CN111875649A - 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111875649A CN111875649A CN202010698972.8A CN202010698972A CN111875649A CN 111875649 A CN111875649 A CN 111875649A CN 202010698972 A CN202010698972 A CN 202010698972A CN 111875649 A CN111875649 A CN 111875649A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- conjugate
- trehalose
- saccharide antigen
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及化学与医药技术领域，公开了一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用。本发明所述缀合物以海藻糖作为内嵌佐剂，与肿瘤细胞表面异常表达的肿瘤相关糖抗原(STn或Tn)偶合得到；具有结构明确、合成方法简便、产物质量稳定可控等优点，特别是该疫苗的能克服糖抗原免疫原性弱的缺点，诱导产生高亲和力的特异性IgG抗体，从而达到靶向杀死肿瘤细胞的抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学与医药技术领域，尤其涉及一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用。
背景技术
如今癌症已成为人类的第一杀手并成为全球最大的公共卫生问题，恶性肿瘤死亡率呈明显增长趋势，严重的威胁人类的生活。现治疗癌症的方法有手术、化疗、放疗、 免疫疗法，其中肿瘤免疫疗法是研究肿瘤治疗的热门之一。在肿瘤细胞表明异常过量 表达的肿瘤相关糖抗原(TACAs)，具有重要的生物学功能，是糖抗原肿瘤疫苗设计 的优秀靶点。
但是肿瘤相关糖抗原(TACAs)是T细胞非依赖性抗原，免疫原性较弱，需要在 免疫原性载体分子的协助下才能刺激T细胞并诱导持久的抗体反应。如何提高糖抗原 的免疫原性，使其更高效地诱导产生高滴度、高亲和力的IgG抗体并特异性地杀死肿 瘤细胞，是肿瘤疫苗的研究热点之一。经典的策略是将糖抗原与载体蛋白缀合来增强 其免疫原性，但糖蛋白疫苗有偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点。 因此，肿瘤相关糖抗原疫苗的全合成策略成了新的研究热点之一；全合成糖抗原疫苗 具有明确的结构，质量稳定可控等优点，便于各种免疫学和临床研究。近年来，科研 工作者发现多种病原菌表面的糖分子可作为全合成糖抗原肿瘤疫苗的内嵌佐剂，其既 能克服糖抗原免疫原性弱的缺点，又可以避免蛋白质引起的“表位抑制”效应。
海藻糖-6,6-二霉菌酸酯(TDM，索状因子)是结核分枝杆菌细胞壁中重要的糖脂成分，由海藻糖及2条霉菌酸酯链构成；该糖脂能引起炎症反应，并且对肿瘤细胞有 一定的细胞毒性。研究表明，海藻糖-6,6-二霉菌酸酯的衍生物Vizantin和TDE免疫活 性高且毒性低，可作为有效佐剂用于疫苗研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物。本发明以强效免疫刺激剂海藻糖衍生物Vizantin和TDE作为内嵌佐剂分别缀合糖抗原(STn、Tn)得到 所述缀合物，其中海藻糖衍生物能提高糖抗原的免疫原性，所述缀合物能够诱导T细 胞介导体液免疫，产生高浓度的高亲和力的IgG抗体，达到特异性杀死肿瘤细胞的目 的。
本发明的另一目的在于提供所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备肿瘤疫苗 中的应用。
本发明的还一目的在于提供所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，所述缀合物结构通式如下式I所示：
[X—L—Y]
式(I)
其中，X表示糖抗原，选自下式中的任意一种糖抗原，或其可要药用盐、水合物 或溶剂化物：
L表示连接体，选自以下
-NHC(O)-(CH2CH2O)a-CH2CH2-C(O)NH-、
-(OCH2CH2)a-CH2CH2-C(O)NH-、
-NHC(O)-(CH2)a-C(O)NH-、
中 的任意一种，a是0到20中的任意一个整数；
Y表示海藻糖衍生物，选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂 化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、-CH2-CH(OR3)-(CH2)m-CH3，-(CH2)mCH3或 -(CH2)mCHR3 2，R3为-(CH2)m-CH3或-C(O)-(CH2)m-CH3，m是选自8-26的整数。
优选地，所述L选自
中的任意一种，a是0到20中的任意一个整数。
优选地，所述L选自
中的任意一种，a是0到20中的任意一个整数。
优选地，所述Y选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、-(CH2)mCH3或-(CH2)mCHR3 2，R3为-(CH2)m-CH3或 -C(O)-(CH2)m-CH3，m是选自8-26的整数。
优选地，所述Y选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢或-(CH2)mCH3，m是选自8-26的整数。
优选地，所述缀合物选自如下任一结构或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
本发明同时所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物的制备方法，当Y为
S1.化合物7在氢化钠、四丁基溴化铵催化作用下与溴丙炔反应得到化合物8；
S2.化合物8在三氟乙酸的条件下，脱去PMB基团得到化合物9；
S3.化合物9与相应的脂肪酸链进行酯化缩合得到对应的化合物10或11；
S4.化合物10与化合物Tn或STn、化合物11与化合物STn分别在催化剂的作用 下反应得到化合物19或20、化合物21；
S5.化合物19、20和21分别经脱苄基保护反应，即可得到目标产物；
当Y为
制备过程包括；
S11.化合物7在2,6-二甲基吡啶的催化下与叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯反应得到化合物12；
S21.化合物12在氢化钠、四丁基溴化铵催化作用下与溴丙炔反应得到化合物化合物13；
S31.化合物13在三氟乙酸的条件下，脱去PMB基团得到化合物14；
S41.化合物14分别与相应的脂肪酸链进行酯化缩合得到对应的化合物15或16；
S51.化合物15或16分别脱去保护基团三甲基硅烷得到相应的化合物17或18；
S61.化合物17或18与三氟化硼乙醚反应得到相应的化合物22或23；
S71.化合物22或23分别经脱苄基保护反应，即可得到目标产物；
其中，化合物7至23的结构如下所示：
优选地，步骤S5和步骤S71中，脱苄基保护反应的催化剂为氢气/钯碳/氢氧化钯、氢气/钯碳或氢气/氢氧化钯等，优选氢气/钯碳；反应采用的溶剂为二氯甲烷/甲醇/水、 二氯甲烷、甲醇或二氯甲烷/甲醇等；优选二氯甲烷/甲醇/水。
优选地，步骤S4和步骤S61中，反应的催化剂为碘化亚铜/N,N-二异丙基乙胺或 碘化亚铜/N,N-二异丙基乙胺/冰乙酸等；优选碘化亚铜/N,N-二异丙基乙胺；反应的溶 剂为二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇或四氢呋喃/甲醇等；优选四氢呋喃/甲醇。
优选地，步骤S51中，反应的催化剂为三氟化硼乙醚或三氟乙酸的水溶液等，优 选三氟化硼乙醚；反应的溶剂为乙腈、二氯甲烷或四氢呋喃等，优选为乙腈。
优选地，步骤S3和步骤S41中，反应过程中的缩合试剂可以选择4-二甲氨基吡 啶(DMAP)/1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘盐(EDC·MEI)，N,N’-二环 己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)等，优选DMAP/EDC·HCl。
