KR20200106034A - 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 백신 - Google Patents

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샤라바띠 과디할리 파라메스와라파
마릴다 피 리스보아
실비아 오스트리치
제시카 프지고다
보파나 모난다
아른 본 보닌
클라니 리베프 페레이라
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박실론 아게
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Abstract

본 발명는 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac, 및 O8 O-폴리사카라이드 및 카르바페넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258 O-폴리사카라이드와 연관된 화학식(I)의 합성 사카라이드 및 이의 컨주게이트에 관한 것이다. 상기 합성 사카라이드, 상기 컨주게이트 및 상기 합성 사카라이드 또는 상기 컨주게이트를 함유하는 약제학적 조성물은 클렙시엘라 뉴모니아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 더욱이 화학식(I)의 합성 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서 마커로서 유용하다.

Description

클렙시엘라 뉴모니아에 대한 백신
본 발명은 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac, 및 O8 O-폴리사카라이드 및 카르바파넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258 O-폴리사카라이드와 관련된 화학식(I)의 합성 사카라이드 및 이의 컨주게이트에 관한 것이다. 상기 합성 사카라이드, 상기 컨주게이트 및 상기 합성 사카라이드 또는 상기 컨주게이트를 함유하는 약제학적 조성물은 클렙시엘라 뉴모니아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 더욱이, 화학식(I)의 합성 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서 마커로서 유용하다.
클렙시엘라 뉴모니아는 대체로 기도 및 요로에서 대량 서식하고 클렙시엘라 뉴모니아 감염증(K. pneumoniae infection: KPI)을 유발시키는 그램-음성, 조건적 혐기성, 간균(rod-shaped bacterium)이다. KPI는 주로 면역 약화된 환자에 영향을 주는 병원내 감염증의 주된 원인이다. 지난 십년 동안, 클렙시엘라 뉴모니아에 의해서 유발된 감염증은 거의 모든 이용 가능한 항미생물제에 내성인 균주(strain)의 출현 및 이들의 세계적인 전파로 인해서 건강 관리 설정에 중요한 도전이 되고 있다. 클렙시엘라 뉴모니아에 의해서 유발된 감염증은 높은 이병율 및 사망율의 원인이다. 따라서, 클렙시엘라 뉴모니아에 의해서 유발된 감염증의 방지가 고도로 요구되며, 위험 군의 백신접종이 가장 비용 효율적이고 가장 강력한 수단이다.
대부분의 박테리아와 같이, 클렙시엘라 뉴모니아는 일반적으로 박테리아 표면 상에 복잡한 폴리사카라이드로 구성된 협막을 생성시키며, 이는 고도로 면역원성 및 비독성이다. 단백질과 비교하여, 탄수화물은 진화론적으로 더욱 안정하고, 일련의 일반적으로 사용되는 백신에서 활용되었다. 캐리어 단백질에 공유적으로 연결되는 때에, 올리고사카라이드 항원은 오래 지속되는 T-세포-의존성 보호를 유발시킬 수 있다. 클렙시엘라 뉴모니아는 전형적으로는 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 협막 폴리사카라이드(CPS, K-항원) 둘 모두를 발현하고, 이들은 이들 종의 병독성의 원인이다. LPS는 상이한 수의 올리고사카라이드 반복 단위(RU)를 함유하는 O-특이적 폴리사카라이드(O-PS), 코어 올리고사카라이드 및 지질 A로 형성된 주요 표면 항원이다. O-PS 구조(O-항원)는 클렙시엘라 균주의 O-혈청형을 정의한다. 클렙시엘라 뉴모니아 O-항원의 가변성은 현재 9가지의 주요 O-혈청형: O1, O2, O2ac, O3 (O3a 및 O3b를 포함함), O4, O5, O7, O8, O12 및 이들 혈청군 내의 새로운 서브타입(subtype), 예컨대, 혈청형 O2의 서브타입 O2a, O2ab, O2ae, O2aeh, 및 O2afg로 제한된다. 클렙시엘라 뉴모니아는 또한 많은 협막(K) 유형으로 혈청학적으로 분류되었다. 따라서, 상이한 K 항원을 갖는 다양한 클렙시엘라 뉴모니아 균주가 특이적 O-항원 혈청형에 속한다. 예를 들어, O1 혈청형에 속하는 클렙시엘라 뉴모니아 균주의 많은 K-혈청형이 확인되었다(Infection and Immunity, 1983, p.56-61). O1 혈청형에 속하는 클렙시엘라 뉴모니아 균주의 대부분의 인기 있는 K-혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70이다.
최근, 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP)가 출현하여 전세계적으로 확산되었다. 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP)는 매우 제한된 치료 옵견으로 인해서 주요 건강 우려사항이다. CRKP는 일반적으로 베타-락탐 유형 항생제를 분해할 수 있는 카바페넴아제(carbapenemase)를 갖는다. 서열 타입(sequence type: ST) 258로 일컬어지는 특이적 계통은 KPC-생성 클렙시엘라 감염증의 대부분에 대에서 원인인 것으로 밝혀졌다. 또한 CRKP ST258 균주는 상이한 협막 폴리사카라이드(CPS)를 갖는 것으로 공지되어 있다.
클렙시엘라 뉴모니아의 리포폴리사카라이드(LPS) 및 협막 폴리사카라이드 (CPS), 즉 클렙시엘라 뉴모니아의 두 표면 성분은 주로 항-클렙시엘라 백신에 대한 후보물질로서 논의되고 있다. CPS는 고도로 면역원성인 것으로 입증되었다. 그러나, 클렙시엘라 CPS 백신의 심각한 단점은 큰 수의 K-유형(80 가지 이상의 상이한 항원)이다. 클렙시엘라 백신에서의 LPS 항원의 이용에서, LPS의 지질 A에 의해서 주로 유발되는 부작용 독성 반응은 LPS-함유 백신에 의한 활성 면역화의 큰 단점을 나타낸다. 단백질과 비교하여, 탄수화물은 진화론적으로 더욱 안정하다. 캐리어 단백질에 공유적으로 연결되는 때에, 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드는 오래 지속되는 T-세포-의존성 보호를 유발시킬 수 있다(Microbiol Rev 1995, 591). 탄수화물 백신의 현재의 개발에 대한 검토를 위해서 문헌[Chem. & Biol. 2014, 21, 38-50]을 참조할 수 있다. 자동화된 탄수화물 합성 및 탄수화물-기반 백신의 개발에서의 이의 적용에 대한 검토를 위해서 문헌[arbohydr. Res. 2008, 343, 1889-1896]을 참조할 수 있다.
WO 2016/156338 A1은 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아에 의해서 유발된 질환의 치료를 위한 합성 카르바페넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 사카라이드 및 이의 컨주게이트를 개시하고 있다. 그 후에, 동일한 그룹이 글리칸 마이크로어레이(glycan microarray) 연구에 의해서 제조된 헥사사카라이드의 서브구조가 천연 CR-클렙시엘라 뉴모니아 CPS와 가교반응하는 단클론 항체 1C8에 의해서 인식되지 않음을 밝혀냈다(Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 13973- 13978).
논문[Vaccine 1986, 4, 15]은 K2, K3, K10, K21, K30 및 K55 혈청형으로부터 유도된 협막 폴리사카라이드로 구성된 6가의 클렙시엘라 백신에 대해서 보고하고 있다. 시험된 백신은 치명적인 실험용 클렙시엘라 K2 화상 패혈증에 대해서 고도로 방어서이어서, 백신접종 후 기능성 항체를 유도함을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
O-항원은 CPS보다 훨씬 덜 가변적이기 때문에, 코어 올리고사카라이드 및 지질 A가 없는 클렙시엘라 뉴모니아 LPS O-항원이 예방적 및 치료적 둘 모두의 면역요법을 위한 효능적인 표적 항원일 수 있다.
O-항원의 반복 단위, 즉, 클렙시엘라 뉴모니아의 O-폴리사카라이드가 해명되었다(Journal of Bacteriology, 1996, p.5205-5214; The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277 (28), pp.25070-25081) (도 1 및 2 참조).
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2a, O2ac의 O-폴리사카라이드(OPS)의 공통의 구조는 디사카라이드 반복 단위로 이루어져 있다:
→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→ (갈락탄 I).
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, 및 O8의 O-폴리사카라이드(OPS)의 공통의 구조는 디사카라이드 반복 단위로 이루어져 있다:
→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→ (갈락탄 II)
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는,
[→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n으로 이루어져 있다.
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O2a의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는,
→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→ 로 이루어져 있다.
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O2ac의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는,
[→5)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n으로 이루어져 있다.
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O2ae 및 O2aeh의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는,
Figure pct00001
로 이루어져 있다.
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O2afg, 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아 (CRKP) ST258 균주의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는,
Figure pct00002
로 이루어져 있다.
클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O8의 O-폴리사카라이드의 반복 단위는 펜타사카라이드로 이루어져 있다:
Figure pct00003
.
본 발명의 목적은 클렙시엘라 뉴모니아 O-폴리사카라이드와 관련이 있으며 클렙시엘라 뉴모니아에 의해서 유발된 질환에 대해서 보호하는 항체를 유도하는 방어성 면역원성 O-항원 에피토프, 즉, O-항원 에피토프를 함유하는 잘-정의된 화학식(I)의 합성 사카라이드를 제공하는 것이다. 상기 사카라이드는 면역원성 캐리어에 컨주게이션(conjugation)되어 클렙시엘라 뉴모니아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용한 컨주게이트(conjugate) 및 이의 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 더욱이, 화학식(I)의 합성 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서 마커로서 유용하다.
본 발명의 목적은 독립항의 교시내용에 의해서 해결된다. 본 발명의 추가의 유리한 특징, 양태 및 상세사항은 본원의 종속항, 설명, 도면 및 실시예로부터 입증된다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "연결기"는 사카라이드의 환원-말단 모노사카라이드를, 임의로 적어도 하나의 상호연결 분자에 결합시킴으로써, 면역원성 캐리어 또는 고체 지지체와 연결시킬 수 있는 분자 단편을 포함한다. 따라서, 연결기의 기능은 그 자체로 또는 상호연결 분자와 함께 환원-말단 모노사카라이드와 면역원성 캐리어 또는 고체 지지체 사이의 특별한 거리를 확립하고/거나, 유지하고/거나, 브릿징하는 것이다. 사카라이드와 면역원성 캐리어 사이의 특정의 거리를 유지시킴으로써, 면역원성 캐리어의 구조(예, 캐리어 단백질의 이차 구조)에 의한 면역원성 사카라이드 에피토프의 차폐(shielding)가 회피될 수 있다. 또한, 연결기는 반응성 기의 입체 장애를 감소시킴으로써 사카라이드와의 더 큰 커플링 효율을 제공한다(Methods in Molecular Medicine 2003, 87, 153-174). 더욱 특히, 연결기의 한 끝은 환원-말단 모노사카라이드의 아노머 중심에서의 외향 고리 산소 원자(exocyclic oxygen atom)에 연결되고, 다른 끝은 상호연결 분자와 질소 원자를 통해서 또는 면역원성 캐리어 또는 고체 지지체와 직접적으로 연결된다.
본 기술분야에서 공지된 사카라이드 컨주게이트(예, 사카라이드-캐리어 단백질 컨주게이트, 항체-약물 컨주게이트)를 위한 어또한 연결기가 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 사카라이드 캐리어 단백질 컨주게이트에 관한 많은 수의 공보로부터, 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 본원에서 개시된 사카라이드 및 컨주게이트에 적합한 연결기를 용이하게 예상할 수 있는데(참조, "Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification" in Chem Soc Rev. 2018, Advance Article, DOI: 10.1039/C8CS00495A; Acc Chem Res 2017, 50, 1270-1279), 그 이유는 사용된 연결기, 즉, 이의 길이 및 연결 유형이 사카라이드 컨주게이트의 면역원성에 상당한 영향을 주지 않기 때문이다(참조, PLoS ONE 2017, 12(12): e0189100, J. Immun. Meth. 1996, 191, 1-10). 그러한 적합한 연결기는 무해(즉, 비독성) 및 비-면역원성이고(즉, 컨주게이트에 의한 면역화에 대한 비방어성 항체의 형성을 유도하지 않고), 상업적으로 구입 가능한 이작용성 폴리에틸렌 글리콜((Journal of Controlled Release 2013, 172, 382-389, J. Immun. Meth. 1996, 191, 1-10), 글루타르산 유도체(J. Org. Chem. 2005, 70(18), 7123-7132), 아디프산 유도체, 스크아레이트 유도체(squarate derivative), 알킨, N-하이드록시석신이미드, 예컨대, 상업적으로 구입 가능한 MFCO-NHS(모노플루오로-치환된 사이클로옥틴 N-하이드록시석신이미드 에스테르), 말레이미드(문헌[Acc Chem Res 2017, 50, 1270-1279]에 개시됨), 또는 친수성 알킬 포스피네이트 및 설포닐(WO2014080251A1에 개시됨)을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "상호연결 분자"는 작용기 X와 작용기 Y를 함유하는 이작용성 분자를 나타내며, 여기에서, 작용기 X는 연결기 L상의 말단 아미노기와 반응할 수 있고, 작용기 Y는 면역원성 캐리어 또는 고체 지지체 상에 존재하는 작용기와 반응할 수 있다. 도 3은 상업적으로 구입 가능한 상호연결 분자의 예를 나타내지만, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 상호연결 분자를 본원에서 나타낸 예로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "애주번트(adjuvant)"는 면역학적 애주번트, 즉, 백신과 항원적으로 관련되지 않으면서, 백신에 함유된 주어진 항원에 대한 면역 반응을 향상시킴으로써 백신의 효과를 변형시키거나 강화시키는 백신 조성물에 사용되는 물질을 나타낸다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자에 있어서, 애주번트의 통상적으로 인식되는 예는 다음을 포함한다:
- 칼슘염 및 알루미늄 염(또는 이들의 혼합물)을 포함한 미네랄-함유 조성물. 여기에서, 칼슘염은 칼슘 포스페이트를 포함한다. 알루미늄 염은 하이드록사이드, 포스페이트, 설페이트 등을 포함하고, 그러한 염은 적합한 형태(예, 겔, 결정상, 비정질, 등)를 갖는다. 이들 염에 대한 흡착이 바람직하다. 미네랄 함유 조성물은 또한 금속 염의 입자로서 제형화될 수 있다. 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트로서 공지된 애주번트가 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 애주번트로서 일반적으로 사용되는 "하이드록사이드" 또는 "포스페이트" 애주번트 중 어떠한 것을 사용할 수 있다. "알루미늄 하이드록사이드"로 공지된 애주번트는 전형적으로는 알루미늄 옥시하이드록사이드 염이고, 이는 일반적으로는 적어도 부분적으로 결정상이다. "알루미늄 포스페이트"로서 공지된 애주번트는 전형적으로는, 흔히 또한 소량의 설페이트를 함유하는 알루미늄 하이드록시포스페이트(즉, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트)이다. 이들은 침전에 의해서 얻어질 수 있으며, 침전 동안의 반응 조건 및 농도가 염 중의 하이드록실에 대한 포스페이트의 치환도에 영향을 준다. 알루미늄 하이드록사이드와 알루미늄 포스페이트 둘 모두의 혼합물이 본 발명에 따른 제형에서 사용될 수 있고;
- 광범위한 범위의 식물 종의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코시드(sterol glycoside) 및 트리페르페노이드 글리코시드(triterpenoid glycoside)의 이종 군인 사포닌. 퀼리자 사포나리아, 몰리나 나무(Quillaia saponaria, Molina tree)의 껍질로부터의 사포닌이 애주번트로서 광범위하게 연구되었다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르나타(Smilax ornata)(sarsaprilla), 깁소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata) (brides veil), 및 사포나리아 오피시날리스(Saponaria oficianalis)(soap root)로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 사포닌 애주번트 제형은 정제된 제형, 예컨대, QS21 뿐만 아니라, 지질 제형, 예컨대, ISCOMs를 포함한다. 사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제되었다. QS 7, QS 17, QS 18, QS2 1, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함한, 이들 기술을 사용한 특이적 정제 분획이 확인되었다. 사포닌 제형은 또한 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 사포닌과 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(immunostimulating complex: ISCOM)로 일컬어지는 독특한 입자를 형성시키기 위해서 사용될 수 있다. ISCOM은 일반적으로는 포스포리피드, 예컨대, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함한다. 어떠한 공지된 사포닌이 ISCOM에 사용될 수 있다. 바람직하게는 ISCOM는 QuilA, QHA & QHC 중 하나 이상을 포함하고;
- 생분해성 및 비독성인 물질로부터 형성된 마이크로입자(즉, 직경 100 nm 내지 150 pm, 더욱 바람직하게는 직경 200 nm 내지 30 pm, 또는 500 nm 내지 10 pm). 그러한 비독성 및 생분해성 물질은 폴리(α-하이드록시 산), 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리카프로락톤을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니고;
- CD1d 리간드, 예컨대, α-글리코실세라미드, 피토스핑고신(phytosphingosine)-함유 α-글리코실세라미드, OCH, KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노실아미노)-1,3,4-옥타데칸트리올], CRONY-101, 3"-설포-갈락토실-세라미드; 7DW8-5 (Funakoshi Co., Ltd.)
