PT86484B - Processo para a preparacao de oligossacarideos, de imunogenios e de vacinas contendo tal imunogenio - Google Patents

Processo para a preparacao de oligossacarideos, de imunogenios e de vacinas contendo tal imunogenio Download PDF

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Description

presente invento refere-se ao processo de preparação de novos oligossacarídeos que compreendem a estrutura (D-ribose-D-ribitol-fosfato) , (D-ribitol-fosfato-D-ribose)m ou Çfosfato-D-ribose-D-ribitol) , sendo m 2,3,4, .... 19 ou 23, o qual compreende a substituição dos grupos protectores num oligossacarídeo com a estrutura referida, por um átomo de hidrogénio e tendo sido, no referido oligossacarídeo, o átomo de hidrogénio dos grupos hidroxilo livres substituído por um grupo protector. 0 invento refere-se ainda ao processo de preparação de imunogénios e de vacinas as quais são úteis no tratamento de infecçães provocadas pelo'haemophilus Influenzae tipo b.
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-2mEhCRIA DESCRITIVA invento refere-se a novos oligcssacáridcs contende unidades D-ribose, D-ribitel e fosfato, a imunegenes contendo tais oligossacáridos, a vacinas contendo tais imunegenes e a processos para preparar tais oligossacáridos, imunegenes e vacinas.
ú polissacáriuc capsular ua bactéria Haemophilus influenzae tipo b consiste de muitas uniuades de D-ribose-D-ribitol-fosfato (—j>3)-D-ribf-(l—£ l)-ribitcl-(5—^PC^-). o Haemophilus influenzae tipo b é, inter alia, uma bactéria patcgénica que provoca meningite e outras uoenças infeccicsas.
Verificou-se que a imunidade pode ser obtida através da administração ao polissacárido capsular uc Haemcphilus influenzae tipo b (HIB). Verificou-se também que, em particular, em crianças com menos de 2 anos ae iaaae, a imuniaaae obtida é de curta duração e em crianças com menos ae lo meses de idade, não pode ser detectada. Isto pode ser melhorado administrando c polissacárido capsular associado ao denominado transportador ti mo-dependente (proteína). Tais conjugados polissacárido-proteí na têm a desvantagem de a estrutura r.ãc está rigcrosamente definida e de a porção polissacárido no prcauto não ser homogénea. Isto tem como consequência que cada lote de vacina acabado ae preparar que contenha tais conjugaacs tem de ser testado em ani mais e/ou humanes experimentais em relação à eficácia da vacina. Em adição, a utilização de um tal proouto numa vacina pode produzir anticorpos ou tcxiciuade indesejades.
Os oligossacáridos obtiaes através õa degradação ao polissacárido capsular ao HIB também não sãc puros, embora melhor definidos. Neste caso, também, a eficácia terá sempre que ser novamente testada.
Existe, portanto, a necessiuade de uma vacina, contra a doença por HIB contendo um fragmento de oligossacárido puro, ri gorosamente descrito, i.e. um fragmento ue oligossacárido que não contenha oligossacáridos possuindo uma estrutura cu comprimento de cadeia aíferentes.
Verificou-se agora que se pedem obter tais oligossacáridos puros por uma via sintética e que se podem obter imunegenes ade
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quaacs associando tais fragmentes corn um transportador. Tais imunogenes podem ser usados em vacinas. (,· facto de que um tal cligossacárido possa ser preparaao per uma via sintética tem também a vantagem de que a aispcnibilidade nãc fica dependente da disponibilidade aa bactéria patcgénica HIB.
invento refere-se, portanto, ao processo de preparação de cligossacáridos que compreenuem L-ribose-L-ribitol-fosfato, D-ribitol-fcsfato-n-ribese cu fosfato-L-ribose-L-ribitcl 2,3,4 .... 19 ou 20 vezes e, em particular, a cligossacáridos possuin do a fórmula:
na qual
K - 0 ou 1 se L - 1,
K - G se L = C,
L = 0 cu 1,
Π1 - d , 3 · > ... 19 c-u 20, uesde que : a possa ser 1, se X, L e η - 1,
ou se L, n e q - 1,
n = 0 ou i5
q - c ou 1 se n — 1,
q = c se n = 0
X = hidrogénio,um grupo reactivo que é capaz de formar,uirecta ou indirectamente, uma ligação com um transportador, cu um grupo possuindo uma cadeia hidrcfóbica na extremidade não li gada, ou c grupo terminal Xó- é substituído pele grupo reac-
tivo HJ\- ou Ho-, e = hidrogénio, um grupo reactivo que é capaz de formar, directa cu inuirectamente, uma ligação com um. transportador, ou um grupo com uma caueia hiarofcbica na extremidade não ligada, cu o grupo terminal -CY é substituído pelo grupo reactivo cu -SH,
hiuregénie se
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X / hidrogénio ou que X hidrogénio se Y / hidrogénio e seus sais.
C invento refere-se também ac processe de preparação de imunogenes contendo um oligossacárido como acima descrito, cujo oligossacárido está associado a um transportador, cu contendo uma associação de diversas moléculas de um oligossacárido comc acima descrito, e a vacinas que contêm tais imunegenes.
I'ão tendo em conta X(XO-) e Y(-GY), o esqueleto D-ribcse-D-ribitcl-fosfato como mostrado na fórmula 1 pocie terminar tan to no laao esquerdo como nc lado direito, num grupe ribese, ribitol ou fosfato. Cs cligossacáridos que, desprezando X(XO-) e Y(-OY), terminam num grupo ribitol cu ribese à esquerda e num grupe fosfato a aireita, cu num grupo ribitol eu ribose à direi ta e num grupo fosfato à esquerda são, contuuo, preferidos. De preferência, m é igual a 2,3,4,5 ou 6 visto que um esqueleto de oligossacárido com um tal comprimento está geralmente já ade quado em relação ao objecto em vista, úais preferivelmente, m é igual a 3,4,5 cu 6.
De preferência, K,L,n e q são iguais a zero, X é igual a H e Y não é igual a H.
Como os grupos fosfato nos cligossacáridos de acordo com c invente existem no estado ionizado em solução a,por exemplo,pH neutro, os cligossacáridos ue acordo com c presente invento são preparados de preferência sob a forma ue um sal, por exemplo um sal de sódio.
Como os oligossacáridGS ue acordo cem o presente invento nac têm per se qualquer imuncgenicidade,cu têm imuncgenicidade inaae quaaa,é necessário associar cs ditos cligossacáridos a um transportador, como resultado da qual a dita imunogenicíãade é de facto obtida num grau suficiente.Dependendo do tipo de transportador, variará a forma na qual o oligossacárido é associado ao transpor tadcr.A associação do oligossacárido e ao transportador procede directa cu inairectamente via.X(XC-)ou Y(-GY)na fórmula 1.
Se X e Y são hidrogénio, o oligossacárido terá qe ser modificado num desses locais para fazer a associação com o possível transportador. Gemo- cs grupos -OH e t=C apresentados na formula 1, que são activos em maior ou menor grau, são protegidos por
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-.i*w
um período de tempo maior ou menor aurante a preparação dos oligossacáridcs de acordo com o inv-nto, é vantajoso introduzir as modificações necessárias para a associação com o transportador antes dos grupos protectores serem removidos. Como já mencionauo, a associação do oligcssacáriâo com o transportaaor efectua-se via X(XO-) ou via Y(-CY). Ias se X e Y fossem hidro génio na fórmula 1, os grupos protectores teriam cie ser introduzidos novamente antes do grupo necessário para a associação com o transportador poder ser introauziào. X é portanto, de preferência igual a hiurogánio e Y(-GY) igual a um aos outros grupos especificados cu Y é igual a hidrogénio e X(XC-) igual a um dos outros grupes especificaaos.
Daqui em diante, se X ou Y” cu g termo grupo reactivo são usados, significa também em qual grupo reactivo consiste o grupo reactivo -NH^ cu -3H, tornanuo-se necessário· ler -Nru cu -SH respectivamente para XO- cu para -GY. G oligossacárído de acordo com o presente invento termina, portanto, de preferência numa extremidade, num grupo hidroxilo e na outra extremiaade num grupo reactivo ou num grupo possuindo uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada. A escolha entre estes dois tipos de grupos é determinada pela forma na qual a associação do oligossacárido e dc transportador é conseguida. Sm principie, existem disponíveis aois processos conhecidos rer se para esta finalidade. De acordo coro o primeiro processo, o oligossacáridc é ligado ao transportaaor. Neste caso, o transportador é, usualmente, uma proteína . De acordo com c segunde processo, a associação úo oligossacárído é obtida por· uma interaeção hiarofebica entre um grupo ligado ao oligossacárído possuindo uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada e c transportador, sendo o transportaaor uma micela, uma vesícula ou um lipossema, ou por uma interaeção hidrofética uos oligcssacáridos entre si. No primeiro caso, o grupo hidrofóbico entra numa interaeção hidrcfcbica com as regiões hidrofcbicas aos compostos anfifílicos (lípidos) na micela, na vesícula ou no lipossoma, enquanto o oligossacárído termina na interface da micela, da vesícula ou do lipossoma.
São conhecidos os grupos reactivos que são capazes de forό7 122 uA/o9^0-161
-υmar, uirecta ou indirectamente, uma ligação com uma proteína. Por uma ligação indirecta neste contexto entende-se que a ligação é efectuada entre o grupo reactivo e a proteína através de um composto adicional. Se X cu Y na formula 1 for um grupo reactivo, todos os grupos reactivos capazes de formar uma ligação com um carboxilo, amina ou outra função reactiva da proteína opcionalmente introduzida, cu aqueles que pouem ser ligados através de um composto adicional a um carboxilo, amina, ou outra função reactiva da proteína opcionalmente introduzida, sãc. em princípio adequados.
Exemplos de tais grupos reactivos são os grupos possuindo
I a seguinte função reactiva:
—U—alquilvC
pode consistir de uma destas funções reac
C grupo reactivo tivas ou, se c grupo reactivo for maior, pode conter uma uas ditas funções reactivas, caso em que c grupo termina de preferência numa das ditas funções reactivas.