优选地，化合物7的制备过程如下：
S31.以海藻糖为起始原料，在对甲苯磺酸的作用下，4-甲氧基苯甲醛二甲缩醛 对原料进行4,6位羟基选择性保护，得到化合物5，用溴化卞对裸露的羟基进行全苄基 化得化合物6；
S32.化合物6选择性还原4,4’位糖羟基得到化合物7；
其中化合物5和6的结构如下：
优选地，步骤S32中，反应的催化剂为三乙基硅烷/三氟甲磺酸或氰基硼氢化钠/盐酸乙醚；反应在溶剂为二氯甲烷、甲醇或四氢呋喃中进行。
更优选地，步骤S32中，反应的催化剂为氰基硼氢化钠/盐酸乙醚；反应在溶剂 二氯甲烷中进行。
本发明上述制备路线简短、反应条件温和、产率高、操作方便，能够用于工业化 制备。
所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备肿瘤疫苗中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述肿瘤疫苗或抗肿瘤药物为乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、 前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、甲腺癌、脑癌、胃癌 或白血病的疫苗或药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以强效免疫刺激剂海藻糖衍生物Vizantin和TDE作为内嵌佐剂分别缀合糖抗原(STn、Tn)得到所述缀合物，其中海藻糖衍生物能提高糖抗原的免疫原性，使 得所述缀合物能够诱导T细胞介导体液免疫，产生高浓度的高亲和力的IgG抗体，达 到特异性杀死肿瘤细胞的目的，可制备成为肿瘤疫苗或抗肿瘤药物进行应用。
附图说明
图1为缀合物1，2，3与4制备的疫苗诱导小鼠产生的抗体免疫活性评价图。
图2为缀合物1，2，3与4制备的疫苗诱导小鼠产生的抗体血清特异性杀死肿瘤 细胞MCF-7的补体依赖性细胞毒性评价图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明， 均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
实施例1海藻糖衍生物与糖抗原缀合物1、2、3、4与L2-3的制备
1)化合物5的合成
将海藻糖(10.00g,0.03mol)和对甲苯磺酸一水化合物(1.10g,5.84mol)溶于 二甲基甲酰胺中，在氮气保护下滴加茴香醛二甲缩醛(20mL,0.117mol)，室温搅拌 反应，反应24小时后，乙酸乙酯稀释，饱和碳酸氢钠溶液，静置，有白色固体析出， 抽滤，得化合物5(11.90g,70％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.41-7.39(d,J＝8.8 Hz,4H),6.88-6.68(d,J＝8.8Hz,4H),5.51(s,2H,PhCH),5.11(d,J＝3.6Hz,2H,H-1& H-1′),4.19(dt,J＝10.0,4.8Hz,2H,H5&H5′),4.12-4.06(m,2H,H3&H3′),4.03-3.98(t,J ＝9.6,2H,H4&H4′),3.77(s，6H),3.72-3.67(t,J＝10.4Hz,2H),3.61(dd,J1＝9.2Hz,J2＝ 4.0Hz,2H),3.45(t,J＝9.6,2H),3.31-3.29(m,2H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C28H34O13[M+H]+579.2072 found,579.2067.
2)化合物6的制备
化合物5(2.98g，5.75mmol)溶于N-N-二甲基甲酰胺中，在氮气的保护下，加入 氢化钠(60％in oil；2.30g，57.5mmol)，反应液降温到0℃，依次加入溴化卞(5.5mL，45.98mmol)、四丁基碘化铵(425.01mg，1.15mmol)。室温反应18h，反应液降温至 0℃，滴少量甲醇溶液进行反应的淬灭，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水冲洗混合液，收集 有机层，浓缩得粗品，硅胶柱色谱纯化得白色固体化合物6(14.90g,78.4％)。1H NMR (400MHz，CDCl3)δ7.34-7.24(m,24H),6.92-6.90(d,J＝8.8Hz，4H)5.51(s,2H, PhCH)，5.11(d,J＝3.8Hz，2H,H-1&H-1′),4.96(d,J＝10.8Hz,2H,PhCH2O),4.85-4.81 (dd,J＝10.8Hz,4H),4.72(d,J＝10.8Hz,2H,PhCH2O),4.27(dt,J＝10.0,4.8Hz,2H, H5&H5′),4.14(t,J＝9.4Hz,2H,H3&H3′),4.12-4.10(m,2H,H4&H4′),3.83(S,6H), 3.69-3.59(m,6H)；HR-ESI-MS(m/z):calcdfor C54H58O11[M+H]+939.395found， 939.3933.
3)化合物7的制备
将6(2.00g，2.11mol)溶于四氢呋喃中，依次加入氰基硼氢化钠、甲基橙指示剂，冰浴下，缓慢滴加盐酸乙醚溶液，滴加至反应液的颜色由橙黄色渐变为粉红色，且半 分钟内不变化，然后，缓慢升至室温，继续反应8小时，加乙酸乙酯溶液稀释，饱和 食盐水洗3次，有机层减压浓缩，得黄色油状液体粗品。硅胶柱色谱纯化得呈白色油 状液体化合物7(1.31g,68.2％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37-7.23(m,20H), 7.19-7.16(d,J＝6.4Hz,4H),6.83-6.80(d,J＝6.4Hz,4H),5.20(d,J＝3.6Hz,2H),5.00 (d,J＝11.2Hz,2H),4.80(d,J＝11.2Hz,2H),4.70-4.60(q,J＝12.0Hz,4H),4.40(q,J ＝12.0Hz,4H),4.73-4.63(m,6H),4.12-4.08(dt,J1＝13.6Hz,J2＝7.6Hz,2H),3.89-3.87 (t,J＝9.2Hz,2H),3.77(s,6H),3.67-3.65(t,J＝9.2Hz,2H)，3.53(dd,J＝9.6,3.6Hz,2H), 3.51-3.43(qd,J＝10.4,4.0Hz,4H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C56H62O13[M+COOH]- 987.4172found,987.4177
4)化合物8的合成
N-N'-二甲基甲酰胺溶解化合物7(1.01g,1.06mmol)，加入氢化钠(60％in oil；2.31 g,57.5mmol)，反应液降温至0℃，依次加入溴丙炔(5.5mL，45.98mmol)、四丁基溴 化铵(425.10mg,1.15mmol)。室温搅拌反应4h，反应液的颜色由乳白变为浊黄色，滴 少量甲醇溶液进行反应的淬灭，乙酸乙酯稀释反应液，饱和食盐水冲洗混合液，有机 层浓缩的粗品，硅胶柱色谱纯化得白色油状化合物8(0.45g,42.3％)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.40-7.27(m,20H),7.21-7.18(d,J＝8.4Hz,4H),6.84-6.81(d,J＝8.4Hz, 4H),5.15-5.14(d,J＝3.6Hz,2H),4.98-4.83(q,J＝10.4Hz,4H),4.64(s,4H),4.48-4.45 (d,J＝11.6Hz,4H),4.39-4.33(m,4H),4.16-4.11(m,2H),3.98-3.96(t,J＝9.2Hz,2H), 3.79(s,6H)，3.53-3.48(m,6H),3.40-3.37(m,4H),2.41(t,J＝2.4Hz,2H)；HR-ESI-MS (m/z):calcd forC62H66O13[M+Na]+1041.4396found,1041.4395.
5)化合物9的合成
二氯甲烷溶解化合物8(50.20mg,0.0491mmol)，缓慢滴加5％TFA(0.15mL)， 反应2h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠冲洗，有机相减压浓缩得粗品，柱层析分离纯 化得透明无色油状化合物9(33.20mg,85.7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.28 (m,20H),5.12-5.11(d,J＝3.6Hz,2H),5.01-4.98(d,J＝10.8Hz,2H),4.86-4.83(d,J＝ 10.8Hz,2H),4.72-4.65(m,4H),4.46-4.37(m,4H),4.04-4.00(m,4H),3.72-3.60(m,4H), 3.54-3.49(m,4H),2.49-2.48(t,J＝2.0Hz,2H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C46H50O11[M +COOH]-823.3335found,823.3311.
6)化合物10的合成
二氯甲烷溶解化合物9(21.03mg)，自制脂肪酸链(22.00mg)，EDC/HCl(4eq) 和DMAP(1eq)，加热至53℃，回流反应12h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠溶液 冲洗，收集有机相，减压浓缩得粗品，柱层析分离纯化得透明淡黄色油状化合物10 (20.36mg,54％)。1HNMR(400MHz in CDCl3)δ7.40-7.27(20H,m),5.15-5.14(2H,d, J＝3.2Hz),5.00-4.98(2H,d,J＝10.8Hz),4.86-4.84(2H,d,J＝10.8Hz),4.72-4.66(2H,q, J＝12.4Hz),4.46-4.42(2H,dd,J＝12.4Hz),4.32-4.28(2H,dd,J1＝15.2Hz,J2＝2.4Hz), 4.19(2H,m),4.14(4H,m),4.01(2H,t,J＝9.2Hz),3.52(2H,dd,J1＝9.6Hz,J2＝3.2Hz), 3.45(2H,t,J＝9.2Hz),2.44(2H,s),2.19(4H,d,J＝6.8Hz),1.80(2H,m),1.24(64H,m), 0.87(12H,t,J＝6.4Hz).13C NMR(100MHz in CDCl3)δ14.15,22.71,26.56,26.51, 29.37,29.64,29.67,29.95,31.93,33.71,33.78,34.86,39.08,60.14,62.59,68.89,72.95, 74.62,75.75,77.25,79.26,79.70,81.33,94.02,127.44,127.58,127.77,127.92,128.11, 128.48,128.55,137.78,137.71,138.45,173.24.HR-ESI-MS(m/z):calcd for C88H130O13[M +Na]+1417.9404found,1417.9404.
7)化合物11的制备
二氯甲烷溶解化合物9(40.20mg)，Behenic Acid(52.53mg)，EDC/HCl和DMAP， 加热至53℃，回流反应12h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠溶液冲洗，收集有机相， 减压浓缩得粗品，柱层析分离纯化得透明淡黄色油状化合物11(46.80mg,63％)。1H NMR(400MHz inCDCl3)δ7.37-7.25(20H,m),5.15-5.14(2H,d,J＝3.6Hz),5.00-4.98 (2H,d,J＝10.8Hz),4.86-4.84(2H,d,J＝10.8Hz),4.69(4H,m),4.37-4.33(2H,dd,J1＝ 15.6Hz,J2＝2.4Hz),4.32-4.28(2H,dd,J1＝15.6Hz,J2＝2.4Hz),4.15-4.03(6H,m),3.96 (2H,t,J＝9.2Hz),3.49-3.44(2H,dd,J1＝10.0Hz,J2＝3.6Hz),3.41-3.39(4H,t,J＝9.2 Hz,2H),2.37(2H,t,J＝2.4Hz),2.25(2H,t,J＝7.6Hz),1.48(4H,m),1.20(76H,m),0.82 (6H,t,J＝6.8Hz).13CNMR(100MHz in CDCl3)δ14.17,22.73,24.88,29.19,29.30, 29.40,29.52,29.65,29.70,29.74,31.96,34.16,60.11,62.73,68.90,72.95,74.63,75.76, 77.27,79.18,79.72,81.36,94.04,127.44,127.59,127.81,127.95,128.13,128.51,128.57, 137.78,137.71,138.41,173.51.HR-ESI-MS(m/z):calcd for C90H134O13，[M+Na]+ 1445.9710 found,1445.9730.
8)化合物12的合成
二氯甲烷溶解化合物7(270.21mg,0.29mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.15mL)， 0℃下缓慢加入叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯(0.14mL)，室温下搅拌反应30min，加 水淬灭，二氯甲烷萃取，有机相减压浓缩，粗品过硅胶柱，得淡黄色油状化合物12 (171.14mg,56.5％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.56-7.09(m,26H),6.84-6.82(d,J ＝6.0Hz,4H),5.32-5.26(d,J＝3.6Hz,2H),5.10-5.01(dd,J1＝28.4Hz,J2＝11.6Hz,2H), 4.85(d,J＝11.2Hz,1H),4.76-4.75(m,2H),4.63(d,J＝12.0Hz,2H),4.55-4.52(d,J＝ 12.0Hz,1H),4.45-4.32(m,4H),3.92-3.81(m,2H),3.80(s,6H),3.67-3.58(m,4H), 3.51-3.43(m,4H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C62H76O13Si，[M+Na]+1079.4947 found, 1079.4951.
9)化合物13的合成
-N'-二甲基甲酰胺溶解化合物12(366.1mg,1eq)，在氮气的保护下，加入氢化钠(60％inoil；6eq)，0℃条件下依次加入溴丙炔(6eq)与四丁基溴化铵(6eq)；室 温反应4h，反应液降温至0℃，缓慢滴加少量甲醇淬灭反应，二氯甲烷稀释，依次用 饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水冲洗，收集有机相，减压浓缩，过硅胶柱分离纯化的 化合物13(380.01mg,97％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40-7.27(m,20H),7.21-7.18 (m,4H),6.84-6.81(m,4H),5.26(dd,J1＝22.4Hz,J2＝2.8Hz,2H),5.12(d,J＝11.6Hz, 1H),4.87-4.84(d,J＝11.6Hz,2H),4.64(s,4H),4.39-4.33(m,4H),4.16-4.11(m,2H), 3.79(m,6H),3.53-3.48(m,6H),3.40-3.37(m,4H),2.41(m,2H),2.43(s,1H),0.85(s,9H), 0.01(dd,J＝3.2Hz,6H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C65H78O13Si，[M+Na]+1117.5104 found,1117.5107.
10)化合物14的合成
二氯甲烷溶解化合物13(50.20mg,0.049mmol)，缓慢滴加5％TFA(0.15mL)， 反应2h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠溶液冲洗，收集有机相，减压浓缩，所得粗品 经柱层析分离纯化，得透明无色油状化合物14(33.10mg，87.5％)；1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.32-7.12(m,20H),5.13-5.08(dd,J1＝21.6Hz,J2＝2.8Hz,2H),5.01-4.98(d,J ＝11.6Hz,1H),5.01-4.98(d,J＝11.6Hz,1H),4.94-4.91(d,J＝11.6Hz,1H),4.82-4.80(d, J＝11.6Hz,1H),4.73-4.70(d,J＝11.6Hz,1H),4.66-4.59(m,2H),4.56-4.50(m,2H), 4.38-4.30(m,2H),4.03-4.01(t,J＝9.2Hz,2H),3.93-3.83(m,2H),3.76-3.70(m,2H), 3.62-3.52(m,4H),3.49-3.43(m,5H),2.47(s,1H),0.87(s,9H),0.01(d,J＝24.0Hz,6H)； 13C NMR(100MHz,CDCl3)δ139.09,138.53,137.97,137.86,128.52,128.48,128.46, 128.17,128.15,127.79,127.76,127.63,127.43,127.08,93.54,81.16,81.08,80.32,79.96, 79.85,77.43,77.32,76.80,75.52,74.91,74.54,73.13,72.93,72.85,71.13,70.38,61.38,59.97,26.08,18.17,-3.66,-4.88.HR-ESI-MS(m/z):calcd for C49H62O11Si,[M+COOH]-899.4043found,899.4034.
10)化合物15的合成
二氯甲烷溶解化合物14(140.01mg)，自制脂肪酸链(213.77mg)，EDC/HCl 和DMAP，加热至53℃，回流反应12h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠溶液冲洗，收 集有机相，减压浓缩得粗品，柱层析分离纯化得透明淡黄色油状化合物15(169.50mg, 70.3％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.18(m,20H),5.22-5.18(dd,J1＝16.8Hz,J2＝3.2Hz,2H),5.11-5.08(d,J＝11.6Hz,1H),5.00-4.97(d,J＝11.6Hz,1H),4.88-4.86(d,J ＝10.4Hz 1H),4.77-4.63(m,4H),4.57-4.54(d,J＝11.6Hz,1H),4.44-4.27(dq,J1＝15.2 Hz,J2＝2.0Hz,2H),4.18-4.04(m,6H),3.89(dd,J1＝12.0Hz,J2＝3.6Hz,1H),3.79(t,J ＝8.8Hz,1H),3.65-3.63(t,J＝9.6Hz,1H),3.57-3.53(td,J1＝9.2Hz,J2＝3.2Hz,2H), 3.46(t,J＝9.2Hz,1H),2.44(s,1H),2.18(m,4H),1.78(s,2H),1.26(m,64H),0.89-0.85 (m,21H),0.01-0.00(d,J＝2.4Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ14.15,22.71,26.56, 26.51,29.37,29.64,29.67,29.95,31.93,33.71,33.78,34.86,39.08,60.14,62.59,68.89, 72.95,74.62,75.75,77.25,79.26,79.70,81.33,94.02,127.44,127.58,127.77,127.92,128.11,128.48,128.55,137.78,137.71,138.45,173.24.HR-ESI-MS(m/z):calcd forC91H142O13Si[M+Na]+1494.0112found,1494.0111.
11)化合物16的合成
二氯甲烷溶解化合物14(250.00mg)，Behenic Acid(398.80mg)，EDC/HCl(223.47mg)和DMAP(35.75mg)，加热至53℃，回流反应12h，二氯甲烷稀释，饱和碳酸 氢钠溶液冲洗，收集有机相，减压浓缩得粗品，柱层析分离纯化得透明淡黄色油状化 合物16(334.51mg,76.2％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.21(m,20H),5.22-5.18 (dd,J1＝16.8Hz,J2＝3.2Hz,2H),5.11-5.08(d,J＝11.6Hz,1H),5.00-4.97(d,J＝11.6Hz, 1H),4.88-4.86(d,J＝10.4Hz 1H),4.75-4.56(m,5H),4.44-4.20(m,2H),4.09(m,6H), 3.93-3.76(m,2H),3.66-3.45(m,4H),2.43(d,J＝4Hz,1H),2.2(m,4H),1.62(s,2H), 1.25(m,76H),0.88-0.85(m,15H),0.01-0.00(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ-5.02, -3.62,1.03,14.14,18.13,22.71,24.79,24.87,26.01,29.18,29.29,29.38,29.50,29.65, 29.72,31.94,34.11,34.15,60.06,62.79,68.82,70.57,70.60,72.74,73.09,74.59,74.80, 75.58,79.73,79.89,80.89,81.10,93.38,127.03,127.32,127.58,127.81,127.82,127.87, 128.11,128.20,128.47,128.57,137.61,137.75,138.37,138.99,173.47.HR-ESI-MS(m/z) calcdfor C96H138O13Na,(M+Na)+1522.0036,found 1522.0020.
12)化合物17与18的合成
乙腈溶解化合物16(220.01mg)，0℃下缓慢滴加三氟化硼乙醚(40μL)，反应 液逐渐变黄色，反应2小时后，用饱和碳酸氢钠溶液终止中和反应，二氯甲烷溶液稀释 萃取，收集有机相，减压浓缩，所得粗品经柱层析分离纯化，得透明淡黄色油状液体 化合物18(140.00mg,68.9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36-7.21(m,20H), 5.17-5.13(d,J＝3.2Hz,2H),5.01-4.83(dq,J1＝10.8Hz,J2＝6.0Hz,4H),4.73-4.66(m, 4H),4.44-4.40(dd,J1＝15.2Hz,J2＝2.4Hz,1H),4.34-4.28(m,2H),4.23-4.11(m,4H), 4.04-4.00(t,J＝9.6Hz,2H),3.90-3.85(m,2H),3.56-3.40(m,4H),2.43(t,J＝2.4Hz,1H), 2.29-2.24(m,4H),1.56(m,4H),1.25(m,76H),0.88-0.85(t,J＝2.4Hz,6H).HR-ESI-MS (m/z)calcd forC87H132O13,(M+Na)+1407.9578,found 1407.9567.
同方法制得白色固体化合物17(41.76mg，60.4％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ7.36-7.30(m,20H),5.18(d,J＝3.2Hz,2H),5.01-4.83(dq,J1＝10.8Hz,J2＝6.0Hz,4H), 4.75-4.56(m,4H),4.45-4.41(dd,J1＝15.2Hz,J2＝2.4Hz,1H),4.32-4.28(m,2H), 4.23-4.11(m,4H),4.04-3.99(t,J＝9.6Hz,2H),3.89-3.85(m,2H),3.54-3.40(m,4H),2.45 (s,1H),2.21-2.18(m,4H),1.80(m,2H),1.25(s,64H),0.88-0.85(t,J＝6.4Hz,12H),13C NMR(100MHz,CDCl3)δ14.15,22.71,26.52,26.57,29.38,29.65,29.67,29.94,31.93, 33.71,33.75,33.77,33.79,34.88,34.94,39.04,39.10,60.14,62.55,68.93,69.92,70.16,72.87,73.05,74.66,75.53,75.76,78.91,79.40,79.68,80.61,81.40,94.04,94.37,127.45, 127.80,127.83,127.93,128.05,128.10,128.50,128.55,137.73,137.75,138.39,138.66, 173.27,174.23.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C85H128O13Na,(M+Na)+1379.9247,found 1379.9206.
13)化合物19的合成
四氢呋喃与甲醇(1：1)溶解化合物10(40.00mg,0.028mmol)、Tn(20.00mg,0.068mmol)、碘化亚铜(106.41mg，0.56mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(90μL)，室 温下搅拌反应24小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶柱 分离纯化得到化合物19(24.35mg,43％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.83(s, 2H),7.21-7.16(m,20H),5.11(s,2H),4.86(m,4H),4.62(m,20H),4.03(m,14H),3.70(s, 4H),3.49(m,13H),2.1(s,4H),1.83(s,6H),1.68(s,64H),0.78(m,12H)；HR-ESI-MS (m/z):calcd for C108H166N8O25,[M+H]+1976.2037 found,1976.2007
14)化合物20的合成
四氢呋喃与甲醇(1：1)溶解化合物10(40.01mg，0.028mmol)、STn(20mg，0.068mmol)、碘化亚铜(106.41mg，0.56mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(90μL)， 室温下搅拌反应24小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶 柱分离纯化得到化合物20(38mg,51.9％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.63(s, 1H),7.38-7.24(m,20H),5.19(s,2H),5.00-4.96(d,J＝12.8Hz,4H),4.86-4.82(d,J＝8.0 Hz,2H),4.76-4.69(m,8H),3.56(m,5H),4.51(s,4H),4.13(m,4H),3.97-3.89(m,5H), 3.90-3.63(m,24H),3.58-3.47(m,10H),2.75-2.69(dd,J1＝13.2Hz,J2＝3.6Hz,4H), 2.24-2.21(d,J＝6.8Hz,5H),2.03-20.1(d,J＝9.2Hz,12H),1.84(m,4H),1.26(s,64H), 0.88(t,J＝6.4Hz,12H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C130H200N10O41,[M+2H]+2 1279.7009 found,1279.7037.
15)化合物21的合成
四氢呋喃与甲醇(1：1)溶解化合物11(30.01mg,0.021mmol)、STn(29.01mg，0.050mmol)、碘化亚铜(79.80mg,0.42mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(90μL)， 室温下搅拌反应24小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶 柱分离纯化得到化合物21(22.31mg,43％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3) δ7.74-7.67(d,J＝26.4Hz,1H),7.36-7.07(m,20H),5.19(d,J＝5.2Hz,2H),5.07-4.93(d, 1H),4.90-4.82(d,J＝5.2Hz,1H),4.76-4.63(m,4H),4.60-4.54(m,2H),4.41-4.09(m, 20H),3.92-3.65(m,14H),3.58-3.48(m,8H),3.26-3.25(d,J＝4.8Hz,2H),2.56-2.52(m, 2H),2.34-2.27(m,4H),2.08-1.98(m,12H),1.80-1.62(m,2H),1.60-1.50(m,4H),1.26(s, 76H),0.88(m,6H).HR-ESI-MS(m/z):calcd for C132H204N10O41,[M+2H]+2 1293.7165 found,1293.7167
16)化合物22的合成
四氢呋喃与甲醇(1：1)溶解化合物17(35.01mg，0.026mmol)、STn(20mg，0.068mmol)、碘化亚铜(106.41mg，0.56mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(90μL)， 室温下搅拌反应24小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶 柱分离纯化得到化合物22(14.5mg，31.1％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3) δ7.77-7.71(s,1H),7.40-7.24(m,20H),5.21-5.20(dd,J1＝6.8Hz,J2＝3.2Hz,2H), 5.01-4.87(m,5H),4.78-4.75(d,J＝11.6Hz,2H),4.71-4.47(m,8H),4.23-4.16(m,5H), 4.16-4.01(m,7H),4.13(m,4H),3.97-3.44(m,21H),2.75-2.71(m,1H),2.24-2.20(m,4H), 2.05(s,6H),1.84-1.77(m,4H),1.62(m,1H),1.46(m,4H),1.26(s,64H),0.88(t,J＝5.6 Hz,12H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd forC106H163N5O27,[M+H]+1939.1608 found, 1939.1629
17)化合物23的合成
四氢呋喃与甲醇(1：1)溶解化合物18(36.01mg,0.026mmol)、STn(20mg，0.068mmol)、碘化亚铜(106.41mg，0.56mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(90μL)， 室温下搅拌反应24小时；硅藻土过滤掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品；硅胶 柱分离纯化得到化合物23(22.80mg,44.5％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.65 (s,1H),7.38-7.28(m,20H),5.22-5.20(d,J＝7.6Hz,2H),5.01-4.90(m,5H),4.78-4.71(m, 6H),4.51-4.48(m,3H),4.27-3.99(m,11H),3.60-3.43(m,7H),2.74-2.70(m,1H),2.27(s, 4H),2.04-2.00(d,J＝12.0Hz,6H),1.80-1.75(m,1H),1.57s,5H),1.26(s,64H),0.88(t,J ＝5.6Hz,12H)；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C108H167N5O27,[M+H]+1967.1921 found, 1967.1908
18)化合物L2-3的合成
二氯甲烷/甲醇/水(3：3：1，10.0mL)溶解化合物19(10.05mg)，加入钯碳(15.64mg)，通入氢气，密封搅拌40个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶 剂，得到白色固体化合物L2-3(4.81mg，56.7％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3) δ8.01(s,2H),4.92-4.90(m,2H),4.88(s,2H),4.78-4.50(m,14H),4.21(m,2H),4.23-4.17 (m,4H),4.01-3.92(m,4H),3.86-3.82(t,J＝9.2Hz,2H),3.72-3.68(m,4H),3.64-3.48(m, 7H),3.41-3.38(dd,J1＝9.2Hz,J2＝2.8Hz,2H),3.39-3.23(t,J＝9.6Hz,4H),2.97-2.92(q, J＝7.6Hz,1H),2.61(s,1H),2.20-2.18(d,J＝6.8Hz,3H),1.88(s,6H),1.75(s,2H), 1.19(s,64H),0.88(t,J＝5.6Hz,12H).HR-ESI-MS(m/z):calcd for C80H142N8O25[M+H]+ 1616.0159found,1616.0162.
