碳烯基，顺-11-二十碳烯基，顺-13-二十二碳烯基，顺-15-二十四碳烯基，9,12-十八碳二烯基，6,9,12-十八碳三烯基，8,11,14-二十碳三烯基，5,8,11,14-二十碳四烯基，7,10,13,16-二十二碳四烯基，4,7,10,13,16-二十二碳五烯基，9,12,15-十八碳三烯基，6,9,12,15-十八碳四烯基，8,11,14,17-二十碳四烯基，5,8,11,14,17-二十碳五烯基，7,10,13,16,19-二十二碳五烯酰基，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯基，1,2-二硫戊环-3-戊烷基，6,8-二噻烷辛烷基，二十二烷十七烷基，桐醇基，梓醇基，紫杉醇基，蒎烯基，视黄基，14-甲基十五烷基，9,10-环氧硬脂基，9,10-环氧十八烷-12-烯基，6-十八炔基，9-十八炔基，6-十八烯t10-十七碳烯-8-炔基，9-十八碳烯-12-炔基，t7,t11-十八碳二烯-9-炔基，t8,t10-十八碳二烯-12-炔基，二十碳四烯基，2-羟基二十四烷基，2-羟基-15-二十四烯基，12-羟基-9-十八烯基或14-羟基_二十碳烯基，6-十八炔基，t11-八-10-亚甲基十六烷基，冠醚芳基，CRS)磷酸酯6,8-双(甲基硫烷基)-辛基，4,6-双(甲基硫烷基)-烷基，2,4-双(甲基硫烷基)-丁基，羟基乙烯基，蓖麻酸基，月桂基，桐油基，十一烷基，十二烷基，十六烷基，十八烷基，二十烷基，二十二烷基，二十四烷基，顺-9-十四烯基，顺9-十六烯基，顺-6-十八烯基，顺-9-十八烯基，顺-9-二十碳烯基，顺-11-二十碳烯基，顺-13-二十二碳烯基，顺-15-二十四碳烯基，9,12-十八碳二烯基，6,9,12-十八碳三烯基，8,11,14-二十碳三烯基，5,8,11,14-二十碳四烯基，7,10,13,16-二十二碳四烯基，4,7,10,13,16-二十二碳五烯基，9,12,15-十八碳三烯基，6,9,12,15-十八碳四烯酸，8,11,14,17-二十碳四烯酸，5,8，11,11,14-二十碳五烯酸，7,10,13,16,19-二十二碳五烯基，5,8,11-二十碳三烯基，1,2-二硫戊环-3-戊基，6,8-二噻烷辛基，桐油基，十四烷基，十四烷基，十四烷基，十一烷基，十一烷基，十一烷基，十一烷基，十一烷基，十一烷基，十一烷基，十二烷基，t11-十八烯-9-炔基，9-十八炔基，6-十八烯-9-炔基，t10-十七烯-8-炔基，9-十八烯-12-炔基，t7,t11-辛二烯-9-炔基，t8,t10-十八碳二烯-12-炔基，5,8,11,14-二十碳四烯基，2-羟基二十四烷基，2-1-羟基-15-四-亚烯基，12-羟基-9-十八碳烯基和14-羟基-11-二十碳烯基。
根据另一个优选的实施方式，R*和R#各自独立地被苯环取代，优选是被未取代的苯环取代。进一步地，所述苯环在R*或R#的取代位置位于R*或R#与式(1)-(3)所示结构连接位置的对位。
根据一种更优选的实施方式，R*和R#相同，优选为线性的烷基残基，更优选为线性的C10-C30的烷基残基，最优选为线性的-C14H29残基。
在另一种更优选的实施方式中，R*和R#不相同，并代表不同的线性烷基残基，优选地R*为线性C20-C30的烷基残基，R#为线性C10-C19的烷基残基，更优选地，R*为线性-C25H51残基，R#为线性-C14H29残基。
在另一种更优选的实施方式中，R*和R#不相同，并代表不同的线性烷基残基，优选地R*为线性C1-C10的烷基残基，R#为线性C10-C19的烷基残基，更优选地，R*为线性-C4H9残基，R#为线性-C14H29残基。
在另一种更优选的实施方式中，R*为残基，R#为线性-C14H29残基；其中左侧的波浪线表示式(1)-(3)所示的佐剂结构中除R*外的其他部分，下同。
在另一种更优选的实施方式中，R*表示为残基，R#为线性-C14H29残基；
在另一种更优选的实施方式中，R*表示为-(CH2)9-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)4-CH3残基，R#为线性-C14H29残基；
在另一种更优选的实施方式中，R*表示为线性-C9H19残基，R#为线性-C14H29残基
在另一种更优选的实施方式中，R*和R#不相同，并代表不同的线性烷基残基，R*进一步被苯环取代，优选地，R*表示为一个苯环取代的线性C1-C10的烷基残基，R#为线性C10-C19的烷基残基；更优选地，R*表示为线性的-C6H12-Ph残基，R#为线性-C14H29残基。
在另一种更优选的实施方式中，R*和R#不相同，并代表不同的线性烷基残基，优选地R*为线性C20-C30的烷基残基，R#为线性C1-C10的烷基残基；更优选地，R*为线性-C25H51残基，R#为线性-C5H11残基。
在本发明中，所述肿瘤相关的糖抗原指的是：肿瘤细胞表面过量表达的一些异常的糖链，与正常细胞的正常糖链相比，肿瘤细胞表面的异常糖链通常以链长变短，过度唾液酸化为特征，称之为肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs)。所述肿瘤相关的糖肽抗原指的是与肽链连接的肿瘤相关的糖抗原。
其中，常见的肿瘤相关的糖抗原可以包含但不限于以下一种或多种：Tn、TF、STn、GD2、GD3、GM2、GM3、Globo H、Lex、Ley、KH-1。部分肿瘤相关的糖抗原的结构式如下所示：
肿瘤相关的糖肽抗原可以为以下种类：
AFP，辅肌动蛋白(alpha-actinin-4)，ARTC1，BAGE，BCR-abl,B-RAF,CA15-3，CA19-9，CA-125，CASP-5，CASP-8，β-连环蛋白(beta-catenin)，癌胚抗原(carcinoembryonic)，修饰的癌胚抗原(modified carcinoembryonic antigen)，癌相关突变粘蛋白(carcinoma-associated mutated mucins)，CDC27,CDK4，CDKN2A，CEA，嗜铬粒蛋白A(chromogranin A)，COA-1，细胞周期蛋白依赖性激酶-4(cyclin dependent kinase-4)，EFTUD，伸长因子2(elongation factor 2)，生长因子受体vI 11(growth factorreceptor EGFRvI11)，EB病毒EBNA基因产物(Epstein Barr Virus EBNA gene product)，ETA，ETV6-AML1融合蛋白，FLT3-ITD，FN1，GAGE，神经节苷脂(gangliosides)，GPNMB，gp75/TRP-1，gp100，H1FT，HAGE，HERV-K-MEL，HIP-55，HLA-A2，HLA-A11，hsp70-2，KIAAO205，驱动蛋白2(kinesin 2)，KK-LC-1，KLK-4，KM-HN-1，KSA，LAGE，LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白(LDLR-fucosyltransferaseAS fusion protein)，MAGE，乳腺珠蛋白-A(mammaglobin-A)，MART-1/Melan A，MART-2，ME1，肌球蛋白1类(myosin calss 1)，MUC1，MUM，MUM-2，MUM-3，NA-88，NCAM-180，neo-PAP，NFYC，NY-BR，NY-ESO-1，OA1，OGT，OS-9，p15，p21-ras，乳头瘤病毒E7(papilloma virus E7)，乳头瘤病毒E6(papilloma virus E6)，PRDX5，PTPRK，PSA，PSMA，RAGE，K-ras，N-ras，RAB38，RBAF600，SAGE，SIRT2，SNRPD 1，sp17，SYT-SSX1融合蛋白(SYT-SSX1fusion protein)，SYT-SSX2融合蛋白(SYT-SSX2fusion protein)，TA90，TAG，TGF-β1抗凋亡因子(TGF-β1anti-apoptotic factor)，TGF-βRII，甲状腺球蛋白(thyroglobulin)，TRAG-3，磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomeras e)，TRP2，TRP2-INT2，肿瘤蛋白D52(tumor protein D52)，酪氨酸酶(tyrosinase)，WT1，以及上述抗原的片段，衍生物及其两个以上抗原的组合。
