FI89172B - Nya oligosackarider och deras anvaendning foer framstaellning av immunogener - Google Patents

Description

1 89172

Uudet oligosakkaridit ja niiden käyttö immunogeenien valmistamiseen 5 Keksintö koskee uusia oligosakkarideja, jotka si sältävät D-riboosi-, D-ribitoli- ja fosfaattiyksikköjä, sekä niiden näyttöä immunogeenien valmistamiseen.

Bakteerin Haemophilus Influenzae tyyppi b kapselipolysakkaridi koostuu monista D-riboosi-D-ribitolifos-10 faatti-yksiköistä (->3 )-D-ribf-( 1-»1 )-ribitoli-5-*P04-). Haemophilus influenzae tyyppi b on, muun muassa, patogeeninen bakteeri, joka aiheuttaa aivokalvontulehdusta ja muita tarttuvia tauteja.

On todettu, että voidaan saada aikaan immuniteetti 15 antamalla Haemophilus influenzae tyyppi b:n (HIB) kapseli-polysakkaridia. On myös todettu, että erityisesti alle 2 vuoden ikäisillä lapsilla kestää saavutettu immuniteetti lyhyen aikaa ja alle 18 kuukauden ikäisillä lapsilla sitä ei voida havaita ollenkaan. Asiaa voidaan parantaa anta-20 maila kapselipolysakkaridi liitettynä niin kutsuttuun ka-teenkorvasta riippuvaiseen kantajaan (proteiiniin). Tällaisilla polysakkaridi-proteiinikonjugaateilla on se huono puoli, että rakenne ei ole tarkoin määrätty ja että tuotteessa ei polysakkaridiosa ole homogeeninen. Tästä on seu-25 rauksena, että jokainen vasta valmistettu erä rokotetta, joka sisältää tällaisia konjugaatteja, on testattava koe-eläimillä ja/tai ihmisillä rokotteen tehokkuuden suhteen. Lisäksi voi sellaisen tuotteen käyttäminen rokotteessa aiheuttaa epäsuotavia vasta-aineita tai myrkyllisyyttä.

30 Oligosakkaridit, jotka on saatu hajottamalla HIB- kapselipolysakkaridia, eivät myöskään ole puhtaita, vaikkakin tarkemmin määrättyjä. Tällöinkin on tehokkuus aina testattava jälleen.

Sen vuoksi on olemassa tarve saada HIB-sairautta .35 vastaan rokote, joka sisältää tarkoin kuvatun, puhtaan 2 $9172 oligosakkaridifragmentin, s. o. oligosakkaridifragmentin, joka ei sisällä sellaisia oligosakkarideja, joilla on erilainen rakenne tai ketjun pituus.

Nyt on todettu, että sellaisia puhtaita oligosakka-5 rideja voidaan saada synteettisesti ja että voidaan saada aikaan sopivia immunogeeneja liittämällä sellaiset fragmentit yhteen kantajan kanssa. Tällaisia immunogeeneja voidaan käyttää rokotteissa. Siitä, että tällainen oligosakkaridi voidaan valmistaa synteettisesti, aiheutuu myös 10 se etu, että saatavuus ei ole riippuvainen patogeenisen bakteerin HIB saatavissa olosta.

Keksintö koskee siten oligosakkarideja, joilla on seuraava kaava: 15 xf°l:s1 Γ 1 "-W t:i ! Ργ'/ΐ"

tH-i-o — i___<Mf [-o-f---“i*! 1--°X

Ho HO j

20 LJL

k 1 m n q (1)

Jossa k = 0 tai 1, jos 1=1, 25 k = 0, jos 1=0, 1=0 tai 1, m = 2,3 ... 19 tai 20, sillä ehdolla, että m voi olla 1, jos k, 1 ja n * 1 tai jos 1, n ja q 1, n * 0 tai 1, 30 q 0 tai 1, jos n = 1, q = 0, jos n = 0, X = vety, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutumattomassa 35 päässä, tai pääteryhmä X0- on korvattu reaktiokykyisellä li 3 89172 ryhmällä H2N- tai HS-, Ja Y = vety, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutumattomassa 5 päässä, tai pääteryhmä -OY on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä -NH2 tai -SH, sillä ehdolla, että Y = vety, jos X Φ vety tai että X = vety, jos Y φ vety, ja niiden suoloja.

Keksintö koskee myös näiden oligosakkaridien käyt-10 töä immunogeenien valmistamiseen, jotka immunogeenit sisältävät kantajaan liitetyn oligosakkaridin tai usean oligosakkaridin yhdistymän. Immunogeenit soveltuvat käytettäviksi rokotteissa.

Kun jätetään huomioimatta X(XO-) ja Y(-OY), voi D-15 riboosi-D-ribitoli-fosfaatti-runko, joka on esitetty kaavassa 1, päättyä sekä vasemmalla että oikealla riboosi-, ribitoli- tai fosfaattiryhmään. Parhaina pidetään kuitenkin oligosakkarideja, jotka päättyvät, kun X(XO-) Ja Y(OY) jätetään huomioon ottamatta, vasemmalla ribitoli- tai ri-20 boosiryhmään ja oikealla fosfaattiryhmään tai oikealla ribitoli- tai riboosiryhmään ja vasemmalla fosfaattiryhmään. m on edullisesti 2, 3, 4, 5 tai 6, koska sen pituinen oli-gosakkaridirunko on yleensä jo riittävän kokoinen kysymyksessä olevaa tarkoitusta varten. Vielä edullisemmin m on 25 3, 4, 5 tai 6.

Mieluimmin k, 1, n ja q ovat nolla, X on H ja Y ei ole H.

Koska keksinnön mukaisissa oligosakkarideissa olevat fosfaattiryhmät esiintyvät liuoksessa ionisoituneina 30 esimerkiksi neutraalissa pH:ssa, valmistetaan tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit edullisesti suolan, esimerkiksi natriumsuolan, muodossa.

Koska keksinnön mukaiset oligosakkaridit eivät sellaisenaan ole immunogeenisiä tai riittävän immunogeenisiä, 35 on välttämätöntä liittää mainitut oligosakkaridit kanta- 4 89172 jaan, minkä seurauksena todella aikaansaadaan riittävän asteisena mainittu immunogeenisyys. Tapa, jolla oligosakkaridi liitetään kantajaan, vaihtelee kantajan tyypin mukaan. Oligosakkaridin ja kantajan yhteenliittyminen tapah-5 tuu suoraan tai epäsuorasti kaavassa 1 olevan X(XO-):n tai Y(-OY):n kautta.

Jos X ja Y ovat vety, on oligosakkaridia muunnettava jommasta kummasta noista kohdista, jotta yhteenliittyminen kantajan kanssa tulisi mahdolliseksi. Koska kaavas-10 sa 1 näkyvät -OH ja =0 -ryhmät, jotka ovat enemmän tai vähemmän aktiivisia, ovat keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistuksen aikana suojattuina pitemmän tai lyhyemmän ajan, on edullista suorittaa kantajan kanssa yhteen-littymistä varten tarvittavat muutokset ennen kuin suojaa-15 vat ryhmät poistetaan. Kuten jo on mainittu, tapahtuu oligosakkaridin yhdistyminen kantajan kanssa joko X(X0-):n tai Y(-0Y):n kautta. Jos X ja Y olisivat kaavassa 1 nyt vetyjä, olisi suojaavat ryhmät lisättävä jälleen ennen kuin kantajan kanssa yhdistymiseen tarvittava ryhmä voi-20 täisiin lisätä. X on sen vuoksi mieluummin vety ja Y(-OY) on jokin muista ilmoitetuista ryhmistä, tai Y on vety ja X(XO-) on jokin muista ilmoitetuista ryhmistä.

Kun tästä lähtien käytetään ilmausta "X" tai "Y" tai termiä "reaktiokykyinen ryhmä", tarkoitetaan myös ta-25 pausta, jossa reaktiokykyisen ryhmän muodostaa reaktiokykyinen ryhmä -NH2 tai -SH, jolloin tulee käsittää -NH2 tai -SH vastaavasti ryhmäksi XO- tai -OY. Tämän keksinnön mukainen oligosakkaridi päättyy siten mieluimmin toisessa päässä hydroksyyliryhmään ja toisessa päässä reaktiokykyi-30 seen ryhmään tai ryhmään, jonka sitoutumattomassa päässä on hydrofobinen ketju. Näiden kahden ryhmätyypin välillä tehtävän valinnan ratkaisee tapa, jolla oligosakkaridin ja kantajan yhdistäminen toteutetaan. Periaatteessa on tätä tarkoitusta varten käytettävissä kaksi sinänsä tunnettua 35 menetelmää. Ensimmäisen menetelmän mukaan oligosakkaridi s 89172 sidotaan kantajaan. Siinä tapauksessa kantajana on tavallisesti proteiini. Toisen menetelmän mukaan saadaan oligosakkaridin liittyminen aikaan hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla sellaisen oligosakkaridiin sidotun ryhmän, jos-5 sa on sitoutumattomassa päässä hydrofobinen ketju, ja kantajan välillä, jolloin kantaja on miselli, vesikkeli tai liposomi, tai oligosakkaridien keskinäisen hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Ensimmäisessä tapauksessa hydrofobinen ryhmä osallistuu hydrofobiseen vuorovaikutukseen 10 misellissä, vesikkelissä tai liposomissa olevien amfifii-listen yhdisteiden (lipidien) hydrofobisten alueiden kanssa, kun taas oligosakkaridi päätyy misellin, vesikkelin tai liposomin jakopinnalle.

Tunnetaan reaktiokykyisiä ryhmiä, jotka kykenevät 15 muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen proteiinin kanssa. Epäsuoralla sidoksella tarkoitetaan tässä yhteydessä, että reaktiokykyisen ryhmän ja proteiinin välinen sidos muodostetaan lisäyhdisteen avulla. Jos X tai Y on kaavassa 1 reaktiokykyinen ryhmä, ovat kaikki sellaiset 20 reaktiokykylset ryhmät periaatteessa sopivia, jotka kykenevät muodostamaan sidoksen karboksyylin, amiinin tai proteiinin muun, siihen mahdollisesti lisätyn reaktiivisen ryhmän kanssa, tai jotka voidaan sitoa lisäyhdisteen välityksellä karboksyyliin, amiiniin tai proteiiniin muuhun, 25 siihen mahdollisesti lisättyyn reaktiokykyiseen ryhmään.

Esimerkkejä sellaisista reaktiokykyisistä ryhmistä ovat ryhmät, joissa on seuraava reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä:

30 L

/S /A s* -nh2, -n ,-sh, -S-S-V \> ja -c x r w 6 89172 joissa R = -OH, -Nj, -O-alkyylifC^^), -OC6F5, -H, -Br, -Cl tai

O

Λη

5 -O-N

V

Reaktiokykyinen ryhmä voi muodostua yhdestä näistä 10 reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, tai jos reaktiokykyinen ryhmä on suurempi, se voi sisältää yhden mainituista reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, jossa tapauksessa ryhmä mieluimmin päättyy yhteen mainituista reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä.

15 Koska immunogeenisyyden tehostamisen kannalta on edullista, jos oligosakkaridissa olevat riboosi-ribitoli-fosfaatti-yksiköt ovat jonkin matkan päässä proteiinista sen jälkeen kun oligosakkaridi on sidottu proteiiniin, on reaktiokykyinen ryhmä mieluimmin melko pitkä ryhmä, jossa 20 on yksi yllä mainituista reaktiokykyisistä funktionaali sista ryhmistä.

Kuten on sanottu, sijoitetaan reaktiokykyinen ryhmä oligosakkaridirungon päähän mieluimmin kun mainittu runko on vielä suojattuna. Kun yhden mainituista reaktiokykyi-25 sistä funktionaalisista ryhmistä sisältävä reaktiokykyinen ryhmä on lisätty, voidaan mainittu reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä muuttaa joksikin toiseksi reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, jos oligosakkaridienko on vielä suojattuna, mutta myös jos rungosta on suojaus jo 30 kokonaan poistettu.

Siten reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -NH2, kuten esimerkiksi —(-CH2ΤΪ-Η7 V^NH2 ja^CH2^-K~^-NH-4aminoV-NH2 35 \=/ 6 v // happo

II

7 89172 jossa a = 0-16, b = 0-2, c = 1-10 ja pääteaminohappo on mieluimmin glysiini, voidaan muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää aktiivisen esteri- Ja maleimidi-funktionaalisen ryhmän, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka 5 sisältää maleimidi- funktionaalisen ryhmän; mainituista ryhmistä saadaan seuraavan yhdisteen avulla o ιο , o jossa Rrllä on edellä annettu merkitys, ryhmät 15 o -f CH2^^^b-NH-j-O-CHx-N T[ ja · 20 ° 0 0 25

Lisäksi voidaan reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -NH2, muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää kaksi aktiivista esteri-30 tai aldehydi- funktionaalista ryhmää, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää reaktiokykyisenä funktionaalisena ryhmänä aktiivisen esterin tai aldehydin, esimerkiksi ryhmäksi 8 89172

H

-N-<J-(CH2)d-C-R O O

5 jossa R:llä on edellä annettu merkitys ja d - 1-6, tai sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää funktionaaliset ryhmät aktiivinen esteri ja -SH, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää funktionaalisen ryhmän -SH, esimerkiksi 10 seuraaviksi -NH-C-(CH2)d-SH tai -NH-C-CH-(CH2)d-SH, joissa d = 1-6 ja o 0 NHAc

Ac=asetyyli.

15

Reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -SH, voidaan muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää aktiivisen esteri- ja maleimidi-funktionaalisen ryhmän, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka 20 sisältää aktiivisen esterin reaktiokykyisenä funktionaali sena ryhmänä, esimerkiksi seuraavaksi

O

S-CHj-/-Vc^

25 -s-1/ '-r vR

o

Reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät ryhmän 0 ft 30 -C-R reaktiokykyisenä funktionaalisena ryhmänä, voidaan muuttaa suorittamalla reaktio sellaisten yhdisteiden kanssa, jotka sisältävät funktionaaliset ryhmät -NH2 ja -SH tai funktionaaliset ryhmät maleimidi ja -NH2, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää vastaavasti ryhmän -SH tai male-35 imidiryhmän reaktiivisena funktionaalisena ryhmänä.

li 9 89172

Sellaiset reaktiokykyisen ryhmän muuttamiset ovat sinänsä tunnettuja kirjallisuudessa.

Täten valmistetut keksinnön mukaiset oligosakkaridit kytketään proteiiniin tai peptidiin. Proteiinissa ole-5 vat reaktiokykyiset ryhmät -NH2, -COOH tai -SH voidaan muuttaa joksikin yllä kuvatuista muista reaktiokykyisistä ryhmistä yllä kuvattuja menetelmiä vastaavalla menetelmällä.

Keksinnön mukainen oligosakkaridi ja proteiini voi-10 daan sitten kytkeä toisiinsa muun muassa seuraavasti: oligosakkaridi-maleimidi + HS-proteiini -♦ immunogeeni oligosakkaridi-SH + maleimidi-proteiini -* immunogeeni 15 oligosakkaridi-SH + ^"^-S-S-proteiini -* immunogeeni oligosakkaridi-S-S- O + HS-proteiini -* immunogeeni

O

II

20 oligosakkaridi-C-R + H2N-proteiini -» immunogeeni

O

«I

oligosakkaridi-NH2 + R-C-proteiini -» immunogeeni, joissa R:llä on sama merkitys kuin edellä.

Sellaiset kytkemiset voidaan toteuttaa suoraan tai 25 epäsuorasti.

Lisäksi oligosakkaridit, joissa on reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä -NH2, voidaan esimerkiksi kytkeä proteiinin NH2 -ryhmään kytkevän aineen, kuten esimerkiksi bis[N-hydroksisukkiini-imidi]estereiden tai glutaaridial-30 dehydin avulla.

Jos X tai Y on kaavassa 1 ryhmä, joka sisältää sitoutumattomassa päässä hydrofobisen ketjun, ovat tähän tarkoitukseen sopivia sellaiset ryhmät, jotka kykenevät olemaan hydrofobisessa vuorovaikutuksessa misellin, vesik- 35 kelin tai llposomin kanssa tai kykenevät muodostamaan mi sellin hydrofobisten vuorovaikutusten avulla.

10 891 72

Hydrofobinen ketju on mieluimmin 12 - 24 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä. Parhaimpina pidetään ryhmiä, joissa 12 - 24 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä muodostaa mainitun ryhmän.

5 Vielä mieluummin ryhmä on haarautumaton alkyyli ryhmä, joka sisältää 14 - 22 hiiliatomia.

Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit sopivat käytettäviksi rokotteen valmistamiseen HIB-sairautta vas taan. Koska tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit eivät 10 sellaisinaan ole immunogeenisiä, ne tulisi yhdistää kantajaan, joka saa yhdistelmästä immunogeenisen. Periaate on sinänsä tunnettu niin kutsuttujen hapteenien yhteydestä, jotka voidaan, vaikkakaan ne eivät sellaisinaan ole immu-nogeenisia, saada immunogeenisiksi yhdistämällä ne kanta-15 jaan. Sopivia kantajia ovat proteiinit, peptidit, misel-lit, vesikkelit ja liposomit. Parhaimpina pidetään proteiineja tai misellejä.

Erityisen sopivina proteiineina ja peptideinä voidaan mainita tetanustoksiini, tetanustoksoidi, difteria-20 toksiini, difteriatoksoidi, pertussistoksiini, pertussis- toksoidi, pertussis- rihmainen hemagglutiniini, pertussis-karvat, pertussis-ulkokalvoproteiinit, meningokokin (Neisseria meningitidis) ulkokalvoproteiinit, Haemophilus in-fluenzaen ulkokalvoproteiinit, Haemophilus influenzaen 25 karvat, polioviruksen alayksikköproteiinit ja tuhkarokko- viruksen alayksikköprotelinit. Parhaimpina pidetään Haemophilus influenzaen proteiineja. Eräs sellaisten kantajien hyvä puoli on, että niitä käytetään tai voidaan käyttää olemassa olevissa DPTP-rokotteissa. Mainitut proteiinit 30 ovat sinänsä tunnettuja ja samoin tunnetaan myös sellaisten proteiinien eristysmenetelmiä. Tunnetaan myös menetelmiä sakkaridien yhdistämiseksi sellaisiin proteiineihin. Tavallisesti on kysymyksessä kovalenttinen sidos sakkari-din ja proteiinin välillä.

Il n 89172

Jos X tai Y on kaavassa 1 ryhmä, joka sisältää hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa päässä, voidaan oligosakkaridi saada immunogeeniseksi sopivalla tavalla yhdistämällä mainittu oligosakkaridi miselleihin, vesikkeleihin 5 tai liposomeihin. Yhteenliittyminen saadaan aikaan hydrofobisen ketjun ja misellin, vesikkelin tai liposomin hydrofobisten osien välisen hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Sellaiset yhdistämismenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

10 Jos X tai Y on kaavassa 1 reaktiokykyinen ryhmä, voidaan haluttaessa ensin suorittaa reaktio sellaisen yhdisteen kanssa, joka sisältää reaktiokykyisen ryhmän ja hydrofobisen ketjun. Näin saatu tuote voidaan sitten liittää miselleihin, vesikkeleihin tai liposomeihin.

15 Toinen menetelmä keksinnön mukaisten oligosakka ridien saamiseksi immunogeeniseksi on käsitellä oligosakkarideja, joissa X tai Y on hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa päässä omaava ryhmä, sellaisella tavalla, että mainitut hydrofobiset ketjut muodostavat misellirakenteen 20 hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Tässä tapauksessa immunogeenisyyttä ei saavuteta yhdistämällä oligosakkaridi kantajan kanssa, vaan siten, että useat oligosakkaridimo-lekyylit liittyvät keskenään yhteen.

Vielä eräs mahdollinen tapa valmistaa immunogeeni 25 on kytkeä kaavan 1 mukaiset oligosakkaridit, joissa X tai Y on reaktiokykyinen ryhmä, amfifiiliseen adjuvanttimole-kyyliin kovalenttisella sidoksella mainitun reaktiokykyi-sen ryhmän avulla. Tämä kytkeminen voi tapahtua suoraan tai epäsuorasti. Oligosakkaridin ja adjuvantin toisiinsa 30 kytkemisen jälkeen voi adjuvantin sitoutumaton pää muodostaa misellin, mahdollisesti yhdessä sitoutumattoman adjuvantin tai muiden lipidiaineiden kanssa. Sopivia amfifii-lisia adjuvantteja ovat esimerkiksi avridiini (N,N-diokta-dekyyli-N',N'-bis(2-hydroksietyyli)propaanidiamiini), li-35 poidiamiini 4-aminometyyli-l-(2,3-(di-n-dekyylioksi)-n- 12 891 72 propyyli)-4-fenyylipiperidiini, dimetyylidioktadekyyliam-moniumbrotnidi, lauryylimuramyylidipeptidi, lauryylitetra-peptidi, (N2-[N-(N-lauryyli-L-alanyyli)-ϊ-D-glutamyyli]-N6-(glysyyli)-D,D-L,L-2,6-diaminopimeliinihappo, L-tyrosii-5 ni ja sen alkyylijohdannaiset, maltoositetrapalmitaatti, pluronic-polyolit,L-tyrosiini-atsobentseeni-p-arsonaatti, sorbitaanimono-oleaatti (Span 80), trehaloosijohdannaiset (kuten esimerkiksi trehaloosidimykolaatti), retiinihappo ja sen johdannaiset, D,L-a-tokoferoli (vitamiini E), lipi-10 di A ja analogit ja glykosidit, kuten esimerkiksi saponii-nit (esimerkiksi Quil A, joka on saatu Quillaja-saippuayr-tin Molina niinestä).

Sellaisia immunogeeneja ja menetelmiä näiden immu-nogeenien valmistamiseksi tunnetaan sinänsä EP-patenttiha-15 kemuksesta 86,200,203,7. Lipidi A ja analogeja tunnetaan adjuvantteina NL-patenttihakemuksesta 8 500 499. Saponii-nien käyttö adjuvantteina ja misellien muodostaminen anti-geenideterminantteihin kytketyistä saponiineista tunnetaan NL-patenttihakemuksesta 8 303 646.

20 Tämän keksinnön mukaiset immunogeenit sopivat käy tettäviksi rokotteen valmistamiseen HlB-sairautta vastaan. Immunogeenisyyden tehostamiseksi edelleen voidaan edullisesti käyttää adjuvantteja. Sellaisten adjuvanttien käyttö ja mainitut adjuvantit ovat sinänsä tunnettuja. Adjuvantit 25 voidaan lisätä immunogeeniin. On myös mahdollista liittää adjuvantteja yhteen immunogeenin kanssa. Sellaiset menetelmät immunogeenisyyden parantamiseksi ovat myös sinänsä tunnettuja. Tämän keksinnön mukaiset immunogeenit käsittävät siten paitsi oligosakkaridien yhdistelmiä kantajien 30 kanssa ja oligosakkaridien keskenään muodostamia yhdisty-miä, myös mainittua kahta tyyppiä olevia yhdistelmiä, joihin on myös yhdistetty adjuvantti.