Se as unidades ribose-ribitol-fosfato no oligossacárido estiverem a alguma distância da proteína após ligaçãG ao oligos sacáriáo à proteína é vantajoso na promoção ua imunogenicidade que o grupo reactivo seja de preferência, um grupo bastante Icn go com uma das funções reactivas acima mencionadas.
Come foi dito, um grupo reactivo é incorporado na extremída de do esqueleto do oligossacárido ue preferência quando o dito
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- . ·ί
-7esqueleto está ainaa protegiao. Uma vez que um grupo reactivo contendo uma das ditas funções reactivas tenha siao incorporado, a dita função reactiva pode ser convertida numa das outras funções reactivas se c esqueleto cligossacárido estiver ainda protegido, mas também se o esqueleto já estiver ccmpletamente desprotegido.
Assim, osg?upos reactivos contendo uma função -NH2 tal como
e-XCH„1_
d. d <p.
-HH —C amino ác i uo)c UH2 na qual a = 0-16, b = 0-2, c - 1-10 e o aminoácido terminal é de preferência glicina, pouem através de um composto contendo um éster activo e uma função maleimida, ser convertidos num. gru po reactivo contendo uma função maleimida (cs altos grupos aeram, com
na qual R tem c mesmo significado que na página (6), os grupos
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Além disso, os grupos reactivos contendo uma função -NH^ podem ser convertidos através de um composto contendo duas funções éster cu aldeído activas num grupe reactivo contendo um éster ou aldeído activo como função reactiva, por exemplo,
H
I
- N-C-(CHO) ,-C-R
II 2 d II
0 na qual R tem c mesmo significado que na página (6) e d = 1-6, cu através de um composto contendo um éster activo e uma função -SH num grupo reactivo contendo uma função -SH, por exemplo,
-NH-C-(CHO) q-SH ou -liH-C-CH-(CHoK-SH || 2 d H| u
C NHAc na qual d = 1-6 e Ac = = acetil
Os grupos reactivos contendo uma função -SH podem ser convertidos através de um composto contendo Ui éster activo e uma função maleimida num grupo reactivo contendo um éster activo como a função reactiva, por exemple,
Os grupos reactivos contendo um grupo -C-R como a função reactiva podem ser convertidos, por reacção com compostos contendo uma função -NH^ e —SH ou uma função maleimida e -HH^, num grupo reactivo contenuo, respectivamer.te, um grupo -SH ou maleimida como função reactiva.
Tais conversões ao grupo reactivo são conhecidas per se na literatura.
Os oligossacáridos assim preparados de acordo com c invento estão ligados a uma proteína ou a um peptíao. Cs grupos
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reactivos -NHg, -COOH ou -SH na proteína, podem ser convertidos num dos outros grupos reactivos acima descritos por um processo análogo àqueles aqui uescritos.
C oligossacárido de acordo com o invento e a prGteína podem então ser ligados entre si, inter alia, da seguinte forma: oligossacárido - maleimida + HS-proteína—>imuncgénio oligossacárido - SH + maleimida-proteína—>imunogénio oligossacárido - SH +
S-proteína—>imunogenio oligossacárido - S-S
+ HS-proteina^irnunogénic o
1' oligossacárido-C-R + H^N-proteína—>imunogénic 0 , il , . , oligossacarido-NH2 + R-C-proteina—/irnunogemo, nas quais R tem c mesmo significado que na página 6.
Tais ligações podem ser efectuadas directa ou indirectamente
Além disso, os oligossacáridos com uma função -NHg reactí va podem, por exemplo, ser ligados a um grupo NHg de uma proteína através de um agente de ligação, tal como ésteres bis/”N-hidroxissuccinimida_7 ou dialdeído glutárico.
Se X ou Y na fórmula 1 for um grupo contendo uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada, aqueles grupos são adequados para esta finalidade e são capazes de entrar numa interacção hidrofóbica com uma micela, uma vesícula ou um lipcssoma, ou são capazes de formar uma micela através de interseções hidrofóbicas.
A cadeia hidrofóbica é, de preferência, um grupo alquilo contendo 12-24 átomos de carbono. E dada maior preferência a grupos nos quais o grupo alquilo contendo 12-24 átomos de carbono forma o dito grupo.
Ainda mais preferivelmente, o grupo é um grupo alquilo não ramificado contendo 14-22 átomos de carbono.
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-.'-' ,:
-10Os oligossacáridos de acordo com o presente invento podem ser usados adequadamente para produzir uma vacina contra a aoença por HIB. Como os oligossacáridos de acordo com o presen te invento não são imunogénicos per se, devem ser associados a um transportador que dê imunogenicidade à associação. Este prin cipic é conhecido per se nos chamados haptenos, os quais, embora não sejam imunogénicos per se, podem ser tornados imunogénicos associando-os a um transportador. Transportadores adequados são proteínas, péptidos, micelas, vesículas e lipossomas. A maior preferência é dada a proteínas ou a micelas.
Como proteínas e péptidos especialmente adequados, têm-se mencionado toxina tetânica, toxóide tetânico, toxina de difteria toxóide da difteria, toxina de pertussis, toxóide da pertussis, hemaglutinina filamentosa da pertussis, fimbriae da pertussis, proteínas da membrana externa da pertussis, proteínas da membra na externa de meningococcis (Neisseria meningitidis), proteínas da membrana externa do fíaemcphilus influenzae, fimbriae do Haemophilus influenzae, proteínas de sub-unidades de vírus polio e proteínas de sub-unidades de vírus do Sarampo. São preferidas as proteínas dc Haemophilus influenzae. Uma vantagem de tais transportadores é que eles sãc ou podem ser usados em vacinas DPTP existentes. As ditas proteínas são conhecidas per se, bem como os processo de isolamento de tais proteínas. São também conhecidos processos de associação de sacárido a tais proteínas. Geralmente está envolvida uma ligação covalente entre o sacárido e a proteína.
Se X ou Y na fórmula 1 for um grupe contendo uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada, o cligossacárido pode ser tornado imunogénico de uma forma apropriada associando o dito oligossacárido a micelas, vesículas ou lipossomas. A associação é obtida através de uma interaeção hidrofóbica da cadeia hidrofóbica com partes hidrofóbicas da micela, da vesícula ou do lipossoma. Tais processos de associação são conhecidos per se.
Se X ou Y na fórmula 1 for um grupo reactivo, pode-se efectuar opcionalmente em primeiro lugar uma reacção com um composto contendo um grupo reactivo e uma cadeia hidrofóbica. 0
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-11produtc assim obtido pode então ser associado a micelas, vesículas ou lipossomas.
Outro processo de dar imunogenicidade aos oligossacáridos de acordo com o invento consiste em tratar os oligossacáridos nos quais X ou Y é um grupo contendo uma cadeia hictrofóbica na extremidade não ligada de uma forma tal que as ditas cadeias hidrofóbicas formem uma estrutura de micela através de interacções hiarofóbicas. Neste caso, a imunogenicidade não é obtida por uma associação do oligossacárido com um transportador mas por associação de diversas moléculas do dito oligossacárido entre si.
Ainda uma outra possibilidade de preparar um imunGgénio consiste em ligar os oligossacáridos de acordo com a fórmula 1 na qual X ou Y é um grupo reactivo, a uma molécula adjuvante anfifílica através ae uma ligação covalente via 0 dito grupo reactivo. Esta associação pode ser directa ou inairecta. Após ligação do oligossacárido e do adjuvante, a extremidade não ligada do adjuvante pode formar uma micela possivelmente com um adjuvante não ligaao ou com outras substâncias lipídicas. São ad juvantes anfifílicos adequados, por exemplo, avridina (Ν,Ν-dioctadecil-N1,N,-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina), a amina lipoidal 4-aminometil-l(2,3-(ãi-n-àeciloxi)-n-propil)-4-fenil-piperidina, brometo de dimetil-dioctadecilarnónic, dipéptido de dilaurilmuramilo, tetrapéptido de laurilo, ácido (N -/ N-(N-lauril-L-alanil)- -D-glutamil_7-Nú-( glicil)-D,D-L,L-2,6-diamina-pimélico, L-tirosina e seus derivados alquílicos, tetrapalmitato de maltose, polióis plurónicos, azobenzeno-p-arsonato de L-tirosina, monocleato de sorbitano (Span 8θ), derivados da trthalose (tais como dimicolato de tre-halose) ácido retinoílico e seus derivados, D,L-Oo-tcccferol (vitamina E), lípido A e análogos e glieosidos, tais como, por exemplo saponinas (por exemplo, Quil A da casca da Quillaja Saponaria Molina).
Tais imunogénios e métodos para preparar estes imunogénios são conhecidos per se pelo pedido de patente europeia 86.2OO.2O3>7 0 lípido A e análogos são conhecidos como adjuvantes através do pedido de patente Alemã 8.5OC.499· θ use de saponinas como adjuvantes e a formação de micela de saponinas ligadas a determi67 122 CA/Ο980-161
-12fiantes antigénicos são conhecidos por meio do Pedido de Patente Alemã 8.303-646.
Os imunogénios de acordo com 0 presente invento podem ser usados apropriadamente na preparação de uma vacina contra a doença HIB. Para melhorar ainda mais a imunogenicidade, pcaem-se usar, com vantagem, aajuvantes. 0 uso de tais adjuvantes e os referiaos adjuvantes são conhecidos per se. Os adjuvantes podem ser adicionados ao imunogénio. S também possível associar adjuvantes ao imunogénio. Tais métodos de melhoramento da imunogenicidade são também conhecidos per se. Os imunogénios de acorde com 0 presente invento, compreendem assim, além das associações de oligossacáridos com transportadores e das associa ções entre os próprios oligossacáridos, associações dos dois tipos referidos com as quais se associa também um adjuvante.
A vacina de acordo com o presente invento contém, pelo menos, imunogénios de acordo com o presente invente. Usualmente c imunogénio estará na vacina numa solução, emulsão ou suspensão aquosas às quais se podem fazer adições que são habituais em vacinas, tais como, de adjuvantes, estabilizantes, tampões e outros imunogénios. Adjuvantes adequados que podem ser adicionados são hidróxido, fosfato ou óxido ae alumínio, ou uma composição que consiste num óleo mineral, por exemplo àíarcol 52, ou um óleo vegetal e um ou mais agentes emulsionantes, tal como Tween 80 ou Span 80, ou um dos adjuvantes anfifíliccs já mencionados anteriormente.
São estabilizantes adequados carbo-hidratos tais como sorbitol, lactose, manitol, amido, sacarose, dextrano e glucose cu proteínas tais como albumina ou caseína.
Como tampões é possível usar, por exemplo, um tampão de fosfato de metal alcalino, de carbonato de metal alcalino ou de carbonato de metal alcalino-terroso.
Como já mencionado, a vacina pode também conter outros imunogénios. Neste caso tem-se o chamado cocktail que tem a vantagem ue se conseguir imunidade contra vários patogenes por meio de uma única auministração. Gutros imunogénios que podem ser usados sãc, por exemplo, os imunogénios usados nas vacinas DPTP conhecidas. A vacina é preparada de acordo com métodos conhe67 122
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-13.,»·,·'*1*·' h''5 ;,· „.Λ*”'/*' eidos per se usando um imunogénio de acordo com o presente invento, por exemplo, por dissolução, emulsão ou suspensão do imunogénio num meio aquoso. Pode adicionar-se um ou mais dos aditivos usuais ao referido meio aquoso ou estes podem estar nele presentes.
Uma tal vacina pode ser usada para imunização contra a doença HIB mas também, para a assim chamada inoculação (na qual o corpo não é directamente estimulado para formar anticorpos livres específicos, mas é na realidade pré-condicionado de modo que, após infecção subsequente ou revacinação seja provocada uma reacção imunológica forte). A vacina é habitualmente administra da por rneio de injecção intra-muscular ou subcutânea, Em geral, a quantidade de imunogénio administrada por injecção estará entre 0,1 e 100 jug por dose.
A vacina, de acordo com o presente invento oferece, em prin cípio, protecção a todos os indivíduos contra a doença por HIB e é extremamente adequada, em particular, para vacinação de crianças pequenas (menos de 2 anos de idade) . Como resultado da pu reza do oligossacárido de acordo com o presente invento, não é necessário testar cada lote de vacina contendo tal oligossacárido, preparado, em relação à sua eficácia. Além disso, limitam-se com uma tal vacina a quantidade de anticorpos indesejávelmente estimulados, e a ocorrência de outros efeitos secundários, como toxicidade.
Os oligossacáridos de acordo com o presente invento podem ser preparados fazendo reagir uns com os outros, em vários passos, diversos compostos seleccionados do grupo que consiste em compostos que contêm unidades ribose, ribose-ribitol, ribose-ribitol-fosfato, ribitol, ribitol-fosfato, ribitol-fosfato-ribose, fosfato, fosfato-ribose e fosfato-ribose-ribitol, sendo as referidas unidades providas com os grupos protectores necessários, e finalmente removendo os grupos protectores. Os oligossacáridos de acordo com o presente invento são preparados principalmente por substituição dos grupos protectores nos oligossacáridos por um átomo de hidrogénio, os quais compreendem a estrutura (D-ribose-U-ribitol-fosfato)n, (D-ribitol-fosfato-D-ribose)n ou (fosfato-D-ribose-D-ribitol)n, onde n= 2,
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-143,4··· 19 ou 20 e onde o átomo de hidrogénio nos grupos hidroxi livres foi substituído por um grupo protector. Ha generalidade sabe-se que os oligossacáridos podem ser preparados ligando uni dades maiores ou menores umas às outras, a partir das quais o oligossacárido final é construído por meio de várias reacçães, sendo as unidades providas com os grupos protectores necessários. Depois do oligossacárido desejado ter sido construído, os grupos protectores são removidos. 3e um dos grupos á e Ϊ na fór mula 1 de acordo com a página das fórmulas anexa não é hidrogénio , e estes grupos não ocorrem nos compostos a partir dos quais o oligossacárido foi construído, estes grupos devem ser também incorporados antes dos grupos protectores serem removidos.
Os oligossacáridos de acordo com o presente invento podem ser preparados partindo de um composto de fórmula 2 de acordo com a página das fórmulas. Partindo deste composto há vários métodos de preparar os oligossacáridos de acordo com o presente invento.
primeiro método consiste em construir o oligossacárido por incorporação contínua de uma unidade pequena. Isto pode ser realizado por fosforilação de compostos de fórmula 2 com compostos de fórmula 3 acoplando em seguida um composto de fór mula 5 ao grupo fósforo, repetindo estes dois passos tantas ve zes quantas as desejadas, e finalmente, terminando a construção por reacção com um composto de fórmula 6 de acordo com a página das fórmulas, após a qual, os grupos protectores devem ainda ser removidos. Outro método consiste na fosforilação de um com posto de fórmula 5 com um composto de fórmula 3, ligação do pro duto ootido, por meio do produto fósforo, a um composto de fórmula 2, repetição deste passo, tantas vezes quanto desejadas e, finalmente, terminação da construção por reacção com um composto de fórmula 6, de acordo com a página das formulas, após a qual os grupos protectores devem ainda ser removidos. 0 invento refere-se assim, em particular a um método de preparação dos oligossacáridos de acordo com o presente invento caracterizado por
1) um composto de fórmula 2 de acordo com a página das fór mulas é reagido com um composto de fórmula 3 de acordo com a página das fórmulas, fórmulas nas quais:
Ó7 122
0A/C980-161
-1?K — 0 se L - Cl,
K=G ou 1 se L = 1,
L = 0 cu 1
R^= a um grupo protector permanente, um grupo reactivo capaz de formar directa ou indirecta mente uma ligação com um transportador, e que contém uma função reactiva que tem um grupo protector permanente, ou um grupo contendo na extremidade não ligada uma cadeia hidrofóbica, ou o grupo terminal ® su“ bstituído pelo grupo reactivo Hgn ou HS-, grupo reacti vo que é provido com um grupo protector permanente.
Rg= a um grupo protector permanente
A = a um átomo de oxigénio ligado por meio de uma ligação dupla ao átomo de fósforo ou a nada (neste caso o átomo de fósforo tem um par de electrces livre),
a um grupo reactivo, e a um grupo reactivo ou um grupo de fórmula 4 de acordo com a página das fórmulas na qual q = 0 ou 1, Rg = a um grupo protector permanente e R^ = a um grupo protector permanente, um grupo reactivo que e capaz de formar, directa ou indirectamente uma ligação com um transportador e que contém uma função reactiva que tem um grupo protector permanente, ou um grupo com uma cadeia hiarofóbica na extremiaade não ligada, ou 0 grupo terminal -OR^ é substituído por um grupo reactivo HgNou HS-, grupo reactivo que é provido com um grupo pro tector permanente, e por
2) se R^ não é um grupo de fórmula 4, o produto obtido no passe 1) é reagido com um composto de fórmula 5 de acordo com a página das fórmulas onde Rg ® grLLP° protector permanente e
R é um grupo protector temporário sendo o produto assim obtido desprotegido por substituição de R^ por um átomo de hidrogénio e por
3) o passo 2) ser repetido m-2 vezes com produto obtido no passo 2) em lugar do produto obtido no passo 1) e por
4) o produto obtido no passo 2) ou no passo 3) ser reagido com um composto de fórmula 0 de acordo com a página das fórmu67 122
OA/C980-161 .4
G'·-'· j'”*
-16las, na qual
R2 = a um grupo protector permanente,
R_ = a um grupo reactivo,
R? = a um grupo protector permanente, um grupo reactivo capaz de formar uma ligação, directa ou inairectamente com um transportador e que contém uma função reactiva que tem um grupo protector permanente, ou um grupo com uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada, ou o grupo exterior R^G- é substituído pelo grupo reactivo H2N- ou HS-, grupo reactivo que é provido com um grupo protector permanente, n = G ou 1, q - C se n = 0, q = 0 ou 1 se n = 1, e por
5) no produto assim obtido o grupo protector permanente R^ ou R?, se presente e se desejado, é substituído por X ou Y desde que X ou Y não sejam hidrogénio e por
6) o composto obtido no passo 1), 4) ou 5) ser desprotegido por substituição dos grupos protectores permanentes por um átomo de hidrogénio.
invento refere-se também a um processo para preparar oli gossacáridos de acordo com o presente invento, caracterizado por
1) um composto de fórmula 2 de acordo com a página das fór mulas, na qual K, L, R^ e R2 têm o mesmo significado que acima, ser reagido com o produto de reacção de um compos to de fórmula 3 de acordo com a página aas fórmulas, na qual R2? R^ © R^ têm 0 mesmo significado que acima, com a condição de que não seja um grupo possuindo a fórmu la 4 de acordo com a página aas formulas de um composto de fórmula 5’ de acordo com a página das fórmulas, na qual R2 e R^ têm o mesmo significado que acima, e o produto assim obtido ser uesprotegido substituindo R^ por um átomo de hidrogénio e por
2)oproduto obtido no passo 1) ser reagido com o produto de reacção de um composto de fórmula 3 um composto de formula 5 de acordo com a página das fórmulas, sendo o
122
OA/C980-161
-17produto assim obtido desprotegido substituindo R/ por um átomo de hidrogénio e por este procedimento ser repetido m-3 vezes como produto obtido, e por
3) 0 produto obtido no passo 1) ou 2) ser reagido com um composto de fórmula 6 de acordo com a página das fórmulas, na qual n, q, R^, R^ e R? têm os mesmos significados que anteriormente, e por
4) no produto assim obtido, 0 grupo protector permanente ou Ry, se presente e se desejado, ser substituído por
X ou Y desde que X ou Y não seja hidrogénio, e por
5) o composto obtido no passo 3) ou 4) ser desprotegido por substituição dos grupos protectores permanentes por um átomo de hidrogénio.
R^ Pode ser um grupo protector permanente ou se X no oligos sacárido desejado não for hidrogénio, pode ser igual a X, com a condição dequq^unção reactiva esteja provida com um grupo protec tor permanente em consequência do qual a função reactiva não entra em nenhuma reacção durante a formação do esqueleto do oligossacáriao. Uma vez que X na fórmula 1 é de preferência hidrogénio, R^ é de preferência um grupo protector permanente.
R^ é um grupo protector permanente.
R- na fórmula 3 ® um grupo reactivo e, é ura. grupo reactivo ou um grupo ue fórmula 4. Uma vez que Y é de preferência diferente de hidrogénio, R^ na fórmula 4 é de preferência um grupo que não um grupo protector permanente. Uma vez que k, L, n e q são preferivelmente zero, R^ é, ae preferência um grupo reactivo e, em consequência, não é um grupo de fórmula 4.
Pele termo grupo protector permanente significa-se grupos que durante todo 0 decurso da preparação dos oligossacáridos de acordo com o invento exercem a sua influência protectora sobre os - de outro 'modo - grupos reactivos. Só após a síntese ter sido completamente efectuada, são removidos os grupos protectores permanentes substituindo-os por um átomo de hidrogénio. Tais grupos protectores são conhecidos na química aos nucleótidos e dos açúcares.
Os grupos Rg na fórmula 2, 3, 4, 5 ® 6 podem ser grupos iguais ou diferentes, escolhidos, de preferencia do conjunto de
122
OA/O980-161
-18grupos seguintes: benzoílo, benzilo, benziloximetilo, 2-clorofenil, benziloxicarbonilo, terc.-butildifenilsililo, alquilo com
10-20 átomos ae carbono, tetra-hidropiranilo, terc.-butildimetilsililo e tritilo. De preferencia, R2 nas unidades ribitol é benzilo. Se R^ ou R^ são ou contêm grupos protectores permanen tes, gs referidos grupos podem ser apropriadamente escolhidos do conjunto anteriormente mencionado. 0 mesmo se aplica a R„ na fórmula 3 Que é, preferivelmente 2-clorofenilo.
De preferência, R^ na fórmula 2 juntamente com na posição 5' da unidade ribose, forma um grupo -Si - 0 - SiI I (íc3h9)2 (íc3h9)2 (neste caso, K e L são iguais a zero) ou R2, na posição 5' da unidade ribose, e R^ são benzilo.
De preferência, R2 na posição 2' da unidade ribose é benzilo, benziloximetilo, tetra-hidropiranilo ou terc.-butildimetilsililo preferindo-se benzilo e benziloximetilo, e R2 na posição 5’ da unidade ribose na fórmula 4, 5 e 6 é benzilo, benziloximetilo, tetra-hidropiranilo, tritilo ou terc.-butildifenilsililo, preferindo-se benzilo e terc.-butildifenilsililo.
Os grupos reactivos R3 e R^ na fórmula 3 podem ser grupos que são capazes, em conjunto, de efectuar uma ligação entre os grupos OH livres em compostos de fórmula ) e 2. São compostos adequados de fórmula 3:
lí
Cl— P —Cl , Cl- 1 - P---( 1 ) —CHO— CHÒ— CN, cL d.
* or2 or2
Cl — 0 II P — 0-- CH„ - | d _CC1O 3 e (alquil 0χ -C1()) N - P - 1 N( alquilC^.) 2
0¾ 0R2
.....
*·- ií^ jJT '
-196η 122
0A/09SG-1Ó1
A reacção entre compostos de fórmula 2 e 3 tem lugar, habitualmente à pressão atmosférica e a uma temperatura entre zero e 6C° centígrados durante 2C minutos - 3 horas.
Sm seguida, o produto assim obtido é reagido com um composto ae fórmula 5 na qual Rg ® Uia gnupo protector permanente e R^ é um grupe protector temporário.
Em relação a Rg aplica-se o que já foi focado anteriormente sobre a fórmula 2. Um grupo protector temporário, significa neste contexto que se utiliza um grupo que exerce a sua função protectora durante uma parte da construção do esqueleto do oligossacárido, de modo a, subsequentemente, antes da construção estar completada, ser removido selectivamente, i.e. sem que os grupos protectores permanentes sejam removidos. Tais grupos são conhecidos na química dos nucleótidos e dos açúcares. Grupos adequados são: alilo, 1-propenilo, dimetoxitritilo, cloroacetilo, bromoacetilo, levulinoílo e aliloxicarbonilo. A maior preferência para é para alilo e 1-propenilo.
A reacção com o composto possuindo a fórmula 5 efectua-se geralmente à pressão atmosférica e a uma temperatura entre 0 e 6C°C durante 20 min - 3 horas.
Após reacção com o composto de fórmula 5? o grupo é selectivamente removido, geralmente à pressão atmosférica e a uma temperatura de 0 a 6o°C durante 10-60 min, e é substituído por um átomo de hidrogénio.
Depois, se desejado, a reacção com um composto de acordo com a fórmula 3? desde que R^ seja um grupo reactivo, a reacção com um composto de acordo com a fórmula > e a substituição de R^ por um átomo de hidrogénio podem ser repetidas m-2 vezes. As condições sob as quais estes passos são efectuados são as mesmas do que para os passos equivalentes já descritos anteriormente.
Em seguida, o produto obtido é reagido com um composto de fórmula 6 de acordo com a página das fórmulas, e R^, aplica-s© o que já foi focado Rg e R^ nas fórmulas 2 e 3· De preferência n e q são iguais ZerO. R? uexu u womu »d.gxxj,j. ,
Rg ® Rç7 sejam necessariamente idênticos.
Em relação a Rg anteriormente em relação a a tem o mesmo significado que Rn; isto não significa que Como Y nc oligossacá67 122
ΟΑ/Ο980-161
cia igual a Y (Y # H), com a condição de que a função reactiva é provida com um grupo protector permanente. Os grupos que podem ser usados adequadamente para este fim são os grupos protec tores permanentes já mencionados; é dada maior preferência ao grupo benziloxicarbonilo.
As condições sob as quais a reacção com um composto de acor do com a fórmula 6 é gsralmente efectuada, são as seguintes: temperatura 10-60°C à pressão atmosférica, tempo 15 mn - 6 horas.
A construção do esqueleto do Gligossacárido está assim completa. Se desejado, R^ ou R?, desde que R^ ou Ry seja um grupo protector permanente, podem agora ser substituídos por X ou Y desde que X ou Y / H. Nos oligossacáridos de acordo com o presente invento, é de preferencia hidrogénio; nesse caso, R^ é, de preferência, um grupo protector permanente. Como Y é de preferência diferente de hidrogénio, R? é, de preferência igual a Y (Y / H) com um grupo protector permanente. Nesse caso, nem R^ nem R? precisam de ser substituídos por X ou Y desde que X ou Y / H. De preferência, este passo não é, portanto, efectuado.
Finalmente, os grupos protectores permanentes são substituídos por um átomo de hidrogénio. Da mesma forma que o uso e a introdução de grupos protectores permanentes é conhecido na química do açúcar e de nucleótidos, a desprotecção é também conhecida.
Contudo, a preparação de oligossacáridos de acordo com o presente invento, nos quais K, L, n e q = 0, é efectuada, de preferência, deixando um composto de fórmula 2 reagir com o pro duto de reacção de um composto de acordo com a fórmula 3 e de acorde com a fórmula 5· Após desprotecção do produto obtido re-
igossacárido pode ser ainda aumentado por reacção com o produto de um composto de fórmula 3 e de fórmula 5 θ desprotegendo o produto obtido removendo novamente Rz, Isto pode ser repetido tantas vezes quantas desejado tendo em conta o comprimento desejado do esqueleto do oligossacárido. A construção do esqueleto do oligossacárido é completacta pela reacção com um composto de fórmula 6. A vantagem desta abordagem q que o número de passos pode ser reduzido porque o produto ,Λ
.........
122
CA/Ο980-161
-21obtido reagindo um composto de fórmula 3 θ só necessita de ser preparado uma vez. Uma segunda vantagem é o facto de que um composto de fórmula 3 reage mais selectivamente com um composto de fórmula 5 que com um composto de fórmula 2. Em ambos os casos, o composto de fórmula 3 serve para ligar só um composto de fórmula 2 ou % enquanto o outro grupo reactivo do composto possuindo a fórmula 3 permanece intacto. No caso de reacção com um composto de fórmula 2, ocorre mais formação de dímero indesejável.
A reacção entre um composto de fórmula 3 e 5 é efectuada a uma temperatura entre 10 e 60 C e à pressão atmosférica e estará geralmente completa dentro de 10-óG mn. 0 produto assim formado é também reagido a 10 - 60°C e à pressão atmosférica com um composto de fórmula 2. Esta reacção estará geralmente comple ta ao fim de 0,5-3 horas e é efectuada de preferência na presença de um catalisador, tal como N-metilimidazol ou tetrazol, ou após activação com,ou na presença de um reagente activador, tal comc l-(2,4,6-triisopropilbenzeno-2’-sulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazol ou l-(mesitileno-2’-sulfonil)-3-nítro-l,2,4,-triazol.
Os compostos de acordo com a fórmula 3 que podem ser adequados para serem usados são em princípio os mesmos que os compostos já acima mencionados.
Os oligossacáridos de acordo com o presente invento podem tambÃm ser preparados partindo de um composto de fórmula 6 de acordo com a página das fórmulas.
Este composto é reagido com um composto possuindo a fórmula 5 na qual H é substituído per R/ e R^ por Η. A desprotecção é então efectuada substituindo R^ por H e reagindo o produto obtido com um compcsto de fórmula 3 θ de fórmula 2, consecutivamente. Outra possibilidade consiste em reagir um composto de fórmula 6 com o produto obtido pela reacção de um composto de fórmula 3 GOm um composto de fórmula 5 na qual H é substituído por R/ e R^ por H e reagindo 0 composto obtido com um composto de fórmula 2. Cs passos intermediários podem novamente ser repetidos m-2 vezes.
Em vez de compostos de fórmula 3 de acordo com a página das fórmulas, podem também ser usados outros compostos de fósforo
6η 122
ΟΑ/Ο930-161
-22para a preparação dos oligossacáridos ae acordo com o invento. Isto aplica-se tanto aos processos já descritos e aos processos de preparação adiante, três grupos reactivos, dem ser reagidos com o das fórmulas, depois o fonato correspondente o qual, após activaçãc com um reagente activador, tal como cloreto de pivaloílo, é reagido com o composto 5 ou 2 oe acordo com a página das fórmulas.
Assim, os compostos de fósforo tendo tal como PCl^ ou salicilclorofosfina, pocomposto 2 ou de acordo com a página proauto obtido é hidrolisado para o fosApcs reacção ue um composto de fórmula 3 â® acordo com a página das fórmulas com o composto 2 ou 5 de acordo com a página das fórmulas, o proauto assim formado pode também ser hidrolisaac - com remoção ao grupo reactivo livre que resta e o grupo prctector permanente (que é neste caso um grupo protector tem porário) - para o fosfonato correspondente o qual após activação com um reagente activador, é reagido com o composto 5' ou 2 de acordo com a página de fórmulas.
Se A na fórmula 3 for nada e o composto de fósforo tiver assim um par de electrões livres cu se durante a preparação dos oligossacáridos de acordo com o invento se formarem compostos de fósforo que não estão completamente oxidados, deve-s© efectuar uma oxidação, por exemplo com Ig/piridina ou terc.-butilperóxido de forma a obter o fosfato correspondente.
Outro processo de preparação de oligossacáridos de acordo com o invento é através da chamada síntese de bloco. Neste caso, fragmentos relativamente grandes do oligossacárido desejado são preparados separadamente e depois ligados entre si. Ainda outro processo consiste em preparar um fragmento relativamente grande e desproteger uma parte do fragmento obtido num local diferente aa outra parte, tenao como resultado que ambas as partes podem ser ligadas entre si. 0 invento de acordo com o presente pedido refere-se, portanto, também, em particular, a um processo para a preparação de oligossacáridos de acordo com o presente invento caracterizado pelo facto de
1) um composto de fórmula 2 de acordo com a página das fórmulas ser reagido com c produto ae reacção de um composto de fórmula 3 e fórmula 5 a® acordo com a página das fór67 122
ΟΛ/C980-161
mulas em cujas fórmulas e ^6 os mss“ mos significados que já descritos e R^ é um grupo reactivo, e pelo facto do produto assim obtido ser desprote gidG substituindo R^ por um átomo de hidrogénio, e pelo facto de
2) o passo 1) ser repetido tantas vezes quantas as desejadas com o proauto obtido no passo 1) em vez do composto de acordo com a formula 2 e pelo facto de
3) o passo 1) e se desejado o passo 2) serem repetidos partindo de um composto de fórmula 2) na qual K=0, L=1 e R1 ser um grupo protector temporário, e sendo R^ subs tituído por um átomo de hidrogénio no último passo em vez de Rz, e pelo facto de
4) o produto obtido no passo no passo 3) serem reagidos formado R& ser substituído pelo facto de
5) o produto obtido no passo to de fórmula 6) de acordo qual R2, R^, R?, n e q têm e pelo facto de
1) ou 2) e o produto obtido entre si e no produto assim por um átomo de hidrogénio e
4) ser reagido com um composcom a página aas fórmulas na os significados já descritos
6) o grupo protector permanente R^ ou R? se presente e se desejado, no produto assim obtido ser substituído por
X ou Y desde que X ou Y não sejam hidrogénio, e pelo facto de
7) o composto obtido no passo 5) ou 6) ser desprotegido substituindo os grupos protectores permanentes por um átomo de hidrogénio.
Este processo cie preparação pode ser também efectuado usando um composto de fórmula 6 no passo 3) em vez de um composto de fórmula 2, utilizando o produto de reacção de um composto de fórmula 3 e de fórmula 5·
Este processe de preparação pode também ser efectuado a partir de um composto de fórmula 6 de forma análoga à já descrita.
invento refere-se também a um processo ae preparação de oligossacáridos de acordo com o presente invento caracterizado
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ΟΑ/Ο9θΟ-161
pele facto de
1) ura composto de fórmula 2 de acordo com a página das fór- mulas ser reagido com o proauto de reacção de um composto de fórmula 3 e de fórmula 5 de acordo com a página das fórmulas, na qual A, R^, 1/ e ^6 0 significado já descrito e 5/ é um grupo reactivo, K=0, L=C> e 1/ é um grupo protector, e o produto assim obtido ser desprotegido substituindo R^ por um átomo de hidrogénio, e pelo facto de
2) o passo 1) ser repetido tantas vezes quantas as desejadas com o produto obtido no passo 1) em vez do composto de fórmula 2, e pelo facto de
3) uma parte do produto obtido nc passo 2) ser desprotegido substituindo R^ por um átomo de hidrogénio em vez de R^, e pelo facto de
4) os produtos nos quais R^ e F/ foram substituídos serem reagidos entre si após um dos referidos produtos ter sido reagido com um composto de fórmula 3, ® pelo facto de
5) R^ no produto obtido ser substituído por um átomo de hidrogénio, e pelo facto de
6) o produto no passo 5) ser reagido com um composto de fórmula 6 cie acordo com a página das fórmulas na qual n, q, R^, R^, e R^ têm o significado já descrito e pelo facto de
7) o grupo protector permanente R^ ou Ry,se presente e se desejado, no produto assim obtido ser substituído por X ou Y nãc sejam hidrogénio e pelo facto de
8) o composto obtido no passo 6) ou 7) ser desprotegido substituindo os grupos protectores permanentes por um átomo de hidrogénio.
Este processo de preparação pode ser também efectuado em sequência inversa, i.e., partindo de um composto de fórmula 6 e terminando com a incorporação necessária para obter um composto de fórmula 2.
Uma outra variante desta síntese em bloco é aquela em que, antes dos dois blocos serem ligados, a incorporação do grupo terminal (por reacção com um composto de fórmula 6 ou de fórmula
6? 122
OA/C980-161 f
,.., „0** rf·
-252) ser efectuada num dos blocos. A síntese em blocos é particularmente vantajosa se se preparam oligossacárioos relativamente grandes, lesta forma podem ser consideravelmente reduzidos o número de passos de reacção. As condições sob as quais os blocos são ligados entre si não são em princípio diferentes das acima já discutidas para os outros processos. Gs processos de preparação descritos podem ser efectuados, de forma adequada, em parte ou na totalidade, numa fase sólida.
C invento é explicado com referência aos seguintes exemplos:
EXEMPLOS
1. Preparação de um composto de fórmula 2 de acordo com a página das fórmulas
Partindo da D-ribonolactcna, preparou-se l-0-/2-benziloximetil“3?5“c“( tetra-isopropildi siloxano-1,3-diil )-y?-D-ribofuranGsil__7-2,3)4-tri-G-benzil-D-ribitol (composto 15 no esquema 1) através de 13 produtos intermediários.
composto 2 no esquema 1 foi preparado a partir do composto 1 como descrito na Ganadian J. Chem. 36 (195θ) 1720.
4,5 ml de clcroformato de alilo em 10 ml de acetonitrilo seco foram adicionados gota a gota,enquanto se agitou,a 4 g de composto 2 e 3,5 ml de piridina seca em 10 ml de acetonitrilo seco a C°C. A agitação foi então continuada durante 1 hora a 0°C.
excesso de cloroformato foi destruído adicionando gelo. A mistura de reacção foi diluída com 100 ml de éter e lavada 3 vezes com 50 ml de água. A camada orgânica foi seca com IãgSO. e concentrada sob vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em 10 ml de diclorometano e filtrado através de uma pequena coluna que foi enchida com 6 g de silica gel 60. A coluna foi lavada com 40 ml de diclorometano. 0 filtrado e o líquido de lavagem foram combinados e concentrados sob vácuo. 0 composto 3 foi cristalizado a partir disto com éter/diisopropil éter.
g de composto 3 em 20 ml de dioxano foram colocados sob uma atmosfera de hélio. Depois de se adicionarem 15 mg de te67 122
0Α/0980-161
-26traquis (trifenilfosfina) paládio, a solução foi mantida durante 15 min,sob condições de refluxo e a mistura de reacção com o composto 4 foi concentrada.
8,6 g de composto 4, 3,5 g de borohidreto de sódio e 150 ml de tetra-hidrofurano seco foram aquecidos para 55°C. Adicio naram-se 30 ml de metanol em 45 mino enquanto se agitou, a agitação foi então efectuada durante 1 hora a 55°0 .