优选地，所述糖肽抗原为MUC-1，其结构如下所示：
其中，GTSAPDTRRAP均为氨基酸残基。
在第一种以共价连接(组分a-b-c)的方式中，所述佐剂可以为以下结构：
需要说明的是，上述结构式中的虚线表示化学键，表示佐剂与连接单元连接的化学键。
在第二种混合自组装的方式中，所述佐剂可以为：
其中，R1为-H、-(CH2)n2CH3、取代或未取代的苯环、取代或未取代的萘环；n1为0-20的整数，n2为0-10的整数；所述-OH的位置可以根据式(1)-式(3)的佐剂中的-OH的位置进行确认；
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
优选地，所述佐剂可以为以下结构：
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
进一步优选地，所述佐剂的具体结构为：
在第一种以共价连接的方式中，组分(a)与组分(c)通过组分(b)连接单元共价连接，其中，连接单元(b)用L表示，进一步表示为-L1-L2-，-L2-，-L2-L3-或-L1-L2-L3-。
其中，L1可以选自以下结构中的一种：
其中，x为1-60的整数；
Y*表示一个键，-NH-，-O-，-S-，-S-S-；
在本发明中，虚线表示化学键。
L2为-CH2-、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、-C7H14-、-C8H16-、-C9H18-、-C10H20-、-CH(CH3)-、-C[(CH3)2]-、-CH2-CH(CH3)-、-CH(CH3)-CH2-、-CH(CH3)-C2H4-、-CH2-CH(CH3)-CH2-、-C2H4-CH(CH3)-、-CH2-C[(CH3)2]-、-C[(CH3)2]-CH2-、-CH(CH3)-CH(CH3)-、-C[(C2H5)(CH3)]-、-CH(C3H7)-、-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-、-CO-CH2-、-CO-C2H4-、-CO-C3H6-、-CO-C4H8-、-CO-C5H10-、-CO-C6H12-、-CO-C7H14-、-CO-C8H16-、-CO-C9H18-、-CO-C10H20-、-CO-CH(CH3)-、-CO-C[(CH3)2]-、-CO-CH2-CH(CH3)-、-CO-CH(CH3)-CH2-、-CO-CH(CH3)-C2H4-、-CO-CH2-CH(CH3)-CH2-、-CO-C2H4-CH(CH3)-、-CO-CH2-C[(CH3)2]-、-CO-C[(CH3)2]-CH2-、-CO-CH(CH3)-CH(CH3)-、-CO-C[(C2H5)(CH3)]-、-CO-CH(C3H7)-或-CO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-；
n为1-60的整数；
L3为-CO-、-O-CO-、-NH-CO-、-NH(C＝NH)-、-SO2-、-O-SO2-、-NH-、-NH-CO-CH2-。
在第二种混合自组装的方式中，所述连接单元(b)可以用L或L-L#表示，其中，如果L中不带有C10-C100的脂肪链，连接单元(b)用L-L#表示，L#表示为带有C10-C100的脂肪链的结构。如果L中带有C10-C100的脂肪链，则连接单元(b)可以表示为L。L可以为上文中描述的各种结构，唯一不同的是，L的一端与组分(a)连接，另一端则用氢原子补齐。例如，另一端可以表示为-YH或-CH3。其中，所述C10-C100的脂肪链指的是碳原子个数为10-100个，且不含有除烷基外的取代基和杂原子。而除了C10-C100的脂肪链的结构，L#还可以含有或者不含有其它结构，其它的结构没有特别的限定，可以为各种化学结构。另外，C10-C100的脂肪链可以位于组分(b)的侧链位置上或者碳骨架上，当C10-C100的脂肪链位于碳骨架上时，C10-C100的脂肪链是碳骨架的端尾。
在本发明中，所述L、L1、L2和L3的方向没有限定，由于L1、L2和L3均有两个键与其它结构相连，所以均可以有两种连接方式，L也可以有两种连接方式。举例来说，
L2为-CH2-CH(CH3)-、L3为-NH-CO-，L为-L1-L2-L3，则L可以有以下几种结构：
在第一种共价连接的方式中，L与组分(a)和(c)连接时，左右方向也没有限制，原则与上文描述相同。虚线表示L与组分(a)和(b)连接的化学键。
在第二种混合自组装的方式中，则遵循组分(b)的C10-C100的脂肪链端不与组分(a)连接，即C10-C100的脂肪链端暴露在外的原则。如果C10-C100的脂肪链位于组分(b)的侧链位置上，则连接方向没有限制。如果C10-C100的脂肪链位于组分(b)的碳骨架位置上，则组分(b)的非脂肪链端与组分(a)连接。
根据一种具体的实施方式，组分(a)、(b)和(c)以共价连接方式连接时，疫苗分子优选为以下结构：
在组分(a)、(b)和(c)以共价连接方式连接时，组分(a)、(b)和(c)的含量的摩尔比为1：1：1。
根据另一种具体的实施方式，组分(a)和(b)通过进行共价连接，连接产物(组分a-b)和(c)通过混合自组装方式，组分a-b和组分(c)的含量的摩尔比为1：0.01-10，优选为1：0.1-10。
进行混合的组分a-b和组分(c)的结构分别如下所示：其中，组分(a)为STn，组分(b)的右端为βGalCer，组分(b)为βGalCer和共价连接方式中的连接单元连接的产物，组分(c)选自图示结构中的至少一种。
在本发明中，所述混合自组装的方式可以为各种常规方式，例如可以包括：搅拌、涡旋、振荡或反复颠倒等。
在本发明中，除了组分a-b-c的疫苗分子，或者组分a-b和组分(c)混合自组装形成的混合物外，所述脂质体疫苗制剂中还包括：
(d)脂质载体，所述脂质载体可以为本领域的各种疫苗制剂中使用的脂质载体，例如，可以为胆固醇、1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DCPC)和1,2-二油酰基卵磷脂(DOPC)中的一种或多种。优选地，所述脂质载体为胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱按照摩尔比0.1-10:1的比例形成的混合物；
优选地，所述脂质载体为胆固醇和1,2-二油酰基卵磷脂按照摩尔比0.1-10:1的比例形成的混合物；
优选地，所述脂质载体为胆固醇、1,2-二油酰基卵磷脂和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱按照摩尔比0.1-10:0.1-10:1的比例形成的混合物。
在第一种共价连接的方式中，组分a-b-c、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱的摩尔比可以在较大范围内变动，例如可以为1：0.1-100：0.1-100，优选为1：1-100：1-100。其中，1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱可以替换为相同摩尔数的1,2-二油酰基卵磷脂或相同摩尔数的1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱与1,2-二油酰基卵磷脂的混合物。
在第二种混合自组装的方式中，组分a-b、组分(c)、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱的摩尔比可以在较大范围内变动，例如可以为1：0.01-100：0.1-100：0.1-100，优选为1：0.1-10：1-10：1-10。其中，1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱可以替换为相同摩尔数的1,2-二油酰基卵磷脂或相同摩尔数的1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱与1,2-二油酰基卵磷脂的混合物。