- 면역자극 올리고뉴클레오티드, 그러한 CpG 모티프(motif) 함유 올리고뉴클레오티드(구아노신 잔기에 포스페이트 결합에 의해서 연결된 비메틸화된 시토신 잔기를 함유하는 디뉴클레오티드 서열), 또는 CpI 모티프 함유 올리고뉴클레오티드(이노신에 연결된 시토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열), 또는 이중 가닥 RNA, 또는 회문서열(palindromic sequence)을 함유하는 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드. 면역자극 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 변형체/유사체, 예컨대, 포스포로티오에이트 변형체를 포함할 수 있고, 이중가닥이거나 (RNA를 제외한) 단일가닥일 수 있고;
- 포스페이트-함유 비환식 골격에 연결된 지질을 함유하는 화합물, 예컨대, TLR4 길항제 E5564;
- 오일 에멀션(oil emulsion)(예, 프로인트 애주번트(Freund's adjuvant));
- 인접한 모노사카라이드 단위 상에 양성 및 음성 전하 둘 모두를 포함하는 쯔비터이온성 폴리사카라이드(ZPS);
- 외막 베지클(outer membrane vesicle: OMV).
이론적으로는, 면역학적 이벤트의 캐스케이드(cascade)에서 특정의 상황을 선호하거나 증폭시켜서, 궁극적으로는 더 뚜렷한 면역학적 반응을 유도할 수 있는 각각의 분자 또는 물질이 애주번트로서 정의될 수 있다.
원칙적으로는, 백신 제형 중의 애주번트의 사용을 통해서,
- 백신에 적절하거나 요망되는 면역 반응을 유도하여 최적화하고;
- 백신의 점막 전달, 즉, 점막 표면, 예컨대, 구강 또는 위 또는 폐 상피 및 관련된 림프 조직과의 백신의 접촉을 유도하는 투여를 가능하게 하고;
- 세포-매개된 면역 반응을 촉진시키고;
- 약한 면역원, 예컨대, 고도로 정제된 또는 재조합 항원의 면역원성을 향상시키고;
- 방어 면역을 제공하기 위해서 요구되는 항원의 양 또는 면역화의 빈도를 감소시키고;
- 감소되거나 약화된 면역 반응을 갖는 개체, 예컨대, 신생아, 노인, 및 면역약화된 백신 수용자에서의 백신의 효능을 향상시킬 수 있다.
비록 이들의 작용 방식에 대해서는 거의 알려져 있지 않지만, 애주번트는 하기 기전 중 하나에 의해서 면역 반응을 증가시키는 것으로 현재 여겨진다;
- 항원의 생물학적 또는 면역학적 반감기를 증가시킴;
- 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)에의 항원 전달 뿐만 아니라, 예를 들어, APC에 의한 항원-애주번트 복합체의 섭취 후에 항원을 시토졸(cytosol)내로 엔도솜 막을 가로지르게 함으로써, APC에 의한 항원 처리 및 제시를 향상시킴;
- 면역 반응을 개시시키는 작용을 하는, 스트레스를 받았거나 손상된 세포로부터의 위험 유도 신호를 모방함(mimicking);
- 면역조절 시토카인의 생산을 유도함;
- 면역계의 특이적 서브셋을 향해서 면역 반응을 편향시킴; 및
- 항원 도전(antigen challenge)의 빠른 분산(rapid dispersal)을 차단함.
사카라이드는, 이들이 쯔비터이온성(zwitterionic)이 아니면, 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 TI-2 (T 세포 독립성-2) 항원 및 불량한 면역원(poor immunogen)으로서 공지되어 있다. 따라서, 사카라이드-기반 백신을 생산하기 위해서, 상기 사카라이드는 면역원성 캐리어에 컨주게이션되어 사카라이드에 비해서 증가된 면역원성을 제시하는 컨주게이트를 제공한다. 이러한 문맥에서, 용어 "면역원성 캐리어"는 사카라이드에 컨주게이션되어 사카라이드 그 자체에 비해서 증가된 면역성을 제시하는 컨주게이트를 형성시키는 구조로서 정의된다. 따라서, 면역원성 캐리어, 바람직하게는 단백질 캐리어로의 사카라이드의 컨주게이션(conjugation)은, 상기 면역원성 캐리어에 대한 면역 반응을 유도하지 않으면서, 상기 사카라이드에 대한 면역 반응의 자극 효과를 지닌다.
따라서, 본 발명은 화학식(I)의 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:
Figure pct00004
상기 식에서,
U1은
Figure pct00005
를 나타내고;
U2는
Figure pct00006
를 나타내고;
U3은
Figure pct00007
를 나타내고;
U4는
Figure pct00008
를 나타내고;
U5는 공유결합 또는
Figure pct00009
를 나타내고;
U6은
Figure pct00010
를 나타내고;
R1, R1', R* 및 R*'는 서로 독립적으로 -H 또는 U6을 나타내고, 여기에서, R1 및 R*는 동시에 -U6일 수 없고, R1' 및 R*'는 동시에 -U6일 수 없고,
L은 연결기를 나타내고;
E는 -NH2, -N3, -CN, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -CO2R', -CO-(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CO-(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CONH-NH2, -OH, -SH, 또는 -SAc를 나타내고;
R'는 -H, -Me, -Et,
Figure pct00011
를 나타내고;
n은 1 내지 20의 정수이고;
m은 0 내지 20의 정수이고;
k는 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
x 및 y는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이고;
U1 및 U2가 모노사카라이드이고 n이 1인 경우, m, x, 및 y는 동시에 0이 아니다.
연결기 L은 바람직하게는 2 내지 40 개의 탄소 원자(임의의 측쇄의 탄소원자를 포함함), 더욱 바람직하게는 2 내지 30, 더욱 바람직하게는 2 내지 20, 더욱 바람직하게는 2 내지 14, 더욱 바람직하게는 2 내지 12, 및 더욱더 바람직하게는 2 내지 10 개의 탄소 원자를 함유한다.
산소 원자(즉, -O-L-NH2의 산소) 및 NH2-기 사이의 가장 짧은 원자 사슬은 2 내지 14 개의 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 12 개의 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 10 개의 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 8 개의 원자로 이루어진다. 가장 짧은 사슬(아노머 중심에서의 산소와 NH2-기 사이의 가장 짧은 가능한 연결임)이 2 내지 6 개의 원자로 이루어지는 경우에, 이들은 바람직하게는 탄소 원자이다. 가장 짧은 사슬이 4 내지 8 개의 원자로 이루어지는 경우에, 사슬은 O, N 및 S로부터 선택된 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 가장 짧은 사슬이 9 내지 14 개의 원자로 이루어지는 경우에, 사슬은 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 3, 또는 4 개의 헤테로원자를 함유할 수 있다.
연결기 -L-, 또는 가장 짧은 사슬이 완전히 또는 부분적으로 불소화되는 것이 또한 바람직하다. 연결기 -L-은 3-원 또는 4원 또는 5원 또는 6원 포화 카르보사이클 또는 5원 부분 불포화(및 방향족 아님) 카르보사이클 또는 4원 또는 5원 또는 6원 포화된 산소 헤테로사이클 또는 4원 또는 5원 또는 6원 포화된 질소 헤테로사이클 또는 6원 방향족 카르보사이클을 함유할 수 있다.
연결기 -L-는 또한 아미드(-NH-CO-, -CO-NH-) 및/또는 우레아(-NH-CO-NH-) 잔기 및 바람직하게는 단지 하나의 아미드 또는 우레아 잔기를 함유할 수 있다. 연결기는 또한 치환체, 바람직하게는 두 개의 치환체, 예컨대, R10 및 R11 또는 4개의 치환체, 예컨대, R10, R11, R15 및 R14를 함유할 수 있고, 이러한 치환체는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖고, 바람직하게는 -F, -Cl, -CH3, -C2H5, -C3H7, -C5H9, -C6H13, -OCH3, -OC2H5, -CH2F, -CHF2, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHC(O)CH3, -N(CH3)2, 및 -N(C2H5)2로부터 선택된다.
연결기 -L-이 불소화되는 경우에, 둘 초과의 치환체 -F가 바람직하다.
바람직하게는 연결기 -L-은 -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -CF2-, -(CF2)2-, -(CF2)3-, -(CF2)4-, -(CF2)5-, -(CF2)6-, -(CF2)7-, -(CF2)8-, -(CF2)9-, -(CF2)10-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -(CH2)3-O-CH2-, -CH2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-CH2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)4-O-CH2-, -CH2-O-(CH2)4-, -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, -La-Lb-Ld-Lc-Le-, -La-Ld-Le-로부터 선택되고;
-La-는 -(CH2)o-, -(CF2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2-, -(CR10R11)o-,
Figure pct00012
로부터 선택되고;
-Lb- 및 -Lc-는 서로 독립적으로 -O-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -NR9-, -NR18-, -SO2-, -NH-CO-CH2-NH-,
Figure pct00013
로부터 선택되고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CF2)q-, -(CR12R13)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, -(CH2-CH2-O)q-CH2-,
Figure pct00014
Figure pct00015
로부터 선택되고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-, -(CR14R15)p1-, -(CR14R15)p1-O-(CR21R22)p2-,
Figure pct00016
로부터 선택되고;
R9 및 R18은 서로 독립적으로 -CH3, -C2H5, -C3H7 및 -C(O)CH3로부터 선택되고;
R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R19, R20, R21 및 R22는 서로 독립적으로 -H, -F, -Cl, -CH3, -C2H5, -C3H7, -C5H9, -C6H13, -OCH3, -OC2H5, -CH2F, -CHF2, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHC(O)CH3, -N(CH3)2 및 -N(C2H5)2로부터 선택되고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10로부터 선택된 정수이다.
더욱 바람직하게는, -L-는 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 또는 -La-Ld-Le-를 나타내고;
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, -E가 -NH2이면, L은 -C3H6-가 아니다.
더욱더 바람직하게는, -L-E는 -La-E, -La-Le-E, -La-Lb-Le-E, 또는 -La-Ld-Le-E를 나타내고;
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
-E는 -NH2, -N3, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -CO2R', -CO-(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CO-(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CONH-NH2, -OH, 또는 -SH를 나타내고;
R'는
Figure pct00017
를 나타내고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, -L-E가 -C3H6-NH2는 아니다.
가장 바람직하게는, 화학식(I)의 사카라이드는,
Figure pct00018
로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 -O-L-E를 갖고;
여기에서,
R'는 -H, -Me, -Et,
Figure pct00019
를 나타내고;
X는 -Br, -Cl, -I, -CO2H, 또는 -SAc를 나타낸다.
더욱 바람직한 구체예에서, -O-L-E는
Figure pct00020
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기에서, R'는 -H, -Me, -Et, 4-니트로페닐, 펜타플루오로페닐, 또는 -N-하이드록시석신이미딜, -(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), 또는 -(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜)을 나타내고;
X는 -Br, -Cl, -I, -CO2H, 또는 -SAc를 나타낸다.
특히 바람직하게는, -O-L-E는,
Figure pct00021
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 사카라이드의 아노머는 -O-L-E 기가 결합되는 C-1-위치에서의 α/β-아노머를 의미한다. 글리코시드 결합의 입체화학은 화학식(I)에서 당 단편 U1 및 U2의 아노머 중심에 대해서 나타낸 입체화학에 의해서 정의된다는 것이 탄수화물 화학 분야에서의 통상의 기술자에게는 명확하다.
본 발명의 사카라이드는 흡습성이고, 그에 따라서 이의 다양한 수화물을 형성시킬 수 있다. 바람직하게는 물 분자 대 사카라이드의 몰 비율은 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 가장 바람직하게는 5 내지 10의 범위에 있다.
본 발명의 사카라이드는 염기성 및/또는 산성 치환체를 함유하고/거나, 이들은 유기 또는 무기 산 또는 염기와 염을 형성할 수 있다.
그러한 산부가염 형성에 적합한 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말론산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말산, 푸마르산, 석신산, 아스코르브산, 말레산, 설폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 락트산, 타르타르산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아질산, 하이드록시에탄설폰산, 에틸렌설폰산, p-돌루엔설폰산, 나프틸설폰산, 설파닐산, 캄포르설폰산, 차이나 애시드(china acid), 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐-벤젠설폰산, 피크르산(picric acid), 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산(tartronic acid), (o, m, p)-톨루익산, 나프틸아민 설폰산, 및 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 잘 공지된 그 밖의 미네랄 또는 카르복실산이다. 염은 유리 염기 형태를 충분한 양의 바람직한 산과 접촉시켜 통상의 방식으로 염을 생성시킴으로써 제조된다.
적합한 무기 또는 유기 염기의 예는, 예를 들어, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 및 라이신 또는 아르기닌 등이다. 염은 본 기술분야에서 잘 공지된 방법을 사용한 통상의 방식으로, 예를 들어, 화학식(I)의 화합물의 용액을 상기 언급된 기로부터 선택된 염기의 용액으로 처리함으로써, 제조될 수 있다.
