JP2003528032A - リボース−リビトールホスフェートのオリゴ糖誘導体とそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、医学の分野、特に、b型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Hib）によって引き起こされる感染症を予防するためのワクチンにおける主成分として用いられるリボース-リビトール-ホスフェートに由来するオリゴ糖混合物の化学合成と共に、上記のオリゴ糖混合物を含むワクチンに関する。本発明の化学合成によって得られたオリゴ糖混合物は、構造AまたはBの化合物少なくとも５個の式（ホスフェート-リボース-リビトール）ｎまたは（リボース-リビトール-ホスフェート）nの反復単位を含み、これは、b型インフルエンザ菌の莢膜多糖類の反復単位を表してnのみが異なり、nは４〜25の間で含まれる値であって（n≧４ y≦25）、式中R₁またはR₂は担体と結合するためのスペーサーであり、但しR₂がHである場合はR₁はスペーサーであり、R₁がHである場合にはR₂がスペーサーである。本発明はまた、そのようなオリゴ糖混合物を含む免疫原、上記の免疫原を含むワクチン、およびこれらのオリゴ糖を混合物として調製する方法に関する。さらに、本発明は、b型インフルエンザ菌によって引き起こされる感染症を予防するために、ワクチンを単独、または他のワクチンと組み合わせて用いることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、医学の分野、特に、b型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza
e）（Hib）によって引き起こされる感染症を予防するためのワクチンにおける主
成分として用いられるリボース-リビトールホスフェートに由来するオリゴ糖混
合物の化学合成と共に、上記のオリゴ糖混合物を含むワクチンに関する。

【０００２】 （先行技術） b型インフルエンザ菌は、世界中で重篤なヒトの健康問題である。この細菌は
、主に５歳未満の小児において髄膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、および他の呼吸器疾患
を引き起こす。聴覚障害から重度の精神遅滞に及ぶ後遺症が認められ、これらは
多くの国において疾患の生存者の30％以上に達している。世界保健機構の最近の
推定では、世界で年間550,000人以上の小児がb型インフルエンザ菌によって引き
起こされる疾患のために死亡することが示された。

【０００３】 インフルエンザ菌の精製莢膜多糖類は、成人では保護免疫を誘導することが可
能であるが、小児における免疫応答は非常に弱く、２歳未満の幼児では実質的に
ない。

【０００４】 莢膜多糖類は、以下の構造を有する：

【化２】

【０００５】 主な問題は、多糖類であるという抗原の特性そのものであり、これはまだ未成
熟な幼児免疫系を刺激することができないT非依存的抗原であることが証明され
ている。この問題は、担体として知られている蛋白質に多糖類を共有結合（結合
）によって連結することによって解決できることが示された。このようにして得
られた産物は、複合ワクチンとして知られ、生後２ヶ月から抗体保護レベルを誘
導する。

【０００６】 チュら（Chu et al.、Infection immunity 1983、40：245〜256）は、臭化シ
アンによる活性化後の天然の莢膜多糖類および破傷風トキソイドから抱合体を得
た。

【０００７】 ゴードン（Gordon、米国特許第4,496,538号）は、臭化シアンによって天然の
多糖類を活性化した後、これを二ヒドラジドアジピン酸によってジフテリアトキ
ソイドに結合させた。

【０００８】 ヒルマンら（Hilman et al.、米国特許第4,459,286号）は、初回活性化後の髄
膜炎菌蓋膜蛋白質に、6-アミノカプロン酸によって天然の多糖類を結合させた。

【０００９】 これまでの結合プロセスでは全て、共有結合は莢膜多糖類のいくつかの基と担
体蛋白質の間で起こっている。

【００１０】 小児における保護免疫の誘導能は、結合体の構造に依存する。結合を本来の多
糖類上で行う場合、結合に関与する置換基が多糖類鎖に単独で無作為に分布する
ために、各バッチの特徴を調べることは非常に複雑となる。

【００１１】 これらのワクチンは全て、物理化学的な方法によって分析することが非常に難
しい；したがって、一般的に行われていることは、実験動物における免疫原性の
研究による各バッチの評価である。しかし、結合体の挙動は実験動物と子供では
異なる。

【００１２】 安定な品質に関する世界保健機構（WHO）の基準によれば（ホリデイ、ジョー
ンズ（M. R. Holliday, C. Jones、Biologicals, 1999、27：51〜53）、複合ワ
クチンの品質管理は、バッチ毎の類似性を示す物理化学的方法に基づかなければ
ならない。

【００１３】 この作業を容易にするために、複合ワクチンはより一層分子レベルで定義され
なければならない。この問題に対するもう一つの解決策は、莢膜多糖類断片の合
成である。合成によるb型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）抗原の
構築プロセスは主に二つの段階を有し、すなわち、二糖類中間体の合成とそのオ
リゴマー化である。この合成のためにいくつかのアプローチが開発されている。

【００１４】 ビューベリーら（Beuvery et al.、欧州特許出願番号第0276 516号；米国特許
第5,034,519号；Tetrahedron Lett. 28、1553、1987）およびフーガーホウトら
（Hoogerhout et al、J. Carbohydr. Chem. 7、1988、399〜416）は、反復単位
３〜20個を含むと請求する莢膜多糖類の断片を合成によって得た。この目標を達
成するために、二糖類中間体２をまず調製した後、固相化学または溶液合成によ
って反復単位６個を含むオリゴマーを調製した（エリー（Elie）ら、Rec. Trav.
Chim. Pays-Bas 108、1989、219）。オリゴマーをスペーサーによって蛋白質ま
たはペプチドに結合させた。結合した三量体は、莢膜多糖類から調製した市販の
ワクチンよりマウスにおいて免疫原性であった。

【００１５】 従うべき合成経路を示す好ましい態様において、以下の方法を用いた：１−リ
ビトールの合成、２−リボースとのカップリング、３−リボース単位に置換基の
選択的導入、および４−燐酸活性化基の導入。この経路を用いれば、重要な二糖
類誘導体２がわずか15の反応段階で得られた。

【化３】

【００１６】 全体的な収率は７％である（ハーマンズ（Hermans）ら、Recl. Trav. Chim. P
ays-Bas 1987、106：498〜504）。さらに、このプロセスは、主な二つの欠点を
有する：プロセスには11のクロマトグラフィー段階が含まれることと、重要な中
間体の保護基が、オリゴマー化プロセスにとって理想的ではないことである。

【００１７】 オリゴマー化、または第二の合成段階において、用いた方法は、ホスホトリエ
ステルによる活性化によって溶液合成であり、この場合は１サイクルあたり二糖
類に基づいて70〜90％の収率が得られる。そのような技法の主な欠点は、収率が
劇的に低下するために、４反復単位以上を含む断片を調製することが不可能であ
る点である。二糖類中間体２は、異なる３つの保護基を有し、そのために最終産
物の脱保護が非常に難しい。したがって、この二糖類は固相化学によるオリゴマ
ー化にとってあまり都合がよくない。このため、六量体の合成が報告された。

【００１８】 免疫アッセイでは（ピータース（Peters ）CCAMら、Infect. Immunity 1991、
59：3504〜10）、破傷風トキソイドに三量体を結合させることと、マウスおよび
サルにおけるその免疫原性が報告されたに過ぎない。

【００１９】 ジャスト、ウペスラシス（G. Just, J. Upeslacis、欧州特許出願第0 320 942
号；チャン、ジャスト（L. Chan, G. Just）、Tetrahedron. 46、1990、151〜16
2）は、二糖類中間体と溶液化学における合成によって莢膜多糖類の断片を合成
した。抗原を合成するために最適な中間体を調製する目的で、異なる経路を選択
した：１−リビトールの合成、２−適当な保護基を有するリボース単位の合成、
３−リボースとリビトールのカップリング、および４−燐酸活性官能基の導入。

【化４】

【００２０】 この方法論を用いて、ホスホロアミダイトとして中間体３を用いる技法は、オ
リゴマー化技法のための保護基のよりよい選択を示す。この目的を達するために
は、さらに多数の段階が必要であった。重要な誘導体は、19段階で得られたが、
精製するためにクロマトグラフィープロセス８回を用いた。

【００２１】 二糖類３を溶液中でオリゴマー化すると、３反復単位を含む莢膜多糖類の断片
を生じ、収率は１サイクルあたり二糖類に基づいて70〜90％であった。

【００２２】 カンディルら（Kandil et al.、Syn. Lett. 1992、555〜7）、チョンら（Chon
et al.、国際公開公報第93/15205号、米国特許第5,679,352号）は、同じ二糖類
中間体３を用いて固相化学によって、支持体としてモノメトキシポリエチレング
リコールを用いて、莢膜多糖類の断片を合成して、６反復単位までを含む断片を
得て、１サイクルあたりの収率は95％であった。

【００２３】 クリバンら（Krivan et al.、国際公開公報第94/00149号）およびニルソンら
（Nilsson et al.、J. Carbohydr. Chem. 10、1991、1〜22）は、類似の二糖類
中間体および固相化学を用いて10反復単位の断片を得た。この断片を、スペーサ
ーを通じてHibアドヘシンに結合させた。ホスホネート中間体は21段階で得られ
、全収率は５％であった。クロマトグラフィー少なくとも７段階も必要であった
。オリゴマー形成プロセスは、H-ホスホネートと、メリフィールドアミノ化樹脂
を用いる固相化学とを用いて実施した。抗原は１サイクルあたり97〜99％の取り
込みで得られた。

【００２４】 チュ・マカド（Chiu Machado）ら（J. Carbohydr. Chem. 13 1994、465〜474
）およびキューバ国特許第22424号は、適当に保護されたリボース誘導体をブド
ウ糖から合成する場合に効率のよい技法を報告した。この誘導体を用いて、彼ら
は20反応段階で重要な二糖類を調製した。

【００２５】 Hib断片の調製およびそのワクチンにおける用途に、合成を応用することが難
しい一つの局面は、二糖類中間体の合成である。

【００２６】 上記の方法は全て、現代の炭化水素化学の技術の現状を反映しているが、それ
らは２つの重大な技術的欠点を有する。合成を通じていくつかのクロマトグラフ
ィー段階を用いることは、工業規模での合成から見て現実的ではなく、そして合
成段階数が通常非常に多い。より少ない反応段階での二糖類の合成に関する主な
問題は、リボース単位におけるベンジル基の導入である。

【００２７】 二糖類中間体のオリゴマー化プロセスは、溶液中で行うことができるが、達成
されうる最大規模は３〜４反復単位に限定されるという重大な欠点を有する。同
様に、固相化学によっても行うことができる。固相化学では、１サイクルあたり
高い収率で６〜10反復単位に及ぶ二糖類の調製が可能である。しかし、通常存在
する２つの重大な問題は、１サイクルあたりの二糖類中間体の高い取り込みを得
るために、通常、３〜10 モル等量という過剰量の二糖類を必要とするため、真
の収率が10〜15％に過ぎないという点である。過剰量の二糖類はプロセスの過程
で失われる。もう一つの問題は、２つの異なる誘導体を通常必要とするという点
で、一つは固相支持体へのカップリングのために、もう一つは鎖の伸長のために
用いられる。

【００２８】 その構造のみならず鎖長にも如何なる差もない単一の純粋なオリゴ糖断片の合
成は、Hib抗原の合成に関するこれまでの報告の全てに共通する局面であり、同
時にその主な目的の一つである。これは全て、より容易な品質管理のために、よ
り安定した品質の抗Hib複合ワクチンを得るためには、単一の分子で構成される
抗原が必要であるという仮定に基づいた。

【００２９】 新しい方法は、天然の多糖類を断片にすることによってオリゴ糖断片を調製す
るために、そして同様にその末端位置の一つによってオリゴ糖混合物を活性化す
るために開発された。

【００３０】 米国特許第4,808,700号；米国特許第4,761,283号と共にセイド（R.C. Seid）
ら（Glycoconjugate J., 1989, 6：489〜498）では、天然の多糖類を過ヨウ素酸
塩によって酸化して、得られた断片を精製した。オリゴ糖断片の混合物は、以下
のスキームによって示されるように２つの末端の位置で活性化されるようになる
。これらのオリゴ糖を、還元的アミノ化反応によってCRM 197に結合させた。ス
キームから認められるように、双方の結合部位は異なる。結合が形成された後、
異なる構造を有する結合オリゴ糖の少なくとも２つのファミリーが存在するであ
ろう。一方、オリゴ糖の割合は、同じ蛋白質の２つの異なる部位に、または２つ
の異なる蛋白質分子に同じオリゴ糖が結合した結果を左右するであろう。これら
の現象は全て不均一性を生じ、品質管理が困難となる。

【化５】

【００３１】 一方、米国特許第5,153,312号と共にコンスタンチノ（P. Constantino）ら（V
accine 1999、17：1251〜63）において、天然の多糖類の酢酸による加水分解お
よび得られたオリゴ糖断片混合物の精製が報告されている。産物は、オリゴ糖混
合物の完全性に影響を及ぼしうる高いpHと温度で、エチレンジアミンによる還元
的アミノ化によってスペーサーを導入すると、一連の反応によって活性化される
。一方、一部の抗原は、そのカルボニルヘミアセタールが以下のスキームに示す
ように還元されるとおそらく不活化される。さらに、オリゴ糖アミン誘導体は、
その末端エステル機能の一つによってアジピン酸の活性なエステルに選択的に置
換された。他のエステル機能は、蛋白質をカップリングするためになおも活性で
ある。

【化６】

【００３２】 天然の多糖類の断片化産物から調製した２つのワクチンは、多数の小児の免疫
の実践において用いられている。これは、単一の大きさではなくて、多様な大き
さのオリゴ糖をHibに対する複合ワクチンの製造に使用すること、そして同時に
製品の再現性および品質を適切に制御することが可能であることを証明した。こ
の方法によって得られた結合体が多糖類の直接活性化によって得られた結合体よ
り明確であっても、天然の多糖類の断片化を行った後に機能的活性基を導入し、
そして化学合成によって得ることができる分子定義の同じレベルおよび抗原の純
度を得ることは実質的に不可能である。

【００３３】 既定の大きさを有するオリゴ糖または大きさは異なるが構造の残りは均一であ
るオリゴ糖の混合物のいずれを用いても、複合ワクチンの品質管理において明ら
かな長所はない。このことは、Hibオリゴ糖混合物の組成物を決定することがよ
り容易となる当技術分野の現状の分析方法による実験の進歩によって証明されて
いる（コンスタンチノ（P. Constantino）ら、Vaccine 1999、17：1251〜1263お
よびプリオエティ（D. Prioeti）ら、欧州炭化水素シンポジウム（European Car
bohydrate Symposium）、ガルウェイ、1999年７月、PB014）。

【００３４】 一方、Hibオリゴ糖の大きさ毎の混合物からなるワクチンと断片が３反復単位
より大きい場合の単一のサイズのオリゴ糖からなるワクチンの間の免疫学的挙動
に差はない（ピライ（S. Pillai）ら、Infection and Immunity、1991、59：437
1〜6；カンディル（A. A. Kandil）ら、Glycoconjugate, J. 1997、14、13〜7；
およびピータース（Peters, CCAM）ら、Infect. Immunity 1991、59、3504〜10
）。

【００３５】 さらなる状況によって、全ての観点から最適な単一の大きさを選択することが
困難である。４〜６反復単位のオリゴ糖はより容易に合成され、その大きさは通
常、適当な免疫応答を誘導するために十分である。しかし、このワクチンにとっ
て必要な担体蛋白質の量は非常に多く、ワクチンにおけるオリゴ糖の安定性は、
ホスホジエステルの加水分解による分解プロセスが、４反復単位未満の蛋白質に
カップリングした非常に短い断片を非常に急速に誘発するために、不良となり、
したがって不活性である。８〜20反復単位の大きさを有する断片は、その大きさ
の半数が分解されても、担体蛋白質にカップリングした残りの断片が４反復単位
より大きいために、原則としてより安定である。ワクチン用量にとって必要な担
体蛋白質の量も同様により少ない。

【００３６】 しかし、Hibのオリゴ糖に関する技術の現状によれば、大きさの範囲が10〜20
である断片の合成は、溶液法では不可能であり、固相法でもなお難題である。実
際に、これまで報告された例において、この大きさのオリゴ糖は全く存在しない
。もう一つの短所は免疫応答のT-細胞依存性であり、小児において良好な免疫応
答を得るために非常に重要な局面である。多糖類のT細胞依存性は、その大きさ
が増加するにつれて減少する（フェルナンデス、スベレマーク（C. Fernandez,
E. Sverremark）、Cell Immunol. 1994、153：67〜78）。

【００３７】 結論すると、Hib抗原の合成が競争できるようになるためには、重要な二糖類
に対する段階数を減少させ、クロマトグラフィー段階数を減少させ、特にオリゴ
マー化プロセスにおける収率を有意に増加させなければならない。

【００３８】 天然の多糖類の加水分解によって得られるオリゴ糖の混合物は、双方の大きさ
の区間の分画を含み、それぞれの長所を利用して短所を減少させる。類似の混合
物を合成によって得ることができれば、双方の大きさの間隔を含むことを利用で
きるであろう。合成によってデザインすると、この混合物はより明確で純粋とな
り、正確な割合と位置でスペーサーを含むであろう。

【００３９】 （発明の開示） 本発明は、特に、b型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Hib）に
よって引き起こされる感染症を予防するためのワクチンにおける主成分として用
いられるリボース-リビトール-ホスフェートに由来するオリゴ糖混合物の化学合
成と共に、上記のオリゴ糖混合物を含むワクチンに関する。

【００４０】 本発明の化学合成によって得られたオリゴ糖混合物は、構造AまたはBの化合物
少なくとも５個の式（ホスフェート-リボース-リビトール）ｎまたは（リボース
-リビトール-ホスフェート）nの反復単位を含み、これは、b型インフルエンザ菌
の莢膜多糖類の反復単位を表してnのみが異なり、nの値は４〜25の間でであり（
n≧４ y≦25）、式中、R₁またはR₂は担体と結合するためのスペーサーであって
、但しR₂がHである場合はR₁はスペーサーであり、R₁がHである場合にはR₂がスペ
ーサーである。

【化７】

【００４１】 本発明はまた、そのようなオリゴ糖混合物を含む免疫原、上記の免疫原を含む
ワクチン、およびこれらのオリゴ糖を混合物として調製する方法に関する。さら
に本発明には、b型インフルエンザ菌によって引き起こされる感染症を予防する
ために、ワクチンを単独、または他のワクチンと組み合わせて用いることが含ま
れる。

【００４２】 本発明によって、化学合成によって明確な大きさのオリゴ糖の規則正しい混合
物をより効率的に得ることが可能である。この混合物は、より高い純度を有し、
より単純な技術的プロセスを用いて得られる。同様に、本発明の混合物から調製
した複合ワクチンは、その製造のためにより優れており、その品質管理において
より単純であることも判明した。

【００４３】 本発明のもう一つの目的は、上記のオリゴ糖混合物を得る合成方法であって、
これは、重要な二糖類中間体、スペーサー、および促進物質の制御された重縮合
からなる一段階プロセスであることを特徴とし、同様に、抗原の平均的な大きさ
を、各参加者の比率、その添加順序、および反応時間によって制御することがで
きるという事実を特徴とする。

【００４４】 本発明のもう一つの目的は、b型インフルエンザ菌によって引き起こされる疾
患に対するワクチンの調製物において、アジュバントおよび他の添加剤と共に、
またはそれらを用いずに上記の免疫原を用いることである。

【００４５】 本発明のもう一つの目的は、例えば、B型肝炎、DPT、抗髄膜炎菌A、B、C、抗
肺炎球菌1、5、6B、6A、14、19F、19A、23Ｆおよび抗ポリオワクチンと結合して
、または結合せずに、他のワクチンとの複合ワクチンの調製においてこれまでに
記述されている混合物を用いることである。

【００４６】 本発明のもう一つの目的は、Hibオリゴ糖の合成にとって必要な重要な二糖類
に対する合成プロセスの最適化である。最適化は、二糖類４に適用されるとその
二糖類５への変換を可能にし、ベンジル保護基を一段階でリボース単位に導入し
、全プロセスを有意により短くより単純にする新しい選択的ベンジル化反応の発
見からなる。

【化８】

【００４７】 本発明の目的はまた、11反応段階のみにおいて、そしてクロマトグラフィープ
ロセスを用いない高純度での調製を可能にする中間体４を合成するための最適な
技法である。

【００４８】 本発明のもう一つの目的は、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ラテックス
のような免疫学的に不活性な物質との結合によって、抗Hib抗体を検出および定
量するために、先に記述したオリゴ糖を用いることである。

【００４９】 本発明の新規性は、得られたオリゴ糖混合物の組成物であって、これはその末
端位の一つのみにおいて、合成において予めデザインされた位置に結合のための
スペーサーを有するb型インフルエンザ菌莢膜多糖類の反復単位に対応する。こ
れは、同じ規則的で均一な構造に反応する。オリゴ糖混合物は、２つの異なる大
きさの区間からの断片、すなわち主に４〜８と８〜20の断片を含み、各区画から
の長所を得て、各群を分離しうるという短所を減少させる。

【００５０】 さらに、本発明の新規性は、化学合成によってそのような混合物を調製するた
めのプロセス自身であり、それによって産物を高い再現性および効率で調製する
ことが可能となる。同じようにして、本発明によって、一反応によって一段階で
リボース単位にベンジル保護基を導入し、そのようなオリゴ糖の合成にとって重
要な二糖類誘導体の調製における有効性が増加することが示される。

【００５１】 二糖類中間体の合成は、以下のスキームに示す９の化学反応によって、誘導体
5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビトール14を調製することから始まる
。D-リボースを、当技術分野において既に記述されている技法（レオナート（Le
onart）ら、J. Het. Chem. 1966、3：485）に従ってイロプロピリデン誘導体６
に変換した。相転移条件で５位を臭化アリルによってアリル化した後、イソプロ
ピリデン基を硫酸のメタノール溶液によって加水分解して、誘導体８を得て、こ
れに、塩化ベンジルと水素化ナトリウムのジメチルホルムアミド溶液によるベン
ジル化を行う。

【化９】

【００５２】 メチル基を、酢酸と塩酸の混合物によって加水分解し、水素化ホウ素ナトリウ
ムによる還元を行った。誘導体5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-D-リビトール11
をシリカゲル上で吸収させ、パーコレーションプロセスによって、最初にシクロ
ヘキサン、そして次にクロロホルムによって選択的に抽出した。この技法によっ
て、従来のクロマトグラフィー法によらずに大規模での精製が可能となる。

【００５３】 さらに、誘導体11をピリジン中でトリチル化して、塩化ベンジルおよび水素化
ナトリウムのジメチルホルムアミド溶液によってベンジル化して、最後に酢酸に
よって加水分解すると、最終的なリビトール誘導体が得られ、これを蒸留によっ
て精製した。リビトール誘導体14は、以下のスキームに示すように、リボフラノ
ースペルアセテート15によってリボシル化した。脱アセチル化の後に吸収-脱着
方法を新しく適用することによって、従来のクロマトグラフィー段階を行わなく
ともトリオール４が大規模で得られる。

【化１０】

【００５４】 次に、本発明の枠組みにおいてベンジル化反応の発見をトリオール4に適用す
る。この反応によって、カラムクロマトグラフィー精製プロセスの後に誘導体５
が得られる。中間体５のアリル基をプロペニルに異性化した後、ホスホネートを
リボース単位の遊離の３位に導入した。プロペニル基を除去すると、重要な中間
体誘導体19が得られた。同様にして、誘導体17の３位でのヒドロキシ官能基のア
セチル化、５位でのホスホネートの導入、および産物の脱アセチル化によって、
５位でホスホネート、そして３位で遊離のヒドロキシ官能基を有する重要な二糖
類23が得られる。

【化１１】

【００５５】 形成された産物の構造は、全ての場合について、核磁気共鳴¹Hおよび¹³C並び
にH-HおよびH-X相関実験によって確認した。純度は薄層クロマトグラフィーまた
はHPLCによってチェックした。

【化１２】

【００５６】 誘導体18または22から開始すると、誘導体24を得ることができ、25もまた、示
されるように重縮合反応におけるアクセプターとして用いることができる。

【００５７】 オリゴマー化反応は異なる条件で、通常３つのみの成分、すなわち重要な二糖
類（19またはその類似体23）、塩化ピバロイル、塩化アダマンタン-1-カルボニ
ル、または他の立体妨害酸塩化物となりうる反応の促進物質、および反応を停止
させて、同時にスペーサーを導入する第３の成分に基づいて調べた。この成分は
、例えば、24、25、または26位のような末端位において機能的活性基またはその
前駆体を含む。

【００５８】 スペーサーとして、24、25または26が、5-アジド-3-オキサペンタノールであ
る場合には、一般式R₁-Y-OHの如何なる化合物も用いることができ、式中、Yは脂
肪族鎖となりうるスペーサー鎖である。脂肪族鎖は、その中に挿入される芳香族
鎖、または０〜５まで変動する多くのヘテロ原子を含みうる。R₁はスペーサーの
末端位における官能基であり、NH₂、COOR、CHO、SH、またはその前駆物質となり
うる。

【００５９】 重縮合プロセスにとって最適な条件は、いくつかの場合について開発されてお
り、例えばジクロロメタン-ピリジン中で二糖類19、スペーサー5-ジアジド-3-オ
キサペンタノール26、および塩化ピバロイルによって産物が得られる。オリゴマ
ー27を含む分画は、酸化、およびLH-20のメタノール溶液中でのLH-20ゲルクロマ
トグラフィー後の二糖類に基づいて収率70〜85％で得ることができる。

【化１３】

【００６０】 オリゴ糖混合物27を、メタノール-酢酸エチル-水-酢酸中でパラジウム／炭素
の存在下で水素添加して、粗二糖類混合物28を得た。スペーサー基を活性化する
必要がある場合、プロセスは次の段階で行うことがよりよい。例えば、オリゴマ
ー28の混合物に、β-マレイミドプロピオン酸のN-ヒドロキシスクシニミジルエ
ステルのジメチルホルムアミド溶液を加えた。反応が完了した後、得られた溶液
を蒸留水によって希釈して、カットオフ1000のメンブレンを通過させて窒素圧下
でディアフィルター（dyafilter）した。このようにして得られた産物30は、結
合プロセスにおいて容易に用いられる活性なオリゴ糖混合物である。

【化１４】

【００６１】 形成された産物の構造は、全ての場合において核磁気共鳴¹Hおよび¹³Cによっ
て、並びにH-HおよびH-X相関実験によって確認した。

【００６２】 蛋白質を、二硫化物としてマスクされたチオール基を導入することによってチ
オプロピオン酸によって誘導体化した。この誘導体化に関して、SPDPまたはDSP
のような試薬を用いることができ、その後窒素大気中でジチオスレイトールとの
反応を行うことができる。過剰量の試薬は、水性エタノール（20〜95％）によっ
て沈殿させた後遠心することによって、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）OM
Pまたは破傷風トキソイドに関して消失させることができる。髄膜炎菌（Neisser
ia meningitidis）OMPに関して、実施したプロセスを以下のスキームに示す。

【化１５】

【００６３】 チオール化蛋白質は、0.2ミクロンの濾紙を予め通過させて凍結乾燥した活性
オリゴ糖と不活性大気中で混合する。エタノール沈殿によって反応を停止させ、
遠心またはディアフィルトレーション（diafiltration）を行った。

【００６４】 または、活性化試薬の過剰量をディアフィルトレーション（diafiltration）
によって結合体から除去することができる。双方の分離プロセスによってほぼ全
ての蛋白質非結合オリゴ糖が消失し、最終産物の品質は非常に安定となる。

【００６５】 オリゴ糖30の混合物を他の担体、例えば液体に結合させることができる。この
ように、例えば、カルボジイミドの存在下での2,3-ジオクタデシルオキシプロピ
ルスクシニミジルブタンジオエート33との反応によって結合体34が得られる。

【化１６】

【００６６】 合成オリゴ糖混合物と蛋白質との結合物は、適当な生理的緩衝液中で希釈また
は再溶解することができ、最終のワクチン組成物を得ることを目的としてアジュ
バント、保存剤、および他の物質のような添加剤と混合することができる。

【００６７】 同様に、ワクチンを製剤プロセスの前または間に、１歳未満の幼児の免疫スケ
ジュールにおいて現在用いられているタイプの他のワクチンと混合することがで
きる。例えば、B型髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（OMP）からの外膜蛋白
質と混合することによって、抗-Hibと抗B型髄膜炎菌との複合ワクチンを形成す
ることができる。DTPと混合すると、抗Hib、抗ジフテリア、抗百日咳、および抗
破傷風の複合四価ワクチンを得ることができる。

【００６８】 オリゴ糖30と髄膜炎菌外膜蛋白質との間の複合ワクチンの免疫原性は、いくつ
かの動物モデルにおいて証明された。ワクチンによって誘導されるHib莢膜多糖
類に対する抗体の存在は、ELISA法を用いて検出した（フィップス（D.C. Phipps
）ら、J. Immunolog. Methods, 1990、135：121〜8）。結果を図２〜５に示す。

【００６９】 ウサギでは、アルミナを用いずに処方したワクチンは、最初の用量でより高い
反応を誘導する。しかし、いずれの調製物も二回目の投与後は等しくなる。いず
れの場合も高い抗体力価を認めた。

【００７０】 スプレージ・ドーリー（Sprague-Dawley）系ラットの場合、炭化水素-蛋白質
比が異なる二つの結合体から調製したワクチンも同様に、高い抗Hib抗体力価を
示した。

【００７１】 Balb cマウスでは、類似の結合体から得たワクチンは、高い抗莢膜多糖類抗体
力価を誘導した。

【００７２】 オリゴ糖30の混合物を、例えばポリアクリルアミドのようなマトリクスとカッ
プリングさせることができる。この産物は、免疫したヒトまたは実験動物におけ
る抗Hib抗体を検出するために用いることができる。混合物はまた、ラテックス
にカップリングさせて、病気またはワクチン接種者における抗体の検出に用いる
ことができる。ボビン（N. Bovin）ら（Glycoconjugate J., 1998, 15：431〜44
6）に従って活性化したポリアクリルアミドは、オリゴ糖30の混合物と反応した
。HbO-HSA、抗Hib抗体を検出するための推奨物質、および30のポリアクリルアミ
ド結合体の相対能を図６に示す。合成オリゴ糖を含む産物についてよりよい反応
ノイズ比が得られた。

【００７３】 （実施例） （例１：5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-D-リビトール11の合成） アリル化− メチル2,3-O-イソプロピリデン-D-リボフラノシド100 gを臭化ア
リル70 mlに溶解して、50％水酸化ナトリウム水溶液75 mlおよびヨウ化テトラブ
チルアンモニウム2.6 gの存在下で12時間攪拌した。この後、攪拌を停止して、
相を分離した。水槽をジクロロメタン（70 ml）によって抽出し、プールした有
機相を乾燥させて蒸発させた。

【００７４】 加水分解− 得られたシロップをメタノール1.5 Lに溶解した。この溶液に硫
酸水溶液（0.4 N）3.6 mlを加えて、混合物を３時間還流した。反応が完了した
後、これを重炭酸ナトリウムによって中和して、得られた塩を濾過して、溶液を
蒸発させた。残査を酢酸エチルによって抽出して、乾燥させ蒸発させた。産物を
真空で少なくとも２時間乾燥させた。

【００７５】 ベンジル化− 得られた産物をジメチルホルムアミド450 mlに溶解した。得ら
れた溶液を０℃に冷却して、水素化ナトリウム50 gを徐々に加えた。混合物を30
分間攪拌した後、塩化ベンジル（150 ml）を滴下した。２時間攪拌した後、メタ
ノール20 mlを反応液に滴下した。得られた懸濁液を真空で蒸発させ、ジクロロ
メタン中で再溶解し、水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて、
蒸発させた。

【００７６】 加水分解− 先の反応によって得られたシロップをジオキサン1.5 Lに溶解し
た。HCl（２N、1.5 L）を加えて、系を75〜80℃に加熱した。２時間後、反応を
停止させて、相を分離した。水相をジクロロメタン200 mlによって２回抽出して
、プールした有機相を蒸発させた。濃縮産物をジクロロメタン（１L）に溶解し
てその後水（400 ml）、重炭酸ナトリウム飽和溶液（300 ml）、および水（400
ml）によって連続的に洗浄し、最後に硫酸ナトリウム上で乾燥させて蒸発させた
。

【００７７】 還元− 得られたシロップをエタノール（800 ml）に溶解して、系を20℃に冷
却した。次にNaBH₄ 24 gを加えた。混合物を室温で1.5時間攪拌して、反応が完
了した後、過剰量の水素化ホウ素を、pHが７〜８に達するまで酢酸によって破壊
した。溶液を濾過して蒸発させた。残査をジクロロメタン500 mlに溶解して、有
機溶液を水で洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させて、以下の例に使用した。

【００７８】 （例２：5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-D-リビトール11の精製） 先の例の粗5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-D-リビトール11のジクロロメタン
溶液に、シリカゲル300 gを加えて、産物が固相に吸収されるまで混合物を手で
攪拌した。懸濁液を真空下で蒸発させて、ジクロロメタンを除去した。産物を含
むシリカゲルをパーコレーターに置いた。不純物をシクロヘキサンによる48時間
の抽出によって除去した。産物を抽出するために、抽出の溶媒をジクロロメタン
に交換すると、クロマトグラフィーによって純粋な淡黄色のシロップが得られた
。収率75〜95％。NMR¹³Cδ60.7（C-1）、70.2（C-4）、71.0、71.7、72.0、73.6
（PhCH₂C-5，OCH₂CH=）、79.2、79.3（C-2,3）、117.1（CH₂=）、127.5-128.2（
Ph）、134.3（CH=）、138.0、138.1（シプソ）。

【００７９】 （例３：5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビトール14の合成） トリチル化− 先の例の5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-D-リビトール11 100
gを真空で乾燥させて、ピリジン600 mlに溶解した。この溶液にクロロトリフェ
ニルメタン75 gおよびジメチルアミノピリジン0.5 gを加えて、混合物を50℃で
６時間攪拌した。反応が終了した後、溶媒を蒸発させて、残査をジクロロメタン
500 mlに溶解し、溶液を水（１L）によって洗浄して、乾燥および蒸発させた。
残査を真空で３時間乾燥させた。

【００８０】 ベンジル化− 先の反応のシロップをジメチルホルムアミド300 mlに溶解して
、溶液を５℃に冷却した。水素化ナトリウム（25 g）を徐々に加えて、その後攪
拌を30分間継続した。塩化ベンジル（40 ml）を徐々に加えて攪拌を１時間維持
した。反応の終了後、これを再度冷却して過剰量の試薬を破壊するために、メタ
ノール10 mlを徐々に加えた。溶媒を蒸発させて、残査をジクロロメタン500 ml
に溶解して、水１Lによって洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムによって乾燥さ
せて蒸発させた。

【００８１】 加水分解− 残査を酢酸（１L）および水110 mlに溶解して、反応物を80℃で1
.5時間攪拌した。溶媒を蒸発によって除去して、残査をシクロヘキサン500 mlに
溶解した。有機層を０〜５℃で４時間冷却した後、濾過して、水で洗浄し、硫酸
ナトリウム上で乾燥させて、蒸発させた。200〜220 ℃および0.1 mmでの蒸留に
よって純粋な産物が得られた。収率はリボース100 gに基づいて80〜90 g。NMR¹³ Cδ61.2（C-1）、69.6、71.8、72.1、72.3、73.9（PhCH₂C-5、OCH₂CH=）、78.0
、78.8、78.9（C-2,3,4）、116.8（CH₂=）、127.5〜128.2（Ph）、134.7（CH=）
、138.0、138.1、138.2（シプソ）。

【００８２】 （例４：5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(β-D-リボフラノシル)-D-リ
ビトール４の合成） グリコシル化− 先の例の産物（370 g）を無水ジクロロメタン2.7 Lに溶解し
て、リアクターに移した。溶液を０〜25℃に冷却して、粉末分子ふるい４Å（20
7 g）を加えて、15分後、三フッ化ホウ素エーテラート（407 ml）を15 ml/分で
徐々に加えた。最後に無水ジクロロエタン（１L）に溶解したD-リボフラノース
ペルアセテート15（370 g）を20分間かけて徐々に加えた。反応を３時間攪拌し
て、TLCヘキサン／酢酸エチル（2/1）によって調べた。プレートは、５％H₂SO₄
のエタノール溶液によって炭化させることによって展開させた。反応が完了した
後、pHが７となるまでトリエチルアミン（222 ml）によって中和した後、重炭酸
ナトリウムの飽和溶液（800 ml）を加えて、30分間攪拌した。反応液のpHは中性
に維持しなければならない。リアクターの内容物を真空下で濾過した。固体をジ
クロロエタン（200 ml）によって２回洗浄して、固体中に残っている如何なる産
物も抽出した。固相を捨てて、有機相を水600 mlによって２回抽出し、硫酸ナト
リウム上で乾燥させて真空下で蒸発させた。

【００８３】 脱アセチル化− メタノール（２L）に溶解した先の反応物から得られたシロ
ップに、メトキシドナトリウム（１％）のメタノール溶液をpHが９に達するまで
加えた。反応をほぼ２時間まで継続した。完了した後、pHが６〜７に達するまで
反応物を酸性樹脂によって中和した。樹脂を真空下で濾過によって除去した。シ
ロップ（427 g）は、5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビトール、D-リボ
ーサ、および他の不明な不純物と共に所望の産物を含む。

【００８４】 （例５：5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(β-D-リボフラノシル)-D-リ
ビトール４の精製） 先の例のシロップをジクロロメタン（１L）に溶解した。この溶液にシリカゲ
ル（１kg）を加えて、産物が固相に吸収されるまで混合物を手で攪拌した。懸濁
液を真空下で蒸発させてジクロロメタンを除去した。得られた固体を真空下で２
時間乾燥させて、微量のジクロロメタンも除去した。

【００８５】 産物を含むシリカゲルをパーコレーターに置いた。不純物をシクロヘキサンに
よる48時間の抽出によって除去した。抽出の溶媒をクロロホルムに変更して産物
を抽出すると、淡黄色のシロップが得られた。収量238 g。NMR¹Hδ5.85（m、1H
、CH=）、5.20（m、2H、CH₂=）、4.85（s、1H、H-1'）、¹³Cδ62.8（C-5'）、77
.7、77.9、78.2（C-2,3,4）、84.0（C-4'）、107.2（C-1'）。

【００８６】 （例６：5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(β-D-2',5'-ジ-O-ベンジル-
リボフラノシル)-D-リビトール5の合成） ベンジル化− 先の例から得られた化合物（200 g）をトルエン（２L）に溶解
した。この溶液にBu₂SnO（80 g）を加えて、混合物を４時間還流した。５０%NaH
（56 g）を室温で少量ずつ加え、混合物を80℃で30分攪拌した。ヨウ化テトラブ
チルアンモニウム（62 g）を加えて、混合物をさらに１時間攪拌した。塩化ベン
ジル（148 ml）を加えて、反応を80℃で数時間攪拌を継続した。TLC（ヘキサン
／酢酸エチル−２／１）がジベンジル化二糖類からなる主産物を示すまで、塩化
ベンジルを同様に30分間隔で繰り返し加えた。反応物を冷却して、１％HClのメ
タノール溶液によって中和した。次に、反応物をセライトに通過させて、減圧下
で蒸発させた。何らかの塩を含む得られた産物を酢酸エチル中で溶解して、減圧
下で濾過して濃縮した。粗シロップを溶媒系トルエン-アセトン60/1中でカラム
クロマトグラフィーによって精製した。純粋物５をシロップとして得た（100 g
）。NMR-¹Hδ5.96（m、1H、-CH=）、5.18（m、2H、CH₂=）、5.02（s、1H、H-1）
。

【００８７】 （例７：2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(β-D-2',5'-ジ-O-ベンジル-3'-O-トリエ
チルアンモニウムホスホネート-リボフラノシル)-D-リビトール(19)の合成） アリル基の異性化− 先の例から得られたシロップ20 gを高真空下で２時間乾
燥させた。シロップを無水ジメチルスルホキシド（100 ml）に溶解して、t-ブト
キシドカリウム（6.4 g）を加えた。反応物を100℃で１時間攪拌した後、氷水25
0 mlに加えた。pHが７に達するまで濃塩酸を滴下した。混合物をジエチルエーテ
ル80 mlによって３回抽出した。有機相をプールして、硫酸ナトリウムによって
乾燥させて蒸発させた。

【００８８】 燐酸化− イミダゾール（1.5 g）の無水アセトニトリル（34 ml）溶液を０℃
に冷却した。三塩化燐（0.56 ml）およびトリエチルアミン（3.1 ml）を加えた
。得られた溶液を15分間攪拌した。先の溶液からの二糖類を、無水アセトニトリ
ル（３ ml）に溶解したこの混合物に加えた。得られた混合物を室温で15分間攪
拌して、１M臭化トリエチルアンモニウム溶液を加えて停止させた。攪拌を10分
間継続して、ジクロロメタンを加え、相を分離した。有機層を重炭酸トリエチル
アンモニウムの冷溶液によって洗浄して、乾燥させ、蒸発させた。

【００８９】 プロペニル基の加水分解− 産物を60％酢酸に溶解して、70℃で30分間攪拌し
た。溶媒を蒸発によって除去して産物をジクロロメタンに溶解し、重炭酸トリエ
チルアンモニウムによって洗浄して、乾燥および蒸発させた。得られた産物のカ
ラムクロマトグラフィーによって、純粋な化合物が収率70〜85％で得られた。NM
R ¹Hδ6.85（d、H-P）、4.95（s、H-1）、4.60（m、H-3）、2.93（q、NCH₂CH₃）
、1.20（t、NCH₂CH₃）、¹³Cδ105.9（C-1）。

【００９０】 （例８：19〜26の重縮合反応（比10-1）） 化合物19（１g）のピリジン-トリエチルアミン（10-1、１ml）溶液に、塩化ト
リメチルアセチル（0.14 ml）を加えて、反応を20分間攪拌した。スペーサー26
（29.2 mg）を加えて、新しい量の塩化トリメチルアセチル（0.9 ml）を加えて
、反応を１時間攪拌した。I₂（1.1 g）のピリジン-水溶液（7.3 ml；20-1）を加
えて、反応を30分間攪拌した。混合物をジクロロメタンによって希釈して、チオ
スルフェートナトリウム溶液（１M）、臭化トリエチルアンモニウム（0.5 M）の
冷溶液によって洗浄した後、硫酸ナトリウムによって乾燥させて、蒸発させた。
得られた産物をメタノールに溶解してセファデックスLH-20のカラムにおいて同
じ溶媒によってクロマトグラフィーを行った。オリゴマーを含む分画をプールし
て蒸発させた。収率80％。

【００９１】 （例９：19〜26の重縮合反応（比10-1）） 化合物19（１g）およびスペーサー26（14.6 mg）のピリジン-トリエチルアミ
ン（10-1、１ml）溶液に塩化トリメチルアセチル（0.23 ml）を加え、反応を２
時間攪拌した。I₂（1.1 g）のピリジン-水溶液（7.3 ml；20-1）を加えて、産物
を例８と同様に処理した。

【００９２】 （例１０：19〜26の重縮合反応（比5-1）） 化合物19（１g）およびスペーサー24（29.2 mg）のピリジン-トリエチルアミ
ン（10-1、１ml）溶液に塩化トリメチルアセチル（0.23 ml）を加え、反応を２
時間攪拌した。I₂（1.1 g）のピリジン-水溶液（7.3 ml；20-1）を加えて、産物
を例８と同様に処理した。

【００９３】 （例１１：23〜26の重縮合反応（比5-1、溶媒ピリジン） 化合物23（１g）およびスペーサー26（29.2 mg）のピリジン（１ml）溶液に塩
化トリメチルアセチル（0.23 ml）を加え、反応を２時間攪拌した。I₂（1.1 g）
のピリジン-水溶液（7.3 ml；20-1）を加えて、産物を例８と同様に処理した。

【００９４】 （例１２：19〜24の重縮合反応（比5-1、溶媒ピリジン） 化合物19（１g）およびスペーサー24（29.2 mg）のピリジン（１ml）溶液に塩
化トリメチルアセチル（0.23 ml）を加え、反応を２時間攪拌した。I₂（1.1 g）
のピリジン-水溶液（7.3 ml；20-1）を加えて、産物を例８と同様に処理した。

【００９５】 （例１３：例８〜12の産物の水素添加反応） 先の例８〜12の粗産物を酢酸エチル-エタノール-水-酢酸（1-2-2-0.1）の混合
物中でパラジウム／10％炭素によって水素添加した。最後に産物を、セファデッ
クスC-25 Naでのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。凍結乾燥産
物の特徴をNMRによって調べ、基本反復単位Rib-Rib-ホスフェートおよびスペー
サーが示された。最初にカットオフメンブレン1000を通過させ、残留物を10000
カットオフメンブレンに通過させることによって、ディアフィルトレーション（
diafiltration）および限外濾過プロセスの後に活性分画を得た。10000メンブレ
ンを通過した溶液をプールして凍結乾燥すると、最終産物28を生じ、全体的な収
率は、反応条件に応じて、開始二糖類に基づいて20〜80％の間である。NMR ¹Hδ
5.12（H-1）、4.60（H-3）、3.29（CH₂NH₂）、³¹Pδ2.14（spac-P-Rib）、0.74
（リビトール-P-Rib）。

【００９６】 （例１４：誘導体5-(3-マレイミドプロピオンアミド)-3-オキサペンチルオリゴ
リボシルリビトールホスフェート30の合成） 先の例（3.34 mg、1.73 μmol）の二回蒸留水溶液（0.1 ml）に、N,N-ジメチ
ルホルムアミド（0.4 ml）に溶解したN-ヒドロキシスクシニミジルβ-マレイミ
ドプロピオネート27 0.7 mg（2.62 μmol）を加えた。４時間の反応後、溶液を
真空下で蒸発させ、蒸留水（0.5 ml）に再懸濁させ、遠心した（10分、3500 rpm
）。上清を水によって希釈して、カットオフメンブレン1000を備えたアミコン装
置で限外濾過を行った。残留物を凍結乾燥した。収率は85〜95％であった。NMR
：¹H、δ6.95（s、2H、CH=CH）、5.01（s、H-1）、3.41（t、2H、CH₂NH）、2.56
（t、2H、CH₂a）。

【００９７】 （例１５：例１３から得られた産物のイオン交換クロマトグラフィーによる分析
） 例８〜12の産物を水素添加してナトリウム塩として、塩化ナトリウムの直線勾
配によってHR5/5モノQカラムにおいてイオン交換クロマトグラフィーによって分
析した（コンスタンチノ（P. Constantino）ら、Vaccine 1999、17：1251〜1263
）。例８の溶出クロマトグラフィープロフィールを図1Bに示し、異なる大きさの
断片を示す。それらを文献において報告された結果および五量体のクロマトグラ
ムを表す図1Aと比較すると、混合物において４〜５反復単位から20以上の断片が
表されるという結論に達することができる。

【００９８】 （例１６：髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）外膜蛋白質との結合） 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）外膜蛋白質複合体（OMPC）400 mgを、N₂ (g)を予め通過させたpH ８のPBS緩衝液80 mlに溶解した。氷冷水浴中で攪拌しな
がら、溶液にN₂(g)を５分間通過させた。DSPのジメチルホルムアミド溶液1.6 ml
を加えて、混合物を４℃で２時間緩く攪拌した。DTTのPBS溶液1. 6 mlを加えて
、４℃で攪拌を１時間継続した。得られた懸濁液を、冷エタノール20〜400 mlを
含む遠心管に移した。フラスコを1800 rpm、４℃で30分間遠心して上清を捨てた
。新しいエタノールを固体に加えて、エタノール200〜400 mlを加えた後遠心プ
ロセスを再度繰り返した。沈殿物をpH ７〜９のPBS緩衝液80 mlに再懸濁した。
得られた溶液に合成オリゴ糖30を加えて、攪拌を１〜48時間継続した。プロセス
が完了した後、エタノール沈殿-遠心操作を繰り返した後、30,000カットオフメ
ンブレンを用いてディアフィルトレーションを行った。残留物をPBS緩衝液にお
いて再溶解して、Hib濃度を40〜80 μg/mlとした。

【００９９】 （例１７：破傷風トキソイドとの結合） 濃度５ mg/mlの破傷風トキソイドのpH ８のPBS溶液にN₂(g)を５分間通気した
。氷冷水浴中での攪拌を維持しながら、DSPのジメチルホルムアミド溶液1.6 ml
を加えて、混合物を４℃で２時間緩く攪拌した。DTTのPBS溶液1.6 mlを加えて、
４℃での攪拌を１時間継続した。得られた溶液を、10000カットオフメンブレン
を備えた限外濾過装置に移した。メンブレンを通過した溶液がエルマン試験陰性
となるまで、予めN₂(g)を通気した新鮮な緩衝液を加えることによって、溶液を
数回ディアフィルトレートした。得られた溶液に合成オリゴ糖30を加えて、攪拌
を１〜48時間継続した。プロセスが完了した後、メンブレンを通過した溶液が糖
に関するフェノール硫酸試験陰性となるまで、溶液を再度ディアフィルトレート
した。最後に溶液をPBS緩衝液に再溶解して、Hib濃度40〜80 μg/mlを得た。

【０１００】 （例１８：ジオクタデシルグリセロールヘミスクシネートへの結合） 例８の産物（10 mg）をジメチルホルムアミド１mlに溶解して、N-ヒドロキシ
スクシニミドエステル31としてジオクタデシルグリセロールヘミスクシネートの
溶液に加えた。この溶液にエチルジアミノプロピルカルボジイミド（５mg）を加
えて、反応を６時間攪拌した。新しいカルボジイミドを加えて、攪拌を６時間継
続した。溶媒を蒸発させて、混合物をC18-シリカゲル（１g）のカラムに適用し
た。水による溶出によってオリゴ糖が除去された。産物をメタノール-水の勾配
濃度によって溶出した。収率85％。NMR ¹Hδ5.12（H-1）、4.60（H-3）、3.40（
CH₂NH）、1.30（CH₂）、0.90（CH₃）。

【０１０１】 （例１９：アジュバントを含まないワクチンの調製） 燐酸緩衝液に40 μg/mlの濃度で溶解した例16の免疫原を、無菌的な条件で４
〜８℃で２回蒸留水溶液によって希釈した。懸濁液を10分間攪拌した。Hib抗原
の最終濃度は、リボースと総蛋白質の推定によって決定し、Hib抗原の最終濃度
が20 mg/mlとなるまでより多くの緩衝液を加えることによって再調節することが
可能であった。チメロサールを最終濃度0.1〜0.001％で加えた。得られた懸濁液
は、アジュバントを含まない抗Hib-複合ワクチンの最終バルクである。

【０１０２】 （例２０：アジュバントとしてアルミナを含む抗Hibワクチンの調製） 燐酸緩衝液に40 μg/mlの濃度で溶解した例16の免疫原を、４〜６℃の無菌的
条件でアルミナ１〜0.01 mg/mlの蒸留水溶液の等量と混合した。攪拌を４〜８℃
で20分間維持した。Hibの最終濃度は、リボースと総蛋白質の推定によって決定
し、Hib抗原の最終濃度が20 mg/mlとなるまでより多くの緩衝液を加えることに
よって再調節することが可能であった。チメロサールを最終濃度0.1〜0.001％で
加えた。得られた懸濁液は、アルミナを含む抗Hib-複合ワクチンの最終バルクで
ある。

【０１０３】 （例２１：抗Hib抗B型髄膜炎菌複合ワクチンの調製） 燐酸緩衝液に80 μg/mlの濃度で溶解した例16の免疫原を、４〜６℃の無菌的
条件で、現在VAMEMGOC BCにおいて100〜200 mg/mlの濃度で用いられているB型髄
膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜蛋白質複合体（OMPC）のバルク溶液と
共に混合した。軽度の磁気攪拌によって20分間均一にした後、反応の内容物をア
ルミナ１〜0.01 mg/mlの蒸留水溶液の等量と混合した。攪拌を４〜６℃で20分間
維持した。Hibの最終濃度は、リボースと総蛋白質の推定によってローリー法に
よって決定し、Hib抗原の最終濃度が20 mg/mlとなるまでより多くの緩衝液を加
えることによって再調節することが可能であった。チメロサールを最終濃度0.1
〜0.001％で加えた。得られた懸濁液は、アルミナを含む抗Hib-抗B型髄膜炎菌結
合ワクチンの最終バルクである。

【０１０４】 （例２２：抗Hib抗DTP複合ワクチンの調製） 燐酸緩衝液に80 μg/mlの濃度で溶解した例16の免疫原を、４〜６℃の無菌的
条件で、４倍濃度のDTPのバルク溶液と混合した。軽度の磁気攪拌によって20分
間均一にした後、反応の内容物をアルミナ１〜0.01 mg/mlの蒸留水溶液の等量と
混合した。攪拌を４〜６℃で20分間維持した。Hibの最終濃度は、リボースと総
蛋白質の推定によってローリー法によって決定し、Hib抗原の最終濃度が20 mg/m
lとなるまでより多くの緩衝液を加えることによって再調節することが可能であ
った。チメロサールを最終濃度0.1〜0.001％で加えた。得られた懸濁液は、アル
ミナを含む抗Hib-抗B型髄膜炎菌結合ワクチンの最終バルクである。

【０１０５】 （例２３：合成オリゴ糖混合物とOMPから調製したワクチンの免疫学的アッセイ
） 例19および20のワクチンを抗原１μg〜２μgの用量で免疫した。これらの実験
において用いられた動物はウサギ、ラットおよびマウスであった。免疫２回を４
週間間隔で行い、０、28、および42日に採血した。血液を採取して3500 rpmで20
分間遠心した。血清を10倍希釈して、−40℃で保存した。

【０１０６】 抗体反応は、Hib-HSAをコーティング抗原として用いて間接的ELISAによって測
定した。結果を図２〜５に示す。

【０１０７】 （例２４：合成オリゴ糖とp-ニトロフェニルアクリレートの混合物の結合体） 例13のオリゴ糖の混合物（10 mg）をジメチルホルムアミドに溶解して、ニト
ロフェニルアクリレート（10〜30 mg）のジメチルホルムアミド溶液（１ ml）に
加えた。トリエチルアミン0.1〜0.5 mlを加えて、反応を16時間攪拌して維持し
た。アンモニア0.1〜0.5 mlを加えて、攪拌を24時間継続した。溶液をセファデ
ックスLH-20カラムにアセトニトリル中で適用した。アセトニトリル-水によって
溶出した。リボースに関するオルシノールアッセイにおいて陽性の分画をプール
して、凍結乾燥した。収率は通常80％以上である。

【０１０８】 （例２５：合成オリゴ糖結合体の抗Hib抗体検出能） 先の例からの産物の炭酸-重炭酸緩衝液溶液を96ウェルプレートの半分に１〜1
00 μgの濃度で適用した。プレートの残りの半数に、推奨濃度で抗原HbO-HSAを
適用した。破傷風トキソイドにカップリングした天然の莢膜多糖類を含むワクチ
ンによって免疫したマウスの血清を用いて、ELISAアッセイを実施する。得られ
た結果を図６に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 モノQ HR5/5上でNaCl直線勾配０〜500 mMでのイオン交換クロマトグラフィー
による例15において得られたオリゴマー分画の典型的なクロマトグラム。A-五量
体；B-例10からのオリゴマー。

【図２】 例16のワクチンによって免疫したウサギにおける抗体反応。

【図３】 例15のワクチンによって免疫したウサギにおける抗体反応。

【図４】 例15のワクチンによって免疫したラットにおける抗体反応。

【図５】 例15のワクチンによって免疫したBalb/cマウスの抗体反応。

【図６】 結合体26-PAAの抗Hib抗体の検出能。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 15/10 Ｃ０７Ｈ 15/10 15/18 15/18 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＺ，Ｄ Ｍ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，Ｍ Ｚ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ヴェレス ベンコモ、ヴィセンテ グイレ ルモ キューバ国 シウダッド デ ラ ハバ ナ、セントロ ハバナ、エントレ スラッ ド イ イエスズ ペレグリノ 615 (72)発明者 ロイ、レネ カナダ国 ケベック、ガティノー、アブニ ュ デュ シェヴァル ブラン 686 Ｆターム(参考） 4C057 AA17 AA18 AA19 AA20 BB02 BB04 DD03 JJ06 JJ20 4C085 AA03 AA04 BA14 BA16 BA53 BA55 BA89 CC33 EE06 FF24

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（ホスフェート-リボーサ-リビトール）nまたは（リボー
   ス-リビトール-ホスフェート）nの反復単位を含むオリゴ糖の混合物であって、
   混合物が合成によって得られ、構造AまたはBの化合物少なくとも５個を含み、n
   の値が４〜25であり、式中R₁またはR₂は担体と結合するためのスペーサーであっ
   て、但しR₂＝HであればR₁はスペーサーであり、R₁＝HであればR₂がスペーサーで
   ある、オリゴ糖混合物。 【化１】
2. 【請求項２】 構造AまたはBの式（ホスフェート-リボーサ-リビトール）n
   または（リボース-リビトール-ホスフェート）nの化合物が互いにnのみが異なり
   、nの値が４〜25である、請求項１記載のオリゴ糖の混合物。
3. 【請求項３】 スペーサーが０〜５までの数のヘテロ原子を含む脂肪族炭化
   水素鎖および／または芳香族鎖を意味し、これが常にもう一方の末端に、担体と
   して機能する分子と化学結合を形成することができる官能基NH₂、COOR、CHO、SH
   またはその前駆体を有する、請求項３記載のオリゴ糖の混合物。
4. 【請求項４】 式（ホスフェート-リボーサ-リビトール）nまたは（リボー
   ス-リビトール-ホスフェート）nの反復単位を含むオリゴ糖の混合物を合成する
   方法であって、塩基性溶媒中で立体的に妨害された酸の活性な誘導体となりうる
   促進物質の存在下で、オリゴマー鎖の成長を停止させるアクセプターとして反応
   に関与するスペーサーと共に、二糖類誘導体19または23に適用される一段階の重
   縮合反応が行われる方法。
5. 【請求項５】 二糖類中間体19または23および促進物質がモル比１／１〜３
   で存在する、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 促進物質がエステルによって妨害された酸の活性誘導体であ
   る、請求項４および５記載の方法。
7. 【請求項７】 促進物質が好ましくは塩化ピバロイル、塩化アダマントイル
   、または燐酸の活性誘導体である、請求項４〜６に記載の方法。
8. 【請求項８】 二糖類中間体19または23およびスペーサーがモル比５〜10/1
   で存在する、請求項４記載の方法。
9. 【請求項９】 二糖類が19、スペーサーが24、促進物質が塩化ピバロイル、
   および溶媒がピリジンである、請求項４〜８記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項４〜９記載の技法に従って得られた化合物に、ホス
    ホネートのホスフェートへの燐酸化をさらに行い、その後水素添加によって、ベ
    ンジル保護基を除去し、スペーサーの脱保護または活性化、そして一つまたはい
    くつかの分子ふるいプロセスによって４より小さく25より大きい反復単位の分画
    が除去される、請求項１〜３記載のオリゴ糖混合物を合成する方法。
11. 【請求項１１】 上記のオリゴ糖混合物が蛋白質、ペプチド、または脂質か
    らなる群より選択される担体分子に会合している、請求項１〜３記載のオリゴ糖
    混合物を含む免疫原。
12. 【請求項１２】 b型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）によっ
    て引き起こされる感染疾患を予防するための、アジュバントまたは他の添加剤と
    共に、または含まずに調製された請求項11記載の免疫原を含むワクチン。
13. 【請求項１３】 抗B型肝炎、抗髄膜炎菌A、Bおよび／またはC、DPT、抗ポ
    リオ、抗肺炎球菌１、５、6B、6A、14、19F、19^aおよび／または23Fのような他
    のワクチン、またはそのそれぞれの免疫原の組み合わせと組み合わせて用いられ
    る請求項12記載のワクチン。
14. 【請求項１４】 2,3,4-トリ-O-ベンジル-5-O-アリル-D-リビトール14をリ
    ボフラノースペルアセテートによってリボシル化した後、脱アセチル化すること
    によって化合物４を生じ、これをさらに精製するためにシリカゲル中で吸収脱着
    を行うことによる、二糖類中間体2,3,4-トリ-O-ベンジル-5-アリル-(β-D-リボ
    フラノシル)-D-リビトール4を純粋な形で合成する方法。
15. 【請求項１５】 トルエン、ベンゼン、テトラヒドロフラン、またはキシレ
    ンのような溶媒において、比１：0.5〜２：0.001〜１、0.5〜10：1〜５で、酸化
    ジブチルスズ、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、水素化ナトリウム、および塩
    化ベンジルによる二糖類４のジベンジル化プロセスによって、式５の化合物を生
    じた後アリルをプロペニルに異性化することを含む、二糖類中間体17の合成方法
    。
16. 【請求項１６】 誘導体19および23の合成における中間体としての二糖類5-
    O-プロペニル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(2',5'-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフ
    ラノシル)-D-リビトール17。
17. 【請求項１７】 請求項５〜７のオリゴマー形成プロセスにおける重要な中
    間体としての二糖類誘導体2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(2',5'-ジ-O-ベンジル-
    β-D-リボフラノシル)-D-リビトール-5-O-トリエチルアンモニウムホスホネート
    23および2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-(2',5'-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシ
    ル)-D-リビトール-3'-O-トリエチルアンモニウムホスホネート19。
18. 【請求項１８】 三塩化燐-イミダゾールによる燐酸化プロセスの後にプロ
    ペニル基の加水分解またはアセチル化、プロペニル基の加水分解、および三塩化
    燐-イミダゾールの燐酸化の後に脱アセチル化を含む、二糖類17から開始する二
    糖類19または23の調製方法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜３のオリゴ糖混合物を合成するための二糖類19
    または23の使用。
20. 【請求項２０】 オリゴ糖混合物が免疫学的に不活性なポリマー材料に会合
    している、請求項１〜３記載のオリゴ糖混合物を含む高分子。
21. 【請求項２１】 請求項18記載の高分子の使用からなるb型インフルエンザ
    菌（Haemophilus influenzae）の莢膜多糖類に対する抗体の検出および定量のた
    めの請求項20記載の高分子の使用。