在本发明中，所述脂质体疫苗制剂优选经过冻干制成冻干粉以及冻干粉在盐水中重建的过程。所述冻干和重建均可以为本领域的常规选择，可以为各种疫苗冻干和重建的常规操作。所述盐水是氯化钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的水溶液，氯化钠的浓度是0.15M，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度是0.02M。根据一种具体的实施方式，所述冻干的过程可以包括：将胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DCPC)以及疫苗分子溶解于二氯甲烷：甲醇(v/v,1:1)的混合液中，超声10min后冻干。重建的过程可以包括：脂质体疫苗溶解于盐水中，超声10min即可注射。
本发明还提供了上述脂质体疫苗制剂在制备肿瘤相关药物中的用途。
本发明还提供了一种生产IgG抗体的方法，该方法包括使用上述脂质体疫苗制剂进行免疫反应。
以下将通过实施例对本发明进行描述。
在实施例中，所使用的原料均可以商购获得。
实施例1
本实施例用于说明(a)肿瘤相关的糖抗原STn(化合物S1，保护基保护的STn抗原)、以及上述糖抗原与连接单元(化合物4)共价连接。
将化合物3(200mg)溶于二氯甲烷/甲醇(v/v 1:1)中，加入钯碳后，通入氢气，搅拌1-2h，硅藻土过滤，滤液减压除去溶剂，得到产物S1。将S1溶于CH3CN，加入己二酸对硝基苯酚酯(化合物4，连接臂)，室温条件下反应过夜，硅胶柱色谱分离，洗脱剂比例为二氯甲烷/甲醇＝20：1，得到产物5(180mg)无色油状液体。上述产物5即为肿瘤相关的糖抗原STn与连接臂共价连接的产物。产物5的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝9.2Hz,2H),7.23(d,J＝9.2Hz,2H),5.51(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),5.36(dd,J＝6.9,2.7Hz,1H),4.84(d,J＝3.6Hz,1H),4.53(dd,J＝9.3,1.5Hz,1H),4.30(dd,J＝12.2,2.6Hz,2H),4.27–4.16(m,2H),4.01–3.93(m,2H),3.90(s,1H),3.83(dd,J＝12.8,6.0Hz,2H),3.76(s,3H),3.73–3.65(m,4H),3.58(d,J＝8.3Hz,4H),3.52–3.46(m,2H),3.45–3.38(m,1H),3.37(s,1H),3.30(s,1H),2.80(dd,J＝11.8,3.3Hz,1H),2.59(t,J＝14.5Hz,2H),2.41(s,3H),2.26–2.16(m,2H),2.06(dd,J＝7.6,3.2Hz,6H),1.97(d,J＝5.0Hz,6H),1.77–1.63(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.77,172.23,171.94,171.00,170.91,170.29,169.88,168.21,155.23,153.44,145.02,125.00,122.35,99.09,97.47,77.32,77.00,76.68,75.60,74.56,71.70,69.85,69.67,69.53,69.05,68.63,68.21,66.53,64.16,62.93,58.66,53.11,50.19,38.98,35.80,35.63,33.72,24.67,24.49,23.97,22.95,20.94,20.70,20.60；MS(MALDI-TOF)calcd.for C43H58N4O24Na+[M+Na]+1037.3339,found 1037.3459。
实施例2
本实施例用于说明本发明的用于共价连接的佐剂S9α、S10α、S11α、S12α和S13α及其制备方法
将化合物S2和S3加入装有在干燥分子筛的反应瓶中，加入干燥的四氢呋喃，搅拌一个小时后冷却至-20℃，加入BF3·Et2O溶液，并在该温度条件下保持2h。反应结束后用乙酸乙酯稀释，用硅藻土过滤。加入饱和碳酸氢钠溶液除去BF3·Et2O，产物通过硅胶柱分离，洗脱剂比例是石油醚/乙醚4:1，得到产物S4α和S4β。
将S4α溶解在体积比为乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 8:2:5)的体系中，60℃条件下搅拌3-4h，得到产物S5α，减压除去溶剂，再加入三甲基磷的四氢呋喃溶液搅拌3-5h，得到产物S6α，再将制备好的C25H51COCl溶解于干燥的二氯甲烷中加入，在0℃条件下加入三乙胺，半小时后反应结束，减压除去溶剂，后通过硅胶柱分离得到产物S7α，洗脱剂比例为二氯甲烷/甲醇＝10:1。
产物S7α的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(ddt,J＝19.0,11.8,5.6Hz,20H),5.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.82(d,J＝3.5Hz,1H),δ4.78–4.63(m,4H),4.62–4.53(m,2H),4.52–4.44(m,2H),4.33(d,J＝7.6Hz,1H),4.00(s,1H),3.82(ddd,J＝23.4,11.8,5.0Hz,5H),3.73–3.62(m,3H),3.56–3.47(m,1H),2.72(s,1H),2.64(s,1H),1.95–1.81(m,2H),1.24(d,J＝6.1Hz,72H),0.88(t,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.20,138.48,138.37,138.17,137.91,128.51,128.43,128.41,128.38,127.96,127.94,127.90,127.88,127.85,127.77,127.72,127.65,99.44,80.03,79.23,77.52,75.80,73.49,73.10,72.50,71.76,69.80,69.26,68.39,62.75,50.49,36.78,31.93,30.10,29.78,29.73,29.71,29.68,29.66,29.61,29.45,29.38,29.37,25.76,25.72,22.70,14.14。ESI-MScalcd.for C78H124NO9 +[M+H]+1219.02。
将得到的S7α(1.27g)溶于干燥的二氯甲烷中，加入对甲苯磺酰氯和三乙胺，室温搅拌3h，待原料消失后，加入饱和的氯化铵溶液调节到至中性，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥有机层，减压除去溶剂硅胶柱分离得到产物白色固体S8(1.31g，92％)，洗脱剂比例为PE/EA＝3:1。产物S8的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝8.3Hz,2H),7.41–7.01(m,22H),5.84(d,J＝8.7Hz,1H),4.73(d,J＝3.4Hz,1H),4.72–4.60(m,4H),4.55(d,J＝11.5Hz,2H),4.47(d,J＝11.3Hz,2H),4.21(d,J＝8.4Hz,1H),4.18–4.01(m,2H),3.94(dd,J＝11.7,4.7Hz,2H),3.83–3.62(m,5H),3.60–3.41(m,1H),2.38(s,3H),1.95–1.87(m,2H),1.22(d,J＝6.8Hz,72H),0.85(t,J＝6.7Hz,6H).
