CN109045292A - 一种a群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用。该A群链球菌寡糖蛋白缀合物中,其寡糖抗原是明确且单一的寡聚体六糖或九糖衍生物,可通过化学方法合成;其连接臂为丁二酰亚胺;其使用的新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶。本发明还涉及上述A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法及其在制备抗A群链球菌疫苗中的应用。本发明所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物可以同时诱导出两类不同靶点的抗体协同针对A群链球菌,是一种复合型疫苗。这种疫苗具有更好的适用性,可以更有效的抑制A群链球菌,并且不受限于抗生素大量使用带来的细菌耐药性问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用,属于抗A群链球菌疫苗研制技术领域。
背景技术
A群链球菌(GAS)是一种常见的革兰氏阳性病原菌,据统计,全球每年死于GAS感染疾病的人数约50万,其中80%是由GAS感染并发症引起的,主要以风湿性心脏病和侵略性GAS疾病为主(The Lancet Infectious Diseases 2005,5(11),685-694)。对于GAS感染引起的疾病,常见的治疗方式是使用抗生素干预,但随着细菌抗药性的不断增强,抗A群链球菌疫苗的研制对于GAS感染疾病的预防和治疗显得尤为重要。
理想的抗A群链球菌疫苗应具备以下特点:(1)其抗原决定簇是保守性的,存在于所有的A群链球菌菌株中;(2)其具有高的免疫原性;(3)其可以很好的使人体产生强有力的免疫记忆,比如诱导血清免疫蛋白G(IgG)和粘膜免疫蛋白A(IgA)响应,同时又不会与人体组织发生交叉免疫反应(Journal of Molecular Medicine 2012,90(10),1197–1207)。A群链球菌细胞壁表面多糖和其毒力因子C5a肽酶(ScpA)都是潜在的疫苗抗原靶标分子。由于细菌细胞表面多糖本身的免疫原性较低,以其为抗原开发疫苗的方式通常是将获得的糖链经过修饰后与具有免疫增强活性的载体蛋白共价结合来制备相应的糖蛋白缀合物。
加拿大Pinto等人合成了包含二到六个糖基的寡糖抗原(Carbohydrate research1996,291,21-41),与鸡卵清蛋白和牛血清蛋白共价缀合来制备相应寡糖缀合物(Bioorganic&Medicinal Chemistry 1996,4(11),2003-2010),并研究了寡糖缀合物的免疫活性与寡糖半抗原结构间关系(Carbohydrate Research 2000,324(1),17-29);诺华公司制备了六糖、十二糖寡糖半抗原并与破伤风类毒素共价缀合来制备寡糖缀合物(WO2012082635),此寡糖缀合物在老鼠免疫实验中展现出良好的免疫活性(Vaccine 2010,29,104-114)。但是,上述研究工作使用的载体蛋白为常见的载体蛋白,比如鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、破伤风类毒素等。目前已有研究报道使用上述载体蛋白制备的糖缀合物在免疫时可能产生一些不良效果,主要体现在抗原竞争和载体诱导抗原表位抑制两个方面(HumanVaccines&Immunotherapeutics 2013,9(12),2505-2523)。
当前,抗A群链球菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段,有许多问题函待解决。目前,以ScpA193为载体与GAS寡糖抗原连接制备抗A群链球菌寡糖缀合物疫苗,尚未见相关文献报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用,以失活的A群链球菌C5a肽酶ScpA193为载体,与A群链球菌寡糖抗原连接制备抗A群链球菌的寡糖蛋白缀合物,其中的寡糖抗原是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚衍生物。
术语说明:
室温:是指25±2℃。
本发明通过如下的技术方案来实现:
一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物,结构通式如式(I)所示:
其中,GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物;
连接臂为丁二酰亚胺;
新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶,其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸,制备方法参照文献(RSC Advance 2017,7,42056-42063);
m为与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原数量,是1到30任意一个整数。
根据本发明优选的,所述A群链球菌寡糖蛋白缀合物,结构通式如下:
式(II)中,n是2或3,m是1到30任意一个整数。
上述一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法,步骤如下:
(1)GAS寡糖抗原的活化:将GAS寡糖抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的混合液,GAS寡糖抗原在混合液中的浓度为0.1~10mg/mL,搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯,双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原的摩尔当量比为10~15:1,室温搅拌4小时,减压蒸馏得白色粉末状固体,固体用乙酸乙酯洗涤,干燥后得活化的GAS寡糖抗原;
(2)缀合物的合成:按照5~30:1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液,室温搅拌过夜,透析法除去小分子物质,得糖蛋白缀合物水溶液,将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物。
根据本发明优选的,步骤(1)中所述GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物。
进一步优选的,所述寡聚体六糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。
进一步优选的,所述寡聚体九糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。
根据本发明优选的,步骤(1)中所述混合液中N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的体积比为4:1,其中,磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8。
根据本发明优选的,步骤(2)中所述新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶,其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸,制备方法参照文献(RSC Advance 2017,7,42056-42063)。
根据本发明优选的,步骤(2)中所述活化的GAS寡糖抗原在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1~10mg/mL。其中,磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8。
上述制备方法中涉及的药品均为普通市售产品,且未详细说明的步骤均按本领域常规操作进行。
上述A群链球菌寡糖蛋白缀合物在制备抗A群链球菌疫苗中的应用。
有益效果
本发明制备的寡糖蛋白缀合物可以同时诱导出两类不同靶点的抗体协同针对A群链球菌,是一种复合型疫苗。这种疫苗具有更好的适用性,可以更有效的抑制A群链球菌,并且不受限于抗生素大量使用带来的细菌耐药性问题。
附图说明
图1是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖衍生物N2的1H NMR谱图;
图2是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体九糖衍生物N3的1H NMR谱图;
图3是载体蛋白ScpA193、寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和寡糖蛋白缀合物N3-ScpA193的质谱图;
图4是寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和N3-ScpA193的特异性抗体滴度图;
图中纵坐标为抗体滴度,横坐标中IgM代表针对寡糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白,IgG代表针对寡糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中重链为γ的免疫球蛋白,其有常见的IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c和IgG3五种亚型,C57/BL6小鼠不产生IgG2a亚型的抗体。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
室温:是指25±2℃;本发明中所涉及药品均为普通市售产品;
新型载体蛋白ScpA193为失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶,其结构特征为将193位的组氨酸突变为丙氨酸,按照现有方法制备,制备方法参照文献(RSC Advance 2017,7,42056-42063)。
N2为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖衍生物,3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷;
N3为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体九糖衍生物,3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。
实施例1:3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖-ScpA193缀合物的合成(N2-ScpA193)
1、GAS寡糖抗原N2的合成
1)化合物H1的合成
氮气保护下,将化合物2-脱氧-2-邻苯二甲酰胺基-3,4,6-三乙酰基吡喃氨基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯(2.52g,4.35mmol)(Journal of Organic Chemistry 2005,70(1),214-226),4-氧-苯甲酰基吡喃鼠李糖异丙硫苷(1.26g,4.14mmol)(CarbohydrateResearch.2011,346(17),2801-2804)用15mL干燥的二氯甲烷溶解后转移到装有活化分子筛的反应瓶中,补加干燥的二氯甲烷至50mL,室温搅拌,30分钟后,加冰水浴降至0℃,滴加三氟甲磺酸三甲基硅脂(79μL,0.435mmol)。0℃搅拌,1小时后,用三乙胺中和,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=1/1)得产物(1.70g,56%),即化合物H1。
2)化合物H2的合成
将化合物H1(1.65g,2.22mmol)溶于15mL干燥二氯甲烷和5mL干燥吡啶的混合溶液中。在0℃,氮气保护下向反应液中用恒压滴液漏斗滴加0.785mL氯乙酰氯(11.1mmol)与2.5mL干燥的二氯甲烷混合溶液,滴加速度约2秒/滴。保持反应环境,反应搅拌1.5小时。之后将反应液用乙酸乙酯稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,收集有机相干燥、旋干。残留物经硅胶柱色谱纯化得白色固体产物(1.69g,93%),即化合物H2。
3)化合物H3的合成
将化合物H2(1.60g,1.96mmol)用25mL二氯甲烷溶解,加入N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液(v:v=4:1)0.75mL,加入碘代丁二亚酰胺(0.655g,2.93mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅脂(36μL,0.196mmol)。室温搅拌2小时后,用三乙胺中和反应液,减压旋干。所得固体化合物经硅胶柱色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯=3/2)得白色泡沫状化合物。将所得化合物(0.965g,1.27mmol)用干燥的二氯甲烷溶解,在0℃、氮气保护下加入三氯乙腈(0.38mL,3.81mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(38μL,0.381mmol)。反应液在0℃下搅拌1.5小时后将溶剂旋干,所得固体化合物经硅胶柱色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯=2/1)得白色固体产物(1.24g,71%),即化合物H3。
4)化合物H4的合成
氮气保护下,将化合物H3(544mg,0.610mmol),叠氮丙醇(1.26g,4.14mmol)用3mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,补加干燥的二氯甲烷至5mL,加冰水浴将温度降至0℃,滴加三氟甲磺酸三甲基硅脂(16.6μL,91.6μmol)。反应在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,TLC(石油醚/乙酸乙酯=3/2)检测显示化合物H3全部消失以后用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离得泡沫状固体化合物。将所得化合物在室温下用24mL甲醇和6mL二氯甲烷溶解,并加入硫脲(158mg,2.08mmol)和2,6-二甲基吡啶(49μL,0.415mmol)。反应在70℃回流12小时,TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/1)显示原料消失之后将反应液温度自然冷却至室温。将反应液用乙酸乙酯稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,取有机相干燥、旋干,过柱纯化得白色固体(293mg,81%),即化合物H4。
5)化合物H5的合成
将化合物4-氧-苯甲酰基吡喃鼠李糖异丙硫苷(3.0g,9.21mmol)(CarbohydrateResearch2011,346(17),2801-2804)溶于25mL干燥二氯甲烷和15mL干燥吡啶的混合溶液中,在0℃、氮气保护下向反应液中用恒压滴液漏斗滴加0.765mL氯乙酰氯(9.65mmol)与7.5mL干燥二氯甲烷的混合溶液,滴加速度约2秒/滴。保持反应环境,反应搅拌1.5小时。而后向反应液中滴加苯甲酰氯(1.88mL,18.4mmol),反应在0℃、氮气保护下继续搅拌1.5小时。之后将反应液稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,取有机相干燥、旋干。将所得固体化合物在室温下用240mL甲醇和60mL二氯甲烷溶解,并加入硫脲(3.5g,45.9mmol)和2,6-二甲基吡啶(1.05mL,9.21mmol)。反应在70℃回流12小时,之后将反应液温度自然冷却至室温。将反应液用乙酸乙酯稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,取有机相干燥、旋干,过柱纯化得白色固体产物(1.23g,31%),即化合物H5。
6)化合物H6的合成
氮气保护下,将化合物H5(343mg,0.799mmol)和化合物H3(795mg,0.879mmol)用7.5mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,溶液在室温下搅拌20分钟。之后加冰水浴将温度降至0℃,滴加三氟甲磺酸三甲基硅脂(16.0μL,87.9μmol)。反应在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,TLC(石油醚/乙酸乙酯=2/1)检测显示化合物H5全部消失以后用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=2/1)得白色泡沫状产物(705mg,68%),即化合物H6。
7)化合物H7的合成
将化合物H6(300mg,0.256mmol)在室温下用22mL甲醇和5.5mL二氯甲烷溶解,并加入硫脲(97.5mg,1.28mmol)和2,6-二甲基吡啶(30μL,0.256mmol)。反应在70℃回流12小时,TLC(石油醚/乙酸乙酯=2/1)显示原料消失之后将反应液温度自然冷却至室温。将反应液用乙酸乙酯稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,取有机相干燥、旋干,过柱纯化得白色固体产物(255mg,91%),即化合物H7。
8)化合物H8的合成
氮气保护下,将全乙酰化三氯乙酰亚胺酯吡喃鼠李糖(103mg,0.238mmol)(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 1993,3(4),697-702)和化合物H7(200mg,0.182mmol)用3.5mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,溶液在室温下搅拌20分钟。之后将混合溶液温度降至0℃,滴加三氟甲磺酸三甲基硅脂(4.3μL,23.8μmol)。反应在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/1)检测显示化合物H7全部消失以后用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=1/1)得产物(215mg,86%),即化合物H8。
9)化合物H9的合成
氮气保护下,将化合物H4(36.6mg,47.6μmol)和化合物H8(81.6mg,59.6μmol)用2.5mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,溶液在室温下搅拌20分钟。之后将混合溶液温度降至0℃,加入碘代丁二亚酰胺(16mg,71.2μmol)和三氟甲磺酸三甲基硅脂(1.3μL,7.12μmol)。反应在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=2/3)得产物(76mg,78%),即化合物H9。
10)GAS寡糖抗原N2的合成
将化合物H9(40mg,19.2μmol)溶于20mL甲醇,在0℃下通氨气至饱和,之后封死瓶口,反应在室温下搅拌,直到MALDI-TOF质谱显示反应已经进行完全。减压排掉剩余的气体,并蒸馏掉全部溶剂。所得固体化合物溶于3mL乙酸酐和3mL吡啶的混合溶液中,反应在室温下搅拌5小时,之后减压蒸馏除掉全部溶剂。所得固体产物溶解到10mL甲醇溶液里,逐滴加入1N的氢氧化钠溶液调节pH值至10,反应搅拌3小时,MALDI-TOF质谱检测显示反应已经进行完全。之后用酸性树脂中和反应液中的碱,减压浓缩,所得固体用聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P2分子筛色谱柱以水为流动相纯化。将所得化合物冻干后复溶于3mL水中,氮气保护下加入钯碳(10%负载于碳,4mg),之后用氢气置换反应瓶中的气体。反应在室温下,氢气气体环境下搅拌,直到MALDI-TOF质谱显示反应进行完全。滤掉钯碳,将样品冻干得白色絮状固体产物(19mg,95%),即GAS寡糖抗原N2。N2的1H NMR谱图如图1所示。1H NMR(600MHz,D2O):δ5.03(d,J=1.6Hz,1H,H-1Rha),5.02(d,J=1.5Hz,1H,H-1Rha),4.96(d,J=1.3Hz,1H,H-1Rha),4.63(H-1Rha,overlap in H2O),4.58(d,J=8.4Hz,1H,H-1GlcN),4.54(d,J=8.4Hz,1H,H-1GlcN),4.13(dd,J=3.0,1.7Hz,1H,H-2Rha),4.03(dd,J=2.8,2.0Hz,1H,H-2Rha),3.91(dd,J=3.1,1.9Hz,1H,H-2Rha),3.88(dd,J=3.4,1.7Hz,1H,H-2Rha),3.83(dd,J=9.8,3.2Hz,1H,H-3Rha),3.81-3.24(m,25H),2.93-2.85(m,2H,CH2CH2CH2NH2),1.87(s,3H,CH3CO),1.87(s,3H,CH3CO),1.83-1.73(m,2H,CH2CH2CH2NH2),1.15(d,J=6.3Hz,3H,H-6Rha),1.14(d,J=6.3Hz,3H,H-6Rha),1.12(d,J=6.3Hz,3H,H-6Rha),1.10(d,J=6.3Hz,3H,H-6Rha)。
2、一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193的制备方法,步骤如下:
(1)N2的活化:将上述制备的GAS寡糖抗原N2(3mg)溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer,Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8)的混合液(DMF:PBS=4:1,体积比),搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯,双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原N2的摩尔当量比为15:1,室温搅拌4小时,减压蒸馏除去溶剂得白色粉末状固体,固体用EA(乙酸乙酯)洗涤,干燥,得活化的GAS寡糖抗原N2;
(2)缀合物的合成:按照30:1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原N2和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液,反应液室温搅拌过夜,用透析的方法除去小分子物质,透析完毕后将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193。
上述制备的寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193的结构式如下:
其中,上述寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193的载糖率按照以下公式计算,得其糖含量为21%,N2-ScpA193中与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原N2数量的平均值为23。
实施例2:
按照实施例1所述的方法合成GAS寡糖抗原N2。
一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193的制备方法,步骤如下:
(1)N2的活化:将上述制备的GAS寡糖抗原N2(2mg)溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer,Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8)的混合液(DMF:PBS=4:1,体积比),搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯,双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原N2的摩尔当量比为10:1,室温搅拌4小时,减压蒸馏除去溶剂得白色粉末状固体,固体用EA(乙酸乙酯)洗涤,干燥,得活化的GAS寡糖抗原N2;
(2)缀合物的合成:按照10:1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原N2和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液,反应液室温搅拌过夜,用透析的方法除去小分子物质,透析完毕后将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193。
上述制备的寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193的结构式如下:
计算得寡糖蛋白缀合物的糖含量为4%,N2-ScpA193中与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原N2数量的平均值为6。
实施例3:3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖-ScpA193缀合物的合成(N3-ScpA193)
1、GAS寡糖抗原N3的合成
1)化合物H10的合成
氮气保护下,将实施例1制备的化合物H4(97mg,0.126mmol)和化合物H6(161mg,0.137mmol)用5mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,溶液在室温下搅拌30分钟。之后将混合溶液温度降至0℃,加入碘代丁二亚酰胺(42mg,0.187mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅脂(3.4μL,18.7μmol)。反应液在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/1)显示化合物H6消失后用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=1/1)得产物(188mg,80%),即化合物H10。
2)化合物H11的合成
将化合物H10(136mg,73.5μmol)在室温下用12.5mL甲醇/二氯甲烷(v/v=4:1)的混合溶液溶解,并加入硫脲(28mg,0.363mmol)和2,6-二甲基吡啶(9μL,73.5μmol)。反应在70℃回流12小时,之后将反应液温度自然冷却至室温。将反应液用乙酸乙酯稀释,用1M的盐酸水溶液萃洗,取有机相干燥、旋干,过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯=2/3)得产物(112mg,86%),即化合物H11。
3)化合物H12的合成
氮气保护下,将实施例1制备的化合物H8(59.5mg,43.4μmol)和化合物H11(67.5mg,37.7μmol)用3.5mL干燥的二氯甲烷转移到装有活化分子筛的反应瓶中,溶液在室温下搅拌30分钟。之后将混合溶液温度降至0℃,加入碘代丁二亚酰胺(12.5mg,56.6μmol)和三氟甲磺酸三甲基硅脂(1.0μL,56.6μmol)。反应在0℃下搅拌1小时后缓慢升温至室温,之后用三乙胺中和反应,过滤掉分子筛,减压蒸馏除去溶剂。所得固体经硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯=1/2)得产物(77.8mg,67%),即化合物H12。
4)GAS寡糖抗原N3的合成
将化合物H12(34mg,11.9mmol)溶于30mL甲醇,在0℃下通氨气至饱和,之后封死瓶口,反应在室温下搅拌,直到MALDI-TOF质谱显示反应已经进行完全。减压排掉剩余的气体,并蒸馏掉全部溶剂。所得固体化合物溶于3mL乙酸酐和3mL吡啶的混合溶液中,反应在室温下搅拌5小时,之后减压蒸馏除掉全部溶剂。所得固体产物溶解到10mL甲醇溶液里,逐滴加入1N的氢氧化钠溶液调节pH值至10,反应搅拌3小时,MALDI-TOF质谱显示反应已经进行完全。之后用酸性树脂中和反应液中的碱,减压浓缩,所得固体用聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P2分子筛色谱柱以水为流动相纯化,所得化合物冻干后复溶于3mL水中,氮气保护下加入钯碳(10%负载于碳,4mg),之后用氢气置换反应瓶中的气体。反应在室温下,氢气氛围下搅拌,直到MALDI-TOF质谱显示反应进行完全。滤掉钯碳,将样品冻干得白色絮状固体产物(17mg,91%),即GAS寡糖抗原N3。N3的1H NMR谱图如图2所示。1H NMR(600MHz,D2O)δ:5.02(s,2H,2×H-1Rha),5.00(s,1H,H-1Rha),4.94(s,1H,H-1Rha),4.92(s,1H,H-1Rha),4.63(s,1H,H-1Rha),4.56(d,J=8.2Hz,1H,H-1GlcN),4.55(d,J=8.3Hz,1H,H-1GlcN),4.52(d,J=8.5Hz,1H,H-1GlcN),4.12(s,2H,2×H-2Rha),4.01(s,1H,H-2Rha),3.90(s,2H,2×H-2Rha),3.86(s,1H,H-2Rha),3.81(d,J=10.0Hz,1H,H-3Rha),3.78-3.22(m,37H),3.05-2.82(m,2H,CH2CH2CH2NH2),1.85(s,3H,CH3CO),1.85(s,3H,CH3CO),1.84(s,3H,CH3CO),1.84-1.75(m,2H,CH2CH2CH2NH2),1.18-1.04(m,18H,6×H-6Rha)。
按照实施例1中所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法合成缀合物N3-ScpA193,结构式如下:
计算得寡糖蛋白缀合物的糖含量为26%,N3-ScpA193中与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原N3数量的平均值为22。
实施例4
按照实施例3所述的方法合成GAS寡糖抗原N3。
按照实施例2中所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法合成缀合物N3-ScpA193,所不同的是,步骤(2)中活化的GAS寡糖抗原N3和新型载体蛋白ScpA193的摩尔比为15:1,制备的缀合物N3-ScpA193结构式如下:
计算得寡糖蛋白缀合物的糖含量为10%,N3-ScpA193中与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原N3数量的平均值为10。
上述实施例1制备的寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和实施例3制备的N3-ScpA193以及新型载体蛋白ScpA193的质谱图如3所示,实施例1制备的N2-ScpA193的平均分子量为131438Da,实施例3制备的N3-ScpA193的平均分子量为140499Da,新型载体蛋白Scp193的平均分子量为104216Da。
实施例5:寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和N3-ScpA193的免疫原性抗体滴度测定
实施例1和3中制备的寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和N3-ScpA193在小鼠(C57/BL6,7周大,每组6只)体内进行免疫试验。采用皮下注射的方式,注射量以寡糖用量计算,3μg/只小鼠/次,分别在第1、14、21、28、42天进行免疫。
分别在免疫前1天和末次免疫14天后取血,制备抗血清研究其免疫原性,用相应寡糖的BSA(牛血清白蛋白)缀合物作为固定抗原,以酶联免疫法(ELISA)检测多糖特异性抗体的滴度,结果如图4中A和B所示。
经过免疫后,小鼠血液中的抗体滴度明显增高,IgG2b抗体的滴度在总抗中占有较大比例,说明化合物诱导产生的免疫响应主要是IgG2b型,而IgG2b型抗体属于T细胞参与的免疫响应,它能够使宿主细胞产生免疫记忆,促进抗体成熟,这一结果说明化合物N2-ScpA193和N3-ScpA193是一种非常有前景的抗A群链球菌疫苗。
Claims (10)
1.一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物,其特征在于,结构通式如式(I)所示:
其中,GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物;
连接臂为丁二酰亚胺;
新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶,其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸;
m为与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原数量,是1到30任意一个整数。
2.如权利要求1所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物,其特征在于,结构通式如下:
式(II)中,n是2或3,m是1到30任意一个整数。
3.权利要求1或2所述的一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)GAS寡糖抗原的活化:将GAS寡糖抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的混合液,GAS寡糖抗原在混合液中的浓度为0.1~10mg/mL,搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯,双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原的摩尔当量比为10~15:1,室温搅拌4小时,减压蒸馏得白色粉末状固体,固体用乙酸乙酯洗涤,干燥后得活化的GAS寡糖抗原;
(2)缀合物的合成:按照5~30:1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液,室温搅拌过夜,透析法除去小分子物质,得糖蛋白缀合物水溶液,将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述寡聚体六糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述寡聚体九糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。
7.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述混合液中N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的体积比为4:1,其中,磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8。
8.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶,其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸。
9.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述活化的GAS寡糖抗原在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1~10mg/mL;其中,磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO4 0.1M,KH2PO4 0.1M,pH 8。
10.权利要求1或2所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物在制备抗A群链球菌疫苗中的应用。
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