CN115093450B - 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用 - Google Patents

一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115093450B
CN115093450B CN202210672139.5A CN202210672139A CN115093450B CN 115093450 B CN115093450 B CN 115093450B CN 202210672139 A CN202210672139 A CN 202210672139A CN 115093450 B CN115093450 B CN 115093450B
Authority
CN
China
Prior art keywords
krn
reaction
compound
washing
methanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210672139.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115093450A (zh
Inventor
陈超
郑致伟
周雨笑
朱佳乐
李�根
高祺
隋强
戈冬眠
岳慧
李玉杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Anyikang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Anyikang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Anyikang Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Anyikang Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210672139.5A priority Critical patent/CN115093450B/zh
Publication of CN115093450A publication Critical patent/CN115093450A/zh
Priority to PCT/CN2023/099915 priority patent/WO2023241571A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115093450B publication Critical patent/CN115093450B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本发明涉及一种化合物及其在合成免疫佐剂KRN7000中的应用，所述的化合物为KRN7k‑9；所述的合成免疫佐剂KRN7000的方法包括：(1)糖砌块嵌段合成并进行羟基保护；(2)脂肪链嵌段合成；(3)将所述糖砌块嵌段和所述脂肪链嵌段进行偶联‑还原成的化合物KRN7k‑9，从化合物KRN7k‑9出发，进一步合成KRN7000。

Description

一种化合物及其在合成免疫佐剂KRN7000中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种化合物及其在合成免疫佐剂KRN7000中的应用。
背景技术
基于单一抗原的现代亚单位疫苗与传统病毒疫苗相比，具有更精确的靶向作用和更高的安全性。然而，抗原自身一般表现低免疫原性，需要佐剂分子来增加免疫原性并增强免疫反应。佐剂应该具备高效力，且低毒性才可以应用到临床。
一些天然的和合成的佐剂分子已经被用于临床实验，也有被批准用于人类疫苗。天然佐剂一般是混合物，难以获得，在一些情况下，又不够稳定，所以合成佐剂是我们的目标。
KRN7000(结构如图1所示)是一类海洋海绵衍生化的合成糖脂，具有抗肿瘤和免疫激活特性[1,2,3]。结构上，它由半乳糖通过α-O-糖苷键连接到C18植物鞘氨醇与酰胺键连接的饱和C26脂肪链。KRN7000嵌入到树突细胞上的非多态性MHC-1样抗原呈递分子CD1d上，其疏水烷基链埋在CD1d结合沟中，极性部分处在CD1的外表面，暴露在溶剂中以便T细胞受体能够识别，极性部位与确定CD1d残基接触决定了识别方向。KRN7000与树突细胞上CD1d结合呈递给恒定自然杀伤性T细胞(iNKT)上的T细胞受体，激活iNKT细胞。虽然在血液中iNKT细胞只占T细胞的一小部分，但是它代表一类特别的淋巴细胞，能够快速响应；这些激活的iNKT细胞迅速产生TH1-型(IFNγ)和TH2-型(IL-4)细胞因子，活化其它免疫细胞参与先天性免疫和获得性免疫[4,5]。
KRN7000作为一种特别有用的特异性CD1d激动剂，在过去26年里引起了浓厚研究兴趣，但是其来源有限且价格昂贵，且人工合成较为困难迫使发展了不同的合成方法[3]。早期主要集中于合成方法的开发，产业化工艺开发几乎没有。主要合成难点如下：
1.糖环2位乙酰基，苄基等保护后，邻基参与效应糖苷化倾向形成α-糖苷键，构建高选择性α-糖苷键是合成的一大挑战。通常合成的为混合物，异构体的分离也是较为棘手的。糖苷化同样也存在收率低，成本高，杂质纯化难度增大[6]。
2.糖供体需要不同的保护基来确保立体或区域选择性，糖供体上1位离去基团通常有三氯乙腈，苯硫酚，乙酰基，碘等保护基。对供体大量合成具有挑战[7,8,9]。
3.鞘氨醇脂肪链通常选择叠氮化试剂，如叠氮化钠易爆，较为危险，放大存在问题[10]。
基于此，提出本发明。
[参考文献]
[1]Morita,M.；Motoki,K.；Akimoto,K.；Natori,T.；Sakai,T.；Sawa,E.；Yamaji,K.；Koezuka,Y.；Kobayashi,E.；Fukushima,H.Structure-Activity Relationship of a-Galactosylceramides Against B16-Bearing Mice.J.Med.Chem.1995,38,2176-2187.
[2]Tashiro,T.；Mori,K.Fifteen Years since the Development of KRN7000Structure-Activity Relationship Studies on Novel Glycosphingolipids WhichStimulate Natural Killer T Cells.Trends.Glycosci.Glyc.2010,22,280–295.
[3]Banchet-Cadeddu,A.；Henon,E.；Dauchez,M.；Renault,J.H.；Monneaux,F.；Haudrechy,A.The Stimulating Adventure of KRN 7000.Org.Biomol.Chem.2011,9,3080-3104；
[4]Koch,M.；Stronge,V.S.；Shepherd,D.；Gadola,S.D.；Mathew,B.；Ritter,G.；Fersht,A.R.；Besra,G.S.；Schmidt,R.R.；Jones,E.Y.；Cerundolo,V.The CrystalStructure of Human CD1d with and withoutα-Galactosylceramide.Nat.Immunol.2005,6,819-826.
[5]Laurent,X.；Renault,N.；Farce,A.；Chavatte,P.；Henon,E.PLoSComput.Biol.2014,10,e1003902.
[6]a)Morales-Serna,J.A.；Boutureira,O.；Diaz,Y.；Matheu,M.I.；Castillon,S.Recent Advances in the Glycosylation of Sphingosines andCeramides.Carbohydr.Res.2007,342,1595-1612；b)Yao,D.；Liu,Y.；Yan,S.；Li,Y.；Hu,C.；Ding,N.Evidence of Robust Participation by an Equatorial 4-O group inGlycosylation on a 2-azido-2-deoxy-glucopyranosyl Donor.Chem.Commun.2017,53,2986-2989；c)Xu,K.；Man,Q.；Zhang,Y.；Guo,J.；Liu,Y.；Fu,Z.；Zhu,Y.；Li,Y.；Zheng,M.；Ding,N.Investigation of the Remote Acyl Group Participation in Glycosylationfrom Conformational Perspectives by Using Trichloroacetimidate as the AcetylSurrogate.Org.Chem.Front.2020.