将得到的S8(15mg)溶于DMF中，加入叠氮钠，80℃条件下搅拌过夜，冷却到室温后，萃取分离，无水硫酸钠干燥有机层，减压除去溶剂，硅胶柱分离得到无色蜡状物S9α(12mg，90％)，洗脱剂比例PE/EA＝5:1。产物S9α的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.14(m,20H),5.90(d,J＝8.7Hz,1H),4.81(d,J＝2.4Hz,1H),4.77–4.72(m,2H),4.71(d,J＝4.8Hz,1H),4.67(d,J＝11.5Hz,1H),4.63–4.54(m,2H),4.49(dd,J＝11.6,6.1Hz,2H),4.28(dd,J＝8.5,5.9Hz,1H),3.90(s,1H),3.83(d,J＝5.3Hz,2H),3.81–3.72(m,4H),3.62–3.47(m,2H),3.29(dd,J＝12.6,4.9Hz,1H),2.47(d,J＝1.5Hz,1H),1.93(q,J＝7.3Hz,2H),1.24(d,J＝6.8Hz,72H),0.88(t,J＝6.7Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.86,138.58,138.46,138.13,137.80,128.56,128.44,128.38,128.36,128.04,127.98,127.88,127.86,127.79,127.78,127.64,127.59,98.66,79.70,78.97,77.19,75.70,73.39,73.12,72.65,71.76,69.02,68.61,67.73,51.23,50.03,36.75,31.95,29.97,29.84,29.75,29.73,29.70,29.68,29.62,29.57,29.52,29.48,29.40,29.39,25.87,25.75,25.55,22.72,14.16；MS(MALDI-TOF)calcd.for C78H122N4NaO8 +[M+Na]+1265.9155,found1265.9707。
采用与S9α相同的路线合成佐剂S10α、S11α和S12α。
S10α：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53–7.16(m,20H),5.89(d,J＝8.8Hz,1H),4.84(d,J＝2.2Hz,1H),4.74(dt,J＝20.6,11.4Hz,4H),4.66–4.56(m,2H),4.52(dd,J＝11.6,7.7Hz,2H),4.31(d,J＝4.0Hz,1H),3.97–3.70(m,7H),3.66–3.47(m,2H),3.31(dd,J＝12.6,4.8Hz,1H),2.50(s,1H),1.94(q,J＝7.0Hz,2H),1.80–1.56(m,3H),1.59–1.36(m,4H),1.25(d,J＝6.8Hz,35H),0.88(dt,J＝7.0,3.4Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.75,138.55,138.43,138.11,137.76,128.50,128.38,128.32,128.30,127.98,127.90,127.81,127.78,127.72,127.70,127.58,127.52,98.62,79.70,79.07,77.15,75.69,73.31,73.09,72.62,71.75,68.57,67.70,51.18,50.01,36.70,31.88,31.83,29.98,29.78,29.67,29.62,29.48,29.39,29.34,29.32,29.28,25.81,25.67,22.65,22.63,14.08,14.06。MS(MALDI)calculated for C62H90N4NaO8 +(M+Na+)1041.6651,found1041.7104。
S11α：1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.45–7.20(m,20H),7.12(dd,J＝8.3,5.6 Hz,2H),6.96(t,J＝8.7 Hz,2H),6.01(d,1H),4.85(s,1H),4.82–4.67(m,4H),4.67–4.58(m,2H),4.54(dd,J＝11.5,8.6 Hz,2H),4.33(d,J＝3.6 Hz,1H),3.96–3.76(m,7H),3.66–3.53(m,2H),3.31(dd,J＝12.6,2 Hz),2.57(t,J＝7.7 Hz,2H),2.30(t,J＝7.5 Hz,1H),1.97(d,J＝7.3 Hz,2H),1.80–1.38(m,8H),1.28(t,J＝7.8 Hz,31H),1.39-1.09(m,32H),1.01–0.80(m,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ172.82,160.98(d,J＝242.8 Hz),138.48,138.32(d,J＝3.3Hz),138.30,138.00,137.69,129.53(d,J＝7.7 Hz),128.46,128.34,128.28,128.27,127.96,127.88,127.78,127.71,127.70,127.55,127.50,114.78(d,J＝21.0 Hz),98.54,79.61,78.83,77.09,75.61,73.31,73.03,72.53,71.66,68.95,68.46,67.61,51.13,49.93,36.62,35.02,31.85,31.54,29.86,29.74,29.64,29.59,29.50,29.45,29.40,29.34,29.30,29.28,29.11,25.76,25.63,22.62,14.07。MS(MALDI)calculated forC69H95FN4NaO8 +(M+Na+)1149.7026,found1149.7732.