Em. immunogeeneja voidaan myös formuloida rokotteisiin. Tavallisesti immunogeeni on rokotteessa vesiliuok-35 sessa, -emulsiossa tai -suspensiossa, joissa voi esiintyä l! 13 891 72 rokotteissa tavanomaisia lisäaineita, kuten esimerkiksi adjuvantteja, stabiloimisaineita, puskureita ja muita im-munogeeneja. Sopivia adjuvantteja, joita voidaan lisätä, ovat alumiinihydroksidi, -fosfaatti tai -oksidi tai seos, 5 jonka muodostavat mineraaliöljy, esimerkiksi Marcol 52, tai kasviöljy ja yksi tai useampia emulgoimisaineita, kuten esimerkiksi Tween 80 tai Span 80, tai jokin jo yllä mainituista amfifiilisista adjuvanteista.

Sopivia stabiloimisaineita ovat sellaiset hiilihyd-10 raatit kuin sorbitoli, laktoosi, mannitoli, tärkkelys, sakkaroosi, dekstraani ja glukoosi tai sellaiset proteiinit kuin albumiini tai kaseiini.

Puskureina on mahdollista käyttää esimerkiksi alka-limetallifosfaatti-, alkalimetallikarbonaatti- tai maa-15 alkalimetallikarbonaattipuskuria.

Rokote voi sisältää myös muita immunogeeneja. Siinä tapauksessa on kysymyksessä niin kutsuttu cocktail, jolla on se etu, että voidaan saada aikaan immuniteetti useita taudin aiheuttajia vastaan yhden ainoan antomuodon avulla. 20 Muita immunogeeneja, joita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi tunnetuissa DPTP-rokotteissa käytettävät immunogee-nit. Rokote valmistetaan sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan käyttäen tämän keksinnön mukaista immunogeenia, esim. liuottamalla, emulgoimalla tai suspendoimalla imrau-25 nogeeni vesiympäristöön. Yksi tai useampia tavallisista lisäaineista voidaan lisätä tai voi olla läsnä mainitussa vesiympäristössä.

Tällaista rokotetta voidaan käyttää immunoimaan HIB-sairautta vastaan, mutta myös niin kutsuttuun "esikä-30 sittelyyn" (jossa kehoa ei suoraan stimuloida muodostamaan . . spesifisiä vapaita vasta-aineita, vaan todellakin esikäsi- tellään niin, että myöhemmän tartunnan tai uudelleenrokot-tamisen jälkeen syntyy voimakas immuunireaktio). Rokote annetaan tavallisesti ruiskeena lihakseen tai ihon alle. 35 Yleensä immunogeenimäärä, joka annetaan ruiskeessa on 0,1 - 100 pg annosta kohden.

14 891 72 Tällainen rokote antaa periaatteessa jokaiselle yksilölle suojan HIB-sairautta vastaan ja sopii etenkin erittäin hyvin pienten lasten (alle 2 vuoden ikäisten) rokottamiseen. Johtuen tämän keksinnön mukaisen oligosak-5 karidin puhtaudesta ei ole tarpeellista testata jokaisen valmistetun rokote-erän, joka sisältää sellaista oligosakkaridia, tehokkuutta. Lisäksi ei-toivotusti stimuloitujen vasta-aineiden määrä ja muiden sivuvaikutusten, kuten myrkyllisyyden, esiintyminen ovat vähäisiä tällaisen rokotit) teen yhteydessä.

Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa antamalla erilaisten yhdisteiden, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat yhdisteet, jotka sisältävät riboosi-, riboosi-ribitoli-, riboosi-ribitoli-fos-15 faatti-, ribitoli-, ribitoli-fosfaatti-, ribitoli-fosfaat-ti-riboosi-, fosfaatti-, fosfaatti-riboosi- ja fosfaatti-riboosi-ribitoli-yksikköjä, jolloin mainitut yksiköt on varustettu tarpeellisilla suojaavilla ryhmillä, reagoida keskenään erillisissä vaiheissa ja poistamalla lopuksi 20 suojaavat ryhmät. Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit valmistetaan lopullisesti siten, että oligosakkarideissa, jotka käsittävät rakenteen (D-riboosi-D-ribitoli-fosfaat-ti)., (D-ribitoli-fosfaatti-D-riboosi)„ tai (fosfaatti-D- riboosi-D-ribitoli )„, jossa m * 2, 3, 4, ... 19 tai 20 ja 25 jossa vapaiden hydroksiryhmien vetyatomi on korvattu suo-jaavalla ryhmällä, korvataan suojaavat ryhmät vetyatomilla. Yleisluonteisesti on tunnettua, että oligosakkaridit voidaan valmistaa sitomalla suurempia tai pienempiä yksikköjä, joista lopullinen oligosakkaridi rakentuu, toisiinsa 30 erillisten reaktioiden avulla, jolloin yksiköt ovat varustettuja tarpeellisilla suojaavilla ryhmillä. Sen jälkeen kun haluttu oligosakkaridi on muodostettu, poistetaan suojaavat ryhmät. Jos toinen kaavassa 1 olevista ryhmistä X ja Y ei ole vety ja nämä ryhmät eivät esiintyneet yhdis-35 teissä, joista oligosakkaridi muodostettiin, tulisi nämä ryhmät myös lisätä ennen kuin suojaavat ryhmät poistetaan.

Il is 89172 Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa lähtien seuraavan kaavan 2 mukaisesta yhdistees tä.

5 Γ 1 E-.-?__Vk &

io J L _J

k l Tästä yhdisteestä lähdettäessä on olemassa joukko menetel-15 miä keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistamiseksi.

Ensimmäinen menetelmä muodostaa oligosakkaridi on lisätä jatkuvasti pieniä yksiköitä yksi kerrallaan. Tämä voidaan tehdä fosforyloimalla kaavan 2 mukaisia yhdisteitä yhdisteillä, joilla on kaava 3 20

A

i p** (3) 0¾ 25 liittämällä sitten yhdiste, jolla on kaava 5 .»i

Ho 0¾ l—o^ 30 fosforiryhmään, toistamalla näitä kahta vaihetta niin usein kuin halutaan ja päättämällä lopuksi rakenteen muodostaminen suorittamalla reaktio yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 ie ? 91 72 R,° —I o /~T- ol3, s * k y « VY -öäa V”f--°°*--°*J (6) of? i_ j i_ n q 10 minkä jälkeen on vielä poistettava suojaavat ryhmät. Toinen tapa on fosforyloida kaavan 5 mukainen yhdiste kaavan 3 mukaisella yhdisteellä, sitoa saatu tuote fosforiryhmän avulla kaavan 2 mukaiseen yhdisteeseen, toistaa tätä vai- 15 hetta niin usein kuin halutaan ja lopuksi päättää rakenteen laatiminen suorittamalla reaktio kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa, minkä jälkeen on vielä poistettava suojaavat ryhmät. Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa siten, että 20 1) yhdiste jolla on kaava 2 25 __tk k l 30 reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava 3

A

35 °R,fc '% (3) 17 391 72 joissa kaavoissa k = 0, jos 1=0, k = 0 tai 1, jos 1=1, 1=0 tai 1, 5 R1 = jatkuvasti suojaava ryhmä, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, tai ryhmä, joka sisältää sitoutumattomassa pääs-10 sä hydrofobisen ketjun, tai päätteenä oleva ryhmä RjO- on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä H2N- tai HS-, joka reaktiokykyinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, R2 = jatkuvasti suojaava ryhmä, 15 A = happiatomi, joka on sitoutunut kaksoissidoksella fos-foriatomiin, tai ei mitään (tässä tapauksessa fosforiato-milla on vapaa elektronipari), R3 = reaktiokykyinen ryhmä ja R* = reaktiokykyinen ryhmä tai ryhmä, jolla on kaava 4 20 1 ky yJ -o*,. (4) O --ORr

25 S

q jossa q = 0 tai 1, R2 = jatkuvasti suojaava ryhmä ja R5 = 30 jatkuvasti suojaava ryhmä, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutu-35 mattomassa päässä, tai päätteenä oleva ryhmä -0R5 on kor- ie 9 9172 vattu reaktiokykyisellä ryhmällä H2N- tai HS-, joka reak-tiokykyinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, ja 2) jos R4 ei ole kaavan 4 mukainen ryhmä, vaiheessa 5 1) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 5, <» jq Ho 0¾ jossa R2 on jatkuvasti suojaava ryhmä ja R6 on tilapäisesti suojaava ryhmä, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja 15 3) vaihe 2) toistetaan m-2 kertaa vaiheessa 2) saa dulla tuotteella vaiheessa 1) saadun tuotteen asemesta, ja 4) vaiheesta 2) tai vaiheesta 3) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa jolla on kaava 6, jossa R2 = jatkuvasti suojaava ryhmä 20 R3 =* reaktiokykyinen ryhmä, R7 = jatkuvasti suoj aava ryhmä, reaktiokyky inen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla 25 ryhmällä, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutumattomassa päässä, tai ulkopuolinen ryhmä R70- on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä H2N- tai HS-, Joka reaktiokykyi-nen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, n = 0 tai 1, 30 q = 0, jos n = 0, q = 0 tai 1, jos n = 1, ja 5) näin saadussa tuotteessa jatkuvasti suojaava ryhmä Ri tai R7, jos se on läsnä tai Jos halutaan, korvataan X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 19 891 72 6) vaiheessa 1), 4) tai 5) saadusta yhdisteestä poistetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla.

Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan myös 5 valmistaa menetelmällä jossa 1) yhdiste, jolla on kaava 2 ίο te __rk K» ,2) k l 15 jossa k:lla, L:llä, R2:llä ja R2:lla on sama merkitys kuin edellä, saatetaan reagoimaan reaktiotuotteen kanssa, jonka ovat muodostaneet yhdiste, jolla on kaava 3 20 T (3) 25 jossa R2:lla, R3:lla ja R4:lla on sama merkitys kuin edellä, sillä ehdolla, että R4 ei ole yhdiste, jolla on kaava 4, 30 *°TA/~te W 141 ° --°R5- q 20 891 72 ja yhdiste, jolla on kaava 5, 5 H 00¾ —°\ jossa R2:lla ja R6:lla on sama merkitys kuin edellä, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja 10 2) vaiheessa 1) saadun tuotteen annetaan reagoida reaktiotuotteen kanssa, jonka ovat muodostaneet kaavan 3 mukainen yhdiste ja kaavan 5 mukainen yhdiste, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja että tämä menettely toistetaan m-3 kertaa 15 saadulla tuotteella, ja 3) vaiheessa 1) tai 2) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 20 r Ί [7 M VV -ÖR* !--°°5 1--0S/ (6) 01? i — -11— -1 n q 25 jossa n:llä, q:lla, R2:lla, R3:lla ja R7:llä on sama merkitys kuin edellä, ja 4) näin saadussa tuotteessa korvataan jatkuvasti 30 suojaava ryhmä Rx tai R7, jos se on läsnä tai jos halutaan, X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 5) vaiheessa 3) tai 4) saadusta yhdisteestä poistetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vety-atomilla.

Il .

2i 39172 R2 voi olla jatkuvasti suojaava ryhmä tai, jos X ei halutussa oligosakkaridissa ole vety, se voi olla sama kuin X, sillä ehdolla, että reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojäävällä ryhmällä, 5 mistä on seurauksena, että reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä ei osallistu mihinkään reaktioon oligosakkaridirung-on muodostamisen aikana. Koska X on kaavassa 1 mieluimmin vety, on R2 mieluimmin jatkuvasti suojaava ryhmä.

R2 on jatkuvasti suojaava ryhmä. R3 on kaavassa 3 10 reaktiokykyinen ryhmä ja R4 on reaktiokykyinen ryhmä tai kaavan 4 mukainen ryhmä. Koska Y mieluimmin ei ole vety, on R5 kaavassa 4 mieluimmin muu ryhmä kuin jatkuvasti suojaava ryhmä. Koska k, 1, n ja q ovat mieluimmin nolla, on R4 mieluimmin reaktiokykyinen ryhmä eikä siten kaavan 4 15 mukainen ryhmä.

Termillä "jatkuvasti suojaava ryhmä" tarkoitetaan ryhmiä, joiden - muuten - reaktiokykyisiä ryhmiä suojaava vaikutus kestää koko keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistuksen ajan.

20 Vasta sen jälkeen kun synteesi on suoritettu aivan loppuun, poistetaan jatkuvasti suojaavat ryhmät korvaamalla ne vetyatomilla. Sellaisia suojaavia ryhmiä tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa.

Ryhmät R2 kaavassa 2, 3, 4, 5 ja 6 voivat olla sa-25 moja tai erilaisia ryhmiä ja ne on mieluimmin valittu seu-raavien ryhmien joukosta: bentsoyyli, bentsyyli, bentsyy-lioksimetyyli, 2-kloorifenyyli, bentsyylioksikarbonyyli, tert.butyylidifenyylisilyyli, 10 - 20 hiiliatomia sisältävä alkyyli, tetrahydropyranyyli, tert.butyylidimetyylisi-30 lyyli ja trityyli. Mieluimmin R2 on ribitoliyksiköissä bentsyyli.

Jos R3 tai Rs ovat tai sisältävät jatkuvasti suojaavia ryhmiä, on mainitut ryhmät sopivasti valittu yllä mainitusta joukosta. Sama koskee kaavassa 3 olevaa R2:ta, 35 joka on mieluimmin 2-kloorifenyyli.

22 89 1 72

Kaavassa 2 muodostaa Rx mieluimmin yhdessä riboosi-yksikön asemassa 5' olevan R2:n kanssa ryhmän -Si - 0 - Si-

5 I I

(iC3H9)2 (iC3H9 )2 (siinä tapauksessa ovat k ja 1 nolla} tai riboosiyksikön asemassa 5' oleva R2 ja R3 ovat bentsyyli.

10 Riboosiyksikön asemassa 2' oleva R2 on mieluimmin bentsyyli, bentsyylioksimetyyli, tetrahydropyranyyli tai tert.butyylidimetyylisilyyli, joista parhaina pidetään bentsyyliä ja bentsyylioksimetyyliä, ja riboosiyksikön asemassa 5’ kaavassa 4, 5 ja 6 oleva R2 on bentsyyli, 15 bentsyylioksimetyyli, tetrahydropyranyyli, trityyli tai tert.butyylidifenyylisilyyli, joista parhaina pidetään bentsyyliä ja tert.butyylidifenyylisilyyliä.

Kaavassa 3 olevat reaktiokykyiset ryhmät R3 ja R4 voivat olla ryhmiä, jotka yhdessä kykenevät saamaan ai- 20 kaan sidoksen kaavan 5 ja kaavan 2 mukaisissa yhdisteissä olevan vapaan OH-ryhmän välille. Sopivia kaavan 3 mukaisia yhdisteitä ovat: o 25 S h^n-O— p—o-n'^n O-rv '5 1 $ · 0

Cl— P Cl , Cl-J? 0 Oi—CHj— CN ,

30 | I

0R-, 0R2 0

Cl-5—0 — CH2— CC^ja (alkyyli-Cl-C10)i,-M*(alIWli;-ci-cio)2· 1 OR2

Olt, li 23 891 72

Kaavan 2 ja 3 mukaisten yhdisteiden välinen reaktio tapahtuu yleensä ilman paineessa ja lämpötilassa 0-60 °C 20 minuutista 3 tuntiin kestävänä aikana.

Näin saadun tuotteen annetaan sitten reagoida kaa-5 van 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa R2 on jatkuvasti suojaava ryhmä ja R6 on tilapäisesti suojaava ryhmä.

R2:n suhteen pätee sama mikä on jo mainittu yllä käsiteltäessä kaavaa 2. Tilapäisesti suojaavalla ryhmällä tarkoitetaan tässä yhteydessä, että käytetään ryhmää, jon-10 ka suojaava vaikutus kestää osan aikaa oligosakkaridirun-koa rakennettaessa ja joka sitten myöhemmin, ennen kuin rakentaminen on saatettu täysin loppuun, poistetaan selektiivisesti, s.o. poistamatta jatkuvasti suojaavia ryhmiä. Sellaisia ryhmiä tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa. 15 Sopivia ryhmiä ovat: allyyli, 1-propenyyli, dimetoksitri-tyyli, klooriasetyyli, bromiasetyyli, levulinoyyli ja al-lyylioksikarbonyyli. Parhaimpina R6-ryhminä pidetään al-lyyliä ja 1-propenyliä.

Reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa tapah-20 tuu tavallisesti ilman paineessa ja lämpötilassa 0 - 60 °C 20 minuutista 3 tuntiin kestävänä aikana.

Sen jälkeen kun on suoritettu reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, poistetaan ryhmä R6 selektiivisesti, tavallisesti ilman paineessa ja lämpötilassa 0 - 60 °C 25 10-60 minuutin aikana, ja korvataan vetyatomilla.

Sitten voidaan haluttaessa suorittaa reaktio yhdisteen kanssa, joka on kaavan 3 mukainen, sillä ehdolla, että R, on reaktiokykyinen ryhmä, reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa ja R6:n korvaaminen vetyatomilla toistaa 30 m-2 kertaa. Olosuhteet, joissa nämä vaiheet suoritetaan, ovat samat kuin jo on kuvattu yllä vastaaville vaiheille.

Sitten annetaan saadun tuotteen reagoida kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa. R2:n ja R3:n suhteen pätee sama mikä on jo mainittu yllä R2:n ja R3:n osalta käsiteltäessä 35 kaavoja 2 ja 3. n ja q ovat mieluimmin nolla. R7:llä on 24 8 9 172 sama merkitys kuin F^rllä; tämä ei tarkoita, että Rt:n ja R7:n on välttämättä oltava identtisiä. Koska toivotussa oligosakkaridissa Y mieluimmin ei ole vety, on R7 mieluimmin sama kuin Y (Y + H), sillä ehdolla, että reaktiokykyi-5 nen funktionaalinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä. Ryhmiä, joita voidaan sopivasti käyttää tähän tarkoitukseen, ovat jo mainitut jatkuvasti suojaavat ryhmät; parhaimpana pidetään bentsyylioksikarbonyyliryh-mää.

10 Olosuhteet, joissa reaktio kaavan 6 mukaisen yh disteen kanssa tavallisesti tapahtuu, ovat seuraavanlaiset: lämpötila 10 - 60 eC ilman paineessa, aika 15 min 6 tuntia.

Oligosakkaridirungon rakentaminen on sillä tavoin 15 saatu loppuun. Haluttaessa voidaan Rx tai R7, mikäli Rx tai R7 on jatkuvasti suojaava ryhmä, nyt korvata X:llä tai Y:-llä, mikäli X tai Y ί H. Tämän keksinnön mukaisissa oligosakkarideissa X on mieluimmin vety; siinä tapauksessa Rj on mieluimmin jatkuvasti suojaava ryhmä. Koska Y mieluim-20 min ei ole vety, on R7 mieluimmin sama kuin Y (Y φ H) varustettuna jatkuvasti suojaavalla ryhmällä. Siinä tapauksessa ei Rjjtä eikä R7:ä tarvitse korvata X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y / H. Mieluimmin ei tätä vaihetta sen vuoksi suoriteta.

25 Lopuksi korvataan jatkuvasti suojaavat ryhmät vety- atomilla. Aivan kuten jatkuvasti suojaavien ryhmien käyttö ja lisääminen tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa, tunnetaan myös suojauksen poistaminen.

Kuitenkin tämän keksinnön mukaisten oligosakkari-30 dien, joissa k, 1, n ja q » 0, valmistaminen suoritetaan mieluimmin antamalla kaavan 2 mukaisen yhdisteen reagoida kaavan 3 mukaisen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reaktio-tuotteen kanssa. Sen jälkeen kun saadusta tuotteesta on poistettu suojaus poistamalla R6, voidaan oligosakkaridi-35 runkoa jatkaa edelleen suorittamalla reaktio kaavan 3 mu- li 25 89172 kaisen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reaktiotuotteen kanssa ja poistamalla saadusta tuotteesta jälleen suojaus poistamalla R6. Tämä voidaan toistaa niin usein kuin halutaan pitäen mielessä oligosakkaridirungon vaadittu pituus.

5 Oligosakkaridirungon rakentaminen päätetään suorittamalla reaktio kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa.

Tämän lähestymistavan etuna on, että vaiheiden lukumäärää voidaan pienentää, koska tuotetta, joka saadaan antamalla kaavan 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen 10 yhdisteen reagoida, tarvitsee valmistaa vain kerran. Toinen etu on se seikka, että kaavan 3 mukainen yhdiste reagoi selektiivisemmin kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa kuin kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Kummassakin tapauksessa kaavan 3 mukainen yhdiste soveltuu sitomaan ai-15 noastaan yhden kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen, kaavan 3 mukaisen yhdisteen toisen reaktiokykyisen ryhmän pysyessä koskemattomana. Kun on kysymyksessä reaktio kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa, tapahtuu epäsuotavammanlaista dimeerin muodostumista.

20 Kaavan 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen välinen reaktio suoritetaan lämpötilassa 10 -60 °C ja ilman paineessa ja se tapahtuu yleensä 10 - 60 minuutissa. Täten muodostuneen tuotteen annetaan myös reagoida 10 - 60 °C:ssa ja ilman paineessa kaavan 2 mukaisen 25 yhdisteen kanssa. Tämä reaktio on yleensä kulkenut loppuun 0,5-3 tunnin kuluttua ja se suoritetaan mieluimmin katalyytin, kuten esimerkiksi N-metyyli-imidatsolin tai tetra-tsolin, läsnä ollessa tai sen jälkeen kun on aktivoitu sellaisella aktivoivalla reagenssilla tai sellaisen akti-30 voivan reagenssin läsnä ollessa kuin esimerkiksi 1-(2,2,6-tri-isopropyylibentseeni-2' -sulfonyyli )-3-nitro-l, 2,4-tri-atsoli tai l-(mesityleeni-2'-sulfonyyli)-nitro-l,2,4-tri-atsoli.

Kaavan 3 mukaiset yhdisteet, joita voidaan sopi-35 vasti käyttää, ovat periaatteessa samoja kuin yhdisteet, jotka on jo mainittu yllä.

26 0 9172 Tämän keksinnön mukaiset: oligosakkaridit voidaan myös valmistaa lähtien kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä.

Tämän yhdisteen annetaan sitten reagoida kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa H on korvattu R6:lla ja 5 R6 on korvattu H:11a. Suojaus poistetaan sitten korvaamalla R6 H:11a ja antamalla saadun tuotteen reagoida peräkkäin kaavan 3 mukaisen ja kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Toinen mahdollisuus on antaa kaavan 6 mukaisen yhdisteen reagoida tuotteen kanssa, joka on saatu antamalla kaavan 3 10 mukaisen yhdisteen reagoida kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa H on korvattu R6:lla ja R6 H:11a ja antamalla saadun yhdisteen reagoida kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Välivaiheet voidaan jälleen toistaa m-2 kertaa.

Kaavan 3 mukaisten yhdisteiden asemesta voidaan 15 käyttää myös muita fosforiyhdisteitä valmistettaessa keksinnön mukaisia oligosakkarideja. Tämä koskee sekä jo kuvattuja menetelmiä että vielä seuraavia valmistusmenetelmiä. Siten voidaan antaa fosforiyhdisteiden, joissa on kolme reaktiokykyistä ryhmää, kuten esimerkiksi PCl3:n tai 20 salisyylikloorifosfiinin, reagoida kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen kanssa ja saatu tuote hydrolysoidaan sitten vastaavaksi fosfonaatiksi, jonka annetaan, aktivoivalla rea-genssilla, kuten esimerkiksi pivaloyylikloridilla, aktivoinnin jälkeen, reagoida kaavan 5 tai 2 mukaisen yhdis-25 teen kanssa.

Sen jälkeen kun kaavan 3 mukaisen yhdisteen on annettu reagoida kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen kanssa, voidaan näin muodostunut tuote myös hydrolysoida poistaen jäljelle jäänyt vapaa reaktiokykyinen ryhmä ja jatkuvasti 30 suojaava ryhmä (joka on tässä tapauksessa tilapäisesti suojaava ryhmä) - vastaavaksi fosfonaatiksi, jonka annetaan aktivoivalla reagenssilla aktivoinnin jälkeen reagoida kaavan 5 tai 2 mukaisen yhdisteen kanssa.

Jos A ei kaavassa 3 ole mitään ja fosforiyhdistees-35 sä on siten vapaa elektronipari, tai jos keksinnön mukais- li 27 89172 ten oligosakkaridien valmistuksen aikana muodostuu fosfo-riyhdisteitä, jotka eivät ole täysin hapettuneita, tulisi suorittaa hapettaminen, esimerkiksi I2/pyridiiniä tai tert. butyyliperoksidia käyttäen, jotta saataisiin vastaava fos-5 faatti.

Eräs toinen menetelmä keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistamiseksi on valmistus niin kutsutun kappa-lesynteesin avulla. Tässä tapauksessa valmistetaan halutun oligosakkaridin melko suuria palasia erikseen ja ne sido-10 taan sitten toisiinsa. Vielä eräs menetelmä on valmistaa kohtalaisen suuri kappale ja poistaa osasta saatua kappaletta suojaus eri kohdasta kuin toisesta osasta, minkä seurauksena nämä osat voidaan yhdistää toisiinsa. Erityisesti keskinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa 15 sellaisella menetelmällä jossa 1) yhdiste jolla on kaava 2 h—._i__rk t?·· ,2) k i 25 saatetaan reagoimaan yhdisteen jolla on kaava 3

A

30 S~~ o) 0¾ yhdisteen, jolla on kaava 5 28 qa< 72 «3, 5 Ho °βζ —°\ reaktiotuotteen kanssa, joissa kaavoissa k, 1, A, R2, R2, R3 Ja Re ovat merkitykseltään jo kuvatun mukaisia ja R4 on reaktiokykyinen ryhmä, 10 ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja 2) vaihe 1) toistetaan niin monta kertaa kuin halutaan vaiheessa 1) saadulla tuotteella kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta, ja 15 3) vaihe 1) ja, jos niin halutaan, vaihe 2) toiste taan lähtien kaavan 2 mukaisesta yhdisteestä, jossa k = 0, 1 = 1 ja Rj on tilapäisesti suojaava ryhmä, ja korvaten R2 R6:n asemesta viimeisessä vaiheessa vetyatomilla, ja 4) vaiheessa 1) tai 2) saadun tuotteen ja vaiheessa 20 3) saadun tuotteen annetaan reagoida toistensa kanssa ja siten muodostuneessa tuotteessa korvataan R6 vetyatomilla, ja 5) vaiheessa 4) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 25 K·,0—I o t V --z , •RO-?--o --oR, ...

30 J I 1 r (6)

Of? l J L

n q jossa R2, R3, R7, n ja q ovat merktiykseltään jo kuvatun 35 mukaisia, ja li 29 891 72 6) Jatkuvasti suojaava ryhmä Rx tai R/ Jos se on läsnä ja jos halutaan, korvataan täten saadussa tuotteessa X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 7) vaiheessa 5) tai 6) saadusta tuotteesta pois-5 tetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla.

Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa käyttäen vaiheessa 3) kaavan 6 mukaista yhdistettä kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta samalla kun käytetään kaavan 10 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reak tiotuotetta.

Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa lähtien kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä vastaavasti kuin on jo kuvattu siltä osin.

15 Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan myös valmistaa menetelmällä, jossa 1) yhdiste, jolla on kaava 2 20 r 1 Γ Ί R —o-, _ Ho—, OvT l-0** 1 :¾ ^>.7 o V7 * (2) __o—I__-Π*4 L-0» _ 25 k l saatetaan reagoimaan yhdisteen, jolla on kaava 3 30 * V-p*y o) ja yhdisteen, jolla on kaava 5 p g * 7 o 30 * Ύ1 <*> 5 Ho '—‘«i reaktiotuotteen kanssa, joissa kaavoissa A:11a, R2:lla, R3:lla ja R6:lla on jo kuvattu merkitys ja R4 on reaktiokyky inen ryhmä, k = 0, 1 = 0 ja R, on suojaava ryhmä, ja näin 10 saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vety-atomilla, ja 2) vaihe 1) toistetaan niin monta kertaa kuin halutaan vaiheessa 1) saadulla tuotteella kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta, ja 15 3) osasta vaiheessa 2) saatua tuotetta poistetaan suojaus korvaamalla R3 R6:n asemesta vetyatomilla, ja 4) tuotteiden, joissa R2 ja R6 on korvattu, annetaan reagoida toistensa kanssa sen jälkeen kun toisen mainituista tuotteista on annettu reagoida kaavan 3 mukaisen 20 yhdisteen kanssa, ja 5) R6 korvataan saadussa tuotteessa vetyatomilla, ja 6) vaiheessa 5) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 25

ί W

*j0—r--° --oS; (6)

oi? L J L

30 4 n q jossa n, q, R2, R3 ja R7 ovat merkitykseltään jo kuvatun mukaisia, ja 3i »9172 7) jatkuvasti suojaava ryhmä Rx tai R7, jos se on läsnä ja jos halutaan, korvataan täten saadussa tuotteessa X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 8) vaiheessa 6) tai 7) saadusta yhdisteestä poiste-5 taan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vety- atomilla.

Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa päinvastaisessa järjestyksessä, s.o. aloittaen kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä ja lopettaen lisäämiseen, joka vaa-10 ditaan kaavan 2 mukaisen yhdisteen saamiseksi.

Vielä yksi näiden kappalesynteesien muunnelma on, että ennen kuin kyseiset kaksi kappaletta yhdistetään, lisätään pääteryhmä (suorittamalla reaktio kaavan 6 tai kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa) toiseen kappaleista. Kap-15 palesynteesi on erityisen edullinen, jos valmistetaan kohtalaisen suuria oligosakkarideja. Reaktiovaiheiden lukumäärää voidaan tällä tavalla pienentää huomattavasti. Olosuhteet, joissa kappaleet liitetään toisiinsa, eivät periaatteessa eroa niistä, joita on yllä kuvattu muiden me-20 netelmien yhteydessä. Kuvatut valmistusmenetelmät voidaan sopivasti suorittaa, kokonaan tai osittain, kiinteän faasin pinnalla.

Keksintöä on selitetty seuraavien esimerkkien avulla.

25 Esimerkki 1 1. Kaavan 2 mukaisen yhdisteen valmistaminen

Aloittaen D-ribonolaktonista valmistettiin 1-0-[2-bentsyylioksimetyyli-3,5-0-(tetraisopropyylidisiloksaani- 1,3-diyyli)-B-D-ribofuranosyyli]-2,3, 4-tri-O-bentsyyli-D-30 ribitoli (yhdiste 15 toimintasuunnitelmassa 1) 13 välituotteen kautta.

Toimintasuunnitelmassa 1 oleva yhdiste 2 valmistettiin yhdisteestä 1 kuten on kuvattu julkaisussa Canadian J. Chem. 36 (1958) 1720.

32 89 1 7? 4.5 ml allyyliklooriformiaattia, joka oli 10 ml:ssa kuivaa asetonitriiliä, lisättiin tipoittain, sekoittaen 4 g:n joukkoon yhdistettä 2 ja 3,5 ml:aan pyridiiniä, jotka olivat 10 ml:ssa kuivaa asetonitriiliä 0 °C:ssa. Sekoitta- 5 mistä jatkettiin sitten 1 tunnin ajan 0 °C:ssa. Ylimäärä klooriformiaattia tuhottiin lisäämällä jäätä. Reaktioseos laimennettiin 100 ml:11a eetteriä Ja pestiin 3 kertaa 50 ml:11a vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin MgS04:n avulla ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin 10 ml:aan 10 dikloorimetaania ja suodatettiin pienen pylvään lävitse, jossa oli pakattuna 6 g silikageeliä 60. Pylväs pestiin 40 ml:11a dikloorimetaania. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjössä. Yhdiste 3 kiteytettiin tästä eetteri/di-isopropyylieetterillä.

15 5 g yhdistettä 3, joka oli 20 ml:ssa dioksaania, sijoitettiin heliumilmakehän alle. Sen jälkeen kun oli lisätty 15 mg tetrakis(trifenyylifosfiini)palladiumia, liuosta kuumennettiin 15 minuutin ajan palautusjäähdytys-olosuhteissa ja reaktioseos, jossa oli yhdiste 4, konsen-20 troitiin.

8.6 g yhdistettä 4, 3,5 g natriumboorihydridiä ja 150 ml kuivaa tetrahydrofuraania kuumennettiin 55 eC:een. Lisättiin 30 ml metanolia 45 minuutin aikana sekoittaen. Sekoittamista jatkettiin sitten 1 tunnin ajan 55 °C:ssa.

25 Jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos konsentroitiin tyhjössä. Jäännöstä haihdutettiin yhdessä kuivan metanolin kanssa (3 x 50 ml), se otettiin 100 ml:aan dikloorimetaania ja pestiin 100 ml:11a 90 %:isesti kyllästettyä ammo-niumkloridin vesiliuosta. Vesikerrosta uutettiin dikloori-30 metaanilla (2 x 100 ml). Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös puhdistettiin kromatografian avulla (eluoiden dikloorimetaa-ni/metanolilla 100/0 -* 95/5). Sopivat fraktiot sisältävät yhdistettä 5. 6,2 g yhdistettä 5 liuotettiin 100 ml:aan 35 etikkahappoa, minkä jälkeen lisättiin 40 ml vettä. Liuosta 33 8 9 1 7 2 sekoitettiin 4 tunnin ajan 50 °C:ssa. Reaktioseos konsentroitiin tyhjössä. Jäännöstä haihdutettiin yhdessä kuivan tolueenin kanssa (3 x 25 ml) ja kuivan pyridiinin kanssa (3 x 25 ml) ja se liuotettiin uudelleen 40 ml:aan pyri-5 diiniä. Sen jälkeen kun oli lisätty 7,5 g trityyliklori-dia, liuosta sekoitettiin 12 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml metanolia, reaktioseos konsentroitiin tyhjössä.

Jäännöstä haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa (3 10 x 25 ml) ja se otettiin 150 ml:aan dikloorimetaania ja pestiin 150 ml:11a 1 M natriumbikarbonaattiliuosta ja 150 ml:11a vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Sen jälkeen kun oli suoritettu kromatografinen puhdistus kuten edellisessä vaiheessa, saa-15 tiin yhdiste 6. 7,3 g yhdistettä 6 liuotettiin 40 ml:aan kuivaa N,N-dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisättiin 2 g natriumhydridiä pieninä annoksina. Sekoitettu reaktio-seos jäähdytettiin 0 eC:een ja lisättiin 6,2 ml bentsyyli-bromidia 10 ml:ssa kuivaa N,N-dimetyyliformamidia tipoit-20 tain 30 minuutin aikana. Sekoittamista jatkettiin vielä 30 minuutin ajan 0 °C:ssa ja sitten 12 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten lisättiin hitaasti 10 ml metanolia ja reaktioseos konsentroitiin tyhjössä. Jäännös otettiin 150 ml:aan eetteriä ja pestiin kolme kertaa 50 ml:11a H20:ta. 25 Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Puhdistamalla konsentraatti kromatografisesti (eluoiden heksaani/dikloorimetaanilla 2/1 (400 ml) ja 1/1 (400 ml) ja sen jälkeen dikloorimetaanilla) ja haihduttamalla oikeat fraktiot saatiin yhdiste 7. 8,5 g yhdis-30 tettä 7 liuotettiin 135 ml:aan etikkahappoa ja 15 ml:aan vettä ja kuumennettiin 90 minuutin ajan 80 °C:ssa. Liuos konsentroitiin tyhjössä. Jäännös otettiin eetteriin ja pestiin vedellä (50 ml) ja 1 M natriumbikarbonaattiliuok-sella (2 x 50 ml).

34 8 9 1 72

Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin 10 ml dikloorimetaa-ni/heksaania 1/1 ja suoritettiin suodatus. Suodos puhdistettiin kromatografisesti (eluoiden 400 ml :11a kloroformi/ 5 heksaani 1/1, 400 ml:11a dikloorimetaania ja dikloorime-taani/metanolilla 98/2), minkä jälkeen saatiin yhdiste 8.

3,4 g yhdistettä 9, joka oli ostettu, ja 3,1 g yhdistettä 8 kuivattiin haihduttamalla yhdessä dioksaanin kanssa (3 x 50 ml) ja liuotettiin sitten 50 ml:aan kuivaa 1,2-dikloo-10 rietaania. Lisättiin molekyyliseuloja (4 A, 10 g aktivoituja pellettejä) ja seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 90 minuutin ajan typpivirran alla. Sitten lisättiin 3 x 30 μΐ trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaat-tia 1 tunnin väliajoin. 1 tunnin kuluttua viimeisestä li-15 säämisestä lisättiin 100 μΐ trietyyliamiinia; molekyyli-seulat poistettiin suodattamalla ja pestiin kloroformilla ja tolueenilla. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös puhdistettiin kromatografisesti (eluoiden tolueeni/asetonilla 100/0 -» 98/2). Yhdiste 20 10 saatiin oikeista fraktioista. 5 g siitä liuotettiin 25 ml:aan kuivaa dioksaania; sitten lisättiin 25 ml kuivaa metanolia ja 1,25 ml 1 M natriummetoksidia metanolissa. Reaktioseosta sekoitettiin 4 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli lisätty 0,25 ml 1 M natrium-25 metoksidia metanolissa sekoitettiin vielä tunnin ajan.

Sitten lisättiin 1,25 g Dowex 50 WX4:ä (H*-muotoa) ja se poistettiin jälleen 30 minuutin kuluttua suodattamalla ja pestiin metanolilla ja kloroformilla. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografises-30 ti puhdistamalla (eluoiden dikloorimetaani/metanolilla 100/0 -* 95/5) saatiin yndiste 11, josta 2,4 g konsentroitiin kaksi kertaa 20 ml:ssa kuivaa pyridiiniä. Sitten lisättiin 20 ml kuivaa pyridiiniä. Saatua liuosta sekoitettiin typpi-ilmakehän alla 0 °C:ssa ja lisättiin 1,4 ml 35 1,3-dikloori-l,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaania ti- l! oc 89172 35 poittain 15 minuutin aikana. Sitten sekoitettiin 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Reaktioseos konsentroitiin tyhjössä ja sitä haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa (3 x 20 ml). Jäännös otettiin 75 ml:aan dietyylieetteriä ja 5 pestiin 1 M KH2P04-liuoksella (3 x 50 ml) ja 1 M NaHC03-liuoksella (3 x 50 ml). Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografisen puhdistamisen jälkeen (eluoiden dikloorimetaani/asetonilla 100/0 -+ 98/2) saatiin yndiste 12, josta 1,49 g konsentroitiin 10 kahdesti 5 ml:sta asetonitriiliä. Sitten lisättiin 4,5 ml asetonitriiliä. Liuosta sekoitettiin typpi-ilmakehän alla 50 eC:ssa ja lisättiin peräkkäin 1,35 ml kuivaa N,N-di-isopropyylietyyliamiinia ja 0,5 ml bentsyylioksimetyyli-kloridia. 2 tunnin kuluttua lisättiin 0,25 ml bentsyyliok-15 simetyylikloridia ja sitten sekoitettiin vielä tunnin ajan. Sitten lisättiin 2 ml kuivaa metanolia 50 eC:ssa. Jäähdyttämisen jälkeen konsentroitiin reaktioseos tyhjössä. Jäännös otettiin 40 ml:aan dietyylieetteriä ja pestiin 1 M KH2P04-liuoksella (3 x 20 ml) ja 1 M NaHC03-liuoksella 20 (20 ml). Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsen

troitiin tyhjössä. Kromatografisen puhdistamisen jälkeen (eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla 10/0 -* 9/1) saatiin yhdiste 13. Yhdiste 13 (1,32 g) liuotettiin 4 ml:aan tet-rahydrofuraania. Liuoksesta poistettiin kaasut 3 kertaa ja 25 se sijoitettiin heliumin alle. Lisättiin 1,5-syklo-okta-dieenibis(metyylidifenyylifosfiini)iridiumheksafluorofos-faattia (2 - 3 mg), minkä jälkeen liuoksesta jälleen poistettiin kaasut 3 kertaa ja se sijoitettiin heliumin alle. H2-virta johdettiin liuoksen ylitse 2 minuutin ajan, minkä 30 jälkeen siitä taas poistettiin kaasut ja se sijoitettiin heliumin alle. 4 tunnin kuluttua reaktioseos konsentroitiin tyhjössä. Näin saatu yhdiste 14 liuotettiin asetoniin ja veteen (1,2 g 15 ml:aan ja 1 ml:aan vastaavasti). Sitten lisättiin 300 mg HgO ja 375 mg HgCl2 ja suspensiota 35 sekoitettiin 30 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa. HgO

36 89172 poistettiin suodattamalla ja pestiin. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös otettiin 75 ml:aan dietyylieetteriä ja pestiin 40 ml:11a 50 %^eesti kyllästettyä KI-liuosta (3 x), 40 ml:11a 1 % NaHS03-5 liuosta ja 40 ml :11a 1 M NaHC03-liuosta. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä.

Kromatografisen puhdistamisen (eluoiden heksaani/-etyyliasetaatilla 9/1 -» 7/3) jälkeen saatiin 0,97 g puhdasta yhdistettä 15; Rf 0,34 (heksaani/etyyliasetaatti 10 7/3), [α]*0 = +39* (c 1,0 - CHC13).

Esimerkki 2

Kaavan 5 mukaisen yhdisteen valmistaminen

Aloittaen toimintasuunnitelmassa 1 olevasta yhdisteestä 14 valmistettiin yhdiste 17 toimintasuunnitelman 2 15 mukaan.

Yhdiste 14 (425 mg) konsentroitiin 2 mltsta kuivaa dioksaania (2 x) ja liuotettiin 2,2 ml:aan 0,5 M tetra-n-butyyliammoniumfluoridia dioksaanissa. Sen jälkeen kun sitä oli seisotettu ympäristön lämpötilassa 30 minuutin 20 ajan, haihdutettiin liuotin pois tyhjössä. Jäännökseen lisättiin 25 ml 1 M NaHC03 ja seosta uutettiin 25 ml:11a dikloorimetaania (3 x). Yhdistetyt uutteet kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografisen puhdistamisen jälkeen (eluoiden dikloorimetaani/metanolilla 25 100/0 -* 98/2) ja oikeiden fraktioiden tyhjössä konsentroi- misen jälkeen saatiin 239 mg tuotetta, joka sisälsi 200 mg yhdistettä 16. Tämä tuote konsentroitiin kahdesti 2,5 ml:-sta kuivaa pyridiiniä ja liuotettiin sitten 2,5 ml:aan dikloorimetaania. Sen jälkeen kun oli lisätty 65 μΐ N,N-30 di-isopropyylietyyliamiinia ja 90 μΐ tert.butyylidifenyy-lisilyylikloridia, reaktioseosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 12 tunnin ajan. Sen jälkeen kun oli lisätty 65 μΐ N,N-di-isopropyylietyyliamiinia ja 90 μΐ tert.butyy-lidifenyylisilyylikloridia sekoitettiin vielä 24 tunnin 35 ajan. Sitten lisättiin 0,5 ml metanolia ja konsentroitiin 37 89172 sitten tyhjössä. Jäännös otettiin dietyylieetteriin (25 ml) ja pestiin 1 M KH2P04-liuoksella (3 x 10 ml) ja 1 M NaHCOj-liuoksella (10 ml). Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografisesti puh-5 distamalla (eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla 10/0 -» 7/3) saatiin 254 mg yhdistettä 17; Rf = 0,41 (heksaani/-etyyliasetaatti 7/3) ja [α]£0 = 24,8" (c = 1,0 - CHC13).

Esimerkki 3

Kaavan 3 mukaisen yhdisteen valmistaminen 10 2-kloorifenyyli-0,0-bis( 1-bentsotriatsolyyli ) fos faatti valmistettiin julkaisun I.R.L. Press, Oxford, U.K.

(1984) 153 - 183 mukaisesti. Tätä yhdistettä kutsutaan tästä lähtien yhdisteeksi 18.

Esimerkki 4 15 Kaavan 1 mukaisen yhdisteen valmistaminen

Valmistettiin tämän keksinnön mukainen oligosakkaridi toimintasuunnitelman 3 mukaan.

229 mg yhdistettä 15 ja 254 mg yhdistettä 17 konsentroitiin erikseen 2,5 ml:sta pyridiiniä (3 x, viimei-20 sellä kerralla tilavuus oli 1 ml). Sitten lisättiin 1,46 ml 0,2 M yhdisteen 18 dioksaaniliuosta yhdisteen 17 joukkoon, minkä jälkeen liuosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 30 minuutin ajan. Tämä liuos lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 15 ja 50 μΐ N-metyyli-imidatsolia 25 vedettömissä olosuhteissa. Kun liuosta oli sekoitettu 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, se laimennettiin 50 ml;11a dietyylieetteriä ja pestiin 1 M trietyyliammonium-bikarbonaatilla (2 x 25 ml), IM KH2P04-liuoksella (25 ml) ja 1 M trietyyliammoniumbikarbonaatilla (25 ml). Orgaani-30 nen kerros kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografisesti puhdistamalla (eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla 10/0 -♦ 8/2) saatiin 368 mg yhdistettä 19 (n = 1), jota käsiteltiin sitten Hg0/HgCl2:11a, kuten on kuvattu yndisteen 15 valmistamisen yhteydessä. Kromatografiän 35 avulla erottamisen jälkeen (eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla 9/1 -» 7/3) saatiin yhdiste 20 (n = 1).

38 89172

Yhdiste 21 (0,22 mmoolia), joka oli valmistettu antamalla bentsyylioksikarbonyyliglysiinin pentakloorife-nyyliesterin ja 3-amino-1-propanolin reagoida dioksaanissa (ympäristön lämpötilassa, 1 tunnin ajan), fosforyloitiin 5 yhdisteellä 18 (1,1 ml 0,2 M liuosta dioksaanissa). Liuos lisättiin seokseen, jossa oli 296 mg yhdistettä 20 (n = 1) ja 20 μΐ N-metyyli-imidatsolia. Sen jälkeen kun oli sekoitettu 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, lisättiin -reaktioseokseen jälleen liuos, joka oli saatu fosforyloi-10 maila 0,30 mmoolia yhdistettä 21 1,5 ml:11a 0,2 M yhdisteen 18 dioksaaniliuosta (30 minuutin ajan). 2 tunnin kuluttua saatiin yhdiste 22 (n * 1) suorittamalla pesumenet-tely, jollainen on kuvattu yhdisteen 19 (n * 1) valmistamisen yhteydessä ja puhdistamalla kromatografisesti 15 (eluoiden kloroformi/asetonilla 100/0 -* 95/5).

Yhdisteestä 22 (n = 1) (285 mg) poistettiin suojaus suorittamalla peräkkäin seuraavat vaiheet: 2-kloorifenyyliryhmien poistaminen suorittamalla reaktio syn-pyridiini-2-karboksaldoksiimin ja N1,N1,N3,N3-20 tetrametyyliguanidiinin kanssa tetrahydrofuraanissa 48 tunnin aikana ympäristön lämpötilassa; 1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-l,3-diyyli-j a tert.butyylidifenyylisilyyliryhmän poistaminen antamalla reagoida tetra-n-butyyliammoniumfluoridin kanssa dioksaa-25 nissa 16 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa; bentsyylioksikarbonyyli-, bentsyylioksimetyyli ja bent syy li ryhmien poistaminen hydrogenolyysin avulla tert.-butanoli/vedessä (24 tuntia) ja vedessä (24 tuntia), peräkkäin, 10 % Pd/C:n (600 mg) ja glysiiniamidin läsnä ol-30 lessa.

Sen jälkeen kun oli poistettu katalyytti suodattamalla, pesty suodos (3x) kloroformilla, haihdutettu kloroformi pois, pakastekuivattu, suoritettu geelisuodatus käyttäen Sephadex G-25:tä (eluoiden 0,01 M trietyyliammo-35 niumbikarbonaatilla pH 7) ja pakastekuivattu sokerin suh- li 39 89172 teen positiiviset fraktiot, annettiin saadun materiaalin kulkea Dowex 50 WX4 (Na*-muoto) -pylvään lävitse vedessä. Pakastekuivaamisen jälkeen saatiin 51 mg kiinteää yhdistettä 23 (n * 2). 31P-NMR: 5 6 1,54 ja 0,74. 1H-NMR (vert. HDO, 4,65 ppm): δ 4,90 (s,

1H); 4,86 (s, 1H); 4,5 - 4,4 (m, 8 viivaa, 1H); 3,21 (t, -NH-CH2-CH2-, välike); l,71t, -CH2-CH2-CH2, välike). 13C-NMR

(ulkoinen vertailukohde tetrametyyliammoniumkloridi δ 56,2): δ 167,8 (s), 107,7 (s, C-l Ribf), 107,5 (s, C-l 10 Ribf), 83,5 (s, CH), 82,8 (d, CH, Jcp 5,8 Hz), 75,2 (s, CH), 75,1 (d, CH, Jcp 3,4 Hz), 74,6 (leveä s, CH, Jcp ratkaisematon), 72,3 (s, 2 x CH), 71,8 (d, 2 x CH, Jcp 8,8 Hz), 71,4 (s, CH), 71,0 (s, 2 x CH), 6,95 (s, CH2), 69,3 (s, CH2), 67,5 (d, CH2, Jcp 4,4 Hz), 67,3 (d, CH2 Jcp 4,4 15 Hz), 64,4 (d, CH2, Jcp 5,9 Hz), 63,4 (s, CH2), 63,2 (s, CH2), 41,3 (s, CH2 Gly), 37,2 (s, CH2), 30,0 (d, CH2, Jcp 7,3 Hz).

FAB-MS (nopea atomi -pommitus-massaspektrometria) paljasti signaalin m/z 823 /yhdiste 23, n - 2, -Na)‘ ole-20 van runsain signaali suuren massan alueella.

Esimerkki 5

Yhdisteen 23 (n = 3) valmistaminen

Yhdistettä 20 (n = 1) (0,46 mmoolia) lisättiin liuokseen, joka oli saatu fosforyloimalla 0,56 mmoolia 25 yhdistettä 17 3 ml:n avulla 0,2 M yhdisteen 18 liuosta dioksaani/pyridiinissä 30 minuutin ajan. 3 tunnin kuluttua saatiin 0,36 mmoolia yhdistettä 19 (n * 2). Jo edellä kuvatun menetelmän mukaisesti valmistettiin sitten 0,30 mmoolia yhdistettä 20 (n = 2) ja aloittaen 0,15 mmoolista 30 yhdistettä 20 (n = 2), saatiin 478 mg yhdistettä 22 (n = 2). 45 pmoolista tätä yhdistettä saatiin poistamalla suojaus yhdistettä 23 (n = 3). Saanto 22 mg; 31P-NMR: δ 1,66 ja 0,85 (kaksi limittäistä signaalia); 1H-NMR D20:ssa (vert. HDO, δ 4,65); 4,92 (s, 2H); 4,88 (s, 1H); 4,55 -35 4,42 (m, 2H); 3,25 (t, 2H, välike -NH-CH2-CH2-); 1,74 (t, 2H, välike -CH2-CH2-CH2-); [a]30 = -30,1° (c = 1,0, H20).

40 R 91 72

Esimerkki 6

Immunogeenien valmistaminen

Valmistettiin immunogeeneja kytkemällä yhdiste 23 (n = 2) ja yhdiste 23 (n = 3) (katso toimintasuunnitelmaa 5 3) tetanustoksoidiin (TT) ja Haemophilus influenzae tyyppi b:n ulkokalvoproteiiniin (MP) toimintasuunnitelman 4 mukaisesti .

Ensin muutettiin oligosakkarideja 23 (n » 2, 3) antamalla pääteaminoryhmän reagoida N-sukkiini-imidyyli-10 S-asetyylimerkaptoasetaatin kanssa, jolloin saatiin yhdiste 24 (n « 2 tai 3). Proteiineihin liitettiin 2-pyridyyli-ditio (PDP) -ryhmiä antamalla lysiinien e-NH2-ryhmien reagoida N-sukki ini-imidyyli-2-pyridyylidi tiopropionaatin (SPDP) kanssa. Lisättiin yhdisteitä 24 ja 25 puskuriliuok-15 sessa (pH 6,1). Oligosakkaridikomponentin S-asetyyliryhmä lohkaistiin pois lisäämällä hydroksyyliamiinia, minkä seurauksena muodostuu vapaa -SH -ryhmä. Tioli 26 reagoi sitten proteiinissa olevan PDP-ryhmän kanssa, jolloin muodostuu yhdiste 27. Oligosakkaridin liittymisen määrä määri-20 tettiin analysoimalla differentiaali-UV-mittauksen avulla vapautuneen 2-tiopyridonin määrä (Δε343 = 8000 M'1).

Materiaalit

Tetanustoksoidiliuos (10 mg/ml) ja H. Influenzae -ulkokalvoproteiiniliuos (2,5 mg/ml 0,14 M NaCl + 0,1 % 25 Zwittergent 3-14 -liuoksessa). N-sukkiini-imidyyli-S-ase- tyylimerkaptoasetaatti valmistettiin julkaisun Anal. Bio-chem. 132 (1983) 68 - 73 mukaan. SPDP saatiin toiminimeltä Pierce Chemical Company ja Zwittergent 3-14 (N-tetradekyy-li-N,N-dimetyyli-3-ammonio-l-propaanisulfonaatti)toimini-30 meitä Calbiochem. N-etyylimorfOliini ja dimetyyliasetamidi tislattiin fluoridinitrobentseenistä.

Puskuriliuos A: 2 M N-etyylimorfoliini/HCl pH 8,5 Puskuriliuos B: 0,01 M trietyyliammoniumbikarbonaatti pH7,0 35 Puskuriliuos C: 0,1 M natriumfosfaatti + 0,005 M EDTA (di- li 4i 89172 natriumetyleenidiamiinitetra-asetaattidihydraatti) pH 6,1 Puskuriliuos D: 0,1 M natriumfosfaatti pH 7,8 PD-10-pyl-väs: Pharmacian etukäteen pakattu Sephadex G-25 M -kerta-käyttöpylväs (tilavuus 9,1 ml, korkeus 5 cm).

5 G-25-pylväs: kooltaan 100 x 1,0 cm oleva Pharmacian

Sephadex G-25 (erittäin hienojakoinen).

Yhdisteen 24 valmistaminen 19,8 mg (21,4 pmool) yhdisteen 23 (n = 2) trietyy-liammoniummuotoa liuotettiin 0,21 ml:aan puskuriliuosta A, 10 minkä jälkeen lisättiin 25 mg N-sukkiini-imidyyli-S-ase-tyylimerkaptoasetaattia 0,85 ml:ssa dimetyyliasetamidia. Homogeenista reaktioseosta seisotettiin 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten se tehtiin happamaksi lisäämällä etikkahappoa (100 μΐ). Sokeriaine saostettiin 15 lisäämällä 5 ml asetonia. Siirappimainen saostuma sentri-fugoitiin erilleen, liuotettiin pieneen tilavuuteen puskuriliuosta B ja puhdistettiin G-25-pylvään avulla käyttäen tätä puskuriliuosta eluenttina. Sokeria sisältävät fraktiot yhdistettiin ja pakastekuivattiin. Saatu tuote 20 pakastekuivattiin vielä kaksi kertaa vedestä ja liuotettiin sitten 0,50 ml:aan puskuriliuosta C. Saatu tuote sisälsi 11,5 pmoolia yhdistettä 24 (n = 2).

11 mg yhdistettä 23 (n = 3) muutettiin yhdisteeksi 24 (n = 3) täysin samalla tavalla. Tuote sisälsi 4,2 pmoo-25 lia yhdistettä 24 (n = 3).

Yhdisteen 25 valmistaminen PD-10-pylväs tasapainotettiin 25 ml:11a puskuri-liuosta D. Sitten pylvääseen pantiin 1,50 ml (15 mg, suurin piirtein 100 nmoolia, molekyylipaino suurin piirtein 30 150 000) TT-liuosta ja eluoitiin puskuriliuoksella D. 4,5 mg SPDP:tä 0,45 ml:ssa etanolia lisättiin näin saatuun liuokseen, jossa oli TT:tä puskuriliuoksessa D (eluutioti-lavuus 2,5 - 6,0 ml). Sen jälkeen kun oli annettu reagoida 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, reaktioseos lisät-35 tiin G-25-pylvääseen ja eluoitiin puskuriliuoksella C.

42 891 72

Proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja laimennettiin 20 ml:ksi (proteiinikonsentraatio suurin piirtein 5 nmoolia/ml) puskuriliuoksella C, johon oli liuotettu hiukkasen natriumatsidia. 3,0 ml:a tätä liuosta käsiteltiin 5 heliumin alla 1,0 pmoolilla ditiotreitolia. Sen jälkeen kun oli seisotettu 24 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, oli ΔΕ343 = 1 648 (vertailuaine: käsittelemätön PDP-TT). Koska Δι:„ = 8000, on 2-tiopyridonin pitoisuus 206 nmoolia-/ml. Liittymisen määrä oli 41 PDP:tä/TT.

10 15 mg TT:tä käsiteltiin 1,0 pmoolilla SPDP:tä täy sin samalla tavoin. G-25-fraktio laimennettiin 15 ml:ksi. Liittyminen: 4,5 PDP:tä/TT.

Vastaavasti siirrettiin 3,75 mg (suurin piirtein 95 nmoolia, molekyylipaino suurin piirtein 40 000) MP:tä kah-15 teen 3,5 ml:n annokseen puskuriliuosta D. Proteiinia käsiteltiin vastaavasti 14,4 ja 0,4 pmoolilla SPDP:tä.

Sen jälkeen kun oli suoritettu geelisuodatus käyttäen G-25:tä, laimennettiin proteiinifraktio 15 ml:ksi (proteiinikonsentraatio suurin piirtein 5,25 nmoolia/ml). 20 Koska MP on hyvin hydrofobista, lisättiin tässä tapauksessa 0,1 % Zwittergent 3-14:ta puskuriliuoksiin C ja D.

Liittyminen: suurin piirtein 4,9 ja suurin piirtein 1,3 PDP:tä/MP.

Yhdisteen 27 valmistaminen 25 43 pl (1,0 pmoolia) aikaisemmin saatua liuosta, jossa oli yhdistettä 24 (n - 2) puskuriliuoksessa C, lisättiin 3,0 ml:aan (1 mg/ml) 4,5 PDP/TT, 4,5 ml:aan (0,75 mg/ml) 41 PDP/TT, 4,5 ml:aan (0,25 mg/ml) 1,3 PDP/MP ja 4,5 ml:aan 4,9 PDP/MP (G-25-fraktiot puskuriliuoksessa C, 30 katso yllä). Liuoksista poistettiin ilma heliumin avulla. Sitten lisättiin 10 pl 0,2 M hydroksyyliamiinia, pH 6,15. Sen jälkeen kun reaktion oli annettu tapahtua yön ajan ympäristön lämpötilassa, määritettiin muodostuneen 2-tiopyridonin määrä. Odotettu määrä tiopyridonia oli lohjennut 35 pois proteiineista 4,5 PDP/TT, 1,3 PDP/MP ja 4,9 PDP/MP ja

II

43 891 72 siten oli muodostunut vastaava määrä yhdistettä 27. Keskimäärin 20 molekyyliä yhdistettä 26 kytkettiin 41 PDP/TT:-hen. Sen jälkeen kun oli lisätty lisämäärä yhdistettä 24 (n = 2), pysyi sakkaridin liittyrnisyyden määrä muuttumat-5 tomana. Vastaavaan konjugaattiin, joka lyhyemmän reaktio-ajan jälkeen sisälsi 17 molekyyliä dimeeriä, lisättiin 1 pmooli kysteeiniä. Odotettu kokonaismäärä tiopyridonia muodostui sitten nopeasti.

Yhdistettä 24 (n = 3) käytettiin vastaavalla ta-10 valla yhdisteen 27 mukaisten trimeeri-proteiinikonjugaat-tien valmistamiseen.

Kaikkiaan valmistettiin seuraavat konjugaatit:

1,3 ja 4,9 dimeeriä ja trimeeriä/MP

4,5 dimeeriä ja trimeeriä/TT

15 20 dimeeriä/TT (jossa 21 jäljelle jäänyttä PDP-ryhmää) 17 dimeeriä/TT (ilman jäljellä olevia PDP-ryhmiä johtuen jälkikäsittelystä kysteiinillä) 13 trimeeriä/TT (28 jäjellä olevaa PDP-ryhmää) .

Näiden konjugaattien antigeenisyys määritettiin ja 20 sitä verrattiin HIB:n alkuperäisen polysakkaridin (Ca-suo-la), ihmisen polysakkaridirokotteen ja homologisen antigeenin ( = polysakkaridi/MP), joka synnyttää hiiren vasta-aineet, antigeenisyyteen. Testattavat aineet sekoitettiin parittaisessa laimennussarjassa vakiomäärän kanssa anti-25 seerumia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, määritettiin jäljellä olevien vapaiden vasta-aineiden tiitteri suorassa ELISA-inhibitio-testissä. Tulokset olivat seuraavanlaiset: 44 Ö9U2

Konjugaatti Konsentraatio % (pg/ml) Inhibitio 1,3 dlmeeriä/MP 10 45 5 1,3 trimeeriä/MP 10 86 4.9 dimeeriä/MP 10 49 4.9 trimeeriä/MP 10 81 4.5 dimeeriä/TT 10 21 4.5 trimeeriä/TT 10 56 10 20 dimeeriä/TT 10 19 17 dimeeriä/TT 10 20 13 trimeeriä/TT 10 53 alkuperäinen polysakkaridi (ca-suola) 10 91 15 ihmisen polysakkaridirokote 10 90 homologinen antigeeni (tyra- minoitu polysakkaridi 10 12

Kuten tästä selvästi käy ilmi, esiintyy dimeerikon-20 jugaateilla huomattavaa sitoutumista vasta-aineisiin, vaikkakin mainittu sitoutuminen on selvästi vähempää kuin alkuperäisen polysakkaridin sitoutuminen. Trimeerikonju-gaatit kykenevät miltei vetämään vertoja alkuperäiselle polysakkaridille kyvyssä sitoutua vasta-aineisiin.

25 Esimerkki 7

Rokotteen valmistaminen

Trimeeri-oligosakkaridi (yhdiste 23, n = 3) sidottiin tetanustoksoidiin glutaarialdehydillä sekoittamalla 10 - 100-kertainen ylimäärä (molaarisuuden perusteella) 30 trimeeriä tetanustoksoidin kanssa ja lisäämällä glutaa-rialdehydiä 3 x ylimäärin ligandiin verrattuna 1 tunnin väliajoin. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli seisotettu 5 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, lisättiin 20-kertai-nen ylimäärä (ligandiin verrattuna) glysiiniä. Kun oli 35 kulunut 1 tunti ympäristön lämpötilassa, lisättiin li « 89 1 72

NaCNHB3. Kun oli kulunut 5 tuntia ympäristön lämpötilassa reaktioseos dialysoitiin. Lähtien 2,4 mmoolista trimeeriä saatiin 120 pmoolia konjugaattia, jolloin 3 trimeeriä oli liittynyt tetanustoksoidia kohden (3 trimeeriä/TT) ja tri-5 meeri:TT-painosuhde oli 0,1:3.

Hiirille annettiin ruiskeena konjugaattia, jossa oli Haemophilus influenzae tyyppi b -polysakkaridia ja Haemophilus influenzae tyyppi b -ulkokalvoproteiinia kytkettynä adipiinidihydratsidin avulla (PS-MP). Proteiinin 10 ja polysakkaridin painosuhde oli konjugaatissa 1:1. Annos ruisketta kohden oli 5 pg konjugaattia. Ruiskeen antaminen toistettiin 3 ja 5 viikkoa ensimmäisen ruiskeen jälkeen. 6 viikon kuluttua määritettiin IgG-tiitteri ja se säädettiin 100:ksi.

15 Toisille hiirille annettiin ruiskeena 3,12 pg 3 trimeeriä/TT-konjugaattia. Tämän ruiskeen antaminen toistettiin 4 viikon kuluttua ja 6 viikon kuluttua määritettiin IgG-tiitteri, joka oli 36 verrattuna PS-MP-tiitte-riin, joka oli säädetty 100:ksi.

20 3 trimeeriä/TT-konjugaatin voimakas immunogeenisyys voidaan todeta siitä, että suurin piirtein 1/3 IgG-tiitte-ristä, joka saatiin ruiskuttamalla 7,5 pg polysakkaridia, saatiin aikaan käyttämällä ainoastaan 0,25 pg oligosakkaridia. 1/30:11a painosta saatiin aikaan 1/3 vaikutuksesta.

25 Lisäksi trimeerin ruiskuttaminen toistettiin ainoastaan kerran, kun taas polysakkaridin ruiskuttaminen toistettiin kaksi kertaa.

46 891 72

Toimintasuunnitelma 1: — OH [-or’

HO-, RO-, 0 -0X

V>0 — — —OH — =0B-' «O OH Q CoAU LOA»

2 R:H 1 6 R*z Trt . R*= H

3 R:Ali.O-CO- 2 R1=Trt.R2 Bzl Γ R rAli « R,= h .«*=821 ™χϊ·.—TO-W“L·—>r°-W^s Π “ — OBzl i Pori -0Bf

SzO Ote RO OR L0A(| ''s.'' Lor

/V

g 10 R = 0X

1t R:H 12 R,zH;R,sAII

13 r's80M ; R* AU U R1. BOM ; RZzProp 15 R1*- BOM ; R zH

Toimintasuunnitelma 2: rfo o ~~ “U°n1 -08*1 !£ -- γΐ/ —οβζΐ οΙΓΊ -oe*t R O <*** LoProp

16 r’iR^H

«N* .

17 R* > tBuPhi Si- ; R *H

All=allyyli; Trt=trifenyylimetyyli; Bzl=bentsyyli; Bz=bentsoyyli; Ac=asetyyli; BCM=bentsyylioksimetyyli; Prop=propen-1 -yyli; tBuPh2Si- = t-butyylidifenyyli-silyyli.

Ii 47 89172

Toimintasuunnitelma 3:

„ 0 AWV H

N *-o-p-0-W *» Ö i Ö ♦ 17 * ~ f 1 rr :o°L*: s n Es: o o oeo i— o--p-o oao i— o — e

^l· ' I

yv ?

PM? .CM

- Jr 19 R « Pr op

20 R = M

♦1° Z-Gly-NH-(CH2)3-OH» 15 ·-- -- 21 "°VN Ί-0·*' ,β“*,νο ><>;?>«" Λ rr -SS: o K o *-«»r 3 O 080 — O--*-O 0801—0--P-Ο-ΚΗ,Η

' S. " I I

-/V ? <? . pwj.cii wrfl.cn . *. ' L J n • ’: l* ^ PAHs * 1 M--O OH L0-P---0-<CH.)|-N-C-CM,-NMf |No»l - -· i. i n n-» L o J ho »

Ph(2-Cl) =2-kloorifenyyli; Z =bentsyylioksikarbomyyli; Gly=gly-siini ja muilla lyhenteillä on sama merkitys kuin toiminta-suunnitelmissa 1 ja 2.

48 891 72 * «Λ l e*

X

V t uczo .□ Z—X 0) ~ t> X Μ «Λ V=° C^1 I o| J? o

rv I

s I o ? c > a _ h 1-1-' δ 5 5 I . Λ ' ‘51

^ 0=0.— o * "· 4J

ΙΐΛ x n rfS 5Lo & fH OOQO t Λ 7 « 1 1 .] J z-x

*-· I

H *>· § OTv^ S* 7 I - o7^0 f=o » $ >*“? *-* * .51 ^—!—- j 51 t 7 a o < '3 o

Eh ^ |j ^_I C

Λ ο = α.— o ."d ^ «,Ι Ϊ O O O o ^ • r·^ ^—U »oi "ro __ γη( Ui ΓΛ I & 0<z^ °7V-o 5 ov ό _ O I ° ΓΛ Λ^-° r, 0< >o 9 x ϊ i2_I ϊ u o o ;

I * S T

to u 1 I f u "

^ X

<-> «£>)

J J

» 6 l!

Claims (6)

49 £9172

1. Oligosakkaridi, tunnettu siitä, että sillä on seuraava kaava 5 ‘hsl Γ 1 ts -oH. O \-f -0* ° V“f 0>/ L___j— o — ψ---—OOH y—o — fjn--OOH--oy 10 «0 H° _ _ L k L 1 m n q jossa k - 0 tai 1, jos 1=1, 15 k = 0, jos 1=0, 1=0 tai 1, m = 2,3 ... 19 tai 20, sillä ehdolla, että m voi olla 1, jos k, 1 ja n 1 tai jos 1, n ja q = 1, n = 0 tai 1, 20 q = 0 tai 1, jos n = 1, q = 0, jos n = 0, X = vety, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee, suoraan tai epäsuorasti, muodostamaan sidoksen kantajan kanssa, tai ryhmä, joka sisältää hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa 25 päässä, tai pääteryhmä XO- on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä H2N- tai HS-, ja Y = vety, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee, suoraan tai epäsuorasti, muodostamaan sidoksen kantajan kanssa, tai ryhmä, joka sisältää hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa 30 päässä, tai pääteryhmä -OY on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä -NH2 tai -SH, sillä ehdolla, että Y = vety, jos X f vety ja että X = vety, jos Y Φ vety, ja sen suolat.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen oligosakkaridi, 35 tunnettu siitä, että m = 2, 3, 4, 5 tai 6. 50 «9172

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen oligosakkaridi, tunnettu siitä, että X = vety ja Y Φ vety.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen oligosakkaridi, tunnettu siitä, että Y = vety, ja X / 5 vety.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen oligosakkaridi, tunnettu siitä, että reaktiokykyinen ryhmä on ryhmä, joka sisältää yhden seuraavista reaktioky-kyisistä funktionaalisista ryhmistä 10 -NH2, -SH, -8-ShQ , ' ta± "C~R' 0 15 jossa R = OH, -N3, -0-alkyyli(C1_12), -OC6F5, 0 Λ-ι -H, -Br, -Cl tai -0-N I 20 5

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen oligosakkaridin käyttö immunogeenin valmistukseen. Il ‘ si 89172