[7]a)Christina,A.E.；van der Marel,G.A.；Codee,J.D.C.,in ModernSynthetic Methods in Carbohydrate Chemistry:From Mono-saccharides to ComplexGlycoconjugates,ed.D.B.Werz and S.Vidal,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,1stedn,2014,ch.4,p.2014.；b)Nigudkar,S.S.；Demchenko,A.V.Stereocontrolled 1,2-cisGlycosylation as the Driving Force of Progress in Synthetic CarbohydrateChemistry.Chem.Sci.2015,6,2687-2704；c)Guo,J.；Ye,X.S.Protecting Groups in CarbohydrateChemistry:Influence on Stereoselectivity of Glycosylations.Molecules.2010,15,7235-7265.
[8]a)Ding,N.；Li,C.；Liu,Y.；Zhang,Z.；Li,Y.Concise Synthesis ofClarhamnoside,a Novel Glycosphingolipid Isolated from the Marine Sponge Agelaclathrodes.Carbohydr.Res.2007,342,2003-2013；b)Liu,Y.；Xu,X.；Gao,Q.；Yan,S.；Li,Y.；Ding,N.Glycosylation of a Ketone with an O-Glycosyl TrichloroacetimidateProvides an Enol Glycoside.Org.Lett.2018,20,5186-5189.
[9]Yang Zhang,a Jia Guo,a Xiaoyan Xub,Qi Gao,b Xianglai Liu,a andNing Ding.Practical and scalable synthesis of KRN7000 by using of GlycosylIodide as the glycosyl donor.Chin.J.Chem.2020,37,XXX—XXX.
[10]Schumann,B.；Parameswarappa,S.G.；Lisboa,M.P.；Kottari,N.；Guidetti,F.；Pereira,C.L.；Seeberger,P.H.Nucleophile-Directed Stereocontrol OverGlycosylations Using Geminal-Difluorinated Nucleophiles.Angew.Chem.In.tEd.2016,55,14431-14434.
发明内容
本发明首先涉及一种三步法合成KRN7000的方法，所述的方法包括如下反应步骤：
(1)糖砌块嵌段合成并进行羟基保护；
(2)脂肪链嵌段合成；
(3)将所述糖砌块嵌段和所述脂肪链嵌段进行偶联-还原成下式(1)所示的化合物KRN7k-9，从化合物KRN7k-9出发，进一步合成KRN7000；
步骤(1)所述的糖砌块嵌段中，
糖母核为葡萄糖，
糖砌块嵌段中包含单STol取代基，
糖母核中的羟基使用保护剂保护，所述的保护剂为二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)和苯甲酰氯；
优选的，糖母核中与氧原子相邻的两个羟基被一个二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)保护剂保护，剩余两个羟基被BzCl保护；
最优选的，所述的经羟基保护的糖砌块嵌段为式(2)所示的化合物KRN7k-6，
所述的化合物KRN7k-6的制备过程如下反应式所示，
具体的：
1)D-吡喃葡萄糖为原料，将D-吡喃葡萄糖溶于乙酸酐中，加入吡啶，反应后制得化合物KRN7k-2(白色固体)；
优选的，D-吡喃葡萄糖与乙酸酐的用量比(摩尔比)为1：10，乙酸酐与吡啶的用量比(体积比)为1：1，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用饱和碳酸氢钠洗涤，5％(质量百分比)柠檬酸水洗，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，负压浓缩，加入石油醚搅拌析出固体，过滤得固体，进行精制；
2)KRN7k-2溶于二氯甲烷中，加入对甲基苯硫酚后缓慢滴加三氟化硼乙醚，反应后制得化合物KRN7k-3(白色固体)；
优选的，KRN7k-2与对甲基苯硫酚、三氟化硼乙醚的用量比(摩尔比)为5：6：9，反应过程惰性气体保护，温度0-5℃；产物以饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤并以EA+PE进行重结晶精制；
3)甲醇中加入KRN7k-3，缓慢滴加甲醇钠/甲醇溶液至pH在9-10之间，反应后制得化合物KRN7k-4(白色固体)；
优选的，反应产物加甲醇洗涤干净的H+阳离子树脂调pH到7，浓缩后加入石油醚，乙酸乙酯(1：10)搅拌析出固体，过滤，精制；
4)吡啶中加入KRN7k-4，缓慢滴加二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)，反应后制得油状化合物KRN7k-5；
优选的，二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)的摩尔量略多于KRN7k-4的摩尔量，反应过程冰浴下进行，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用水洗，饱和食盐水洗涤精制；
5)吡啶中加入KRN7k-5，缓慢滴加苯甲酰氯，反应完全后，加入甲醇淬灭反应后制得化合物KRN7k-6(白色固体)；
优选的，KRN7k-5与苯甲酰氯的用量(摩尔比)为1：8，反应完全后，加入甲醇淬灭反应，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗，5％柠檬酸水洗，水洗，食盐水洗，浓缩后得油状粗产物，加入无水乙醇搅拌析出固体，过滤，精制。
步骤(2)所述的脂肪链嵌段为：式(3)所示的化合物L5，
所述化合物L5以植物鞘氨醇为底物制备获得，所述的化合物L5的制备过程如下反应式所示，
具体的：
1)植物鞘氨醇溶于四氢呋喃/甲醇(3：1)中，加入1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐，搅拌溶解后加入碳酸钾)和无水硫酸铜继续反应至反应完成得化合物L2；
优选的，植物鞘氨醇与1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐、碳酸钾、无水硫酸铜的用量比(摩尔比)为13：14：38：1，反应产物以甲醇溶解后薄层层析法纯化精制；
2)化合物L2溶于吡啶中，加入DMAP，氮气保护缓慢滴加TBDPSCl，反应结束后加入甲醇淬灭反应得油状化合物L3；
优选的，L2与DMAP、TBDPSCl的用量比(摩尔比)为10：1：11，产物以乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤至pH中性，过滤，负压浓缩精制；
3)化合物L3中加入吡啶、DMAP，氮气保护下缓慢滴加苯甲酰氯，反应结束后加甲醇淬灭反应得油状化合物L4；
优选的，L3与吡啶、DMAP的用量比(摩尔比)10：40：1，产物负压浓缩得油状物，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩进行精制；
4)化合物L4加入四氢呋喃、吡啶，缓慢加入氟化氢吡啶溶液，反应结束后得化合物L5(白色固体)；
优选的，约40mmol L4中加入170mL四氢呋喃，170mL吡啶，冰浴至0℃，缓慢加入104ml氟化氢吡啶溶液，控制反应体系温度10-45℃；反应结束后，乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠调pH到6-7，分层后，加入1.5M盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩得油状物粗品L5，粗产物用薄层层析法进行分离纯化精制。
步骤(3)的制备过程如下反应式所示，
具体的：
1)KRN7k-6中加入L5，N-碘代丁二酰亚胺，分子筛活化粉，超干二氯甲烷溶解后，加入三氟甲磺酸酸，反应结束后三乙胺淬灭得油状液体KRN7k-7；
优选的，KRN7k-6、L5、N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸的用量比(摩尔比)为14：10：40：3，反应在氮气保护下冰浴进行，反应结束后，三乙胺淬灭，负压浓缩得油状物，粗产物用薄层层析法精制；
2)KRN7k-7溶于二氯甲烷，甲醇，加入六水氯化镍，冰浴搅拌，再加入硼氢化钠后常温反应，反应得目标化合物淡黄色液体KRN7k-8；
优选的，KRN7k-7、六水氯化镍、硼氢化钠的用量比(摩尔比)为1：6：10；反应完全后，加入硅胶负压浓缩得固体，粗产物用薄层层析法进行分离纯化；
3)蜡酸、EDCI、HOBT、四氢呋喃混匀后氮气保护下冰浴，加入溶于四氢呋喃的KRN7k-8，加入DIPEA混合，再将混合后的溶液滴加到蜡酸溶液中，此步氨基接上HO2C-C25H51，反应结束后得油状液体KRN7k-9；
优选的，蜡酸、EDCI、HOBT、KRN7k-8、DIPEA摩尔比为3：20：20：2：6；反应体系温度0-5℃，反应结束后水洗，饱和食盐水洗至中性，负压浓缩后用薄层层析法进行精制；
4)将KRN7k-9溶于四氢呋喃中，冰浴滴加氢氟酸吡啶溶液，脱除硅叉保护基搅拌至反应完成得油状液体KRN7k-10；
优选的，将KRN7k-9四氢呋喃中，冰浴滴加氢氟酸吡啶溶液，反应完成用饱和碳酸氢钠溶液淬灭，负压浓缩至只有水层，加入二氯甲烷搅拌后取有机层，饱和食盐水洗涤至pH中性，负压浓缩得粗产物，用薄层层析法精制；
5)将KRN7k-10溶于甲醇中，冰浴滴加甲醇钠/甲醇溶液调pH，反应完得终产品KRN7000(白色固体)；
优选的，滴加甲醇钠/甲醇溶液调pH＝10，滴完升温至室温继续反应，反应完加入氯仿溶解，过滤，氯仿漂洗，负压浓缩得固体粗品，加入甲醇搅拌出固体，过滤得粗品，再加入石油醚搅拌，过滤出白色固体KRN7000。
本发明还涉及式(1)所示的化合物KRN7k-9，
本发明还涉及式(2)所示的化合物KRN7k-6，
本发明还涉及化合物KRN7k-9、KRN7k-6在制备疫苗佐剂KRN7000或包含KRN7000的疫苗产品中的应用。
本发明还涉及所述化合物KRN7k-9的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以D-吡喃葡萄糖为原料制备化合物KRN7k-6，具体的步骤包括：
1)D-吡喃葡萄糖为原料，将D-吡喃葡萄糖溶于乙酸酐中，加入吡啶反应后制得白化合物KRN7k-2(白色固体)；
优选的，D-吡喃葡萄糖与乙酸酐的用量比(摩尔比)为1：10，乙酸酐与吡啶的用量比(体积比)为1：1，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用饱和碳酸氢钠洗涤，5％(质量百分比)柠檬酸水洗，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，负压浓缩，加入石油醚搅拌析出固体，过滤得固体，进行精制；
2)KRN7k-2溶于二氯甲烷中，加入对甲基苯硫酚后缓慢滴加三氟化硼乙醚，反应后制得化合物KRN7k-3(白色固体)；
优选的，KRN7k-2与对甲基苯硫酚、三氟化硼乙醚的用量比(摩尔比)为5：6：9，反应过程惰性气体保护，温度0-5℃；产物以饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤并以EA+PE进行重结晶精制；
3)甲醇中加入KRN7k-3，缓慢滴加甲醇钠/甲醇溶液至pH在9-10之间，反应后石油醚：乙酸乙酯(10：1，v:v)加入搅拌出固体，过滤，制得化合物KRN7k-4(白色固体)；
优选的，反应产物加甲醇洗涤干净的H+阳离子树脂调pH到7，浓缩后加入石油醚，乙酸乙酯(1：10)搅拌析出固体，过滤，精制；
4)吡啶中加入KRN7k-4，缓慢滴加二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)，反应后制得油状化合物KRN7k-5；
优选的，二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)的摩尔量略多于KRN7k-4的摩尔量，反应过程冰浴下进行，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用水洗，饱和食盐水洗涤精制；
5)吡啶中加入KRN7k-5，缓慢滴加苯甲酰氯，反应完全后，加入甲醇淬灭，加入无水乙醇搅拌析出固体，过滤后制得化合物KRN7k-6(白色固体)；
优选的，KRN7k-5与苯甲酰氯的用量(摩尔比)为1：8，反应完全后，加入甲醇淬灭反应，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗，5％柠檬酸水洗，水洗，食盐水洗，浓缩后得油状粗产物，加入无水乙醇搅拌析出固体，过滤，精制；
(2)以植物鞘氨醇为原料，制备化合物L5，具体的步骤包括：
6)植物鞘氨醇溶于四氢呋喃/甲醇(3：1)中，加入1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐，搅拌溶解后加入碳酸钾)和无水硫酸铜继续反应至反应完成得化合物L2；
优选的，植物鞘氨醇与1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐、碳酸钾、无水硫酸铜的用量比(摩尔比)为13：14：38：1，反应产物以甲醇溶解后薄层层析法纯化精制；
7)化合物L2溶于吡啶中，加入DMAP，氮气保护缓慢滴加TBDPSCl，反应结束后加入甲醇淬灭反应得油状化合物L3；
优选的，L2与DMAP、TBDPSCl的用量比(摩尔比)为10：1：11，产物以乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤至pH中性，过滤，负压浓缩精制；
8)化合物L3中加入吡啶、DMAP，氮气保护下缓慢滴加苯甲酰氯，反应结束后加甲醇淬灭反应得油状化合物L4；
优选的，L3与吡啶、DMAP的用量比(摩尔比)10：40：1，产物负压浓缩得油状物，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩进行精制；
9)化合物L4加入四氢呋喃、吡啶，缓慢加入氟化氢吡啶溶液，反应结束后得化合物L5(淡黄色固体)；
优选的，约40mmol L4中加入170mL四氢呋喃，170mL吡啶，冰浴至0℃，缓慢加入104ml氟化氢吡啶溶液，控制反应体系温度10-45℃；反应结束后，乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠调pH到6-7，分层后，加入1.5M盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩得油状物粗品L5，粗产物用薄层层析法进行分离纯化精制；
(3)以化合物KRN7k-6、化合物L5为原料，制备KRN7k-9，具体步骤如下：
10)KRN7k-6中加入L5，N-碘代丁二酰亚胺，分子筛活化粉，超干二氯甲烷溶解后，加入三氟甲磺酸，反应结束后三乙胺淬灭得油状液体KRN7k-7；
优选的，KRN7k-6、L5、N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸的用量比(摩尔比)为14：10：40：3，反应在氮气保护下冰浴进行，反应结束后，三乙胺淬灭，负压浓缩得油状物，粗产物用薄层层析法精制；
11)KRN7k-7溶于二氯甲烷，甲醇，加入六水氯化镍，冰浴搅拌后再加入硼氢化钠，反应得目标化合物淡黄色液体KRN7k-8；
优选的，KRN7k-7、六水氯化镍、硼氢化钠的用量比(摩尔比)为1：6：10；反应完全后，加入硅胶负压浓缩得固体，粗产物用薄层层析法进行分离纯化；
12)蜡酸、EDCI、HOBT、四氢呋喃溶剂混匀后氮气保护下冰浴；KRN7k-8、DIPEA加入等体积四氢呋喃溶剂混合；再将混合后的KRN7k-8溶液滴加到蜡酸溶液中，反应结束后得油状液体KRN7k-9；
优选的，蜡酸、EDCI、HOBT、KRN7k-8、DIPEA摩尔比为3：20：20：2：6；反应体系温度0-5℃，反应结束后水洗，饱和食盐水洗至中性，负压浓缩后用薄层层析法进行精制。
本发明的有益效果在于：
(1)合成了一种新型化合物中间体KRN7k-9，再通过三步反应得到KRN7000；
(2)对工艺进行优化，可以高效合成关键新型化合物中间体KRN7k-9；
(3)本发明中，选择商业化的D-吡喃葡萄糖，植物鞘氨醇为起始物料，主链通过二叔丁基硅基保护，选择性与脂肪链合成α-糖苷键，在通过一步还原叠氮成氨基得到新型化合物中间体，经优化后的工艺路线，可大规模制备目标新型化合物中间体KRN7k-6，进而高效合成疫苗佐剂KRN7000，解决了其来源以及应用于临床疫苗中的一个障碍。
附图说明
图1、KRN7000佐剂的化合物结构。
图2、本发明合成KRN7000佐剂的合成路线图。
图3、新化合物关键中间体KRN7k-9的化合物核磁表征数据。
图4、KRN7000佐剂的化合物核磁表征数据。
图5、KRN7000佐剂的化合物质谱表征数据。
具体实施方式
1.1实验材料
实验用水为Milli-Q水(18.2MΩ·cm，Millipore公司)。
吡啶(Py)、三乙胺(TEA)、乙酸乙酯(EA)、石油醚(PE)、甲醇(MeOH)、无水乙醇(Ethanol absolute)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(CH2Cl2)等均为分析纯试剂，购买于上海泰坦科技，直接使用；其他主要试剂货号及质量标准如下表1。
表1，主要试剂货号及质量标准
1.2实验仪器
四氟节门层析柱(型号：C363230C,C364640C)是购自重庆欣维尔玻璃有限公司。
低温循环泵(型号：DLSB-5/20)，控温仪(型号：ZNHW-II)，磁力搅拌器(型号：98-2)，机械搅拌器(型号：100W)，旋片式真空泵(型号：2XZ-4)，暗箱紫外分析仪器(型号：ZF-20D)，鼓风干燥箱(型号：DHG-9240A)均购自上海信铮科贸有限公司。
HPLC：Agilent 1260Infinityll，设备编号：ME-D-044(J)；色谱柱：InfinityLabPoroshell 120EC C18(色谱柱编号：C18-03)购自上海赛默飞世尔科技有限公司。
实施例1：糖砌块结构嵌段的合成
步骤1.化合物KRN7k-2的制备
取一个250mL的四口烧瓶，将D-吡喃葡萄糖(10g，55.5mmol)溶于乙酸酐(50mL，532.4mmol)中，待混合均匀后向反应液中缓慢滴加50mL吡啶，缓慢升温，搅拌至溶解，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，65℃负压浓缩除去溶剂，100mL乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，5％柠檬酸水洗，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性。
有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，加入石油醚100ml，搅拌析出固体，过滤出白色固体得化合物KRN7k-2，45℃烘干，产量22.02g，产率97％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.70(d,J＝8.3Hz,1H),5.43(d,J＝2.7Hz,1H),5.34(d,J＝1.1Hz,2H),4.35(dd,J＝6.9,4.4Hz,1H),4.14(d,J＝4.1Hz,1H),4.06(t,J＝6.6Hz,1H),2.16(d,J＝1.8Hz,6H),2.14–2.10(m,9H).MS(ESI):413.2(C16H22O11,[M+Na]+)。
步骤2.化合物KRN7k-3的制备
取一个500mL的四口烧瓶，KRN7k-2(22.0g，56.4mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入10g分子筛活化粉(01283099，AR)干燥，氮气保护下降温至0℃，加入对甲基苯硫酚(9.9g，66.6mmol)；
缓慢滴加三氟化硼乙醚(14.4g，101.5mmol，缓慢升温，控温0-5℃，滴完保温0℃保温1h，转到室温搅拌过夜，TLC检测进度。
反应完，饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，食盐水洗涤至中性。无水硫酸钠干燥，过滤，负压浓缩得粗品固体化合物，43ml乙酸乙酯溶解，加热回流后滴加325ml石油醚重结晶得白色固体，50℃烘干得KRN7k-3，产量15.48g，收率60.4％。熔点118.0-119.0℃。
1H NMR(CDCl 3,600MHz)δ2.0(d,J＝12Hz,6H),2.09(s,6H),2.35(s,3H),3.69(dd,J＝1.8Hz,6Hz,1H),4.19(m,2H),4.63(d,J＝6Hz,1H),4.92-5.03(m,2H),5.21(d,J＝12Hz,1H),7.12-7.40(m,4H)ppm.MS(ESI):453.0(C21H26O9S,[M-H]-)。
步骤3.化合物KRN7k-4的制备
取一个250mL的四口圆底烧瓶，分别向其中加入甲醇100ml和KRN7k-3(15g，33mmol)，磁力搅拌不溶解。
冰浴至0℃，缓慢滴加甲醇钠(0.26g,5.0mmol)至pH在9-10之间，2-5min后反应液变澄清并用TLC监测。
反应完全后，加甲醇洗涤干净的H+阳离子树脂(A824461，AR)调pH到7，减压蒸馏至干。
加入15ml乙酸乙酯溶解，加热至回流，加入150ml石油醚保温搅拌1h，降温至室温过滤出白色固体，50℃烘干得KRN7k-4，产量7.88g，产率83.4％，熔点：142.0-143.0℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.13(t,J＝10.1Hz,2H),5.22–4.95(m,1H),4.47(t,J＝9.6Hz,1H),3.66(d,J＝30.0Hz,1H),3.57–3.46(m,2H),3.42(t,J＝5.2Hz,1H),3.41–3.36(m,1H),2.27(s,3H).MS(ESI):285.57(C13H18O5S,[M-H]-)。
步骤4.化合物KRN7k-5的制备
/>
取一个250mL的四口圆底烧瓶，分别向其中加入吡啶100ml和KRN7k-4(14.3g，49.9mmol)搅拌溶解。
冰浴至0℃，缓慢滴加二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)(24.2g，54.9mmol)，自然升温，控温0-10℃，滴完撤去冰浴升至室温搅拌，TLC监测。
反应完全后，负压浓缩至干。加100mL乙酸乙酯溶解，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤负压浓缩至干得油状KRN7k-5，产量21.8g，产率102.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47(t,J＝13.9Hz,2H),7.11(d,J＝7.9Hz,2H),4.46(t,J＝8.4Hz,1H),4.41(t,J＝5.5Hz,1H),4.23(d,J＝11.2Hz,2H),3.76–3.66(m,1H),3.56–3.47(m,1H),3.43(d,J＝0.7Hz,1H),2.79(t,J＝12.2Hz,1H，OH),2.72(dd,J＝12.0,3.3Hz,1H，OH),2.33(s,3H),1.05(s,9H),1.03(s,9H).MS(ESI):449.5(C21H34O5SSi,[M+Na]+)。
步骤5.化合物KRN7k-6的制备
取一个250mL的四口圆底烧瓶，分别向其中加入吡啶60ml和KRN7k-5(21.8g，49.9mmol)搅拌溶解。
冰浴至0℃，缓慢滴加苯甲酰氯(56.1g，400mmol)，缓慢升温，反应液变浑浊，滴完，室温搅拌，TLC监测。
反应完全后，加入9.6mL(6eq)甲醇淬灭反应，负压浓缩至干。
加二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗，5％柠檬酸水洗，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤负压浓缩至干得油状液体，粗产物加入200ml无水乙醇，搅拌析出固体，过滤得得KRN7k-6，为白色固体，产量19.5g，产率60.2％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.3Hz,1H),7.99(dd,J＝7.2,1.4Hz,3H),7.64–7.44(m,4H),7.37(dd,J＝7.8,2.8Hz,4H),7.04(t,J＝16.5Hz,2H),6.04–5.74(m,1H，2-H),5.19(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H，3-H),4.88–4.86(m,2H，1-H，4-H),4.35–4.25(m,2H，6a-Hand 6b-H),3.60(d,J＝14.1Hz,1H，5-H),2.31(s,3H),1.16(d,J＝4.5Hz,9H，CH 3-tBu-Si),1.00–0.93(m,9H，CH 3-tBu-Si).MS(ESI):657.4(C35H42O7SSi,[M+Na]+)。
实施例2、脂肪链部分合成
步骤1.化合物L2的制备
取一个500mL的四口烧瓶，将植物鞘氨醇(20g，63mmol)溶于四氢呋喃/甲醇(3：1)400ml中，加入1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐(14.5g，69.3mmol)，
搅拌溶解后加入碳酸钾(26g，189mmol)和无水硫酸铜(0.8g，5mmol)继续反应至反应完成，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，负压浓缩除去溶剂，甲醇溶解，过滤除去无机物，负压浓缩得固体粗品，粗产物用薄层层析法进行分离纯化(DCM:MeOH＝10:1)，得白色固体L2。产量19.2g，产率89％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ3.82–3.67(m,1H),3.58(dd,J＝20.3,9.1Hz,1H),3.51(dt,J＝25.0,9.9Hz,1H),3.41–3.22(m,2H，H-3,H-4),1.65–1.33(m,2H，CH 2),1.24(s,24H，12×CH 2),0.86(t,J＝6.7Hz,3H，CH 3).MS(ESI):685.3(C18H37N3O3,[2M-H]-)。
步骤2.化合物L3的制备
取一个250mL的四口烧瓶，将L2(15g，43.7mmol)溶于吡啶150ml中，搅拌溶解；
加入二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.56g，4.4mmol)，氮气保护缓慢滴加叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)(13.7g，48mmol)，自然升温，滴完控制体系温度为30-35℃，余温搅拌过夜，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，加入0.1eq甲醇淬灭反应，减压浓缩得油状物，乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤至pH中性。无水硫酸钠干燥，过滤，负压浓缩得油状物L3，未经纯化直接下一步。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(dd,J＝19.2,6.0Hz,4H),7.51–7.32(m,6H),4.09–3.97(m,1H),3.96–3.83(m,1H),3.65(d,J＝32.7Hz,2H),3.56(dd,J＝9.7,5.5Hz,1H),1.55(d,J＝8.5Hz,2H),1.27(d,J＝9.7Hz,24H),1.08(s,9H),0.89(d,J＝6.5Hz,3H).MS(ESI):582.5(C34H55N3O3Si,[M+H]+)。
步骤3.化合物L4的制备
取一个500mL的四口烧瓶，加入L3(25.4g，43.7mmol)，吡啶(250ml)，DMAP(0.5g，4.4mmol)，氮气保护下降温，控制反应体系温度0-5℃，缓慢滴加苯甲酰氯。
滴完，内温升至0℃，撤去冰浴，室温反应过夜，反应结束后，滴加6eq甲醇淬灭反应，反应液负压浓缩得油状物，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性。
无水硫酸钠干燥，过滤，负压浓缩得油状物化合物L4，未经纯化直接下一步。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(dd,J＝8.6,7.3Hz,4H),7.89(dd,J＝15.7,7.2Hz,4H),7.61–7.51(m,6H),7.42(t,J＝8.5Hz,6H),5.56–5.44(m,2H),3.98(q,J＝6.5Hz,1H),3.85(dd,J＝11.7,5.1Hz,2H),1.89–1.73(m,2H),1.23(d,J＝10.6Hz,24H),1.04(s,9H),0.88(t,J＝5.6Hz,3H).MS(ESI):812.5(C48H63N3O5Si,[M+Na]+)。
步骤4.化合物L5的制备
取一个500mL的氟化瓶，加入L4(34.5g，43.7mmol)，170mL四氢呋喃，170mL吡啶，冰浴至0℃，分批加入104ml氟化氢吡啶溶液(反应放热)，控制反应体系温度10-45℃；反应体系最高升温至40℃，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠调pH到6-7，分层后，加入1.5M盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性。
无水硫酸钠干燥，过滤，负压浓缩得油状物粗品L5，粗产物用薄层层析法进行分离纯化(EA:PE＝10:1)得白色固体L5，产量12g，L2出发到L5的综合收率50％。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.07–7.95(m,4H),7.62–7.51(m,2H),7.49–7.40(m,4H),5.62–5.44(m,2H),4.05–3.92(m,1H),3.87–3.70(m,2H),2.01–1.86(m,2H),1.38–1.17(m,24H),0.88(t,J＝7.1Hz,3H).MS(ESI):552.5(C32H45N3O5,[M+H]+)。
实施例3、偶联-还原合成新化合物中间体
步骤1.化合物KRN7k-7的制备
取一个250mL的四口烧瓶，加入KRN7k-6(5.0g，7.9mmol)，L5(3.1g，5.6mmol)，N-碘代丁二酰亚胺(5.0g，22.4mmol)，2.5g分子筛活化粉干燥，二氯甲烷75mL溶解，溶液为淡红色溶液；
氮气保护下冰浴降温至0℃，加入三氟甲磺酸(0.25g，1.7mmol)，溶液迅速变成红色溶液，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，三乙胺淬灭，负压浓缩得油状物，粗产物用薄层层析法进行分离纯化(EA:PE＝10:1)得油状液体KRN7k-7，产量2.9g，收率48.7％。
1H NMR(CDCl 3):d 7.92–8.04(10H,m,Ar–H),7.27–7.64(10H,m,Ar–H),5.80(1H,dd,H-2,J 2,1＝3.6),5.55(1H,dd,J 3,2＝10.6,J 3,4＝2.8Hz,H-3),5.42–5.50(2H,m,H-3Cer,H-4Cer),5.31(1H,d,H-1),4.87(d,1H,H-4),4.13–4.27(m,3H,H-2Cer,H-6a,,H-6b),4.00–4.13(m,1H,H-5),3.85–3.90(m,1H,H-1a Cer),3.68(dd,1H,J 1a,1b＝10.4,J 1b,2＝8.6Hz,H-1b Cer),1.86(m,2H,H-5a Cer,H-5b Cer),1.24(m,24H,CH 2),0.96,1.12(2s,18H,2*t-Bu),0.88(3H,t,CH 3)；MS(ESI):1084.5(C60H79N3O12Si,[M+Na]+。
步骤2.化合物KRN7k-8的制备
取一个100mL的圆底烧瓶，向其中加入KRN7k-7(2.5g，2.4mmol)溶于25mL二氯甲烷，37.5mL甲醇，冰浴至0℃；
加入六水氯化镍(3.4g，14.1mmol)，保温搅拌半小时后再加入化合物硼氢化钠(0.9g，23.6mmol)，常温搅拌并用TLC监测。
反应完全后，加入硅胶负压浓缩得固体。
粗产物用薄层层析法进行分离纯化(PE:EA＝15:1)，得目标化合物KRN7k-8。
产物KRN7k-8为淡黄色液体，产量1.46g，产率60％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08–7.84(m,10H),7.46–7.31(m,10H),5.78–5.71(m,1H),5.49–5.44(m,1H),5.44–5.30(m,2H),5.18(dt,J＝17.5,8.8Hz,1H),4.85(d,J＝12.6Hz,1H),4.21(dq,J＝21.1,10.6Hz,3H),4.11(s,1H),3.85(s,1H),3.69(d,J＝11.6Hz,1H),1.80(d,J＝1.8Hz,2H),1.31(d,J＝19.2Hz,24H),1.18–1.00(m,18H),0.93–0.91(m,3H).MS(ESI):1035(C60H81NO12Si,[M+H]+)。
实施例4、合成KRN7000
步骤1.化合物KRN7k-9的制备
取一个50mL的四口烧瓶，加入蜡酸(0.71g，1.8mmol)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(2.3g，11.8mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.6g，11.8mmol)，四氢呋喃12mL，氮气保护下冰浴降温至0℃，保温搅拌30分钟；
再将KRN7k-8(1.23g，1.2mmol)溶于12mL四氢呋喃，加入二异丙基乙二胺(DIPEA)(0.46g，3.6mmol)混合，再将混合后的溶液滴加到蜡酸溶液中，继续保温0-5℃反应30分钟，转移到室温搅拌过夜，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，水洗，饱和食盐水洗至中性，负压浓缩得粗品，粗产物用薄层层析法进行分离纯化(PE:EA＝10:1)得油状液体KRN7k-9，产量0.84g，收率50％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.16–7.83(m,10H),7.51–7.31(m,10H),6.53(d,J＝9.4Hz,1H),5.71(dd,J＝10.6,3.7Hz,1H),5.63–5.48(m,2H),5.20(d,J＝3.6Hz,1H),4.84(d,J＝2.9Hz,1H),4.64–4.56(m,1H),4.30–4.18(m,2H),3.94(s,1H),3.88–3.74(m,1H),3.68(dd,J＝11.2,4.7Hz,1H),2.26–2.16(m,3H),1.87(dd,J＝17.1,10.3Hz,2H),1.31–1.22(m,76H),0.87(dt,J＝6.9,3.3Hz,9H).MS(ESI):1414(C86H131NO13Si,[M+H]+)。
步骤2.化合物KRN7k-10的制备
/>
取一个25mL的四口烧瓶，将KRN7k-9(0.8g，0.565mmol)溶于8mL四氢呋喃中，冰浴至0℃；
滴加氢氟酸吡啶2.4mL溶液至反应液中，滴完升至室温搅拌至反应完成，并用TLC监测反应进度。
反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应至中性，负压浓缩至只有水层，加入二氯甲烷搅拌15分钟，分液取有机层，饱和食盐水洗涤两次至pH中性。
负压浓缩得化合物粗品粗产物，用薄层层析法进行分离纯化(PE:EA＝2:1)得油状液体KRN7k-10，产量0.57g，产率79％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07–7.36(m,21H),5.98–5.74(m,1H),5.61(d,J＝20.7Hz,2H),5.23(s,1H),4.70(s,1H),4.58(dd,J＝16.9,9.4Hz,1H),4.44–4.29(m,3H),4.21(t,J＝6.7Hz,1H),4.14–4.04(m,2H),4.03(d,J＝15.5Hz,2H),2.30(dd,J＝16.8,9.2Hz,3H),1.74–1.66(m,5H),1.31–1.21(m,79H),0.97–0.88(m,7H).MS(ESI):1273.8(C78H115NO13,[M+H]+)。
步骤3.终产品KRN7000的制备
取一个25mL的四口烧瓶，将KRN7k-10(0.5g，0.4mmol)溶于10mL甲醇中，冰浴至0℃，反应物未溶解；
滴加甲醇钠/甲醇溶液调pH＝10，滴完升温至室温继续反应，并用TLC监测反应进度。
反应完，加入氯仿溶解，过滤，氯仿漂洗，负压浓缩得固体粗品，加入5ml甲醇搅拌出固体，过滤得粗品，再加入5ml石油醚搅拌30分钟，过滤出白色固体KRN7000，产量0.27g，产率80.2％。
1H NMR(400MHz,Pyr)δ8.42(d,J＝8.6Hz,1H),5.56(d,J＝3.6Hz,1H),5.25(d,J＝4.3Hz,1H),4.72–4.61(m,2H),4.50(dd,J＝12.7,6.7Hz,2H),4.47–4.34(m,4H),4.30(s,2H),2.42(t,J＝7.3Hz,2H),2.27(s,1H),1.89(s,2H),1.81(dd,J＝14.5,7.4Hz,2H),1.66(s,1H),1.27(d,J＝26.2Hz,64H),0.86(t,J＝6.4Hz,6H).MS(ESI):880.8(C50H99NO9,[M+Na]+)。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种合成KRN7000的方法，所述的方法包括如下反应步骤：
(1)合成糖砌块嵌段并进行羟基保护；所述的经羟基保护的糖砌块嵌段为式(2)所示的化合物KRN7k-6，
所述的化合物KRN7k-6的制备过程如下反应式所示，
具体反应步骤如下：
(1-1)D-吡喃葡萄糖为原料，将D-吡喃葡萄糖溶于乙酸酐中，加入吡啶反应后制得白化合物KRN7k-2；
KRN7k-2：
(1-2)KRN7k-2溶于二氯甲烷中，加入对甲基苯硫酚后缓慢滴加三氟化硼乙醚，反应后制得化合物KRN7k-3；
KRN7k-3：
(1-3)甲醇中加入KRN7k-3，缓慢滴加甲醇钠/甲醇溶液至pH在9-10之间，反应后加入体积比10：1的石油醚：乙酸乙酯搅拌出固体，过滤，制得化合物KRN7k-4；
KRN7k-4：
(1-4)吡啶中加入KRN7k-4，缓慢滴加二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)，反应后制得油状化合物KRN7k-5；
KRN7k-5：
(1-5)吡啶中加入KRN7k-5，缓慢滴加苯甲酰氯，反应完全后，加入甲醇淬灭，加入无水乙醇搅拌析出固体，过滤后制得化合物KRN7k-6；
(2)合成脂肪链嵌段；所述的脂肪链嵌段为式(3)所示的化合物L5，
所述的化合物L5的制备过程如下反应式所示，
具体反应步骤如下：
(2-1)植物鞘氨醇溶于体积比为3：1的四氢呋喃/甲醇中，加入1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐，搅拌溶解后加入碳酸钾和无水硫酸铜继续反应至反应完成得化合物L2；
L2：
(2-2)化合物L2溶于吡啶中，加入DMAP，氮气保护缓慢滴加TBDPSCl，反应结束后加入甲醇淬灭反应得油状化合物L3；
L3：
(2-3)化合物L3中加入吡啶、DMAP，氮气保护下缓慢滴加苯甲酰氯，反应结束后加甲醇淬灭反应得油状化合物L4；
L4：
(2-4)化合物L4加入四氢呋喃、吡啶，缓慢加入氟化氢吡啶溶液，反应结束后得化合物L5；
(3)将所述糖砌块嵌段和所述脂肪链嵌段进行偶联-还原成下式(1)所示的化合物KRN7k-9，从化合物KRN7k-9出发，进一步合成KRN7000；
步骤(3)的反应式为，
具体反应步骤如下：
(3-1)KRN7k-6中加入L5，N-碘代丁二酰亚胺，分子筛活化粉，超干二氯甲烷溶解后，加入三氟甲磺酸，反应结束后三乙胺淬灭得油状液体KRN7k-7；
KRN7k-7：
(3-2)KRN7k-7溶于二氯甲烷，甲醇，加入六水氯化镍，冰浴搅拌后再加入硼氢化钠，反应得目标化合物淡黄色液体KRN7k-8；
KRN7k-8：
(3-3)蜡酸、EDCI、HOBT、四氢呋喃溶剂混匀后氮气保护下冰浴；KRN7k-8、DIPEA加入等体积四氢呋喃溶剂混合；再将混合后的KRN7k-8溶液滴加到蜡酸溶液中，反应结束后得油状液体KRN7k-9；
(3-4)将KRN7k-9溶于四氢呋喃中，冰浴滴加氢氟酸吡啶溶液，脱除硅叉保护基搅拌至反应完成得油状液体KRN7k-10；
KRN7k-10：
(3-5)将KRN7k-10溶于甲醇中，冰浴滴加甲醇钠/甲醇溶液调pH，反应完得终产品KRN7000。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
(1-1)中，D-吡喃葡萄糖与乙酸酐的用量比为摩尔比1：10，乙酸酐与吡啶的用量比为体积比1：1，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用饱和碳酸氢钠洗涤，质量百分比5％的柠檬酸水洗，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，负压浓缩，加入石油醚搅拌析出固体，过滤得固体，进行精制；
(1-2)中，KRN7k-2与对甲基苯硫酚、三氟化硼乙醚的用量比为摩尔比5：6：9，反应过程惰性气体保护，温度0-5℃；产物以饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤并以EA+PE进行重结晶精制；
(1-3)中，反应产物加甲醇洗涤干净的H+阳离子树脂调pH到7，浓缩后加入体积比1：10的石油醚、乙酸乙酯搅拌析出固体，过滤，精制；
(1-4)中，二叔丁基硅基双(三氟甲烷磺酸)的摩尔量略多于KRN7k-4的摩尔量，反应过程冰浴下进行，反应产物用乙酸乙酯抽提，并用水洗，饱和食盐水洗涤精制；
(1-5)中，KRN7k-5与苯甲酰氯的用量比为摩尔比1：8，反应完全后，加入甲醇淬灭反应，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗，5％柠檬酸水洗，水洗，食盐水洗，浓缩后得油状粗产物，加入无水乙醇搅拌析出固体，过滤，精制；
(2-1)中，植物鞘氨醇与1H-咪唑磺酰叠氮盐酸盐、碳酸钾、无水硫酸铜的用量比为摩尔比13：14：38：1，反应产物以甲醇溶解后薄层层析法纯化精制；
(2-2)中，L2与DMAP、TBDPSCl的用量比为摩尔比10：1：11，产物以乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤至pH中性，过滤，负压浓缩精制；
(2-3)中，L3与吡啶、DMAP的用量比为摩尔比10：40：1，产物负压浓缩得油状物，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩进行精制；
(2-4)中，40mmol L4中加入170mL四氢呋喃，170mL吡啶，冰浴至0℃，缓慢加入104ml氟化氢吡啶溶液，控制反应体系温度10-45℃；反应结束后，乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠调pH到6-7，分层后，加入1.5M盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性，干燥，过滤，负压浓缩得油状物粗品L5，粗产物用薄层层析法进行分离纯化精制；
(3-1)中，KRN7k-6、L5、N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸的用量比为摩尔比14：10：40：3，反应在氮气保护下冰浴进行，反应结束后，三乙胺淬灭，负压浓缩得油状物，粗产物用薄层层析法精制；
(3-2)中，KRN7k-7、六水氯化镍、硼氢化钠的用量比为1：6：10；反应完全后，加入硅胶负压浓缩得固体，粗产物用薄层层析法进行分离纯化；
(3-3)中，蜡酸、EDCI、HOBT、KRN7k-8、DIPEA摩尔比为3：20：20：2：6；反应体系温度0-5℃，反应结束后水洗，饱和食盐水洗至中性，负压浓缩后用薄层层析法进行精制。
CN202210672139.5A 2022-06-14 2022-06-14 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用 Active CN115093450B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210672139.5A CN115093450B (zh) 2022-06-14 2022-06-14 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用
PCT/CN2023/099915 WO2023241571A1 (zh) 2022-06-14 2023-06-13 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210672139.5A CN115093450B (zh) 2022-06-14 2022-06-14 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115093450A CN115093450A (zh) 2022-09-23
CN115093450B true CN115093450B (zh) 2024-02-09

Family

ID=83290474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210672139.5A Active CN115093450B (zh) 2022-06-14 2022-06-14 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115093450B (zh)
WO (1) WO2023241571A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115093450B (zh) * 2022-06-14 2024-02-09 上海安奕康生物科技有限公司 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113292615A (zh) * 2020-02-24 2021-08-24 山东大学 一种血清型ⅷ型b族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用
CN114085255A (zh) * 2020-08-24 2022-02-25 山东大学 一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用
CN115490739A (zh) * 2022-11-02 2022-12-20 山东大学 一种糖脂化合物及其制备方法和用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106674297A (zh) * 2015-11-11 2017-05-17 中国科学院生态环境研究中心 具有抗癌活性的新型krn7000类似物及合成方法
CN107880082A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 复旦大学 一种6”‑o‑功能基‑krn7000的制备方法
CN111760021B (zh) * 2020-05-18 2023-06-16 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有α-半乳糖神经酰胺类似物与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
WO2023070223A1 (en) * 2021-11-01 2023-05-04 Université de Montréal Synthetic glycoconjugate vaccine prototype against streptococcus suis
CN115093450B (zh) * 2022-06-14 2024-02-09 上海安奕康生物科技有限公司 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113292615A (zh) * 2020-02-24 2021-08-24 山东大学 一种血清型ⅷ型b族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用
CN114085255A (zh) * 2020-08-24 2022-02-25 山东大学 一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用
CN115490739A (zh) * 2022-11-02 2022-12-20 山东大学 一种糖脂化合物及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Klebsiella pneumoniae O1 and O2ac antigens provide prototypes for an unusual strategy for polysaccharide antigen diversificationBiosynthesis of Klebsiella O-antigens";Steven D. Kelly，et al;《Royal society of chemistry》;第294卷(第28期);第 10863-10876页。 *
"Novel synthesis of α-galactosyl-ceramides and confirmation of their powerful NKT cell agonist activity";Adrianne Lee et al;《Carbohydrate Research》;第341卷(第17期);第2785-2798页。 *
"Synthesis and biological activity of hydroxylated analogues of KRN7000 (a-galactosylceramide)";Masao Shiozaki et al;《Carbohydrate Research》;第23卷;第46-66页。 *
"Synthesis of RCAI-172 (C6 epimer of RCAI-147) and its biological activity";Masao Shiozaki，et al;《Bioorganic & Medicinal Chemistry》;第22卷(第2期);第827-833页。 *
"外周血循环肿瘤细胞对卵巢癌患者临床病理特征和预后关系的Meta分析";平文萍，等。;《现代妇产科进展》;第第28卷卷(第第11期期);第812-817页。 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023241571A1 (zh) 2023-12-21
CN115093450A (zh) 2022-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6259887B2 (ja) グリコスフィンゴ脂質の調製及びその使用の方法
EP2536737B1 (en) A method for preparation of the tetrasaccharide lacto-n-neotetraose (lnnt) containing n-acetyllactosamine
Fan et al. Synthesis of α-galactosyl ceramide and the related glycolipids for evaluation of their activities on mouse splenocytes
US20140323705A1 (en) Manufacture of lacto-n-tetraose
EP2678348A1 (en) Novel glycosyl phosphites
CA2789821A1 (en) Production of 6'-o-sialyllactose and intermediates
US20110245488A1 (en) Process for the synthesis of l-fucosyl di- or oligo-saccharides and novel 2,3,4 tribenzyl-fucosyl derivatives intermediates thereof
CN115093450B (zh) 一种化合物及其在合成免疫佐剂krn7000中的应用
Huang et al. Synthesis of serine-based glycolipids as potential TLR4 activators
CN106674297A (zh) 具有抗癌活性的新型krn7000类似物及合成方法
Yen et al. Concise synthesis of α-galactosyl ceramide from d-galactosyl iodide and d-lyxose
Lin et al. Rearrangement Reactions in the Fluorination of d-Glucopyranoside at the C-4 Position by Dast
EP0204344A2 (en) Sialosylcerebrosides and a preparation method thereof
CN109627270B (zh) 一种绿脓假单胞菌o11血清型o抗原寡糖的化学合成方法
DK2920194T3 (en) Process for the preparation of alpha-glactosyl-ceramide compounds
CN114085255B (zh) 一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用
Liang et al. Efficient one-pot syntheses of α-D-arabinofuranosyl tri-and tetrasaccharides present in cell wall polysaccharide of Mycobacterium tuberculosis
Sun et al. Design and synthesis of new krn7000 analogues
CN117069782A (zh) 一种具有α-立体选择性的糖苷类化合物通用关键中间体的制备方法
JP2629852B2 (ja) グリコシル化合物の製造方法
JP2020158489A (ja) 二環性ウロソン酸誘導体の製造方法およびウロソン酸誘導体の製造方法
Evans et al. Synthesis and immunostimulatory activity of two α-S-galactosyl phenyl-capped ceramides
CN114891049A (zh) 基于邻炔基苄醚类糖基供体的高效糖基化方法
JP2560250B2 (ja) 天然型スフィンゴシン類の製造方法とその合成中間体
JPH0558639B2 (zh)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant