CN111760021B - 一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有α‑半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用,属于抗肿瘤糖疫苗研制技术领域。本发明提供的一种含有α‑半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物,其为通式(Ⅰ)的化合物或通式(Ⅰ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物;该缀合物能产生具有更高滴度的针对肿瘤糖抗原Tn特异性的免疫反应,达到杀死肿瘤细胞的目的,产生抗肿瘤作用,有望成为新一代的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用,属于抗肿瘤糖疫苗研制技术领域。
背景技术
癌症防治已成为我国的重要公共卫生问题,严重地威胁人们的生命安全。迫切需要的有效的癌症防治方法,肿瘤疫苗被认为是继手术、化疗和放射之外的第四种治疗方式,而且显示出较好的临床应用前景。以肿瘤细胞表面异常表达的肿瘤相关糖抗原(TACAs)为靶点的肿瘤糖疫苗具有特异性高、副作用小、疗效较好等优点。其中Thomsennouveau(Tn)抗原在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤细胞表面均异常过量表达,是糖抗原肿瘤疫苗设计的优秀靶点。
由于Tn糖抗原是T细胞非依赖性抗原,需要在免疫原性载体分子的协助下才能刺激T细胞并诱导持久的抗体反应。传统的策略是将糖抗原与含有B细胞表位的载体蛋白(KLH,BSA或者CRM197)偶联,获得的糖蛋白疫苗可产生高滴度高亲和力的抗体,目前Tn的KLH缀合蛋白疫苗已进入临床研究阶段。但糖蛋白疫苗依然存在着偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点。为了避免这些缺点,引入内嵌佐剂的全合成糖抗原疫苗成为新的研究策略。
α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000),是从一种海绵中分离出的天然α-GalGSL类似物,是第一种有效激活iNKT细胞的脂质。在KRN7000的激活作用下,iNKT细胞可通过穿孔蛋白依赖机制直接裂解肿瘤细胞,还可通过分泌多种细胞因子作用于T细胞和NK细胞间接杀死肿瘤细胞。这种独特的性质已用于临床研究,可利用NKT细胞的佐剂效应来开发更有效的疫苗。
为了解决糖蛋白疫苗存在的缺陷,本发明提供一种全合成糖抗原疫苗及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物,所述的缀合物为通式(Ⅰ)的化合物或通式(Ⅰ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物;
其中:
n为2-6的整数;
m为9-25的整数;
本发明以强效免疫刺激剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)作为内嵌佐剂缀合糖抗原Tn得到本发明所述的缀合物(KRN7000-Tn。),即全合成糖抗原疫苗。在本发明所述的缀合物中,KRN7000能提高Tn糖抗原的免疫原性,将Tn糖抗原提呈到相应的免疫细胞,引起更强的针对糖抗原Tn的免疫反应,产生具有更高滴度、高亲和力和具有记忆力的T细胞调节免疫反应,达到杀死肿瘤细胞的目的。
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式,所述的缀合物为结构式(Ⅱ)的化合物或结构式(Ⅱ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物;
其中:
n为2-6的整数。
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式,所述的缀合物为结构式(Ⅲ)的化合物或结构式(Ⅲ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物;
作为本发明所述的缀合物的优选实施方式,所述的α-半乳糖神经酰胺类似物为通式(Ⅳ)或通式(Ⅳ)的化合物的异构体、可药用盐、水合物或溶剂化合物;
其中:
X为O或N任意一种取代基;
m为9-25的整数;
本发明的另一目的是提供所述的缀合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)将化合物1和化合物2溶解于有机溶剂中,加入缩合剂反应,得到化合物3;
(2)将化合物4和步骤(1)所述的化合物3溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物5;
(3)将步骤(2)所述的化合物5在催化剂的作用下与巯基乙酸反应,得到化合物6;
(4)步骤(3)所述的化合物6溶解于有机溶剂中,加入催化剂,与乙酸酐反应,得到化合物7;
(5)步骤(4)所述的化合物7溶解于有机溶剂中,加入甲醇钠反应,得到化合物8;
(6)取化合物9和化合物10溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物11;
(7)取步骤(6)所述的化合物11溶解于有机溶剂中,加入三氟化硼乙醚反应,得到化合物12;
(8)取步骤(5)所述的化合物8与步骤(7)所述的化合物12溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物13。
(9)取步骤(8)所述的化合物13溶解于有机溶剂中,加入催化剂,经脱苄基反应,即可获得所述的缀合物。
所述化合物1至所述化合物13的结构式如下所示:
其中:
n为2-6的整数;
m为9-25的整数;
R1选自-OC(NH)CCl3、STol、SPh、Set、Cl、Br中的任意一种取代基。
本发明所述制备方法的反应式如下所示:
其中:
n为2-6的整数;
m为9-25的整数;
R1选自-OC(NH)CCl3、STol、SPh、Set、Cl、Br中的任意一种取代基。
本发明所述的制备方法,其合成路线简短、反应条件温和、产率高、操作方便,能够用于工业化制备。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(1)中,所述有机溶剂为二氯甲烷溶液,所述缩合剂为N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)的混合物。
本发明所述的制备方法,步骤(2)中,化合物3与化合物4在催化剂的作用下反应得到偶联产物5。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(2)中,所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醚或四氢呋喃;当化合物4的取代基R1为-OC(NH)CCl3时,所述催化剂选自氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟甲磺酸中的任意一种;或者当化合物4的取代基R1为STol、SPh或Set时,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺和选自三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯中的任意一种;或者当化合物4的取代基R1为Cl或Br时,所述催化剂选自碳酸钾、碳酸银、碳酸铯、碳酸汞、高氯酸银、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸中的任意一种;所述反应的温度为-40~-20℃。
更优选地,步骤(2)中,所述有机溶剂为二氯甲烷;当化合物4的取代基R1为-OC(NH)CCl3时,所述催化剂为三氟甲磺酸三甲基硅酯。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(3)中,化合物5在催化剂的作用下反应得到化合物6;所述催化剂为吡啶,所述催化剂与所述巯基乙酸的体积比为1:1。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(4)中,化合物6溶解于N,N-二甲基甲酰胺,在哌啶的催化下脱去保护集团得到氨基,在吡啶与乙酸酐的作用下得到化合物7;所述吡啶与所述乙酸酐的体积比为2:1。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(5)中,化合物7溶于有机溶剂中,在催化剂的作用下反应得到化合物8;所述有机溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶液,所述甲醇与所述二氯甲烷的体积比为1:1;所述的催化剂为甲醇钠。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(6)中,化合物9与化合物10溶于有机溶剂中,在催化剂的作用下反应得到化合物11;所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醚或四氢呋喃中任意一种,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和选自三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸中的任意一种。
更优选地,步骤(6)中,所述有机溶剂为二氯甲烷与乙醚的混合溶液,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)的混合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(7)中,化合物11溶于有机溶剂中,加入三氟化硼乙醚反应,得到化合物12;所述有机溶剂为乙腈与二氯甲烷的混合溶液,所述乙腈与所述二氯甲烷的体积比为1.5:1。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(8)中,化合物12与化合物8溶于有机溶剂中,在催化剂的作用下反应得到化合物13;所述溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合溶液,所述催化剂为碘化亚铜、N,N-二异丙基乙胺与冰乙酸的混合物。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式,步骤(9)中,化合物13溶于有机溶剂中,在催化剂的作用下反应得到化合物14;所述溶剂二氯甲烷与甲醇的混合溶液,所述催化剂为氢气、钯碳与氢氧化钯的混合物。
本发明的再一目的是提供所述的缀合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
作为本发明所述的应用的优选实施方式,所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、胰腺癌、甲腺癌、脑癌、胃癌和白血病。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明提供的一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物,以强效免疫刺激剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)作为内嵌佐剂缀合糖抗原Tn获得,其中,KRN7000能提高Tn糖抗原的免疫原性,将Tn糖抗原提呈到相应的免疫细胞,产生具有更高滴度的针对肿瘤糖抗原Tn特异性的免疫反应,达到杀死肿瘤细胞的目的,产生抗肿瘤作用,有望成为新一代的抗肿瘤药物。
(2)本发明提供的含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物的制备方法,其合成路线简短、反应条件温和、产率高、操作方便,能够用于工业化制备。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的缀合物(Ⅲ)的抗体免疫活性评价图;
图2为本发明实施例1制备的缀合物(Ⅲ)诱导小鼠产生的抗体血清特异性识别肿瘤细胞MCF-7的流式细胞实验评价图;
图3为本发明实施例1制备的缀合物(Ⅲ)诱导小鼠产生的抗体血清特异性杀死肿瘤细胞MCF-7的补体依赖性细胞毒性评价图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例为本发明提供的一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物,其结构式如下式(Ⅲ)所示:
上述含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)将化合物1和化合物2溶解于有机溶剂中,加入缩合剂反应,得到化合物3;得到化合物3的反应式如下式所示:
步骤(1)的具体操作为:二氯甲烷溶液(80.0mL)溶解(化合物1)Fmoc-L-苏氨酸(4.5g,13.1mmol)与(化合物2)2-[2-(2-丙炔基氧)乙氧基]乙胺(2.2g,15.7mmol),冰浴下加入N,N’-二环己基碳二亚胺(3.0g,14.4mmol)与1-羟基苯并三唑(0.7g,1.3mol),除去冰浴,恢复至室温,室温下搅拌反应4小时;硅藻土过滤,收集滤液,滤液减压蒸馏除去有机溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚3:1)得到白色固体化合物3(4.9g,产率为65.4%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.60(d,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.40(t,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.31(t,J=7.4Hz,2H,Ar-H),6.91(d,J=5.7Hz,1H,-NHCO-),5.89(d,J=8.0Hz,1H,-NHCO-),4.47(dd,J=10.5,7.0Hz,1H),4.36(dt,J=16.5,4.3Hz,2H),4.22(t,J=7.0Hz,1H),4.18–4.11(m,3H),3.68–3.41(m,8H,-O-CH2-),2.87(s,1H),2.43(d,J=2.6Hz,1H,-C≡CH),1.16(d,J=6.3Hz,3H,-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.98,156.80,143.72,143.69,141.32,127.79,127.11,125.09,125.03,120.04,79.45,76.75,74.90,70.00,69.39,69.01,67.18,66.97,58.64,58.38,47.16,39.22,18.31.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C26H30N2O6,[M+Na]+:489.1996,found:489.1980.
(2)将化合物4和步骤(1)所述的化合物3溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物5;得到化合物5的反应式如下式所示:
步骤(2)的具体操作为:称取化合物4(3.1g,6.4mmol)、化合物3(2.5g,5.4mmol)和分子筛(7.0g)置于原底烧瓶中,加入无水级别的二氯甲烷和重蒸乙醚(1:3)混合液(40.0mL)溶解,氮气保护下,室温搅拌3小时;反应液冷却至-30℃,加入三氟甲磺酸三甲基硅脂(97.0μL,0.5mmol),逐渐升温至-27℃,-27℃的温度下搅拌反应12小时;二氯甲烷稀释反应液,依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗1次,盐水洗1次,收集有机层,无水硫酸钠干燥后,过滤,滤液减压蒸馏除去有机溶剂得到粗品;硅胶柱分离纯化(洗脱剂为甲醇/二氯甲烷1:100)得到无色油状液体化合物5(1.5g,产率为36.0%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.60(dd,J=7.5,2.6Hz,2H,Ar-H),7.41(t,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.33(t,J=7.4Hz,2H,Ar-H),7.08(d,J=5.7Hz,1H,-NHCO-),5.92(d,J=6.8Hz,1H,-NHCO-),5.43(d,J=3.2Hz,1H),5.28(d,J=3.6Hz,1H,H-1),4.41(m,J=7.0,3.4Hz,2H),4.26(m,J=14.5,7.0Hz,4H),4.16(d,J=2.4Hz,2H,-O-CH2-C≡C),4.13–4.05(m,2H),3.90(m,J=10.9,3.8Hz,1H),3.65(m,J=5.0,4.1Hz,4H,-O-CH2-),3.56(m,J=16.9,11.8,5.7Hz,4H,-O-CH2-,-N-CH2-),2.42(t,J=2.4Hz,1H,-C≡CH),2.17(s,3H,-CO-CH3),2.08(s,3H,-CO-CH3),2.04(s,3H,-CO-CH3),1.18(d,J=6.4Hz,3H,-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.39,170.09,169.84,168.22,156.04,143.73,141.32,127.78,127.12,125.13,125.06,120.06,120.03,97.24,79.58,76.74,74.65,74.44,70.06,69.63,69.49,69.00,67.35,67.26,66.97,61.69,58.47,58.33,57.20,47.14,39.51,29.71,20.73,20.67,16.34.ESI-TOFHRMS m/z:calcdfor C38H45N5O13,[M+Na]+:802.2906,found:802.2880.
(3)将步骤(2)所述的化合物5在催化剂的作用下与巯基乙酸反应,得到化合物6;得到化合物6的反应式如下式所示:
步骤(3)的具体操作为:称取化合物5(1.5g,1.9mmol)置于圆底烧瓶中,加入吡啶与巯基乙酸(1:1)的混合溶液(4.0mL),室温下搅拌反应2小时;冰浴下加入用饱和碳酸氢钠水溶液搅拌至无气泡产生;二氯甲烷溶液稀释反应液,依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗2次,盐水洗2次,收集有机相,无水硫酸钠干燥后,减压蒸馏除去有机溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化(洗脱剂为甲醇/二氯甲烷1:100)得到白色固体化合物6(1.1g,产率为73.9%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(dd,J=7.1,1.2Hz,2H,Ar-H),7.64(d,J=7.4Hz,2H,Ar-H),7.41(tt,J=7.5,1.6Hz,2H,Ar-H),7.34(m,J=6.4,5.2,3.0Hz,2H,Ar-H),6.78(t,1H,-NHCO-),6.51(d,J=9.1Hz,1H,-NHCO-),5.82(d,J=8.8Hz,1H,-NHCO-),5.39(d,J=3.2Hz,1H),5.07(m,J=11.4,3.2Hz,1H),4.96(s,1H,1-H),4.62–4.40(m,3H),4.26(m,J=9.5,8.3Hz,4H),4.15(d,J=2.4Hz,2H,-O-CH2-),4.08(m,J=7.1,6.3Hz,2H),3.65(m,J=7.1,6.5,3.8Hz,4H,-O-CH2-),3.56(s,2H,-O-CH2-C≡C),3.46(d,J=5.9Hz,2H,-N-CH2-),2.47(t,J=2.4Hz,1H,-C≡CH),2.16(s,3H,-CO-CH3),2.03(s,6H,-CO-CH3),2.00(s,3H,-CO-CH3),1.27(t,J=5.5Hz,3H,-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.90,170.80,170.40,169.94,156.66,143.71,141.33,127.82,127.80,127.16,125.13,125.06,120.05,120.03,99.87,79.36,77.38,76.75,75.14,69.91,69.25,69.07,68.80,67.35,67.31,62.11,58.53,58.34,47.63,47.20,39.37,23.08,20.84,20.78,20.68,17.64.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C40H49N3O14,[M+Na]+:818.3107,found:818.3061.
(4)步骤(3)所述的化合物6在催化剂的作用下与乙酸酐反应,得到化合物7;得到化合物7的反应式如下式所示:
步骤(4)的具体操作为:干燥无水级别的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5.0mL)溶解化合物6(1.1g,1.4mmol),加入哌啶(50.0μL),室温下搅拌反应4小时;减压蒸馏除去有机溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化(甲醇/二氯甲烷1:100)得到无色油状液体(750.0mg,产率为92.1%)。乙酸酐与吡啶(1:2)的混合溶液(1.5mL)溶解无色油状液体(100.0mg,174.4μmol),室温下搅拌反应2小时;减压蒸馏除去有机溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化(甲醇/乙酸乙酯1:25)得到无色油状液体化合物7(79.0mg,产率为76.2%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(t,J=5.2Hz,1H,-NHCO-),6.64(m,J=9.0,3.5Hz,1H,-NHCO-),6.57(d,J=9.4Hz,1H,-NHCO-),5.37(m,J=3.3,1.3Hz,1H),5.08(m,J=11.3,3.2Hz,1H),4.94(d,J=3.6Hz,1H,H-1),4.88(s,1H),4.64(dd,J=8.9,2.5Hz,1H),4.56(m,J=11.3,9.4,3.6Hz,1H),4.26(m,J=7.1,5.6,1.3Hz,1H),4.21(d,J=2.4Hz,2H,-O-CH2-C≡C),4.17(m,J=6.3,2.5Hz,1H),4.08(m,J=11.4,6.5Hz,2H),3.71–3.61(m,4H),3.60–3.50(m,2H),3.44(m,J=13.9,9.4,7.4,3.1Hz,2H),2.54(t,J=2.4Hz,1H,-C≡CH),2.17(s,3H,-CO-CH3),2.13(s,3H,-CO-CH3),2.03(d,J=2.5Hz,6H,-CO-CH3),1.99(s,3H,-CO-CH3),1.28(d,J=6.3Hz,3H,-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.99,170.86,170.72,170.43,170.39,170.23,100.30,79.37,78.06,77.29,75.13,69.99,69.28,69.08,68.95,67.38,67.22,62.20,58.37,56.47,47.44,39.33,23.26,23.04,20.80,20.75,20.65,18.09.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C27H41N3O13,[M+H]+:616.2712,found:616.2717.[M+Na]+:638.2532,found:638.2532.
(5)步骤(4)所述的化合物7溶解于有机溶剂中,加入甲醇钠反应,得到化合物8;得到化合物8的反应式如下式所示:
步骤(5)的具体操作为:制备甲醇钠溶液:金属钠(5.4mg),加入到的甲醇溶液(10.0mL)中,冷却至室温待用;甲醇与二氯甲烷(1:1)的混合溶液(3mL)溶解化合物7(79.0mg,128.4mmol),加入已制备好的甲醇钠溶液(0.1mL)调节pH=8,持续搅拌反应2小时;加入适量的离子交换树脂调节pH至7终止反应;硅藻土过滤,收集滤液,除去有机溶剂得到白色固体化合物8(54.0mg,产率为86.0%)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.75(s,1H,H-1),4.42(d,J=2.6Hz,1H),4.18–4.08(m,4H),3.79(q,J=4.7,3.6Hz,2H),3.67–3.55(m,5H),3.52(m,J=6.0,3.4Hz,2H),3.45–3.35(m,3H),3.24–3.15(m,2H),2.78(t,J=2.4Hz,1H,-C≡CH),1.99(s,3H,-CO-CH3),1.97(s,3H,-CO-CH3),1.17(d,J=6.4Hz,3H,-CH3).13C NMR(100MHz,MeOD)δ172.76,172.27,170.94,99.60,79.18,76.26,74.72,71.52,69.66,69.00,68.97,68.88,68.71,61.30,57.69,57.07,50.02,48.26,48.05,47.83,47.62,47.53,47.41,47.20,46.98,39.09,21.86,21.81,21.15,17.82.ESI-TOF HRMS m/z:calcdforC21H35N3O10,[M+H]+:490.2395,found:490.2395.
(6)取化合物9和化合物10溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物11;得到化合物11的反应式如下式所示:
步骤(6)的具体操作为:取化合物9(3.9g,6.7mmol)与化合物10(3.0g,4.2mmol)于圆底烧瓶中,加入已高温干燥过的分子筛(10.0g),氮气保护,加入无水二氯甲烷/重蒸乙醚(1:3)的混合液(80.0mL)溶解,室温搅拌3小时;反应液冷却至0℃,加入N-碘代丁二酰亚胺(2.9g,12.7mmol)搅拌15分钟后,加入三氟甲磺酸三甲基硅脂(152.0μL,0.8mmol),0℃下搅拌反应12小时;用二氯甲烷稀释反应液,依次用饱和的硫代硫酸钠水溶液洗1次,饱和碳酸氢钠水溶液洗2次,盐水洗1次,收集有机层,无水硫酸钠干燥后,过滤,滤液减压蒸馏除去有机溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚1:40)得到无色油状液体化合物11(3.0g,产率为50.8%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(m,J=13.9,9.1,4.0Hz,15H,Ar-H),5.90(d,J=7.5Hz,1H,-NHCO-),4.99(d,J=11.4Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.83(d,J=2.6Hz,1H,H-1),4.81(d,J=4.0Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.78(s,1H,Ar-CH2-O-),4.68(t,J=12.8Hz,2H,Ar-CH2-O-),4.58(d,J=11.4Hz,1H,Ar-CH2-O-),4.18(m,J=8.3,4.7,4.2Hz,1H,-N-CH-),4.06–3.96(m,2H,H-2),3.88(m,J=10.0,2.5Hz,1H,H-3),3.85–3.73(m,4H),3.69–3.62(m,1H),3.49(dd,J=12.4,7.4Hz,1H,H-6),3.14(m,J=12.3,5.9Hz,1H,H-6),2.01(t,J=7.7Hz,2H,-CH2-CONH-),1.63–1.45(m,4H,-CH2-),1.13(d,J=22.6Hz,68H,-CH2-),0.88(m,J=7.4,5.6Hz,24H,-CH3),0.07(d,J=4.8Hz,12H,Si-CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.04,138.51,138.43,138.18,128.45,128.38,128.30,127.87,127.84,127.75,127.66,127.45,100.00,79.00,77.36,77.25,76.72,76.42,76.03,75.83,74.89,74.70,73.52,73.32,69.94,69.39,51.62,51.22,36.87,33.43,31.96,29.92,29.76,29.74,29.69,29.64,29.59,29.51,29.48,29.40,26.14,26.07,25.69,22.72,18.35,18.20,14.16,-3.65,-3.93,-4.61,-4.89.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C83H144N4O8Si2,[M+H]+:1382.0595,found:1382.0581.
(7)取步骤(6)所述的化合物11溶解于有机溶剂中,加入三氟化硼乙醚反应,得到化合物12;得到化合物12的反应式如下式所示:
步骤(7)的具体操作为:乙腈与二氯甲烷(1.5:1)混合溶液(2.5mL)溶解化合物11(200.0mg,144.8μmol),加入三氟化硼乙醚络合物(40.0μL,318.6μmol),室温下搅拌反应2小时;减压蒸馏除去有机溶剂得粗品,硅胶柱分离纯化(洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚1:5)得到白色固体化合物12(122.0mg,产率为73.1%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.27(m,15H,Ar-H),6.28(d,J=8.5Hz,1H,-NHCO-),4.98(d,J=11.4Hz,1H),4.92–4.86(m,2H),4.86–4.75(m,2H),4.70(d,J=11.6Hz,1H),4.59(d,J=11.4Hz,1H),4.27(m,J=7.0,3.4Hz,1H),4.05(m,J=9.9,3.7Hz,1H),3.95–3.79(m,4H),3.73(m,J=7.4,5.6Hz,1H),3.49(m,J=12.5,7.3,6.6,2.9Hz,3H),3.03(m,J=12.5,5.5Hz,1H),2.16(t,J=7.6Hz,2H,-CO-CH2-),1.61(q,J=8.2Hz,4H,-CH2-),1.38–1.17(m,68H,-CH2-),0.88(t,J=6.8Hz,6H,-CH3).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ173.17,138.27,138.04,137.75,128.53,128.43,128.41,128.09,128.02,127.97,127.79,127.57,98.70,79.09,77.45,76.33,75.78,74.69,74.61,73.99,73.21,73.07,70.24,69.00,51.07,49.43,36.82,33.86,32.03,29.95,29.93,29.85,29.81,29.79,29.77,29.70,29.58,29.49,29.47,29.44,26.07,25.90,22.80,14.23.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C71H116N4O8,[M+H]+:1153.8866,found:1153.8861.
(8)取步骤(5)所述的化合物8与步骤(7)所述的化合物12溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物13;得到化合物13的反应式如下式所示:
步骤(8)的具体操作为:甲醇与二氯甲烷(1:2)混合溶液(3.0mL)溶解化合物12(40.0mg,34.7μmol)、化合物8(10.0mg,20.4μmol)、碘化亚铜(195.0mg,1.0mmol),加入N,N-二异丙基乙胺(168.0μL,1.0mmol)与冰乙酸(12.0μL,0.2mmol),室温下搅拌反应12小时;硅藻土过滤掉不溶物,滤液减压蒸馏除去溶剂得粗品;硅胶柱分离纯化得到白色固体化合物13(18.0mg,产率为53.6%)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3(1:50,v/v,0.6mL))δ7.70(s,1H,-N-CH=C-),7.45–7.28(m,15H,Ar-H),5.03(d,J=11.3Hz,1H),4.89(t,J=4.1Hz,2H,H-1 x2),4.86–4.77(m,3H),4.76(d,J=3.1Hz,1H),4.66–4.61(m,3H),4.55(d,J=2.4Hz,1H),4.27(dd,J=14.1,3.1Hz,1H),4.19(m,J=8.0,4.8Hz,2H),4.14–4.03(m,3H),3.95(d,J=7.7Hz,3H),3.87(t,J=5.5Hz,1H),3.73–3.66(m,2H),3.66–3.57(m,4H),3.52(d,J=2.7Hz,2H),3.46(m,J=7.9,5.9Hz,4H),3.37(m,J=1.6Hz,1H),3.32(m,J=12.0,4.1Hz,2H),3.14(q,J=7.4Hz,2H),2.10(d,J=3.9Hz,8H,-CO-CH2-,-CO-CH3 x 2),1.57(q,J=8.3,6.9Hz,2H,-CH2-),1.49(m,J=7.1,3.1Hz,8H,-CH2-),1.43(d,J=6.6Hz,6H,-CH2-),1.25(d,J=3.8Hz,65H,-CH2-,-CH3),0.88(t,J=6.7Hz,6H,-CH3).13C NMR(100MHz,MeOD/CDCl3(1:50,v/v,0.6mL))δ173.73,171.94,171.09,138.25,137.91,137.59,128.67,128.66,128.35,128.29,128.25,128.00,127.72,99.76,98.25,79.00,77.67,77.55,77.17,77.03,75.92,75.21,74.92,74.88,74.07,73.61,72.70,70.65,70.24,70.02,69.87,69.53,69.44,67.38,63.96,62.10,56.81,54.43,51.47,50.65,49.86,42.60,39.47,36.66,33.33,32.04,29.97,29.92,29.87,29.84,29.81,29.78,29.77,29.73,29.58,29.54,29.48,26.08,25.97,22.80,22.75,22.71,18.55,18.35,17.25,14.16,12.28.ESI-TOF HRMS m/z:calcdfor C92H151N7O18,[M+H]+:1643.1188,found:1643.1165.
(9)取步骤(8)所述的化合物13溶解于有机溶剂中,加入催化剂,经脱苄基反应,即可获得所述的缀合物。得到所述缀合物的反应式如下式所示:
步骤(8)的具体操作为:二氯甲烷/甲醇(1:1)的混合溶剂(10.0mL)溶解化合物13(6.0mg,3.7μmol),加入钯碳(5.0mg),通入氢气,密封搅拌24个小时,硅藻土滤过掉不溶物,滤液减压蒸馏除去溶剂,得到白色固体化合物14,即为所述的缀合物Tn-KRN7000(5.5mg,96.1%)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3(1:10,v/v,0.6mL))δ8.00(s,1H),4.89(d,J=3.4Hz,3H),4.70–4.52(m,6H),4.23(d,J=6.3Hz,3H),4.09(s,1H),3.98–3.59(m,15H),3.49(s,7H),3.20(m,J=7.4Hz,2H),2.25–2.15(m,2H),2.11-2.09(s,6H),1.59(d,J=13.3Hz,4H),1.42(t,J=6.6Hz,16H),1.27(s,66H),0.89(t,J=6.7Hz,6H).13CNMR(150MHz,MeOD/CDCl3(1:10,v/v,0.6mL))δ172.95,172.93,172.90,171.72,100.37,100.23,78.43,77.38,74.69,72.48,71.85,70.69,70.46,70.15,70.09,69.88,69.25,67.68,64.47,62.28,57.69,55.29,51.56,50.90,50.78,49.50,49.38,49.23,49.09,48.95,48.81,48.67,48.52,43.42,39.97,32.57,32.50,32.50,30.40,30.38,30.29,30.22,30.06,29.98,29.94,29.91,26.54,26.49,23.21,22.63,18.82,18.70,17.27,14.29,13.00.ESI-TOFHRMS m/z:calcdfor C71H133N7O18[M+H]+:1372.9780,found:1372.9766.
实验例1
本实验例1对实施例1制备的缀合物(全合成糖疫苗)进行免疫小鼠,通过ELSA实验初步评价其免疫作用,通过荧光激活细胞分选(FACS)技术证明抗体血清能特异性识别肿瘤细胞(MCF-7),同时通过抗体介导的互补依赖细胞毒性(CDC)实验表明抗体血清在补体的介导下具有杀死肿瘤细胞的能力。
1.ELISA免疫分析
1)小鼠免疫:
取6-8周龄的C57BL/6小鼠6只。将糖疫苗制备成脂质体后,通过小鼠皮下注射的方式进行免疫试验,采用一次初始免疫和三次增强免疫方案,分别在第0、14、21、28天注射制备的疫苗,每只每次注射量0.1mL;第38天每只小鼠取血取0.1mL到0.2mL,在0℃放置60分钟,4000转/分钟离心15分钟,取上层清亮血清用于ELISA检测分析。
2)ELISA免疫分析:
0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)溶解Tn-BSA,配置成2.0μg/mL溶液,以每孔100.0μL的量加入96孔板,放入4℃孵育过夜;第二天37℃培养箱孵育一小时;用PBST(PBS+0.05%吐温-20)洗板3次(300μL/孔/次)。洗板后,加入PBS/1%BSA;每孔加入250.0μl;常温孵育一小时,用PBST洗板3次。将6只小鼠血清样品等量混合后用PBS稀释300、900、2700、8100、24300、72900、218700与656100倍;将稀释好的血清以每孔100.0μL加入96孔板,每个稀释梯度平行做三个副孔;放置在37℃培养箱孵育两个小时,洗板3次。将HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG(稀释2000倍),每孔加入100.0μL,室温孵育一小时;洗板3次。加入TMB溶液,每孔加入100.0μL,室温避光显色20分钟。加入0.5M H2SO4溶液,每孔加100.0μL。立即用酶标仪检测吸光度,检测波长为450nm,570nm作为背景波长。
3)将吸光度(OD)值相对于抗血清稀释值作图,并获得最佳拟合线。使用该线的方程式来计算OD值达到0.2时的稀释度值,并且根据稀释值的倒数计算抗体滴度如图1所示。
4)实验结果:
从图1可看出,本发明实施例1合成的KRN7000-Tn糖疫苗(缀合物Ⅲ),无需外部佐剂的条件下,在小鼠体内能更快速地产生特异性免疫应答,同时激活NKT细胞,高效地将IgM抗体同种型转换成IgG。
2.流式细胞实验(FACS)
实验方法:取过量表达Tn糖抗原的乳腺癌细胞MCF-7和不表达Tn糖抗原的肿瘤细胞MDA-231分别在含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基中培养(37℃,5%CO2);胰酶消化,收集细胞,显微镜下数细胞数,每个试管分装2.0×105个细胞,加1mL的含3%的FBS的PBS缓冲液(FACS缓冲液)重悬,离心2分钟,去掉上清液,用FACS缓冲液清洗两次;加入制备好的小鼠血清,在冰中孵育1个小时,FACS缓冲液清洗两次,加入荧光标记的二抗,在冰中避光孵育一个小时,FACS缓冲液清洗两次,重悬于0.8mL的FACS缓冲液中,用流式细胞仪检测。
实验结果:如图2所示,MCF-7是过度表达Tn抗原的乳腺癌细胞,把不表达Tn抗原的MDA-231肿瘤细胞为阴性对照。在MCF7细胞中,与免疫前血清相比,本发明实施例1合成的KRN7000-Tn糖疫苗(缀合物Ⅲ)诱导产生的抗体血清的荧光峰明显向右偏移。在MDA-231免疫前血清与抗体血清无明显差别。结果表明,KRN7000-Tn糖疫苗诱导的抗体能特异性识别表达Tn抗原的MCF-7细胞。
3.抗体介导的互补依赖细胞毒性(CDC)
实验方法:取过量表达Tn糖抗原的乳腺癌细胞MCF-7和不表达Tn糖抗原的肿瘤细胞MDA-231分别在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养;将对数生长期的细胞配置成1.0×105cell/mL密度的细胞悬液,接种到96孔板中,每孔100μL,约10000个细胞,放置到培养箱中培养过夜。除去培养基,无血清的MEM培养液洗三次,加入MEM稀释的小鼠血清,37℃孵育2小时。无血清的MEM洗三次,加入一定比例(1:10)稀释的补体溶液,在37℃培养1小时。同时设置低参照(仅用无血清培养基)和高参照(5%triton-100处理)组。孵育结束后,离心细胞,取20μL的细胞上清液用PBS稀释至100μL,用100μL的LDH细胞毒性检测试剂显色30分钟。在490nm测量每孔的吸光值,根据低参照和高参照孔,计算细胞的裂解率。
实验结果:如图3所示,MCF-7是过度表达Tn抗原的乳腺癌细胞,把不表达Tn抗原的MDA-231肿瘤细胞为阴性对照。在相同条件下,本发明实施例1合成的KRN7000-Tn糖疫苗(缀合物Ⅲ)诱导产生的抗体血清对小鼠产生的抗血清介导的MCF-7细胞裂解率显著高于空白血清。对不表达Tn抗原的MDA-231细胞的细胞毒性与空白血清的差异无统计学意义,结果证实KRN7000-Tn糖疫苗具有一定的特异性抗肿瘤作用。
综上,实验结果表明,本发明提供的一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物(KRN7000-Tn糖疫苗),以强效免疫刺激剂α-半乳糖神经酰胺类似物(KRN7000)作为内嵌佐剂缀合糖抗原Tn获得,其中,KRN7000能提高Tn糖抗原的免疫原性,将Tn糖抗原提呈到相应的免疫细胞,产生具有更高滴度的针对肿瘤糖抗原Tn特异性的免疫反应,达到杀死肿瘤细胞的目的,产生抗肿瘤作用,有望成为新一代的抗肿瘤药物。
最后所应当说明的是,上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将化合物1和化合物2溶解于有机溶剂中,加入缩合剂反应,得到化合物3;
(2)将化合物4和步骤(1)所述的化合物3溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物5;
(3)将步骤(2)所述的化合物5在催化剂的作用下与巯基乙酸反应,得到化合物6;
(4)步骤(3)所述的化合物6溶解于有机溶剂中,加入催化剂,与乙酸酐反应,得到化合物7;
(5)步骤(4)所述的化合物7溶解于有机溶剂中,加入甲醇钠反应,得到化合物8;
(6)取化合物9和化合物10溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物11;
(7)取步骤(6)所述的化合物11溶解于有机溶剂中,加入三氟化硼乙醚反应,得到化合物12;
(8)取步骤(5)所述的化合物8与步骤(7)所述的化合物12溶解于有机溶剂中,加入催化剂反应,得到化合物13;
(9)取步骤(8)所述的化合物13溶解于有机溶剂中,加入催化剂,经脱苄基反应,即可获得所述的缀合物;
所述化合物1至所述化合物13的结构式如下所示:
其中:
n为2-6的整数;
m为9-25的整数;
R1选自-OC(NH)CCl3、STol、SPh、Set、Cl、Br中的任意一种取代基;
步骤(1)中,所述有机溶剂为二氯甲烷溶液,所述缩合剂为N,N’-二环己基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的混合物;
步骤(2)中,所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醚或四氢呋喃;当化合物4的取代基R1为-OC(NH)CCl3时,所述催化剂选自氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟甲磺酸中的任意一种;或者当化合物4的取代基R1为STol、SPh或Set时,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺和选自三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯中的任意一种;或者当化合物4的取代基R1为Cl或Br时,所述催化剂选自碳酸钾、碳酸银、碳酸铯、碳酸汞、高氯酸银、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸中的任意一种;所述反应的温度为-40~ -20℃;
步骤(3)中,所述催化剂为吡啶,所述催化剂与所述巯基乙酸的体积比为1:1;
步骤(4)中,所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺,所述催化剂为哌啶,所述催化剂与所述乙酸酐的体积比为2:1;
步骤(5)中,所述有机溶剂为甲醇与二氯甲烷的混合溶液,所述甲醇与所述二氯甲烷的体积比为1:1;所述催化剂为甲醇钠;
步骤(6)中,所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙醚或四氢呋喃中的任意一种,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺和选自三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸中的任意一种;
步骤(7)中,所述有机溶剂为乙腈与二氯甲烷的混合溶液,所述乙腈与所述二氯甲烷的体积比为1.5:1;
步骤(8)中,所述有机溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合溶液,所述催化剂为碘化亚铜、N,N-二异丙基乙胺与冰乙酸的混合物;
步骤(9)中,所述有机溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合溶液,所述催化剂为氢气、钯碳与氢氧化钯的混合物;
所述缀合物为通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐;
其中:
n为2-6的整数;
m为9-25的整数;
5.如权利要求1所述缀合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述有机溶剂为二氯甲烷;当化合物4的取代基R1为-OC(NH)CCl3时,所述催化剂为三氟甲磺酸三甲基硅酯;
步骤(6)中,所述有机溶剂为二氯甲烷与乙醚的混合溶液,所述催化剂为N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯的混合物。
6.如权利要求1-5任一所述含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物的制备方法制得的缀合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、肠癌、肾细胞癌、细胞性淋巴癌、胰腺癌、甲腺癌、脑癌、胃癌和白血病。
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