놀랍게도, 화학식(I)의 사카라이드는 면역원성 방어 에피토프를 함유하고 인간 및/또는 동물 숙주에서의 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아 또는 혈청형 O1, O2, O2ac, O8 및 카르바파넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258에 대한 방어 면역 반응을 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 화학식(I)의 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac, O8 O-폴리사카라이드 뿐만 아니라, 카르바파넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258 O-폴리사카라이드와 가교-반응하고, 또한 포식세포(phagocyte)에 의해서 치사시키기 위해서 그들을 옵소닌 작용하는 항체를 유발시킨다.
본 발명의 사카라이드는 순도 및 생산의 용이성 면에서 박테리아 공급원으로부터 생산된 사카라이드 및 이의 컨주게이트와 연관된 모든 문제를 극복하고 있다. 비록, 그것이 확립되고 허용된 방법이지만, 이러한 접근법에 대한 몇 가지 단점이 있다. 첫째로, 그것은 본래의 탄수화물의 생산을 위한 대량의 관심 병원성 종을 배양한 다음에, 탄수화물을 수확하고 정제하는 것을 필요로 한다. 관심 종의 생물학적 안전성 수준 뿐만 아니라, 배양의 용이성에 따라서, 이러한 단계는 신규한 병원성 종으로의 기술의 확장과 관련하여 주요 난관을 나타낼 수 있다. 추가로, 병원성 박테리아의 협막 폴리사카라이드로부터의 정의된 길이 및 구조의 순수한 사카라이드의 분리 및 정제가 지루하고 때로는 용이하지 않은 공정임이 잘 공지되어 있다. 첫 번째로, 협막 포리사카라이드의 생산은 성장 조건의 최적화를 필요로 한다. 두 번째로, 구성 모노사카라이드의 구조적 통합이 유지되는 해중합 조건이 밝혀질 필요가 있다. 마지막으로, 정의된 길이 및 구조의 순수한 사카라이드의 분리를 가능하게 하는 정제 조건이 결정될 필요가 있다. 일반적인 오염물질, 예컨대, 세포 폴리사카라이드, 핵산 및 단백질 외에, 또한 해중합 공정을 통해서 얻어지는 바람직하기 않은 사카라이드가 배제되어야 한다. 따라서, 박테리아 공급원으로부터의 정의된 구조 및 길이의 순수한 사카라이드의 생산은 지루하고 거의 불가능한 공정이다.
하기 화학식(I)의 합성 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:
Figure pct00022
상기 식에서,
U1은
Figure pct00023
를 나타내고;
U2는
Figure pct00024
를 나타내고;
U3은
Figure pct00025
를 나타내고;
U4는
Figure pct00026
를 나타내고;
U5는 공유결합 또는
Figure pct00027
를 나타내고;
U6은
Figure pct00028
를 나타내고;
R1, R1', R* 및 R*'는 서로 독립적으로 -H 또는 U6을 나타내고, 여기에서, R1 및 R*는 동시에 -U6일 수 없고, R1' 및 R*'는 동시에 -U6일 수 없고,
L은 연결기를 나타내고;
E는 -NH2, -N3, -CN, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -CO2R', -CO-(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CO-(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CONH-NH2, -OH, -SH, 또는 -SAc를 나타내고;
R'는 -H, -Me, -Et,
Figure pct00029
를 나타내고;
n은 1 내지 20의 정수이고;
m은 0 내지 20의 정수이고;
k는 0 내지 10으로부터 선택된 정수이고;
x 및 y는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이고;
U2-U1이
Figure pct00030
를 나타내는 때에, m은 0일 수 없고, U5-U4는 U2-U1일 수 없고;
U1 및 U2가 모노사카라이드이고 n이 1인 경우, m, x, 및 y는 동시에 0이 아니다.
하기 화학식(I)의 합성 사카라이드가 바람직하다:
Figure pct00031
상기 식에서,
U1은
Figure pct00032
를 나타내고;
U2는
Figure pct00033
를 나타내고;
U4는
Figure pct00034
를 나타내고;
U5는
Figure pct00035
를 나타내고;
m은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
k는 0이고;
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고
x, y, L 및 E는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
하기 화학식(I)의 합성 사카라이드가 바람직하다:
Figure pct00036
상기 식에서,
U1은
Figure pct00037
를 나타내고;
U2는
Figure pct00038
를 나타내고;
U3은
Figure pct00039
를 나타내고;
U5는 공유결합을 나타내고;
m, n, k, x, y, L 및 E는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
화학식(I)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00040
를 나타내고;
U2는
Figure pct00041
를 나타내고;
U4은
Figure pct00042
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00043
을 나타내고;
m이 0 및 1로부터 선택된 정수이고;
k가 0이고,
n, U3, x, y, L 및 E는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는 화학식(I)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00044
를 나타내고;
U2는
Figure pct00045
를 나타내고;
U4은
Figure pct00046
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00047
을 나타내고;
m이 0 및 1로부터 선택된 정수이고;
k가 0이고,
n, U3, x, y, L 및 E는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는 화학식(I)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00048
를 나타내고;
U2는
Figure pct00049
를 나타내고;
U4은
Figure pct00050
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00051
을 나타내고;
m이 1 내지 10의 정수이고;
k가 0이고,
n, U3, x, y, L 및 E는 청구항 1에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는 화학식(I)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
하기 화학식(I-A)의 합성 사카라이드 또는 이들 사카라이드의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:
Figure pct00052
상기 식에서,
U1은
Figure pct00053
를 나타내고;
U2는
Figure pct00054
를 나타내고;
U4은
Figure pct00055
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00056
을 나타내고;
L, E, m, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
상기 정의된 바와 같이, U1 및 U2는 모노사카라이드이고, 그에 따라서, n이 1일 경우에, m, x, 및 y는 동시에 0은 아니다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00057
를 나타내고;
U2는
Figure pct00058
를 나타내고;
m은 0이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00059
를 나타내고;
U2는
Figure pct00060
를 나타내고;
m은 0이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00061
를 나타내고;
U2는
Figure pct00062
를 나타내고;
U4은
Figure pct00063
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00064
을 나타내고;
m은 0 및 1로부터 선택된 정수이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00065
를 나타내고;
U2는
Figure pct00066
를 나타내고;
U4은
Figure pct00067
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00068
를 나타내고;
m이 0 및 1로부터 선택된 정수이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 같은 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00069
를 나타내고;
U2는
Figure pct00070
를 나타내고;
U4은
Figure pct00071
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00072
을 나타내고;
m이 1 내지 10의 정수이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00073
를 나타내고;
U2는
Figure pct00074
를 나타내고;
m, x 및 y는 0이고;
L, E, 및 n은 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00075
를 나타내고;
U2는
Figure pct00076
를 나타내고;
m, x 및 y는 0이고;
L, E, 및 n은 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(I-A)의 합성 사카라이드로서,
U1 및 U4는
Figure pct00077
를 나타내고;
U2 및 U5는
Figure pct00078
를 나타내고;
m은 1 내지 10의 정수이고;
L, E, n, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(I-A)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
상기 정의된 바와 같이, U1 및 U2는 모노사카라이드이고, 그에 따라서, n이 1인 경우에, m, x, 및 y는 동시에 0은 아니다;
화학식(I-A)의 사카라이드로서, n이 1 내지 10의 정수인 화학식(I-A)의 사카라이드가 더욱 바람직하다.
화학식(I-B)의 합성 사카라이드가 또한 바람직하다:
Figure pct00079
상기 식에서,
U1은
Figure pct00080
를 나타내고;
U2는
Figure pct00081
를 나타내고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택된 정수이고,
x 및 y는 1고,
L 및 E는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
따라서, 화학식(II-1) - (II-17) 중 어느 하나의 합성 사카라이드가 또한 본 발명의 범위 내에 있다:
Figure pct00082
상기 식에서, n, R1, m, L 및 E는 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖고, R1이 -H인 경우에, n은 2 내지 20의 정수이고, 바람직하게는, n이 2 내지 12의 정수임;
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
상기 식에서, R1, m, n, k, L 및 E는 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지며, n 및 m은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10로부터 독립적으로 선택된 정수이고, k는 is an integer from 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10의 정수임.
바람직하게는, 연결기 -L-은 화학식(I), (I-A), (I-B) 및 (II-1)-(II-17)에서 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 또는 -La-Ld-Le-을 나타내고; 여기에서,
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, -E가 -NH2이면, L은 -C3H6-가 아니다.
더욱더 바람직하게는, -L-E는 화학식(I), (I-A), (I-B) 및 (II-1)-(II-17)에서 -La-E, -La-Le-E, -La-Lb-Le-E, 또는 -La-Ld-Le-E를 나타내고; 여기에서,
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
-E는 -NH2, -N3, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -CO2R', -CO-(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CO-(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CONH-NH2, -OH, 또는 -SH를 나타내고;
R'는
Figure pct00087
를 나타내고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, -L-E가 -C3H6-NH2는 아니다.
가장 바람직하게는, 화학식(I), (I-A), (I-B) 및 (II-1)-(II-17)의 사카라이드는,
Figure pct00088
로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 -O-L-E를 갖고;
여기에서, R'는 -H, -Me, -Et,
Figure pct00089
를 나타내고;
X는 -Br, -Cl, -I, -CO2H, 또는 -SAc를 나타낸다.
가장 바람직하게는, 화학식(I), (I-A), (I-B) 또는 (II-1)-(II-17)의 사카라이드는,
Figure pct00090
로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 -O-L-E를 가지며;
여기에서, R'는 -H, -Me, -Et,
Figure pct00091
를 나타내고;
X는 -Br, -Cl, -I, -CO2H, 또는 -SAc를 나타낸다.
가장 바람직한 구체예에서, -L-은 -(CH2)o-를 나타내고, o은 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수이다. 따라서, 특히 바람직한 합성 사카라이드는 -L-이 -(CH2)o-를 나타내고, o가 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수인 화학식(I), (I-A), (I-B) 및 (II-1)-(II-17) 중 어느 하나의 사카라이드이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 사카라이드는 화합물 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 사카라이드는 화합물 A-01 - A-07, A-11 - A17, A-21 - A-27, A-31 - A-37, A-41 - A-47, A-51 - A-57, A-61 - A-67, A-71 - A-77, A-81 - A-87, A-91 - A-97, A-101 - A-107, A-111 - A-117, A-121 - A-127, A-131 - A-137, F-01, F-19, F-27, F-31, F-36, F-54, F-62, F-66, F-71, F-89, F-97, F-101, F-106, F-124, F-132, F-136, F-141, F-159, F-167, F-171, F-176, F-194, F-202, F-206, F-211, F-229, F-237, F-241, F-246, F-264, F-299, F-281, F-272, F-276, F-307, F-311, F-316, F-334, F-342, F-346, F-351, F-414, F-417, F-421, F-426, F-444, F-452, F-456, F-461, F-479, F-487, F-491, F-496, F-514, F-522, F-526, K-01, K-06, K-11, K-26, K-31, K-36, K-51, K-56, K-61, K-76, K-81, K-86, K-101, K-106, K-111, K-126, K-131, K-136, K-151, K-156, K-161, K-176, K-181, K-186, K-201, K-206, K-211, K-226, K-231, K-236, K-251, K-256, K-261, K-276, K-281, K-286, K-301, K-306, K-311, K-326, K-331, K-336, O-01, O-02, O-03, O-06, O-07, O-08, O-11, O-12, O-13, O-16, O-17, O-18, O-21, O-22, O-23, O-26, O-27, O-28, O-31, O-32, O-33, O-36, O-37, O-38, O-41, O-42, O-43, O-46, O-47, O-48, O-51, O-52, O-53, O-56, O-57, O-58, O-61, O-62, O-63, O-66, O-67, O-88, P-01 - P-03, P-06 - P-08, P-11 - P-13, P-16 - P-18, P-21 - P-23, P-26 - P-28, P-31 - P-33, P-36 - P-38, P-41 - P-43, P-46 - P-48, P-51 - P-53, P-56 - P-58, P-61 - P-63, P-66 - P-68, Q-1, Q-26, Q-101, Q-151, Q-251, Q-301, Q-351, Q-376, Q-451, Q-501, Q-551, Q-601 및 Q-651로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 1:
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
표 2:
Figure pct00095
Figure pct00096
표 3
Figure pct00097
Figure pct00098
표 4
Figure pct00099
Figure pct00100
표 5
Figure pct00101
Figure pct00102
표 6
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
표 7
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
표 8
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
표 9
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
표 10
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
표 11
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
표 12
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
표 13
Figure pct00145
Figure pct00146
표 14
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
표 15
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
화학적 합성
본 발명의 또 다른 양태는,
A1) LG1은 이탈기이고, R1P는 P4 또는 U5p이고, U5p는
Figure pct00161
인 디사카라이드 D1을 제공하는 단계;
B1) D1을 디사카라이드 D2와 반응시켜 n이 1인 사카라이드 O1a를 얻는 단계로서,
상기 (O1a)에서, n이 2 내지 20의 정수인 경우에는, 다음 단계 B2) 및 B3)를, 즉,
B2) 사카라이드 D1과 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P3를 제거하는 단계,
B3) 사카라이드 D1를 단계 B2) 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 n은 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O1a를 얻는 단계를 n-1회 반복하는 단계;
C) 사카라이드 O1a의 보호기 P6를 제거하고 이탈기 LG2를 도입하여 사카라이드 O1b를 얻는 단계;
D1) 사카라이드 O1b를 반응물 HO-L-Ep와 커플링시켜 사카라이드 O1c를 얻는 단계; 또는
D2) 사카라이드 O1b를 사카라이드 M1와 반응시켜 사카라이드 O2a를 얻는 단계; 및 임의로,
E1) 사카라이드 (O1c)의 보호기 P3를 제거하여 사카라이드 O1d를 얻고, 사카라이드 O1d를 사카라이드 M2와 반응시켜 사카라이드 O3a를 얻는 단계; 또는
E2) 사카라이드(O2a)의 보호기 P3를 제거하여 사카라이드 O2b를 얻고, 사카라이드 O2b를 사카라이드 M2와 반응시켜 사카라이드 O4a를 얻는 단계; 및
F1) 사카라이드 O1c, O2a, O3a 또는 O4a의 모든 보호기를 제거하여 화학식(I-1), (I-2), (I-3), 또는 (I-4)의 상응하는 사카라이드를 얻는 단계를 포함하는 화학식(I)의 합성 방법에 관한 것이다:
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
상기 식에서, Ep는 보호 말단기이고, LG1-LG3은 이탈기이고,
P1, P2, P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, 및 P14는 보호기를 나타내고, L, E, R1, R1p는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, R1p은 P4이다.
따라서, 상기 기재된 합성 방법에 따르면, 하기 단계들의 조합이 수행되어 본 발명의 합성 사카라이드를 생성시킬 수 있다:
단계: A1) → B1) → C) → D1) → F1), A1) → B1) → C) → D2) →F1), A1) → B1) → C) → D1) → E1) → F1), 또는 A1) → B1) → C) →D2) → E2) → F1).
대안적으로, 화학식(I)의 사카라이드의 합성 방법은,
A2) R1P는 P4 또는 U5p이고, U5p는
Figure pct00177
인 디사카라이드 D6을 제공하는 단계;
B1') 사카라이드 D6을 사카라이드 D8과 반응시켜 n이 1인 사카라이드 O3b를 얻는 단계로서,
n은 2 내지 20의 정수인 경우에, 하기 단계 B2') 및 B3'), 즉,
B2') 사카라이드 D6와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P8을 제거하는 단계;
B3') 사카라이드 D6를 단계 B2') 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 n이 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O3b를 얻는 단계를 n-1회 반복하는 단계; 임의로,
E3) 사카라이드 O3b의 보호기 P8을 제거하여 사카라이드 O3c를 얻는 단계, 및
E4) 사카라이드 O3c를 사카라이드 M3와 반응시켜 사카라이드 O4b를 얻는 단계; 또는
E5) 사카라이드 O3c를 디사카라이드 D4와 반응시켜 m이 1인 사카라이드 O5a를 얻는 단계로서,
m이 2 내지 20의 정수인 경우에,
하기 단계 e5) 및 e6), 즉
e5) 모노사카라이드 D4와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P3'를 제거하는 단계;
e6) 사카라이드 D4를 단계 e5) 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 m이 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O5a를 얻는 단계를 m-1회 반복하는 단계; 또는
E6) 사카라이드 O3c를 LG7이 이탈기를 나타내는 디사카라이드 D5와 반응시켜 m이 1인 사카라이드 O5b를 얻는 단계로서,
m이 1 내지 20의 정수인 경우에,
다음 단계 e7) 및 e8), 즉,
e7) 모노사카라이드 D5와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P9'를 제거하는 단계;
e8) 사카라이드 D5를 단계 e7) 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 m이 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O5b를 얻는 단계를 m-1회 반복하는 단계;
e9) 보호기 PN를 제거하고 -NH2 기를 -NHAc 기로 전환시켜 사카라이드 O5c를 얻는 단계;
F2) 사카라이드 O3b, O4b, O5a, 또는 O5c의 모든 보호기를 제거하여 화학식(I-5), (I-6), (I-7), 또는 (I-8)의 상응하는 사카라이드를 얻는 단계를 포함한다:
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
Figure pct00181
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
Figure pct00185
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
Figure pct00191
상기 식에서, Ep는 보호 말단기이고; LG4 - LG7은 이탈기이고; PN, P1, P2, P2', P3, P3', P4, P4', P5, P5', P6, P7, P7', P8, P8', P9, P9', P10, P10', P11, P12 , P13, 및 P14는 보호기를 나타내고, L, E, R1, R1p, m, 및 n은 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, R1p은 P4이고, R1은 H이다.
따라서, 상기 기재된 합성 방법에 따르면, 하기 단계들의 조합이 수행되어 본 발명의 합성 사카라이드를 생성시킬 수 있다:
단계: A2) → B1') → E3) → F2), A2) → B1') → B2') → B3') → E3)→ F2), A2) → B1') → B2') → B3') → E3)→ E4) →F2), A2) → B1') → B2') → B3') → E3)→ E5) →F2), A2) → B1') → B2') → B3') → E3)→ E5) →F2).
P1, P2, P2', P3, P3', P4, P4', P5, P5', P6, P7, P7', P8, P8', P9, P9', P10, P10', P11, P12, P13 및 P14는 보호기를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "보호기"는, 바람직하게는, 히드록실기 및 티올의 보호를 위해서 사용되는, 유기 합성에서 일반적으로 사용되는 기를 나타낸다. PN은 아민기의 보호를 위해서 사용되는 보호기를 나타낸다.
더욱 바람직하게는, P 1 , P 2 ', P 3 , P 3 ', P 4 , P 4 ', P 5 , P 5 ', P 6 , P 7 , P 7 ', P 8 , P 8 ', P 9 , P 9 ', P 10 , P 10 ', P 11 , P 12 , P 13 및 P 14 는 하이드록실기에 대한 적합한 보호기, 더욱 바람직하게는, 적합한 탈보호 반응 시퀀스에 의해서 후속적으로 하나 하나 제거될 수 있는 하이드록실기에 대한 다양한 적합한 보호기이다. 하이드록실기에 대한 바람직한 보호기는 아세틸, 페닐, 벤질, 이소프로필리덴, 벤질리덴, 나프틸리덴, 벤조일, p-메톡시벤질, p-브로모벤질, p-메톡시벤질리덴, p-메톡시페닐, p-브로모벤질리덴, p-니트로페닐, 알릴, 트리클로로아세틸, (2-니트로페닐)아세틸, 이소프로필, p-브로모벤질, 디메톡시트리틸, 트리틸, 2-나프틸메틸, 피발로일, 클로로아세틸, 트리이소프로필실릴, 3차-부틸디메틸실릴, 3차-부틸디페닐실릴, 3차-부틸메톡시페닐실릴, 트리에틸실릴, 트리메틸실릴, 2-트리메틸실릴에톡시메틸, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 벤질옥시메틸, 메틸옥시메틸, 3차-부틸옥시메틸, 메톡시에틸옥시메틸, 레불리노일이고, PN은 2,2,2-트리클로로에틸 카르보닐(Troc) 또는 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐(Fmoc)를 나타낸다.
특히, 보호기 P1 및 P6은 페닐을 나타내고, 보호기 P3 및 P3'는 2-나프틸메틸을 나타내고, 보호기 P2, P4, P4', P5', P11, P12, 및 P14는 벤질, p-메톡시벤질을 나타내고, 보호기 P2', P5, P7, P7', P8, P8', P9, P10, P10', 및 P13은 벤조일이고, 보호기 P6은 부틸디메틸실릴을 나타낸다. 임의로, OP4 및 OP5, OP4' 및 OP5'는 페닐 헤미아세탈을 형성한다. P9'는 벤조일 또는 레불리노일이다. PN은 2,2,2-트리클로로에틸 카르보닐(Troc)이다.
본 발명의 합성에 적합한 이탈기의 예는 탄수화물 화학에서의 통상의 기술자에게는 잘 공지되어 있으며, 할라이드, 티오에테르, 이미데이트, 아세테이트, 및 포스페이트를 포함한다.
바람직하게는, 이탈기 LG1, LG2, LG3, LG4, LG5, LG6 및 LG7은 are selected from 할로겐(Cl, Br, F, I), -O-C(=NH)-CCl3, -O-C(=NPh)-CF3, -OAc, -SRL, -SO-Ph, -O-(CH2)3-CH=CH2, -O-P(ORL)2, -O-PO(ORL)2, -O-CO-ORL, -O-CO-SRL, -O-CS-SRL, -O-CS-ORL,
Figure pct00192
이고, 여기에서,
RL은 어떠한 알킬 또는 아릴기, 바람직하게는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 페닐 또는 톨루일일 수 있다.
바람직하게는, 이탈기 LG1, LG2, LG3, LG4, LG5, LG6 및 LG7은
Figure pct00193
로 이루어진 이탈기의 군으로부터 선택된다.
언급된 바와 같이, 옥소카르베늄 중간체(oxocarbenium intermediate)의 제공은 적절한 또는 적합한 활성화제에 의한 글리코실화제의 아노머 위치에 정위된 이탈기의 활성화에 좌우된다. 포스페이트(즉, 포스페이트 활성화제) 및 이미데이트(즉, 이미데이트 활성화제)를 위한 적합한 활성화제가 루이스 산, 예컨대, 실릴 트리플레이트 또는 은 트리플레이트(silver triflate)인 반면에, 티오에테르를 위한 적합한 활성화제, 즉 티오에테르 활성화제는 NIS/TfOH, NIS/TMSOTf, NIS/BF3·Et2O, NIS/AgOTf, DMTST/Tf2O, IDPC, BSP/Tf2O, Ph2SO/Tf2O을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니라는 것은 통상의 기술자의 일반적인 지식이다. 실릴 트리플레이트의 예는 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트, 3차-부틸 디메틸 트리플루오로메탄설포네이트, 트리이소프로필 트리플루오로메탄설포네이트를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, LG1, LG2, LG3, LG4, LG5, LG6 및 LG7은 티오에테르이고(see Carbohydr. Res. 2015, 13-22), LG1, LG2, LG3, LG4, LG5, LG6 및 LG7이
Figure pct00194
로 이루어진 군으로부터 선택되는 때에 더욱더 바람직하다.
Ep는 보호 말단기를 나타낸다. E는 -NH2, -N3, -CN, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -CO2R', -CONHNH2, -SH, 또는 -SAc를 나타내고; 상응하는 보호 말단기 Ep는 -N(PN1)(PN2), -N3, -CN, -O-N(PN1)(PN2), -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -CO2R', -CONHN(PN1)(PN2), -SPs, 또는 -SAc를 나타내고;
PN1, 및 PN2은 아민에 적합한 보호기이고, 아민과 함께 보호된 카르바메이트 또는 아미드를 형성한다. 카르바메이트를 형성하는 보호기의 예는 3차-부틸옥시 카르보닐, 9-플루오레닐메틸 카르보닐, 알릴 카르보닐, 트리클로로에틸 카르보닐 및 벤질옥시 카르보닐을 형성한다. 아미드를 형성하는 보호기의 예는 아세틸 또는 트리클로로 아세틸을 포함한다. 바람직하게는, 보호기 P12는 벤질을 나타내고, 보호기 P13은 벤질옥시 카르보닐을 나타낸다.
Ps는 티올에 적합한 보호기이고, 페닐, 벤질, p-메톡시벤질, p-메톡시페닐, p-니트로페닐, 및 알릴로부터 선택된다.
사카라이드들 사이의 커플링 반응은 글리코실화 시약의 존재하에 수행될 수 있다. 적합한 시약은, 이로 한정되는 것은 아니지만, AgOTf, BF3·OEt2, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf), 트리플루오로메탄설폰산(TfOH), 트리플루오로메탄설폰산 무수물(Tf2O, 트리플산 무수물), 란타노이드(III) 트리플레이트, NIS/AgOTf, NIS/TfOH 또는 디메틸(메틸티오) 설포늄 트리플루오로메탄설포네이트(DMTST)를 포함한다.
단계 B1), B1'), B1''), B1'''), B3), B3'), B3''), B3'''), B5''), B5'''), D1), D2), E1), E2), E4), E5), E6), a4), e6), e8)에서 사카라이드들 사이의 커플링 반응은 -80℃ 내지 -60℃의 온도에서 비극성 용매 및 극성 비양성자성 용매의 혼합물 중에서 NIS/TfOH 또는 TBSOTf에 의한 활성화에 의해서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 반응은 -70℃에서 톨루엔과 디에틸 에테르의 혼합물 중에서 TBSOTf에 의한 활성화에 의해서 수행되는 것이 더욱더 바람직하다.
바람직하게는, 단계 a4)에서의 모노사카라이드 M5와 사카라이드 M3 사이이 커플링 반응은 -10℃ 내지 +10℃의 온도에서 비극성 용매 중에서 TBSOTf에 의한 활성화에 의해서 수행된다.
단계 F1) - F3)에서 수행되는 보호기 P1, P3, P5 - P13의 제거는,
- 용매들의 혼합물 중의 과산화수소의 존재하에, 염기, 바람직하게는 NaOMe 또는 LiOH에 의한 처리에 의해서 염기-불안정한 보호기의 첫 번째 분해; 및
- 용매들의 혼합물 중의 팔라듐 촉매의 존재 하에 화합물을 수소에 가함으로써 수소화에 민감한 보호기의 두 번째 분해를 포함한다.
본 발명에 따른 추가의 양태는 화학식(I)의 사카라이드를 제조하기 위한 중간체 화합물로서, 화학식(O1b), (O1c), (O1d), (O2a), (O2b), (O3a), (O3b), (O3c), (O4a), (O4b), (O5a), (O5b) 및 (O5c) 중 어느 하나인 중간체 화합물을 나타낸다:
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
상기 식에서, LG2는 이탈기를 나타내고; Ep는 보호 말단기이고,
PN, P2, P2', P3', P4, P4', P5, P5', P7, P7 ', P8, P8 ', P9, P9 ', P10, P10 ', P11, P12, P13 및 P14는 보호기를 나타내고, L, R1p, m, 및 n은 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
화학식(O1b), (O1c), (O1d), (O2a), (O2b), (O3a), (O3b), (O3c), (O4a), (O4b), (O5a), (O5b) 및 (O5c)에서, 바람직하게는, 연결기 -L-은 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 또는 -La-Ld-Le-을 나타내고;
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, -E가 -NH2이면, L은 -C3H6-가 아니다.
특히 바람직한 중간체는 -L-이 -(CH2)o-를 나타내고, o가 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수인 화학식(O1b), (O1c), (O1d), (O2a), (O2b), (O3a), (O3b), (O3c), (O4a), (O4b), (O5a), (O5b), 및 (O5c)의 중간체이다.
P2, P2', P3', P4, P4', P5, P5', P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, 및 P14는 하이드록실기에 적합한 보호기, 더욱 바람직하게는, 적합한 탈보호 반응 시퀀스에 의해서 후속적으로 하나 하나 제거될 수 있는 하이드록실기에 대한 다양한 적합한 보호기이다. 하이드록실기에 대한 바람직한 보호기는 아세틸, 페닐, 벤질, 이소프로필리덴, 벤질리덴, 나프틸리덴, 벤조일, p-메톡시벤질, p-브로모벤질, p-메톡시벤질리덴, p-메톡시페닐, p-브로모벤질리덴, p-니트로페닐, 알릴, 트리클로로아세틸, (2-니트로페닐)아세틸, 이소프로필, p-브로모벤질, 디메톡시트리틸, 트리틸, 2-나프틸메틸, 피발로일, 클로로아세틸, 트리이소프로필실릴, 3차-부틸디메틸실릴, 3차-부틸디페닐실릴, 3차-부틸메톡시페닐실릴, 트리에틸실릴, 트리메틸실릴, 2-트리메틸실릴에톡시메틸, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 벤질옥시메틸, 메틸옥시메틸, 3차-부틸옥시메틸, 메톡시에틸옥시메틸, 및 레불리노일이다.
PN은 아민기의 보호에 사용되는 보호기, 더욱 바람직하게는 2,2,2-트리클로로에틸 카르보닐(Troc) 또는 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐(Fmoc)를 나타낸다.
따라서, 중간체(O1b), (O1c), (O1d), (O2a), (O2b), (O3a), (O3b), (O3c), (O4a), (O4b), (O5a), (O5b) 및 (O5c)가 특히 바람직하다: 보호기 P1 및 P6는 페닐을 나타내고, 보호기 P3 및 P3'은 2-나프틸메틸을 나타내고, 보호기 P2, P4, P4', P5', P11, P12 및 P14는 벤질, p-메톡시벤질을 나타내고, 보호기 P2', P5, P7, P7', P8, P8', P9, P10, P10' 및 P13은 벤조일이고, P9'는 벤조일 또는 레불리노일이고, 보호기 P6은 부틸디메틸실릴을 나타낸다. PN은 2,2,2-트리클로로에틸 카르보닐(Troc)이다. 임의로, OP4 및 OP5, OP4' 및 OP5'는 페닐 헤미아세탈을 형성한다.
본 발명의 추가의 양태는 화학식(I-1) - (I-5)의 화합물을 나타낸다:
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
Figure pct00202
상기 식에서, m, n, L, E, R1, R*, R1' 및 R*'는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
글리코컨주게이트
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 사카라이드를 포함하는 컨주게이트를 나타낸다. 놀랍게도, 상기 컨주게이트는 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환에 대한 면역화을 위한 백식으로서 유용한 것으로 입증되었다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP)를 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형으로부터 선택된다. 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg(갈락탄-III), O8, CRKP 균주 ST 258. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
사카라이드는, 이들이 면역원성이 아닌 경우에, 일반적인 TI-2(T 세포 독립적-2) 항원 및 불량한 면역원으로서 통상의 기술자에게 공지되어 있다. TI-2 항원은 표면 노출된 면역글루불린 수용체의 가교연결을 통해서 성숙한 B 세포에 의해서만 인식되는 항원이다. T 세포 도움 없이는, 면역학적 기억이 생성되지 않으며, IgM로부터 다른 IgG 서브클래스로 전환하는 이소타입(isotype) 뿐만 아니라, B 세포 친화성 돌연변이가 발생하지 않는다. 더욱이, 사카라이드는 인간 당지질 및 당단백질과의 구조적 상동성으로 인해서 인간에서의 공지된 불량한 면역원이다. 이들의 불량한 면역원성 특성으로 인해서, 사카라이드는, 효능적인 백신의 생산에 필수적인 특징인, B 세포에 의한 항체 생산 뿐만 아니라 기억 세포의 형성 둘 모두를 생성시키기에 불량한 특성을 나타낸다.
따라서, 효능적인 사카라이드-기반 백신을 생산하기 위해서, 화학식(I), (I-1) - (I-5), 및 (II-1)-(II-17)의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700이 면역원성 캐리어에 컨주게이션되어, 사카라이드와 비교하여, 증가된 면역원성을 제시하는 컨주게이트를 제공한다. 따라서, 화학식(III)의 컨주게이트가 또한 본 발명의 범위에 포함된다:
Figure pct00203
상기 식에서,
i는 2 내지 25; 바람직하게는 2 내지 18로부터 선택된 정수이고;
-E1-은 공유결합, -NH-, -O-NH-, -O-, -S-, -CO-, -CH=CH-, -CONH-, -CO-NHNH-,
Figure pct00204
를 나타내고;
-T-는
Figure pct00205
를 나타내고;
a는 1 내지 10의 정수를 나타내고;
b는 1 내지 4의 정수를 나타내고;
CP는 캐리어 단백질이고;
U1, U2, U3, U4, U5 L, m, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, E1은 공유결합, -NH-, -CH=CH-, -CONH-,
Figure pct00206
이다.
상기 컨주게이트는 화학식(I)의 적어도 하나의 합성 사카라이드, 및 적어도 하나의 합성 사카라이드가 공유결합되어 있는 면역원성 캐리어, 바람직하게는 캐리어 단백질로 이루어진다.
놀랍게도, 면역원성 캐리어, 바람직하게는 캐리어 단백질에 공유적으로 연결된 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 컨주게이트에 의한 면역화는 화학식(I)의 사카라이드의 탄수화물 부분에 특이적인 항체의 높은 역가의 생성을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 상기 항체는 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac, O8 O-폴리사카라이드 뿐만 아니라, 카르바페넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258 O-폴리사카라이드와 교차 반응하고 옵소닌 식세포 작용(opsonophagocytosis) 및 살균 활성을 제시하여, 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 방어를 부여한다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이들의 서브타입을 포함하거나 이로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP)로부터 선택된다. 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, , O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg (갈락탄-III), O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는, O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
본 발명의 적어도 하나의 컨주게이트를 함유하는 백신은 클렙시엘라 뉴모니아의 협막 폴리사카라이드의 비-선택적 분해에 의해서 얻은 사카라이드의 분리된(및 합성되지 않은) 혼합물 또는 이의 컨주게이트를 함유하는 백신에 비해서 부작용 및/또는 비-방어성 면역 반응을 거의 유발시키지 않는다. 더욱이, 본 발명의 백신은 비-선택적으로 분해된 협막 폴리사카라이드의 분리된 혼합물을 함유하는 백신보다 GMP 조절에 따라서 더 용이하게 제조될 수 있고 더 용이하게 특성화되며, 이는 안정성 및 순도 조절을 더 용이하게 할 뿐만 아니라, 불순물의 종류 및 양을 검출할 수 있게 한다.
이러한 문맥에서, 용어 "면역원성 캐리어"는 사카라이드에 컨주게이션되어 사카라이드 자체와 비교하여 증가된 면역원성을 제시하는 컨주게이트를 형성시키는 구조로서 정의된다. 따라서, 컨주게이트(III)는 화학식(I), (I-1)-(I-5), (II-1) - (II-17)의 사카라이드, 바람직하게는, 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70 및 O-01 - O-70, P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700을 면역원성 캐리어에 컨주게이션시킴으로써 얻어지며, 이는 효과로서 상기 면역원성 캐리어에 대한 면역 반응을 유도하지 않으면서, 화학식(I)의 올리고사카라이드에 대한 면역 반응의 자극을 갖는다.
가장 바람직하게는, 컨주게이트(III)는 화합물 A-01 - A-07, A-11 - A17, A-21 - A-27, A-31 - A-37, A-41 - A-47, A-51 - A-57, A-61 - A-67, A-71 - A-77, A-81 - A-87, A-91 - A-97, A-101 - A-107, A-111 - A-117, A-121 - A-127, A-131 - A-137, F-01, F-19, F-27, F-31, F-36, F-54, F-62, F-66, F-71, F-89, F-97, F-101, F-106, F-124, F-132, F-136, F-141, F-159, F-167, F-171, F-176, F-194, F-202, F-206, F-211, F-229, F-237, F-241, F-246, F-264, F-299, F-281, F-272, F-276, F-307, F-311, F-316, F-334, F-342, F-346, F-351, F-414, F-417, F-421, F-426, F-444, F-452, F-456, F-461, F-479, F-487, F-491, F-496, F-514, F-522, F-526, K-01, K-06, K-11, K-26, K-31, K-36, K-51, K-56, K-61, K-76, K-81, K-86, K-101, K-106, K-111, K-126, K-131, K-136, K-151, K-156, K-161, K-176, K-181, K-186, K-201, K-206, K-211, K-226, K-231, K-236, K-251, K-256, K-261, K-276, K-281, K-286, K-301, K-306, K-311, K-326, K-331, K-336, O-01, O-02, O-03, O-06, O-07, O-08, O-11, O-12, O-13, O-16, O-17, O-18, O-21, O-22, O-23, O-26, O-27, O-28, O-31, O-32, O-33, O-36, O-37, O-38, O-41, O-42, O-43, O-46, O-47, O-48, O-51, O-52, O-53, O-56, O-57, O-58, O-61, O-62, O-63, O-66, O-67, O-88, P-01 - P-03, P-06 - P-08, P-11 - P-13, P-16 - P-18, P-21 - P-23, P-26 - P-28, P-31 - P-33, P-36 - P-38, P-41 - P-43, P-46 - P-48, P-51 - P-53, P-56 - P-58, P-61 - P-63, P-66 - P-68, Q-1, Q-26, Q-101, Q-151, Q-251, Q-301, Q-351, Q-376, Q-451, Q-501, Q-551, Q-601 및 Q-651로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드의 컨주게이션에 의해서 얻어진다. 53으로부터 포함함.
바람직한 면역원성 캐리어는 면역조절 특성을 갖는 캐리어 단백질(CP) 또는 글리코스핑고리피드이다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는, 캐리어 단백질(CP)은 디프테리아 톡소이드, 돌연변이된 디프테리아 톡소이드, 개질된 디프테리아 톡소이드, 돌연변이되고 개질된 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 개질된 파상풍 톡소이드, 돌연변이된 파상풍 톡소이드, 외막 단백질(outer membrane protein: OMP), 소혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine: KLH), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa: rEPA) 콜레라 톡소이드(cholera toxoid: CT)의 재조합 비독성 형태를 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다. 본원에서 사용되는 용어 "톡소이드"는, 독성이 화학적(포르말린) 또는 열처리에 의해서 불활성화되거나 억제된 반면에, 다른 성질, 전형적으로는 면역원성이 유지된 박테리아 독소(일반적으로는 외독소)를 나타낸다. 본원에서 사용된 돌연변이된 톡소이드는 야생형 아미노산 서열을 보정함으로써 독성이 덜하거나 심지어 비독성으로 보정된 재조합 박테리아 독소이다. 그러한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환일 수 있다. 그러한 돌연변이된 톡소이드는 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 개질된 톡소이드를 생성시킬 수 있는 작용성을 그 표면에서 제시한다. 상기 작용성은 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지되어 있고, 환원제의 존재하에 활성화된 에스테르, 이소시아네이트기 또는 알데하이드와 반응할 수 있는 라이신 잔기의 일차 아미노 작용성, 카르보디이미드에 의해서 활성화될 수 있는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기의 카르복실레이트 작용성, 또는 시스테인 잔기의 티올 작용성을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
활성화된 에스테르는 N-(γ-말레이미도부티릴옥시) 설포석신이미드 에스테르(설포-GMBS), 석신이미딜(4-아이오도아세틸) 아미노벤조에이트(설포-SIAB), 석신이미딜-3-(브로모아세타미도)프로피오네이트(SBAP), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), 디석신이미딜 아디페이트(DSA), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시석신이미드(PEG-4-SPDP), 비스-(4-니트로페닐) 아디페이트 및 비스-(4-니트로페닐) 석신네이트을 포함한다(도 3 참조). 바람직하게 활성화된 에스테르는 디석신이미딜 아디페이트(DSA), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), 비스-(4-니트로페닐) 아디페이트 및 비스-(4-니트로페닐) 석신네이트이다.
캐리어 단백질 상의 시스테인 잔기는 적합한 상호연결 분자와 추가로 반응하여 그 표면에 상호연결 분자의 작용기 X를 갖는 개질된 캐리어 단백질을 제공할 수 있는 상응하는 데하이드로알라닌(dehydroalanine)으로 전환될 수 있다.
화학식(I)의 사카라이드가 라이신 잔기의 일차 아민 작용성을 작용성으로서 제시하는 캐리어 단백질(CP)로서의 비독성의 돌연변이된 디프테리아 독소 CRM197에 컨주게이션되는 것이 특히 바람직하다.
야생형 디프테리아 독소와 같은 CRM197은 글리신에 대한 글루탐산의 단일 아미노산 치환을 갖는 디설파이드 브릿지(disulfide bridge)에 의해서 연결된 두 서브유닛(subunit)으로 이루어진 535 개의 아미노산(58 kD)의 단일 폴리펩티드 사슬이다. 그것은 프레브나르(Prevnar)와 같은 질병을 위한 많은 승인된 컨주게이트 백신에서 캐리어 단백질로서 사용된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 캐리어 단백질은 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여, 상호연결 분자의 상기 작용기 X를 그 표면에 지니는 개질된 캐리어 단백질을 제공할 수 있는 라이신 잔기의 일차 아미노 작용성을 그 표면에서 제시하며, 이는 화학식(I)의 화합물의 연결기의 말단 아미노기와 반응할 수 있다.
상호연결 분자의 상기 작용기 X는 말레이미드, α-아이오도아세틸, α-브로모아세틸, N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS), 알데하이드, 이미도에스테르, 카르복실산, 알킬 설포네이트, 설포닐 클로라이드, 에폭사이드, 무수물, 카르보네이트를 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하기 화학식(IV)의 컨주게이트가 바람직하다:
Figure pct00207
상기 식에서,
i는 2 내지 25, 바람직하게는 2 내지 18로부터 선택된 정수이고;
-E1-은 공유결합, -NH-, -O-NH-, -S-, -CO-, -CH=CH-, -CONH-, -CO-NHNH-,
Figure pct00208
를 나타내고;
-T-는
Figure pct00209
를 나타내고;
a는 1 내지 10의 정수를 나타내고;
b는 1 내지 4의 정수를 나타내고;
U1, U2, U3, U4, U5, L, m, n, k, x, 및 y는 본원에, 예컨대, 화학식(I)에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
하기 화학식(IV)의 컨주게이트가 바람직하다:
Figure pct00210
상기 식에서,
i는 2 내지 25, 바람직하게는 2 내지 18로부터 선택된 정수이고;
-E1-은 공유결합, -NH-, -O-NH-, -S-, -CO-, -CH=CH-, -CONH-, -CO-NHNH-,
Figure pct00211
를 나타내고;
-T-는
Figure pct00212
를 나타내고;
a는 1 내지 10의 정수를 나타내고;
b는 1 내지 4의 정수를 나타내고;
U2-U1이
Figure pct00213
를 나타내는 때에, m은 0일 수 없고, U5-U4는 U2-U1일 수 없고;
U1, U2, U3, U4, U5, L, m, n, k, x, 및 y는 본원에, 예컨대, 화학식(I)에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, E1은 공유결합, -NH-, -CH=CH-, -CONH-,
Figure pct00214
이다.
하기 화학식(IV)의 컨주게이트, 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:
U1은
Figure pct00215
를 나타내고;
U2는
Figure pct00216
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00217
을 나타내고;
k는 0이고,
L, E1, i, m, n, x, 및 y는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
하기 화학식(IV)의 컨주게이트가 또한 바람직하다:
U1은
Figure pct00218
를 나타내고;
U2는
Figure pct00219
를 나타내고;
m은 0이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
화학식(IV)의 합성 사카라이드로서,
U1은
Figure pct00220
를 나타내고;
U2는
Figure pct00221
를 나타내고;
U4은
Figure pct00222
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00223
를 나타내고;
m이 0 및 1로부터 선택되는 정수이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는 화학식(IV)의 합성 사카라이드가 바람직하다.
화학식(IV)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00224
를 나타내고;
U2는
Figure pct00225
를 나타내고;
U4은
Figure pct00226
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00227
또는
Figure pct00228
를 나타내고;
m은 0 또는r 1의 정수이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(IV)의 컨주게이트가 바람직하다.
화학식(IV)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00229
를 나타내고;
U2는
Figure pct00230
를 나타내고;
U4은
Figure pct00231
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00232
을 나타내고;
m이 1 내지 10의 정수이고,
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(IV)의 컨주게이트가 바람직하다.
화학식(V)의 컨주게이트가 또한 바람직하다:
Figure pct00233
상기 식에서,
U1은
Figure pct00234
를 나타내고;
U2는
Figure pct00235
를 나타내고;
U4은
Figure pct00236
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00237
또는
Figure pct00238
를 나타내고;
L, E1, i, m, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
화학식(V)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00239
를 나타내고;
U2는
Figure pct00240
를 나타내고;
m은 0이고, L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(V)의 컨주게이트가 또한 바람직하다.
화학식(V)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00241
를 나타내고;
U2는
Figure pct00242
를 나타내고;
U4은
Figure pct00243
를 나타내고;
m은 0이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(V)의 컨주게이트가 또한 바람직하다.
화학식(V)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00244
를 나타내고;
U2는
Figure pct00245
를 나타내고;
m은 0이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(V)의 컨주게이트가 또한 바람직하다.
화학식(V)의 컨주게이트로서,
U1은
Figure pct00246
를 나타내고;
U2는
Figure pct00247
를 나타내고;
U4은
Figure pct00248
를 나타내고;
U5는 공유결합, 또는
Figure pct00249
을 나타내고;
m은 1 내지 10의 정수이고;
L, E1, i, n, k, x, 및 y는 본원에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 화학식(V)의 컨주게이트가 또한 바람직하다.
화학식(V-1) -(V-14) 중 어느 하나의 컨주게이트가 더욱 바람직하다:
Figure pct00250
Figure pct00251
Figure pct00252
Figure pct00253
Figure pct00254
Figure pct00255
Figure pct00256
상기 식에서,
R1 및 R*는 독립적으로 -H, 또는
Figure pct00257
를 나타내고;
여기에서, R1 및 R*는 동시에
Figure pct00258
일 수 없고;
L, E1, T, i, m, k, 및 n은 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖고, 바람직하게는, n 및 m은 1 내지 10의 정수이다.
더욱 바람직하게는, n이 1 내지 10의 정수인 화학식(III), (IV), (V) 및 (V-1) - (V-14) 중 어느 하나의 컨주게이트.
더욱 바람직하게는, i가 4 내지 10으로부터 선택되는 화학식(III), (IV), (V) 및 (V-1) - (V-14) 중 어느 하나의 컨주게이트.
바람직하게는, -T-는
Figure pct00259
이고, a는 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택된 정수이다.
따라서, -T-가
Figure pct00260
이고, a가 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택된 정수인 화학식(IV), (V) 및 (V-1) - (V-17) 중 어느 하나의 컨주게이트가 특히 바람직하다.
바람직하게는, 연결기 -L-는 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 및 -La-Ld-Le-로부터 선택되고;
-La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2로부터 선택되고;
-Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
-Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 및 -(CH2-CH2-O)q-CH2-로부터 선택되고;
-Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 및 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-로부터 선택되고;
o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이다.
가장 바람직한 구체예에서, E1은 공유결합, -NH-, -CH=CH-, -CONH-,
Figure pct00261
이다.
또 다른 구체예에서, 상기 면역원성 캐리어는 바람직하게는 면역조절 특성을 갖는 글리코-스핑고리피드, 및 더욱 바람직하게는 (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노실아미노옥타데칸-3,4-디올이다. 본원에서 사요오딘 용어, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드는 표적 항원에 면역계의 반응을 자극할 수 있지만, 상기 정의된 바와 같이 자체로는 면역성을 부여하지 않는 적합한 글리코스핑고리피드를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 글리코스핑고리피드는 스핑고지질(sphingolipid)에 α-연결된 탄수화물 모이어티를 함유하는 화합물이다. 바람직하게는, 탄수화물 모이어티는 헥소피라노스(hexopyranose)이며, 가장 바람직하게는 α-D-갈락토피라노스이다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는, 스핑고지질은 아미드 결합을 통해서 지방산에 연결된 C18 아미노 알코올을 함유하는 일종의 지질이다. C18 아미노 알코올은 바람직하게는 하이드록실기로 모노-, 디- 또는 폴리치환된다. 특히 바람직하게는, C18 아미노 알코올은 피토스핑고신(phytosphingosine)이다. 지방산은 바람직하게는 16 내지 28개, 더욱 바람직하게는 18 내지 26개 범위의 탄소수의 포화된 알킬 사슬을 갖는 모노카르복실산이다. 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드는, 이로 한정되는 것은 아니지만, (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노실아미노옥타데칸-3,4-디올을 포함하고, 이는 천연 킬러 T(NKT) 세포에 의한 천연 킬러(NK) 활성 및 시토카인 생산을 자극할 수 있고, 생체내 효능적인 항종양 활성을 나타낸다(Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1998, 95, 5690).
면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드와의 화학식(I)의 사카라이드의 컨주게이트는 열에 안정한 이점을 갖는다. 추가로 이들은 마우스에서 화학식(I)의 사카라이드 및 CRKP의 O-폴리사카라이드에 대한 IgG1, IgG2a 및 IgG3 항체의 높은 역가를 생성시킬 수 있다. 컨주게이션에 적합하게 하기 위해서, 작용성은 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드상에 도입된다. 상기 작용성은 화학식(I)의 사카라이드의 연결기의 말단 아미노기와 직접적으로 반응하여 화학식(I)의 사카라이드의 컨주게이트를 제공하거나, 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 면역조절 특성을 갖는 개질된 글리코스핑고리피드를 제공하기 쉽다.
바람직하게는, 상기 작용성은 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드의 갈락토오스 모이어티의 탄소 6에서 도입된다. 따라서, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드는 사카라이드의 말단 아미노기 또는 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하기 쉬운 작용기로 작용성화된다. 아미노기와 반응하기 쉬운 작용기는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 활성화된 에스테르, 이소시아네이트기, 알데하이드, 에폭사이드, 이미도에스테르, 카르복실산, 알킬 설포네이트 및 설포닐 클로라이드를 포함한다. 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 상호연결 분자의 작용기 X를 제시하는 면역조절 특성을 갖는 개질된 글리코스핑고리피드를 제공하기 쉬운 작용기는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 아민, 알코올, 티올, 활성화된 에스테르, 이소시아네이트기, 알데하이드, 에폭사이드, 비닐, 이미도에스테르, 카르복실산, 알킬 설포네이트, 설포닐 클로라이드, 비닐기, 알키닐기 및 아지도기를 포함한다.
바람직하게는, 면역조절 특성을 갖는 글리코스핑고리피드의 탄수화물 모이어티의 C6에서 도입되는 작용기는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 비닐, 말레이미드, α-아이오도아세틸, α-브로모아세틸, N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS), 및 2-피리딜디티올을 포함하거나 함유하는 군으로부터 선택된다.
상호연결 분자의 상기 작용기 X는 말레이미드, α-아이오도아세틸, α-브로모아세틸, N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS), 알데하이드, 카르복실산, 에폭사이드, 알킬 설포네이트, 설포닐 클로라이드, 무수물, 및 카르보네이트를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용된 용어 "상호연결 분자"는 작용기 X와 작용기 Y를 함유하는 이작용성 분자로서, 작용기 X가 연결기 -L- 상의 말단 아미노기와 반응할 수 있고, 작용기 Y가 면역원성 캐리어 또는 고체 지지체 상에 존재하는 작용기와 반응할 수 있는, 이작용성 분자를 나타낸다.
화학식(I), (I-A), (I-B), (I-1) - (I-5), (II-1) - (II-17) 중 어느 하나, 바람직하게는, 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700 중 어느 하나의 적어도 한 사카라이드롤 포함하는 컨주게이트, 및 특히, 화학식(III), (IV), (V) 및 (V-1) - (V-14) 중 어느 하나의 컨주게이트가 인간 및/또는 동물 숙주에서 방어성 면역 반응을 유발시키며, 그에 따라서, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 면역원성 캐리어에 컨주게이션된 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 컨주게이트는 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환은 폐렴(pneumonia), 기관지염(bronchitis), 수막염(meningitis), 요로 감염증(urinary tract infection), 병원내 폐렴(nosocomial pneumonia), 복강내 감염증(intra-abdominal infection), 상처 감염증(wound infection), 혈액의 감염증(infection of blood), 골수염(osteomyelitis), 균혈증(bacteremia), 패혈증(septicemia) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)을 포함한다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg(갈락탄-III), O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
약제학적 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 면역원성 캐리어에 컨주게이션된 화학식(I)의 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 적어도 하나의 컨주게이트 및/또는 화학식(I)의 적어도 하나의 사카라이드를 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 애주번트 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 인간 및/또는 동물 숙주에서의 방어성 면역 반응을 상승시키기 위해서 사용될 수 있다. 이상적으로는, 약제학적 조성물은 인간에서의 사용에 적합하다.
특히, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신은 인간 및/또는 동물 숙주에서 방어성 면역 반응을 유발시키며, 그에 따라서, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신은 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환은 폐렴, 기관지염, 수막염, 요로 감염증, 병원내 폐렴, 복강내 감염증, 상처 감염증, 혈액의 감염증, 골수염, 균혈증, 패혈증 및 강직성 척추염을 포함한다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신은 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 이로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP)으로부터 선택된 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에 유용하다. 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg(갈락탄-III), O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
바람직하게는, 약제학적 조성물 또는 백신은 활성 성분으로서 화학식(I-1) - (I-5), (II-1) - (II-17) 중 어느 하나의 적어도 하나의 사카라이드 및/또는 화학식(I-1) - (I-5), (II-1) - (II-17) 중의 어느 하나의 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 컨주게이트 중 적어도 하나를 포함한다.
특히, 약제학적 조성물 또는 백신은 화학식(III), (IV), (V) 및 (V-1) - (V-14) 중 어느 하나의 적어도 하나의 컨주게이트를 포함하고,
더욱 바람직하게는, 약제학적 조성물 또는 백신은 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, 및 P-01 - P-70 및/또는 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, P-01 - P70 및 Q-1 - Q-700 중 적어도 하나를 포함하는 컨주게이트 중 적어도 하나를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 약제학적 조성물 또는 백신은 사카라이드 A-01 - A-07, A-11 - A17, A-21 - A-27, A-31 - A-37, A-41 - A-47, A-51 - A-57, A-61 - A-67, A-71 - A-77, A-81 - A-87, A-91 - A-97, A-101 - A-107, A-111 - A-117, A-121 - A-127, A-131 - A-137, F-01, F-19, F-27, F-31, F-36, F-54, F-62, F-66, F-71, F-89, F-97, F-101, F-106, F-124, F-132, F-136, F-141, F-159, F-167, F-171, F-176, F-194, F-202, F-206, F-211, F-229, F-237, F-241, F-246, F-264, F-299, F-281, F-272, F-276, F-307, F-311, F-316, F-334, F-342, F-346, F-351, F-414, F-417, F-421, F-426, F-444, F-452, F-456, F-461, F-479, F-487, F-491, F-496, F-514, F-522, F-526, K-01, K-06, K-11, K-26, K-31, K-36, K-51, K-56, K-61, K-76, K-81, K-86, K-101, K-106, K-111, K-126, K-131, K-136, K-151, K-156, K-161, K-176, K-181, K-186, K-201, K-206, K-211, K-226, K-231, K-236, K-251, K-256, K-261, K-276, K-281, K-286, K-301, K-306, K-311, K-326, K-331, K-336, O-01, O-02, O-03, O-06, O-07, O-08, O-11, O-12, O-13, O-16, O-17, O-18, O-21, O-22, O-23, O-26, O-27, O-28, O-31, O-32, O-33, O-36, O-37, O-38, O-41, O-42, O-43, O-46, O-47, O-48, O-51, O-52, O-53, O-56, O-57, O-58, O-61, O-62, O-63, O-66, O-67, O-88, P-01 - P-03, P-06 - P-08, P-11 - P-13, P-16 - P-18, P-21 - P-23, P-26 - P-28, P-31 - P-33, P-36 - P-38, P-41 - P-43, P-46 - P-48, P-51 - P-53, P-56 - P-58, P-61 - P-63, P-66 - P-68, Q-1, Q-26, Q-101, Q-151, Q-251, Q-301, Q-351, Q-376, Q-451, Q-501, Q-551, Q-601 및 Q-651 중 적어도 하나, 및/또는 사카라이드 A-01 - A-07, A-11 - A17, A-21 - A-27, A-31 - A-37, A-41 - A-47, A-51 - A-57, A-61 - A-67, A-71 - A-77, A-81 - A-87, A-91 - A-97, A-101 - A-107, A-111 - A-117, A-121 - A-127, A-131 - A-137, F-01, F-19, F-27, F-31, F-36, F-54, F-62, F-66, F-71, F-89, F-97, F-101, F-106, F-124, F-132, F-136, F-141, F-159, F-167, F-171, F-176, F-194, F-202, F-206, F-211, F-229, F-237, F-241, F-246, F-264, F-299, F-281, F-272, F-276, F-307, F-311, F-316, F-334, F-342, F-346, F-351, F-414, F-417, F-421, F-426, F-444, F-452, F-456, F-461, F-479, F-487, F-491, F-496, F-514, F-522, F-526, K-01, K-06, K-11, K-26, K-31, K-36, K-51, K-56, K-61, K-76, K-81, K-86, K-101, K-106, K-111, K-126, K-131, K-136, K-151, K-156, K-161, K-176, K-181, K-186, K-201, K-206, K-211, K-226, K-231, K-236, K-251, K-256, K-261, K-276, K-281, K-286, K-301, K-306, K-311, K-326, K-331, K-336, O-01, O-02, O-03, O-06, O-07, O-08, O-11, O-12, O-13, O-16, O-17, O-18, O-21, O-22, O-23, O-26, O-27, O-28, O-31, O-32, O-33, O-36, O-37, O-38, O-41, O-42, O-43, O-46, O-47, O-48, O-51, O-52, O-53, O-56, O-57, O-58, O-61, O-62, O-63, O-66, O-67, O-88, P-01 - P-03, P-06 - P-08, P-11 - P-13, P-16 - P-18, P-21 - P-23, P-26 - P-28, P-31 - P-33, P-36 - P-38, P-41 - P-43, P-46 - P-48, P-51 - P-53, P-56 - P-58, P-61 - P-63, P-66 - P-68, Q-1, Q-26, Q-101, Q-151, Q-251, Q-301, Q-351, Q-376, Q-451, Q-501, Q-551, Q-601 및 Q-651 중 적어도 하나를 포함하는 컨주게이트 중 적어도 하나를 포함한다.
올리고사카라이드의 농축
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 약제학적 조성물 또는 백신은 추가로 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2a, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 카르바페넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 ST258을 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아의 협막 폴리사카라이드 단편, O-폴리사카라이드 및/또는 협막 폴리사카라이드, O-폴리사카라이드 단편 및/또는 이들의 단백질 컨주게이트 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "애주번트"는 면역학적 애주번트, 즉, 백신과 항원적으로 관련됨이 없이 백신에 함유되는 주어진 항원에 대한 면역 반응을 향상시킴으로써 상기 백신의 효과를 변화시키거나 증강시키는 백신 조성물에 사용되는 물질을 나타낸다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는, 면역학적 애주번트의 통상적으로 인식되는 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 오일 에멀션(예, 프로인트 애주번트(Freund's adjuvant)), 사포닌, 알루미늄 또는 칼슘 염(예, 알럼(alum)), 비-이온성 블록 폴리머 계면활성제 및 기타 다수를 포함한다.
약제학적 조성물은 특히 투여 시점에 바람직하게는 수성 형태이지만, 이들은 또한 비-수성 액체 형태로 또는 건조된 형태로, 예를 들어, 젤라틴 캡슐로서 또는 동결 건조물 등으로서 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 하나 이상의 보존제, 예컨대, 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 무-수은 조성물이 바람직하고, 무-보존제 백신이 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 생리적 염, 예컨대, 나트륨 염을 포함하여 긴장성(tonicity)을 조절할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 전형적이며, 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산나트륨 탈수물(disodium phosphate de수화물), 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
약제학적 조성물은 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg의 오스말농도(osmolality)를 가질 수 있다.
약제학적 조성물은 담수(예, w.f.i.) 중의 화합물(불용성 금속 염이 있거나 없음)을 포함할 수 있지만, 일반적으로는 하나 이상의 완충제를 포함할 것이다. 전형적인 완충제는 포스페이트 완충제; 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 석시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히, 알루미늄 하이드록사이드 애주번트와 함께); 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제 염은 전형적으로는 5-20 mM 범위로 포함될 것이다.
약제학적 조성물은 전형적으로는 5.0 내지 9.5, 예를 들어, 6.0 내지 8.0의 pH를 갖는다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이며 무-글루텐이다.
약제학적 조성물은 동물(및 특히, 인간) 환자에게 투여하기에 적합하고, 그에 따라서, 인간 및 수의학적 사용 둘 모두를 포함한다. 이들은, 환자에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 환자에게서 면역 반응을 상승시키는 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 대상체가 클렙시엘라 뉴모니아에 노출되기 전에 및/또는 대상체가 클렙시엘라 뉴모니아에 노출된 후에 투여될 수 있다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료를 위한 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신의 제조를 위한 면역원성 캐리어에 컨주게이션된 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 적어도 하나의 컨주게이트 및/또는 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드의 용도에 관한 것이고, 특히, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아와 연관된 질환은 폐렴, 기관지염, 수막염, 요로 감염증, 병원내 폐렴, 복강내 감염증, 상처 감염증, 혈액의 감염증, 골수염, 균혈증, 패혈증 및 강직성 척추염을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신의 제조를 위한 화학식(I-1) - (I-7), (II-1) - (II-17) 중 어느 하나의 적어도 하나의 사카라이드 및/또는 화학식(I-1) - (I-7), (II-1) - (II-17) 중 어느 하나의 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 컨주게이트 중 적어도 하나의 용도를 나타낸다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신의 제조를 위한 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70, P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700 중 적어도 하나 및/또는 사카라이드 A-01 - A-140, B-01 - B-140, C-01 - C-70, D-01 - D-70, E-01 - E-70, F-01 - F-530, G-01 - G-350, H-01 - H-350, J-01 - J-350, K-01 - K-350, M-01 - M-70, N-01 - N-70, O-01 - O-70 및 P-01 - P-70 및 Q-1 - Q-700 중 적어도 하나를 포함하는 컨주게이트 중 적어도 하나의 용도를 나타낸다.
특히, 본 발명은 상기 약제학적 조성물 또는 상기 백신의 제조를 위한 화학식(III), (IV), (V) 및 (V-1) - (V-14) 중 어느 하나의 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 컨주게이트 중 어느 하나의 적어도 하나의 컨주게이트의 용도를 나타낸다.
약제학적 조성물은 단위 용량형(unit dose form)으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 컨주게이트의 투여량은 0.1 내지 10 μg, 바람직하게는 1 내지 10 μg, 바람직하게는 0.2 내지 9 μg, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 9 μg, 바람직하게는 1 내지 6 μg, 및 가장 바람직하게는 1 내지 5 μg이다. 일부 구체예에서, 단위 투여량은 0.1-1.0 mL, 예를 들어, 약 0.5 mL의 부피를 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 함유하는, 예를 들어, 단위 투여량을 함유하는 전달 장치(예, 주사기, 분사기, 분무기, 흡입기, 피부 패치 등)를 제공한다. 이러한 장치는 척추동물 대상체에 조성물을 투여하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 함유하는, 예를 들어, 단위 투여량을 함유하는 무균 컨테이너(예, 바이알)을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 투여량을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 함유하는 기밀하게 밀봉된 용기를 제공한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 바이알을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주사 가능 물질로서, 즉, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 주입 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다(예, 동결 건조된 조성물 또는 스프레이-동결 건조된 조성물). 조성물은 국소 투여를 위해서, 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여를 위해서, 예를 들어, 정제 또는 캡슐로서, 스프레이로서, 또는 시럽으로서(임의로 향료 첨가됨) 제조될 수 있다. 조성물은 폐 투여를 위해서, 예를 들어, 흡입기에 의해서, 미세한 분말 또는 스프레이를 사용한 폐 투여를 위해서 제조될 수 있다. 조성물은 좌제로서 제조될 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해서, 예를 들어, 스프레이 또는 점적제(drops)로서 제조될 수 있다. 근육내 투여를 위한 주사 가능한 물질이 전형적이다.
약제학적 조성물은 애주번트의 효과적인 양, 즉, 단일 용량으로 또는 시리즈 중 일부로서 개체에게 투여되는 때에, 동시-투여된 클렙시엘라 뉴모니아 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기에 효과적인 양을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
이러한 양은 처리되는 개체의 건강 및 물리적인 조건, 연령, 처리되는 개체의 분류 군(예, 비-인간 영장류, 영장류, 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 요구되는 방어 정도, 백신의 제형화, 의학적 상황의 치료 의사의 평가, 및 그 밖의 관련 인자에 따라서 다양할 수 있다. 이러한 양은 비교적 넓은 범위에 있을 것이며, 이는 통상적인 시험을 통해서 결정될 수 있다.
본 발명의 백신의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따른 한 컨주게이트 또는 화학식(I)의 하나의 사카라이드의 치료 유효 투여량은 질환에 대한 적어도 부분적인 면역화를 생성시키는 화합물의 양을 나타낸다. 그러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물 중의 표준 약제학적, 약리학적, 및 독물학적 절차에 의해서 측정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 투여량 비율이 치료학적 지표이다. 투여되는 조성물의 실제 양은 치료되는 대상체, 대상체의 체중, 고통의 중증도, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 및/또는 동물 숙주에서 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 화학식(I)의 사카라이드 및/또는 이의 염 및/또는 이의 컨주게이트 또는 이의 약제학적 조성물을 상기 인간 및/또는 동물 숙주에게 투여함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 및/또는 동물 숙주에서의 클렙시엘라 뉴모니아에 의해서 유발된 질환을 치료 또는 방지하는 방법은 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드 및/또는 이의 염 및/또는 이의 컨주게이트 또는 이의 약제학적 조성물을 상기 인간 및/또는 동물 숙주에게 투여함을 포함한다. 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
면역학적 분석
본 발명의 또 다른 양태는 O-폴리사카라이드 또는 협막 폴리사카라이드에 하기 사카라이드 단편 중 하나를 함유하는, 박테리아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서 마커로서 사용하기 위한 화학식(I)의 사카라이드를 나타낸다:
→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→
→3)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→
[→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n
[→5)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n.
Figure pct00262
Figure pct00263
Figure pct00264
.
바람직하게는, 화학식(I)의 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서 마커로서 유용하다.
그러한 분석은, 예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 항체의 검출에 유용한 마이크로어레이(microarray) 및 ELISA를 포함한다.
본 발명의 사카라이드는 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 항체의 검출에 유용한 면역학적 분석을 제공하기 위한 고체 지지체에 용이하게 컨주게이션될 수 있다.
바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아는 O1, O2, O2ac, O3, O4, O5, O7, O8, O12 및 이의 서브타입을 포함하거나 그로 이루어진 O-혈청형 및 카르바페넴 내성 클렙시엘라 뉴모니아(CRKP), 바람직하게는, O-혈청형 O1, O2a, O2ac, O2ae, O2aeh, O2afg, O8, 및 CRKP 균주 ST 258, 더욱 바람직하게는 O1, O2a, O2ab, O2ac, O2afg, O8, CRKP 균주 ST 258로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 클렙시엘라 뉴모니아 균주 혈청형은 O1:K1, O1:K2, O1:K7, O1:K8, O1:K10, O1:K12, O1:K16, O1:K19, O1:K21, O1:K22, O1:K27, O1:K34, O1:K42, O1:K45, O1:K55, O1:K57, O1:K62, O1:K65, O1:K66, O1:K69 및 O1:K70, O2a, O2ac, 및 CRKP 균주 ST 258이다.
상기 고체 지지체는 그들의 표면상에서, 화학식(I)의 사카라이드의 아미노기 또는 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 개질된 고체 지지체를 제공하기 쉬운 작용성을 제시하여, 화학식(I)의 사카라이드의 아미노기와 추가로 반응할 수 있는 상호연결 분자의 작용기 X를 그들의 표면상에서 제시한다. 본 발명에 따른 구체예에서, 고체 지지체는 상호연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 개질된 마이크로어레이 슬라이드(microarray slide)를 제공하기 쉬운 작용성을 그들의 표면에서 제시하여, 그들의 표면상에서 상호연결 분자의 작용기 X를 제시하는 마이크로어레이 슬라이드이다. 그러한 마이크로어레이 슬라이드의 예는 이로 한정되는 것은 아니지만, Corning® 에폭사이드 코팅된 슬라이드 또는 Corning® GAPS™ II 코팅된 슬라이드를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 고체 지지체는 화학식(I)의 사카라이드의 아미노기, 및 더욱 바람직하게는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 활성화된 에스테르와 반응하기 쉬운 작용성을 그들의 표면 상에서 제시하는 마이크로어레이 슬라이드이다. 그러한 마이크로어레이 슬라이드는, 예를 들어, CodeLink® NHS 슬라이드이다.
도 1은 클렙시엘라 뉴모니아 O-폴리사카라이드의 반복 단위의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2는 클렙시엘라 뉴모니아 O-폴리사카라이드의 반복 단위의 화학적 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 상호연결 분자의 작용기 X의 예를 제공한다.
도 4a는 본 발명의 올리고사카라이드의 컨주게이트를 개략적으로 나타내고, 도 4b는 CRM197 캐리어 단백질에 컨주게이션되는 본 발명의 사카라이드의 일부 예를 열거하고 있다.
도 5는 10 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 해결된 면역화 실험에서 사용된 글리코컨주게이트(2.5 μg/웰) 61*-CRM197 및 158*-CRM197의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 6은 KPC 글리코컨주게이트 61*-CRM197 및 158*-CRM197의 SEC 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 61*-CRM197 또는 158*-CRM197 제형으로 면역화된 마우스(n=6)로부터의 0일 및 35일에 모은 혈청의 ELISA 역가를 나타낸다. 상기 제형의 혈청을 O-항원 BSA 컨주게이트 61*-BSA 또는 158*-BSA에 대해서 시험하였다. 혈청을 1% BSA-PBS으로 1:100, 1000 및 10,000으로 희석시켰다. 0.5 μg의 상응하는 O-항원/BSA 컨주게이트로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰당 희석된 혈청(100 μL)을 첨가하였다. 1:10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-마우스 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
도 8은 61*-CRM197 또는 158*-CRM197 제형으로 면역화된 마우스(n=6)로부터 0일 및 35일에 모은 혈청의 가교-반응을 나타낸다. 상기 제형의 혈청을 상응하는 균주 61*: LPS (O1) 및 158*: LPS (Gal-III)로부터의 LPS에 대해서 시험하였다. 둘 모두의 경우에서, 혈청을 1% BSA-PBS으로 1:200으로 희석시켰다. 1.0 μg의 상응하는 LPS로 코팅된 마이크로역가 플레이트의 웰당 희석된 혈청(100 μL)을 첨가하였다. 1:10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-마우스 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
도 9는 61*-CRM197 제형으로 면역화된 토끼(n=4)로부터의 0일 및 35일에 모은 혈청의 가교 반응성을 나타낸다. 61*-CRM197 제형의 혈청을 상이한 KPC 균주로부터 분리된 LPS에 대해서 시험하였다. 혈청을 LPS (O1), 상업적-LPS(O2a,c), LPS (O2a), 및 LPS (Gal III)에 대해서 시험하였다. 혈청을 1% BSA-PBS으로 1:200으로 희석시켰다. 1.0 μg의 상응하는 LPS로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰당 100 μLd의 희석된 혈청을 첨가하였다. 1:10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-토끼 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
도 10은 58*-CRM197 제형으로 면역화된 토끼(n=4)로부터의 0일, 7일, 21일 및 35일에 모은 혈청의 ELISA 역가를 나타낸다. 158*-CRM197 제형의 혈청을 상응하는 O-항원/BSA 컨주게이트 158*-BSA에 대해서 시험하였다. 혈청을 1% BSA-PBS으로 1:1000 및 10,000으로 희석시켰다. 0.5 μg의 상응하는 O-항원/BSA 컨주게이트로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰당 희석된 혈청(100 μL)을 첨가하였다. 1:10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-토끼 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
도 11은 158*-CRM197 제형으로 면역화된 토끼(n=4)로부터 0일 및 35일에 모은 혈청의 가교-반응을 나타낸다. 158*-CRM197 제형의 혈청을 상이한 KPC 균주로부터 분리된 LPS에 대해서 시험하였다. 혈청을 LPS(O1), 상업적-LPS (O2a,c), LPS(O2a), 및 LPS(Gal III)에 대해서 시험하였다. 혈청을 1% BSA-PBS로 1:200으로 희석시키고, 1.0 μg of 상응하는 LPS로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰당 100 μL의 희석된 혈청을 첨가하였다. 1:10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-토끼 이차 항체를 사용하여 검출을 수행하였고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
도 12은 본 발명의 올리고사카라이드 내에서 사용되는 추가의 연결기 L' 및출발물질을 나타낸다.
실시예
A. 화학적 합성
일반적인 정보:
달리 언급되지 않는 한, 상업적 등급 용매를 사용하였다. 건조한 용매를 Waters Dry Solution System으로부터 얻었다. 크로마토그래피를 위한 용매를 사용 전에 증류시켰다. 민감성 반응이 열-건조된 유리 제품에서 아르곤 대기 하에 수행하였다. 분석용 박층 크로마토그래피(TLC)를 0.25 mm 두께의 실리카겔로 사전 코팅된 Kieselgel 60 F254 유리 플레이트 상에서 수행하였다. 스팟(spot)들을 바닐린 용액(95% EtOH 중의 6%(w/v) 바닐린 및 10%(v/v) 황산) 또는 한센 염색(Hanessian's stain)(물 중의 5%(w/v) 암모늄 몰리브데이트, 1%(w/v) 세륨(II) 설페이트 및 10%(v/v) 황산)으로 염색함으로써 가시화시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피를 Fluka Kieselgel 60(230-400 mesh) 상에서 수행하였다.
1H, 13C 및 이차원 NMR 스펙트럼을 296 K에서 Varian 400-MR 분광계로 측정하였다. 화학적 이동(Chemical shifts: d)을 각각의 잔류 용매 피크에 대해서 백만분율(ppm)으로 보고한다(CDCl3: 1H NMR에서 d 7.26 및 13C NMR에서 d 77.16; CD3OD: 1H NMR에서 d 3.31 및 13C NMR에서 d 49.15). 다음 약어를 사용하여 피크의 다중도를 나타낸다: s 단일선; d 이중선; dd 이중선의 이중선; t 삼중선; dt 삼중선의 이중선; q 사중선; m 다중선. 결합상수(J)는 헤르쯔(Hz)로 보고된다. 광학 회전(OR) 측정은 λ = 589 nm 및 괄호로 표시된 용매 중의 g/100 mL로 표현된 농도(c)에서 Schmidt & Haensch UniPol L1000 편광계로 수행하였다. 고분해능 질량 분광법(High resolution mass spectrometry: HRMS)을 Agilent 6210 ESI-TOF 질량 분광계로 Free University Berlin, Mass Spectrometry Core Facility에서 수행하였다. 적외선(IR) 스펙트럼을 출원인의 설비에서 Perkin Elmer 100 FTIR 분광계로 측정하였다.
