CN114085255A - 一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用 - Google Patents

一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O‑抗原寡糖片段及其制备方法与应用。本发明制备的寡糖片段为苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O‑抗原四糖重复单元，是以各种保护的单糖模块为原料，通过顺序糖基化策略进行糖苷化反应来制备得到的，其中的寡糖片段的还原端吡喃糖基的C‑1位是由氨基烷烃链修饰，可与蛋白、脂质、多肽等缀合进而制备成寡糖缀合物，然后进行相关免疫学研究。本发明的制备方法设计合理，可操作性强，分离简单，产品收率高，纯度好。通过合成不同还原端的多糖重复片段以进行免疫学研究，对于研发相应的克罗诺杆菌糖类疫苗具有重要意义。

Description

一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段及其制备方法与应用，属于抗克罗诺杆菌疫苗研制技术领域。
背景技术
苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacter turicensis)，是一种兼性厌氧及呈棒状的革兰氏阴性病原菌，隶属于克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)。1961年，Urmenyi等首次报道了克罗诺杆菌的感染，随后此菌受到了科学家们的广泛关注(Joseph,S.etal.J.Clin.Microbiol.2012,50(9),3031–3039)。克罗诺菌属是一种在食品和环境中广泛存在的条件致病菌，可导致免疫力低下的各个不同年龄层人群(例如HIV/AIDS患者)感染疾病，对新生儿，尤其是早产儿，低体重儿的威胁最大。人们被其感染会导致患有坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症，并带来严重的神经系统后遗症，严重威胁着人类的生命健康安全，尤其是对感染后的新生儿造成较高的死亡率(达40-80％)(Bowen,A.B.et al,Emerg.Infect.Dis.2006,12(8),5)。目前对于克罗诺杆菌的威胁，人们缺乏有效的治疗和预防手段。
O-抗原，或称O-多糖，是脂多糖(LPS)的最外层部分，由数十个相同的寡糖单位组成。苏黎世克罗诺杆菌脂多糖O-抗原是苏黎世克罗诺杆菌脂多糖(LPS)的高度特异性抗原部分，亦是宿主抗体反应靶向的主要抗原，可被免疫系统和噬菌体先天性识别。而多糖与蛋白共价结合形成糖缀合物后可以大幅度加强其免疫原性。同时，糖缀合物疫苗不仅产生B细胞免疫，还诱导T细胞免疫，产生长久又有效的免疫保护效果。所以，制备苏黎世克罗诺杆菌脂多糖O-抗原的糖缀合物疫苗具有预防和治疗苏黎世克罗诺杆菌感染疾病的巨大潜力。目前使用的糖缀合物疫苗多从细菌细胞中提取得到多糖，但提取获得的细菌多糖结构具有微观不均一性。而为了克服从细菌提取的多糖不均一这一问题，我们可通过合成的方式来获得结构明确、组成均一的O-抗原糖链衍生物，再将其与载体偶连制备成糖缀合物疫苗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段及其制备方法与应用，以各种保护的单糖模块为原料，采用顺序糖链组装策略来制备苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段，其中寡糖片段的还原端吡喃糖基的C-1位是由氨基烷烃链修饰的。
术语说明：
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
-All：烯丙基；-Bn：苄基；-Nphth：邻苯二甲酰亚胺基；-Pico：吡啶-2-甲酰基；-STol：对甲苯硫基；TLC：薄层层析色谱；1H NMR：核磁共振氢谱；13C NMR：核磁共振碳谱。
化合物a：对甲基苯基2,3-二羟基-4-氧-苄基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷；
化合物b：2-叠氮-1-烷基2-邻苯二甲酰亚胺基-4,6-二-氧-亚苄基-3-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷；
化合物c：2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖；
化合物d：对甲基苯基1-硫-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明通过如下的技术方案来实现：
一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段，其结构式如式I所示：
Figure BDA0002646992300000021
其中，n为1-5的整数。
本发明中的5型脂多糖O-抗原寡糖片段是自然条件下脂多糖O-抗原的四糖重复片段衍生物，其还原端吡喃糖基的C-1位是由氨基烷烃链修饰，可与蛋白质或脂质等缀合进而制备成寡糖缀合物。本发明中的寡糖片段为5型脂多糖O-抗原的寡糖重复单元。
本发明中，优选的苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段的名称和结构式如表1所示。
表1.苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段的名称和结构式
Figure BDA0002646992300000022
上述苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1的制备方法，包括步骤如下：
(1)以化合物a为原料经醚化反应、酯化反应制得糖基供体1；
Figure BDA0002646992300000023
(2)以化合物b为原料经转位反应制得糖基受体2，其中n是1-5任意一个整数；
Figure BDA0002646992300000031
(3)化合物c与三氯乙腈经亲核加成反应制得糖基供体3；
Figure BDA0002646992300000032
(4)取化合物d，经苄基化保护，制得糖基供体4；
Figure BDA0002646992300000033
(5)取糖基供体1与糖基受体2，经偶联反应，制得中间产物5；
Figure BDA0002646992300000034
(6)取中间产物5脱除Pico基团，制得中间产物6；
Figure BDA0002646992300000035
(7)取糖基供体3与中间产物6，经偶联反应，制得中间产物7；
Figure BDA0002646992300000036
(8)取中间产物7脱除All基团，制得中间产物8；
Figure BDA0002646992300000041
(9)取糖基供体4与中间产物8，经偶联反应，制得中间产物9；
Figure BDA0002646992300000042
(10)取中间产物9脱除保护基，制得到苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1；
Figure BDA0002646992300000043
根据本发明优选的，步骤(1)中所述醚化反应为：将化合物a溶解于二氯甲烷，加入四丁基碘化铵和烯丙基溴，在碱性环境下冰水浴反应3-5小时，分离得醚化产物；
优选的，所述化合物a和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物a、四丁基碘化铵、烯丙基溴的摩尔比为1:(1-2):(1-2)，所述碱性环境是向反应体系中加入质量浓度8-12％的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液和二氯甲烷的体积比为1:(0.5-1.5)；最优选的，所述化合物a和二氯甲烷的质量体积比为1:10g/mL，所述化合物a、四丁基碘化铵、烯丙基溴的摩尔比为1:1:1.5，所述氢氧化钠溶液和二氯甲烷的体积比为1:1。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述酯化反应为：将醚化产物溶解于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-吡啶甲酸以及催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温反应，搅拌过夜，分离得糖基供体1；
优选的，所述醚化产物和二氯甲烷的质量体积比为1:(4-6)g/mL，所述醚化产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2-吡啶甲酸和摩尔比为1:(1-2):(1-2)；最优选的，所述醚化产物和二氯甲烷的质量体积比为1:5g/mL，所述醚化产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2-吡啶甲酸和摩尔比为1:1.5:1.3。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述转位反应为：将化合物b溶解于二氯甲烷中，加入三乙基硅烷、三氟化硼乙醚，氩气保护下冰水浴反应5-12小时，分离得糖基受体2；
优选的，所述化合物b和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物b和三乙基硅烷的质量体积比为1:(4-6)g/mL，所述三乙基硅烷和三氟化硼乙醚的体积比为(5-15):1。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述亲核加成反应为：将化合物c溶解于二氯甲烷中，加入三氯乙腈和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，室温搅拌反应20-40分钟，分离得糖基供体3；
优选的，所述化合物c和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物c和三氯乙腈的摩尔比1:(2-4)，所述二氯甲烷和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的体积比为(150-200):1；最优选的，所述化合物c和二氯甲烷的质量体积比为1:10g/mL，所述化合物c和三氯乙腈的摩尔比1:3。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述苄基化保护的步骤为：将化合物d溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入氢化钠反应直至不出气泡，滴加溴化苄，室温反应，分离得糖基供体4；
优选的，所述化合物d与N，N-二甲基甲酰胺的质量体积比为1:(20-30)g/mL，所述化合物d和氢化钠的摩尔比为1:(5-10)，所述化合物d和溴化苄的摩尔比为1:(5-10)；最优选的，化合物d与二甲基甲酰胺的质量体积比为1:26g/mL，所述化合物d和氢化钠的摩尔比为1:8，所述化合物d和溴化苄的摩尔比为1:6。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述偶联反应为：将糖基供体1与糖基受体2溶解于1,2-二氯乙烷中，加入分子筛，将反应体系降温至-35～-25℃，加入碘代琥珀酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸(TfOH)并缓慢升温至-5～5℃，反应0.5-1.5小时，得中间产物5；
优选的，所述糖基供体1与糖基受体2的摩尔比为(2-4):1，所述糖基供体1和1,2-二氯乙烷的质量体积比为1:(30-40)g/mL，所述糖基供体1、碘代琥珀酰亚胺(NIS)、三氟甲磺酸(TfOH)的摩尔比为(2-3):(6-7):1，所述分子筛为
Figure BDA0002646992300000051
分子筛。
根据本发明优选的，步骤(6)中所述脱除Pico基团的步骤为：将中间产物5溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，加入醋酸铜，室温搅拌反应2-4个小时，分离得中间产物6；
优选的，所述中间产物5与混合溶剂的质量体积比为1:(150-200)g/mL，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为(10-15):1，所述中间产物5与醋酸铜的摩尔比为1:(1-2)；最优选的，所述中间产物5与醋酸铜的摩尔比为1:1.7。
根据本发明优选的，步骤(7)中所述偶联反应为：将中间产物6和糖基供体3溶解于二氯甲烷，加入分子筛，将反应体系降温至-80～-75℃，加入TfOH并缓慢升温至-45～-35℃，搅拌反应0.5-1.5小时，分离得中间产物7；
优选的，所述糖基供体3和中间产物6的摩尔比为(1.5-2.0):1，所述中间产物6和二氯甲烷溶的质量体积比为1:(20-30)g/mL，所述中间产物6和TfOH的摩尔比为(8-9):1，所述分子筛为
Figure BDA0002646992300000052
分子筛。
根据本发明优选的，步骤(8)中所述脱除All基团的步骤为：将中间产物7溶解于四氢呋喃，与铱复合物溶液混合，室温搅拌2-4小时后，加入NIS和去离子水，室温搅拌0.5-1.5小时，分离得中间产物8；
优选的，所述中间产物7和铱复合物的摩尔比为(1-2):1，所述中间产物7和NIS的摩尔比为1:(5-6)。
根据本发明优选的，步骤(9)中所述偶联反应为：将糖基供体4和中间产物8溶解于乙醚和二氯甲烷的混合溶剂，加入分子筛，将反应体系降温至-105～-95℃，加入NIS和TfOH并缓慢升温至-65～-55℃，搅拌反应1-3个小时，分离得中间产物9；
优选的，所述糖基供体4和中间产物8的摩尔比为(2.0-4.0):1；所述中间产物8和混合溶剂的质量体积比为1:(70-80)g/mL，所述乙醚和二氯甲烷的体积比为4:1，所述中间产物8、NIS、TfOH的摩尔比为1:(8-9):(2-3)，所述分子筛为
Figure BDA0002646992300000061
分子筛。
根据本发明优选的，步骤(10)中所述脱除保护剂的步骤为：将中间产物9溶解于乙醇，加入水合肼，70-90℃回流反应至NPhth基团脱除干净，分离旋干得到浆状物，再将浆状物溶解于吡啶，加入醋酸酐，室温搅拌反应过夜，旋干得到固体化合物；然后将固体化合物溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂,加入甲醇稀释的甲醇钠溶液，调节pH至10,室温搅拌反应5-7小时，过滤旋干后，将旋干后的化合物溶解于甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶液中，加入氢氧化钯，在氢气氛围下对苄基和叠氮基进行氢解，氢解完毕后，分离得苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1。
优选的，所述中间产物9和乙醇的质量体积比为1:(400-500)g/mL，所述中间产物9和吡啶的质量体积比为1:(50-100)g/mL，所述中间产物9与二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的质量体积比为1:(50-100)g/mL，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1，所述中间产物9与甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶液的质量体积比为1:(100-200)g/mL，其中甲醇、二氯甲烷和去离子水的体积比为10:5:1。
优选的，所述中间产物9和水合肼的质量体积比为1:(40-50)g/mL，所述中间产物9和醋酸酐的质量体积比为1:(40-50)g/mL，所述中间产物9和氢氧化钯的摩尔比为1:(2-3)。
上述苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段在制备抗苏黎世克罗诺杆菌疫苗中应用。
本发明中未详细说明的实验步骤均按照本技术领域常规操作进行。
本发明的技术特点和有益效果：
1、本发明提供了一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段，该寡糖片段是一种自然条件下脂多糖O-抗原的四糖重复片段衍生物，是以各种保护的单糖模块为原料，以鼠李糖为核心依次进行糖苷化反应来制备得到的，其中寡糖片段的还原端吡喃糖基的C-1位是由氨基烷烃链修饰，可与蛋白或脂质等缀合进而制备成寡糖缀合物，然后进行相关免疫学研究，进行疫苗制备。
2、本发明合成的O-抗原寡糖片段具备免疫原性，是苏黎世克罗诺杆菌脂多糖的高度特异性抗原部分，亦是宿主抗体反应靶向的主要抗原，可被免疫系统和噬菌体先天性识别。
3、本发明的制备方法设计合理，可操作性强，分离简单，产品收率高，纯度好。通过合成不同还原端的寡糖片段以进行免疫学研究，对于研发相应的苏黎世克罗诺杆菌疫苗具有重要意义。
附图说明
图1是苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1的1HNMR谱图；
图2是苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1的13C NMR谱图；
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃；本发明中所涉及药品均为普通市售产品，未特别说明的化合物都是可商购或可参照文献制备的物质，且未详细说明的步骤均按本领域常规操作进行。
实施例中涉及的强酸性阳离子交换树脂的类型为AmberliteIR-120，或Amberlyst-15。
实施例中涉及的化合物a、b、c、d均为本技术领域常规的单糖糖苷，可按照本领域常规方法制备得到，也可从市场定制购得。
实施例1：2-氨基-1-乙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[2-氮-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖基-(1→3)-]-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-氮-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(CT-1)的制备
苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1合成路线如下：
Figure BDA0002646992300000071
上述合成路线中的反应试剂及反应条件:
(a)NIS,TfOH,1,2-dichloroethane,-30℃,81％,α:β＝1:3；
(b)Cu(OAc)2,CH2Cl2,CH3OH,r.t.,88％；
(c)TfOH,CH2Cl2,-78℃,55％；
(d)NIS,Ir Complex,THF,H2O,r.t.,78％；
(e)NIS,TfOH,-100℃,CH2Cl2,Et2O,70％,onlyα；
(f)i.N2H4,CH3CH2OH,reflux；ii.Ac2O,pyridine,r.t.；iii.CH3ONa,CH3OH,CH2Cl2,r.t.；vi.Pd(OH)2,H2O,CH3OH,CH2Cl2。
(1)对甲苯基4-氧-苄基-2-氧-烯丙基-3-氧-吡啶甲酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷(1)
将对甲苯基2,3-二羟基-4-氧-苄基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷(化合物a，1克,2.78毫摩尔)溶解于10毫升干燥的二氯甲烷中，冰水浴，加入四丁基碘化铵(930毫克,2.78毫摩尔)以及烯丙基溴(0.36毫升,4.17毫摩尔)，再加入质量浓度10％的氢氧化钠溶液10毫升，冰水浴反应4小时直至TLC(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)上原料点消失。后处理：用水以及饱和食盐水萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，柱层析分离(100-200目，石油醚:乙酸乙酯＝10:1、6:1)得到白色固体(867毫克,78％)，然后将得到的白色固体(867毫克，2.17毫摩尔)溶解于4.4毫升干燥的二氯甲烷中，加入EDC(0.63克，3.25毫摩尔)、2-吡啶甲酸(0.35克，2.83毫摩尔)以及催化量的DMAP，室温反应，搅拌过夜。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)检测，产物点出现，原料点消失。后处理：将反应液用乙酸乙酯稀释后，用饱和食盐水萃洗两次，无水Na2SO4干燥,过滤，旋干。柱层析分离(100-200目，石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得到糖基供体1(534毫克,50％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.82–7.09(m,13H,Ph),5.78(ddt,J＝16.8,10.1,5.9Hz,1H,-OCH2CH＝CH2),5.50(dd,J＝9.4,3.3Hz,1H,H-3),5.43(d,J＝1.9Hz,1H,H-1),5.18–5.02(m,2H,-OCH2CH＝CH2),4.87(d,J＝11.0Hz,1H,PhCH2),4.69(d,J＝11.0Hz,1H,PhCH2),4.30(dq,J＝9.4,6.2Hz,1H,H-5),4.20(dd,J＝3.3,1.9Hz,1H,H-2),4.13–3.99(m,2H,-OCH2CH＝CH2),3.88(t,J＝9.4Hz,1H,H-4),2.33(s,3H,SPhCH3),1.38(d,J＝6.2Hz,3H,CH3).
(2)2-叠氮-1-乙基2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3-氧-乙酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)
将2-叠氮-1-乙基2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-4,6-二-氧-亚苄基-3-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物b，n＝1，1.58g，2.84毫摩尔)溶解于干燥的15毫升二氯甲烷中，氩气保护，冰水浴条件下，加入8毫升三乙基硅烷、0.8毫升三氟化硼乙醚溶液。冰水浴反应6小时后，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)检测，产物点出现，原料点消失。后处理：将反应液用乙酸乙酯稀释，加入饱和碳酸氢钠中和，饱和食盐水萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干。柱层析分离(100-200目，石油醚:乙酸乙酯＝3:1、2:1)得到糖基受体2(808mg，51％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.72–6.88(m,14H,Ph),5.22(d,J＝8.1,1H,H-1),4.75–4.49(m,4H,CH2Ph),4.26–4.14(m,2H,H-2,6),3.93(m,1H,CH2CH2N3),3.85–3.74(m,3H,H-3,5),3.65(m,1H,H-4),3.56(m,1H,CH2CH2N3),3.32(m,1H,CH2CH2N3),3.15–3.08(m,1H,CH2CH2N3),2.87(t,J＝2.7Hz,4-OH).
(3)2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖(2,2,2-三氯-乙酰亚胺酯)苷(3)
将2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖(化合物c，485毫克，1.11毫摩尔)溶解于5毫升干燥的二氯甲烷中，冰水浴，加入三氯乙腈(0.33mL，3.24毫摩尔)和0.03毫升的DBU，室温搅拌反应，20分种后TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)监测，产物点生成，原料点消失。后处理：三乙胺中和，减压蒸馏，柱层析分离(100-200目，石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到糖基供体3(450毫克,70％)。
(4)对甲苯基2,3,4,6-四-氧-苄基-1-硫-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)
将对甲苯基1-硫-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物d，1.90g,6.64mmol)在冰水浴以及氩气保护下，加入50毫升的DMF溶解，加入60％的氢化钠(2.1克,52.5毫摩尔)反应约10分钟直至不出气泡，然后缓慢滴加溴化苄(4.72毫升,6.8g,40毫摩尔)，滴加完后撤去冰水浴室温反应，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)检测，产物点生成，原料点消失。后处理：加入冷水猝灭反应，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水萃取两次，无水Na2SO4干燥，过滤旋干，柱层析分离(100-200目，石油醚:乙酸乙酯＝10:1、5:1)得到糖基供体4(3.01g，70％)。
(5)2-叠氮-1-乙基4-氧-苄基-2-氧-烯丙基-3-氧-吡啶甲酰基-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-二氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)
将步骤(1)得到的糖基供体1(300毫克，0.59毫摩尔)和步骤(2)得到的糖基受体2(110毫克，0.20毫摩尔)用10毫升的1,2-二氯乙烷溶解转移至装有已活化的
Figure BDA0002646992300000091
分子筛(1.0克)的反应瓶中，室温下搅拌30分种。然后将反应体系降温至-30℃，加入NIS(300毫克，1.33毫摩尔)和TfOH(2.8微升，0.21毫摩尔)并缓慢升温至0℃，反应1小时后，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)检测出现两种比移值十分接近的两种构型产物点。后处理：加入三乙胺中和反应，抽滤，用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和食盐水各萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干。多次柱层析分离(200-300目，石油醚:乙酸乙酯＝8:1、6:1、5:1)难以分离，得到α:β＝1:3的中间产物5(149毫克，81％)。
(6)2-叠氮-1-乙基4-氧-苄基-3-羟基-2-氧-烯丙基-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-二氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)
将步骤(5)制备的α、β混合的中间产物5(630毫克,0.67毫摩尔)溶解于100毫升二氯甲烷以及7.5毫升甲醇的混合溶液中，加入醋酸铜(230毫克，1.15毫摩尔)，室温下搅拌反应3个小时，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)检测产物点出现，原料点消失。后处理：将反应液用乙酸乙酯稀释，用去离子水和饱和食盐水各萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干。柱层析分离(200-300目，石油醚:乙酸乙酯＝3:1、2:1)可分离得到β构型的中间产物6(367毫克，88％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.77–6.98(m,19H),5.93(m,1H,CH2CH＝CH2),5.30(m,1H),5.25–5.20(m,2H,H-1GlcN),4.88(d,J＝11.0Hz,1H),4.66(s,1H,H-1Rha),4.65–4.61(m,2H),4.60–4.55(m,2H),4.44–4.38(m,2H),4.18(dd,J＝10.8,8.4Hz,1H),4.13–4.06(m,2H),3.96(m,1H),3.78–3.67(m,2H),3.66–3.56(m,2H),3.50(d,J＝3.7Hz,1H),3.43–3.32(m,2H),3.19–3.08(m,3H),2.38(d,J＝9.8Hz,1H),1.26(d,J＝5.3Hz,3H,CH3).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ138.55,138.30,137.35,134.87,130.89,128.81,128.40,128.33,128.28,128.02,127.77,127.66,127.52,127.44,117.51,101.54(C-1Rha),98.04(C-1GlcN),81.96,80.22,78.11,75.18,75.04,74.85,74.23,73.92,73.40,71.34,69.90,68.38,65.55,55.70,50.40,30.93,30.55,29.69,19.17,17.81,13.72.
(7)2-叠氮-1-乙基2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖基-(1→3)-4-氧-苄基-2-氧-烯丙基-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-二氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)
将步骤(3)得到的糖基供体3(364毫克，0.629毫摩尔)和中间产物6(350毫克，0.419毫摩尔)用10毫升二氯甲烷溶解转移至装有已活化的
Figure BDA0002646992300000101
分子筛(1.5克)的反应瓶中，室温下搅拌30分种。然后将反应体系降温至-78℃，加入TfOH(12微升，0.05毫摩尔)并缓慢升温至-40℃。搅拌反应1小时后，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)检测单一构型的产物点出现，供体点消失。后处理：加入三乙胺中和反应，抽滤，旋干。柱层析分离(200-300目，正己烷:乙酸乙酯＝2:1)，回收90毫克的受体，得到中间产物7(214毫克，55％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.71–6.90(m,23H,Ph),6.00(m,1H,CH2CH＝CH2),5.72(dd,J＝10.7,9.1Hz,1H,H-3GluN1),5.55(d,J＝8.3Hz,1H,H-1GluN1),5.32(m,1H),5.21(d,J＝8.4Hz,1H,H-1GluN2),5.19–5.16(m,1H),5.12(dd,J＝10.2,9.1Hz,1H),4.70(d,J＝12.1Hz,1H),4.68(s,1H,H-1Rha),4.60–4.53(m,2H),4.42(d,J＝12.2Hz,1H),4.38(dd,J＝10.6,8.3Hz,1H,H-2GluN1),4.34–4.30(m,1H),4.28(dq,J＝5.8,1.4Hz,2H),4.23(d,J＝11.9Hz,1H),4.18–4.09(m,4H),4.04(dd,J＝11.0,1.7Hz,1H),3.99–3.95(m,1H),3.95–3.92(m,1H),3.89(d,J＝2.9Hz,1H),3.75(dd,J＝9.8,8.5Hz,1H),3.72–3.61(m,4H),3.57(m,1H),3.50(dd,J＝9.5,2.9Hz,1H),3.37–3.28(m,2H),3.13–3.07(m,2H),1.98(s,3H,OCH3),1.94(s,3H,OCH3),1.81(s,3H,OCH3),1.05(d,J＝6.1Hz,3H,CH3).
(8)2-叠氮-1-乙基2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖基-(1→3)-4-氧-苄基-2-氧-烯丙基-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-二氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)
取铱复合物(30毫克，0.035毫摩尔)于反应瓶，真空干燥后，加入干燥的1.5毫升四氢呋喃，用氢气置换反应瓶中的氩气，直至铱复合物逐渐溶解，溶液澄清后，保持氢气氛围室温搅拌2小时。2小时后，溶液呈浅黄色，用氩气置换反应体系中的氢气，将已干燥好的步骤(7)得到的中间产物7(75毫克，0.059毫摩尔)以干燥的四氢呋喃溶解转移至反应瓶中，室温搅拌3小时后，加入NIS(80毫克，0.35毫摩尔)和1毫升的去离子水，室温搅拌。1小时后，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)检测，产物点出现，原料点消失。后处理：将反应液用乙酸乙酯稀释，用去离子水和饱和食盐水萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干,柱层析分离(200-300目，石油醚:乙酸乙酯＝1：1)得到中间产物8(63毫克，87％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.71–6.80(m,23H,Ph),5.68(dd,J＝10.6,9.1Hz,1H),5.43(d,J＝8.5Hz,1H,H-1GlcN),5.19(d,J＝8.4Hz,1H.H-1GlcN),5.11(dd,J＝10.2,9.1Hz,1H),4.69(s,1H,H-1Rha),4.66(d,J＝12.2Hz,1H),4.60–4.54(m,2H),4.49(d,J＝12.2Hz,1H),4.42(td,J＝10.9,8.5Hz,2H),4.28(d,J＝11.7Hz,1H),4.21–4.16(m,3H),4.03–3.97(m,3H),3.97–3.93(m,1H),3.81(dd,J＝9.8,8.6Hz,1H),3.76–3.72(m,1H),3.69–3.62(m,2H),3.58(m,1H),3.42(dd,J＝9.1,2.9Hz,1H),3.37–3.29(m,2H),3.15–3.08(m,2H),2.07(s,3H,OCH3),2.00(s,3H,OCH3),1.81(s,3H,OCH3),1.06(d,J＝6.1Hz,3H,CH3).
(9)2-叠氮-1-乙基2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,4,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃氨基葡萄糖基-(1→3)-]-4-氧-苄基-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-二氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)
将步骤(4)得到的糖基供体4(110毫克，0.17毫摩尔)和步骤(8)得到的中间产物8(69毫克，0.057毫摩尔)用5毫升的干燥乙醚和二氯甲烷混合溶液(乙醚:二氯甲烷＝4:1，v/v)溶解转移至装有已活化的
Figure BDA0002646992300000111
分子筛(1.0克)的反应瓶中，室温下搅拌30分种。然后将反应体系降温至-100℃，加入NIS(110毫克，0.48毫摩尔)和TfOH(2微升，0.15毫摩尔)并缓慢升温至-60℃。搅拌反应2个小时，TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)检测产物点出现，供体点消失。后处理：加入三乙胺中和反应，抽滤，用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和食盐水各萃洗两次，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干。通过柱层析分离(200-300目，梯度洗脱，正己烷:乙酸乙酯＝7:1-2:1)以及LH-20凝胶柱纯化，得到中间产物9(70毫克,70％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.72–6.88(m,43H),5.83–5.78(m,2H,H-1Glc),5.60(d,J＝8.3Hz,1H,H-1GlcN),5.14(d,J＝8.4Hz,1H，H-1GlcN),5.05–4.99(m,2H),4.99–4.90(m,2H),4.87(s,1H,H-1Rha),4.84(t,J＝11.7Hz,2H),4.74(d,J＝12.0Hz,1H),4.63(d,J＝11.6Hz,1H),4.52(s,1H),4.50–4.45(m,3H),4.37–4.24(m,6H),4.20–4.15(m,2H),4.13(d,J＝12.5Hz,2H),4.11–4.05(m,2H),4.03–3.97(m,2H),3.97–3.91(m,2H),3.90–3.84(m,2H),3.76–3.65(m,6H),3.61–3.56(m,2H),3.52(m,3.5Hz,1H),3.47(t,J＝9.3Hz,1H),3.30(m,1H),3.24(m,1H),3.06(m,1H),1.97(s,3H,OCH3),1.70(s,3H,OCH3),1.66(s,3H,OCH3),1.10(d,J＝6.1Hz,3H,CH3).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.19,170.10,169.35,167.84,166.43,139.56,139.36,138.86,138.55,138.22,137.65,137.63,134.02,133.80,131.91,131.18,130.80,128.31,128.22,128.18,128.13,128.11,128.08,128.06,127.80,127.77,127.68,127.49,127.46,127.43,127.35,127.30,127.21,127.19,127.14,126.93,126.89,123.48,123.28,123.13,102.92(C-1Rha),100.03(C-1GlcN),97.96(C-1GlcN),95.12(C-1Glc),81.69,81.52,80.09,80.02,79.97,78.48,77.43,75.35,75.16,74.56,74.27,74.22,73.74,73.36,73.07,72.17,71.95,71.26,70.60,70.52,69.48,68.94,68.63,68.32,61.42,55.47,55.02,50.35,29.70,20.57,20.31,20.27,17.81.
(10)2-氨基-1-乙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[2-脱氧-乙酰胺基-β-D-吡喃氨基葡萄糖基-(1→3)-]-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2-脱氧-乙酰胺基-β-D-吡喃氨基葡萄糖苷(CT-1)
用5毫升的二氯甲烷和10毫升的甲醇溶解步骤(9)得到的中间产物9(24毫克,0.013毫摩尔)后，往反应液中持续通氨气鼓泡1小时，而后用玻璃塞塞住反应瓶，保持瓶内氨气压力，室温搅拌反应。反应持续15天，MALDT-TOF质谱检测仍有NPhth基团未脱除干净，直接旋干得到浆状物。将此浆状物溶解于10毫升的乙醇后，加入1毫升的水合肼，80℃回流反应12小时，MALDT-TOF质谱检测反应完毕。后处理：用乙酸乙酯稀释反应液，用水和饱和食盐水各萃洗两次，并将水相反萃两次，无水Na2SO4干燥，过滤，减压旋干得到浆状物。而后，将此浆状物溶于1.5毫升的吡啶，冰水浴的条件下，加入1毫升的醋酸酐，室温搅拌反应过夜。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:3)检测产物点出现，原料点消失。后处理：多次加入甲苯共沸旋干得到固体化合物。接下来，将此固体化合物溶于2毫升的二氯甲烷和甲醇的混合溶液(二氯甲烷:甲醇＝1:1，v/v),加入已被甲醇稀释的甲醇钠溶液，调节pH至10,室温搅拌反应6小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:3)检测产物点出现，原料点消失。后处理：酸性树脂中和，过滤，旋干。而后将旋干后的化合物，溶解于2毫升甲醇、1毫升二氯甲烷以及0.2毫升去离子水的混合溶液中，加入氢氧化钯(4毫克，0.03毫摩尔)，在氢气氛围下对苄基和叠氮基进行氢解，氢解4天后通过MALDI-TOF质谱检测反应完毕。后处理:过滤，冻干，过P-2凝胶柱得终产物CT-1(2.4毫克，23％)。终产物CT-1的1HNMR谱图和13C NMR谱图如图1和图2所示。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ5.07(d,J＝3.6Hz,1H,H-1Glc),4.84(s,1H,H-1Rha),4.39(s,1H,H-1GlcN),4.20(d,J＝3.3Hz,1H,H-1GlcN),4.16–4.12(m,1H),3.90(ddd,J＝11.3,7.5,3.5Hz,1H),3.83–3.72(m,5H),3.70–3.64(m,2H),3.64–3.54(m,6H),3.54–3.47(m,3H),3.44–3.35(m,3H),3.35–3.23(m,6H),3.13–3.03(m,2H),1.24–1.10(m,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ174.89,174.35,103.10(C-1GlcN),101.63(C-1Rha),100.81(C-1GlcN),99.31(C-1Glc),79.86,77.40,76.34,75.58,74.37,73.81,73.53,72.69,72.63,71.90,71.45,71.21,69.97,69.49,69.26,65.57,60.70,60.50,59.92,55.67,55.37,39.30,25.95,22.16,22.04,16.33。

Claims (10)

1.一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段，其特征在于，结构式如式I所示：
Figure FDA0002646992290000011
其中，n为1-5的整数。
2.权利要求1所述的苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)以化合物a为原料经醚化反应、酯化反应制得糖基供体1；
Figure FDA0002646992290000012
(2)以化合物b为原料经转位反应制得糖基受体2，其中n是1-5任意一个整数；
Figure FDA0002646992290000013
(3)化合物c与三氯乙腈经亲核加成反应制得糖基供体3；
Figure FDA0002646992290000014
(4)取化合物d，经苄基化保护，制得糖基供体4；
Figure FDA0002646992290000015
(5)取糖基供体1与糖基受体2，经偶联反应，制得中间产物5；
Figure FDA0002646992290000021
(6)取中间产物5脱除Pico基团，制得中间产物6；
Figure FDA0002646992290000022
(7)取糖基供体3与中间产物6，经偶联反应，制得中间产物7；
Figure FDA0002646992290000023
(8)取中间产物7脱除All基团，制得中间产物8；
Figure FDA0002646992290000024
(9)取糖基供体4与中间产物8，经偶联反应，制得中间产物9；
Figure FDA0002646992290000025
(10)取中间产物9脱除保护基，制得到苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1；
Figure FDA0002646992290000031
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述醚化反应为：将化合物a溶解于二氯甲烷，加入四丁基碘化铵和烯丙基溴，在碱性环境下冰水浴反应3-5小时，分离得醚化产物；
优选的，所述化合物a和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物a、四丁基碘化铵、烯丙基溴的摩尔比为1:(1-2):(1-2)，所述碱性环境是向反应体系中加入质量浓度8-12％的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液和二氯甲烷的体积比为1:(0.5-1.5)；
优选的，步骤(1)中所述酯化反应为：将醚化产物溶解于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-吡啶甲酸以及催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温反应，搅拌过夜，分离得糖基供体1；
进一步优选的，所述醚化产物和二氯甲烷的质量体积比为1:(4-6)g/mL，所述醚化产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2-吡啶甲酸和摩尔比为1:(1-2):(1-2)。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述转位反应为：将化合物b溶解于二氯甲烷中，加入三乙基硅烷、三氟化硼乙醚，氩气保护下冰水浴反应5-12小时，分离得糖基受体2；
优选的，所述化合物b和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物b和三乙基硅烷的质量体积比为1:(4-6)g/mL，所述三乙基硅烷和三氟化硼乙醚的体积比为(5-15):1。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述亲核加成反应为：将化合物c溶解于二氯甲烷中，加入三氯乙腈和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，室温搅拌反应20-40分钟，分离得糖基供体3；
优选的，所述化合物c和二氯甲烷的质量体积比为1:(5-15)g/mL，所述化合物c和三氯乙腈的摩尔比1:(2-4)，所述二氯甲烷和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的体积比为(150-200):1；
优选的，步骤(4)中所述苄基化保护的步骤为：将化合物d溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入氢化钠反应直至不出气泡，滴加溴化苄，室温反应，分离得糖基供体4；
进一步优选的，所述化合物d与N，N-二甲基甲酰胺的质量体积比为1:(20-30)g/mL，所述化合物d和氢化钠的摩尔比为1:(5-10)，所述化合物d和溴化苄的摩尔比为1:(5-10)。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述偶联反应为：将糖基供体1与糖基受体2溶解于1,2-二氯乙烷中，加入分子筛，将反应体系降温至-35～-25℃，加入碘代琥珀酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸(TfOH)并升温至-5～5℃，反应0.5-1.5小时，得中间产物5；
优选的，所述糖基供体1与糖基受体2的摩尔比为(2-4):1，所述糖基供体1和1,2-二氯乙烷的质量体积比为1:(30-40)g/mL，所述糖基供体1、碘代琥珀酰亚胺(NIS)、三氟甲磺酸(TfOH)的摩尔比为(2-3):(6-7):1，所述分子筛为
Figure FDA0002646992290000041
分子筛。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述脱除Pico基团的步骤为：将中间产物5溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，加入醋酸铜，室温搅拌反应2-4个小时，分离得中间产物6；
优选的，所述中间产物5与混合溶剂的质量体积比为1:(150-200)g/mL，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为(10-15):1，所述中间产物5与醋酸铜的摩尔比为1:(1-2)；
优选的，步骤(7)中所述偶联反应为：将中间产物6和糖基供体3溶解于二氯甲烷，加入分子筛，将反应体系降温至-80～-75℃，加入TfOH并升温至-45～-35℃，搅拌反应0.5-1.5小时，分离得中间产物7；
进一步优选的，所述糖基供体3和中间产物6的摩尔比为(1.5-2.0):1，所述中间产物6和二氯甲烷溶的质量体积比为1:(20-30)g/mL，所述中间产物6和TfOH的摩尔比为(8-9):1，所述分子筛为
Figure FDA0002646992290000042
分子筛。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述脱除All基团的步骤为：将中间产物7溶解于四氢呋喃，与铱复合物溶液混合，室温搅拌2-4小时后，加入NIS和去离子水，室温搅拌0.5-1.5小时，分离得中间产物8；
优选的，所述中间产物7和铱复合物的摩尔比为(1-2):1，所述中间产物7和NIS的摩尔比为1:(5-6)；
优选的，步骤(9)中所述偶联反应为：将糖基供体4和中间产物8溶解于乙醚和二氯甲烷的混合溶剂，加入分子筛，将反应体系降温至-105～-95℃，加入NIS和TfOH并升温至-65～-55℃，搅拌反应1-3个小时，分离得中间产物9；
进一步优选的，所述糖基供体4和中间产物8的摩尔比为(2.0-4.0):1；所述中间产物8和混合溶剂的质量体积比为1:(70-80)g/mL，所述乙醚和二氯甲烷的体积比为4:1，所述中间产物8、NIS、TfOH的摩尔比为1:(8-9):(2-3)，所述分子筛为
Figure FDA0002646992290000043
分子筛。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(10)中所述脱除保护剂的步骤为：将中间产物9溶解于乙醇，加入水合肼，70-90℃回流反应至NPhth基团脱除干净，分离旋干得到浆状物，再将浆状物溶解于吡啶，加入醋酸酐，室温搅拌反应过夜，旋干得到固体化合物；然后将固体化合物溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂,加入甲醇稀释的甲醇钠溶液，调节pH至10,室温搅拌反应5-7小时，过滤旋干后，将旋干后的化合物溶解于甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶液中，加入氢氧化钯，在氢气氛围下对苄基和叠氮基进行氢解，氢解完毕后，分离得苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段CT-1；
优选的，所述中间产物9和乙醇的质量体积比为1:(400-500)g/mL，所述中间产物9和吡啶的质量体积比为1:(50-100)g/mL，所述中间产物9与二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的质量体积比为1:(50-100)g/mL，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1，所述中间产物9与甲醇、二氯甲烷和去离子水的混合溶液的质量体积比为1:(100-200)g/mL，其中甲醇、二氯甲烷和去离子水的体积比为10:5:1；
优选的，所述中间产物9和水合肼的质量体积比为1:(40-50)g/mL，所述中间产物9和醋酸酐的质量体积比为1:(40-50)g/mL，所述中间产物9和氢氧化钯的摩尔比为1:(2-3)。
10.权利要求1所述的苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖O-抗原寡糖片段在制备抗苏黎世克罗诺杆菌疫苗中应用。
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