19)化合物1的合成
二氯甲烷/甲醇/水(3：3：1，10.0mL)溶解化合物20(10.05mg)，加入钯碳(15.64mg)，通入氢气，密封搅拌40个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶 剂，得到白色固体化合物1(4.72mg，53.8％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ 8.0(s,2H),4.96(s,2H),4.90-4.87(m,3H),4.6-4.53(m,5H),4.22-4.11(m,7H),3.98-3.86 (m,6H),3.80-3.69(m,10H),3.65-3.47(m,10H),3.43-3.31(m,8H),2.94-2.91(dd,J1＝ 11.2Hz,J2＝4.8Hz,2H),2.60(m,2H),2.21-2.19(d,J＝6.4Hz,4H),1.93-1.75(m,12H), 1.69-1.62(m,2H),1.55-1.48(m,2H),1.21(s,64H),0.88(t,J＝6.0Hz,12H).HR-ESI-MS (m/z):calcd forC102H176N10O41[M+Na]+2220.1887 found,2220.1807.
20)化合物2的合成
二氯甲烷/甲醇/水(3：3：1，10.0mL)溶解化合物21(10.05mg)，加入钯碳(15.64mg)，通入氢气，密封搅拌40个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶 剂，得到白色固体化合物2(6.10mg,54％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ8.09 (s,2H),5.1(s,2H),4.97-4.96(d,J＝1.2Hz,2H),4.85-4.74(m,5H),4.43-4.13(m,10H), 4.10-3.96(m,9H),3.91-3.68(m,25H),3.62-3.41(m,11H),3.05-3.00(dd,J1＝14.4Hz,J2＝7.2Hz,2H),2.75-2.70(m,2H),2.41-2.37(t,J＝7.2Hz,4H),2.05(s,12H),1.81(m,2H), 1.66-1.62(m,4H),1.27(s,76H),0.88(t,J＝6.0Hz,6H).HR-ESI-MS(m/z):calcd for C104H180N10O41,[M+2H]+21113.6226found,1113.6251.
21)化合物3的合成
二氯甲烷/甲醇/水(3：3：1，10.0mL)溶解化合物22(10.05mg)，加入钯碳(15.64mg)，通入氢气，密封搅拌40个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶 剂，得到白色固体化合物3(6.01mg,74.1％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ8.12 (s,1H),5.1(s,2H),5.00-4.96(m,2H),4.66-4.61(m,4H),4.36-4.30(m,2H),4.29-4.16(m, 4H),4.09-3.97(m,5H),3.9-3.42(m,22H),3.23-3.1(m,2H),3.05-3.00(dd,J1＝14.8Hz,J2＝7.2Hz,2H),2.78-2.67(m,4H),2.32-2.28(m,4H),2.3(m,4H),2.05(s,6H),1.85(s,2H), 1.66-1.62(m,1H),1.28(s,64H),0.88(t,J＝5.6Hz,6H).HR-ESI-MS(m/z):calcd for C78H139N5O27,[M+H]+1578.9730found,1578.9726
22)化合物4的合成
二氯甲烷/甲醇/水(3：3：1，10.0mL)溶解化合物23(10.05mg)，加入钯碳(15.64mg)，通入氢气，密封搅拌40个小时，硅藻土滤过掉不溶物，滤液减压蒸馏除去溶 剂，得到白色固体化合物4(5.9mg，66.5％)。1H NMR(400MHz,CD3OD/CDCl3)δ8.12 (s,1H),5.11-5.10(d,J＝5.4Hz,2H),5.00-4.95(m,2H),4.38-4.21(m,5H),4.01-4.67(m, 16H),3.63-3.45(m,6H),3.1-3.0(m,2H),2.72-2.70(d,J＝21.6Hz,1H),2.41-2.38(td,J1＝ 17.2Hz,J2＝7.6Hz,4H),2.07(s,6H),1.81-1.78(m,1H),1.66-1.62(m,4H),1.26(s,76H), 0.89(t,J＝5.6Hz,6H).HR-ESI-MS(m/z):calcd for C80H143N5O27,[M+H]+1607.0043 found,1607.0044.