S12α：1H NMR(600 MHz,Chloroform-d)δ7.39–7.21(m,20H),7.12(d,J＝8.2 Hz,2H),7.00(t,J＝8.6 Hz,2H),6.95(dd,J＝9.2,4.4 Hz,2H),6.88(d,J＝8.2 Hz,2H),5.89(d,J＝8.7 Hz,1H),4.83(d,J＝2.5 Hz,1H),4.80–4.65(m,4H),4.66–4.55(m,2H),4.51(t,J＝10.9 Hz,2H),4.35(t,J＝7.1 Hz,1H),3.96–3.72(m,7H),3.62–3.50(m,2H),3.30(dd,J＝12.6,4.8 Hz,1H),2.56(t,J＝7.8 Hz,2H),2.48(s,1H),1.98–1.85(m,2H),1.74–1.46(m,10H),1.43(s,2H),1.42–1.11(m,29H),0.88(t,J＝7.0 Hz,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ172.80,159.76,157.36,155.34,153.36,138.58,138.45,138.11,137.84,137.78,129.54,128.55,128.42,128.36,128.34,128.03,127.93,127.84,127.76,127.75,127.62,127.56,120.07,119.99,118.31,116.24,116.01,98.62,79.75,79.12,77.20,77.17,75.70,73.37,73.12,72.65,71.78,68.97,68.57,67.73,51.20,50.05,36.72,35.18,31.91,31.62,30.02,29.82,29.70,29.66,29.60,29.55,29.51,29.42,29.36,29.29,25.85,25.69,22.68,14.11。MS(MALDI)calculated for C75H99N4NaO9 +(M+Na+)1241.7288,found 1241.8127。
S13α由于在脱去Bn的过程中双键往往会被破坏，不宜合成S13α结构，应对S5α侧链的叠氮集团还原成氨基后予以保护。所以合成αGalCer侧链含不饱和双键或三键衍生物及含有此类似结构化合物的应当先脱去Bn再连双烯的侧链。其路线修改为：
将得到的S6溶于40mL 3:1的二氧六环：水中，然后依次加入三乙胺(1.29mL，9.3mol)，Boc2O(1.2g，5.58mmol)，室温搅拌3h，TLC检测反应完全。减压浓缩，以硅胶层析柱分离，石油醚:乙醚＝4:3洗脱，得到化合物S14(1.05g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50–7.19(m,20H),4.96(d,J＝9.2Hz,1H),4.89–4.65(m,5H),4.66–4.40(m,4H),4.03(s,1H),3.95(s,1H),3.90–3.44(m,9H),2.63(s,2H),1.72(s,3H),1.40(s,9H),1.24(d,J＝8.0Hz,23H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)。13C NMR(400MHz,CDCl3)δ155.42,138.45,138.39,138.23,137.91,128.44,128.30,128.28,128.26,127.90,127.86,127.73,127.66,127.52,127.49,99.14,79.54,79.37,75.78,73.35,73.28,72.50,71.70,69.56,69.22,68.49,62.70,51.68,31.86,29.65,29.60,29.58,29.31,28.30,25.73,22.63,14.09。MS(MALDI)calculated forC57H81NNaO10 +(M+Na+)962.5753,found 962.6218。之后的两步与上述步骤相同，得到化合物S15。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.22(m,20H),4.99(d,J＝9.2Hz,1H),δ4.86(d,J＝3.2Hz,1H),4.85–4.70(m,4H),4.68–4.60(m,2H),4.57(d,J＝11.5Hz,1H),4.50(d,J＝11.7Hz,1H),3.94(d,J＝2.8Hz,2H),3.92–3.74(m,5H),3.59(q,J＝7.4Hz,2H),3.32(dd,J＝12.6,5.1Hz,1H),2.63(d,J＝4.9Hz,1H),2.04–1.58(m,3H),1.47(s,9H),1.29(d,J＝6.6Hz,24H),0.92(t,J＝6.8Hz,3H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.26,138.51,138.45,138.16,137.76,128.46,128.30,128.25,128.23,127.94,127.85,127.72,127.65,127.62,127.45,127.44,98.37,79.72,79.20,78.85,77.15,75.60,73.33,73.16,72.61,71.67,68.85,68.59,67.64,51.43,51.04,31.85,29.66,29.64,29.59,29.30,28.30,25.78,22.63,14.08。MS(MALDI)calculated for C57H80N4NaO9 +(M+Na+)987.5818,found 987.6314。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的糖抗原、连接单元和佐剂依次共价连接的方法
将S9(40mg)溶于5mL的湿甲醇加入PMe3(40μL)在室温下搅拌3小时。减压除去溶剂，并真空抽24h除去残留物中的三甲基磷氧，得到白色固体(32mg，等量)。产物直接溶于1mL干燥的CH3CN中，加入实施例1制备的化合物5(47mg)，室温反应过夜，然后在真空浓缩。通过Sephadex LH-20提纯，洗脱剂二氯甲烷/甲醇(1:1，v/v)，得到产物7(62mg)，继续下一步，产物7溶解在10mL的二氯甲烷/甲醇(1:1，v/v),加入Pd(OH)2/C(30mg)，H2氛围下搅拌3h，硅藻土过滤除去氢氧化钯碳。减压除去溶剂后溶于4mL的四氢呋喃和甲醇的溶液中(v/v,1:1)，加入1mL的0.5mmol/L的甲醇钠溶液在0℃搅拌1h，之后用Amberlite 15(H+)树脂调为中性，过滤后，产物浓缩后后溶解于4mL的四氢呋喃/水溶液中(1:1,v/v)，后加入0.5mLof2.0M的氢氧化钠水溶液，室温搅拌过夜用1.0M盐酸调至中性.减压除去溶剂，经过Sephadex LH-20提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇CH2Cl2/MeOH(v/v,1:1)得到白色固体产物1(20mg,5步产率51％)，MS(MALDI-TOF)calcd.for C79H146N5Na2O25 +[M+2Na-H]+1611.0097，found 1611.0509。
疫苗分子2，3，4，5的合成路线如1。
疫苗分子2：1H NMR(400MHz,Pyridine-d5)δ9.32(s,1H),8.99(d,J＝26.9Hz,2H),8.70(d,J＝7.9Hz,1H),8.54(d,J＝17.3Hz,1H),4.59(d,J＝11.6Hz,9H),4.50(d,J＝15.6Hz,7H),4.35(dt,J＝17.9,6.8Hz,11H),4.16–4.03(m,2H),3.92(s,4H),3.64(t,J＝20.0Hz,14H),2.70–2.42(m,4H),2.14(d,J＝5.1Hz,2H),2.03(s,2H),1.92(s,4H),1.53–1.01(m,44H),0.87(d,J＝8.1Hz,6H).MS(MALDI)calculated for C63H114N5Na2O25 +(M+2Na-H+)1386.7593,found 1386.8218.
疫苗分子3：1H NMR(400MHz,Pyridine-d5)δ9.39(s,2H),9.12–8.91(m,2H),8.56(s,2H),7.15(d,J＝8.7Hz,2H),5.31(d,J＝3.3Hz,2H),5.23(d,J＝6.7Hz,2H),5.11(s,2H),4.91(s,2H),4.78–4.54(m,6H),4.55–4.40(m,4H),4.34(d,J＝10.4Hz,7H),4.09(dd,J＝13.6,6.8Hz,2H),3.92(dt,J＝12.0,5.7Hz,4H),3.78–3.45(m,9H),2.61–2.41(m,7H),2.39–2.22(m,3H),2.13(s,3H),2.04(s,2H),1.92(s,8H),1.75–1.48(m,6H),1.23(d,J＝22.7Hz,31H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)。MS(MALDI)calculated for C70H119FN5Na2O25 +(M+2Na-H+)1494.7968,found 1494.8469.
疫苗分子4：1H NMR(400MHz,Pyridine-d5)δ9.00(s,1H),8.97–8.84(m,1H),8.80(d,J＝8.1Hz,1H),8.63(s,1H),7.33–7.26(m,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.12–7.05(m,4H),5.57–5.33(m,2H),5.26(t,J＝21.1Hz,2H),5.05(s,2H),4.86–4.17(m,20H),4.16–3.78(m,5H),3.79–3.31(m,9H),2.68–2.40(m,7H),2.21–1.99(m,5H),1.87(d,J＝30.1Hz,8H),1.61(t,J＝7.6Hz,5H),1.49–1.02(m,45H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)。MS(MALDI)calculated for C76H123FN5Na2O26 +(M+2Na-H+)1586.8230,found 1586.8019.
疫苗分子5：1H NMR(400MHz,Pyridine-d5)δ9.29(s,1H),8.91(s,1H),8.80(d,J＝8.0Hz,1H),8.64–8.47(m,1H),5.22(d,J＝71.4Hz,2H),4.81(d,J＝7.7Hz,1H),4.77–4.51(m,4H),4.51–4.18(m,7H),4.18–3.80(m,4H),3.81–3.44(m,6H),2.47(d,J＝18.5Hz,4H),2.08(d,J＝38.4Hz,4H),1.90(s,5H),1.31(d,J＝24.4Hz,58H),0.89(t,J＝6.6Hz,6H).MS(MALDI)calculated for C79H146N5Na2O25 +(M+2Na-H+)1611.0097,found 1611.0119
疫苗分子6的合成路线自S15后与以上相似，不同的是在脱Bn之后在TFA条件下脱去Boc，再连上侧链。疫苗分子6的表征数据：1H NMR(400MHz,Pyridine-d5)δ9.00–8.85(m,2H),8.69(s,1H),5.62–5.47(m,12H),4.83–4.56(m,7H),4.58–4.17(m,14H),3.96(d,J＝6.9Hz,3H),3.80–3.38(m,6H),3.09–2.87(m,4H),2.73–2.40(m,3H),2.31(s,2H),2.24–2.03(m,4H),2.02–1.60(m,5H),1.53–1.01(m,53H),0.87(t,J＝4.7,2.5Hz,6H)。MS(MALDI)calculated for C73H130N5Na2O25 +(M+2Na-H+)1522.8845,found 1522.9110。
疫苗分子6的合成方法，其余的疫苗分子1，2，3，4，5也适用。
实施例4
本实施例用于说明共价连接方式的脂质体疫苗的制备
将1,2-二硬酰基-Sn-丙三基磷酸胆碱，胆固醇和实施例3制备得到的疫苗分子按照摩尔比5:4:1溶解于二氯甲烷：甲醇(v/v,1:1)中，超声10分钟，冻干。小鼠免疫前，将制好的脂质体溶于含有氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，缓冲液组分浓度分别为0.15M(氯化钠)和0.02M(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，STn抗原的浓度为10μg/mL，超声10min后注射。
实施例5
本实施例用于说明用于混合自组装方式的佐剂的制备方法
下列佐剂的合成方法参照文献合成：Li,X.；Fujio,M.；Imamura,M.；Wu,D.；Vasan,S.；Wong,C.-H.；Ho,D.D.；Tsuji,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107(29),13010–13015.
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的糖抗原与连接单元共价连接的方法
糖抗原与连接单元共价连接合成化合物7：
化合物S7β.化合物S7β从化合物S4β(2.43g,2.55mmol)制备得到，合成方法类似于从化合物S4α制备化合物S7α，三步反应后得到化合物S7β为1.35g，三步产率为33.7％。1HNMR(400MHz,CDCl3)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58–6.85(m,20H),5.89(d,J＝8.5Hz,1H),4.79(d,J＝11.2Hz,1H),4.75(d,J＝5.1Hz,1H),4.72(d,J＝4.7Hz,1H),4.69(s,2H),4.59(d,J＝4.8Hz,1H),4.56(d,J＝4.7Hz,1H),4.49(d,J＝11.5Hz,1H),4.38(d,J＝8.7Hz,1H),4.33(d,J＝7.7Hz,1H),4.05(dd,J＝10.5,5.2Hz,1H),3.99–3.86(m,2H),3.84–3.70(m,3H),3.66–3.59(m,1H),3.52(d,J＝13.7Hz,1H),3.51–3.45(m,1H),3.43–3.37(m,1H),1.83(q,J＝7.7Hz,2H),1.64(s,4H),1.43(d,J＝6.3Hz,4H),1.24(d,J＝9.3Hz,64H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.92,138.54,138.41,137.63,128.52,128.38,128.37,128.02,127.96,127.85,127.75,127.70,127.64,127.62,104.11,80.63,80.47,78.96,78.84,77.20,75.13,74.43,73.14,72.50,71.99,68.82,67.58,62.70,53.39,50.82,50.18,36.65,31.92,30.25,29.84,29.73,29.71,29.69,29.67,29.65,29.59,29.39,29.36,29.35,29.33,26.00,25.64,22.68,14.10.ESI-MS calcd.for C78H123NNaO9 +[M+Na]+1240.91,found 1241.07.
化合物S9β.化合物S9β从化合物S7β(0.774g,0.636mmol)制备得到，合成方法类似于从化合物S7α制备化合物S9α，两步反应后得到化合物S9β为628mg，两步产率为72％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.52–6.73(m,20H),5.64(d,J＝7.9Hz,1H),4.90–4.54(m,5H),4.49(d,J＝12.6Hz,2H),4.38(d,J＝11.4Hz,1H),4.18(dd,J＝29.8,8.4Hz,3H),3.78(s,1H),3.66(s,2H),3.59–3.48(m,2H),3.40(s,3H),3.26–3.09(m,1H),1.77(d,J＝11.2Hz,3H),1.58(s,3H),1.35(d,J＝19.7Hz,4H),1.17(s,64H),0.80(d,J＝6.3Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.40,138.38,138.26,138.03,137.21,128.38,128.23,128.13,127.94,127.78,127.69,127.61,127.56,127.36,103.69,80.22,79.88,79.35,78.48,77.32,77.00,76.68,75.11,73.53,73.47,72.63,71.81,68.99,66.91,50.87,49.91,36.72,32.04,29.83,29.83,29.49,26.18,25.77,22.84,14.31.MS(MALDI-TOF)calcd.forC78H122N4NaO8 +[M+Na]+1265.91,found 1265.12.
化合物7.化合物7从化合物S9β制备得到，合成方法类似于从化合物S9α制备化合物1，五步反应后得到化合物7为34mg，五步产率为48％。1H NMR(400MHz,C5H5N)δ9.29(s,1H),9.00–8.78(m,2H),8.67–8.44(m,2H),5.30(s,1H),5.13(s,2H),4.81(d,J＝7.7Hz,1H),4.75–4.65(m,2H),4.56(d,J＝21.8Hz,4H),4.39(qd,J＝19.1,11.0Hz,8H),4.22(t,J＝7.3Hz,1H),4.07(dd,J＝15.7,8.6Hz,3H),3.99–3.85(m,2H),3.75–3.48(m,8H),2.47(d,J＝18.5Hz,6H),2.13(s,4H),2.03(s,2H),1.90(s,6H),1.85–1.74(m,3H),1.73–1.60(m,2H),1.31(d,J＝24.4Hz,67H),0.89(t,J＝6.6Hz,6H).MS(MALDI-TOF)calcd.forC79H146N5Na2O25 +[M+2Na-H]+1611.0097,found 1610.9741.
实施例7
本实施例用于说明糖抗原与连接单元共价的连接产物组分(a-b)与佐剂混合自组装脂质体疫苗制剂的方法
将实施例6制备得到的组分a-b(化合物7)与实施例5制备得到的佐剂以及1,2-二硬酰基-Sn-丙三基磷酸胆碱和胆固醇按照1:1:5:4的摩尔比溶解于二氯甲烷：甲醇(v/v,1:1)中，超声10分钟，冻干。小鼠免疫前，将制好的脂质体溶于含有氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，缓冲液组分浓度分别为0.15M(氯化钠)和0.02M(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，STn抗原的浓度为10μg/mL，超声10min后注射。
实施例8
本实施例用于说明包被抗原的制备
将产物3(20.0mg,0.012mmol)溶于4mL四氢呋喃和甲醇的溶液中(v/v,1:1)，加入1mL的0.5mmol/L的甲醇钠溶液在0℃搅拌1h，之后用Amberlite 15(H+)树脂调为中性，过滤后，产物浓缩后后溶解于4mL的四氢呋喃/水溶液中(1:1,v/v)，后加入0.5mL的2.0M的氢氧化钠水溶液，室温搅拌过夜用1.0M盐酸调至中性.减压除去溶剂后，用3mL甲醇溶解，加入10mg钯碳，H2氛围下搅拌3h，硅藻土过滤后，浓缩后，溶于4mL二氯甲烷/甲醇/乙腈(v/v/v,2:1:1)，加入5倍摩尔量的己二酸二硒酯，加几滴碳酸氢钠水溶液，反应2h后用Amberlite15(H+)树脂调为中性，减压除去溶剂，用水萃取，浓缩后得到8mg无色透明固体8(产率36％)。取产物8 1.5mg溶于150μL的DMF，将3.25mg的BSA蛋白溶于1.35mL pH为7.5的PBS缓冲液中，混合后静置24h后，用乙酸乙酯萃取后，离心后冻干，放入-20℃冰箱保存。质谱表征BSA连上11.6个STn抗原。
实施例9
本实施例用于说明动物免疫过程
购买7周大的雌性BALB/c小鼠(购自武汉大学中南医院动物中心)。免疫时间分别为第1天，第15天和第29天，注射方式为腹腔注射。取血方式为断尾取血，取血时间为每次免疫注射后的14天。具体列于表1中。血液静置1h后，离心取血清，存储在-80℃冰箱。
表1
第0天 第1天 第14天 第15天 第28天 第29天 第42天
取血1 初次免疫 取血2 第二次免疫 取血3 第三次免疫 取血4
实施例10
本实施例用于说明间接法测定血液中抗体含量的方法
(1)包被：包被抗原STn-BSA，用pH＝9.0-9.6碳酸盐缓冲液稀释，抗原密度为0.02μg/孔，每孔100μL，置于4℃冰箱过夜。PBST满孔洗涤三次，扣干。
(2)封闭：每孔加入100μL3％BSA的PBS缓冲液，37℃恒温箱温育1h，PBST满孔洗涤三次，扣干。
(3)抗原抗体特异性结合：用0.1％BSA的PBS缓冲液稀释血清，测IgG抗体时，稀释倍数为400，1000，2000，4000，8000，16000，32000，64000；测IgM抗体时,稀释倍数为100，200，400，800，1600，3200，6400，12800。每孔加入100μL稀释液，设置空白和阴性对照。37℃恒温箱温育1h。PBST满孔洗涤三次，扣干。
(4)加二抗：将羊抗鼠IgG-HRP溶于PBS缓冲液中，用0.1％BSA的PBS缓冲液稀释至4000倍，混匀，每孔加入100μL稀释液，37℃恒温箱温育1h。加IgM-HRP二抗操作与此相同。PBST满孔洗涤三次，扣干。
(5)显色：每孔加入50μL显色液(OPD浓度1mg/mL，H2O2浓度为1.5μL/mL)，震荡混匀，室温下避光保存15min。
(6)终止：每孔加入50μL终止液(2M的硫酸)，放入酶标仪中混匀后读数，在490nm波长处测定各孔的吸光度值。
图1-图3为实施例4中通过共价连接方式制备的脂质体疫苗的测试结果图。
图4-图5为实施例7中通过混合自组装方式制备的脂质体疫苗的测试结果图。
在图1中，横坐标为各类型抗体的种类，纵坐标为各类型抗体的滴度，误差线表示平均数标准误差。其中，PBS为空白对照，STn-βGalCer(化合物7)为阴性对照，STn-αGalCer(化合物1)为实验组。从图1中可以看出，共价连接策略的疫苗分子STn-αGalCer可以有效的引发免疫系统实现IgM到IgG的抗体类型转换，产生高滴度的IgG抗体。
在图2中，横坐标为各类型抗体的种类，纵坐标为各类型抗体的滴度，误差线表示平均数标准误差。其中，PBS为空白对照，STn-βGalCer(化合物7)为阴性对照，STn-αGalCer(化合物1)为实验组。从图2中可以看出，STn-αGalCer引发产生的IgG抗体亚型主要为IgG1和IgG3。
在图3中，横坐标为时间，纵坐标为各类型抗体的滴度，误差线表示平均数标准误差。其中，PBS为空白对照，STn-βGalCer(化合物7)为阴性对照，STn-αGalCer(化合物1)为实验组。从图3中可以看出，STn-αGalCer可以迅速的引发免疫系统实现IgM到IgG的抗体转换。
在图4中，横坐标是添加的不同佐剂，纵坐标是抗体滴度，误差线表示平均数标准误差。其中，PBS为空白对照。从图4可以看出，混合自组装方式制备的脂质体疫苗制剂也可以有效的激发免疫系统实现IgM到IgG的抗体类型转换，产生高滴度的IgG抗体。在所用的佐剂中，αGalCer最佳。
在图5中，横坐标是添加的不同佐剂，纵坐标是抗体滴度，误差线表示平均数标准误差。在图5中，横坐标是添加的不同佐剂，纵坐标是抗体滴度，误差线表示平均数标准误差。其中，PBS为空白对照。从图5可以看出，IgG的亚型主要是IgG1和IgG3。

Claims (14)

1.一种脂质体疫苗制剂，其特征在于，所述制剂包括：
(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原；
(b)连接单元；
(c)式(1)-(3)所示的佐剂，
其中，组分(a)肿瘤相关的糖抗原或糖肽抗原与组分(c)式(1)-(3)所示的佐剂在脂质体疫苗制剂中的共存关系有两种：第一种为组分(a)与组分(c)通过组分(b)连接单元共价连接形成组分a-b-c，第二种为组分(a)与组分(b)共价连接，组分(a)与组分(b)共价连接形成的分子组分a-b与组分(c)通过混合自组装为脂质体；
在第一种以共价连接形成组分a-b-c的方式中，所述X为-O-、-NH-、-CH2-或-S-；在第二种混合自组装的方式中，所述X为-OR1、-NHR2或-[-OCH2CH2O-]n1-OCH3，R1为-H、-(CH2)n2CH3、取代或未取代的苯环、取代或未取代的萘环，R2为R1、-COR1或-CONHR1，n1为0-20的整数，n2为0-10的整数；
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
2.根据权利要求1所述的脂质体疫苗制剂，其中，R*和R#相同，均为为线性的-C14H29残基。
3.根据权利要求1所述的脂质体疫苗制剂，其中，R*和R#不相同，R*为线性-C25H51残基，R#为线性-C14H29残基；
优选地，R*为残基，R#为线性-C14H29残基；
优选地，R*表示为残基，R#为线性-C14H29残基；
优选地，R*表示为-(CH2)9-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)4-CH3残基，R#为线性-C14H29残基；
优选地，R*表示为线性-C9H19残基，R#为线性-C14H29残基；
优选地，R*为线性-C25H51残基，R#为线性-C5H11残基。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，所述肿瘤相关的糖抗原为：Tn、TF、STn、GD2、GD3、GM2、GM3、Globo H、Lex、Ley和KH-1中的一种或多种；
优选地，所述糖肽抗原为MUC-1。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，在第一种以共价连接形成组分a-b-c的方式中，所述佐剂为：
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，在第二种混合自组装的方式中，所述佐剂为：
其中，R1为-H、-(CH2)n2CH3、取代或未取代的苯环、取代或未取代的萘环；n1为0-20的整数，n2为0-10的整数；
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
优选地，所述佐剂为：
R*和R#各自独立地为含有1-30个碳原子的碳基团和0-5个选自N、O、F、Br和Cl中至少一种的杂原子的结构，上述结构可以为直链状的、支链状的、环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的结构；
X’、W、Y和Z各自独立地选自-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
进一步优选地，所述佐剂为：
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，在第一种以共价连接的方式中，组分(a)与组分(c)通过组分(b)连接单元共价连接，连接单元(b)用L表示，进一步表示为-L1-L2-，-L2-，-L2-L3-或-L1-L2-L3-。
其中，L1选自以下结构中的一种：
其中，x为1-60的整数；
Y*表示一个键，-NH-，-O-，-S-，-S-S-；
L2为-CH2-、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、-C7H14-、-C8H16-、-C9H18-、-C10H20-、-CH(CH3)-、-C[(CH3)2]-、-CH2-CH(CH3)-、-CH(CH3)-CH2-、-CH(CH3)-C2H4-、-CH2-CH(CH3)-CH2-、-C2H4-CH(CH3)-、-CH2-C[(CH3)2]-、-C[(CH3)2]-CH2-、-CH(CH3)-CH(CH3)-、-C[(C2H5)(CH3)]-、-CH(C3H7)-、-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-、-CO-CH2-、-CO-C2H4-、-CO-C3H6-、-CO-C4H8-、-CO-C5H10-、-CO-C6H12-、-CO-C7H14-、-CO-C8H16-、-CO-C9H18-、-CO-C10H20-、-CO-CH(CH3)-、-CO-C[(CH3)2]-、-CO-CH2-CH(CH3)-、-CO-CH(CH3)-CH2-、-CO-CH(CH3)-C2H4-、-CO-CH2-CH(CH3)-CH2-、-CO-C2H4-CH(CH3)-、-CO-CH2-C[(CH3)2]-、-CO-C[(CH3)2]-CH2-、-CO-CH(CH3)-CH(CH3)-、-CO-C[(C2H5)(CH3)]-、-CO-CH(C3H7)-或-CO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-；
n为1-60的整数；
L3为-CO-、-O-CO-、-NH-CO-、-NH(C＝NH)-、-SO2-、-O-SO2-、-NH-、-NH-CO-CH2-。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，在第二种混合自组装的方式中，所述连接单元(b)用L或L-L#表示，其中，如果L中不带有C10-C100的脂肪链，连接单元(b)用L-L#表示，L#表示为带有C10-C100的脂肪链的结构；如果L中带有C10-C100的脂肪链，则连接单元(b)表示为L；L的一端与组分(a)连接，另一端则用氢原子补齐；其中，所述C10-C100的脂肪链指的是碳原子个数为10-100个，且不含有除烷基外的取代基和杂原子；C10-C100的脂肪链位于组分(b)的侧链位置上或者碳骨架上，当C10-C100的脂肪链位于碳骨架上时，C10-C100的脂肪链是碳骨架的端尾。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的疫苗制剂，其中，组分(a)、(b)和(c)以共价连接方式连接时，疫苗分子为以下结构：
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，组分(a)和(b)通过进行共价连接，连接产物组分a-b和(c)通过混合自组装，组分a-b和组分(c)的含量的摩尔比为1：0.01-100，优选为1：0.1-10；
优选地，组分(a)为STn，组分(b)的右端为βGalCer，组分(b)为βGalCer和共价连接方式中的连接单元连接的产物，组分(c)选自图示结构中的至少一种，
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的脂质体疫苗制剂，其中，所述脂质体疫苗制剂中还包括：
(d)脂质载体，所述脂质载体为胆固醇、1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱和1,2-二油酰基卵磷脂中的一种或多种；
优选地，所述脂质载体为胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱按照摩尔比0.1-10:1的比例形成的混合物；
优选地，所述脂质载体为胆固醇和1,2-二油酰基卵磷脂按照摩尔比0.1-10:1的比例形成的混合物；
优选地，所述脂质载体为胆固醇、1,2-二油酰基卵磷脂和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱按照摩尔比0.1-10:0.1-10:1的比例形成的混合物。
12.根据权利要求11所述的脂质体疫苗制剂，其中，
在第一种共价连接的方式中，组分a-b-c、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱的摩尔比为1：0.1-100：0.1-100，优选为1：1-100：1-100；
在第二种混合自组装的方式中，组分a-b、组分(c)、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-Sn-丙三基-3-磷酸胆碱的摩尔比为1：0.01-100：0.1-100：0.1-100，优选为1：0.1-10：1-10：1-10。
13.权利要求1-12中任意一项所述的脂质体疫苗制剂在制备肿瘤相关药物中的用途。
14.一种生产IgG抗体的方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求1-12中任意一项所述的脂质体疫苗制剂进行免疫反应。
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