Após arrefecimento, a mistura de reacção foi concentrada sob vácuo. 0 resíduo foi co-evaporado com metanol seco (3x50ml) recuperado com 100 ml de diclorometano e lavado com 100 ml de uma solução saturada a 90% de cloreto de amónio em água. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (2x100 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas (ItígSO4) e concentradas sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia (eluição com diclorometano/metanol 100/0—> 95/5). As fracções adequadas contêm compostos 5. 6,2 g de composto 5 foram dissolvidos em 100 ml de ácido acético, após o qual se adicionaram 40 ml de água. A solução foi agitada durante 4 horas a 50°C. A mistura de reacção foi concentrada sob vácuo. 0 resíduo foi co-evaporado com tolueno seco (3x25 ml) e piridina seca (3x25 ml) e redissolvido em 40 ml de piridina. Depois de se adicionarem
7,5 g de cloreto de tritilo, a solução foi agitada durante 12 horas a temperatura ambiente. Após se adicionarem 5 ml de metanol, a mistura de reacção foi concentrada sob vácuo.
resíduo foi co-evaporado com tolueno (3x25 ml) e recuperado em 150 ml de diclorometano e lavado com 150 ml de solução de bicarbonato de sódio 1 Ivi e com 150 ml de água. A camada orgânica foi seca (mgSO^) e concentrada sob vácuo. Após cro matografia de purificação efectuada como no passo anterior, obte ve-se o composto 6. 7,3 g de composto 6 foram dissolvidos em 40 ml de N,N-dimetilformamida seca, após o qual se adicionaram em pequenas porções 2 g de hidreto de sódio. A mistura de reaç ção agitada foi arrefecida para 0°C e adicionaram-se gota a gota durante 30 min,, 6,2 ml de brometo de benzilo em 10 ml de N,N-dimetilformamida seca. Oontinuou-se a agitação durante mais 30 min a 0°0 e depois durante 12 horas à temperatura ambiente. De pois, adicionaram-se lentamente 10 ml de metanol e a mistura de reac
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ção foi concentrada sob vácuo. C resíduo foi recuperado em 150 ml de éter e lavado três vezes com 5'G ml de HgG. A camada orgânica foi seca (MgSO^) e concentrada sob vácuo. A purificação cromatográfica do concentrado (eluição com hexano/diclorometano 2/1 (400 ml) e 1/1 (400 ml) seguioa de diclcrometano) e a evaporação das fracções correctas deu o composto 7, 8,5 g de composto 7 foram dissolvidos em 135 ml ue ácido acético e 15 ml de água e aquecidos durante 90 min a 8C,0C. A solução foi concentra da sob vácuo. C resíduo foi recuperado em éter e lavado com água (50 ml) e solução de bicarbonato de sódio 1M (2x50 ml).
A camada orgânica foi seca (MgSO^) e concentraua sob vácuo. 1C ml de diclGrcmetanc/hexano 1/1 foram adicionados ao resíduo e efectucu-se filtração. 0 filtrado foi purificado cromatcgraficamente (eluição com 400 ml cie clorofórmio (hexano 1/1; 400 ml de diclcrometano e diclorometano/metanol 98/2), após o que se obteve o composto 8. 3,4 g de composto 9, ÇL^e foi comprado, e
3,1 g de composto 8 foram secos por co-evaporação ccm dioxano (3 x 50 ml) e oepois dissolvidos em 50 ml de 1,2-dicloroetano seco. Adicionaram-se peneiros moleculares (4 Â, 10 g de pelotas activaaas) e a mistura fci agitada a temperatura ambiente durante 90 min. sob uma corrente de azoto. Depois 3 x 30 jul de sulfcnato de trimetilsililc trifluorcmetano foram adicionados a intervalos de 1 hora. 1 hora após a última adição, adicionaram-se 100 μΐ de trietilamina; os peneiros moleculares foram removidos por filtração e lavados com clorofórmio e tolueno. 0 filtrado e c líquido de lavagem foram combinados e concentrados sob vácuo. 0 resíduo fci purificado cromatograficamente (eluição cora tolueno/acetona 1G0/G—>98/2). 0 composto 10 foi obtido a partir das fracções correctas. 5 g dele foram dissolvidas em 25 ml de dioxano seco; depois 25 ml de metanol seco e 1,25 ml de metcxido de sódio 1M em metanol foram adicionados. A mistura de reacção foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente. Depois de 0,25 ml de metóxião de sódio 1M em metanol ter sido adicionado, efectuou-se agitação durante mais u a hora. Depois, l,25g de Dowex 5õ λτχ4 (forma H ) foram adicionados e removidos após 36 min. por filtração e lavados ccm metanol e clorofórmio. 0 filtrado e o líquido de lavagem foram combinados e concentra67 122
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-28dos sob vácuo. A purificação cromatográfica (eluição com diclcrcmetano/metanol 1GG/0—=>95/5) deu o composto 11, do qual 2,4 g foram concentrados duas vezes em 20 ml de piridina seca. Depois adicionaram-se 20 ml de piridina seca. A solução obtida foi agitada sob uma atmosfera ae azoto a G°C e 1,4 ml de 1,3-dicloro-ljl^jJ-tetra-isopropildi-siloxano foram adicionados gota a gota em 15 min. Depois a agitação foi efectuaaa durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi concentraaa sob vácuo e co-evaporada com tolueno (3*20 ml). 0 resíduo foi recu perado em 75 ml de dietil-éter e lavado com KH^PO^ 1K (3 x 5θ ml) e ITaHCG^ 1ώ( 3 x 5θ ml). A camada orgânica foi seca (ílgSO^) e concentrada sob vácuo. Após purificação cromatografica (eluição com diclorometano/acetona 1GG/G —=>9θ/2), obteve-se o composto 12, do qual 1,49 g foram concentrados duas vezes a partir de 5 ml de acetonitrilo. Depois 4,5 ml de acetonitrilo foram adicionados. A solução foi agitada sob uma atmosfera de azoto a 5C°C e 1,35 de Ν,Ι'Τ-diisopropiletilamina seca e 0,5 ml de cloreto de benzilcximetilc foram adicionados em sucessão. Duas horas depois, adicionaram-se 0,25 ml de cloreto de benziloximetilo e depois a agitação foi efectuaaa durante mais uma hora. Depois adicionaram-se 2 ml de metanol seco a 50°C. Após arrefecimento, a mistura de reacção foi concentrada sob vácuo. 0 resíduo foi recuperado em 40 ml de dietiléter e lavado com KHgPO^ 1K (3 x x 20 ml) e MaHCC< 1M (20 ml). A camada orgânica fci seca (MgSO.) , 4· e concentrada sob vácuo. Após purificação cromatográfica (eluição com hexano/acetato de etilo 10/0—^9/1)? obteve-se o compos to 13. 0 composto 13 (1,32 g) foi dissolvido em 4 ml de tetra-hidrcfurano. A solução foi desgaseada 3 vezes e colocada sob hélio. Adicionaram-se hexafluorofcsfato de 1,5-cicloocta.dienobls(metildifenilfosfina)-irídio (2-3 mg), após o qual a solução foi novamente desgaseada 3 vezes e colocada sob hélio. Uma corrente de passada sobre a solução durante 2 min., após 0 qual foi novamente desgaseada e colocada sob hélio. Após 4 horas a mistura ae reacção foi concentrada sob vácuo. 0 composto 14 assim obtido foi dissolvido em acetona e água (1,2 g em 15ml e 1 ml respectivamente). Depois adicionaram-se 360 mg de HgG e 375 mg de HgCl2 e a suspensão foi agitaaa durante 3G min à tem-
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-29peratura ambiente. 6 HgO fci removido por filtração e lavado.
C filtrado e o líquido de lavagem foram combinados e concentrados sob vácuo. 0 resíduo foi recuperado em 75 ml de dietil-éter e lavado com 46 ml de uma solução de Kl saturada a 50$ (3x),
mada orgânica foi seca (AgSO^) e concentrada sob vácuo.
Após purificação crcmatográfica (eluição cora hexano/acetato de etilo 9/1—>7/3), obtiveram-se 0,97 g de composto 15 puro; Rf = 0,34 (hexano/acetato de etilo 7/3), ~ +39° (c 1,0-CHCl^).
2. Preparação do composto de fórmula 5 de acordo com a página aas fórmulas
Partindo do composto 14 do esquema 1, preparou-se o composto 17 de acordo com o esquema 2.
composto 14 (425 mg) foi concentrado a partir de 2 ml ae dioxano seco (2x) e dissolvido em 2,2 ml de fluoreto de tetra-n-butilamónio 0,5 em dioxano. Depois de repousar durante 3θ minutos à temperatura ambiente, evaporou-se o solvente sob vácuo. Adicionaram-se 25 ml ae NaHCO^ llá ao resíduo e a mistura foi extraída com 25 ml de diclorometano (3X)· 6s extractos combinados foram secos (HgSO^) e concentrados sob vácuo. Após purificação crcmatográfica (eluição com diclorometano/metanol 100/0—^ —98/2) e concentração sob vácuo das fracções correctas, obtiveram-se 239 mg de um produto que continha 260 mg de composto 16. Este produto foi concentrado duas vezes a partir de 2,5 ml de piridina seca e aepois dissolvido em 2,5 ml de diclorometano. Depois de se adicionarem 65 }il de Ν,ΙΤ-diisopropiletilamina e 90 jul de cloreto de terc.-butilaifenilsililo, a mistura de reacção foi agitaua durante 12 horas à temperatura ambiente. Após terem sido adicionados 65 Jil de Ν,Ν-diisopropiletilamina e 90 ul de cloreto de terc.-butilaifenilsililo, efectuou-se agitação durante mais 24 horas. Adicionaram-se então 0,5 ml de metanol e a concentração foi então efectuada sob vácuo. 6 resíduo foi re-
centrada sob vácuo. A purificação cromatográfica (eluição com
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-30hexano/acetato de etilo 10/0—>7/3) deu 254 mg de composto 17; Rf = 0,41 (hexano/ac et ato de etilo 7/3) © ~ “24,8° (C = 1,0 - CHC1J.
’ d
3. Preparação de um composto de fórmula 3 óe acordo com a página ucas fórmulas
Preparou-se fosfato de 2-clorofenil-0,0-bis(1-benzotriazolil) de acordo com I.R.L. Press, Cxford, U.K. (1984) 153“1θ3· Este composto é daqui em diante denominado composto 18.
4. Preparação de um composto de fórmula 1 de acordo com a página das fórmulas
Preparou-se de acordo com o esquema 3, um oligossacárido de acorde com o presente invento.
229 mg de composto 15' © 25’4 mg de composto 17 foram concentrados separadamente a partir de 2,5 ml d© piridina (3 x, a última vez para um volume de 1 ml). Depois adicionaram-se ao composto 17,1,46 ml de uma solução 0,2 K de composto 18, após a qual a solução foi agitada durante 3θ minutos à temperatura ambiente. Esta solução foi adicionada a uma mistura de composto 15 e 50 pl de M-metilimidazol sob condições anídricas. Após ter sido agitada durante 2 horas à temperatura ambiente, a solução foi diluída com 5θ ml áe dietil-éter e lavada com bicarbonato de trietilamónio 1 II (2 x 25 ml), KHg Ρ0^ 1 M (25 ml) e bicarbonato de trietilamónio 1 M (25 ml). A camada orgânica foi seca (MgSO^) e concentrada sob vácuo. A purificação cromatográfica (eluição com hexano/ac et ato ae etilo 10/0—·> 8/2) deu 3b8mg de composto 19 (n = 1), o qual foi então tratado com HgO/HgClg como descrito para a preparação do composto 15. Após separação crcmatográfica (eluição com hexano/acetato ce etilo 9/1—>7/3) obteve-se o composto 20 (n = 1).
composto 21 (0,22 mmole), preparado por reacção qo éster de pentaclorofenil de benziloxicarbonilglicina e 3-amino-l-propanol em qioxanc (temperatura ambiente, 1 hora) foi fosforilado com o composto 18 (1,1 ml de uma solução em qioxano 0,2 M).
A solução foi adicionada a uma mistura ae 296 mg de compos-
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r
to 2C (n = 1) e 20 yd. de N-metilimidazol. Após agitação durante 2 horas à temperatura ambiente, uma solução obtida fosforilando 0,30 mmole de composto 21 com 1,5 ml de uma solução 0,2 M de composto 16 em dioxano (30 minutos), foi novamente adicionada à mistura de reacção. Após 2 noras, obteve-se o composto 22 (n = 1) por meio de um processo de lavagem como descrito na preparação dc composto 19 (n = 1) e por meio de uma purificação cromatografica (eluição com clorofórmio/acetona 100/0—995/5)· composto 22 (.n = 1) (285 mg) foi desprotegido através dos seguintes passos em sucessão:
- remoção de grupos 2-clorofenil por reacção com sinpiri-
118 3 dina-2-carboxaldoxima e N , N , , NJ-tetrametilguanidina em tetra-hidrofurano durante 48 horas à temperatura ambiente;
- remoção do l,l,3,3-tetra-isopropildi-siloxano-l,3-diil e do grupo tercrbutildifenilsililo por reacção em dioxano com fluoreto de tetra-n-butilamónio durante 16 horas à temperatura ambiente;
remoção dos grupos benziloxicarbonil, benziloximetil e benzilo, por hidrogenólise em terc.-butanol/água (24 horas) e água (24 horas), sucessivamente na presença de Pd/ /C a 10% (ó00 mg) e glicinamida.
Após remcção ao catalisador por filtração, lavagem do filtrado (3 x ) com clorofórmio, evaporação do clorofórmio, liofilização, filtração em gel sobre Sephadex G-25 (eluição com bicarbonato de trietilamónio 0,01 M, pH7), liofilização das fracções açúcar-positivas, o material obtido foi passado através de uma coluna Dowex 5θ x 4 (forma Na ) em água. Após liofilização, obtiveram-se 51 mg co composto 23 sólido (n = 2). ττίΊΚ:
1,54 e 0,74 ’ή (ref. HhG, 4,65 ppm): S 4,90 (s,lH);
4,86 (s, 1H); -CH^-, espaçador 13C NMR (cloreto
4,5-4,4 (m, 8 linhas, 1H); 3,21 (t, -NH-ÇH2)5
1,71 (t, espaçador).
de tetrametilamónio de referência externa 8
56,2): 8 167,3 (s), 107,7 (s, G-l Ribf), 107,5 (s, C-l Ribf),
83,5 (s, CH), 82,8 (d, CH, Jcp 5,8 Hz), 75,2 (s, CH), 75,1 (d,
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GH, Jçp 3,4 Hz), 74,6 (br s, CH, Jcp não dissociado), 72,3 (s, 2 x CH), 71,8 (d, 2 x CH, Jcp 8,8 Hz), 71,4 (s, CH), 71,0 (s, 2 X CH), 6,95 (S, CH2), 69,3 (s, CH2), 67,5 (a, CH2, Jcp 4,4 Hz) 67,3 (d, CH2 Jcp 4,4 Hz), 64,4 (d, CH2, Jcp 5,9 Hz), 63,4 (s, CH2), 63,2 (s, CH2), 41,3 (s, CH2 Gly), 37,2 ( s, CH2), 30,0 (d, CH2, JGp 7,3 Hz).
FAB MS (espectrometria em massa ae bombardeamento atómico rápido) revelou ra/z 823 /composto 23, n = 2, - Na_7” como o sinal mais abundante na região de massa elevada.
5· Preparação do composto 23 (n = 3) composto 20 (n = 1) (0,46 mmole) foi adicionado a uma so lução obtida fosforilando 0,56 mmole do composto 17 com 3 ml ae uma solução 0,2 M do composto 18 em dioxano/piridina durante 3θ minutos. Após 3 horas, obtiveram-se 0,36 mmole de composto 19 (n = 2). De forma análoga ao processo já descrito acima, fo ram então preparados 0,30 mmole ae composto 20 (n = 2) e, partindo de 0,15 mmole de composto 20 (n = 2), obtiveram-se 478 mg de composto 22 (n = 2). A partir aeste composto, 45 Jimole foram desprotegidos para o composto 23 (n = 3)· Produção 22 mg: 31p
NMR: ol,66 e 0,85 (dois sinais sobrepostos); nmr em DgO (ref. HD0, o 4,65): 4,92 (s, 2H); 4,88 (s, 1H); 4,55-4,42 (m, 2H);
3,25 (t, 2H, espaçador -NH-GHp-CHp-); 1,74 (t, 2H, espaçador -CH2-ÇH2-CH2-); = -30,1° (c = 1,0, HgO).
6. Preparação de imunogénios
Prepararam-se imunogénios ligando o composto 23 (n = 2) e composto 23 (n = 3) (ver esquema 3), a toxóide tetânico (TT) e à proteína da membrana externa (MP) do Haemophilus influenzae tipo b ae acorde com o esquema 4.
Em primeiro lugar os oligossacáridos 23 (n = 2e3) foram modificados reagindo o grupo amina terminal com mercaptoacetato de N-succinimidil-S-acetilo, que produziu 0 composto 24 (n = 2 ou
3). Introauziram-se grupos 2-piridilditio (PDP) nas proteínas reagindo os grupos é-NH2 das lisinas com 2-piridilaitiopropio
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nato de N-succinimidilo (SPDP). Gs compostos 24 e 25 foram adicionados num tampão (ρΗό,ΐ). o grupo S-acetilo uo componente cligcssacárido foi cindido adicionando hiuroxilamina, sendo pro duzidc um grupo livre -SH. 0 tiol 26 reage então ccm um grupo PDP na proteína para formar o composto 27· A extensão de incor poração do oligossacárido foi determinada por uma medição diferencial cora U.V. da quantidade de 2-tiopiridona libertada (óé 343 = g.COO M1).
Materiais
Soluções de toxóide tetânico (10 mg/ml) e de proteína da membrana externa do H. Influenzae (2,5 mg/ml em NaCl 0,14 1£ + + 0,1% Zwittergent 3-14). Preparou-se mercaptoacetato de N-suc cinimidil S-acetilo de acordo com Anal. Biochem. 132 (19θ3) 6873. Obteve-se SPDP a partir de Pierce Chemical Company e Zwittergent 3-14 (sulfonato de N-tetradecil-N,N-dimetil-3~amónio-lpropano) ue Calbiochem. N-etilmorfolino e dimetilacetamida foram destilados a partir de fluorouinitrobenzeno.
Tampão A: N-etilmorfolino 2M/HC1 pH 8,5;
Tampão B: bicarbonato de trietilamónio 0,01 M, pH 7,0;
Tampão C: fosfato de sódio 0,1 M + EDTA 0,005 M (di-hidrato de uissodic de tetraacetato de etilenodiamina) pH 6,1;
Tampão D: fosfato de sódio 0,1 Lí, pH 7,8;
Coluna PD-10: coluna descartável Pharmacia Sephadex 0-25 H pré embalada (volume 9,1 ml, altura 5 cm)
Coluna G=25: 100 x 10 cm Pharmacia Sephadex G-25 (superfino)
Preparação do composto 24
19,8 mg (21,4 jumole) da forma trietilamónio ao composto 23 (n = 2) foram dissolvidos em 0,21 ml de tampão A, após o que' se adicionaram 25 mg de mercapotoacetato de N-succinimidil S-acetilc em 0,85 ml de dimetilacetamida, A mistura de reacção homogénea foi mantida durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois efectuou-se acidificação adicionando ácido acético (100juL)c 0 material de açúcar foi precipitado adicionando 5 ml de acetona. 0 precipitado xaroposo foi centrifugado, dissolvido num peΛ* ; ./ _______~
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-34queno volume de tampão B e purificado através de uma coluna G-25 usando este tampão como eluente. As fracções contendo açúcar foram combinadas e liofilizadas, 0 produto obtido foi licfilizado mais duas vezes a partir d© água e depois dissolvido em 0,50 ml de tampão 0. C produto continha 11,5 /imcle de composto 24 (n = 2).
mg de composto 23 (n = 3) foram convertidos em composto 24 (n = 3) de forma idêntica. 0 produto continha 4,2 pmole de composto 24 (n = 3)
Preparação do composto 25
Uma coluna PD-10 foi equilibrada com 25 ml de tampão D.
Depois foram introduzidos 1,50 ml (15 mg, aproximadamente 1C0 nmole, peso molecular aproximadamente de 150.C00) de uma solução TT e eluíaa com tampão D. Adicionaram-se 4,5 mg de SPDP em 0,45 ml de etanol à solução de TT em tampão D (volume de eluição
2,5-6,0 ml) assim obtido. Após reagir durante 1 hora à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi introduzida na coluna G-25 e eluída com tampão C. As fracções contendo proteína foram combinadas e diluídas para 20 ml (concentração de proteína de cerca de 5 nmole/ml) com tampão C no qual uma pitada de azida de sódio tinha sido dissolvida. 3,0 ml desta solução foram tratados sob hélio com 1,0 Jimole de ditiotreitol. Após deixar repousar durante 24 horas à temperatura ambiente,Δ6era = = 1,648 (referência: PDP-TT não tratado). Como/\ó = 8.000, o conteúdo em 2-tiopiridona é de 20o nmole/ml. A incorporação foi de 41 PDP/TT.
mg de TT foram tratados com 1,0 pncle de SPDP de forma idêntica. A fracção G-25 foi diluída para 15 ml. Incorporação
4,5 PDP/TT.
De forma análoga, 3,75 mg (aprox. 95 nmole, peso molecular de aprox. 40.000) de MP foram transferidos duas vezes para 3,5ml de tampão D. A proteína foi tratada respectivamente cora 14,4 e 0,4 jimole de SPDP.
Após filtração era gel através de G-25, a fracção proteica foi diluída para 15 ml (concentração proteica de aprox. 5,25nradLe/
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-35/ml). Como o AP é muito hiurofóbico, adicionou-se neste caso 0,1/6 de Zwittergent 3”14 aos tampões C e D. Incorporação: aprox 4,9 e aprcx. 1,3 de PDP/MP.
Preparação do composto 27 pl (1,0 pmole) da solução obtida anteriormente do ccmpos to 24 (n = 2) em tampãc C foram adicionados a 3,0 ml (1 mg/ml) de 4,5 PDP/TT, 4,5 ml (0,75 mg/ml) de 41 PDP/TT, 4,5 ml (O,25m&/ /ml) de 1,3 PDP/MP e 4,5 ml de PDP/&IP (fracção G-25 em tampão C, ver acima). As soluções foram desarejadas com hélio. Depois | 10 pl de hidroxilamina 0,2 m pH 6,5, foram adicionados. Após reacção de um dia para o outro à temperatura ambiente, determinou-se a quantidade de 2-tiopiridcna formada. A quantidade esperada de ticpiridona foi cindida das proteínas 4,5 PDP/TT, 1,3 PDP/ /λΙΡ e 4,9 PDP/mP e formou-se portanto uma quantidade correspondente de composto 27· Cerca de 20 moléculas ae composto 2o foram ligadas ao 41 PDP/TT. Depois de se adicionar uma quantidade adicional de composto 24 (n = 2), o grau d© incorporação de sacarídeo manteve-se inalterado. A um conjugado análogo que, após um tempo de reacção mais curto, continha 17 moléculas de dímero, adicionou-se 1, /imole de cisteína. A quantidade total de ticpiridona esperada foi então rapidamente formada.
C composto 24 (n = 3) foi usado de forma análoga para a
I preparação de conjugados trímero-proteína de acordo com o composto 27·
Em resumo foram feitos os seguintes conjugados:
1,3 θ 4,9 dímero e trímero/%P
4,5 dímero e trímero/TT
2C dímero/TT (sem grupos PDP residuais 21) dímero/TT (Sem grupos PDP residuais como resultado de pós-tratamento com cisteína) trímero/TT (28 grupos PDP residuais)
A antigenícidade destes conjugados foi medida e comparada com a de polissacáridos nativos de HIB (Sal-Ca), vacina polissacárida humana e o antigénio homólogo (= polissacárido/LíP) a qual produz os anticorpos de rate. As substâncias a serem tesr
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-36tadas foram misturadas numa série de diluições duplas com uma quantidade fixa ue anti-scro. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, 0 título de anticorpos livres residuais foi determinado num teste de inibição ELISA directc.
Os resultados são os seguintes:
Conjugado Concentração (]ig/ml) % de inibição
1,3 dímero/MP 10 45
1,3 trímerc/MP 10 86
4,9 õímero/LIP 10 49
4,9 trímero/LíP 10 81
4,5 aímero/TT 10 21
4,5 trímero/TT 10 56
20 dímero/TT 10 19
17 dímero/TT 10 20
13 trímero/TT 10 53
polissacárido nativo (Ca-Sal) 10 91
vacina oe polissacárido humano 10 90
antigénio homólogo (polissacárido
tiraminado) 10 12
Como se torna evidente, os conjugados dímero apresentam uma ligação considerável aos anticorpos, embora tal ligação seja marcadamente inferior à do pclissacárido nativo. A capacidade do polissacárido nativo para se ligar aos anticorpos pode ser quase igualada pelos conjugados trímeros.
7. Preparação da vacina
Um trímero-oligossacárido (composto 23, n = 3) foi ligado a toxóide tetânico com glutaraldeído misturando ura excesso de 10-100 vezes (numa base molar) dc trímero com toxóide tetânico e adicionando 3 x dialdeído glutárico em excesso em relação ao ligante a intervalos de 1 hora. Após deixar repousar a mistura
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-37de reacção durante 5 horas à temperatura ambiente, usou-se 20 vezes glicina em excesso (em relação ao ligante). Após 1 hora a temperatura ambiente adicionou-se HaCNBH^. Após 5 horas à temperatura ambiente a mistura de reacção foi dialisada. Partin do de 2,4 mmoles de trímero, obtiveram-se 12C /imoles de conjugado, sendo 3 trímeros incorporados por cada toxóide tetânico (3 trímeros/TT), sendo a razão de peso trímero/TT de 0,1:3· Injectaram-se ratos com um conjugado de pclissacárido de Haemophilus influenzae tipo b e proteína da membrana externa de Haemophilus influenzae tipo b ligado por meio de adipina-di-hidrazida (PS-ilP). A razão de peso de proteína e pclissacárido no conjugado era de 1 : 1. A cose por injecção foi de > Jig de conjugado. A injecção foi repetida 3 ® 5 semanas após a primeira injecção. Após 6 semanas determinou-se o título de IgG e foi ajustado para 100.
Outros ratos foram injectados com 3,12 pg do conjugado 3-trímero/TT. Após 4 semanas esta injecção foi repetida e após 6 semanas fci determinado o título de IgG, o qual era de 36 em relação ao título ae PS-kP ajustado para 100.
A forte imunogenicidade ao conjugado 3 trímero/TT pode ser evidente a partir ac facto de que aproximadamente 73 do título de IgG obtido injectando 7,5 pg ãe pclissacárido ter sido conseguido sc com 0,25 pg de oligossacárido. Com 730 do peso, obteve-se 73 do efeito. Em adição, a injecção com o trímero foi repetida somente uma vez enquanto que a com/polissacárido foi repetida duas vezes.
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-38-
- HE IV I r 1IC AÇÕES-

Claims (13)

  1. lê. - Processo para a preparação de um oligossacarídeo caracterizado por se substituírem os grupos protectores de um oligossacarídeo por um átomo de hidrogénio compreendendo o referido oligossacarídeo a estrutura (D-ribose-D-ribitol-fosfato) , (D-ribitol-fosfato-D-ribose)m ou (fosfato-D-ribose-D-ribitol) , onde m = 2,3,4.... 19 ou 20 e no qual c átomo de hiarogénio nos grupos hidroxilo livres foi substituído por um grupo protector.
  2. 2δ. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do oligossacarídeo ter a seguinte fórmula:
    na qual
    K = G ou 1 se L = 1,
    K = 0 se L = 0,
    L = 0 ou 1, m = 2,3 ··· 19 ou 20 com a condição de que m possa ser 1 se K,
    L e η = 1 ou se L, n e q = 1, n = 0 ou 1, q = 0 cu 1 se η - 1, q = 0 se n = 0,
    X = hidrogénio, um grupo reactivo que é capaz, directa ou indireactamente, de formar uma ligação com um transportador, cu um grupo contendo uma cadeia hidrofóbica na extremidade não ligada, ou o grupo terminal XG- é substituído pelo grupo reac tivo HgN- ou H3-, e
    Y = hidrogénio, um grupo reactivo que é capaz directa ou indi-
    67 122
    ΟΑ/Ο900-161
    -39rectamente, de formar uma ligação com um transportador, ou um grupo contendo uma caceia hidrofóbica na extremidade não ligada ou o grupo terminal -GY é substituído pelo grupo reac tivo -NHg ou -SH, com a condição de que Y = hidrogénio se X ϊ de hidrogénio e de que X = hidrogénio se Y / hidrogénio, e dos seus sais.
  3. 3&. - Processo de acordo com a reivindicação 1-2, caracterizado pelo facto de m = 2,3,4,5 ou 6.
  4. 4e. - Processo, ae acordo com a reivindicação 1-3, caracterizado pelo facto de X = hidrogénio e Y / de hidrogénio.
  5. 5's. _ processo, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado pelo facto de Y = hidrogénio e X / de hidrogénio.
  6. 6§. - Processo, de acordo com as reivindicações 1—5, carac terizado pelo facto do grupo reactivo ser um grupo que contém uma das seguintes funções reactivas:
    -NH2, -SH,
    II ou -C-R, na qual R - -OH, -N^, -0-alquilo (Cq.qg'1’
  7. 7â. - Processo, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado pelo facto de X ou Y ser um grupo com um grupo alquilo contendo 12-24 átomos de carbono na extremidade não ligada.
  8. 8&, - processo, de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizado pelo facto do oligossacarídeo ser puro.
  9. 9â. - Processo de preparação de um imunogénio caracterizado por se associar um oligossacarídeo preparado de acordo com as
    67 122
    CA/C98O-161
    -40reivinaicações anteriores, com um transportador, ou por se formar /associação ue várias moléculas de um oligossacarídeo preparado de acordo com as reivindicações anteriores.
  10. 10®. - Processo, de acoruo ccm a reivindicação 9, caracterizado pelo facto do transportador ser uma proteína.
  11. 11®. - Processo, cie acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto da proteína ser a proteína de superfície do Haemophilus influenzae tipo b.
  12. 12®. - Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto ao transportador ser uma micela, uma vesícula ou um lipossoma.
  13. 13®. _ processo de preparação de uma vacina caracterizado pelo facto de se fazer uma solução, emulsão cu suspensão aquosas do imnnogénio preparado de acordo ccm as reivindicações 9-12 e facultativamente se adicionar aajuvantes, estabilizantes, ou tampões, adequados, e outros imunogénios.
PT86484A 1986-12-31 1987-12-30 Processo para a preparacao de oligossacarideos, de imunogenios e de vacinas contendo tal imunogenio PT86484B (pt)

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