实施例2：ELISA免疫分析
(1)将制备好的化合物1至4分别作为疫苗分子1，2，3与4，按照疫苗分子： 二硬脂酰基磷脂酰胆碱把(DSPC)：胆固醇＝1:6.5:5溶解于DCM-MeOH(1:1，v/v，2 mL)混合液中，旋干溶剂，使瓶壁上形成一层薄的脂质膜。加入2.0mL羟乙基哌嗪乙 硫磺酸(HEPES)缓冲液(20Mm,pH＝7.5)，超声10～20min得脂质体1，2，3与 4。
(2)小鼠的免疫：取6-8周龄的C57BL/6小鼠，分成四组，每组6只。通过小鼠 皮下注射的方式进行免疫试验，采用一次初始免疫和三次增强免疫的方案，分别在第 1,14,21,28天注射步骤(1)中制备的脂质体1，2，3与4，每只每次注射量0.1mL， 在第0,27,35,49天采血，每只小鼠取血0.1mL～0.2mL，4℃放置半个小时，离心， 5000转/分钟，分离上层清亮血清。在本实验中，空白对照组(为免疫前血清)用到 的是第一次取血分离出的血清，测定疫苗滴度用到的是第35天采血分离出的血清。
(3)ELISA免疫分析：用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，将Tn-HSA或STn-HSA 配置成2.0μg/mL溶液，以每孔100μL的量加入96孔板，放入4℃孵育过夜；第二 天放入37℃培养箱孵育一小时；用PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗板3次，每孔加入 300μL洗液。洗板后，加入blocking buffer(PBST/1％BSA)；每孔加入250μL；常温 孵育一小时，用PBST洗板3次。样品血清稀释，用PBS按照对半数稀释法从1：300 倍稀释至1：656100倍；将稀释好的血清以每孔100μL加入96孔板中，放置在37℃ 培养箱孵育两个小时，洗板三次。分别在每孔加入100μL的HRP(辣根过氧化物酶) 标记的Kappa,IgG,IgM，室温孵育一个小时；洗板3次。加入TMB(3,3',5,5'-四甲 基联苯胺)溶液，每孔加入100μL，室温避光显色20min。加入0.5M H2SO4溶液，每孔加100μL。在450-570nm双波长处，用酶标仪检测吸光度。
4)将吸光度(OD)值相对于抗血清稀释值作图，并获得最佳拟合线。使用该线 的方程式来计算OD值达到0.2时的稀释度值，并且根据稀释值的倒数计算抗体滴度 如图1所示。
从图1可看出，本发明实施例1合成的海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物1，2，3 与4，在无外加佐剂的情况下，均能诱导产生高滴度的抗体，产生的特异性IgG抗体 滴度是IgM的2～3倍多，表明共价偶联的糖抗原疫苗能诱导T细胞介导的体液免疫； 其中双接STn抗原的缀合物疫苗1与2引发的IgG抗体滴度均略高于单接抗原的缀合 物3与4，说明抗原的空间越复杂，表位数多，对免疫反应具有一定的促进作用；海 藻糖衍生物脂肪酸链为具有支链的CH(C9H19)2的缀合物疫苗1与3诱导产生的抗体分 别略高于脂肪酸链为酯链(CH2)20CH2的缀合物疫苗2与4，说明海藻糖衍生物脂肪酸 链的个数与长短对活性有一定影响。
实施例3：抗体介导的互补依赖细胞毒性(CDC)
用胰酶消化处于对数生长期的CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞)，以每孔1×104个 细胞种于96孔板，在37℃培养过夜，用不含血清的1640培养基洗板两次。取化合物 1组在38天取血的6只小鼠血清样品，每个样品取7μl，然后将6只小鼠的血清样品 混合，用不含血清的1640培养基稀释50倍，得小鼠血清稀释液。化合物2组、3组、 4组以及空白对照组的小鼠血清稀释液按上述方法制备。1组、2组、3组、4组以及 空白对照组(为免疫前血清)均设置样品最大酶活性对照组，样品对照组以及样品处 理组，每个组平行做6个复孔，每孔加入100μl稀释后的小鼠血清溶液，将96孔板置 于37℃培养2h。用不含血清的1640培养基洗板两次后，在样品处理组每孔加入100μl 兔补体血清溶液，最大酶活性对照组每孔加入100μl的LDH释放液，样品对照组每孔 加入100μl不含血清的MEM培养基，置于37℃培养1h。
在新的96孔板每孔加入100μl的PBS溶液，小心吸取40μl上述96孔板的细胞 上清液加至此新的96孔板中，每孔加入60μl的LDH检测液，避光孵育30min。用酶 标仪在490nm处检测。
细胞裂解率(％)＝(样品处理组吸光度-样品对照组吸光度)/(最大酶活性对照组吸光度-样品对照组吸光度)×100％。
结果如图2所示，本发明实施例1合成的1，2，3与4糖疫苗诱导产生的抗血清 均能介导CT-26细胞裂解，细胞裂解率均显著高于空白对照组(P<0.001)，说明糖疫 苗1、2、3与4所诱导产生的抗体都有杀死肿瘤细胞能力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以 做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权 利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述缀合物结构通式如下式I所示：
[X—L—Y]
式(I)
其中，X表示糖抗原，选自下式中的任意一种糖抗原，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
L表示连接体，选自以下
(CH2CH2O)a-CH2CH2-C(O)NH-、
(CH2CH2O)a-、-(OCH2CH2)a 
-NHC(O)-(CH2CH2O)a-CH2CH2-C(O)NH-、-NHC(O)-(CH2CH2O)a-CH2CH2 
-(OCH2CH2)a-CH2CH2-C(O)NH-、
(CH2)a-C(O)NH-、-NHC(O)-(CH2)a-C(O)NH-、-NHC(O)-(CH2)a 
中的任意一种，a是0到20中的任意一个整数；
Y表示海藻糖衍生物，选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、-CH2-CH(OR3)-(CH2)m-CH3，-(CH2)mCH3或-(CH2)mCHR3 2，R3为-(CH2)m-CH3或-C(O)-(CH2)m-CH3，m是选自8-26的整数。
2.根据权利要求1所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述L选自
(CH2CH2O)a-、-(OCH2CH2)a 
-NHC(O)-(CH2CH2O)a-CH2CH2 
(CH2)a-C(O)NH-、-NHC(O)-(CH2)a 
中的任意一种，a是0到20中的任意一个整数。
3.根据权利要求2所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述L选自
(CH2CH2O)a-、-(OCH2CH2)a 
-NHC(O)-(CH2)a 
中的任意一种，a是0到20中的任意一个整数。
4.根据权利要求1所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述Y选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、-(CH2)mCH3或-(CH2)mCHR3 2，R3为-(CH2)m-CH3或-C(O)-(CH2)m-CH3，m是选自8-26的整数。
5.根据权利要求4所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述Y选自下式中的任意一种，或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢或-(CH2)mCH3，m是选自8-26的整数。
6.根据权利要求1所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物，其特征在于，所述缀合物选自如下任一结构或其可要药用盐、水合物或溶剂化物：
7.权利要求1至6任一所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物的制备方法，其特征在于，当Y为
时，制备过程包括：
S1.化合物7在氢化钠、四丁基溴化铵催化作用下与溴丙炔反应得到化合物8；
S2.化合物8在三氟乙酸的条件下，脱去PMB基团得到化合物9；
S3.化合物9与相应的脂肪酸链进行酯化缩合得到对应的化合物10或11；
S4.化合物10与化合物Tn或STn、化合物11与化合物STn分别在催化剂的作用下反应得到化合物19或20、化合物21；
S5.化合物19、20和21分别经脱苄基保护反应，即可得到目标产物；
当Y为
制备过程包括；
S11.化合物7在2,6-二甲基吡啶的催化下与叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯反应得到化合物12；
S21.化合物12在氢化钠、四丁基溴化铵催化作用下与溴丙炔反应得到化合物化合物13；
S31.化合物13在三氟乙酸的条件下，脱去PMB基团得到化合物14；
S41.化合物14分别与相应的脂肪酸链进行酯化缩合得到对应的化合物15或16；
S51.化合物15或16分别脱去保护基团三甲基硅烷得到相应的化合物17或18；
S61.化合物17或18与三氟化硼乙醚反应得到相应的化合物22或23；
S71.化合物22或23分别经脱苄基保护反应，即可得到目标产物；
其中，化合物7至23的结构如下所示：
8.根据权利要求7所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物的制备方法，其特征在于，化合物7的制备过程如下：
S31.以海藻糖为起始原料，在对甲苯磺酸的作用下，4-甲氧基苯甲醛二甲缩醛对原料进行4,6位羟基选择性保护，得到化合物5，用溴化卞对裸露的羟基进行全苄基化得化合物6；
S32.化合物6选择性还原4,4’位糖羟基得到化合物7；
其中化合物5和6的结构如下：
9.权利要求1至6任一所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备肿瘤疫苗中的应用。
10.权利要求1至6任一所述海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010698972.8A CN111875649B (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
| PCT/CN2020/130230 WO2022016755A1 (zh) | 2020-07-20 | 2020-11-19 | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010698972.8A CN111875649B (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111875649A true CN111875649A (zh) | 2020-11-03 |
| CN111875649B CN111875649B (zh) | 2021-12-17 |
Family
ID=73155142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010698972.8A Active CN111875649B (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111875649B (zh) |
| WO (1) | WO2022016755A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022016755A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102276662A (zh) * | 2010-06-09 | 2011-12-14 | 北京大学 | 唾液酸(α-(2→6))-D-吡喃糖衍生物及其合成方法和应用 |
| CN106620682A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-10 | 华中师范大学 | 一种脂质体疫苗制剂及其用途和生产IgG抗体的方法 |
| CN109432415A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-03-08 | 广州粤美医药科技有限公司 | 单磷酸类酯A(MPLA)与糖抗原Globo H的缀合物及其制备方法和应用 |
| CN110064050A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-30 | 北京大学 | 含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用 |
| CN110075291A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-08-02 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011014771A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Wayne State University | Monophosphorylated lipid a derivatives |
| CN111875649B (zh) * | 2020-07-20 | 2021-12-17 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
-
2020
- 2020-07-20 CN CN202010698972.8A patent/CN111875649B/zh active Active
- 2020-11-19 WO PCT/CN2020/130230 patent/WO2022016755A1/zh active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102276662A (zh) * | 2010-06-09 | 2011-12-14 | 北京大学 | 唾液酸(α-(2→6))-D-吡喃糖衍生物及其合成方法和应用 |
| CN106620682A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-10 | 华中师范大学 | 一种脂质体疫苗制剂及其用途和生产IgG抗体的方法 |
| CN109432415A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-03-08 | 广州粤美医药科技有限公司 | 单磷酸类酯A(MPLA)与糖抗原Globo H的缀合物及其制备方法和应用 |
| CN110075291A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-08-02 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗及其应用 |
| CN110064050A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-30 | 北京大学 | 含STn或F-STn的糖缀合物及其制备方法和在抗肿瘤疫苗中的应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022016755A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022016755A1 (zh) | 2022-01-27 |
| CN111875649B (zh) | 2021-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11634449B2 (en) | Macrolides and methods of their preparation and use | |
| AU683026B2 (en) | Novel shingoglycolipid and use thereof | |
| AU2012204336C1 (en) | Methods for preparation of glycosphingolipids and uses thereof | |
| US5936076A (en) | αgalactosylceramide derivatives | |
| AU665536B2 (en) | Novel sphingoglycolipid and use thereof | |
| BG63546B1 (bg) | Пропиофенонови производни и метод за тяхното получаване | |
| US9045512B2 (en) | 6″-amino-6″-deoxygalactosylceramides | |
| CN111760021B (zh) | 一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用 | |
| AU6513094A (en) | Novel sphingoglycolipid and use thereof | |
| WO2007050668A1 (en) | Analogs of alpha galactosylceramide and uses thereof | |
| CZ293076B6 (cs) | Polosyntetické taxany, způsob jejich výroby, farmaceutické prostředky s jejich obsahem a meziprodukty pro jejich výrobu | |
| CZ202796A3 (en) | Cyclic derivatives, process of their preparation and pharmaceutical compositions containing thereof | |
| CN111760020B (zh) | 一种缀合物及其制备方法和应用 | |
| CN111875649B (zh) | 一种海藻糖衍生物与糖抗原的缀合物及其制备方法与应用 | |
| CA2519568C (en) | 6"-amino-6"-deoxygalactosylceramides | |
| RU2320653C2 (ru) | 6r-(3,6-дидезокси-l-арабиногексопиранозилокси)гептановая кислота для лечения заболеваний, связанных со старением и стрессом, и способ ее получения | |
| NO162618B (no) | Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive 6-substituerte mitomycinanaloger. | |
| WO2021193951A1 (ja) | ポリエチレングリコール鎖を有する糖化合物、及び抗体薬物複合体の前駆体 | |
| US4849512A (en) | 3-acylamino-3-deoxyallose derivatives | |
| Caldwell | Synthesis of Alpha-GalCer Analogues as iNKT-Cell Agonists and Reactions of 2-Methyleneoxetanes | |
| JP2625620B2 (ja) | フコシル‐グルコサミン誘導体 | |
| CN117903223A (zh) | 一种二糖结构化合物及其制备方法与应用 | |
| CN117024494A (zh) | 一种缀合物及其制备方法和应用 | |
| JP2633467B2 (ja) | シアリルルイスｘ誘導体 | |
| CN113943330A (zh) | 一类含糖结构化合物、其制备方法、药物组合物和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |