CN113292615B - 一种血清型ⅷ型b族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用 - Google Patents

一种血清型ⅷ型b族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用。本发明制备的寡糖片段为血清型Ⅷ型B族链球菌不同还原端重复片段，是以各种保护的单糖模块为原料，通过收敛式糖基化组装依次进行糖苷化反应来制备得到的，其中的寡糖片段的各还原端吡喃糖基的C‑1位是由氨基烷烃链修饰，可与蛋白缀合进而制备成寡糖蛋白缀合物，然后进行相关免疫学研究。本发明的制备方法设计合理，可操作性强，分离简单，产品收率高，纯度好。通过合成不同还原端的多糖重复片段以进行免疫学研究，对于研发相应的血清型Ⅷ型B族链球菌糖类疫苗具有重要意义。

Description

一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用，属于抗B族链球菌疫苗研制技术领域。
背景技术
B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，也称为无乳链球菌，因其细胞壁中多糖物质属于抗原构造分类中的B族而被统称为B族链球菌。1938年Fry首次报告3例感染B族链球菌引起产后心内膜炎的死亡，证实B族链球菌为人类的致病菌。B族链球菌正常寄居于阴道和直肠，属条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。文献报道已检测出Ia、Ib、II、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ等多个GBS血清型。
据统计约10％～30％的孕妇有感染GBS，致使产妇患有败血症、泌尿系统感染、胎膜感染、宫内膜感染、创伤感染、羊膜腔感染以及产褥感染等疾病。其中40％～70％的孕妇在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带有这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，其中有5％会导致死亡。1970年，美国曾爆发新生儿(小于3月)菌血症和脑膜炎。近年来，非妊娠期GBS感染的比例不断增加，感染GBS成年人会患有坏死性筋肌炎、脑膜炎、菌血症、肺炎、心内膜炎、关节炎以及腹膜炎等疾病，尤其是曾患有糖尿病和恶性肿瘤的成年人更易受GBS入侵。相对其他GBS血清型来说，血清型VIII型是较晚报道的类型之一。研究发现，血清型VIII型GBS主要在日本孕妇分离株中占主导地位，占所有GBS血清型的36％。最近，丹麦地区也报道了几种由血清型VIII型GBS引起的侵袭性疾病，比如丹毒、菌血症、膀胱炎等；此外，日本报道了由血清型VIII型GBS引起的纵隔，皮下和多发性肌肉脓肿等感染疾病。
目前，国内外对于GBS的预防方案都主要采用的是抗生素预防。但是近几年来，全球GBS的耐药性逐年上升，疫苗预防为控制GBS感染提供新的思路和方法。在过去的时间里，GBS疫苗的研究取得了一系列进展，开发策略主要集中在GBS细胞表面抗原上，比如特异性荚膜多糖抗原。上世纪90年代，先后已有多个GBS血清型(Ia、Ib、II、Ⅲ、Ⅳ、V)的结合疫苗完成了Ⅰ、II期临床试验，但尚未见到涉及血清型Ⅷ型相关寡糖结合疫苗的相关报道。因此，通过化学合成结构明确的血清型VIII型荚膜多糖相关寡糖片段来制备相应的结合疫苗对于GBS感染的预防显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段及其制备方法与应用，以各种保护的单糖模块为原料，通过收敛式糖基化组装依次进行糖苷化反应来制备血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段，其中寡糖片段的各还原端吡喃糖基的C-1位是由氨基烷烃链修饰的。
术语说明：
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
-All：烯丙基；-Bn：苄基；-Bz：苯甲酰基；-Pico：吡啶-2-甲酰基；-STol：对甲苯硫基；TLC：薄层层析色谱；1H NMR：核磁共振氢谱；13C NMR：核磁共振碳谱。
本发明通过如下的技术方案来实现：
一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段，其结构式如式I或II所示：
Figure BDA0002390172890000021
其中，n为1-5的整数。
本发明中，部分优选的血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的名称和结构式如表1所示。
表1部分血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的结构式及名称
Figure BDA0002390172890000022
上述血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段I的制备方法，步骤如下：
(1)取对甲苯基2-氧-苄基-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷为原料3位上吡啶-2-甲酰基保护基制得糖基供体G1；
Figure BDA0002390172890000031
(2)取步骤(1)制备的糖基供体G1和2-叠氮基乙基2，3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷进行偶联反应，制得中间产物G2；其中，n是1-5任意一个整数；
Figure BDA0002390172890000032
(3)取步骤(2)制备的中间产物G2脱除鼠李糖3位吡啶-2-甲酰基保护基，继而上乙酰基保护，制得中间产物G3；
Figure BDA0002390172890000033
(4)取步骤(3)制备的中间产物G3脱除鼠李糖4位烯丙基保护基，制得中间产物G4；
Figure BDA0002390172890000034
(5)取步骤(4)制备的中间产物G4为糖基受体与糖基供体S1经过偶联反应，制得中间产物G5；
Figure BDA0002390172890000035
Figure BDA0002390172890000041
(6)取步骤(5)制备的中间产物G5进行脱除保护基反应，制备得到血清型VIII型B族链球菌寡糖片段I；
Figure BDA0002390172890000042
根据本发明优选的，步骤(1)中所述糖基供体G1的具体制备方法为：将对甲苯基2-氧-苄基-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷溶于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、2-吡啶甲酸，室温下搅拌反应，反应完全后经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G1。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为(1.1-1.3):1的糖基供体G1、糖基受体2-叠氮基乙基2，3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷，
Figure BDA0002390172890000044
型分子筛溶于干燥的二氯乙烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-30℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体G1加量的物质的量比为(1.0-1.3):1，在该温度下搅拌20-30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G2。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述中间产物G3的具体制备方法为：将中间产物G2溶于二氯甲烷和甲醇中，在搅拌条件下加入醋酸铜，室温搅拌反应5小时，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G3。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述脱除鼠李糖4位烯丙基保护基的方法为：取催化剂铱复合物溶于干燥的四氢呋喃中，在氢气条件下活化铱复合物，反应液由红褐色变为浅黄色，加入中间产物G3，室温搅拌3小时后加入N-碘代琥珀亚胺和水，室温搅拌15分钟，反应完全，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G4。
根据本发明优选的，步骤(5)中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为1：(1.0-1.2)的糖基供体S1、糖基受体中间产物G4，
Figure BDA0002390172890000043
型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体S1加量的物质的量比为(1.2-1.5):1，在该温度下搅拌反应30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G5。
本发明，糖基供体S1按照现有方法制备，制备方法参照文献：C.Hsu；K.Chu；Y.Linet al.Highly Alpha-Selective Sialyl Phosphate Donors for EfficientPreparation of Natural Sialosides.Chem.Eur.J.2010,16,1754-1760。
根据本发明优选的，步骤(6)中所述脱除保护基反应的方法为：将中间产物G5溶于无水吡啶中，溶液中加入碘化锂，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶解在甲醇中，加入甲醇钠，调节反应体系pH＝9-10，室温下搅拌反应过夜，反应完成后酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于等体积比的叔丁醇和水的溶液中，加入钯碳，氢气下搅拌过夜，反应完成后过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到血清型VIII型B族链球菌寡糖片段I。
上述血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段II的制备方法，步骤如下：
1)取对甲苯基2,3-氧-丙酮叉-4-氧-乙酰丙酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷原料经两步反应制得糖基受体G6；其中，n是1-5任意一个整数；
Figure BDA0002390172890000051
2)取步骤1)制备的糖基受体G6，与糖基供体G7经偶联反应制得中间产物G8；
Figure BDA0002390172890000052
3)取步骤2)制备的中间产物G8进行氯乙酰基脱除反应，制得中间产物G9；
Figure BDA0002390172890000061
4)取步骤3)制备的中间产物G9为糖基受体，与糖基供体2,3-二-氧-苯甲酰基-4,6-氧-亚苄基-α-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯经偶联反应制得中间产物G10；
Figure BDA0002390172890000062
5)取步骤4)制备的中间产物G10进行保护基脱除反应，制备得到血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段II；
Figure BDA0002390172890000063
根据本发明优选的，步骤1)中所述两步反应的方法为：取对甲苯基2,3-氧-丙酮叉-4-氧-乙酰丙酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷、叠氮乙醇、
Figure BDA0002390172890000064
型分子筛溶于干燥乙醚中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至0℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，在该温度下搅拌反应15-20分钟，将反应温度缓慢升至室温，然后用三乙胺中和反应液，经过水洗、干燥、浓缩分离，将分离得到的产物溶于二氯甲烷和吡啶中，加入乙酸肼，室温下搅拌1小时，丙酮淬灭，旋干、分离得到糖基受体G6。
根据本发明优选的，步骤2)中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为1:(1.1-1.3)的糖基供体G7、糖基受体G6，
Figure BDA0002390172890000065
型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-50℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体G7加量的物质的量比为(1.2-1.5):1，在该温度下搅拌20-30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G8。
根据本发明优选的，步骤3)中所述氯乙酰基脱除反应的方法为：取中间产物G8溶于丙酮和二氯甲烷中，加入硫脲，60℃下回流反应6小时，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G9。
根据本发明优选的，步骤4)所述偶联反应的方法为：取物质的量比为(2.5-3.0)：1的糖基供体、糖基受体G9，
Figure BDA0002390172890000071
型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯，三氟甲磺酸三甲基硅酯的加量为糖基供体物质的量的10-20％，在该温度下搅拌20-40分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，分离得中间产物G10。
根据本发明优选的，步骤5)中所述保护基脱除反应的方法为：将中间产物G10溶于无水吡啶中，溶液中加入碘化锂，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶于乙腈中，加入一滴水，0℃下加入三氟化硼乙醚，在该温度下搅拌1小时，后升至室温搅拌过夜反应，反应完成后采用饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃洗水相2次，干燥浓缩过硅胶柱纯化，将纯化收集得到的化合物溶于甲醇中，加入甲醇钠，调节反应体系pH＝9-10，室温下搅拌反应过夜，反应完成后酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于水中，加入钯碳，氢气下搅拌过夜，反应完成后过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段II。
上述血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段在制备抗血清型Ⅷ型B族链球菌疫苗中的应用。
本发明中未详细说明的实验步骤均按照本技术领域常规操作进行。
有益效果：
本发明提供了一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的制备方法，以各种保护的单糖模块为原料，通过收敛式糖基化组装依次进行糖苷化反应来制备血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段，其中的寡糖片段的各还原端吡喃糖基的C-1位是由氨基烷烃链修饰，可与蛋白缀合进而制备成寡糖蛋白缀合物，然后进行相关免疫学研究。本发明的制备方法设计合理，可操作性强，分离简单，产品收率高，纯度好。通过合成不同还原端的多糖重复片段以进行免疫学研究，对于研发相应的血清型Ⅷ型B族链球菌糖类疫苗具有重要意义。
附图说明
图1是血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-1的1HNMR谱图；
图2是血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-1的13C NMR谱图；
图3是血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-2的1HNMR谱图；
图4是血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-2的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃；本发明中所涉及药品均为普通市售产品，未特别说明的化合物都是可商购或可参照文献制备的物质，且未详细说明的步骤均按本领域常规操作进行。
实施例中涉及的强酸性阳离子交换树脂的类型为AmberliteIR-120，或Amberlyst-15。
实施例1：2-氨基乙基5-乙酰氨基-3,5-去氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸基-(2→3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(GBS-1)的制备
血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-1合成路线如下：
Figure BDA0002390172890000081
(1)对甲苯基2-氧-苄基-3-氧-(吡啶-2-甲酰基)-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷(G1)
将对甲苯基2-氧-苄基-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷(6.4g,16mmol)溶于二氯甲烷(60mL),加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.6g，24mmol)和4-二甲氨基吡啶(390mg,3.0mmol)，随后加入2-吡啶甲酸(2.95g,14mmol)。室温下搅拌反应，TLC检测底物消失反应结束，反应液经乙酸乙酯稀释，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，粗品经硅胶柱分离(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到浆状化合物糖基供体G1(7.4g,总收率91％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.81(m,1H,ArH),8.07(d,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.84(td,J＝7.2,1.2Hz,1H,ArH),7.50(m,1H,ArH),7.39–7.34(m,2H,ArH),7.24–7.20(m,2H,ArH),7.15–7.06(m,5H,ArH),5.84(m,1H,-OCH2CHCH2),5.46–5.42(m,2H,H-1,H-3),5.20(m,1H,-OCH2CHCH2),5.06(m,1H,-OCH2CHCH2),4.66(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.49(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.34–4.23(m,2H,-OCH2CHCH2),4.23–4.15(m,2H,H-2,H-5),3.79(t,J＝9.6Hz,1H,H-4),2.34(s,3H,SPhCH3),1.39(d,J＝6.0Hz,3H,H-6)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ164.1,150.1,147.9,137.7,137.4,136.9,134.6,132.3,130.4,129.9,128.2,128.0,127.7,126.9,125.2,117.0,85.6,78.8,76.9,75.0,73.9,72.3,69.2,21.2(SPhCH3),18.0.
(2)2-叠氮基乙基2-氧-苄基-3-氧-(吡啶-2-甲酰基)-4-氧-烯丙基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2,3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G2-1)
取步骤(1)制备的糖基供体G1(504mg，1.07mmol)、糖基受体2-叠氮基乙基2,3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(510mg，0.93mmol)、
Figure BDA0002390172890000091
型分子筛(3.0g)溶于干燥二氯乙烷(20mL)中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至-30℃，加入N-碘代丁二酰亚胺(296mg，1.32mmol)、三氟甲磺酸银(12μL，0.13mmol)，在该温度下继续搅拌30分钟后，将反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，以二氯甲烷(20mL)稀释反应液，过滤，滤液用饱和硫代硫酸钠水溶液(20mL)、饱和食盐水(20mL)萃洗，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(3:2石油醚/乙酸乙酯)得到黄色泡沫状固体中间产物G2-1(588mg,总收率68％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.75(m,1H,ArH),7.95(m,4H,ArH),7.85(m,1H,ArH),7.75(td,J＝7.8,1.8Hz,1H,ArH),7.54–7.46(m,2H,ArH),7.44(m,1H,ArH),7.43–7.33(m,8H,ArH),7.30–7.24(m,4H,ArH),7.04(m,2H,ArH),5.76–5.67(m,2H,H-3Glc,-OCH2CHCH2),5.42(dd,J＝9.6,7.8Hz,1H,H-2Glc),5.09(m,1H,-OCH2CHCH2),4.99(m,1H,-OCH2CHCH2),4.78(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),4.77(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.66–4.58(m,3H,H-3Rha,PhCH2),4.57(s,1H,H-1Rha),4.48(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.17–4.01(m,5H,H-4Glc,H-6Glc,-OCH2CHCH2,-OCH2-),3.85(d,J＝3.6Hz,1H,H-2Rha),3.82–3.75(m,2H,H-5Glc,H-6Glc),3.73(m,1H,-OCH2-),3.55(t,J＝9.6Hz,1H,H-4Rha),3.44(m,1H,-CH2N3),3.29(m,1H,-CH2N3),3.22(m,1H,H-5Rha),1.32(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ166.0,165.3,163.4,150.0,147.7,138.4,136.6,134.5,133.6,133.1,129.8,129.6,129.4,128.9,128.7,128.4,128.3,128.2,127.9,127.6,127.3,126.7,125.0,117.1,101.2(C-1Rha),100.9(C-1Glc),78.0,76.2,76.2,75.5,75.2,75.1,75.0,74.0,73.5,71.7,71.6,69.4,68.3,50.6,17.8。
(3)2-叠氮基乙基2-氧-苄基-3-乙酰基-4-氧-烯丙基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2,3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G3-1)
取步骤(2)制备的中间体产物G2-1(445mg，0.48mmol)溶于二氯甲烷(20mL)和甲醇(1mL)中，在搅拌条件下加入醋酸铜(124mg，0.62mmol)，混合体系室温下搅拌反应5小时，TLC检测底物消失反应结束，二氯甲烷稀释，萃取，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色泡沫状固体，将上述反应得到的化合物溶于吡啶中(5mL)，加入醋酸酐(1mL),常温搅拌1小时后将反应液浓缩,粗品经硅胶柱分离(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色泡沫状固体中间产物G3-1(394mg，总收率95％)。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ7.93(m,4H,ArH),7.55–7.46(m,2H,ArH),7.41–7.24(m,14H,ArH),5.78(m,1H,-OCH2CHCH2),5.69(t,J＝10.2Hz,1H,H-3Glc),5.39(dd,J＝10.2,7.8Hz,1H,H-2Glc),5.16(m,1H,-OCH2CHCH2),5.10(m,1H,-OCH2CHCH2),4.78(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),4.77(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.63(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.58(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.49(s,1H,H-1Rha),4.45(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.31(dd,J＝10.2,3.6Hz,1H,H-3Rha),4.09–3.99(m,5H,H-4Glc,H-6Glc,-OCH2CHCH2,-OCH2-),3.80–3.69(m,3H,H-5Glc,H-6Glc,-OCH2-),3.65(d,J＝3.6Hz,1H,H-2Rha),3.44(m,1H,-CH2N3),3.33(t,J＝9.6Hz,1H,H-4Rha),3.29(m,1H,-CH2N3),3.15(m,1H,H-5Rha),1.77(s,3H,COCH3),1.28(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ169.6,165.9,165.2,138.6,138.4,134.5,133.6,133.1,129.8,129.6,129.4,128.9,128.7,128.4,128.3,128.2,127.6,127.5,127.5,116.9,101.3,100.9,78.0,76.3,75.6,75.2,75.0,75.0,74.8,73.9,71.7,71.6,69.3,68.4,50.6,20.8,17.7.
(4)2-叠氮基乙基2-氧-苄基-3-乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2,3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G4-1)
取铱复合物(74.3mg，0.088mmol)加入干燥的四氢呋喃(15mL)溶解，装上氢气球后不断换气，搅拌下，铱复合物逐渐溶解，溶液澄清后，氢气环境下搅拌10分钟，铱复合物被活化，溶液由红褐色变为浅黄色，用氩气球将氢气置换干净，氩气条件下，将已干燥好的步骤(3)制备的中间产物G3-1(190mg，0.22mmol)以干燥四氢呋喃溶解并转移至反应瓶中，室温搅拌3小时后加入N-碘代丁二酰亚胺(198mg，0.88mmol)，2滴水，室温搅拌反应15分钟，TLC检测底物消失反应结束，以乙酸乙酯(20mL)稀释反应液，过滤，滤液用饱和硫代硫酸钠水溶液(20mL)、饱和食盐水(20mL)萃洗，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色泡沫状固体中间产物G4-1(167g,总收率92％)。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ7.94(m,4H,ArH),7.55–7.47(m,2H,ArH),7.41–7.25(m,14H,ArH),5.72(t,J＝9.6Hz,1H,H-3Glc),5.41(dd,J＝10.8,8.4Hz,1H,H-2Glc),4.82–4.77(m,2H,H-1Glc,PhCH2),4.64(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.59(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.52(s,1H,H-1Rha),4.45(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2,),4.18(dd,J＝10.2,3.0Hz,1H,H-3Rha),4.09–4.02(m,3H,H-4Glc,H-6Glc,-OCH2-),3.82–3.75(m,2H,H-6Glc,H-5Glc),3.73(m,1H,-OCH2-),3.64(d,J＝3.0Hz,1H,H-2Rha),3.57(td,J＝9.6,4.8Hz,1H,H-4Rha),3.45(m,1H,-CH2N3),3.29(m,1H,-CH2N3),3.13(m,1H,H-5Rha),1.93(d,J＝4.8Hz,1H,-OH),1.79(s,3H,COCH3),1.31(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ170.7,165.9,165.3,138.5,138.4,133.6,133.1,129.8,129.6,129.4,128.9,128.7,128.4,128.3,128.2,127.6,127.6,127.5,101.5(C-1Rha),100.9(C-1Glc),76.2,75.9,75.5,75.3,75.1,74.9,73.4,72.4,71.6,70.6,69.2,68.4,50.6,20.7,17.5.
(5)2-叠氮基乙基5-乙酰氨基-5-氮,4-氧-碳酰基-7,8,9-三-氧-乙酰基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯基-(2→3)-2-氧-苯甲酰基-4,6-氧-亚苄基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2-氧-苄基-3-乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→4)-2,3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G5-1)
取步骤(4)制备的中间产物G4-1(63mg，0.077mmol)、糖基供体S1(Chem.Eur.J.2010,16,1754)(72mg，0.077mmol)、
Figure BDA0002390172890000101
型分子筛(1.0g)溶于干燥二氯甲烷(5mL)中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入N-碘代丁二酰亚胺(25mg，0.11mmol)、三氟甲磺酸银(2mg，0.01mmol)，-78℃条件下继续搅拌反应30分钟后，将反应温度缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，以二氯甲烷(20mL)稀释反应液，过滤，滤液用饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)、饱和食盐水(10mL)萃洗，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(2:3石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体中间产物G5-1(88mg,总收率70％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.91(dd,J＝16.8,7.8Hz,4H,ArH),7.86(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.55(t,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.51–7.46(m,3H,ArH),7.45–7.22(m,20H,ArH),5.66(t,J＝9.2Hz,1H,H-3Glc),5.57(d,J＝9.6Hz,1H,H-7sial),5.50(m,1H,H-8sial),5.38(t,J＝9.6Hz,1H,H-2Glc),5.33(s,1H,PhCH),5.29(t,J＝7.2Hz,1H,H-2Glc),4.83(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Gal),4.75(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),4.74(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.61(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.56(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.49–4.37(m,5H,H-3Gal,H-6sial,H-1Rha,H-9sial,PhCH2),4.24(d,J＝12.0Hz,1H,H-6Glc),4.18(dd,J＝10.2,3.2Hz,1H,H-3Rha),4.15(d,J＝12.0Hz,1H,H-6Glc),4.10–4.05(m,2H,H-3Gal,H-6Gal),4.04–3.95(m,3H,-OCH2,H-4Gal,H-9sial),3.78–3.68(m,5H,H-6Gal,-OCH2-,H-5Gal,H-4Rha,H-4sial),3.64(t,J＝2.4Hz,1H,H-2Rha),3.56–3.47(m,2H,H-5Glc,H-5sial),3.44(m,1H,-CH2N3),3.38(s,3H,-OCH3),3.28(m,1H,-CH2N3),3.18(m,1H,H-5Rha),2.91(dd,J＝12.0,3.4Hz,1H,H-3eqsial),2.44(s,3H,COCH3),2.20(s,3H,COCH3),2.04(s,3H,COCH3),1.91(s,3H,COCH3),1.66(t,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),1.61(s,3H,COCH3),1.38(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha)；13CNMR(150MHz,CDCl3):δ172.2,171.0,170.4,169.9,169.1,168.6,166.0,165.2,153.4,138.4,138.3,137.9,133.4,133.1,133.1,130.3,129.8,129.6,129.4,129.4,129.2,128.8,128.6,128.5,128.4,128.3,128.3,128.3,128.2,127.6,127.6,127.6,126.5,101.1,100.8,100.3,96.6,75.6,75.5,75.1,75.0,75.0,74.9,74.9,74.7,73.4,72.6,72.3,71.6,71.3,70.8,69.3,68.9,68.5,68.3,67.7,65.7,63.6,58.8,52.8,50.6,37.3,24.7,22.2,21.4,20.9,20.7,20.5,18.0.
(6)2-氨基乙基5-乙酰氨基-3,5-去氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸基-(2→3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(GBS-1)
将步骤(5)制备的中间产物G5-1(60mg，0.037mmol)溶于无水吡啶(8mL)中，溶液中加入碘化锂(200mg)，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶于甲醇中，加入甲醇钠，调节反应体系pH＝9-10，室温下搅拌反应过夜，MALDI-MS检测指示反应完成，酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于叔丁醇和水(v:v＝1:1，5mL)的溶液中，加入钯碳(10mg)，氢气下搅拌过夜，MALDI-MS检测指示反应完成，过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到目标产物GBS-1(17mg，总收率58％)。其中，图1为目标产物血清型VIII型B族链球菌寡糖片段GBS-1的1HNMR谱图，图2为目标产物血清型VIII型B族链球菌寡糖片段GBS-1的13CNMR谱图。1H NMR(600MHz,D2O):δ4.69(s,1H,H-1Rha),4.55(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Gal),4.33(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),3.96–3.89(m,3H),3.79–3.72(m,3H),3.72–3.62(m,5H),3.60–3.54(m,2H),3.52(dd,J＝6.0,4.8Hz,1H),3.51–3.42(m,7H),3.42–3.38(m,2H),3.36(m,1H),3.30(m,1H),3.16(m,1H),3.08(t,J＝4.8Hz,2H),2.58(dd,J＝12.0,4.2Hz,1H,H-3eqsial),1.85(s,3H),1.62(t,J＝12.0Hz,1H,H-3axsial),1.19(d,J＝6.0Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O):δ174.9,173.8,103.4,102.0,100.4,99.7,80.7,76.3,75.7,75.2,74.9,74.5,72.9,72.8,72.6,71.7,70.7,70.4,69.9,68.2,68.0,67.3,65.7,62.5,60.8,60.5,51.6,39.6,39.3,21.9,16.7.
实施例2：2-氨基乙基5-乙酰氨基-3,5-去氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸基-(2→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)]-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-L-吡喃鼠李糖苷(GBS-2)的制备
血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段GBS-2合成路线如下：
Figure BDA0002390172890000121
(1)2-叠氮基乙基2,3-氧-丙酮叉-β-L-吡喃鼠李糖苷(G6-1)
取对甲苯基2,3-氧-丙酮叉-4-氧-乙酰丙酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷(500mg，1.23mmol)、叠氮乙醇(533mg，6.13mmol)、
Figure BDA0002390172890000122
型分子筛(3.0g)溶于干燥乙醚(15mL)中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至0℃，加入N-碘代丁二酰亚胺(330mg，1.47mmol)、三氟甲磺酸银(31mg，0.13mmol)，在该温度下搅拌反应20分钟，将反应温度缓慢升至室温，然后用三乙胺中和反应液，以二氯甲烷(30mL)稀释反应液，过滤，滤液用饱和硫代硫酸钠水溶液(20mL)、饱和食盐水(20mL)萃洗，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色浆状物，将上述反应得到的化合物(317mg，0.85mmol)溶于二氯甲烷(10mL)和吡啶(2mL)中，加入乙酸肼(157mg，1.71mmol)，室温下搅拌1小时，丙酮淬灭，旋干，粗品经硅胶柱分离(1:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色浆状物糖基受体G6-1(220mg，总收率67％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ4.82(d,J＝2.4Hz,1H,H-1),4.29(dd,J＝6.0,2.4Hz,1H,H-2),4.11(m,1H,-OCH2-),4.04(dd,J＝7.2,6.0Hz,1H,H-3),3.74(m,1H,-OCH2-),3.63–3.52(m,2H,H-4,-CH2N3),3.43–3.32(m,2H,H-5,-CH2N3),2.37(d,J＝4.2Hz,1H,-OH),1.56(s,3H),1.39(s,3H),1.35(d,J＝6.0Hz,3H,H-6)；13CNMR(150MHz,CDCl3):δ111.0,98.9(C-1),80.0(C-3),74.7(C-4),74.4(C-2),71.1(C-5),68.5(-OCH2-),50.6(-CH2N3),27.9,26.2,17.8(C-6).
(2)对甲苯基5-乙酰氨基-5-氮,4-氧-碳酰基-7,8,9-三-氧-乙酰基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯基-(2→3)-2-氧-苯甲酰基-4-氧-氯乙酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃半乳糖苷(G7)
将糖基供体S2(J.Am.Chem.Soc.2013,135,11140)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)和干燥的吡啶(1mL)中，冰浴、氮气保护下加入氯乙酰氯(16μL，0.20mmol)，搅拌1小时后，TLC(2:1石油醚/乙酸乙酯)检测底物消失反应结束，反应液用二氯甲烷稀释(10mL)，然后用1N盐酸水溶液、饱和食盐水萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤、旋干滤液，粗品经硅胶柱分离(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体中间产物G7(125mg，总收率95％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.21(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.59(t,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.48(t,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.36–7.27(m,7H,ArH),7.04(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),5.63(m,1H,H-8sial),5.44(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H,H-7sial),5.24(t,J＝9.6Hz,1H,H-2Gal),5.10(d,J＝3.0Hz,1H,H-4Gal),4.99(d,J＝10.2Hz,1H,H-1Gal),4.77(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H,H-3Gal),4.51(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.45(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.42(dd,J＝12.6,2.4Hz,1H,H-9sial),4.20(dd,J＝9.6,1.8Hz,1H,H-6sial),4.08(d,J＝15.0Hz,1H,ClCH2CO),4.00–3.91(m,3H,H-9sial,ClCH2CO,H-5Gal),3.84–3.77(m,4H,H-4sial，-OCH3),3.59(dd,J＝9.6,5.4Hz,1H,H-6Gal),3.46(m,2H,H-6Gal),2.89(dd,J＝12.0,3.6Hz,1H,H-3eqsial),2.39(s,3H,SPhCH3),2.30(s,3H,COCH3),2.14(s,3H,COCH3),1.98(s,3H,COCH3),1.86(t,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),1.22(s,3H,COCH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ171.5,170.8,170.7,170.1,167.6,166.8,165.5,153.4,138.2,137.8,133.5,133.4,130.5,130.1,129.6,129.5,128.5,128.4,128.3,127.8,127.8,97.3(C-2sial),86.7(C-1Gal),75.6(C-4sial),75.2(C-5Gal),74.3(C-6sial),73.5(PhCH2),72.6(C-3Gal),71.3(C-7sial),70.4(C-4Gal),69.2(C-2Gal),68.0(C-8sial),67.9(C-6Gal),63.5(C-9sial),58.7(C-5sial),53.6(COOCH3),40.7(ClCH2CO),35.8(C-3sial),24.5(SPhCH3),21.5(COCH3),21.2(COCH3),20.7(COCH3),19.9(COCH3).
(3)2-叠氮基乙基5-乙酰氨基-5-氮,4-氧-碳酰基-7,8,9-三-氧-乙酰基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯基-(2→3)-2-氧-苯甲酰基-4-氧-氯乙酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3-氧-丙酮叉-β-L-吡喃鼠李糖苷(G8-1)
取步骤(2)制备的中间产物G7(116mg，0.11mmol)、步骤(1)制备的糖基受体G6-1(34mg，0.13mmol)、
Figure BDA0002390172890000131
型分子筛(2.0g)溶于干燥二氯甲烷(5mL)中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至-50℃，加入N-碘代丁二酰亚胺(30mg，0.14mmol)、三氟甲磺酸银(6mg，0.022mmol)，在该温度下搅拌30分钟，将反应温度缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，以二氯甲烷(20mL)稀释反应液，过滤，滤液用饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)、饱和食盐水(10mL)萃洗，随后有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(1.5:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体中间产物G8-1(106mg,总收率83％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.24(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.58(t,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.46(t,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.37–7.28(m,5H,ArH),5.64(m,1H,H-8sial),5.49(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H,H-7sial),5.21(t,J＝9.6Hz,1H,H-2Gal),5.15–5.08(m,2H,H-4Gal,H-1Gal),4.72(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H,H-3Gal),4.59(d,J＝1.2Hz,1H,H-1Rha),4.52(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.49–4.43(m,2H,PhCH2,H-9sial),4.21(dd,J＝9.6,1.8Hz,1H,H-6sial),4.17(d,J＝15.0Hz,1H,ClCH2CO),4.08(d,J＝14.0Hz,1H,ClCH2CO),4.04–3.96(m,3H,H-9sial,H-2Rha,-OCH2-),3.94–3.85(m,3H,H-9sial,H-5Gal,H-3Rha),3.83(s,3H,-OCH3),3.67(t,J＝8.4Hz,1H,H-4Rha),3.62(m,1H,-OCH2-),3.56–3.42(m,4H,H-6Gal,H-5sial,-CH2N3),3.34(m,2H,H-5Rha,-CH2N3),2.89(dd,J＝12.0,3.6Hz,1H,H-3eqsial),2.41(s,3H,COCH3),2.16(s,3H,COCH3),2.08(s,3H,COCH3),1.92(t,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),1.54(s,3H),1.30(m,6H),1.21(s,3H,COCH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ171.5,170.9,170.5,169.9,167.5,166.8,165.8,153.5,137.7,133.5,130.4,130.1,128.4,128.4,127.8,127.8,110.7,100.6,98.4,97.4,79.9,78.4,75.6,74.4,74.0,73.5,71.6,71.4,71.4,71.2,71.0,70.4,68.4,68.0,67.7,62.6,58.8,53.6,50.5,40.9,35.7,27.5,26.0,24.6,21.5,20.9,19.9,18.6.
(4)2-叠氮基乙基5-乙酰氨基-5-氮,4-氧-碳酰基-7,8,9-三-氧-乙酰基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯基-(2→3)-2-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3-氧-丙酮叉-β-L-吡喃鼠李糖苷(G9-1)
取步骤(3)制备的中间产物G8-1(84mg，0.072mmol)溶于丙酮(8mL)和二氯甲烷(2mL)中，加入硫脲(56mg，0.72mmol)，60℃下回流反应6小时，反应液用二氯甲烷稀释(10mL)，然后用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤、旋干滤液，粗品经硅胶柱分离(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体中间产物G9-1(66mg,总收率85％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.17(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.58(t,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.45(t,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.36–7.26(m,5H,ArH),5.54–5.46(m,2H,H-8sial,H-7sial),5.35(t,J＝9.6Hz,1H,H-2Gal),4.98(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Gal),4.62(d,J＝1.8Hz,1H,H-1Rha),4.60–4.55(m,2H,PhCH2),4.46–4.39(m,3H,H-9sial,H-6sial,H-3Gal),4.03–3.91(m,4H,H-9sial,H-2Rha,H-3Rha,-OCH2-),3.88–3.81(m,2H,H-4sial,H-6Gal),3.79(t,J＝3.4Hz,1H,H-4Gal),3.76–3.68(m,6H,H-6Gal,H-5Gal,H-4Rha,-OCH3),3.63(m,1H,-OCH2-),3.54(t,J＝9.6Hz,1H,H-5sial),3.52–3.46(m,1H,-CH2N3),3.37–3.31(m,2H,H-5Rha,-CH2N3),2.85(d,J＝3.2Hz,1H,-OH),2.82(dd,J＝12.0,3.4Hz,1H,H-3eqsial),2.42(s,3H,COCH3),2.12(s,3H,COCH3),2.09(t,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),2.05(s,3H,COCH3),1.53(s,3H),1.46(s,3H),1.30(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha),1.24(s,3H,COCH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ171.8,170.7,170.3,169.9,168.3,165.4,153.4,138.0,133.3,130.2,130.1,128.4,128.4,127.7,127.6,110.6,100.6,98.4,97.8,79.6,78.7,75.3,75.0,74.6,74.0,73.5,72.6,71.5,70.9,70.8,68.7,68.6,68.3,67.4,63.0,60.4,58.8,53.3,50.6,35.6,27.4,25.9,24.6,21.2,21.0,20.8,20.1,18.6.
(5)2-叠氮基乙基5-乙酰氨基-5-氮,4-氧-碳酰基-7,8,9-三-氧-乙酰基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯基-(2→3)-[2,3-二-氧-苯甲酰基-4,6-氧-苄叉基-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)]2-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3-氧-丙酮叉-β-L-吡喃鼠李糖苷(G10-1)
取2,3-二-氧-苯甲酰基-4,6-氧-亚苄基-α-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯为糖基供体(66mg，0.11mmol)、步骤(4)制备的中间产物G9-1(46mg，0.042mmol)、
Figure BDA0002390172890000151
型分子筛(1.0g)溶于干燥二氯甲烷(5mL)中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(4μL，0.02mmol)，在该温度下搅拌30分钟，将反应温度缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，以二氯甲烷(20mL)稀释反应液，过滤，旋干，粗品经硅胶柱分离(1:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体中间产物G10-1(45mg,总收率69％)。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ7.98(dd,J＝16.8,7.8Hz,4H,ArH),7.92(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.53(dt,J＝16.0,7.4Hz,2H,ArH),7.46(t,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.43–7.27(m,16H,ArH),5.77(t,J＝9.2Hz,1H,H-3Glc),5.59–5.48(m,3H,H-2Glc,H-7sial,PhCH),5.43(m,1H,H-8sial),5.35(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),5.14(t,J＝9.0Hz,1H,H-2Glc),4.84(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Gal),4.59(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.57(s,1H,H-1Rha),4.53(d,J＝12.0Hz,1H,PhCH2),4.33(dd,J＝10.2,4.2Hz,1H,H-6Gal),4.28(d,J＝9.6Hz,1H,H-6sial),4.25–4.08(m,5H,H-3Glc,H-4Glc,H-9sial,H-4sial),3.99(m,1H,-OCH2-),3.97–3.84(m,4H,H-4Glc,H-2Rha,H-5Gal,H-6Glc),3.82(s,3H,-OCH3),3.81–3.76(m,2H,H-3Rha,H-6Gal),3.66–3.58(m,4H,H-5Glc,H-4Rha,H-6Glc,-OCH2-),3.55(t,J＝10.8Hz,1H,H-5sial),3.47(m,1H,-CH2N3),3.33(m,1H,-CH2N3),3.24(m,1H,H-5Rha),2.53(dd,J＝12.0,3.4Hz,1H,H-3eqsial),2.47(s,3H,COCH3),2.12(s,3H,COCH3),2.01(s,3H,COCH3),1.97(d,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),1.74(s,3H),1.47(s,3H),1.27(d,J＝6.0Hz,3H,H-6Rha),1.15(s,3H,COCH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ172.0,170.8,169.7,169.5,167.8,165.8,165.7,164.1,153.6,138.1,136.9,133.1,132.6,130.1,130.0,129.9,129.9,129.7,129.6,129.0,128.5,128.4,128.3,128.1,127.9,127.8,127.5,126.1,110.5,101.4,101.3,101.1,99.0,98.3,80.0,78.9,78.8,75.4,74.9,74.7,74.2,73.9,73.4,73.1,72.9,72.5,71.1,70.6,68.7,68.5,68.2,68.2,65.9,62.7,60.4,58.8,53.4,50.6,42.7,34.4,29.7,27.4,25.8,24.7,21.1,20.7,20.5,18.6.
(6)2-氨基乙基5-乙酰氨基-3,5-去氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸基-(2→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)]-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-L-吡喃鼠李糖苷(GBS-2)
将步骤(5)制备的中间产物G10-1(40mg，0.026mmol)溶于无水吡啶(8mL)中，溶液中加入碘化锂(150mg)，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶于乙腈(6mL)中，加入一滴水，0℃下加入三氟化硼乙醚(82μL，0.65mmol)，在该温度下搅拌1小时，后升至室温搅拌过夜，反应完成后采用饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃洗水相2次，干燥浓缩，粗产品过硅胶柱纯化，将纯化收集得到的化合物溶于甲醇(5mL)中，加入甲醇钠，调节反应体系pH＝9-10，室温下搅拌反应过夜，MALDI-MS指示反应完成后，酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于水(4mL)中，加入钯碳(5mg)，氢气下搅拌过夜，MALDI-MS检测指示反应完成后，过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到目标产物GBS-2(12mg，总收率56％)。其中，图3为目标产物血清型VIII型B族链球菌寡糖片段GBS-2的1HNMR谱图，图4为目标产物血清型VIII型B族链球菌寡糖片段GBS-2的13CNMR谱图。1H NMR(600MHz,D2O):δ4.63(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Glc),4.58(d,J＝7.8Hz,1H,H-1Gal),4.50(s,1H,H-1Rha),4.02(dd,J＝10.2,3.0Hz,1H),3.95(d,J＝3.0Hz,1H),3.88–3.82(m,2H),3.75–3.69(m,2H),3.68–3.57(m,5H),3.56–3.37(m,9H),3.35–3.24(m,3H),3.18(t,J＝9.6Hz,1H),3.09(t,J＝8.4Hz,1H),3.02(t,J＝5.4Hz,2H),2.52(dd,J＝12.6,4.8Hz,1H,H-3eqsial),1.83(s,3H),1.65(t,J＝12.6Hz,1H,H-3axsial),1.17(d,J＝6.0Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O):δ174.9,173.4,103.5,102.5,100.4,99.4,81.3,75.6,75.3,75.1,74.6,74.2,73.2,72.8,72.5,71.9,70.6,70.2,70.1,69.6,68.3,67.9,65.3,62.5,60.6,60.4,51.5,39.3,38.3,21.9,16.7。

Claims (4)

1.一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的制备方法，所述血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的结构式如式I所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式I
其中，n为1-5的整数，其特征在于，制备步骤如下：
（1）取对甲苯基2-氧-苄基-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷为原料3位上吡啶-2-甲酰基保护基制得糖基供体G1；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（2）取步骤（1）制备的糖基供体G1和2-叠氮基乙基 2，3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷进行偶联反应，制得中间产物G2；其中，n是1-5任意一个整数；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
（3）取步骤（2）制备的中间产物G2脱除鼠李糖3位吡啶-2-甲酰基保护基，继而上乙酰基保护，制得中间产物G3；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
（4）取步骤（3）制备的中间产物G3脱除鼠李糖4位烯丙基保护基，制得中间产物G4；
Figure DEST_PATH_IMAGE010
（5）取步骤（4）制备的中间产物G4为糖基受体与糖基供体S1经过偶联反应，制得中间产物G5；
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
（6）取步骤（5）制备的中间产物G5进行脱除保护基反应，制备得到血清型VIII型B族链球菌寡糖片段I；
Figure DEST_PATH_IMAGE016
。
2.如权利要求1所述的血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.步骤（1）中所述糖基供体G1的具体制备方法为：将对甲苯基2-氧-苄基-4-氧-烯丙基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷溶于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、2-吡啶甲酸，室温下搅拌反应，反应完全后经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G1；
ii.步骤（2）中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为（1.1-1.3）:1的糖基供体G1、糖基受体2-叠氮基乙基 2，3-二-氧-苯甲酰基-6-氧-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷，4Å型分子筛溶于干燥的二氯乙烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-30℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体G1加量的物质的量比为（1.0-1.3）:1，在该温度下搅拌20-30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G2；
iii.步骤（3）中所述中间产物G3的具体制备方法为：将中间产物G2溶于二氯甲烷和甲醇中，在搅拌条件下加入醋酸铜，室温搅拌反应5小时，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G3；
iv.步骤（4）中所述脱除鼠李糖4位烯丙基保护基的方法为：取催化剂铱复合物溶于干燥的四氢呋喃中，在氢气条件下活化铱复合物，反应液由红褐色变为浅黄色，加入中间产物G3，室温搅拌3小时后加入N-碘代琥珀亚胺和水，室温搅拌15分钟，反应完全，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G4；
v.步骤（5）中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为1：(1.0-1.2)的糖基供体S1、糖基受体中间产物G4，4Å型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体S1加量的物质的量比为（1.2-1.5）:1，在该温度下搅拌反应30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G5；
vi.步骤（6）中所述脱除保护基反应的方法为：将中间产物G5溶于无水吡啶中，溶液中加入碘化锂，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶解在甲醇中，加入甲醇钠，调节反应体系pH=9-10，室温下搅拌反应过夜，反应完成后酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于等体积比的叔丁醇和水的溶液中，加入钯碳，氢气下搅拌过夜，反应完成后过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到血清型VIII型B族链球菌寡糖片段I。
3.一种血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的制备方法，所述血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的结构式如Ⅱ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
式II
其中，n为1-5的整数，其特征在于，制备步骤如下：
1）取对甲苯基2,3-氧-丙酮叉-4-氧-乙酰丙酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷原料经两步反应制得糖基受体G6；其中，n是1-5任意一个整数；
Figure DEST_PATH_IMAGE020
2）取步骤1）制备的糖基受体G6，与糖基供体G7经偶联反应制得中间产物G8；
Figure DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE024
3）取步骤2）制备的中间产物G8进行氯乙酰基脱除反应，制得中间产物G9；
Figure DEST_PATH_IMAGE026
4）取步骤3）制备的中间产物G9为糖基受体，与糖基供体2,3-二-氧-苯甲酰基-4,6-氧-亚苄基-α-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯经偶联反应制得中间产物G10；
Figure DEST_PATH_IMAGE028
5）取步骤4）制备的中间产物G10进行保护基脱除反应，制备得到血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段Ⅱ；
Figure DEST_PATH_IMAGE030
。
4.如权利要求3所述的血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.步骤1）中所述两步反应的方法为：取对甲苯基2,3-氧-丙酮叉-4-氧-乙酰丙酰基-1-硫-α-L-吡喃鼠李糖苷、叠氮乙醇、4 Å型分子筛溶于干燥乙醚中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至0°C，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，在该温度下搅拌反应15-20分钟，将反应温度缓慢升至室温，然后用三乙胺中和反应液，经过水洗、干燥、浓缩分离，将分离得到的产物溶于二氯甲烷和吡啶中，加入乙酸肼，室温下搅拌1小时，丙酮淬灭，旋干、分离得到糖基受体G6；
ii.步骤2）中所述偶联反应的方法为：取物质的量比为1:（1.1-1.3）的糖基供体G7、糖基受体G6，4Å型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-50℃，加入N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸银，N-碘代丁二酰亚胺的加量与糖基供体G7加量的物质的量比为（1.2-1.5）:1，在该温度下搅拌20-30分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G8；
iii.步骤3）中所述氯乙酰基脱除反应的方法为：取中间产物G8溶于丙酮和二氯甲烷中，加入硫脲，60℃下回流反应6小时，经过水洗，干燥，浓缩分离得中间产物G9；
iv. 步骤4）所述偶联反应的方法为：取物质的量比为（2.5-3.0）：1的糖基供体、糖基受体G9，4Å型分子筛溶于干燥的二氯甲烷中，室温、氮气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-78℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯，三氟甲磺酸三甲基硅酯的加量为糖基供体物质的量的10-20%，在该温度下搅拌20-40分钟，反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和，分离得中间产物G10；
v.步骤5）中所述保护基脱除反应的方法为：将中间产物G10溶于无水吡啶中，溶液中加入碘化锂，将混合物在氮气气氛、120℃下搅拌回流12小时，然后浓缩并在真空下与甲苯共蒸发，蒸发残留物溶于乙腈中，加入一滴水，0℃下加入三氟化硼乙醚，在该温度下搅拌1小时，后升至室温搅拌过夜反应，反应完成后采用饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃洗水相2次，干燥浓缩过硅胶柱纯化，将纯化收集得到的化合物溶于甲醇中，加入甲醇钠，调节反应体系pH=9-10，室温下搅拌反应过夜，反应完成后酸性树脂中和过滤浓缩，粗产品经葡聚糖凝胶LH-20柱纯化收集，将收集到的化合物溶于水中，加入钯碳，氢气下搅拌过夜，反应完成后过滤旋干，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到血清型Ⅷ型B族链球菌寡糖片段Ⅱ。
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WO2017175082A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-12 Gsk Vaccines S.R.L. Immunogenic compositions
CN107224577A (zh) * 2017-05-10 2017-10-03 山东大学 一种基于3型肺炎链球菌荚膜多糖的寡糖缀合物及其制备方法与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Structural and Immunochemical Characterization of the Type VIII Group BStreptococcusCapsular Polysaccharide;Grigorij Kogan et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;19961231;第271卷(第15期);8786-8790 *

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