KR102250099B1 - 스트렙토코커스 뉴모니에 1형에 대한 합성 백신 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니에 1형에 대한 합성 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니에 1형의 협막 폴리사카라이드 내에 포함된 사카라이드 구조의 전합성, 전합성에 의해 수득된 상기 사카라이드 구조를 포함하는 당포합체 및 박테리아 연관, 특히 스트렙토코커스 뉴모니에 연관 질병에 대한 면역화에서의 이러한 당포합체의 용도 및 약제학적 조성물 관한 것이다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니에 1형에 대한 합성 백신{SYNTHETIC VACCINES AGAINST STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TYPE 1}
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니에 1형의 협막 폴리사카라이드(capsular polysaccharide) 내에 포함된 사카라이드 구조의 전합성, 전합성에 의해 수득된 상기 사카라이드 구조를 포함하는 당포합체(glycoconjugates) 및 박테리아 연관 질병에 대한, 특히 스트렙토코커스 뉴모니에 연관 질병에 대한 면역화에서의 이러한 당포합체의 용도 및 약제학적 조성물 관한 것이다.
그램-양성 캡슐화 박테리아 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)(뉴모코커스(pneumococcus): 폐렴구균)는 전세계적인 질병 및 사망의 주요 원인이다. 이들은 상기도에 군집을 이루고 수막염(meningitis), 균혈증(bacteremia) 및 균혈성 폐렴(bacteremic pneumonia) 등과 같은 침습성 폐렴구균 질병(invasive pneumococcal disease) 및 급성 중이염(acute otis media) 및 폐렴을 포함하여 비-침습성 폐렴구균 질병(non-invasive pneumococcal disease)을 야기한다. 이들 질병들은 영유아, 노인 및 전 연령대의 면역저하자(immunocompromised individual)들에서 만연하고 있다. 개발도상국들에서 스트렙토코커스 뉴모니에 연관 질병은 연간으로 120만명의 영유아의 사망을 야기하는 것으로 추산된다.
구조적으로, 박테리아 표면 상에는 원형질막(plasma membrane), 세포벽 및 협막(capsule)의 3가지의 구분된 층들이 관측될 수 있다. 세포벽은 세포벽 폴리사카라이드(C-폴리사카라이드: C-polysaccharide)를 고정하는 펩티도글리칸 골격(peptidoglycan backbone) 및 협막 폴리사카라이드(CPS)로 이루어진다. C-폴리사카라이드는 모든 폐렴구균 혈청형에 공통하는 구조인 반면에 CPS는 90종의 공지의 혈청형 각각에 특이적이고 주요한 발병인자(virulence factor)이다.
90여종의 혈청형들 중에서, 전세계에서 발견된 가장 흔하고 만연하는 혈청형들을 도 1에 나타내었다. 이러한 분포는 또한 지형 및 연령 차이에 기초하여 변화한다. 따라서, 가장 흔하고 만연하는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형의 협막 폴리사카라이드로부터 유래된 면역원성 담체 및 사카라이드 구조를 포함하는 당포합체를 포함하는 백신은 이러한 류의 그램-양성 박테리아에 의해 야기되는 질병에 대하여 높은 확률로 면역화를 제공할 것이다.
현재까지 여러 다가 폐렴구균 백신들이 생산되었다. 상용적으로 획득가능한 23-가 폐렴구균 폴리사카라이드 백신(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine(PPV))은 23가지 혈청형들의 정제된 협막 폴리사카라이드(CPS) 항원을 포함한다. 그러나, 이 백신은 영유아들의 경우에는 효과적이지 않다. 현재 시판된 폐렴구균 공액 백신(PCV: pneumococcal conjugate vaccine)인 PCV-7(Prevnar™)은 각각 디프테리아 CRM197(diphtheria CRM197)에 공액화된 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F의 협막 항원의 사카라이드를 포함하며, 영아들에서 유효하다.
현재 시판된 백신은 북미와 유럽에서 특정 연령의 개인들에 대하여 효과적이다. 이들 백신들의 제조 공정은 복잡하고 고가가 되는 결과를 가져온다. 따라서, 백신은 대부분의 개발도상국들에서는 제공되지 못하고 있다. 본 발명의 목적은 개발도상국의 만연하는 혈청형들의 대부분을 포함하는 제공가능한 합성 당백신(saccharide vaccine)을 제공하는 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니에 1형(SP1)은 가장 만연하는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 중의 하나이다. 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 협막 폴리사카라이드는 반복단위로서: [→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]를 갖는 선형 고분자이다.
스트렙토코커스 뉴모니에 1형 협막 폴리사카라이드의 [→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→] 트리사카라이드 반복단위로부터 유래된 합성 사카라이드 구조가 이미 보고되었다. 그러나, Bundle(Chem. Eur . J. 2010, 16, 3476.)에 의해 개발된 방법은 α-메톡시 사카라이드를 제공하며, 이는 면역원성 담체에의 공액화에 적절하지 않다.
본 발명의 목적은 링커로 관능화된 사카라이드 구조에 대한 개선된 합성 경로를 제공하는 것이며, 상기 사카라이드 구조는 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 협막 폴리사카라이드의 [→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→] 트리사카라이드 반복단위로부터 유래된 것이다. 상기 사카라이드 구조는 링커로 관능화되고, 따라서 면역원성 담체에 공액화되기에 적절한 것이라는 잇점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 목적은 협막 폴리사카라이드 내에 하기 구조들 중 하나를 포함하는 박테리아와 연관된 질병에 대한 면역화를 위한 당포합체 및 상기 당포합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다: α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp; α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp; α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp; α-D-GalAp; α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc; α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc; α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc; α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp. 본 발명에 따른 일반식 (I)의 사카라이드 및/또는 일반식 (II)의 중간체 및/또는 당포합체를 포함하는 약제학적 조성물은 박테리아, 특히 스트렙토코커스 뉴모니에 연관 질병에 대한 면역화에 사용하기 위한 것이며, 상기 질병에는 폐렴, 수막염, 중이염, 균혈증 및 만성 기관지염, 축농증, 관절염 및 결막염의 급성악화가 포함된다.
본 발명의 목적은 독립청구항들의 교시에 의해 해결된다. 본 발명의 다른 이로운 특징들, 관점들 및 상세들이 본 출원의 종속청구항들, 상세한 설명, 도면 및 실시예들로부터 명백해진다.
정의
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "링커(linker)"는 선택적으로 적어도 하나의 중간연결 분자에의 결합에 의하여 사카라이드의 환원성-말단 모노사카라이드(reducing-end monosaccharide)를 면역원성 담체 또는 고체 지지체를 연결할 수 있는 분자 단편(molecular fragment)을 포함한다. 따라서, 그 자체 또는 중간연결 분자와의 조합으로의 링커의 기능은 환원성-말단 모노사카라이드와 면역원성 담체 또는 고체 지지체 사이에 특정한 거리를 구축하고, 유지하고 및/또는 연결하는 것이다. 특히, 링커의 하나의 극단(extremity)은 환원성-말단 모노사카라이드의 아노머 중심(anomeric center)에서 환외 산소 원자(exocyclic oxygen atom)에 연결되고 다른 극단은 황 원자를 경유하여 중간연결 분자와 또는 직접적으로 면역원성 담체 또는 고체 지지체와 연결된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "중간연결 분자(interconnecting molecule)"는 관능기 X 및 관능기 Y를 포함하는 이관능 분자를 의미하며, 여기에서 관능기 X는 링커 A 상의 말단 티올기와 반응할 수 있고 관능기 Y는 면역원성 담체 또는 고체 지지체에 결합할 수 있다. 도 2는 상용적으로 획득가능한 중간연결 분자들의 예들을 나타내고 있으나, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 중간연결 분자들이 여기에 나타낸 예들로 한정되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "보조제(adjuvant)"는 면역 보조제(immunological adjuvant), 즉 백신 조성물 내에 사용되어 항원과 관련하여 연관됨이 없이 백신 내에 포함된 주어진 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 것에 의하여 상기 백신의 효능을 변경시키거나 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 전통적으로 인식된 보조제의 예들에는:
- 칼슘염 및 알루미늄염(또는 이들의 혼합물)을 포함하여 미네랄-함유 조성물. 칼슘염에는 인산칼슘이 포함된다. 알루미늄염에는 임의의 적절한 형태(예를 들면, 겔(gel), 결정(crystalline), 비정질(amorphous) 등)를 취하는 염들과 함께 수산화물, 인산화물, 황산화물이 포함된다. 이들 염들에의 흡착이 바람직하다. 미네랄 함유 조성물은 또한 금속염의 입자로 제형화될 수 있다. 수산화알루미늄 및 인산알루미늄으로 공지된 보조제가 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 보조제로서 일반적으로 사용되는 임의의 "수산화물" 또는 "인산화물" 보조제를 사용할 수 있다. "수산화알루미늄"으로 공지된 보조제는 전형적으로는 알루미늄옥시하이드록사이드 염(aluminium oxyhydroxide salt)이며, 이는 대개는 적어도 부분적으로 결정이다. "인산알루미늄"으로 공지된 보조제는 전형적으로는 또한 소량의 황산화물을 포함하는(즉, 알루미늄하이드록시포스페이트설페이트(aluminium hydroxyphosphate sulfate) 알루미늄하이드록시포스페이트이다. 이들은 침강법으로 수득될 수 있고, 침강 동안의 반응 조건 및 농도가 염 중의 하이드록실에 대한 인산의 치환의 정도에 영향을 준다. 알루미늄하이드록사이드 및 알루미늄포스페이트 둘 다의 혼합물들이 본 발명에 따른 제형에서 사용될 수 있다;
- 광범위한 식물종들의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 배당체(sterol glycoside) 및 트리테르페노이드 배당체(triterpenoid glycoside)의 이종 군(heterologous group)인 사포닌(saponin). 퀼라야(Quillaia saponaria), 몰리나 나무(Molina tree) 껍질에서 수득된 사포닌이 보조제로서 광범위하게 연구되어 왔다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르난타(Smilax ornata)(sarsaprilla), 집소필라 파니큘라타(Gypsophilla paniculata)(brides veil) 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria oficianalis)(soap root)로부터 상용적으로 수득될 수 있다. 사포닌 보조제 제형에는 ISCOMs 등과 같은 액체 제형과 마찬가지로 QS21 등과 같은 정제된 제형들이 포함된다. 사포닌 조성물은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 및 역상-고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 정제되었다. 이들 기술들을 사용하는 특정한 정제된 분획들이 QS7, QS 17, QS 18, QS2 1, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함하여 동정되었다. 사포닌 제형들은 또한 콜레스테롤 등과 같은 스테롤을 포함할 수 있다. 사포닌과 콜레스테롤의 조합을 사용하여 면역자극 복합체(ISCOMs: immunostimulating complexes)라 불리우는 독특한 입자를 형성할 수 있다. ISCOMs에는 일반적으로 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린 등과 같은 인지질이 포함된다. 임의의 공지된 사포닌이 ISCOMs에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM에는 QuilA, QHA 및 QHC 중의 하나 이상이 포함된다;
- 생분해성이고 비-독성인 물질로 형성된 미소구(microparticle)(즉, 직경 100 nm 내지 150 pm, 보다 바람직하게는 직경 200 nm 내지 30 pm 또는 직경 500 nm 내지 10 pm의 입자). 이러한 비-독성 및 생분해성 물질에는 폴리(알파-하이드록시산)(poly(α-hydroxy acid)), 폴리하이드록시부티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리산 무수물(polyanhydride), 폴리카프로락톤(polycaprolactone) 들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다;
- 알파-글리코실세라마이드(α-glycosylceramide), 피토스핑고신-함유 알파-글리코실세라마이드(phytosphingosine-containing α-glycosylceramides), OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데칸트리올](KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1,3,4-octadecanetriol]), CRONY-101, 3"-설포-갈락토실세라마이드(3"-sulfo-galactosylceramide) 등과 같은 CD1d 리간드;
- CpG 모티프를 함유하는 것들(인산 결합에 의해 구아노신 잔기에 연결된 미메틸화 시토신 잔기(unmethylated cytosine residue)를 포함하는 디뉴클레오티드 시퀀스, 또는 CpI 모티프를 함유하는 것들(이노신에 연결된 시토신을 포함하는 디뉴클레오티드 시퀀스), 또는 이중-가닥 RNA, 또는 팔린드롬 시퀀스(palindromic sequence)를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리(dG) 시퀀스를 포함하는 올리고뉴클레오티드 등과 같은 면역자극 올리고뉴클레오티드. 면역자극 올리고뉴클레오티드에는 포스포로티오에이트 변환체(phosphorothioate modifications) 등과 같은 뉴클레오티드 변환체/유사체가 포함될 수 있으며, 이중-가닥 또는 (RNA에 대해서는 제외) 단일-가닥일 수 있다;
- TLR4 길항 E5564(TLR4 antagonist E5564) 등과 같은 인산-함유 비고리형 골격(phosphate-containing acyclic backbone)에 연결된 지질을 포함하는 화합물;
- 오일 에멀젼(예를 들면, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant))
들이 포함된다.
이론적으로, 면역학적 사건들의 폭포에서 특정한 상황을 지원하거나 또는 증폭하여 궁극적으로 보다 확연한 면역 반응을 야기할 수 있는 개개 분자 또는 물질이 보조제로서 정의될 수 있다. 특히, 백신 제형에서의 보조제의 사용을 통하여
- 백신에 대하여 적절하거나 바람직한 면역 반응을 직접적이고 최적화할 수 있고;
- 백신의 점막 전달(mucosal delivery) 즉, 구강 또는 위 또는 폐의 상피 등과 같은 점막표면 및 연관된 림프양조직(lymphoid tissue)과 백신의 접촉이라는 결과를 가져오는 투여를 가능하게 하고;
- 세포-매개 면역 반응을 촉진하고;
- 고도로 정제된 또는 재조합 항원 등과 같이 보다 약한 항원의 면역원성을 향상시키고;
- 보호성 면역을 제공하기 위하여 요구되는 항원의 양 또는 면역화의 빈도를 감소시키고;
- 신생아, 노인 및 면역저하된 백신 수령인(vaccine recipient) 등과 같은 감소되거나 약하된 면역 반응을 수반하는 개체들에서의 백신의 효능을 개선할 수 있다.
비록 이들의 작용 모드에 대하여는 거의 알려지지 않았음에도 불구하고, 현재 보조제는 하기 메카니즘들 중의 하나에 의해 면역 반응을 증강시킨다고 여겨지고 있다:
- 항원의 생물학적 또는 면역학적 반감기를 증가시킴;
- 예를 들면, 항원제시세포(APC)에 의한 항원-보조제 복합체의 섭취 후, 항원이 엔도좀 막(endosomal membranes)을 통해 세포기질(cytosol) 내로 가로지르는 것을 가능하게 하는 것에 의하여 항원제시세포(APC)에 의한 항원 가공 및 제시와 마찬가지로 항원제시세포에의 항원 전달을 개선함;
- 스트레스를 받거나 또는 손상된 세포로부터의 위험 유발 신호(danger inducing signal)를 모방함, 이는 면역 반응을 개시하도록 작용함;
- 면역조절 사이토카인(immunomodulatory cytokine)의 생산을 유도함;
- 면역 반응을 면역계의 특정의 서브셋(subset) 쪽으로 편향시킴; 및
- 면역 유발(antigen challenge)의 신속한 분산을 차단함.
사카라이드는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 TI-2(T 세포 독립성-2(T cell independent-2)) 항원 및 낮은 면역원으로서 공지되어 있다. 따라서, 사카라이드-기반 백신을 생산하기 위하여는, 상기 사카라이드는 면역원성 담체에 공액화되어 당포합체를 제공하고, 이는 사카라이드에 비하여 증가된 면역원성을 제공한다. 이 문맥에서 용어 "면역원성 담체(immunogenic carrier)"는 사카라이드에 공액화되어 사카라이드 그 자체에 비하여 증가된 면역력을 제공하는 당포합체를 형성하는 구조물로 정의된다. 따라서, 면역원성 담체에의 사카라이드의 공액화는 상기 면역원성 담체에 대한 면역 반응을 유발함이 없이 상기 사카라이드에 대한 면역 반응의 자극과 같은 효과를 갖는다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "O-글리코시드 결합(O-glycosidic bond)"은 산소 원자를 통하여 당 단편(sugar fragment) S1, S2, S3에 또는 -O-A-SH에 당 단편 S1, S2 및 S3의 아노머 탄소(즉, 탄소 C-1)를 연결하는 공유결합을 의미한다. 당 단편 S1, S2 및 S3의 아노머 탄소가 -O-A-SH 단편에 연결되는 경우, 산소 원자는 단편 -O-A-SH의 말단 산소 원자이다. 당 단편 S1, S2 및 S3의 아노머 탄소가 다른 당 단편 S1, S2, S3에 연결되는 경우, 산소 원자는 당 단편 S1의 포지션 3의 산소 원자이거나 또는 당 단편 S2의 포지션 3의 산소 원자이거나 또는 당 단편 S3의 포지션 4의 산소 원자이다. 달리 말하면, 본 발명에 따른 사카라이드는 -O-O- 결합 또는 그들의 아노머 또는 C-1 탄소를 경유하여 소러 연결되거나 결합된 당 단편을 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명은 일반식 (I)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00001
여기에서 A는 링커이고;
M, N 및 P는 서로에 대하여 독립적으로 하기 당 단편들 중의 하나를 나타내고:
Figure 112016012345703-pct00002
여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 그리고 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고 n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이다.
각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고 M, N 및 P 각각이 S1, S2 및 S3 중의 하나를 나타내어야 하고, 그리고 당 단편 S1, S2 및 S3의 어느 것도 2회 선택될 수 없다는 것을 의미한다. 따라서, M이 S1인 경우, N은 단지 S2 및 S3로부터 선택될 수 있고 S1을 나타낼 수는 없고, 그리고 M이 S1이고, N이 S2인 경우, P는 S3만 될 수 있다.
용어 "에 동시적으로 연결될 수 없다(cannot be simultaneously connected to)"는 직접적인 연결을 의미한다. "직접적인 연결(direct connection)"은 예를 들어 당 단편 S1이 직접적으로 단편 -O-A-SH에 직접적으로 연결되는 경우, 당 단편 S1은 그의 아노머 탄소 원자를 통해 단편 -O-A-SH에 연결되고 다른 당 단편(예를 들면, S3)을 경유하여 간접적으로 단편 -O-A-SH에 연결되지 않는다. 각 당 단편 S1 또는 S2 또는 S3는 2개의 포지션들을 통하여 연결될 수 있고, 이들은 점선으로 나타내었다. 하나의 포지션은 아노머 탄소 C-1이고, 이는 단편 -O-A-SH의 산소에 또는 다른 당 단편의 점선을 갖는 산소에 연결될 수 있다. 각 당 단편 S1 또는 S2 또는 S3의 점선을 갖는 산소는 단편 -O-A-SH에 연결될 수 없고 단지 수소 원자(말단 당 단편의 경우) 또는 다른 당 단편의 아노머 탄소 C-1에만 연결될 수 있다. 그러나, 당 단편들과 -O-A-SH 단편으로 함께 연결하는 경우, 여기에서 기술된 바와 같은 예외들이 고려되어야만 한다.
따라서, 일반식 (Ia)의 사카라이드 및 일반식 (Ib)의 사카라이드 및 일반식 (Ic)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염이 본 발명의 관점에 속한다:
Figure 112016012345703-pct00003
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n2 = 1이고 n1 = n3 = 0임;
Figure 112016012345703-pct00004
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0임;
Figure 112016012345703-pct00005
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0임.
환언하면, 본 발명은 일반식 (I)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00006
여기에서 A는 링커이고;
P는 S1을 나타내고, N은 S3를 나타내고, M은 S2를 나타내거나;
P는 S3을 나타내고, N은 S2를 나타내고, M은 S1을 나타내거나;
P는 S2를 나타내고, N은 S1을 나타내고, M은 S3를 나타내고;
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n2 = 1이고 n1 = n3 = 0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0이고,
여기에서 S1, S2 및 S3은
Figure 112016012345703-pct00007
Figure 112016012345703-pct00008
Figure 112016012345703-pct00009
와 같이 정의되는 당 단편이고,
당 단편 S1, S2, S3들은 서로 그리고 O-글리코시드 결합을 경유하여 -O-A-SH 단편에 연결된다.
바람직하게는 최대로 n1, n2 및 n3가 0이거나 n1 = n2 = n3 = 1이고, 보다 바람직하게는 n1 = n2 = n3 = 1이다. 또한 당 S1을 포함하는 일반식 (I)의 사카라이드가 바람직하다. 따라서, 일반식 (I)은 하기의 당들을 나타낸다: H-(S1)-(S3)-(S2)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-(S3)-O-A-SH, H-(S3)-(S2)-(S1)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-O-A-SH, H-(S3)-(S2)-O-A-SH, H-(S1)-(S3)-O-A-SH, H-(S1)-O-A-SH, H-(S2)-O-A-SH 및 보다 바람직하게는 H-(S1)-(S3)-(S2)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-(S3)-O-A-SH, H-(S3)(S2)-(S1)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-O-A-SH, H-(S1)-(S3)-O-A-SH 및 H-(S1)-O-A-SH.
특히 바람직한 일반식 (I)의 사카라이드는
Figure 112016012345703-pct00010
Figure 112016012345703-pct00011
Figure 112016012345703-pct00012
이다.
A는 링커로 정의되고 단편 -O-A-SH의 일부이다. 따라서, 링커 A는 산소 원자에 그리고 SH-기에 연결되는 한편으로 산소 원자 및 SH-기는 링커 A의 서로 다른 탄소 원자에 결합된다. -O-C-C-SH와 같이 링커의 적어도 2개의 탄소 원자들이 산소 원자와 SH-기 사이에 존재하는 것이 바람직하다.
링커 A는 바람직하게는 2 내지 20개의 탄소 원자(선택적인 측쇄의 탄소 원자를 포함), 보다 바람직하게는 2 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 16개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 12개 그리고 보다 더 바람직하게는 2 내지 10개의 탄소 원자를 포함한다.
산소(즉, -O-A-SH의 산소)와 SH-기 사이의 가장 짧은 탄소쇄는 바람직하게는 2 내지 14개의 원자, 보다 바람직하게는 2 내지 12개의 원자, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10개의 원자, 보다 더 바람직하게는 2 내지 8개의 원자로 이루어진다. 가장 짧은 쇄(산소와 SH-기 사이에서 가능한 가장 짧은 연결)가 2 내지 5개의 원자로 이루어지는 경우, 이들은 바람직하게는 탄소 원자이다. 가장 짧은 쇄가 4 내지 8개의 원자로 이루어지는 경우, 쇄는 O, N 및 S로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 가장 짧은 쇄가 9 내지 14개의 원자로 이루어지는 경우, 쇄는 O, N 및 S로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 가장 짧은 쇄가 0, 1 또는 2개의 황 원자 및/또는 0, 1 또는 2개의 질소 원자 및/또는 0, 1, 2 또는 3개의 산소 원자를 포함하는 것이 바람직하다. 4개 이상의 산소 원자가 존재하는 경우, 바람직하게는 다른 헤테로원자는 존재하지 않는다.
링커 A 또는 가장 짧은 쇄가 완전히 또는 부분적으로 불소화되는 것이 또한 바람직하다. 링커 A는 4-원(4-membered) 또는 5-원 또는 6-원의 포화된 탄소고리 또는 6-원의 부분적으로 불포화된(그리고 방향족이 아닌) 탄소고리 또는 4-원 또는 5-원 또는 6-원의 포화 산소 헤테로고리 또는 4-원 또는 5-원 또는 6-원의 포화 질소 헤테로고리를 포함할 수 있다.
링커 A는 또한 아미드(-NH-CO-, -CO-NH-) 및/또는 우레아(-NH-CO-NH-) 잔기, 바람직하게는 단지 하나의 아미드 또는 우레아 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 또한 치환기들, 바람직하게는 R1 등과 같은 하나의 치환기 또는 R1 및 R2 등과 같은 2개의 치환기들을 포함할 수 있으며, 이들은 여기에서 정의된 바와 같은 의미를 가지고 바람직하게는 -OCH3, -OC2H5, -CH3, -C2H5, -CH2F, -CF2H, -CF3, -C(O)-NH2, -NHAc, -NH(CH3), -NH(C2H5), -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -NH-C(O)-CH3 및 -C(O)-CH3로부터 선택된다.
링커가 불소화된 경우, 2개 이상의 치환기 -F들이 바람직하다. 산소 헤테로고리가 존재하는 경우, 산소 헤테로고리의 각 탄소 원자는 하이드록시기(-OH)로 치환될 수 있다. 따라서, 5-원의 산소 헤테로고리는 하나 또는 2개의 하이드록시기를 포함할 수 있고 6-원의 산소 헤테로고리는 하나 또는 2개 또는 바람직하게는 3개의 하이드록시기를 포함할 수 있다.
또한 여기에서 -Aa-Ab-Ac-Ad- 또는 -Aa-Ab-Ad-로 정의되는 링커 A는 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 하기 단편들을 포함한다:
-(CH2)o1-, -(CR1R2)o1-, -(CH2)o3-(CH2-CH2-O)o2-(CH2)o1-, -(CH2)o1-S-(CH2)o4-, -(CH2)o1-O-(CH2)o4-, -(CH2)o1-NH-(CH2)o4-, -(CH2)o1-NAc-(CH2)o4-, -(CH2)o1-C(O)-(CH2)o4-, -(CH2)p1-, -(CR7R8)p1-, -(CH2-CH2-O)p1-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-(CH2)p2-, -C(O)-NH-(CH2)p2-, -NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -C(O)-NH-(CH2-CH2-O)p1-C2H4-, -C(O)-NH-(CH2-CH2-O)p1-, -(CH2)q1-, -(CR16R17)q1-, -(CH2)q1-NH-C(O)-, -(CH2)q1-C(O)-NH-,
Figure 112016012345703-pct00013
여기에서 -S-기가 -NH-C(O)-NH-기에 연결되지 않는 것과 같이 상기-언급된 잔기들 중의 2개의 헤테로원자들이 서로 연결되지 않고;
p2, o2, o3가 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이고;
p1, q1, o1, o4가 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이고;
그리고
R1, R2, R7, R8, R16 및 R17은 서로 독립적으로 -H, -OCH3, -OC2H5, -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -F, -CH2F, -CF2H, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHAc, -NH(CH3), -NH(C2H5), -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -NH-C(O)-CH3 및 -C(O)-CH3를 나타낸다.
본 발명에 따른 링커 -A-는
-Aa-Ab-Ac-Ad- 또는 -Aa-Ab-Ad- 또는 -Aa-Ad- 또는 -Aa-를 나타내고;
여기에서
Aa는 -(CH2)o1-, -(CR1R2)o1-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-(CR5R6)o3, -(CR1R2)o3-(CH2-CH2-O)o2-(CR3R4)o1-, -(CH2-CH2-O)o2-(CR1R2)o3-(CR3R4)o1-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-S-(CR5R6)o4-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-O-(CR5R6)o4-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-NH-(CR5R6)o4-, -(CR1R2)o1-S-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-S-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-O-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-O-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-NH-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-NH-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4-, -(CR1R2)o1-C(O)-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-,
Figure 112016012345703-pct00014
Figure 112016012345703-pct00015
를 나타내고,
Ab는 -(CH2)p1-, -(CR7R8)p1-, -(CH2-CH2-O)p1-, -(CR7R8)p1-S-(CR9R10)p2-, -(CR7R8)p1-O-(CR9R10)p2-, -(CR7R8)p1-NH-(CR9R10)p2-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-(CH2)p2-, -C(O)-NH-(CH2)p2-, -NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-, -(CR7R8)p1-(CR9R10)p2-(CH2-CH2-O)p3-, -(CR7R8)p1-(CH2-CH2-O)p2-(CR9R10)p3-, -(CH2-CH2-O)p1-(CR7R8)p2-(CR9R10)p3-, -C(O)-NR15-, -(CR7R8)p1-(CR9R10)p2-(CR11R12)p3, -C(O)-NH-CH(R18)-, -C(O)-NH-CH(R18)-C(O)-NH-CH(R19)-, -C(O)-NH-(CH2-CH2-O)p1-C2H4-,-C(O)-NH(CH2-CH2-O)p1-,
Figure 112016012345703-pct00016
Figure 112016012345703-pct00017
Figure 112016012345703-pct00018
를 나타내고,
Ac는 -(CH2)q1-, -(CR16R17)q1-, -(CH2)q1-NH-C(O)-, -(CH2)q1-C(O)-NH-,
Figure 112016012345703-pct00019
Figure 112016012345703-pct00020
를 나타내고,
Ad는 -(CH2)m1-, -(CR13R14)m1-, -CH2-S-(CH2)m1-, -CH2-O-(CH2)m1-, -CH2-C(O)-(CH2)m1-, -(CH2-CH2-O)m1-(CR13R14)m2-, -(CH2)m1-(CR13R14)m2-, -(CR13R14)m2-(CH2)m1- -(CR13R14)m1-(CH2)m2-, -(CH2)m2-(O-CH2-CH2)m1-,
Figure 112016012345703-pct00021
를 나타내고,
R1 내지 R14, R16 및 R17은 서로 독립적으로 -H, -OCH3, -OC2H5, -OC3H7, -시클로-C3H5, -시클로-C4H7, -시클로-C5H9, -시클로-C6H11, -시클로-C7H13, -시클로-C8H15, -CH2-시클로-C6H11, -C(시클로-C6H11)3, -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C4H9, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C(CH3)3, -C5H11, -CH(CH3)-C3H7, -CH2-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-CH(CH3)2, -C(CH3)2-C2H5, -CH2-C(CH3)3, -CH(C2H5)2, -C2H4-CH(CH3)2, -C6H13, -C3H6-CH(CH3)2, -C2H4-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-C4H9, -CH2-CH(CH3)-C3H7, -CH(CH3)-CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH(CH3)-C2H5, -CH2-CH(CH3)-CH(CH3)2, -CH2-C(CH3)2-C2H5, -C(CH3)2-C3H7, -C(CH3)2-CH(CH3)2, -C2H4-C(CH3)3, -CH(CH3)-C(CH3)3, -C7H15, -C8H17, -C6H4-OCH3, -CH2-CH2-OCH3, -CH2-OCH3, -CH2-C6H4-OCH3, -F, -CH2F, -CF2H, -CF3, -C(O)-NHR15, -C(O)-NHR22, -C(O)-NHR23, -C(O)-NHR24, -C(O)-NHR25, -SCH3, -SC2H5, -NR15R22, -NHR15, -NHR22, -NHR23, -NHR24, -NHR25, -NH-C(O)-R15, -NH-C(O)-R22, -NH-C(O)-R23, -NH-C(O)-R24, -NH-C(O)-R25, -C(O)-R15, -C(O)-R22, -C(O)-R23, -C(O)-R24, -C(O)-R25를 나타낸다.
R15, R22, R23, R24 및 R25는: -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C4H9, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C(CH3)3, -C5H11, -CH(CH3)-C3H7, -CH2-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-CH(CH3)2, -C(CH3)2-C2H5, -CH2-C(CH3)3, -CH(C2H5)2, -C2H4-CH(CH3)2, -C6H13, -C3H6-CH(CH3)2, -C2H4-CH(CH3)-C2H5, -CH(CH3)-C4H9, -CH2-CH(CH3)-C3H7, -CH(CH3)-CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH(CH3)-C2H5, -CH2-CH(CH3)-CH(CH3)2, -CH2-C(CH3)2-C2H5, -C(CH3)2-C3H7, -C(CH3)2-CH(CH3)2, -C2H4-C(CH3)3를 나타내고;
R18, R19, R20 및 R21은 서로 독립적으로 -CH2-OCH3, -CH2-SCH3, -CH2-SeCH3, -C2H4-OCH3, -C2H4-SCH3, -C2H4-SeCH3, -H -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)(OCH3), -CH(CH3)2, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-Ph, -CH2-CH(CH3)(C2H5), -CH2-C(O)-NH2, -C2H4-C(O)-NH2, -CH2-p-C6H4-OCH3를 나타내고;
p2, p3, o2, o3는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이고;
p1, q1, o1, o4, m1, m2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이다.
바람직하게는 링커 A는 잔기 -Aa-를 나타낸다.
-Aa-는 바람직하게는
Figure 112016012345703-pct00022
로부터 선택되는 선형 탄소쇄 또는 포화된 탄소고리이다.
또한 바람직하게는 링커 A는 -(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CH2)o1-Ab-Ad-, -(CH2)o1-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ad- 또는 -(CR1R2)o1-Ad-를 나타내고, 여기에서 Ab, Ac 및 Ad는 여기에서 정의된 바와 같은 의미를 갖고 R1 및 R2는 여기에서 정의된 바와 같은 의미를 갖고 바람직하게는 서로 독립적으로 -H, -OCH3, -OC2H5, -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -F, -CH2F, -CF2H, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHAc, -NH(CH3), -NH(C2H5), -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -NH-C(O)-CH3 및 -C(O)-CH3를 나타낸다.
Ab는 대체로 그리고 특히 앞서 언급된 일반식 -(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CH2)o1-Ab-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ad- 바람직하게는 하기 잔기들: -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-(CH2)p2-, -C(O)-NH-(CH2)p2-, -NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-, -C(O)-NR15-, -C(O)-NH-CH(R18)-, -C(O)-NH-(CH2-CH2-O)p1-C2H4-, -C(O)-NH-(CH2-CH2-O)p1- 중의 하나를 나타내고, 여기에서 치환기 R15 및 R18들은 여기에서 정의된 바와 같은 의미들을 갖고 바람직하게는 -CH3, -C2H5 또는 -C3H7이다.
Ac는 대체로 그리고 특히 앞서 언급된 일반식 -(CH2)o1-Ab-Ac-Ad- 및 -(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad- 바람직하게는 하기 잔기들: -(CH2)q1-,
Figure 112016012345703-pct00023
중의 하나를 나타낸다.
Ad는 대체로 그리고 특히 상기-언급된 일반식 -(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CH2)o1-Ab-Ad-, -(CH2)o1-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-, -(CR1R2)o1-Ab-Ad- 및 -(CR1R2)o1-Ad- 바람직하게는 하기 잔기들:-(CH2)ml-
Figure 112016012345703-pct00024
중의 하나를 나타낸다.
링커 단독 또는 중간연결 분자와의 조합으로의 기능은 사카라이드의 환원성-말단을 면역원성 담체 또는 고체 지지체에 공유적으로 연결하는 것이다. 본 발명에 따른 중간연결 분자는 관능기 X 및 관능기 Y를 포함하는 이관능 분자를 의미하며, 여기에서 관능기 X는 링커 A 상의 말단 티올기와 반응할 수 있고 관능기 Y는 면역원성 담체 또는 고체 지지에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명은 식 (I)의 사카라이드를 의미하며, 여기에서 링커 그 자체 또는 중간연결 분자와의 조합은 환원성-말단 모노사카라이드와 면역원성 담체 또는 고체 지지체 사이에 특정한 거리를 구축하고, 유지하고 및/또는 연결하는 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 구체예에 있어서 링커 -A-는 -Aa-Ab-Ac-Ad-를 나타낸다. 바람직하게는 단편 -Aa-Ab-Ac-Ad-는 하기 단편들 중에서 선택된다:
Figure 112016012345703-pct00025
다른 바람직한 구체예는 일반식 (I)의 사카라이드에 관한 것이고, 여기에서 링커 -A-는 -Aa-Ab-Ad-를 나타낸다. 바람직하게는, 단편 -Aa-Ab-Ad-는
Figure 112016012345703-pct00026
Figure 112016012345703-pct00027
로부터 선택된다.
바람직하게는 링커 A는 -Aa-Ad-를 나타내고, 보다 바람직하게는 단편 -Aa-Ad-는
Figure 112016012345703-pct00028
로부터 선택된다.
바람직하게는, 링커 -A-는 -Aa-를 나타내고, 여기에서 -Aa-는
Figure 112016012345703-pct00029
-(CH2)o1-, -(CR1R2)o1-, -(CR1R2)o3-(CH2-CH2-O)o2-(CR3R4)o1-, -(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-(CR5R6)o3, -(CH2-CH2-O)o2-(CR1R2)o3-(CR3R4)o1-, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-S-(CH2)o4-, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-O-(CH2)o4-, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-NH-(CH2)o4-, -(CR1R2)o1-S-(CR3R4)o4, -(CR1R2)o1-O-(CR3R4)o4, -(CR1R2)o1-NH-(CR3R4)o4 또는 -(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4로부터 선택된다.
바람직한 구체예에 있어서, 치환기 R1 내지 R14, R16 및 R17은 -H, -OCH3, -OC2H5, -CH3, -C2H5, -C3H7, -F, -CH2F, -CF2H, -CF3, -CH(CH3)2, -C4H9, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C(CH3)3, -CH2-CH2-OCH3, -CH2-OCH3, -SCH3, -SC2H5, -NR15R22, -NHR15, -NHR22, -NHR23, -NHR24, -NHR25, -NH-C(O)-R15, -NH-C(O)-R22, -NH-C(O)-R23, -NH-C(O)-R24, -NH-C(O)-R25로부터 선택된다.
-A-가 -Aa-를 나타내는 링커들이 보다 더 바람직하다. 바람직하게는 단편 -Aa-는 -(CH2)o1-, -(CR1R2)o1-, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-(CH2)o3, -(CH2-CH2-O)o2-(CH2)o1-, -(CH2-CH2-O)o2-(CR1R2)-(CH2)o1-, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-S-(CH2)o4, -(CR1R2)o1-S-(CH2)o4, -(CH2)o1-(CR3R4)o2-O-(CH2)o4, -(CR1R2)o1-O-(CH2)o4 또는 -(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4,
Figure 112016012345703-pct00030
의 의미를 갖고;
여기에서
o1 및 o4는 1, 2, 3, 4, 5, 6으로부터 선택되는 정수이고;
o2 및 o3은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6으로부터 선택되는 정수이고;
그리고 치환기 R1 내지 R6은
-H, -OCH3, -OC2H5, -CH3, -C2H5, -C3H7, -F, -CH2F, -CF2H, -CF3, -CH(CH3)2, -C4H9, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -C(CH3)3, -CH2-CH2-OCH3, -CH2-OCH3, -SCH3, -SC2H5, -NHR15, -NHR22, -NHR23, -NHR24, -NHR25, -NH-C(O)-R15, -NH-C(O)-R22, -NH-C(O)-R23, -NH-C(O)-R24, -NH-C(O)-R25로부터 선택된다.
본 발명에 따른 링커 A는 문헌에서 기술된 하기 절차에 따라 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 용이하게 접근될 수 있을 것이다.
게다가, 본 발명은 식 (I)의 합성 사카라이드에 관한 것이며, 여기에서 링커는 선택적으로 적어도 하나의 추가의 중간연결 분자에 결합하는 것에 의하여 티올기를 경유하여 일반식 (I)의 환원성-말단 모노사카라이드를 면역원성 담체 또는 고체 지지체와 연결할 수 있는 분자 단편이다. 특히, 링커의 하나의 극단은 환원성-말단 모노사카라이드의 아노머 중심에서 환외 산소 원자에 연결되고 다른 극단은 황 원자를 경유하여 중간연결 분자와 또는 직접적으로 면역원성 담체 또는 고체 지지체와 연결된다.
본 발명의 화합물은 염기성 및/또는 산성 치환기를 포함하고 이들은 유기 또는 무기 산 또는 염기와 염을 형성할 수 있다. 이러한 산부가염 형성을 위하여 적절한 산의 예들에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말론산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말산, 푸마르산, 숙신산, 아스코르브산, 말레산, 술폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 젖산, 타르타르산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아질산, 하이드록시에탄설폰산, 에틸렌설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프틸설폰산, 설파닐산, 캄포설폰산(camphorsulfonic acid), 차이나산(china acid), 만델산, o-메틸만델산(o-methylmandelic acid), 하이드로겐-벤젠설폰산(hydrogen-benzenesulfonic acid), 피크르산, 아디프산, d-o-톨릴타르타르산(d-o-tolyltartaric acid), 타르트론산, (o, m, p)-톨루산((o, m, p)-toluic acid), 나프틸아민술폰산(naphthylamine sulfonic acid) 및 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 다른 무기 또는 카르복실산이 포함된다. 염은 유리 염기 형태를 충분한 양의 소정의 산과 접촉시켜 통상의 방법으로 염을 형성하도록 하는 것에 의하여 제조된다.
적절한 무기 또는 유기 염기의 예들에는, 예를 들면, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄하이드록사이드(tetraalkylammonium hydroxide), 라이신(lysine) 또는 아르기닌 등이다. 염은 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하는 통상의 방법으로, 예를 들면, 일반식 (I)의 화합물의 용액을 상기 언급된 군에서 선택된 산의 용액으로 처리하는 것에 의하여 제조될 수 있다.
게다가, 본 발명의 화합물이 동시적으로 염기성기 또는 산성기를 포함하는 것 또한 가능하다. 게다가, 이들 염기성기 및 산성기가 서로 근접하게 위치되는 것으로 보여져서 산성기로부터 염기성기로의 분자 내 양성자 전이(intramolecular proton transfer)를 가능하게 하는 것 또한 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 식 (I)의 화합물은 예를 들면 적어도 하나의 -O-기 및 -NH3 +기를 포함하는 쯔비터이온성일 수 있다.
따라서, 본 발명은 일반식 (I)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00031
여기에서 A는 링커이고;
M, N 및 P는 서로 독립적으로 하기 당 단편을 나타내고:
Figure 112016012345703-pct00032
여기에서 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1이 존재하는 경우, 그의 아노머 탄소는 단지 -O-A-SH 또는 당 단편 S3의 포지션 4에서 산소 원자에 연결될 수 있고, 그리고 당 단편 S2가 존재하는 경우, 그의 아노머 탄소는 단지 -O-A-SH 또는 당 단편 S1의 포지션 3에서 산소 원자에 연결되고, 그리고 당 단편 S3이 존재하는 경우, 그의 아노머 탄소는 단지 -O-A-SH 또는 당 단편 S2의 포지션 3에서 산소 원자에 연결될 수 있고;
n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3 중의 적어도 하나는 1이다.
일반식 (I)의 사카라이드에 대하여 여기에서 기술된 바와 동일한 연결들이 또한 여기에서 중간체로 칭하여지는 일반식 (II)의 디설파이드(즉, 이량체성 사카라이드(dimeric saccharides))에도 또한 적용된다.
따라서, 일반식 H-(S1)-(S3)-(S2)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-(S3)-O-A-SH, H-(S3)-(S2)-(S1)-O-A-SH의 트리사카라이드; H-(S1)-(S3)-O-A-SH, H-(S3)-(S2)-O-A-SH, H-(S2)-(S1)-O-A-SH의 디사카라이드 및 H-(S1)-O-A-SH, H-(S3)-O-A-SH의 모노사카라이드가 본 발명의 관점 아래에 포함되며, 여기에서 A는 링커로 정의된다.
본 출원의 바람직한 구체예는 일반식 (I)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00033
여기에서 A는 상기와 같이 정의된 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 당 단편 S2는 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3 중의 적어도 하나는 1이다.
환언하면, 본 발명의 바람직한 사카라이드는 일반식 (I)의 사카라이드이다:
Figure 112016012345703-pct00034
여기에서 A는 상기와 같이 정의되는 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고 그리고
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n1 = 0이고 n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 0이고 n3 = 1이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 일반식 (I)에 따른 화합물은
2-머캅토에탄일 O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실)-(1→4)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)(2-mercaptoethanyl O-(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(α-D-galactopyranosyluronate));
2-머캅토에탄일 O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실)-(1→4)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)(2-mercaptoethanyl O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(α-D-galactopyranosyluronate));
2-머캅토에탄일 O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노시드)(2-mercaptoethanyl O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranoside));
2-머캅토에탄일 O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)(2-mercaptoethanyl O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(α-D-galactopyranosyluronate));
2-머캅토에탄일 O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실)-(1→4)-O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)(2-mercaptoethanyl O-(2-aαetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(α-D-galactopyranosyluronate));
2-머캅토에탄일 O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)(2-mercaptoethanyl O-(α-D-galactopyranosyluronate));
2-머캅토에탄일 O-(α-D-갈락토피라노실우로네이트)-(1→3)-O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노시드)(2-mercaptoethanyl O-(α-D-galactopyranosyluronate)-(1→3)-O-(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranoside));
2-머캅토에탄일 O-(2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노시드)(2-mercaptoethanyl O-(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-α-D-galactopyranoside))
를 포함하거나 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학적 합성
본 발명의 다른 관점은 일반식 (I)의 사카라이드의 합성에 관한 것이고:
Figure 112016012345703-pct00035
여기에서 A는 링커이고;
M, N 및 P는 서로 독립적으로 하기 당 단편들 중의 하나를 나타내고:
Figure 112016012345703-pct00036
여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 그리고 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고 n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이고,
하기의 단계를 포함한다:
A1) 하기 식의 화합물 2를 하기 식의 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 4를 수득하고:
Figure 112016012345703-pct00037
여기에서 P1 내지 P3은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00038
여기에서 P4는 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00039
여기에서 P1 내지 P4 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
화합물 4 상의 보호기 P1 내지 P4의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 5를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00040
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 5가 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 6을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00041
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 4에 대하여 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 7을 제공한다:
Figure 112016012345703-pct00042
여기에서 P5는 보호기이고 P1, P3, P4 및 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
A2) 하기 일반식의 화합물 8을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 9를 제공하고
Figure 112016012345703-pct00043
여기에서 P6 및 P7은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00044
여기에서 P6, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 9 상의 보호기 P4, P6 및 P7의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 10을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00045
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 10이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 11을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00046
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
화합물 9에 대한 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 12를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00047
여기에서 P4, P7 및 A는 상기한 바와 같이 정의됨.
또는
A3) 하기 일반식의 화합물 13을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 14를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00048
여기에서 P8 내지 P11은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00049
여기에서 P4, P8 내지 P11은 상기와 같이 정의됨
그리고
화합물 14의 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 15를 제공한다:
Figure 112016012345703-pct00050
여기에서 P4, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
그리고
B1) 화합물 7을 화합물 13과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 16을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00051
여기에서 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
화합물 16 상의 보호기 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 17을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00052
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 17이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 18을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00053
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 16 상의 보호기 P10의 선택적 제거를 수행하여 하기 일반식의 화합물 19를 제공함:
Figure 112016012345703-pct00054
여기에서 P1, P3 내지 P5, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
B2) 화합물 15를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 20을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00055
여기에서 P4, P6 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨
그리고
아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 20 상의 보호기 P4, P6 내지 P9, P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 21을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00056
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 21이 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 22를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00057
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 20 상의 보호기 P6의 선택적 제거를 수행하여 하기 일반식의 화합물 23을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00058
여기에서 P4, P7 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
B3) 화합물 12를 화합물 2와 반응시켜 하기 일반식의 화합물 24를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00059
여기에서 P1 내지 P4, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨,
그리고
아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 24 상의 보호기 P1 내지 P4 및 P7의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 25를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00060
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 25가 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 26를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00061
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 24 상의 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 27을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00062
여기에서 P12는 보호기이고 그리고 P1, P3, P4, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨.
그리고
C1) 화합물 19를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 28을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00063
여기에서 P1, P3 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
여기에서 하기 화학식의 화합물 29를 수득하기 위하여 보호기 P6이 보호기 P13으로 치환되고:
Figure 112016012345703-pct00064
여기에서 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아세토아미도기 중의 아지도기의 전환 및 보호기 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13의 개열(cleavage)에 의한 화합물 29의 트리사카라이드 디설파이드 30으로의 전환, 여기에서 화합물 30은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00065
그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
및
환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 30의 트리사카라이드 31로의 전환, 여기에서 화합물 31은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00066
그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
C2) 화합물 23을 화합물 2와 반응시켜 하기 일반식의 화합물 32를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00067
여기에서 P1 내지 P4, P7 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아세토아미도기 중의 아지도기의 전환 및 보호기 P1 내지 P4, P7 내지 P9, P11의 개열에 의한 화합물 32의 트리사카라이드 디설파이드 33으로의 전환, 여기에서 화합물 33은 하기의 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00068
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
및
환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 33의 트리사카라이드 34로의 전환, 여기에서 화합물 34는 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00069
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
C3) 화합물 27을 화합물 13과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 35를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00070
여기에서 P1, P3, P4, P7 내지 P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아세토아미도기의 아지도기로의 전환 및 보호기 P1, P3, P4, P7 내지 P11의 개열에 의한 화합물 35의 트리사카라이드 디설파이드 36로의 전환, 여기에서 화합물 36은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00071
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
및
환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 36의 트리사카라이드 37로의 전환, 여기에서 화합물 37은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00072
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "보호기(protecting group)"는 유기 합성에서 통상적으로 사용되는, 바람직하게는 아민, 하이드록실기, 티올, 이민, 카르보닐, 카르복실 또는 다른 관능기 및 특히 바람직하게는 아민, 하이드록실기, 티올 및 카르복실의 보호를 위하여 사용되는 기를 의미한다.
특히, P1, P2, P5, P6, P8 내지 P10, P12 및 P13은 바람직하게는 하이드록실기에 대하여 적절한 보호기들, 보다 바람직하게는 적절한 탈보호 반응의 순서에 의하여 하나에 후속하여 다른 하나를 제거하는 것이 가능한 하이드록실기에 대한 서로 다른 적절한 보호기들이다. 따라서, 하이드록실기에 대한 보호기들, 즉 P1, P2, P5, P6, P8 내지 P10, P12 및 P13은 아세틸, 벤질, 이소프로필리덴, 벤질리덴, 벤조일, p-메톡시벤질, p-메톡시벤질리덴, p-메톡시페닐, p-브로모벤질, p-브로모벤질리덴, p-니트로페닐, 알릴, 아세틸, 이소프로필, p-브로모벤질 디메톡시트리틸, 트리틸, 2-나프틸메틸, 피발로일, 트리이소프로필실릴, 3차-부틸디메틸실릴, 3차-부틸디페닐실릴, 3차-부틸메톡시페닐실릴, 트리에틸실릴, 트리메틸실릴, 2-트리메틸실릴에톡시메틸, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 벤질옥시메틸, 메틸옥시메틸, 3차-부틸옥시메틸, 메톡시에틸옥시메틸, 레불리노일(levulinoyl)로 이루어지거나 이들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, 본 발명의 바람직한 구체예에서 보호기 P1, P5, P8, P9 및 P12는 벤질, P2는 벤질리덴, P6은 레불리노일, P10은 9-플루오레닐메톡시카르보닐 및 P13은 벤질옥시메틸이다.
아민은 대체로 카르바메이트로 보호된다. 따라서, 보호기 P7은 3차-부틸옥시 카르보닐, 9-플루오레닐메톡시 카르보닐, 알릴옥시 카르보닐, 2,2,2-트리클로로에틸옥시 카르보닐, 벤질옥시 카르보닐로 이루어지거나 이들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 P7은 벤질옥시 카르보닐이다.
카르복실산은 대체로 에스테르로 보호된다. 따라서 보호기 P3 및 P11은 메틸, 에틸, 알릴, 이소프로필, 3차-부틸, 페닐, 벤질, p-메톡시벤질로 이루어지거나 이들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 보호기 P3 및 P11은 메틸이다.
하이드록실기에 대한 보호기는 티올에 대한 보호기와 마찬가지로 작용할 수 있다. 따라서, 티올기에 대한 바람직한 보호기는 벤질, 벤조일, 4-O-p-메톡시벤질, 알릴, 아세틸, 메틸설포닐에톡시카르보닐, 레불리닐, 디메톡시트리틸, 2-나프틸메틸, 트리이소프로필실릴, 3차-부틸디메틸실릴, 3차-부틸디페닐실릴, 2-트리메틸실릴에톡시메틸이다. 특히, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 보호기 P4는 벤질기이다.
일반식 (I)의 사카라이드의 합성에서 사용되는 보호기는 영구 보호기(permanent protecting group) 및 임시 보호기(temporary protecting group)들과는 차별화될 수 있다. 영구 보호기는 전합성 동안에 안정하고 합성의 최종 단계에서 효과적으로 제거될 수 있는 보호기이다. 이러한 영구 보호기에는 벤질, 벤질리덴, 벤조에이트, 아세테이트, 알킬 에스테르가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 임시 보호기는 대체로 모노사카라이드 또는 다른 보호기를 포함하여 다른 치환기의 후속 도입을 위하여 합성의 다른 수준들에서 유리 하이드록실기로 효과적으로 제거될 수 있는 직각 보호기(orthogonal protecting group)이다. 보호기의 독창적인 선택은 담체 면역원 또는 고체 지지체에 대한 후속하는 공액화를 위하여 티올기로 관능화된 일반식 (I)의 일련의 사카라이드들에 대한 편리한 접근을 허용한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 일반식 (I)의 사카라이드의 합성에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00073
여기에서 A는 상기와 같이 정의된 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 당 단편 S2는 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
n1, n2 및 n3은 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3 중의 적어도 하나는 1이고
그리고
하기 단계를 포함한다:
A1) 하기 식의 화합물 2를 하기 식의 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 4를 수득하고:
Figure 112016012345703-pct00074
여기에서 P1 내지 P3은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00075
여기에서 P4는 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00076
P1 내지 P4 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
화합물 4 상의 보호기 P1 내지 P4의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 5를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00077
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 5가 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 6을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00078
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 4에 대하여 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 7을 제공한다:
Figure 112016012345703-pct00079
여기에서 P5는 보호기이고 P1, P3, P4 및 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
A2) 하기 일반식의 화합물 8을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 9를 제공하고
Figure 112016012345703-pct00080
여기에서 P6 및 P7은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00081
여기에서 P6, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 9 상의 보호기 P4, P6 및 P7의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 10을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00082
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 10이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 11을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00083
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
A3) 하기 일반식의 화합물 13을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 14를 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00084
여기에서 P8 내지 P11은 보호기를 나타냄,
Figure 112016012345703-pct00085
여기에서 P4, P8 내지 P11은 상기와 같이 정의됨
그리고
화합물 14의 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 15를 제공한다:
Figure 112016012345703-pct00086
여기에서 P4, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
그리고
B1) 화합물 7을 화합물 13과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 16을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00087
여기에서 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
화합물 16 상의 보호기 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 17을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00088
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 17이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 18을 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00089
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
또는
화합물 16 상의 보호기 P10의 선택적 제거를 수행하여 하기 일반식의 화합물 19를 제공함:
Figure 112016012345703-pct00090
여기에서 P1, P3 내지 P5, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
또는
B2) 화합물 15를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 20을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00091
여기에서 P4, P6 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨
그리고
아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 20 상의 보호기 P4, P6 내지 P9, P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 21을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00092
여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 21이 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 22를 제공하거나:
Figure 112016012345703-pct00093
여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
그리고
C1) 화합물 19를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 28을 제공하고:
Figure 112016012345703-pct00094
여기에서 P1, P3 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
여기에서 하기 화학식의 화합물 29를 수득하기 위하여 보호기 P6이 보호기 P13으로 치환되고:
Figure 112016012345703-pct00095
여기에서 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13 및 A는 상기와 같이 정의됨;
그리고
아세토아미도기 중의 아지도기의 전환 및 보호기 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13의 개열에 의한 화합물 29의 트리사카라이드 디설파이드 30으로의 전환, 여기에서 화합물 30은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00096
그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
및
환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 30의 트리사카라이드 31로의 전환, 여기에서 화합물 31은 하기 일반식임:
Figure 112016012345703-pct00097
그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
개별적으로 사카라이드 디설파이드 36, 33, 30, 25, 21, 17, 10 및 5의 사카라이드 37, 34, 31, 26, 22, 18, 11, 및 6으로의 전환은 환원제의 존재 중에서 수행된다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 환원제에는 머캅토에탄올, 디트리오테리톨(ditriotheritol), 트리스(2-카르복시에틸)포스파인, 마그네슘/메탄올, 나트륨/암모니아 후속 염화암모늄/염산이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 사카라이드 디설파이드의 대응하는 사카라이드로의 전환은 트리스(2-카르복시에틸)포스파인으로 수행된다.
화합물 2와 3, 화합물 2와 12, 화합물 5*와 11*, 화합물 19*와 21*, 화합물 2와 23 간의 반응이 (디메틸티오)메틸설포니움 트리플루오로메탄설포네이트(DMTST: (dimethylthio)methylsulfonium trifluoromethanesulfonate) 및 2,4,6-트리-3차-부틸피리딘(TTBPy: 2,4,6-tri-tert -butylpyridine)의 존재 중에서 비극성 용매와 극성 비양성자성 용매의 혼합물 내에서 수행되는 것이 바람직하다. 게다가 3Å 분자체, 4Å 분자체 또는 3Å 산세척 분자체(acid washed molecular sieves) 등과 같은 활성화된 분자체(MS)가 사용될 수 있다. 반응 온도는 -20 ℃ 내지 실온 사이이고, 바람직하게는 온도는 -10 ℃ 내지 실온 사이이고, 보다 바람직하게는 온도는 -5 ℃ 내지 실온 사이이고 가장 바람직하게는 0 ℃ 내지 실온 사이이다. 바람직한 극성 비양성자성 용매는 테트라하이드로퓨란, 디에틸에테르 및 디옥산이다. 바람직한 비극성 용매는 톨루엔, 클로로포름 및 메틸렌클로라이드 등과 같이 할로겐화된 용매이다. 바람직한 비극성 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물은 메틸렌클로라이드/테트라하이드로퓨란, 메틸렌클로라이드/디에틸에테르, 톨루엔/디에틸에테르, 톨루엔/테트라하이드로퓨란이다.
화합물 13과 7, 화합물 8과 3, 화합물 12*와 9*, 화합물 13*과 2*, 화합물 2*와 21*, 화합물 2*와 11*, 화합물 19와 8, 화합물 27과 13 및 화합물 8과 15의 반응이 비극성 용매 또는 비극성 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물 중에서 실릴트리플레이트(silyl triflate)의 존재 중에서 수행되는 것이 또한 바람직하다. 실릴트리플레이트의 예들에는 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트, 3차-부틸 디메틸 트리플루오로메탄설포네이트, 트리이소프로필 트리플루오로메탄설포네이트가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적절한 비극성 용매는 톨루엔, 클로로포름 및 메틸렌클로라이드이다. 바람직한 극성 비양성자성 용매는 테트라하이드로퓨란, 디에틸에테르 및 디옥산이다. 반응 온도는 -20 ℃ 내지 +20 ℃이고, 바람직하게는 온도는 -10 ℃ 내지 +10 ℃이고 보다 바람직하게는 온도는 -5 ℃ 내지 +5 ℃이고 가장 바람직하게는 약 0 ℃이다. 바람직하게는, 3Å 분자체, 4Å 분자체 또는 3Å 산세척 분자체 등과 같은 활성화된 분자체(MS)가 사용될 수 있다.
바람직하게는 화합물 29를 수득하기 위한 화합물 28 상의 보호기 P6의 보호기 P13으로의 치환은 용매 또는 용매의 혼합물 중에서의 화합물 28과 하이드라진 또는 하이드라지늄염의 반응을 포함하는 제1 단계 및 비극성 용매 중에서 제1 단계 후 수득된 생성물의 BnOCH2SCy, DMTST 및 TTBPy로의 처리에 의한 제2 단계의 두 단계로 수행된다. 제1 단계를 위하여는, 하이드라지늄 아세테이트 또는 하이드라지늄 프로피오네이트 등과 같은 약산의 하이드라지늄염이 바람직하다. 이 반응을 위한 적절한 용매는 메틸렌클로라이드 등과 같은 비극성 용매, 피리딘 및 아세트산 등과 같은 극성 용매 및 이들의 혼합물이다. 제2 단계는 바람직하게는 상기 언급된 것과 같은 활성화된 분자체의 존재 중에서 바람직하게는 -10 ℃ 내지 20 ℃ 그리고 가장 바람직하게는 0 ℃ 내지 10 ℃의 온도에서 수행된다. 적절한 비극성 용매는 상기 언급된 것이다. 보호기 P6의 보호기 P13으로의 치환이 영구 보호기의 개열 동안의 부반응을 피하는 데 필수적이라는 것이 밝혀졌다.
화합물 4의 5로, 16의 17로, 13*의 27*로 그리고 20*의 22*로의 전환은 보호기의, 특히 영구 보호기의 개열을 필요로 한다. 상기 보호기의 개열에는 극성 비양성자성 및 극성 양성자성 용매의 혼합물 중에서의 염기로의 처리에 의한 염기-불안정성 보호기(base-labile protecting group)의 제1 개열; 및 극성 양성자성 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물 중에서의 나트륨 및 암모니아에의 노출에 의한 수소화에 민감한 보호기의 제2 개열이 포함된다. 제1 단계를 위한 적절한 양성자성 용매에는 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴 및 N,N-디메틸설폭사이드가 포함되고, 이들은 물 및 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 3차-부탄올을 포함하여 알코올 등과 같은 적절한 양성자성 용매와 혼합된다. 보호기의 염기 개열은 바람직하게는 0 ℃ 내지 실온 사이에 포함되는 실온에서 수행된다. 제1 단계를 수행하기 위한 적절한 염기에는 수산화리튬, 수산화나트륨 및 수산화칼륨이 포함된다. 수소화에 민감한 보호기의 개열은 극성 양성자성 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물 중에서 -78 ℃ 내지 실온 사이에 포함되는 온도에서 나트륨 및 암모니아에의 노출에 의하여 수행된다. 선택적으로, 수소화에 민감한 보호기의 개열 동안 나트륨의 등가물로서 리튬이 사용될 수 있다.
상기 언급된 영구 보호기의 개열에 앞서, 화합물 9의 10으로, 20의 21로, 24의 25로, 29의 30으로, 32의 33으로, 36의 37로 그리고 16*의 18*로의 전환은 아세트아미도기 중의 아지도기의 전환을 포함하며, 이는 바람직하게는 티오아세트산 및 피리딘의 존재 중에서 수행된다. 대안 방법은 아세트아미도기 중의 아지도기의 전환을 먼저 아지도기의 화학선택적 환원(chemoselective reduction) 및 후속하는 아세틸화의 두 단계로 수행하는 것이다. 화학선택적 환원은 암모니아, 아세트산암모늄, 트리페닐포스파인 또는 피리딘의 존재 중에서 Pd/C 상에서의 가수소분해(hydrogenolysis)를 사용하여 수행될 수 있다. 아세틸화는 염기의 존재 중에서 아세틸클로라이드 또는 아세트산 무수물을 사용하여 수행될 수 있다.
사카라이드 I, 5, 6, 10, 11, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 30, 31, 33, 34, 36, 37, 27*, 26*, 24*, 22* 및 18*은 염기성 및/또는 산성 치환기를 포함하고 이들은 유기 또는 무기 산 또는 염기들과 염을 형성할 수 있다. 그러한 산부가염 형성을 위하여 적절한 산의 예들에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말론산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말산, 푸마르산, 숙신산, 아스코르브산, 말레산, 술폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 젖산, 타르타르산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아질산, 하이드록시에탄설폰산, 에틸렌설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프틸설폰산, 설파닐산, 캄포설폰산, 차이나산, 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐-벤젠설폰산, 피크르산, 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산, (o, m, p)-톨루산, 나프틸아민술폰산 및 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 다른 무기 또는 카르복실산이 포함된다. 염은 통상의 방법으로 유리 염기 형태를 충분한 양의 소정의 산과 접촉시켜 염을 생성하도록 하는 것에 의하여 제조된다.
유리 염기 형태는 염을 묽은 수성 수산화나트륨, 탄산칼륨, 암모니아 및 중탄산나트륨 등과 같은 적절한 묽은 염기 수용액으로 처리하는 것에 의해 생성될 수 있다. 유리 염기 형태는 극성 용매 중에서의 용해도 등과 같은 특정한 물리적 특성들에 있어서 그들의 대응하는 염 형태와는 어느 정도 다르나, 염은 그 외에는 본 발명의 목적을 위한 그들의 대응하는 유리 염기 형태와 등가이다.
적절한 무기 또는 유기 염기의 예들은, 예를 들면, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄하이드록사이드, 라이신 또는 아르기닌 등이다. 염은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 통상의 방법으로, 예를 들면, 일반식 (I)의 화합물의 용액을 상기 언급된 군에서 선택된 산의 용액으로의 처리에 의하여 제조될 수 있다.
게다가, 본 발명의 화합물이 동시적으로 염기성기 또는 산성기를 포함하는 것 또한 가능하다. 게다가, 이들 염기성기 및 산성기가 서로 근접하게 위치되는 것으로 보여져서 산성기로부터 염기성기로의 분자 내 양성자 전이를 가능하게 하는 것 또한 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 식 (I)의 화합물은 예를 들면 적어도 하나의 -O-기 및 -NH3 +기를 포함하는 쯔비터이온성일 수 있다.
본 발명은 그의 관점 내에 수화물을 포함하여 화학양론적인 용매화물과 마찬가지로 동결건조 등과 같은 공정에 의해 생산될 수 있는 가변량의 물을 포함하는 화합물을 포함한다.
따라서, 하기 일반식 (I)의 사카라이드의 합성은 추가로 단계 D를 더 포함한다:
D) 일반식 (I)의 화합물의 염을 준비하거나 또는 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 화합물의 염의 동결건조물을 준비하는 단계.
다른 바람직한 구체예에 있어서, 일반식 (II)의 중간체의 합성은 추가로 단계 D를 더 포함한다:
D) 일반식 (II)의 화합물의 염을 준비하거나 또는 일반식 (II)의 화합물 또는 일반식 (II)의 화합물의 염의 동결건조물을 준비하는 단계.
바람직한 구체예에 있어서, 하기 일반식 (I)의 사카라이드
Figure 112016012345703-pct00098
여기에서 A는 상기한 바와 같이 정의된 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 당 단편 S2는 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3 중의 적어도 하나는 1임,
의 합성은 추가로 단계 D)를 포함할 수 있다:
D) 일반식 (I)의 화합물의 염을 준비하거나 또는 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 화합물의 염의 동결건조물을 준비하는 단계.
중간체
본 발명의 다른 관점은 하기 일반식 (II)의 중간체 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00099
여기에서 A는 링커이고;
M, N 및 P는 서로 독립적으로 하기 단편들 중의 하나이고:
Figure 112016012345703-pct00100
여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-S- 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 단편 H-(P)n3-(N)n2-(M)n1-O-A-S- 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이다.
따라서, 하기 일반식 (IIa)의 중간체:
Figure 112016012345703-pct00101
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 =0, 또는 n2 = 1이고 n1 = n3 = 0임; 및
하기 일반식 (IIb)의 중간체:
Figure 112016012345703-pct00102
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 =0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0임; 및
하기 일반식 (IIc)의 중간체:
Figure 112016012345703-pct00103
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0임
및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염이 본 발명의 관점에 속한다.
환언하면, 본 발명은 하기 일반식 (II)의 중간체 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016012345703-pct00104
여기에서 A는 링커이고;
P는 S1을 나타내고, N은 S3를 나타내고, M은 S2를 나타내거나;
또는
P는 S3을 나타내고, N은 S2를 나타내고, M은 S1을 나타내거나;
또는
P는 S2를 나타내고, N은 S1을 나타내고, M은 S3을 나타내고, 그리고
여기에서
n1 = n2 = n3 = 1, 또는 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0, 또는 n2 = n3 = 1이고 n1 = 0, 또는 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0, 또는 n2 = 1이고 n1 = n3 = 0, 또는 n3 = 1이고 n1 = n2 = 0이고;
여기에서
Figure 112016012345703-pct00105
이고 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-S- 단편에 연결됨.
하기 일반식 (II)의 중간체 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염이 바람직하다:
Figure 112016012345703-pct00106
여기에서
A는 상기와 같이 정의되는 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-S- 단편에 연결되고 그리고 당 단편 S2는 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
n1, n2 및 n3은 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 and n3 중의 적어도 하나가 1임.
하기 일반식 (II)의 중간체가 보다 바람직하다:
Figure 112016012345703-pct00107
여기에서 A는 상기와 같이 정의되는 링커이고,
P는 S1을 나타내고,
N은 S3을 나타내고,
M은 S2를 나타내고,
당 단편 S1, S2, S3은 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-S- 단편에 연결되고 그리고
여기에서 n1 = n2 = n3 = 1이거나 또는 여기에서 n1 = n2 = 1이고 n3 = 0이거나 또는 여기에서 n1 = 1이고 n2 = n3 = 0이거나 또는 여기에서 n1 = 0이고 n2 = n3 = 1이거나 또는 여기에서 n1 = n2 = 0이고 n3 = 1임.
중간체: H-(S1)-(S3)-(S2)-O-A-S-S-A-O-(S2)-(S3)-(S1)-H, H-(S2)-(S1)-(S3)-O-A-S-S-A-O-(S3)-(S1)-(S2)-H, H-(S3)-(S2)-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-(S2)-(S3)-H, H-(S1)-(S3)-O-A-S-S-A-O-(S3)-(S1)-H, H-(S3)-(S2)-O-A-S-S-A-O-(S2)-(S3)-H, H-(S2)-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-(S2)-H, H-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-H 및 H-(S3)-O-A-S-S-A-O-(S3)-H들이 보다 더 바람직하다. H-(S1)-(S3)-(S2)-O-A-S-S-A-O-(S2)-(S3)-(S1)-H, H-(S2)-(S1)-(S3)-O-A-S-S-A-O-(S3)-(S1)-(S2)-H, H-(S3)-(S2)-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-(S2)-(S3)-H, H-(S1)-(S3)-O-A-S-S-A-O-(S3)-(S1)-H, H-(S2)-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-(S2)-H 및 H-(S1)-O-A-S-S-A-O-(S1)-H 등과 같이 당 단편 S1을 포함하는 일반식 (II)의 중간체가 특히 바람직하다.
당포합체
본 발명의 다른 관점은 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드의 면역원성 담체와의 반응에 의해 수득되는 당포합체에 관한 것이다. 상기 당포합체는 박테리아 연관 질병에 대한 면역화를 위한 백신으로서 유효한 것으로 입증되었다. 따라서, 면역원성 담체에 공유적으로 연결된 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드를 포함하는 당포합체는 인간 및/또는 동물 숙주에서의 보호성 면역 반응을 야기하기는 데 유용하며 그에 따라 박테리아 연관 질병의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
사카라이드는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 TI-2(T 세포 독립성-2) 항원 및 낮은 면역원으로서 공지되어 있다. TI-2 항원은 표면-노출 면역글로블린 수용기(surface exposed immunoglobulin receptor)의 가교를 통하여 단지 성숙 B 세포에 의해서만 인식되는 항원이다. T 세포의 도움 없이는, 면역 기억이 생성되지 않고 IgM으로부터 다른 IgG 서브클래스(subclass)로의 종류변환(isotype switching)이나 B 세포 친화성 성숙(B cells affinity maturation)도 일어나지 않는다. 게다가, 인간 당지질 및 당단백질과의 구조적 상동성(structural homology)으로 인하여 사카라이드는 인간에 있어서 낮은 면역원으로 공지되어 있다. 이들의 낮은 면역원성 특성으로 인하여, 사카라이드는 잠재적인 백신의 생산을 위하여 필수적인 특징들인 B 세포에 의한 항체 생산과 마찬가지로 기억 세포의 형성 둘 다를 생산하는 데에 대한 낮은 능력을 나타낸다.
따라서, 잠재적인 사카라이드-기반 백신을 생산하기 위해서는, 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드가 면역원성 담체에 공액화되어 당포합체를 제공하며, 이는 사카라이드에 비하여 증가된 면역원성을 제공한다.
이 문맥에서 용어 "면역원성 담체"는 사카라이드에 공액화되어 사카라이드 그 자체에 비하여 증가된 면역력을 제공하는 당포합체를 형성하는 구조물로 정의된다. 따라서, 면역원성 담체에의 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드의 공액화는 상기 면역원성 담체에 대한 면역 반응을 유발함이 없이 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드에 대한 면역 반응의 자극과 같은 효과를 갖는다.
바람직한 면역원성 담체는 면역조절 특성을 갖는 담체 단백질(carrier protein) 또는 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는, 담체 단백질은 디프테리아 변독소(diphtheria toxoid), 돌연변이된 디프테리아 변독소, 변성된 디프테리아 변독소, 돌연변이되고 변성된 디프테리아 변독소, 파상풍 변독소(tetanus toxoid), 변성된 파상풍 변독소, 돌연변이된 파상풍 변독소, 외막 단백질(OMP: outer membrane protein), 소 혈청 알부민(BSA), 키홀림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanine) 또는 콜레라 변독소(CT: cholera toxoid)를 포함하거나 이들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질이다. 여기에서 사용된 바와 같은 용어 "변독소(toxoid)"는 화학적(포르말린) 또는 열 처리에 의하여 그 독성이 비활성화되거나 억제된 반면에 다른 특성들, 전형적으로는 면역원성이 유지된 박테리아 독소(대개는 외독소(exotoxin))를 의미한다. 여기에서 사용된 바와 같은 돌연변이된 변독소는 독성이 덜해지도록 변경되거나 심지어 야생형 아미노산 시퀀스를 변경하는 것에 의해 비-독성이 되도록 한 재조합 박테리아 독소이다. 이러한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환일 수 있다. 이러한 돌연변이된 변독소는 그의 표면에 중간연결 분자의 관능기 Y와 반응하여 변성된 변독소를 제공하는 관능성을 제공한다. 상기 관능성은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지되어 있으며, 환원제의 존재 중에서 활성화된 에스테르, 이소시아네이트기 또는 알데히드와 반응할 수 있는 라이신 잔기의 1차 아미노 관능성, 카르보디이미드에 의해 활성화될 수 있는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기의 카르복실레이트 관능성 또는 시스테인 잔기의 티올 관능성이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다. 활성화된 에스테르에는 N-(Y-말레이미도부티릴옥시) 설포숙신이미드 에스테르(sulfo-GMBS: N-(Y-maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide ester), 숙신이미딜 (4-이오도아세틸) 아미노벤조에이트(sulfo-SIAB: succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate), 숙신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP: succinimidyl-3-(bromoacetamido)propionate), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG: disuccinimidyl glutarat), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시숙신이미드(PEG-4-SPDP: 2-pyridyldithiol-tetraoxatetradecane-N-hydroxysuccinimide)이 포함된다(도 2를 참조하시오). 담체 단백질 상의 시스테인 잔기는 추가로 적절한 중간연결 분자와 반응하여 그들 표면 상에 중간연결 분자의 관능기 X를 갖는 변성된 담체 단백질을 제공할 수 있는 대응하는 디하이드로알라닌으로 변환될 수 있다. 이 경우에 있어서 중간연결 분자 상의 관능기 Y는 티올일 수 있고, 관능기 X는 알켄일 수 있다. 이러한 중간연결 분자는 알릴머캅탄을 포함한다. 이러한 중간연결 분자와의 반응 후, 담체 단백질은 중간연결 분자의 비닐기 X를 제공하는 변성된 담체 단백질로 전환되며, 이는 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드와 반응하기에 적절하다.
일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 사카라이드 특히 사카라이드 37, 34, 31, 26, 22, 18, 11 및 6이 관능성으로서 라이신 잔기의 1차 아민 관능성을 제공하는 비-독성의 돌연변이된 디프테리아 독소 CRM197에 공액화되는 것이 특히 바람직하다.
CRM197 같은 야생형 디프테리아 독소는 디설파이드 브릿지로 연결되고 글루탐산의 글리신으로의 단일 아미노산 치환을 갖는 2개의 서브유닛으로 이루어지는 535개 아미노산(58kD)의 단일 폴리펩티드쇄이다. 이는 프리베나(Prevnar) 등과 같이 질병에 대한 다수의 승인된 공액화 백신에서 담체 단백질로서 활용되었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 담체 단백질은 그의 표면에 중간연결 분자의 관능기 Y와 반응할 수 있는 라이신 잔기의 1차 아미노 관능성을 제공하여 그들의 표면에 일반식 (I)의 화합물의 링커의 말단 티올기와 반응할 수 있는 중간연결 분자의 상기 관능기 X를 갖는 변성된 담체 단백질을 제공할 수 있다. 중간연결 분자의 상기 관능기 X는 말레이미드; α-이오도아세틸; α-브로모아세틸; N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS), 2-피리딜디티올, 티올 및 비닐을 포함하거나 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다(도 3을 참조하시오).
바람직하게는, 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드가 말레이미드로 변성된 비-독성의 돌연변이된 디프테리아 독소 CRM197에 공액화된다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드가 비닐로 변성된 비-독성의 돌연변이된 디프테리아 독소 CRM197에 공액화된다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드가 α-브로모아세트아미드로 변성된 비-독성의 돌연변이된 디프테리아 독소 CRM197에 공액화된다.
다른 구체예에 있어서, 상기 면역원성 담체는 바람직하게는 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드, 보다 바람직하게는 (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노일아미노옥타데칸-3,4-디올((2S,3S,4R)-1-(α-D-galactopyranosyl)-2-hexacosanoylaminooctadecane-3,4-diol)이다. 용어 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드는, 여기에서 사용된 바와 같이, 표적 항원에 대하여 면역계의 반응을 자극할 수 있으나 그 자체가 상기 정의된 바와 같은 면역을 부여하지는 않는 적절한 글리코스핑고리피드를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같은 글리코스핑고리피드는 스핑고리피드에 α-연결된 탄수화물 성분(carbohydrate moiety)을 포함하는 화합물이다. 바람직하게는, 탄수화물 성분은 헥소피라노스이고 가장 바람직하게는 α-D-갈락토피라노스이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는, 스핑고리피드는 아미드 결합을 경유하여 지방산에 연결되는 C18 아미노 알코올(C18 amino alcohol)을 포함하는 일군의 지질이다. C18 아미노 알코올은 바람직하게는 하이드록시기로 1-, 2- 또는 다-치환된다. 특히 바람직하게는, C18 아미노 알코올은 피토스핑고신이다. 지방산은 바람직하가는 16 내지 28 보다 바람직하게는 18 내지 26개의 범위의 탄소의 수의 포화 알킬쇄를 갖는 모노카르복실산이다. 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드에는 생체 내에서 자연살해(NK) 활성 및 자연살해 T(NKT) 세포에 의한 사이토카인 생성을 자극하고 잠재적인 항암 활성을 나타낼 수 있는 (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노일아미노옥타데칸-3,4-디올이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다(Proc . Natl Acad . Sci . USA, 1998, 95, 5690).
일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드의 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드와의 공액화물(cojugate)은 열에 안정한 것이라는 잇점을 갖는다. 공액에 적절하기 위해서는, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드 상에 관능성이 도입된다. 상기 관능성은 직접적으로 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드의 링커의 말단 티올기와 반응하여 일반식 (I), (Ia), (Ib) 또는 (Ic)의 사카라이드의 당포합체를 제공하거나 또는 중간연결 분자의 관능기 Y와 반응하여 면역조절 특성을 갖는 변성된 당포합체를 제공하는 경향이 있다.
바람직하게는, 상기 관능성은 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드의 탄수화물 성분의 C6에 도입된다. 따라서, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드는 티올기, 활성화된 에스테르, 이소시아네이트기, 알데히드, 비닐, 아미노기 및 아지도기와 반응하는 경향이 있는 관능성으로 관능화되어 직접적으로 일반식 (I)의 사카라이드의 당포합체 또는 중간연결 분자의 관능기 X를 제공하는 면역조절 특성을 갖는 변성된 글리코스핑고리피드를 제공한다.
바람직하게는, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드의 탄수화물 성분의 C6에 도입되는 관능성은 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 비닐, 말레이미드, α-이오도아세틸, α-브로모아세틸, N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS), 2-피리딜디티올을 포함하거나 이들을 포함하는 군으로부터 선택된다.
중간연결 분자의 상기 관능기 X는 말레이미드, α-이오도아세틸, α-브로모아세틸, N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS), 2-피리딘디티올, 티올 및 비닐을 포함하거나 이들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "중간연결 분자"는 관능기 X 및 관능기 Y를 포함하는 이관능 분자를 의미하며, 여기에서 관능기 X는 링커 A 상의 말단 티올기와 반응할 수 있고 관능기 Y는 면역원성 담체 또는 고체 지지체에 결합할 수 있다.
일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체가 동물에서 면역 반응을 유발하기에 적절하고, 따라서 그들의 협막 폴리사카라이드 내에
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
로부터 선택되는 사카라이드 구조를 포함하는 박테리아와 연관되는 질병에 대한 면역화에서 백신으로서 유용하다.
바람직하게는, 협막 폴리사카라이드 내에 상기 언급된 사카라이드 구조 중의 하나를 포함하는 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니에 1형이다.
바람직한 구체예에 있어서, 일반식 (I), (Ia), (Ib) 및 (Ic)를 면역원성 담체와 반응시켜 수득되는 당포합체는 박테리아와 연관된 질병에 대한 면역화를 위한 백신으로서 유용하며, 여기에서 상기 질병에는 폐렴, 수막염, 중이염, 균혈증 및 만성 기관지염, 축농증, 관절염 및 결막염의 급성악화가 포함된다.
본 발명의 하나의 관점은 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 동해방지제(cryoprotectant), 동결건조보호제(lyoprotectant), 부형제 및/또는 희석제와 함께 적어도 하나의 일반식 (I)의 임의의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체 및/또는 일반식 (I)의 사카라이드 및/또는 일반식 (II)의 중간체를 포함하는 약제학적 조성물, 특히 백신에 관한 것이다.
상기 백신은 현탁액의 형태로 제조될 수 있거나 동결건조될 수 있다. 현탁액 형태는 동결되어 저장될 수 있다. 동결건조된 형태에 있어서, 하나 이상의 안정화제를 추가하는 것이 바람직하다. 선택적으로 하나 이상의 보조제가 마찬가지로 첨가될 수 있다. 임의의 통상적인 안정화제 및 보조제가 본 발명에 따른 백신 내에 포함될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "보조제"는 면역 보조제, 즉 백신 조성물 내에 사용되어 항원적으로 연관됨이 없이 백신 내에 포함된 주어진 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 것에 의하여 상기 백신의 효능을 변경시키거나 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 전통적으로 인식된 보조제의 예들에는 에멀젼(예를 들면, 프로인트 보조제), 사포닌, 알루미늄 또는 칼슘염(예를 들면, 명반(alum)), 비-독성 차단 폴리머 계면활성제(non-ionic block polymer surfactants) 및 많은 다른 것들이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다.
백신화는 임의의 연령에서 수행될 수 있다. 백신은 피하로, 분무에 의해, 주사에 의해, 경구적으로, 안내로(intraocularly), 기도내로(trachea) 또는 경비로(nasally) 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 담체, 부형제, 용제 및/또는 희석제와 함께 활성성분으로서 백신을 포함하는 약제학적 제형 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, 약제학적 조성물은 동결건조물 또는 액체 완충용액의 형태로 제형화된다.
백신은 또한 실질적으로 비독성인 약제학적으로 수용가능한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제를 선택적으로 사용하여 그의 약제학적으로 수용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 공지된 방법으로 적절한 용량 수준(dosage level)으로 통상적인 고체 또는 액체 담체 또는 희석제 및 통상적인 약제학적으로-제조된 보조제로 제조된다. 바람직한 제제 및 제형은 경구 투여에 적절한 투여가능한 형태이다. 이들 투여가능한 형태들에는, 예를 들면, 알약, 정제, 필름코팅 정제, 코팅 정제, 캡슐, 분말 및 좌약이 포함된다. 경구적으로 투여가능한 형태 이외의 형태가 또한 가능하다. 본 발명의 백신은 흡입; 주사(정맥내, 복강내, 근육내, 피하); 상피 또는 점막피부 라이닝(mucocutaneous lining)(구강 점막, 직장 및 질의 상피 라이닝, 비인두 점막(nasopharyngial mucosa), 장 점막)을 통한 흡수에 의한; 경구로, 직장으로, 경피로(transdermally), 국소로(topically), 피내로(intradermally), 위내로(intragastrically), 피부내로(intracutaneously), 질내로(intravaginally), 도관내로(intravasally), 코내로(intranasally), 구강내로(intrabuccally), 경피로(percutaneously), 설하로(sublingually) 또는 약제학적 기술분야 내에서 획득가능한 임의의 다른 수단을 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 적절한 수단으로 투여될 수 있다.
활성성분으로서 일반식 (I)의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의하여 수득되는 당포합체 또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염을 포함하는 본 발명에 따른 백신은 전형적으로 의도하는 투여의 형태, 즉 경구용 정제, 캡슐(고체-충진된, 반-고체-충진된 또는 액체 충진된), 경구용 겔, 엘릭서(elixir), 분산가능한 과립, 시럽, 현탁액 등의 구성을 위한 분말에 따라 그리고 통상적인 약제학적 관행과 일치하여 적절하게 선택되는 적절한 담체 물질과의 혼합물로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 캡슐의 형태로의 경구 투여를 위해서는, 활성성분이 락토오스, 녹말, 슈크로스, 셀룰로오스, 마그네슘스테아레이트, 디칼슘포스페이트, 칼슘설페이트, 활석, 만니톨, 에틸알코올(액체 형태) 등과 같은 임의의 경구용 비독성의 약제학적으로 수용가능한 비활성 담체와 결합될 수 있다. 게다가, 소망하거나 필요한 경우, 적절한 결합제, 활제(lubricant), 붕해제(disintegrating agent) 및 착색제가 또한 혼합물 내에 포함될 수 있다.
적절한 결합제에는 녹말, 젤라틴, 천연 당(natural sugar), 옥수수 감미제(corn sweetener), 아카시아 등과 같은 천연 및 합성 검(gum), 알긴산 나트륨, 카르복시메틸-셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜 및 왁스가 포함된다. 활제들 중에서 붕산, 소듐벤조에이트, 소듐아세테이트, 염화나트륨 등이 이들 투여형태(dosage form)들에 사용하기 위하여 언급될 수 있다. 붕해제에는 녹말, 메틸셀룰로오스, 구아검 등이 포함된다. 감미제 및 향미제 및 보존제가 또한 적절한 경우에 포함될 수 있다. 상기 언급된 용어들 중의 일부, 즉 붕해제, 희석제, 활제, 결합제 등은 이하에서 보다 상세하게 설명된다.
게다가, 본 발명의 백신은 지연 방출 형태로 제형화되어 치료 효과를 최적화하도록 하나 이상의 성분 또는 활성성분의 속도 조절 방출을 제공할 수 있다. 지연 방출을 위한 적절한 투여형태에는 활성성분으로 함침된 다양한 붕해 속도 또는 제어 방출 중합체 매트릭스(polymeric matrice)의 층들을 포함하고 정제 형태로 성형된 다층 정제(layered tablet) 또는 그와 같이 함침되거나 캡슐화된 다공성 중합체 매트릭스를 포함하는 캡슐이 포함된다.
액체 형태 제제에는 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 예시로서 비경구 주사를 위한 물 또는 물-프로필렌글리콜 용액 또는 경구용 용액, 현탁액 및 에멀젼을 위한 감미제 및 유백화제(opacifier)의 첨가가 언급될 수 있다. 액체 형태 제제에는 또한 코내(intranasal) 투여를 위한 용액이 포함될 수 있다.
흡입을 위한 에어로졸 제제에는 용액 및 분말 형태로의 고체가 포함될 수 있으며, 이들은 예를 들면 질소와 같은 비활성 압축가스 등과 같은 약제학적으로 수용가능한 담체와 조합될 수 있다.
좌약을 제조하기 위해서는, 코코아버터 등과 같은 지방산 글리세리드의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 먼저 용융시키고, 교반 또는 유사한 혼합에 의하여 그 안에 활성성분을 균질하게 분산시킨다. 계속해서 용융된 균질한 혼합물을 통상의 규격의 주형 내로 부어넣고 냉각시켜 고화시킨다.
사용 직전에 경구 또는 비경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 전환되도록 의도되는 고체 형태 제제가 또한 포함된다. 이러한 액체 형태에는 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다.
본 발명의 백신은 또한 경피적으로 전달될 수 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고 이러한 목적으로 당해 기술분야에서 통상적인 매트릭스 또는 저장기 형태의 경피 패치(transdermal patch) 내에 포함될 수 있다.
용어 캡슐은 활성성분을 포함하는 조성물을 고정시키거나 내포하기 위하여 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올 또는 변성된 젤라틴 또는 녹말로 만들어진 특별한 용기 또는 밀봉체(enclosure)를 의미한다. 경질 캡슐(hard shell capsule)은 전형적으로 상대적으로 높은 겔 강도(gel strength)의 뼈 및 돼지껍질 젤라틴의 혼합물로 만들어진다. 캡슐 자체는 소량의 염료, 유백화제(opaquing agent), 가소제 및 보존제를 포함할 수 있다.
정제는 적절한 희석제와 함께 활성성분을 포함하는 압축되거나 주조된 고체 투여 형태를 의미한다. 정제는 혼합물 또는 습식 과립화, 건식 과립화에 의해 수득되는 과립의 압축(compression)에 의하거나 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 압밀(compaction)에 의해서 제조될 수 있다.
경구용 겔(oral gel)은 친수성 반-고체 매트릭스 내에 분산되거나 또는 가용화된 활성성분을 의미한다.
구성을 위한 분말은 활성성분 및 물 또는 주스 내에 현탁될 수 있는 적절한 희석제를 포함하는 분말 혼합물을 의미한다.
적절한 희석제는 대개는 조성물 또는 투여 형태의 대부분을 구성하는 물질이다. 적절한 희석제에는 락토오스, 슈크로스, 만니톨 및 소르비톨 등과 같은 당, 밀로부터 파생되는 녹말, 콘 라이스(corn rice) 및 감자 및 미정질 셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스가 포함된다. 조성물 중의 희석제의 양은 총 조성물의 약 5 내지 약 95중량%, 바람직하게는 약 25 내지 약 75%, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 60중량% 그리고 가장 바람직하게는 약 40 내지 50중량%의 범위가 될 수 있다.
용어 붕해제는 조성물에 첨가되어 이를 와해시키고(붕해) 약물(medicament)을 방출하는 것을 돕는 물질을 의미한다. 적절한 붕해제에는 녹말, 소듐카르복시메틸 녹말(sodium carboxymethyl starch) 등과 같은 "냉수 가용성(cold water soluble)" 변성 녹말, 로커스트콩, 카라야(karaya), 구아, 트라가칸트 및 아가 등과 같은 천연 및 합성 검, 메틸셀룰로오스 및 소듐카르복시메틸셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 미정질 셀룰로오스 및 소듐크로스카라멜로스(sodium croscarmellose) 등과 같은 가교화된 미정질 셀룰로오스, 알긴산 및 알긴산나트륨 등과 같은 알긴산염, 벤토나이트 등과 같은 클레이(clay) 및 발포성 혼합물(effervescent mixture)이 포함된다. 조성물 중의 붕해제의 양은 조성물의 약 1 내지 약 40중량%, 바람직하게는 조성물의 2 내지 약 30중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 약 3 내지 20중량%, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 10중량%의 범위가 될 수 있다.
결합제는 분말을 서로 결합 또는 "결착(glue)"하여 과립을 형성하는 것에 의해 이들을 응집시켜 제형 내에서 "접착제(adhesive)"로서 기능하는 물질을 특징으로 한다. 결합제는 희석제 또는 증량제(bulking agent) 중에서 이미 획득가능한 응집강도를 추가한다. 적절한 결합제에는
슈크로스, 밀로부터 파생되는 녹말, 콘 라이스 및 감자 등과 같은 당; 아카시아, 젤라틴 및 트라가칸트 등과 같은 천연 검; 알긴산, 알긴산나트륨 및 암모늄칼슘알기네이트(ammonium calcium alginate) 등과 같은 해초의 유도체; 메틸셀룰로오스 및 소듐카르복시메틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 물질; 폴리비닐피롤리돈; 및 마그네슘알루미늄실리케이트 등과 같은 무기물이 포함된다. 조성물 중의 결합제의 양은 조성물의 약 1 내지 30중량%, 바람직하게는 조성물의 약 2 내지 약 20중량%, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 10중량%, 보다 더 바람직하게는 3 내지 약 6중량%의 범위가 될 수 있다.
활제는 투여 형태에 첨가되어 마찰 또는 마모를 감소시키는 것에 의해 정제, 과립 등이 압축된 후에 주형 또는 다이(die)로부터 방출되는 것을 가능하게 하는 물질을 의미한다. 적절한 활제에는 마그네슘스테아레이트, 칼슘스테아레이트 또는 포타슘스테아레이트 등과 같은 금속스테아레이트(metallic stearate); 스테아린산; 고융점 왁스; 및 염화나트륨, 소듐벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐올레이트(sodium oleate), 폴리에틸렌글리콜 및 D, L-류신(D, L-leucine)이 포함된다. 활제가 과립의 표면 상에 그리고 과립과 타정기(tablet press)의 부품들 사이에 존재하여야 하기 때문에 활제는 대개 압축 이전의 가장 마지막 단계에서 추가된다. 조성물 중의 활제의 양은 조성물의 약 0.05 내지 약 15중량%, 바람직하게는 조성물의 0.2 내지 약 5중량%, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 3%, 가장 바람직하게는 조성물의 약 0.3 내지 약 1.5중량%의 범위가 될 수 있다.
활주제(glident)는 고결(caking)을 방지하고 과립의 흐름 특성을 개선하여 흐름이 완만하고 균일하게 되도록 하는 물질이다. 적절한 활주제에는 이산화규소 및 활석이 포함된다. 조성물 중의 활주제의 양은 조성물의 약 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 총 조성물의 0.1 내지 약 7중량%, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 5중량%, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2중량%의 범위가 될 수 있다.
착색제는 조성물 또는 투여 형태에 발색을 제공하는 부형제이다. 이러한 부형제에는 식품 등급 염료 및 클레이 또는 산화알루미늄 등과 같은 적절한 흡착제 상에 흡수된 식품 등급 염료가 포함될 수 있다. 착색제의 양은 조성물의 약 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 6중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 약 0.1 내지 약 4중량%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1% 내에서 변할 수 있다.
본 발명의 백신의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA에서 찾을 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 당포합체 및/또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염을 포함하는 적절한 백신 조성물은 적절한 액체 약제학적 담체 중에서 일반식 (I)의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체의 용액 또는 정제, 알약, 필름코팅정, 코팅정, 드라제(dragee), 캡슐, 분말 및 디파짓(deposit), 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액, 에멀젼 등 임의의 다른 제형일 수 있다.
일반식 (I)의 임의의 사카라이드와 면역원성 담체의 반응에 의해 수득되는 당포합체의 치료학적으로 유효한 투여량(dosage)은 질병에 대한 적어도 부분적인 면역화의 결과를 가져오는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 유독성(toxicity) 및 치료학적 효능은 세포 배양 또는 동물 실험에서의 표준 약제학적, 약리적 및 독성학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 용량비(dose ratio)는 치료지수(therapeutic index)이다. 투여된 조성물의 실제 양은 치료되는 대상체, 대상체의 체중, 질병(affliction)의 중증도(severity), 투여의 방법 및 처방 의사의 판단에 의존적일 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 동해방지제, 동결건조보호제, 부형제 및/또는 희석제와 함께 일반식 (I)의 임의의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체 및/또는 일반식 (I)의 임의의 사카라이드 및/또는 일반식 (II)의 중간체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 박테리아에 연관된 질병에 대한 면역화에 유용하다.
여기에서 언급된 스트렙토코커스 뉴모니에 박테리아에는 하기의 혈청형이 포함된다:
스트렙토코커스 뉴모니에 1형, 스트렙토코커스 뉴모니에 4형, 스트렙토코커스 뉴모니에 9V형, 스트렙토코커스 뉴모니에 2형, 스트렙토코커스 뉴모니에 19F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 3형, 스트렙토코커스 뉴모니에 19A형, 스트렙토코커스 뉴모니에 12F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 31형, 스트렙토코커스 뉴모니에 7F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 5형, 스트렙토코커스 뉴모니에 14형, 스트렙토코커스 뉴모니에 6A형, 스트렙토코커스 뉴모니에 6B형, 스트렙토코커스 뉴모니에 18C형 및 스트렙토코커스 뉴모니에 23F형.
본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 동해방지제, 동결건조보호제, 부형제 및/또는 희석제와 함께 일반식 (I)의 임의의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체 및/또는 일반식 (I)의 임의의 사카라이드 및/또는 일반식 (II)의 중간체를 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니에 1형에 연관된 질병에 대한 면역화에 유용한 약제학적 조성물, 특히 백신에 관한 것이다.
[→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]로부터 유도된 사카라이드가 여기에서 정의된 바와 같은 면역원성 담체에의 공액화를 허용하여 당포합체를 제공하는 적절한 링커로 관능화된다. 상기 당포합체는 박테리아에 연관된 질병에 대한, 특히 스트렙토코커스 뉴모니에에 연관된 질병에 대한, 특히 스트렙토코커스 뉴모니에 1형에 대한 면역화를 위한 백신으로서 유효하다는 것이 입증되었다. 상기 질병에는 폐렴, 수막염, 중이염, 균혈증 및 만성 기관지염, 축농증, 관절염 및 결막염의 급성악화가 포함된다.
본 발명의 또 다른 관점은 그들의 협막 폴리사카라이드 내에
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
로부터 선택되는 사카라이드 구조를 포함하는 박테리아로 야기되는 질병의 진단을 위한 면역학적 분석에서의 표지자(marker)로서 유용한 일반식 (I)의 사카라이드 및/또는 일반식 (II)의 중간체에 관한 것이다.
이러한 분석에는, 예를 들면, 본 발명의 사카라이드를 포함하거나 이들을 포함하는 박테리아에 의해 야기되는 질병의 진단에 유용한 마이크로어레이(microarray) 및 효소결합면역흡착분석법(ELISA)가 포함되며, 상기 질병에는 폐렴, 수막염, 중이염, 균혈증 및 만성 기관지염, 축농증, 관절염 및 결막염의 급성악화가 포함된다.
본 발명의 사카라이드는 쉽게 본 발명의 사카라이드를 포함하거나 이들을 포함하는 박테리아에 의해 야기되는 질병의 진단에 유용한 분석을 제공하기 위한 고체 지지체에 공액화될 수 있다. 상기 고체 지지체는 그의 표면에 중간연결 분자의 관능기 Y와 반응할 수 있는 관능성을 제공하여 그들의 표면에 일반식 (I)의 사카라이드의 티올기와 반응할 수 있는 중간연결 분자의 상기 관능기 X를 갖는 변성된 고체 지지체를 제공한다. 상기 고체 지지체에는 그의 표면에 중간연결 분자의 관능기 Y와 반응할 수 있는 관능성을 제공하여 그들의 표면에 중간연결 분자의 관능기 X를 제공하는 변성된 마이크로어레이 슬라이드를 제공할 수 있는 마이크로어레이 슬라이드가 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 마이크로어레이 슬라이드는 그들의 표면 상에 아미노기를 제공한다. 그들의 표면 상에 아미노기를 제공하는 마이크로어레이 슬라이드에는 그 위에 아미노 관능성이 소 혈청 알부민(BSA)와의 배양에 의해 도입된 아민-코팅 GAPS II 슬라이드(코닝사(Corning)) 또는 CodeLink NHS 슬라이드가 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다.
일반식 (I)의 사카라이드로 코팅된 마이크로어레이 슬라이드는 일반식 (I)의 사카라이드를 상기 변성된 마이크로어레이 슬라이드에 공액화시키고, 원생의 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 폴리사카라이드(native Streptococcus pneumoniae type 1 polysaccharide)의 존재 또는 부재 중에서 래빗 항-스트렙토코커스 뉴모니에 1형 형별 혈청(rabbit anti-Streptococcus pneumoniae type 1 typing serum) 인간 폐렴구균 혈청 007sp(serum human pneumococcal serum 007sp)으로 배양시키는 것에 의해 합성된다. 결합 실험들은 래빗 항-스트렙토코커스 뉴모니에 1형 형별 혈청 및 인간 폐렴구균 혈청 007sp 둘 다 α-2,4,6-트리디옥시-4-아미노-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp 및 α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp 사카라이드 구조에 결합됨을 나타내고 있다(도 4 내지 8을 참고하시오). 게다가, 결합은 원생의 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 폴리사카라이드로 저해될 수 있어 본 발명에 따른 사카라이드가 면역계에 의해 인식되는 에피토프를 공유함을 암시하고 있다(도 5 및 도 6을 참조하시오).
도 1은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형의 국제적인 분포를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 상용적으로 획득가능한 중간연결 분자의 예들을 제공한다.
도 3은 본 발명에 따른 중간연결 분자의 관능기 X의 예들을 제공한다.
도 4는 마이크로어레이 상의 일반식 (I)의 사카라이드의 인쇄 패턴을 나타낸다.
도 5는 일반식 (I)의 사카라이드에의 인간 폐렴구균 혈청 007sp(뉴모박스 백신(Pneumovax vaccine)으로 면역화된 287개체의 인간의 합병 혈청)의 결합을 나타내며, 이들은 원생의 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 폴리사카라이드의 존재 중 및 부재 중에서의 변성된 CodeLink NHS 슬라이드 상에 코팅되어 있다.
도 6은 일반식 (I)의 사카라이드에의 래빗 항-스트렙토코커스 뉴모니에 1형 형별 혈청의 결합을 나타내며, 이들은 원생의 스트렙토코커스 뉴모니에 1형 폴리사카라이드의 존재 중 및 부재 중에서의 변성된 아민-코팅 GAPS II 슬라이드(코닝사) 상에 코팅되어 있다.
도 7은 일반식 (I)의 사카라이드에의 래빗 항-스트렙토코커스 뉴모니에 1형 형별 혈청의 결합을 나타내며, 이들은 변성된 아민-코팅 GAPS II 슬라이드(코닝사) 상에 코팅되어 있다.
도 8은 일반식 (I)의 사카라이드에의 래빗 항-스트렙토코커스 뉴모니에 1형 형별 혈청의 결합을 나타내며, 이들은 변성된 CodeLink NHS 슬라이드 상에 코팅되어 있다.
하기의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 입증하기 위하여 포함된다. 실시예들에서 개시된 기술들은 본 발명의 실행에서 잘 기능할 것으로 본 발명자에 의해 발견된 현재의 기술들을 따르며, 따라서 그 실행을 위한 최량의 모드를 구성하는 것으로 고려될 수 있음은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 이해되어야 한다. 그러나, 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는, 본 상세한 설명의 고려하여, 개시되고 그리고 여전히 본 발명의 정신 및 관점으로부터 벗어남이 없이 동일하거나 유사한 결과를 얻는 특정의 구체예들 내에서 많은 변화들이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 여러 관점들의 추가의 변경들 및 대안의 구체예들이 본 상세한 설명의 시각에서 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백할 것이다. 따라서, 본 상세한 설명은 단지 설명으로서 이해되어야 하고 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 본 발명을 실행하는 일반적인 방법을 교시하는 목적을 위한 것이다. 여기에서 표시되고 개시된 본 발명의 형태들은 구체예들의 실시예들로서 고려되어야 한다는 것은 이해되어야 한다. 본 발명의 이러한 설명의 잇점을 파악한 후 모두 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백할 수 있는 바와 같이, 요소들 및 물질들은 여기에서 설명되고 개시된 것들에 대하여 치환될 수 있고, 부품들 및 공정들은 역전될 수 있고, 그리고 본 발명의 특정한 특징들은 독립적으로 활용될 수 있다. 하기 특허청구범위들에서 개시된 바와 같은 본 발명의 정신 및 관점으로부터 벗어남이 없이 여기에서 개시된 구성요소들에서의 변경이 이루어질 수 있다.
실시예
화학적 합성
화학적 합성을 위한 일반 정보
언급되지 않은 경우를 제외하고는 통상적인 시약들은 추가의 정제없이 사용되었다. 용매들은 사용에 앞서 통상적인 방법으로 건조시키고 재증류시켰다. 달리 언급되지 않는 한 모든 반응들은 오븐-건조된 유리용기 내에서 비활성 분위기 하에서 수행되었다. 분석용 박막크로마토그래피(TLC)는 0.25㎜ 두께의 실리카겔로 사전코팅된 Kieselgel 60 F254 유리 플레이트 상에서 수행되었다. TLC 플레이트들은 UV광으로 그리고 하네시안 용액(Hanessian solution)(황산 수용액 중의 황산세륨 및 암모늄몰리브데이트) 또는 황산-에탄올 용액으로의 염색에 의하여 가시화되었다. Fluka Kieselgel 60 (230 내지 400 mesh)에서 컬럼크로마토그래피가 수행되었다. 광회전(OR: optical rotation)은 g/100㎖로 표현된 농도(c)에서 Schmidt & Haensch UniPol L1000 편광계로 측정되었다. 양성자(1H) 및 탄소(13C) 핵자기공명분광분석(NMR) 스펙트럼은 내부 표준으로서 Me4Si와 함께 Varian 400-MR 또는 Varian 600 분광분석기로 측정되었다. NMR 화학적 이동(δ)은 ppm으로 기록되었고 결합상수(J)는 ㎐로 보고되었다. 고해상도 질량분광분석 스펙트럼(HRMS: high-resolution mass spectra)은 Freie Universitat Berlin, Mass Spectrometry Core Facility에서 Agilent 6210 ESI-TOF 질량분광분석기로 기록되었다.
실시예 1: 4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-레불리노일-4,6-디디옥시-D-갈락탈 (1*):
Figure 112016012345703-pct00108
0 ℃에서 CH2Cl2 (40 ㎖) 중의 4-O-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-하이드록시-4,6-디디옥시-D-갈락탈(Org. Lett . 2010, 12, 1624)(1.64 g, 6.21 mmol)(1.64 g, 6.21 mmol)의 용액에 피리딘 (0.501 ㎖, 6.21 mmol), 레불린산 (0.96 ㎖, 9.31 mmol), DMAP (0.152 g, 1.242 mmol) 및 EDC (1.205 ㎖, 6.83 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 그 온도에서 교반시켰다. 3 시간 후, 0.5 당량의 레불린산 및 0.5 당량의 EDC를 첨가하여 반응을 가속시켜 완결시켰다. 5 시간 후, 혼합물을 100 ㎖ DCM으로 희석시키고 물 (50 ㎖), 포화 NH4Cl 수용액 (50 ㎖), 포화 NaHCO3 수용액 (50 ㎖) 및 염수 (50 ㎖)로 세척하였다. 유기 분획을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래스 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:1)로 정제하여 투명 오일로서 에스테르 1* (2.07 g, 5.73 mmol, 92%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C19H23NO6 (M+Na+)에 대한 이론치 384.1423 실측치 384.1415 m /z.
실시예 2: 디부틸 [2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-레불리노일-2,4,6-트리디옥시-D-갈락토피라노실] 포스페이트 (2*):
Figure 112016012345703-pct00109
-25 ℃에서 건조 MeCN (44 ㎖) 중의 갈락탈 1* (3.17 g, 8.77 mmol)의 용액에 세릭암모늄나이트레이트 (14.42 g, 26.3 mmol) 및 소듐아지드 (0.86 g, 13.15 mmol)를 첨가하였다. 반응을 -25 ℃ 내지 -20 ℃ 사이에서 6 시간 동안 격렬하게 교반시켰다. 혼합물을 차가운 Et2O (50 ㎖)로 희석시켰다. 유기층을 냉수(3x30 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 실리카겔 (EtOAc/헥산/Et3N 1:1:0.01)의 플러그(plug)를 통하여 여과하여 엷은 황색 오일로서 4:1 갈락토/탈로(galacto/talo) 혼합물 (2.01 g)로서 조(crude) 글리코실나이트레이트를 수득하였다.
조 글리코실나이트레이트 (2.01 g)에 건조 DMF (28 ㎖) 중의 세슘디부틸포스페이트 (2.21 g, 6.45 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 그 온도에서 4.5 시간 동안 교반시키고, EtOAc (100 ㎖)로 희석시키고 물 (100 ㎖)에 부어넣었다. 유기상을 물 (5x50 ㎖)로 세척하고 결합된 수성 분획들을 EtOAc (50 ㎖)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래스 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 45:55 내지 50:50)로 정제하여 투명 오일로서 글리코실 포스페이트 2* (1.84 g, 3.00 mmol, 37%, 1:10 α/β)를 수득하였다. HRMS (ESI) C27H41N4O10P (M+Na+)에 대한 이론치 635.2458 실측치 635.2422 m /z.
실시예 3: 에틸 2-O-벤질-3,4-이소프로필리덴-1-티오-β-D-갈락토피라노시드 (3*):
Figure 112016012345703-pct00110
0 ℃에서 DMF (150 ㎖) 및 THF (75 ㎖) 중의 에틸 6-O-3차-부틸디메틸실릴-3,4-이소프로필리덴-1-티오-β-D-갈락토피라노시드 (Bioorg . Med . Chem . 2001, 9, 1395) (45.7 g, 121 mmol)의 교반된 용액에 소듐하이드라이드 (60%, 7.24 g, 181 mmol) 계속해서 벤질브로마이드 (17.2 ㎖, 145 mmol)를 소량씩 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 0 ℃에서 교반시키고, 천천히 실온까지 가온시키고 그 온도에서 16 시간 동안 교반시켰다. 반응을 0 ℃에서 포화 NH4Cl (20 ㎖)로 퀀칭(quenched)시키고 물 (200 ㎖) 및 EtOAc (150 ㎖)로 희석시키고 15 분 동안 0 ℃에서 교반시켰다. 분리 후, 유기상을 물 (5x100 ㎖)로 세척하고 결합된 수성 분획들을 EtOAc (2x100 ㎖)로 재추출하였다. 결합된 유기 추출물들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 황색 오일로서 조 벤질에테르 (61 g)를 수득하였다.
0 ℃에서 THF (370 ㎖) 중의 조 벤질에테르 (61 g)의 교반된 용액에 테트라부틸암모늄플루오라이드 (THF 중의 1 M, 166 ㎖, 166 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 1 시간 동안 교반시켰다. 반응을 포화 NaHCO3 수용액 (200 ㎖) 및 EtOAc (100 ㎖)로 희석시켰다. 분리 후, 수성상을 EtOAc (3x100 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 MgSO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 0:1 내지 1:3 내지 1:1)로 정제하여 백색 고체로서 알코올 3*을 수득하였다. HRMS (ESI) C18H26O5S (M+Na+)에 대한 이론치 377.1398 실측치 377.1416 m/z.
실시예 4: 메틸 (에틸 2-O-벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)우로네이트 (4*):
Figure 112016012345703-pct00111
0 ℃에서 CH2Cl2 (50 ㎖) 및 H2O (25 ㎖) 중의 알코올 4* (6.0 g, 16.93 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 TEMPO (0.53 g, 3.39 mmol) 및 BAIB (10.9 g, 33.9 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 1 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 반응을 10% Na2S2O3 수용액 (10 ㎖)으로 퀀칭시키고 EtOAc (30 ㎖)로 희석시켰다. 분리 후, 유기상을 10% Na2S2O3 (4x20 ㎖)로 세척하였다. 수성상을 EtOAc (2x20 ㎖)로 추출하고 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 황색 오일로서 조 산(crude acid) (7.92 g)을 수득하였다.
0 ℃에서 MeOH (300 ㎖) 중의 아세틸클로라이드 (6.04 ㎖, 85 mmol)의 교반된 용액에 MeOH (40 ㎖) 중의 조 산 (7.92 g)을 적가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고, 2 시간 동안 그 온도에서 교반시키고 0 ℃까지 냉각시켰다. 반응을 포화 NaHCO3 수용액 (30 ㎖)으로 퀀칭시키고 고체 NaHCO3로 pH 7까지 중화시켰다. 휘발분들을 증발시키고 혼합물을 EtOAc (70 ㎖)로 희석시켰다. 분리 후, 수성상을 EtOAc (5x50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 수행하여 (EtOAc/헥산 2:3 내지 1:1, 계속해서 1:0) 조 생성물을 수득하고, 이를 메탄올 중에서 -20 ℃에서 결정화시켜 (5 ㎖/g 조 생성물) 백색 고체로서 디올 4* (3.47 g, 10.13 mmol, 60%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C16H22O6S (M+Na)+ 에 대한 이론치 365.1034 실측치 365.1058 m/z.
실시예 5: 메틸 (에틸 2-O-벤질-3,4-O-엔도-벤질리덴-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)우로네이트 (5*) 및 메틸 (에틸 2-O-벤질-3,4-O-엑소-벤질리덴-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)우로네이트 (6*):
Figure 112016012345703-pct00112
Figure 112016012345703-pct00113
실온에서 건조 아세토니트릴 (29 ㎖) 중의 디올 4* (2.99 g, 8.73 mmol)의 교반된 용액에 벤즈알데히드디메틸아세탈 (6.57 ㎖, 43.6 mmol) 및 DL-캄포설폰산 (0.51 g, 2.18 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반시키고 반응을 트리에틸아민 (0.35 ㎖)의 첨가에 의하여 퀀칭시켰다. 혼합물을 감압 하에서 농축시켜 잔사를 수득하고, 이를 실리카겔 (헥산/EtOAc 8:1 (2% Et3N) 내지 1:1 (2% Et3N))의 짧은 플러그를 통하여 여과하여 벤질리덴아세탈 5* (엔도) 및 6* (엑소)의 1:1 혼합물 (3.46 g, 8.03 mmol, 92%)을 수득하였다. 이성질체들을 엑소-이성질체의 EtOAc/헥산으로부터의 선택적 결정화 및 모액의 크로마토그래피 분리(Biotage, 헥산 + 0.5% Et3N 중에서의 10% 내지 40% EtOAc의 편평 경사)에 의하여 분리시켰다. 5*에 대한 분석 데이터: 투명 오일. HRMS (ESI) C23H26O6S (M+Na)+에 대한 이론치 453.1348, 실측치 453.1352 m /z. 6*에 대한 분석 데이터: 백색 고체. HRMS (ESI) C23H26O6S (M+Na)+에 대한 이론치 453.1348, 실측치 453.1338 m/z.
실시예 6: 메틸 (에틸 2,3-O-벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노실)우로네이트 (7*):
Figure 112016012345703-pct00114
실온에서 THF (9.4 ㎖) 중의 아세탈 6* (162 ㎎, 0.38 mmol) 및 소듐시아노하이드라이드 (296 ㎎, 4.70 mmol)의 용액에 가스의 방출이 중지될 때까지 염화수소의 용액 (Et2O 중의 1 M)을 첨가하였다. 10분 후, 소듐시아노하이드라이드 (296 ㎎, 4.70 mmol)를 첨가하고 후속하여 HCl을 첨가하였다. 반응을 실온에서 교반시키고, EtOAc (30 ㎖)로 희석시키고 포화 NaHCO3 수용액 (30 ㎖)으로 퀀칭시켰다. 분리 후, 유기층을 포화 NaHCO3 수용액(20 ㎖)으로 세척하고 수성층을 EtOAc (2x20 ㎖)로 재추출하였다. 유기 추출물을 모으고, MgSO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:1)로 정제하여 백색 고체로서 알코올 7* (67.5 ㎎, 0.156 mmol, 42%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C23H28O6S (M+Na+)에 대한 이론치 455.1504 실측치 455.1511 m/z.
실시예 7: 메틸 (에틸 2,3-O-벤질-4-O-플루오레닐메톡시카르보닐-1-티오-β-D-갈락토피라노실)우로네이트 (8*):
Figure 112016012345703-pct00115
0 ℃에서 피리딘 (1.2 ㎖) 중의 알코올 7* (160 ㎎, 0.370 mmol)의 교반 중인 용액에 FmocCl (383 ㎎, 1.48 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 3 시간 동안 교반시켰다. 계속해서 혼합물을 EtOAc (50 ㎖)로 희석시키고 1 N HCl (2x30 ㎖) 및 포화 NaHCO3 수용액(30 ㎖)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:2)로 정제하여 백색 거품으로서 카르보네이트 8* (217 ㎎, 0.331 mmol, 90%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C38H38O8S (M+Na)+에 대한 이론치 677.2185 실측치 677.2167 m /z.
실시예 8: 디부틸 [메틸 (2,3-O-벤질-4-O-플루오레닐메톡시카르보닐-α/β-D-갈락토피라노실)우로네이트] 포스페이트 (9*):
Figure 112016012345703-pct00116
티오글리코시드 8* (200 ㎎, 0.305 mmol)을 건조 톨루엔 (2x30 ㎖)과 함께 공-증발시키고, 고진공 하에서 1 시간 동안 유지시키고 건조 CH2Cl2 (3 ㎖) 중에 용해시켰다. 활성화된 분자체 (3 Å-AW)를 첨가하고 용액을 15 분 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 디부틸인산 (128 ㎎, 0.611 mmol)으로 처리하고 추가로 15 분 동안 교반시켰다. 계속해서 혼합물을 NIS (89 ㎎, 0.397 mmol)로 처리하고, 실온까지 가온시키고 그 온도에서 3 시간 동안 교반시켰다. 반응을 CH2Cl2 (20 ㎖)로 희석시키고 10% Na2S2O3 수용액 및 포화 NaHCO3 수용액 (20 ㎖) 1:1 (v/v)의 혼합물로 퀀칭시켰다. 수성상을 CH2Cl2 (3x30 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:1 내지 2:1)로 정제하여 투명 오일로서 글리코실 포스페이트 9* (218 ㎎, 0.272 mmol, 89%, 10:1 α/β를 수득하였다. 9*α의 분석 데이터: HRMS (ESI) C44H51O12P (M+Na)+에 대한 이론치 825.3015 실측치 825.3020 m /z. 9*β에 대한 분석 데이터: HRMS (ESI) C44H51O12P (M+Na)+에 대한 이론치 825.3015 실측치 825.2970 m/z.
실시예 9: 메틸 (2-O-벤질-3,4-O-엔도-벤질리덴-α/β-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (10*):
Figure 112016012345703-pct00117
티오글리코시드 5* (102 ㎎, 0.237 mmol), 2-(벤질티오)에탄올 11* (60 ㎎, 0.355 mmol) 및 TTBPy. (117 ㎎, 0.474 mmol)를 무수 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 THF (4.8 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (3 Å) 상에서 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 DMTST (0.2 ㎖ dry CH2Cl2 중의 92 ㎎, 0.355 mmol)로 처리하였다. 반응을 실온까지 가온시키고 그 온도에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응을 1:1 (v/v) MeOH/Et3N 혼합물 (0.1 ㎖)로 퀀칭시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산/Et3N 0:1:0.01 내지 30:70:0.01 내지 45:55:0.01)로 정제하여 대응하는 β-이성질체 10*β (35 ㎎, 0.065 mmol, 27%)와 함께 투명 오일로서 티오에테르 10*α (59 ㎎, 0.110 mmol, 46%)를 수득하였다. 10*α에 대한 분석 데이터: HRMS (ESI) C30H32O7S (M+Na)+에 대한 이론치 559.1766 실측치 559.1731 m/z.
실시예 10: 메틸 (2,4-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노시드)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (12*):
Figure 112016012345703-pct00118
실온에서 건조 THF (5.3 ㎖) 중의 아세탈 10*α (100.0 ㎎, 0.186 mmol)의 교반된 용액에 먼저 보란 트리메틸아민 착체(borane trimethylamine complex) (57.4 ㎎, 0.745 mmol)를 그리고 계속해서 알루미늄클로라이드 (149 ㎎, 1.118 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 4.5 시간 동안 교반시켰다. 물 (10 ㎖) 및 1 M HCl 수용액 (5 ㎖)의 첨가에 의하여 반응을 퀀칭시켰다. 혼합물을 EtOAc (3x 10 ㎖)로 추출하고 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 2:5 내지 1:1)로 정제하여 투명 오일로서 알코올 12* (70.0 ㎎, 0.13 mmol, 70%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C30H34O7S (M+Na)+에 대한 이론치 561.1923 실측치 561.1879 m/z.
실시예 11: 메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-메틸 (2,4-di-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(2-(벤질티오)에탄올 (13*):
Figure 112016012345703-pct00119
알코올 12* (90 ㎎, 0.166 mmol) 및 글리코실포스페이트 9* (208 ㎎, 0.259 mmol)를 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 1 시간 동안 유지시켰다. 혼합물을 건조 CH2Cl2 (3.3 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (3 Å-AW) 상에서 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 TBSOTf (0.2 ㎖ 건조 CH2Cl2 중의 0.133 mmol)를 적가하여 처리하였다. 용액을 실온까지 가온시키고 20 시간 동안 교반시켰다. 반응을 CH2Cl2 (10 ㎖)로 희석시키고 1:1 (v/v) MeOH/피리딘 혼합물 (0.2 ㎖)로 퀀칭시켰다. 용액을 셀라이트(Celite)를 통하여 여과하고 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 (EtOAc/헥산 1:1)의 짧은 플러그를 통하여 여과하여 투명 오일로서 중간체 디사카라이드 혼합물 (150 ㎎, 0.133 mmol, 80%, 3:1 α/β)을 수득하였다.
실온에서 CH2Cl2 (2.6 ㎖) 중의 카보네이트 혼합물 (150 ㎎)의 교반된 용액에 트리에틸아민 (1.1 ㎖, 7.96 mmol)을 첨가하였다. 반응을 그 온도에서 3 시간 동안 교반시키고 톨루엔 (2x10 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:6 내지 2:3 내지 1:1)로 정제하여 대응하는 β-아노머 (20 ㎎, 0.022 mmol, 17%)와 함께 알코올 13* (62 ㎎, 0.068 mmol, 51%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C51H56O13S (M+Na)+에 대한 이론치 931.3339, 실측치 931.3340 m/z.
실시예 12: 2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-레불리노일-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-메틸 (2,4-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (14*):
Figure 112016012345703-pct00120
알코올 13* (65 ㎎, 0.062 mmol) 및 글리코실포스페이트 2* (61 ㎎, 0.100 mmol)를 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 (2.1 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (4 Å-AW) 상에서 1 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 TMSOTf (0.2 ㎖ 건조 CH2Cl2 중의 17 ㎕, 0.093 mmol)로 처리하였다. TLC (EtOAc/헥산 2:3)가 억셉터(acceptor)의 완전한 소모를 표시하는 경우, 혼합물을 3 시간 동안 0 ℃에서 교반되도록 하였다. 반응을 1:1 (v/v) MeOH/NEt3 혼합물 (0.5 ㎖)로 퀀칭시키고, CH2Cl2 (20 ㎖)로 희석시키고 셀라이트를 통하여 여과하였다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:2 내지 1:1)로 정제하여 투명 오일로서 트리사카라이드 14* (69 ㎎, 0.053 mmol, 85%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C70H78N4O19S (M+Na)+에 대한 이론치 1333.4879 실측치 1333.4911 m/z.
실시예 13: 2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-메틸 (2,4-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (15*):
Figure 112016012345703-pct00121
실온에서 건조 CH2Cl2 (1.0 ㎖) 중의 레불리노일에스테르 14* (30 ㎎, 0.023 mmol)의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (56 ㎕, 0.692 mmol) 및 아세트산 (37 ㎕, 0.646 mmol)의 혼합물을, 계속해서 하이드라진 수화물 (2 ㎕, 0.041 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 실온에서 교반되도록 하고, EtOAc (2 ㎖)로 희석시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 물 (15 ㎖)에 부어넣었다. 수성상을 EtOAc (4x10 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 추출물들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 0:1 내지 1:2 내지 2:3)로 정제하여 투명 오일로서 알코올 15* (28 ㎎, 0.023 mmol, 100%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C65H72N4O17S (M+Na)+에 대한 이론치 1235.4511 실측치 1235.4539 m/z.
실시예 14: 2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-벤질옥시메틸-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-메틸 (2,4-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (16*):
Figure 112016012345703-pct00122
알코올 15* (8.6 ㎎, 7.1 μmol), 벤질옥시메틸트리시클로헥산 (79 ㎎, 0.354 mmol) 및 TTBPy. (105 ㎎, 0.425 mmol)를 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 건조 CH2Cl2 (0.4 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (3 Å) 상에서 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 혼합물을 0 ℃까지 냉각시키고 DMTST (0.1 ㎖ CH2Cl2 중의 7.1 ㎎, 0.18 mmol)를 45 분간 적가시키는 한편으로 반응 온도를 10 ℃ 아래로 유지시켰다. 반응을 추가로 45 분 동안 교반시키고, 1:1 (v/v) MeOH/Et3N 혼합물의 추가에 의하여 퀀칭시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:10 내지 1:2)로 정제하여 투명 오일로서 아세탈 16* (6.0 ㎎, 4.5 μmol, 64%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C73H80N4O18S (M+Na)+에 대한 이론치 1355.5086 실측치 1355.5071 m/z.
실시예 15: 2-아세트아미도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-벤질옥시메틸-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-메틸 (2,4-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (17*):
Figure 112016012345703-pct00123
0 ℃에서 건조 피리딘 (0.35 ㎖) 중의 아지드 16* (14.0 ㎎, 10.5 μmol)의 교반된 용액에 티오아세트산 (0.35 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 그 온도에서 24 시간 동안 교반시켰다. 용액을 톨루엔 (2x5 ㎖)과 함께 공증발시키고 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:10 내지 아세톤/헥산 1:7 내지 1:5 내지 1:3)로 정제하여 백색 고체로서 아세트아미드 17* (9.4 ㎎, 7.0 μmol, 66%) as a white solid. 를 수득하였다. HRMS (ESI) C75H84N2O19S (M+Na)+ 에 대한 이론치 1371.5281 실측치 1371.5314 m/z.
실시예 16: 2,2'-디티오비스[2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-α-D-갈락토피라노실우로네이트-(1→3)-α-D-갈락토피라노실우로네이트-(1→1)-1-에탄올] (18*):
Figure 112016012345703-pct00124
0 ℃에서 THF (4.0 ㎖) 중의 디에스테르 17* 및 MeOH (0.8 ㎖)의 교반된 용액에 수 (1.5 ㎖) 중의 1 M NaOH 수용액을 첨가하였다. 반응을 천천히 실온까지 가온시키고 16 시간 동안 교반시켰다. 반응을 EtOAc (5 ㎖)로 희석시키고 pH 4까지 0.5 M NaHSO4 수용액으로 산성화시켰다. 분리 후, 수성 분획을 EtOAc (8x10 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 백색 고체로서 중간체 이산(diacid)를 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (5 ㎖)의 교반된 용액에 THF (1.5 ㎖) 중의 조 이산(crude diacid)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.5 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (45 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (200 ㎎)의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 용액을 아르곤의 기류 하에서 실온까지 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) (Sephadex G-25, 1:1 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디설파이드 18* (1.4 ㎎, 1.65 μmol, 32%)를 수득하였다. HRMS (MALDI) C44H70N4O32S2 (M-H+)에 대한 이론치 1229.3330 실측치 1229.3342 m/z.
실시예 17: 메틸 (에틸 2,3-O-벤질-4-O-레불리노일-1-티오-β-D-갈락토피라노실)우로네이트 (19*):
Figure 112016012345703-pct00125
실온에서 CH2Cl2 (1.9 ㎖) 중의 알코올 7* (94 ㎎, 0.217 mmol)의 교반된 용액에 레불린산 (386 ㎎, 3.26 mmol), DCC (673 ㎎, 3.26 mmol) 및 피리딘 (0.26 ㎖, 3.26 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 그 온도에서 35 시간 동안 교반시키고, CH2Cl2 (5 ㎖)로 희석시키고 셀라이트를 통하여 여과하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔사를 최소량의 CH2Cl2 (1 내지 3 ㎖) 중에 용해시키고 탈지면(cotton wool)을 통하여 여과하였다. 동일한 절차를 3회 반복하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/톨루엔 1:1)로 여과하여 엷은 황색 오일로서 에스테르 19* (91 ㎎, 0.171 mmol, 79%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C28H34O8S (M+Na)+에 대한 이론치 553.1872 실측치 553.1872 m/z.
실시예 18: 메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노시드)우로네이트-(1→1)-6-(벤질티오)헥사놀 (20*):
Figure 112016012345703-pct00126
티오글리코시드 19* (87 ㎎, 0.164 mmol), 6-(벤질티오)헥사놀 21* (85 ㎎, 0.379 mmol) 및 TTBPy. (97 ㎎, 0.392 mmol)를 무수 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 Et2O (2.5 ㎖) 및 CH2Cl2 (0.83 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (3 Å) 상에서 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 DMTST (63.5 ㎎, 0.246 mmol)로 처리하였다. 반응을 실온까지 가온시키고 8 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 반응을 MeOH 및 트리에틸아민의 1:1 (v/v) 혼합물 (0.1 ㎖)로 퀀칭시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/CH2Cl2/헥산 0:0:1 내지 1:2:1)로 정제하여 분리불가능한 α/β 혼합물로서 대응하는 글리코시드 (60 ㎎)를 수득하였다.
실온에서 건조 CH2Cl2 (2.2 ㎖) 중의 글리코시드 혼합물의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (195 ㎕, 2.411 mmol) 및 아세트산 (137 ㎕, 2.393 mmol)의 혼합물을 계속해서 하이드라진 수화물 (5.9 ㎕, 0.121 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 그 온도에서 2 시간 동안 교반시키고, EtOAc (2 ㎖)로 희석시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 물(15 ㎖)에 부어넣었다. 수성상을 EtOAc (4x10 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 추출물들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:2)로 정제하여 대응하는 β-이성질체 (22 ㎎, 0.037 mmol, 22%)와 함께 투명 오일로서 알코올 20* (2 단계에 걸쳐 29 ㎎, 0.049 mmol, 30%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C34H42O7S (M+Na)+에 대한 이론치 617.2544 실측치 617.2542 m/z.
실시예 19: 6,6'-디티오비스[α-D-갈락토피라노실우로네이트-(1→1)-1-헥사놀] (22*):
Figure 112016012345703-pct00127
0 ℃에서 THF (1.0 ㎖) 및 MeOH (0.5 ㎖) 중의 에스테르 20* (10 ㎎, 0.017 mmol)의 교반된 용액에 물 (0.8 ㎖) 중의 1 M NaOH 수용액을 첨가하였다. 반응을 천천히 실온까지 가온시키고 16 시간 동안 교반시켰다. 반응을 EtOAc (5 ㎖) 및 물 (5 ㎖)로 희석시키고 pH 4까지 0.5 M NaHSO4 수용액으로 산성화시켰다. 분리 후, 수성 분획을 EtOAc (8x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 백색 고체로서 중간체 산을 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (8 ㎖)의 교반된 용액에 THF (2 ㎖) 중의 조 이산의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.4 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (45 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (100 ㎎)의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 용액을 아르곤의 기류 하에서 실온까지 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고, 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex G-25, 9:1 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디설파이드 22* (2 단계에 걸쳐 3.1 ㎎, 5.1 μmol, 60%)를 수득하였다. HRMS (MALDI) C24H42O14S2 (M-H+)에 대한 이론치 617.1938 실측치 617.1954 m/z.
실시예 20: 2-아세트아미도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-레불리노일-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-6-(벤질티오)헥사놀 (23*):
Figure 112016012345703-pct00128
6-(벤질티오)헥사놀 21* (29 ㎎, 0.171 mmol) 및 글리코실포스페이트 2* (70 ㎎, 0.114 mmol)을 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 (1.8 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (4 Å-AW) 상에서 1 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 TMSOTf (0.2 ㎖ 건조 CH2Cl2 중의 31 ㎕, 0.171 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 3 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, MeOH 및 트리에틸아민 (0.5 ㎖)의 1:1 (v/v) 혼합물로 퀀칭시키고, CH2Cl2 (20 ㎖)로 희석시키고 셀라이트를 통하여 여과하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 2:3 내지 3:2)로 정제하여 분리불가능한 α/β 혼합물로서 대응하는 글리코시드 (57 ㎎)를 수득하였다.
0 ℃에서 건조 피리딘 (0.9 ㎖) 중의 글리코시드 혼합물의 교반된 용액에 트리아세트산 (0.9 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 24 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 용액을 톨루엔 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시키고 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:2 내지 2:1 내지 6:1)로 정제하여 대응하는 β-이성질체 (21.6 ㎎, 0.034 mmol, 29%)과 함께 백색 고체로서 아세트아미드 23* (2 단계에 걸쳐 22 ㎎, 0.034 mmol, 29%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C34H46N2O8S (M+Na)+에 대한 이론치 665.2872 실측치 665.2865 m /z.
실시예 21: 6,6'-디티오비스[2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-1-헥사놀] (24*):
Figure 112016012345703-pct00129
실온에서 건조 CH2Cl2 (1.0 ㎖) 중의 에스테르 23* (10 ㎎, 0.016 mmol)의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (38 ㎕, 0.467 mmol) 및 아세트산 (24.9 ㎕, 0.436 mmol)의 혼합물을, 계속해서 하이드라진 수화물 (1.0 ㎕, 0.020 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex LH-20, CH2Cl2/MeOH 2:1)로 정제하여 투명 오일로서 대응하는 알코올을 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (5 ㎖)의 교반된 용액에 THF (1.2 ㎖) 중의 중간체 알코올의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.5 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (80 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (100 ㎎)의 첨가에 의하여 퀀칭시켰다. 용액을 아르곤의 기류 하에서 실온까지 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고, 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex G-25, 9:1 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디설파이드 24* (2 단계에 걸쳐 1.7 ㎎, 2.7 μmol, 33%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C28H54N4O8S2 (M+Na)+에 대한 이론치 661.3281 실측치 661.3306 m/z.
실시예 22: 2-아세트아미도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-3-O-레불리노일-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (25*):
Figure 112016012345703-pct00130
2-(벤질티오)에탄올 11* (71 ㎎, 0.421 mmol) 및 글리코실포스페이트 2* (171 ㎎, 0.281 mmol)를 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 30 분 동안 유지시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 (1.8 ㎖) 중에 용해시키고 활성화된 분자체 (4 Å-AW) 상에서 1 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용액을 -40 ℃까지 냉각시키고 TMSOTf (0.2 ㎖ 건조 CH2Cl2 중의 56 ㎕, 0.309 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 0 ℃까지 천천히 가온시키고, MeOH 및 트리에틸아민의 1:1 (v/v) 혼합물 (0.5 ㎖)로 퀀칭시키고, CH2Cl2 (20 ㎖)로 희석시키고, 셀라이트를 통하여 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:3 내지 1:1)로 정제하여 대응하는 β-글리코시드 (22 ㎎, 0.039 mmol, 14%)와 함께 대응하는 α-글리코시드 (55 ㎎, 0.096 mmol, 34%)를 수득하였다.
0 ℃에서 건조 피리딘 (0.4 ㎖) 중의 중간체 α-글리코시드 (40 ㎎, 0.070 mmol)의 교반된 용액에 티오아세트산 (0.4 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 24 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 용액을 톨루엔 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시키고 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:3 내지 아세톤/헥산 1:2 내지 2:3)로 정제하여 백색 고체로서 아세트아미드 25* (31 ㎎, 0.053 mmol, 76%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C30H38N2O8S (M+Na)+에 대한 이론치 609.2246 실측치 609.2256 m/z.
실시예 23: 6,6'-디티오비스[2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-1-에탄올] (26*):
Figure 112016012345703-pct00131
실온에서 건조 CH2Cl2 (3.0 ㎖) 중의 에스테르 25* (20.7 ㎎, 0.035 mmol)의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (86 ㎕, 1.058 mmol) 및 아세트산 (57 ㎕, 0.988 mmol)의 혼합물을, 계속해서 하이드라진 수화물 (3.4 ㎕, 0.071 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 5 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, EtOAc (2 ㎖)로 희석시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 물 (10 ㎖)에 부어넣었다. 수성상을 EtOAc (4x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (아세톤/헥산 1:1)로 정제하여 백색 고체로서 중간체 알코올 (17.5 ㎎)을 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (6 ㎖)의 교반된 용액에 THF (1.5 ㎖) 중의 중간체 알코올의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.5 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (45 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (100 ㎎)의 첨가에 의하여 퀀칭시켰다. 용액을 아르곤의 기류 하에서 실온까지 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고, 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex G-25, 1:10 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디아세테이트 염(diacetate salt) (2 단계에 걸쳐 7.91 ㎎, 12.3 μmol, 70%)으로서 디설파이드 26*를 수득하였다. HRMS (ESI) C20H38N4O8S2 (M+Na)+에 대한 이론치 549.2029 실측치 549.2086 m/z.
실시예 24: 2,2'-디티오비스[α-D-갈락토피라노실우로네이트-(1→1)-1-에탄올] (27*):
Figure 112016012345703-pct00132
0 ℃에서 THF (0.6 ㎖) 및 MeOH (0.3 ㎖) 중의 에스테르 13* (8.6 ㎎, 9.5 μmol)의 교반된 용액에 물 (0.5 ㎖) 중의 1 M NaOH 수용액을 첨가하였다. 반응을 실온까지 천천히 가온시키고 16 시간 동안 교반시켰다. 반응을 EtOAc (5 ㎖) 및 물 (5 ㎖)로 희석시키고 pH 4까지 0.5 M NaHSO4 수용액으로 산성화시켰다. 분리 후, 수성 분획을 EtOAc (8x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 백색 고체로서 중간체 이산을 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (6 ㎖)의 교반된 용액에 THF (1.5 ㎖) 중의 조 이산의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.4 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (75 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (100 ㎎)의 첨가에 의하여 퀀칭시켰다. 용액을 아르곤의 기류 하에서 실온까지 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고, 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex G-25, 1:9 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디설파이드 27* (2 단계에 걸쳐 2.5 ㎎, 2.9 μmol, 61%)를 수득하였다. HRMS (MALDI) C28H42O26S2 (M-H+)에 대한 이론치 901.0966 실측치 901.0981 m/z.
실시예 25: 당포합체의 합성- 일반식 (I)의 사카라이드의 CRM197에의 공액화:
실온에서 0.1 M 인산나트륨 완충제(sodium phosphate buffer) (NaPi) pH 7.4 (1 ㎖) 중의 CRM197 (1 ㎎, 17.2 nmol)의 교반된 용액에 DMF (20 ㎕) 중의 숙신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP) (264 ㎍, 863 nmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, 막여과 (Amicon Ultra centrifuge membranes, 10 kDa 컷-오프(cut-off))를 사용하여 농축시켰다. 단백질 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4로 희석시키고 다시 농축시켰다. 이 과정을 3회 반복하고 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4를 사용하여 1 ㎖로 희석시켰다. 실온에서 120 ㎕ 0.1 M NaPi pH 7.4 중의 일반식 (II)의 중간체 (690 mmol)을 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP) (690 mmol)으로 처리하고, 그 온도에서 아르곤 분위기 하에서 1 시간 동안 방치하고 실온에서 브로모아세트아미도-변성 CRM197 단백질의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 그리고 계속해서 4 ℃에서 16 시간 동안 방치하고, 막여과 (상기 참조)를 사용하여 여과하였다. 계속해서 0.1 M NaPi pH 7.4 (1 ㎖) 중의 정제된 당포합체를 실온에서 100 ㎕ 물 중의 L-시스테인 (417 ㎍, 3.45 μmol)으로 처리하였다. 혼합물을 2 시간 동안 그 온도에서 방치하고 막여과에 의해 정제하였다. 일반식 (I)의 사카라이드의 당포합체 내로의 내포를 MALDI-TOF-MS, SDS-PAGE 및 우각광산란 검출(SEC-RALS: right angle light scattering detection)을 수반하는 크기별 배제 크로마토그래피로 평가하였다.
실시예 26: 당포합체의 합성- 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드에의 일반식 (I)의 사카라이드의 공액화의 흐름에 있어서
테프론 AF2400 배관 (566 ㎕)의 루프(loop)가 장착된 광화학 유동식 반응기(photochemical flow reactor ; Chem . Eur . J. 2013, 19, 3090)를 사용하는 것에 의하여, 물 (300 ㎕) 중의 일반식 (I)의 사카라이드 (1.5 당량) 용액을 물 (300 ㎕) 중의 펜테닐 변성 (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노일아미노옥타데칸-3,4-디올 (1 당량) 및 AcOH (8 ㎕; 주사기 당 체류 시간: 10 분, 유속: 28.3 ㎕/분-1)와 반응시켰다. 반응기 출력물을 동결건조시키고 조 물질(crude material)을 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex-G25, 물 중의 5% EtOH, 10 ㎜x150 ㎜)를 사용하여 정제하여 백색 고체로서 변성 (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노일아미노옥타데칸-3,4-디올에 공유적으로 연결된 일반식 (I)의 사카라이드의 당포합체를 수득하였다.
실시예 27: 당포합체의 합성- BSA에의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 공액화
실온에서 0.1 M 인산나트륨 완충제 (NaPi) pH 7.4 (1 ㎖) 중의 BSA (0.5 ㎎, 7.6 nmol)의 교반된 용액에 DMF (20 ㎕) 중의 N-숙신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP) (89 ㎍, 290 nmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반시키고, 막여과 (Amicon 0.5 ㎖ Ultra centrifuge membranes, 10 kDa 컷-오프)를 사용하여 농축시켰다. 단백질 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4로 희석시키고 다시 농축시켰다. 이 과정을 3회 반복하고 용액을 물을 사용하여 0.5 ㎖까지 희석시켰다. 분석을 위하여 20 ㎕를 취하고, 막여과를 사용하여 단백질 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4로 재-완충시켰다. 실온에서 120 ㎕ 0.1 M NaPi pH 7.4 중의 디설파이드 18* (단량체에 대하여 140 ㎍, 228 nmol)를 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP) (250 nmol)으로 처리하고, 1 시간 동안 그 온도에서 아르곤 분위기 하에서 방치하고 실온에서 활성화된 단백질의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 4 ℃에서 16 시간 동안 방치하고 막여과 (상기 참조)를 사용하여 정제하였다. 물로 세척하고 0.5 ㎖까지 희석한 후, 별도의 분석 샘플 (20 ㎕)을 취하고, 용액을 재-완충시켰다. 계속해서 실온에서 0.1 M NaPi pH 7.4 (0.5 ㎖) 중의 정제된 당포합체를 100 ㎕ 물 중의 L-시스테인 (417 ㎍, 3.45 μmol)으로 처리하였다. 혼합물을 2 시간 동안 그 온도에서 방치하고 막여과에 의하여 정제하였다. 당포합체 내로의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 내포를 MALDI-TOF-MS (포지티브 모드(positive mode))로 평가하였다:
측정된 분자량:
BSA: 66341 m/z.
BSA-SBAP 공액화물(conjugate): 68316 m/z (대략 10개의 SBAP기의 내포).
BSA-SBAP 당포합체: 69101 m/z (대략 1.3 분자의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 내포).
L-시스테인의 퀀칭 후의 BSA-SBAP 당포합체: 72074 m/z (대략 24.5 L-시스테인 분자의 내포).
실시예 28: 당포합체의 합성- BSA에의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 공액화
실온에서 0.1 M 인산나트륨 완충제 (NaPi) pH 7.4 (1 ㎖) 중의 BSA (0.5 ㎎, 7.6 nmol)의 교반된 용액에 DMF (20 ㎕) 중의 N-숙신이미딜-3-말레이미도프로피오네이트 (101 ㎍, 380 nmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반시키고, 막여과 (Amicon 0.5 ㎖ Ultra centrifuge membranes, 10 kDa 컷-오프)를 사용하여 농축시켰다. 단백질 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4로 희석시키고 다시 농축시켰다. 이 과정을 3회 반복하고 용액을 물을 사용하여 0.5 ㎖까지 희석시켰다. 분석을 위하여 20 ㎕를 취하고, 단백질 용액을 막여과를 사용하여 0.1 M NaPi pH 7.4에 재-완충시켰다. 실온에서 120 ㎕ 0.1 M NaPi pH 7.4 중의 디설파이드 18* (단량체에 대하여 140 ㎍, 228 nmol)를 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP) (250 nmol)로 처리하고, 1 시간 동안 그 온도에서 아르곤 분위기 하에서 방치하고 실온에서 활성화된 단백질의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 4 ℃에서 16 시간 동안 방치시키고, 막여과 (상기 참조)를 사용하여 정제하였다. 물로 세척하고 0.5 ㎖까지 희석한 후, 별도의 분석 샘플 (20 ㎕)을 취하고, 용액을 재-완충시켰다. 계속해서 실온에서 0.1 M NaPi pH 7.4 (0.5 ㎖) 중의 정제된 당포합체를 100 ㎕ 물 중의 L-시스테인 (417 ㎍, 3.45 μmol)으로 처리하였다. 혼합물을 2 시간 동안 그 온도에서 방치하고 막여과에 의하여 정제하였다. 당포합체 내로의 글리칸의 내포를 MALDI-TOF-MS (포지티브 모드)로 평가하였다:
측정된 분자량:
BSA: 66341 m/z;
BSA-말레이미드 공액화물: 69254 m/z (대략 19개의 말레이미드기의 내포);
BSA-말레이미드 당포합체: 71340 m/z (대략 3.4 분자의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 내포);
L-시스테인으로의 퀀칭 후의 BSA-말레이미드 당포합체: 72106 m/z (대략 6.3개의 L-시스테인 분자의 내포).
실시예 29: 고체 지지체에의 공액화 - GAPSII 슬라이드를 사용하는 마이크로어레이의 합성
24 시간 동안 실온에서 디이소프로필에틸아민 (2.5% v/v)을 수반하는 건조 DMF 중의 6-말레이미도헥사논산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester) (2 mM)에의 아민-코팅 슬라이드 (GAPS II slides, Corning)의 함침에 의하여 말레이미드-관능화 마이크로어레이를 제조하였다. 슬라이드를 물로 3회 그리고 에탄올로 3회 세척하고, 원심분리시켜 건조시키고, 점적(spotting)할 때까지 아르곤 하에 저장하였다. 자동 압전 어레이 로봇(automatic piezoelectric arraying robot ; Scienion, Berlin, Germany)으로 일반식 (I)의 희석된 사카라이드를 변성된 마이크로어레이 슬라이드 상으로 점(spot) 당 0.4 nℓ로 인쇄하였다. 고정화 반응(immobilization reaction)의 완결을 위하여, 인쇄된 슬라이드를 24 시간 동안 가습실(humidified chamber) 내에 저장하였다. 마이크로어레이 슬라이드를 물로 3회 세척하였다. 1 시간 동안 실온에서 PBS 중의 β-머캅토에탄올 (0.1%, v/v) 내에 슬라이드를 함침시키는 것에 의하여 미반응된 말레이미드를 퀀칭시켰다. 슬라이드를 물로 그리고 에탄올로 3회 세척하고, 원심분리시켜 건조시키고, PBS 중의 BSA (1%, w/v)로 1 시간 동안 실온에서 블로킹시켰다. 블로킹된 슬라이드를 세척하고(PBS로 2회, 물로 3회), 원심분리시키고, 혈청 희석물(sera dilutions)과 함께 배양시켰다.
실시예 30: 고체 지지체에의 공액화 - CodeLink NHS 슬라이드를 사용한 마이크로어레이의 합성
CodeLink NHS 슬라이드를 24 시간 동안 (PBS 중의 1% w/v) 4℃에서 배양시켰다. 슬라이드를 블로킹 완충제(blocking buffer ; 50 mM NaPi pH > 9 중의 100 mM 에탄올아민) 중에서 30 분 동안 실온에서 배양시키고, 물 및 에탄올 각각으로 3회 세척하고, 건조시켰다. 계속해서 슬라이드를 말레이미드 관능화 및 인쇄에 적용시켰다(실시예 29 참조).
실시예 31: 실시예 29 및 30에서 기술된 절차에 따라 합성된 마이크로어레이를 사용한 결합 실험.
원생의 SP1 폴리사카라이드의 존재 또는 부재로 표시된 희석물 중에서 일반식 (I)의 사카라이드로 코팅된 마이크로어레이 슬라이드를 래빗 항-SP1 형별 혈청 또는 인간 폐렴구균 참조 혈청 007sp (뉴모박스 백신으로 면역화된 287개체의 인간의 합병 혈청) 중의 하나와 배양시키고, 형광표지된 항-래빗 또는 항-인간 2차 항체를 사용하는 것에 의하여 결합 실험을 수행하였다.
실시예 32: 링커 A의 그리고 중간연결 분자의 면역원성의 평가
본 발명에 따른 당포합체 즉,
H-(P)n3-(N)n2-(M)n3-O-A-S-잔여 중간연결 분자 1-면역원성 담체 1
등과 같이 중간연결 분자 1을 경유하여 면역원성 담체 1에 연결된 링커 A를 제공하는 일반식 I의 사카라이드를 포함하는 당포합체를 제조하는 데 사용된 링커 A의 그리고 중간연결 분자의 면역원성을 확인하기 위하여,
당포합체 2:
H-(P)n3-(N)n2-(M)n3-O-A-S-잔여 중간연결 분자 2-면역원성 담체 2;
당포합체 3:
갈락토스-O-A-S-잔여 중간연결 분자 1-면역원성 담체 2;
당포합체 4:
갈락토스-O-A-S-잔여 중간연결 분자 2-면역원성 담체 2;
의 3가지 당포합체들이 합성될 필요가 있다.
면역원성 담체 2는 면역화에서 사용된 면역원성 담체 1과는 무관한 것이어야 한다. 예를 들면, CRM197이 당포합체 1을 제조하는 데 사용된 경우, BSA가 면역원성 담체 2로서 사용될 수 있다.
갈락토스가 본 발명에 따른 사카라이드에 즉, H-(P)n3-(N)n2-(M)n3-OH에 무관하기 때문에 갈락토스가 당포합체 3을 제조하는 데 선택되었다.
당포합체 2의 제조에 사용된 중간연결 분자 2는 중간연결 분자 1과는 무관한 것이어야 한다. 예를 들면, 설포-GMBS가 중간연결 분자 1로서 사용된 경우, 무-연관의 중간연결 분자 2는 설포 SIAB가 될 수 있다.
면역원성 담체 2, 중간연결 분자 2의 그리고 무연관의 사카라이드의 선택은 당포합체의 합성의 기술분야에서 숙련된 자에게는 자명한 것이다.
효소결합면역흡착분석법을 위한 프로토콜:
96-웰-플레이트를 PBS 중의 50 ㎕의 개개 당포합체로 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅시켰다. 플레이트를 100 ㎕ 세척 완충제 (PBS+0.1% (v/v) Tween-20)로 1회 세척하고 200 ㎕ 블로킹 용액 (PBS 중의 1% (w/v) BSA)을 사용하여 1 시간 동안 37 ℃에서 블로킹시켰다. 플레이트를 세척 완충제로 3회(3x) 세척하고 계속해서 블로킹 용액 (50 ㎕) 중의 항혈청의 희석물과 함께 16 시간 동안 4 ℃에서 배양시켰다. 플레이트를 3회 세척하고 블로킹 용액 중에 희석된 50 ㎕의 적절한 2차 항체(예를 들면 Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP), abcam ab6789)와 함께 1 시간 동안 37 ℃에서 배양시켰다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고 제조업자의 매뉴얼에 따라 ELISA 기질(예를 들면 Pierce로부터 획득한 ABTS No. 37615)과 함께 배양시켰다.
적용된 당포합체들 간의 광학 밀도(optical density)의 비교는 항-링커-, 항-중간연결 분자 및 항-사카라이드 면역 반응들 간의 정량적인 비교를 제공한다.
실시예 33: 2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-6-(벤질티오)에탄올 (28*)
Figure 112016012345703-pct00133
실온에서 건조 CH2Cl2 (1 ㎖) 중의 중간체 레브 에스테르 25* (17 ㎎, 0.03 mmol)의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (72 ㎕, 0.894 mmol) 및 아세트산 (48 ㎕, 0.834 mmol)의 혼합물을, 그리고 계속해서 하이드라진 수화물 (3 ㎕, 0.062 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 5 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, EtOAc (2 ㎖)로 희석시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 물 (10 ㎖)에 부어넣었다. 수성상을 CH2Cl2 (4x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/hexanes 3:1)로 정제하여 투명 오일로서 알코올 28* (13 ㎎, 0.028 mmol, 92%)을 수득하였다. HRMS (ESI) C23H28N4O5S (M+Na)+에 대한 이론치 495.1678 실측치 495.1679 m/z.
실시예 34: 메틸 (2,3-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아지도-4-(벤질옥시카르보닐)아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실 -(1→1)-2-(벤질티오)에탄올 (29*)
Figure 112016012345703-pct00134
알코올 28*(13 ㎎, 0.028 mmol), TTBPy (45, 0.138 mmol) 및 티오글리코시드 19* (37 ㎎, 0.069 mmol)를 건조 톨루엔 (3x10 ㎖)과 함께 공-증발시키고 고진공 하에서 1 시간 동안 방치시켰다. 혼합물을 건조 THF (1.5 ㎖)에 용해시키고 활성화된 분자체 (3 Å) 상에서 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 0 ℃까지 냉각시키고 DMTST (0.2 ㎖ DCM 중의 17 ㎎, 0.069 mmol)로 적가하여 처리하였다 혼합물을 실온까지 가온시키고 2 시간 후에 별도의 DCM (2 당량) 중의 DMTST 용액으로 처리하였다. 반응을 16 시간 동안 교반시키고 10% Na2S2O3 수용액 및 포화 NaHCO3 수용액 (5 ㎖)의 1:1 (v/v) 혼합물로 퀀칭시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 (3x10 ㎖)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:2)로 정제하여 투명 오일로서 중간체 디사카라이드를 수득하였다.
0 ℃에서 건조 피리딘 (0.2 ㎖) 중의 중간체 디사카라이드의 교반된 용액에 티오아세트산 (0.2 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고 24 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 용액을 톨루엔 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시키고 잔사를 플래시 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 1:3 내지 아세톤/헥산 1:2)로 정제하여 백색 거품으로서 중간체 아세트아미드를 수득하였다.
실온에서 건조 CH2Cl2 (0.6 ㎖) 및 MeOH (60 ㎕) 중의 중간체 아세트아미드의 교반된 용액에 먼저 피리딘 (12 ㎕, 0.16 mmol) 및 아세트산 (8 ㎕, 0.15 mmol)의 혼합물을, 그리고 계속해서 하이드라진 수화물 (1 ㎕, 0.021 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, CH2Cl2 (2 ㎖)로 희석시키고, 아세톤 (0.1 ㎖)으로 퀀칭시키고 물 (5 ㎖)에 부어넣었다. 수성상을 CH2Cl2 (4x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (아세톤/헥산 0:1 내지 1:1)로 정제하여 백색 거품으로서 아세트아미드 29* (회수된 28*에 기초하여 3 단계에 걸쳐 2.7 ㎎, 3.14 μmol, 21%)를 수득하였다. HRMS (ESI) C46H54N2O12S (M+Na)+에 대한 이론치 881.3295 실측치 881.3286 m/z.
실시예 35: 2,2'-디티오비스[α-D-갈락토피라노실우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실 -(1→1)-1-에탄올] (30*)
Figure 112016012345703-pct00135
0 ℃에서 THF (1 ㎖) 및 MeOH (0.25 ㎖) 중의 에스테르 29* (2.7 ㎎, 3.14 μmol)의 교반된 용액에 물 (0.4 ㎖) 중의 1M NaOH 용액을 첨가하였다. 반응을 천천히 실온까지 가온시키고 16 시간 동안 교반시켰다. 반응을 EtOAc (5 ㎖) 및 물 (5 ㎖)로 희석시키고 pH 4까지 0.5 M NaHSO4 수용액으로 산성화시켰다. 분리 후, 수성 분획을 EtOAc (8x5 ㎖)로 추출하고, 결합된 유기 분획들을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 백색 고체로서 중간체 이산을 수득하였다.
-78 ℃에서 액체 암모니아 (10 ㎖)의 교반된 용액에 THF (1.5 ㎖) 중의 조 이산의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 tBuOH (0.4 ㎖)로 처리하고 짙은 청색이 지속될 때까지 새로이 절단한 나트륨의 덩어리 (80 ㎎)를 첨가하였다. 반응을 -78 ℃에서 45 분 동안 교반시키고 고체 암모늄아세테이트 (100 ㎎)의 첨가에 의하여 퀀칭시켰다. 용액을 실온까지 아르곤의 기류 하에서 가온시키고 MeOH (2x10 ㎖) 및 물 (2x5 ㎖)과 함께 공-증발시켰다. 잔사를 공기 하에서 16 시간 동안 방치시키고, 크기별 배제 크로마토그래피 (Sephadex G-25, 1:3 MeOH/5 mM NH4OAc 수용액)로 정제하고 반복적으로 동결건조시켜 백색 고체로서 디설파이드 30* (2 단계에 걸쳐 1.15 ㎎, 2.61 μmol, 83%)를 수득하였다:
양성자 핵자기공명 분광분석(1H NMR ; 600 MHz, D2O) δ 5.16 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 1H), 4.34 - 4.20 (m, 2H), 4.15 - 4.04 (m, 1H), 4.00 - 3.78 (m, 5H), 3.06 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.41 (d, J = 6.6 Hz, 3H). LRMS C32H54N4O20S2 (M+2H)2+에 대한 이론치 440.4 실측치 440.2 m/z.
실시예 36: 본 발명에 따른 일반식 3의 화합물을 평가하기 위한 일반적인 절차
Figure 112016012345703-pct00136
실시예 36.1
Figure 112016012345703-pct00137
12 ㎖의 CH2Cl2 중의 이소시아네이트 A12 (2.70 mmol)의 용액에 아민 (1.05 당량, 2.83 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도에서 12 시간 동안 교반시키고 계속해서 진공 중에서 농축시켰다. 조 물질을 Et2O 중에 용해시키고 후속하여 헥산을 첨가하였다. 계속해서 우레아를 침강시키고 여과하여 생성물을 수득하였다.
무수 CH2Cl2 (3 ㎖) 중의 우레아 화합물로 보호된 p-메톡시벤질에테르 (0.4 mmol) 및 1,3,5-트리메톡시벤젠 (0.2 mmol)의 혼합물에 도관(cannula)을 경유하여 무수 CH2Cl2 (1 ㎖) 중의 실버헥사플루오로안티모네이트 (silver hexafluoroantimonate ; 20 μmol, 5 mol %)의 용액을 첨가하였다. 완료될 때까지 반응 혼합물을 환류되도록 가열시키고 셀라이트의 소형 패드를 통하여 용리액으로서 디클로로메탄으로 여과하였다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 조 잔사(crude residue)를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 A10을 수득하였다.
실시예 36.2
Figure 112016012345703-pct00138
여기에서: R3은 Me를 나타내고 R4는 OH를 나타낸다
i-PrOH (100ⅰL) 중의 알데히드 A17 (1.0 mmol) 및 케톤 A16 (1.0 mmol)의 혼합물에 프로피온산 (0.1 mmol, 10 mol %) 및 피롤리딘 (0.1 mmol, 10 mol %)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45 ℃에서 1 내지 25 시간 동안 교반시켰다. NaHCO3를 첨가하고, 혼합물을 CH2Cl2 (3 5 ㎖)로 추출하였다. 결합된 추출물들을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 중에서 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 중간체 불포화 케톤 A15를 수득하였다.
THF 중의 중간체 불포화 케톤 A15 (0.05 mmol)의 A9.5 x 10-3 M 용액 및 최근 제조한 스트리커 시약(Stryker's reagent) (0.025 mmol)을 함께 혼합시켜 균질한 용액을 형성시키고 이를 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응을 포화 NH4Cl 수용액으로 퀀칭시켰다. 혼합물을 1 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 잔사를 에틸아세테이트로 세척하였다. 유기상을 분리시키고, 수성상을 에틸아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기상들을 MgSO4로 건조시키고 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔사를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 케톤 A14를 수득하였다.
순수 트리스-노닐옥시메틸티타늄 (10.1 mmol)을 2-구 둥근바닥 플라스크에 위치시키고 아르곤 분위기에 적용시켰다. THF 중의 케톤 A14 (4.65 mmol)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반시켰다. 올레산 (17.8 mmol)을 첨가하고 혼합물을 110 ℃까지 가열시켰다. 생성물을 농축시키고 플래시 크로마토그래피로 정제하여 중간체 3차 알코올을 수득하였다.
디클로로에탄 (5 ㎖) 중의 PMB 에테르 (0.1 mmol)의 용액에 POCl3 (0.5 mmol)을 첨가하고 실온에서 교반시켰다. 반응의 완료 후, 빙수(ice water)로 퀀칭시키고 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로에탄 (2 x 5 ㎖)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 감압 하에서 농축시키고 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, EtOAc
Figure 112016012345703-pct00139
:
Figure 112016012345703-pct00140
헥산)로 정제하여 알코올 A13을 제공하였다.
실시예 36.3
Figure 112016012345703-pct00141
오븐-건조된 250-㎖의 둥근바닥 플라스크를 건조 THF (100 ㎖) 중의 1,3-프로판디티올 (20 mmol, 1.1 당량) 및 테트라부틸암모늄이오다이드 (0.40 mmol, 2.2 mol %)로 충전시켰다. 혼합물을 실온에서 교반시키고 소듐하이드라이드 (광유 중의 60% 현탁액, 20 mmol, 1.1 당량)를 소량씩 첨가하였다. 그 결과의 혼합물을 30 분 동안 교반시키고, 계속해서 벤질브로마이드 (18 mmol)를 적가하였다. 용액을 1 시간 동안 실온에서 교반시키고, 계속해서 프릿 깔대기(frit funnel) 상에서 여과하고 진공 하에서 농축시켰다. 그 결과의 조 오일(crude oil)을 진공 하에서 증류시켜 무색 오일로서 표제 화합물 A20을 제공하였다.
무수 DMF (2 ㎖) 중의 A19 (0.11 mmol)의 용액에 티올 A20 (0.22 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 18 시간 동안 교반시키고 계속해서 진공 중에서 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 A18을 제공하였다.
일반식 A20의 다양한 디티올 유도체들이 상용적으로 획득가능하다.
실시예 36.4
Figure 112016012345703-pct00142
새로이 절단한 나트륨 금속 (4.67 mmol)을 이소프로판올 (10 ㎖) 중에 용해시키고 벤질머캅탄 (6.23 mmol)을 첨가하였다. 이소프로판올 (5 ㎖) 중의 4-(브로모메틸)시클로펜트-1-엔 (1.55 mmol)의 용액을 첨가하고 용액을 환류 하에서 4 일 동안 가열시켰다. 용액이 실온까지 냉각되도록 하고, 물 (50 ㎖)로 희석시키고 디에틸에테르 (3X50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물들을 0.1 M 수산화칼륨 (2X50 ㎖)으로 세척하고, 건조시키고 증발시켜 조 A25(crude A25)를 수득하였다. 실리카겔 상에서 에틸아세테이트/헥산으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 표제 화합물 A25를 제공하였다.
자석교반막대, 격막 구비 입구(septum inlet), 오일 버블러(oil bubbler) 및 환류 응축기가 장착된 건조 50-㎖ 플라스크 를 질소로 플러싱시켰다. 0 ℃에서 플라스크에 알켄 A25 (5.5 mmol) 및 건조 THF (2.5 ㎖)를 그리고 계속해서 9-BBN의 용액 (THF 중의 0.5 M 용액, 5.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 천천히 실온까지 승온시키고 계속해서 4 내지 6 시간 동안 교반시켜 B-알킬-9-BBN A24의 용액을 수득하였다.
상기 A24의 보란 용액에 DMF-THF (25 ㎖), PdCl2(dppf) (0.15 mmol), 할로알켄 (5 mmol) 및 분말화된 K3PO4 (6 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 8 시간 동안 50 ℃에서 교반시키고 계속해서 물에 부어넣었다. 생성물을 벤젠으로 추출하고, 물로 4회 세척하고, MgSO4. 상에서 건조시켰다. 실리카겔 상에서 에틸아세테이트/헥산으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 표제 화합물 A22를 제공하였다.
실시예 36.5
Figure 112016012345703-pct00143
0 ℃에서 건조 메탄올 중의 1.1 당량의 알데히드 A30의 용액에 건조 메탄올 중의 1.3 당량의 아민 A28을 아르곤 분위기 하에서 적가하였다. 혼합물을 별도의 10 분 동안 실온에서 교반시키고 후속하여 건조 메탄올 중의 1.0 당량의 산 A27 및 1.1 당량의 이소시아나이드 A29를 첨가하였다. 반응 혼합물을 24 내지 48 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 그 결과의 용액을 디클로로메탄으로 희석시키고 1 N HCl 수용액으로 후속하여 포화 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기층들을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸아세테이트)로 정제하였다.
실시예 36.6
Figure 112016012345703-pct00144
A33의 합성:
에틸알코올 (80 ㎖) 및 물 (27 ㎖) 중의 아지드 A35 (0.03 mol) 및 염화암모늄 (0.07 mol)의 용액에 아연 분말 (0.04 mol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 또는 환류하면서 격렬하게 교반시켰다. 반응이 끝난 후, 에틸아세테이트 (200 ㎖) 및 수성 암모니아 (10 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다.
A31의 합성:
산 A32 (1 mmol) 및 아민 A33 (1 mmol)을 3.5 ㎖ 메탄올 중의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 염산염 (1 mmol)과 3 시간 동안 실온에서 결합시켰다. 혼합물을 EtOAc (20 ㎖)로 희석시키고 물 (10 ㎖), 1 M HCl 수용액 (10 ㎖) 및 포화 NaHCO3 수용액 (10 ㎖)으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 중간체 알코올을 수득하였다.
THF (2 ㎖) 중의 NaH (0.83 mmol)의 현탁액을 0 ℃까지 냉각시키고, 계속해서 현탁액에 THF (4 ㎖) 중의 중간체 알코올 (0.17 mmol)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 환류시키고 계속해서 실온까지 냉각시켰다. 그 온도에서 혼합물에 THF (2 ㎖) 중의 A34 (0.11 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 12 시간 동안 환류시키고 계속해서 실온까지 냉각시켰다. 회전증발기로 용매를 제거한 후, 잔사를 CHCl3 중에 용해시키고 여과하였다. 여액을 회전증발기로 증발시키고 크로마토그래피를 수행하였다.
실온에서 디클로로에탄 (5 ㎖) 중의 PMB 에테르 (0.1 mmol)의 용액에 POCl3 (0.5 mmol)를 첨가하고 실온에서 교반시켰다. 반응의 완료 후, 빙수 중에서 퀀칭시키고 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로에탄 (2 x 5 ㎖)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 감압 하에서 농축시키고 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, EtOAc : 헥산)로 정제하여 대응하는 알코올 A31을 제공하였다.
실시예 36.7
Figure 112016012345703-pct00145
에폭사이드 A42 (5 mmol) 및 물 (2 ㎖)을 시험관 내로 도입시켰다. 아민 A41 (6mmol)을 일부 첨가하고 시험관을 0 ℃에서 방치하고 격렬한 교반 하에서 24 시간 동안 실온까지 가온시켰다. 물 (2 ㎖)을 첨가하고 수성 혼합물을 10 ㎖의 에틸아세테이트로 추출하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 용매를 제거하여 중간체 β-아미노알코올을 수득하였다. EtOAc (2 ㎖) 및 포화 NaHCO3 수용액 (1 ㎖) 중의 조 아민을 CbzCl (6 mmol)로 실온에서 처리하고 5 시간 동안 그 온도에서 교반시켰다. 혼합물을 EtOAc (3x 5 ㎖)로 추출하고, 유기 분획을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 알코올 A40을 수득하였다.
실시예 36.8
Figure 112016012345703-pct00146
브롬화물 A47 (8.26 mmol)을 NaOMe로 pH 9로 조정된 MeOH (5 ㎖) 중의 티올 A48과 반응시켰다. 혼합물을 16 시간 동안 실온에서 교반시키고 감압 하에서 농축시켜 중간체 PMB 에테르를 수득하였다.
디클로로에탄 (5 ㎖) 중의 PMB 에테르 (0.1 mmol)의 용액에 POCl3 (0.5 mmol)을 첨가하고 실온에서 교반시켰다. 반응의 완료 후, 빙수 중에서 퀀칭시키고 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로에탄 (2 x 5 ㎖)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 감압 하에서 농축시키고 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, EtOAc : 헥산)으로 정제하여 대응하는 알코올 A46을 제공하였다.
실시예 36.9
Figure 112016012345703-pct00147
산 A51 (1 mmol) 및 아민 A50 (1 mmol)을 3.5 ㎖ 메탄올 중의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 염산염 (1 mmol)과 3 시간 동안 실온에서 결합시켰다. 혼합물을 EtOAc (20 ㎖)로 희석시키고 물 (10 ㎖), 1 M HCl 수용액 (10 ㎖) 및 포화 NaHCO3 수용액 (10 ㎖)으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 알코올 A49를 수득하였다.
실시예 36.10
Figure 112016012345703-pct00148
효율적인 교반을 수반하면서 피리딘 (60 ㎖) 중의 A53 (80 mmol)의 용액에 MsCl (80 mmol)을 소량씩 30 분 동안 20 ℃에서 첨가하였다. 30 분 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 유지시키고, CH2Cl2 (100 ㎖)로 희석시키고, 수성 세척액이 산성이 될 때까지 2 N HCl 수용액으로 세척하였다. 수층(H2O layer)을 CH2Cl2 (3 X 50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 건조시키고 (Na2SO4), 농축시키고, 농축시켜 중간체 메실레이트(mesylate)를 수득하였다.
실온에서 소듐벤질설파이드 (4.1 mmol)를 소량씩 DMF (5 ㎖) 중의 중간체 메실레이트 (2.7 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 3 시간 후, 혼합물을 톨루엔 (100 ㎖)으로 희석시키고, 물 (25 ㎖) 및 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 진공 중에서 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 티오에테르 A52를 수득하였다.
실시예 36.11
Figure 112016012345703-pct00149
효율적인 교반을 수반하면서 피리딘 (6 ㎖) 중의 디올 A55 (8 mmol)의 용액에 TsCl (8 mmol)을 소량씩 30 분 동안 20 ℃에서 첨가하였다. 30 분 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 유지시키고, CH2Cl2 (100 ㎖)로 희석시키고, 수성 세척액이 산성이 될 때까지 2 N HCl 수용액으로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (3 X 50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켜 중간체 토실레이트(tosylate)를 수득하였다.
5 ㎖의 건조 HMPA 중의 중간체 토실레이트 (0.67 mmol)의 용액을 빙욕(ice bath) 내에서 질소 하에서 냉각시켰다. 이 혼합물을 20 ㎖의 건조 HMPA 중의 NaSBn (10 mmol)의 차가운 용액 (건조 에테르 중의 400 ㎎의 나트륨 및 과량의 BnSH로부터 제조되고 후속하여 제거되고 HMPA로 치환됨)에 첨가하였다. 첨가 후, 용액을 냉장고 (-15 ℃) 내에 14 시간 동안 저장하였다. 계속해서 이를 100 ㎖의 물로 처리하고 에테르로 3회 추출하였다. 에테르 추출물을 물로 4회 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 계속해서 용매를 진공 하에서 제거하고 잔사 (140 ㎎)를 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 티오에테르 A54를 수득하였다.
실시예 36.12
Figure 112016012345703-pct00150
새로이 증류된 CH2Cl2 (20 ㎖)에 질소 하에서 Et2Zn (헥산 중의 1.0 M) (20.0 mmol)을 첨가하였다. 용액을 빙욕 내에서 냉각시키고 계속해서 CH2Cl2 (10 ㎖) 중의 트리플루오로아세트산 (20.0 mmol)의 용액을 주사기를 경유하여 반응 혼합물 내로 적하하였다(dripped). 20 분 동안의 교반에 의하여, CH2Cl2 (10 ㎖) 중의 CH2I2 (20.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 별도의 20 분의 교반 후, CH2Cl2 (10 ㎖) 중의 디올 A58 (10.0 mmol)의 용액을 첨가하고, 빙욕을 제거하였다. 별도의 30 분의 교반 후, 0.1 N HCl (50 ㎖) (달리는 포화 NH4Cl 수용액 또는 Et3N으로 그리고 후속하여 포화 NaHCO3 수용액으로) 및 헥산 (25 ㎖)으로 퀀칭시키고, 층들을 분리시켰다. 수성층을 헥산으로 추출하였다. 결합된 유기층들을 포화 NaHCO3, H2O 및 염수로 세척하고 계속해서 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에테르 = 50/1)로 정제하여 디올 A57을 수득하였다.
효율적인 교반을 수반하면서 피리딘 (6 ㎖) 중의 디올 A57 (8 mmol)의 용액에 TsCl (8 mmol)을 소량씩 30 분 동안 20 ℃에서 첨가하였다. 30 분 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 유지시키고, CH2Cl2 (100 ㎖)으로 희석시키고, 수성 세척액이 산성이 될 때까지 2 N HCl 수용액으로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (3 X 50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켜 중간체 토실레이트를 수득하였다.
5 ㎖의 건조 HMPA 중의 중간체 토실레이트 (0.67 mmol)의 용액을 빙욕 내에서 질소 하에서 냉각시켰다. 이 혼합물을 20 ㎖의 건조 HMPA 중의 NaSBn (10 mmol)의 차가운 용액 (건조 에테르 중의 400 ㎎의 나트륨 및 과량의 BnSH로부터 제조되고 후속하여 제거되고 HMPA로 치환됨)에 첨가하였다. 첨가 후, 용액을 냉장고 (-15 ℃) 내에 14 시간 동안 저장하였다. 계속해서 이를 100 ㎖의 물로 처리하고 에테르로 3회 추출하였다. 에테르 추출물을 물로 4회 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 계속해서 용매를 진공 하에서 제거하고 잔사 (140 ㎎)를 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 티오에테르 A56을 수득하였다.
실시예 36.13
Figure 112016012345703-pct00151
CH2Cl2 (120 ㎖) 중의 디올 A61 (16.1 mmol), 트리에틸아민 (24.1 mmol) 및 DMAP (0.16 mmol)의 용액에 TBDMSCl (19.3 mmol)를 1 시간에 걸쳐 0 ℃에서 5 분량(5 portions)씩 첨가하였다. 그 결과의 불균질한 반응 혼합물을 점진적으로 실온까지 가온시켰다. 혼합물을 12 시간 동안 교반시킨 후 물 및 CH2Cl2로 희석시켰다. 유기층을 연속적으로 포화 NaHCO3 수용액, 포화 NH4Cl 수용액, 물 및 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 엷은 황색 오일을 진공 크로마토그래피로 정제하여 중간체 실릴에테르(silyl ether)를 수득하였다.
밀봉된 관 내에서 iPrOH (1 ㎖) 중의 중간체 실릴에테르 (1.0 mmol) 및 촉매 (활성탄 상의 Rh 또는 Ru, N.E. Chemcat; 기질의 10 중량%)의 혼합물을 60 ℃에서 5 기압의 수소에서 교반시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 MeOH (20 ㎖)로 희석시키고 막여과 (Millipore, Millex-LH, 0.45 ㎜)를 통한 여과에 의하여 촉매를 제거하였다. 여액을 진공 중에서 농축시켜 대응하는 디칼린(decalin)을 수득하였다.
효율적인 교반을 수반하면서 피리딘 (6 ㎖) 중의 중간체 디칼린 알코올 (8 mmol)의 용액에 TsCl (8 mmol)을 소량씩 30 분 동안 20 ℃에서 첨가하였다. 30 분 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 유지시키고, CH2Cl2 (100 ㎖)으로 희석시키고, 수성 세척액이 산성이 될 때까지 2 N HCl 수용액으로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (3 X 50 ㎖)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켜 토실레이트 A60을 수득하였다.
5 ㎖의 건조 HMPA 중의 토실레이트 A60 (0.67 mmol)의 용액을 빙욕 내에서 질소 하에서 냉각시켰다. 이 혼합물을 20 ㎖의 건조 HMPA 중의 NaSBn (10 mmol)의 차가운 용액 (건조 에테르 중의 400 ㎎의 나트륨 및 과량의 BnSH로부터 제조되고 후속하여 제거되고 HMPA로 치환됨)에 첨가하였다. 첨가 후, 용액을 냉장고 (-15 ℃) 내에 14 시간 동안 저장하였다. 계속해서 이를 100 ㎖의 물로 처리하고 에테르로 3회 추출하였다. 에테르 추출물을 물로 4회 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 계속해서 용매를 진공 하에서 제거하고 잔사 (140 ㎎)를 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 중간체 실릴에테르를 수득하였다.
중간체 실릴에테르 (0.235 mmol)를 실온에서 THF (1 ㎖) 중에 용해시키고, 후속하여 70% HF-피리딘 (0.2 ㎖)을 첨가하였다. 2 일 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 주의해서 포화 NaHCO3 수용액으로 퀀칭시키고 그 결과의 용액을 EtOAc로 희석시켰다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4, 상에서 건조시키고 진공 중에서 농축시켰다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 알코올 A59를 수득하였다.
실시예 36.14
Figure 112016012345703-pct00152
CH2Cl2 (10 ㎖) 중의 스쿠아릭 에틸에스테르(squaric ethyl ester) A67 (0.5 mmol), A68 (100 ㎎, 0.588 mmol) 및 Et3N (15 방울)의 용액을 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 계속해서 이를 감압 하에서 농축시켰다. 그 결과의 조 잔사, CH2Cl2 (10 ㎖) 중의 A66 (1.1 mmol) 및 Et3N (15 방울)을 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 계속해서 이를 감압하에서 농축시키고 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. PMB-에테르 (0.444 mmol)를 아세톤 (4.5 ㎖) 및 물 (0.5 ㎖) 중에 용해시켰다. CAN (0.845 mmol)을 고체로서 첨가하고, 후속하여 아세톤 (0.9 ㎖) 및 물 (0.1 ㎖) 중의 CAN (0.845 mmol)의 용액을 70 분에 걸쳐 적가하였다. 추가의 15 분 후, 반응을 중탄산나트륨 수용액에 부어넣고, 클로로포름으로 추출하였다. 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 65를 수득하였다.
실시예 36.15
Figure 112016012345703-pct00153
트리에틸아민 (0.359 ㎖)을 상용적으로 획득가능한 S-벤질-(R)-시스테이놀 (2.56 mmol)의 THF (7.50 ㎖) 중의 용액에 첨가하였다. 10 분 간의 교반 후, 디-3차-부틸디카르보네이트(di-tert-butyldicarbonate) (2.56 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용매를 감압 하에서 제거하고; 잔사를 에틸아세테이트 중에 용해시키고 물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, Na2SO4, 로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 무색 오일로서 A69를 수득하였다.
실시예 37: 본 발명에 따른 사카라이드의 추가의 실시예들:
Figure 112016012345703-pct00154
화학식: C25H41N3O17S; 분자량 = 687.68;
Figure 112016012345703-pct00155
화학식: C23H36F2N2O16S; 분자량 = 666.61;
Figure 112016012345703-pct00156
화학식: C19H32N2O10S, 분자량 = 480.54;
Figure 112016012345703-pct00157
화학식: C12H22O6S2, 분자량 = 326.43;
Figure 112016012345703-pct00158
화학식: C24H40N2O10S, 분자량 = 548.66;
Figure 112016012345703-pct00159
화학식: C18H32N2O11S, 분자량 = 484.53;
실시예 38: 당포합체의 합성- CRM197에의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 공액화
실온에서 0.1 M 인산나트륨 완충제 (NaPi) pH 7.4 (1.33 ㎖) 중의 CRM197 (2 ㎎, 34.5 nmol)의 교반된 용액에 DMF (40 ㎕) 중의 N-숙신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP) (1.05 ㎎, 3.4 μmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 그 온도에서 교반시키고, 막여과 (Amicon 4 ㎖ Ultra centrifuge membranes, 10 kDa 컷-오프)를 사용하여 농축시켰다. 단백질 용액을 멸균수로 4 ㎖까지 희석시키고 다시 농축시켰다. 이 과정을 3회 반복하고 용액을 멸균수를 사용하여 0.5 ㎖까지 희석시켰다. 분석을 위하여 20㎕를 취하고, 단백질 용액을 막여과를 사용하여 0.1 M NaPi pH 8.0 (0.5 ㎖)에 재-완충시켰다. 실온에서 0.1 M NaPi pH 8.0 (0.2 ㎖) 중의 디설파이드 18* (단량체에 대하여 1.44 ㎎, 2.33 μmol)을 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP, pH 7.4의 100nM 저장 용액(stock solution) 25㎕)으로 처리하고, 1 시간 동안 그 온도에서 아르곤 분위기 하에 방치하고 활성화된 단백질의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반시키고, 막여과 (상기 참조)를 사용하여 멸균수로 세척하였다. 별도의 분석용 샘플을 취하고, 용액을 0.1 M NaPi pH 7.4 (0.5 ㎖)에 재-완충시켰다. 계속해서 당포합체를 실온에서 100 ㎕ 중의 L-시스테인 (0.625 ㎎, 5.1 μmol)으로 처리하였다. 혼합물을 2 시간 동안 그 온도에서 방치하고 막여과로 정제하였다. 당포합체 내로의 글리칸의 내포를 MALDI-TOF-MS (포지티브 모드)로 평가하였다:
측정된 분자량:
CRM197: 58100 m/z
CRM197-SBAP 공액화물: 61700 m/z (대략 19개의 SBAP기의 내포)
CRM197-SBAP-당포합체: 66000 m/z (대략 5.9 분자의 2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→1)-2-(티오)에탄올의 내포).
실시예 39: 면역화 실험
마우스 (6 내지 8 주령 암컷 NMRI 마우스, Charles River)를 명반 (Alhydrogel, Brenntag)으로 또는 명반 없이 제형화한 실시예 38에서 합성된 CRM197-SBAP-당포합체 (4 ㎍ 합성 글리칸에 해당)로 피하로 100 ㎕의 총 용적으로 0, 14 및 28일에서 면역화시켰다. 대조군은 동등하게 명반 단독 또는 PBS로 처리되었다. 혈액을 0, 14, 28 및 35 일차에 수집하고 면역 반응을 글리칸 마이크로어레이 및 효소결합면역흡착분석법으로 평가하였다.
명반으로 보조된 당포합체로 면역화된 마우스의 서브셋에서 0 일차에 비하여 35 일차에서 500 및 2500의 종말 적정(endpoint titer)으로 원생의 Sp1 폴리사카라이드에 대한 면역 반응이 발견되었다.

Claims (16)

  1. 일반식 (I)의 사카라이드 및 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염:
    Figure 112021002456161-pct00210

    여기에서 A는 (CH2)o1을 나타내고;
    o1은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되는 정수를 나타내고;
    M, N 및 P는 서로에 대하여 독립적으로 하기 당 단편들 중의 하나를 나타내고:
    Figure 112021002456161-pct00211

    여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 그리고 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
    n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이다.
  2. 일반식 (I)의 사카라이드의 합성 방법:
    Figure 112021002456161-pct00212

    여기에서 A는 (CH2)o1을 나타내고;
    o1은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되는 정수를 나타내고;
    M, N 및 P는 서로 독립적으로 하기 당 단편들 중의 하나를 나타내고:
    Figure 112021002456161-pct00213

    여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-SH 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 일반식 (I) 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 그리고 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-SH 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
    n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이고,
    하기의 단계를 포함함:
    A1) 하기 식의 화합물 2를 하기 식의 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 4를 수득하고:
    Figure 112021002456161-pct00214

    여기에서 P1 내지 P3은 보호기를 나타냄,
    Figure 112021002456161-pct00215

    여기에서 P4는 보호기를 나타냄,
    Figure 112021002456161-pct00216

    여기에서 P1 내지 P4 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    화합물 4 상의 보호기 P1 내지 P4의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 5를 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00217

    여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 5가 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 6을 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00218

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    화합물 4에 대하여 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 7을 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00219

    여기에서 P5는 보호기이고 P1, P3, P4 및 A는 상기와 같이 정의됨.
    또는
    A2) 하기 일반식의 화합물 8을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 9를 제공하고
    Figure 112021002456161-pct00220

    여기에서 P6 및 P7은 보호기를 나타냄,
    Figure 112021002456161-pct00221

    여기에서 P6, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 9 상의 보호기 P4, P6 및 P7의 제거를 수행하여 하기 일반식의 모노사카라이드 디설파이드 10을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00222

    여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 모노사카라이드 디설파이드 10이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 모노사카라이드 11을 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00223

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
    또는
    화합물 9에 대한 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 12를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00224

    여기에서 P4, P7 및 A는 상기한 바와 같이 정의됨,
    또는
    A3) 하기 일반식의 화합물 13을 화합물 3과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 14를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00225

    여기에서 P8 내지 P11은 보호기를 나타냄,
    Figure 112021002456161-pct00226

    여기에서 P4, P8 내지 P11은 상기와 같이 정의됨
    그리고
    화합물 14의 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 15를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00227

    여기에서 P4, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
    그리고
    B1) 화합물 7을 화합물 13과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 16을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00228

    여기에서 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    화합물 16 상의 보호기 P1, P3 내지 P5, P8 내지 P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 17을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00229

    여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 17이 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 18을 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00230

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    화합물 16 상의 보호기 P10의 선택적 제거를 수행하여 하기 일반식의 화합물 19를 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00231

    여기에서 P1, P3 내지 P5, P8, P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨.
    또는
    B2) 화합물 15를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 20을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00232

    여기에서 P4, P6 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨
    그리고
    아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 20 상의 보호기 P4, P6 내지 P9, P11의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 21을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00233

    여기에서 A는 상기와 같이 정의되고 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 21이 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 22를 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00234

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    화합물 20 상의 보호기 P6의 선택적 제거를 수행하여 하기 일반식의 화합물 23을 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00235

    여기에서 P4, P7 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    B3) 화합물 12를 화합물 2와 반응시켜 하기 일반식의 화합물 24를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00236

    여기에서 P1 내지 P4, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨,
    그리고
    아지도기의 아세트아미도기로의 전환 및 화합물 24 상의 보호기 P1 내지 P4 및 P7의 제거를 수행하여 하기 일반식의 디사카라이드 디설파이드 25를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00237

    여기에서 A는 상기와 같이 정의되고, 그리고 여기에서 디사카라이드 디설파이드 25가 추가로 환원제로 처리되어 하기 일반식의 디사카라이드 26를 제공하거나:
    Figure 112021002456161-pct00238

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    화합물 24 상의 선택적 탈보호를 수행하여 하기 일반식의 화합물 27을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00239

    여기에서 P12는 보호기이고 그리고 P1, P3, P4, P7 및 A는 상기와 같이 정의됨.
    그리고
    C1) 화합물 19를 화합물 8과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 28을 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00240

    여기에서 P1, P3 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    여기에서 하기 화학식의 화합물 29를 수득하기 위하여 보호기 P6이 보호기 P13으로 치환되고:
    Figure 112021002456161-pct00241

    여기에서 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    아세토아미도기 중의 아지도기의 전환 및 보호기 P1, P3 내지 P5, P7 내지 P9, P11, P13의 개열(cleavage)에 의한 화합물 29의 트리사카라이드 디설파이드 30으로의 전환, 여기에서 화합물 30은 하기 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00242

    그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    및
    환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 30의 트리사카라이드 31로의 전환, 여기에서 화합물 31은 하기 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00243

    그리고 여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
    또는
    C2) 화합물 23을 화합물 2와 반응시켜 하기 일반식의 화합물 32를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00244

    여기에서 P1 내지 P4, P7 내지 P9, P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    아세토아미도기 중의 아지도기의 전환 및 보호기 P1 내지 P4, P7 내지 P9, P11의 개열에 의한 화합물 32의 트리사카라이드 디설파이드 33으로의 전환, 여기에서 화합물 33은 하기의 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00245

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    및
    환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 33의 트리사카라이드 34로의 전환, 여기에서 화합물 34는 하기 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00246

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    또는
    C3) 화합물 27을 화합물 13과 반응시켜 하기 일반식의 화합물 35를 제공하고:
    Figure 112021002456161-pct00247

    여기에서 P1, P3, P4, P7 내지 P11 및 A는 상기와 같이 정의됨;
    그리고
    아세토아미도기의 아지도기로의 전환 및 보호기 P1, P3, P4, P7 내지 P11의 개열에 의한 화합물 35의 트리사카라이드 디설파이드 36로의 전환, 여기에서 화합물 36은 하기 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00248

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨;
    및
    환원제로의 처리에 의한 트리사카라이드 디설파이드 36의 트리사카라이드 37로의 전환, 여기에서 화합물 37은 하기 일반식임:
    Figure 112021002456161-pct00249

    여기에서 A는 상기와 같이 정의됨.
  3. 제 2 항에 있어서,
    추가로 단계 D:
    D) 일반식 (I)의 화합물의 염을 준비하거나 또는 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 화합물의 염의 동결건조물을 준비하는 단계
    를 더 포함하는 합성 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    화합물 2와 3, 화합물 2와 12 및 화합물 2와 23 간의 반응이 (디메틸티오)메틸설포니움 트리플루오로메탄설포네이트 및 2,4,6-트리-3차-부틸피리딘의 존재 중에서 비극성 용매와 극성 비양성자성 용매의 혼합물 내에서 수행되는 합성 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    화합물 29를 수득하기 위한 화합물 28 상의 보호기 P6의 보호기 P13으로의 치환이 용매 또는 용매의 혼합물 중에서의 화합물 28과 하이드라진 또는 하이드라지늄염의 반응을 포함하는 제1 단계 및 비극성 용매 중에서 제1 단계 후 수득된 생성물의 베닐-O-CH2-S-시클로헥실(BnOCH2SCy), (디메틸티오)메틸설포니움 트리플루오로메탄설포네이트 및 2,4,6-트리-3차-부틸피리딘으로의 처리에 의한 제2 단계의 두 단계로 수행되는 합성 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    보호기의 개열에는 극성 비양성자성 및 극성 양성자성 용매의 혼합물 중에서의 염기로의 처리에 의한 염기-불안정성 보호기의 제1 개열; 및 극성 양성자성 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물 중에서의 나트륨 및 암모니아에의 노출에 의한 수소화에 민감한 보호기의 제2 개열이 포함되는 합성 방법.
  7. 하기 일반식 (II)의 중간체 또는 이러한 사카라이드의 약제학적으로 수용가능한 염:
    Figure 112021002456161-pct00250

    여기에서 A는 (CH2)o1을 나타내고;
    o1은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되는 정수를 나타내고;
    M, N 및 P는 서로 독립적으로 하기 단편들 중의 하나이고:
    Figure 112021002456161-pct00251

    여기에서 당 단편 S1, S2, S3는 O-글리코시드 결합을 경유하여 서로 그리고 -O-A-S- 단편에 연결되고, 각 당 단편 S1, S2 및 S3는 단편 H-(P)n3-(N)n2-(M)n1-O-A-S- 내에 최대로 한 번 제공되고, 당 단편 S1은 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S3에 연결될 수 없고, 당 단편 S3는 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S2에 연결될 수 없고, 당 단편 S2는 동시적으로 -O-A-S- 및 당 단편 S1에 연결될 수 없고, 그리고
    n1, n2 및 n3는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고, 여기에서 정수 n1, n2 및 n3의 적어도 하나는 1이다.
  8. 청구항 1에 따른 일반식 (I)의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시키는 것에 의해 수득되는 당포합체로서, 상기 면역원성 담체는 디프테리아 독소(diphtheria toxin), CRM197, 소 혈청 알부민(Bovin Serum Albumin)인, 당포합체.
  9. 그들의 협막 폴리사카라이드 내에
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    로부터 선택되는 사카라이드 구조를 포함하는 박테리아 연관 질병에 대한 면역화에서의 백신으로서 사용하기 위한 청구항 8에 따른 당포합체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에 1형인 당포합체.
  11. 제 9 항에 있어서,
    박테리아 연관 질병에 폐렴, 수막염, 중이염, 균혈증 및 만성 기관지염, 축농증, 관절염 및 결막염의 급성악화가 포함되는 당포합체.
  12. 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 동해방지제, 동결건조보호제, 부형제 및/또는 희석제와 함께 청구항 8에 따른 당포합체 또는 청구항 1에 따른 사카라이드 또는 청구항 7에 따른 중간체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 스트렙토코커스 뉴모니에 박테리아와 연관된 질병에 대한 면역화에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    스트렙토코커스 뉴모니에 박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에 1형, 스트렙토코커스 뉴모니에 4형, 스트렙토코커스 뉴모니에 9V형, 스트렙토코커스 뉴모니에 2형, 스트렙토코커스 뉴모니에 19F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 3형, 스트렙토코커스 뉴모니에 19A형, 스트렙토코커스 뉴모니에 12F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 31형, 스트렙토코커스 뉴모니에 7F형, 스트렙토코커스 뉴모니에 5형, 스트렙토코커스 뉴모니에 14형, 스트렙토코커스 뉴모니에 6A형, 스트렙토코커스 뉴모니에 6B형, 스트렙토코커스 뉴모니에 18C형 및 스트렙토코커스 뉴모니에 23F형을 포함하거나 이들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  14. 그들의 협막 폴리사카라이드 내에
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    로부터 선택되는 사카라이드 구조를 포함하는 박테리아 연관 질병의 진단을 위한 면역학적 분석에서의 표지자로서 사용하기 위한 청구항 1에 따른 사카라이드.
  15. 그들의 협막 폴리사카라이드 내에
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실
    (α-D-갈락토피라노실)우로네이트-(1→3)-2-아세트아미도-4-아미노-2,4,6-트리디옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→4)-(α-D-갈락토피라노실)우로네이트
    로부터 선택되는 사카라이드 구조를 포함하는 박테리아 연관 질병의 진단을 위한 면역학적 분석에서의 표지자로서 사용하기 위한 청구항 7에 따른 중간체.
  16. 삭제
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