약어
AcOH 아세트산
Alloc 알릴옥시카르보닐
aq. 수성
BH3 보란
BBr3 보론 트리브로마이드
BnBr 벤질 브로마이드
Boc 3차-부톡시카르보닐
br. 광대역
CAS CAS 등록번호(CAS = Chemical Abstracts Service)
CHCl3 클로로포름
cHex 사이클로헥산
d 이중선
dd 이중선의 이중선
DCM 디클로로메탄
DEAD 디에틸 아조디카르복실레이트
DIPEA N,N-디이소프로필-에틸아민
DME 디메톡시에탄
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
DPPA 디페닐포스포릴 아지드
EA 에틸 아세테이트
EDC·HCl N1-((에틸이미노)메틸렌)-N3,N3-디메틸프로판-1,3-디아민 하이드로클로라이드
ES 전기분무
Et2O 디에틸 에테르
EtOAc 에틸 아세테이트
h 시간
HCl 염산
H2O 물
HOBt.H2O 1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-올 하이드레이트
K2CO3 탄산칼륨
LiAlH4 리튬 알루미늄 하이드라이드
m 다중선
ACN 아세토니트릴
MeOH 메탄올
MeI 메틸 아이오다이드
MgSO4 황산마그네슘
min 분
MS 질량 분광분석
Na2CO3 탄산나트륨
NaCNBH3 소듐 시아노보로하이드라이드
NaHCO3 중탄산나트륨
NaH 수소화나트륨
NaOH 수산화나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NCS N-클로로석신이미드
NMR 핵자기공명(nuclear magnetic resonance)
PBS 포스페이트-완충된 염수
Pd/C 탄소상 팔라듐(palladium on carbon)
q 사중선
RM 반응 혼합물
RBF 둥근 바닥 플라스크
rt 실온
s 단일선
sat. 포화됨
sep 칠중선(septet)
SM 출발물질
t 삼중선
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
TsOH 토식산(tosic acid)
Wt 중량.
일반적인 방법
이미데이트 합성-일반적인 원안 A: 기질(1 eq)을 회전증발기에서 고진공 하에 밤새 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 고형물을 질소 대기 하에 DCM에 취하고, Cs2CO3(4 eq)를 그에 첨가하고, 10 분 동안 교반시켰다. (E)-2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(3 eq)을 순수한 RM에 첨가하고, RM을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. RM을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM으로 세척하였다. 합한 여액을 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 용리액으로서 트리에틸아민 및 에틸 아세테이트/시클로헥산로 처리된 실리카 컬럼 상에서 정제를 수행하였다. 용매의 제거 및 진공 하의 건조는 화합물을 엷은 황색빛 고형물로서 생성시켰다.
이미데이트 합성-일반적인 원안 B: 기질(1 eq)을 회전증발기에서 고진공 하에 밤새 톨루엔을 사용하여 공비 제거하였다. 고형물을 질소 대기 하에 DCM에 취하고, Cs2CO3(4 eq)을 그것에 첨가하고, 10 분 동안 교반시켰다. (E)-2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(3 eq)를 순수한 RM에 첨가하고, RM을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. RM을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM으로 세척하였다. 합한 여액을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 담황색 생성물을 생성시켰다.
글리코실화 방법 - 일반적인 원안 A: 수용체(1 eq) 및 공여체(1 eq-1.5 eq) 둘 모두를 RBF에 취하고, 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 혼합물을 RT에서 톨루엔-디옥산 (3:1)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, 실온에서(rt)에서 30 분 동안 N2 대기 하에 교반시켰다. RM을 얼음 배쓰를 사용하여 -2℃로 냉각시키고, TMSOTf(0.2 eq)를 RM에 첨가하고, RM을 5℃에서 20 분 동안 교반시켰다. 이어서, RM을 1 시간에 걸쳐서 실온으로 서서히 가온하였다. TLC 분석을 수행하여 반응의 완료를 모니터링하였다. RM을 포화 NaHCO3로 켄칭시키고, 10 분 동안 교반시키고, EA로 추출하였다. 합한 유기물들을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 상의 컬럼 정제를 실리카 컬럼을 사용한 Biotage 상에서 EA/사이클로헥산을 사용하여 수행하였다. 생성물을 함유하는 분획을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 요망되는 생성물을 얻었다.
글리코실화 방법 - 일반적인 원안 B: 수용체(1 eq) 및 공여체(1 eq-1.5 eq) 둘 모두를 RBF에 취하고, 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 혼합물을 RT에서 DCM에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, RT에서 30 분 동안 N2 대기 하에 교반시켰다. RM을 얼음 배쓰를 사용하여 -2℃로 냉각시키고, TMSOTf(0.2 eq)를 RM에 첨가하고, RM을 5℃에서 20 분 동안 교반시켰다. 이어서, RM을 1 시간에 걸쳐서 실온으로 서서히 가온하였다. TLC 분석을 수행하여 반응의 완료를 모니터링하였다. RM을 포화 NaHCO3로(또는 TEA로) 켄칭시키고, 10 분 동안 교반시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기물들을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 상의 컬럼 정제를 실리카 컬럼을 사용한 Biotage 상에서 EA/사이클로헥산을 사용하여 수행하였다. 생성물을 함유하는 분획을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 요망되는 생성물을 얻었다.
Lev 기 탈보호 - 일반적인 원안 A: Lev-함유 기질(1 eq)을 RT에서 피리딘에 취하고, 하이드라진 아세테이트(3 eq)를 그것에 첨가하고, RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC 분석에 의해서 모니터링하였다. 이어서, RM을 아세톤(100 eq)으로 켄칭시키고, 45 분 동안 RT에서 교반시켰다. 이어서, RM을 진공 중에서 건조한 상태로 증발시켰다. 잔기를 용리액으로서 EA-사이클로헥산을 사용한 실리카 컬럼 상의 Biotage를 사용하여 정제하여 당 활성 스폿(sugar active spot)을 얻었다. 고진공 하에 증발 및 건조 시에, 요망되는 화합물이 무색의 고무질 액체로서 얻어졌다.
Nap 기 탈보호 - 일반적인 원안 A: NAP-함유 기질(1 eq)을 RT에서 DCM-완충 용액(1-2)에 취하고, DDQ (3-4 eq)를 20분 내지 1 시간에 걸쳐서 분량으로 첨가하였다. RM은 검은색으로 변하였고, 이어서, 적갈색으로 변했다. RM을 2 내지 5 시간 동안 교반시켰다. 반응을 반응의 완료에 대해서 TLC에 의해서 모니터링하였다. RM을 NaHCO3 용액으로 켄칭시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로서 EA/Chx 상의 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물을 얻었다.
TDS 기 탈보호 - 일반적인 원안 A: 기질(1 eq)을 RT에서 50 mL 팔콘 튜브(falcon tube) 중의 피리딘에 취하고, 5 분 동안 교반시켰다. 이어서, HF-Py(15 eq)를 그것에 첨가하였다(주의: 버블 및 발열). RM을 RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 SM이 존재하고 극성 스폿이 또한 형성됨을 나타냈다. 그래서, 10 당량(equivalent)의 HF-Py를 한번 더 RM에 첨가하고, RM을 RT에서 추가로 30 시간 동안 교반시켰고, TLC 분석은 여전히 약간의 SM이 존재하고 주요 극성 스폿이 또한 존재함을 나타냈다. RM을 물로 켄칭시키고, DCM으로 희석시키고, RT에서에서 교반하면서 층들을 혼합하고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 세척액(주의: 약간의 발포성), 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 백색 고무질 액체를 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 실리카 컬럼-EA/CHx를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물을 얻었다.
TDS 기 탈보호 - 일반적인 원안 B: 기질(1 eq)을 RT에서 50 mL 팔콘 튜브 중의 피리딘에 취하고, 5 분 동안 교반시켰다. 이어서, HF-Py(50-150 eq)를 그것에 첨가하였다(주의: 버블 및 발열). RM을 RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC 분석에 의해서 모니터링하였다. RM을 물로 켄칭시키고, DCM으로 희석시키고, RT에서에서 교반하면서 층들을 혼합하고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 세척액(주의: 약간의 발포성), 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 백색 고무질 액체를 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 실리카 컬럼-EA/CHx를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물을 얻었다.
메탄올 분해-일반적인 원안 A: 기질(1 eq)을 RT에서 THF-MeOH(1:1 mL)에 취하고, 메탄올 중의 과량의 0.5 M NaOMe 용액을 그것에 첨가하고, 55℃에서 18 시간 동안 계속 교반시켰다. RM을 진공 중에서 증발시켰다. EA 및 물로 희석시켰다. pH가 중성이 될 때까지 AcOH로 산화시켰다. EA로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 엷은 황색빛 층으로서 얻었다.
메탄올 분해-일반적인 원안 B: 기질(1 eq)을 RT에서 THF-MeOH(1:1 mL)에 취하고, 메탄올 중의 과량의 0.5 M NaOMe 용액을 그것에 첨가하고, 55℃에서 3일 동안 계속 교반시켰다. RM을 진공 중에서 증발시켰다. EA 및 물로 희석시켰다. pH가 중성이 될 때까지 AcOH로 산화시켰다. EA로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 엷은 황색빛 층으로서 얻었다.
수소화-일반적인 원안 A: 기질(1 eq)을 DCM:tBuOH:H2O의 혼합물에 취하고, 부탄올(0.2 mL) 중의 Pd/C(1 eq, w/w)의 현탁액을 그것에 첨가하고, ~10 바(bar)의 H2 대기 하에 18 내지 24 시간 동안 수소화시켰다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 메탄올, 물 중의 50% 메탄올로 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 생성물을 용리액으로서 물-아세토니트릴을 사용한 C18 sepak 컬럼을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 24 시간 동안 동결건조시켜 백색의 성긴 고형물을 요구되는 생성물로서 얻었다.
수소화 - 일반적인 원안 B: 기질(1 eq)을 DCM:tBuOH:H2O의 혼합물에 취하고, 부탄올(0.2 mL) 중의 Pd(OH)2(1 eq, w/w)의 현탁액을 그것에 첨가하고, ~10 바(bar)의 H2 대기 하에 18 내지 24 시간 동안 수소화시켰다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 메탄올, 물 중의 50% 메탄올로 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 생성물을 용리액으로서 물-아세토니트릴을 사용한 C18 sepak 컬럼을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 24 시간 동안 동결건조시켜 백색의 성긴 고형물을 요구되는 생성물로서 얻었다.
수소화 - 일반적인 원안 C: 기질(1 eq)을 DCM:IPA:H2O의 혼합물에 취하고, IPA 중의 Pd/C(1 eq, w/w)의 현탁액을 그것에 첨가하고, ~10 바(bar)의 H2 대기 하에 18 내지 24 시간 동안 수소화시켰다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 메탄올, 물 중의 50% 메탄올로 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 생성물을 용리액으로서 물-아세토니트릴을 사용한 C18 sepak 컬럼을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 24 시간 동안 동결건조시켜 백색의 성긴 고형물을 요구되는 생성물로서 얻었다.
A-1 모노사카라이드 빌딩 블록의 제조
화합물 1*
Figure pct00265
화합물 1*을 문헌[J. Org. Chem., 2007, 72 (17), pp 6513-6520]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 2*
Figure pct00266
화합물 1*(40 g, 80 mmol)를 무수 THF/DMF 9:1(390 mL)에 용해시키고, 빙수조로 0℃로 냉각시켰다. BnBr(20.9 g, 120 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 교반시켰다. 이어서, NaH(6.39 g, 160 mmol)를 0℃에서 5개의 분량으로 첨가하였다. NaH의 완전한 첨가 후에, 혼합물을 0℃에서 추가로 5분 동안 교반시키고, 이어서, 빙수조를 제거하고, 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 그것을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응물을 빙수조에 의한 냉각 하에 메탄올의 완만한 첨가에 의해서 켄칭시키고, 이어서, EtOAc/염수 상에 부었다. 층들을 분리하고, 수성층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 고진공 하에 건조시켜 오랜지색 고형물을 얻었다. 고형물을 메탄올로 세척하고 여과하였다. 용매를 증발시켜 생성물을 백색 고형물(47.1 g, 100%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C37H34O5SNa+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 613.2025, 실측치 613.2024.
화합물 3*
Figure pct00267
화합물 2*(47.1 g, 80 mmol)를 무수 DCM(500 mL)에 용해시키고, 에탄디올(35.4 mL, 478 mmol) 및 pTSOH (9.1 g, 47.8 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 for 0.5 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 트리에틸아민(50 mL)으로 켄칭시키고, 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 미정제 생성물을 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제한 후에, 용매를 증발시켜 생성물을 얻었다(38.18 g, 95%). HRMS(ESI+) C30H30O5SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 525.1712, 실측치 525.1708.
화합물 4*
Figure pct00268
디올 3*(15 g, 29.8 mmol)를 무수 DMF(300 mL)에 용해시키고, 빙수조로 0℃로 냉각시켰다. tBu2Si(OTf)2(19.72 g, 44.8 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반시켰다. 혼합물을 Et3N(9 mL)으로 중화시키고, 추가의 5분 동안 교반시켰다. 이어서, 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 분획들을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 미정제 화합물을 isolute® 상에 충전시키고, 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화 정제 시스템을 사용하여 정제하여 생성물을 얻었다(18.18 g, 95%). HRMS(ESI+) C38H46O5SSiNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 665.2733, 실측치 665.2682.
화합물 5*
Figure pct00269
화합물 5*을 문헌[J. Org. Chem. 2006, 71, 9658]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 6*
Figure pct00270
화합물 5*(8.6 g, 20.65 mmol)를 무수 DCM(86 mL)에 용해시키고, 레불린산(3.6 g, 31 mmol), EDC(5.94 mmol, 31 mmol) 및 DMAP(2.5 g, 20.65 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 DCM과 염수 사이에 분배시켰다. 수성층을 DCM으로 2회 추출하였다. 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 새성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템 (에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일로서 얻었다(12.26 g, 99%). HRMS(ESI+) C27H30O8SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 537.1559, 실측치 537.1544.
화합물 7*
Figure pct00271
화합물 6*(6.59 g, 12.81 mmol)를 THF/물 1:1 (250 mL)에 용해시키고, pTsOH (2.92 g, 15.37 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 환류(~80℃) 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 1.5 시간 후에, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, NaHCO3 포화 수용액으로 중화시켰다. 수성층을 EtOAc로 3회 추출하고, 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 무색의 오일(5.76 g, 95%)을 얻었다. HRMS(ESI+) C24H26O8SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 497.1246, 실측치 497.1230.
화합물 8*
Figure pct00272
디올 7*(4.5 g, 9.48 mmol)를 무수 DCM(45 mL)에 용해시키고, 빙수조로 0℃로 냉각시켰다. 피리딘(4.5 g, 56.9 mmol) 및 DMAP(0.116 g, 0.948 mmol)를 첨가하고, 이어서, BzCl(8 g, 56.9 mmol)을 적가하였다. 용액을 실온으로 가온시키면서 교반시켰다. 밤새 교반시킨 후에, 반응물을 NaHCO3 포화 수용액으로 켄칭시키고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)를 사용한 자동화 정제 시스템을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 백색 포말로서 얻었다 (5.78 g, 89%). HRMS(ESI+) C38H34O10SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 705.1770, 실측치 705.1744.
화합물 9*
Figure pct00273
화합물 9*을 문헌[Tetrahedron 2015, 71, 33, 5315-5320]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 10*
Figure pct00274
화합물 10*을 문헌[J. Carb. Chem. 2001, 20, 9, 855-865]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 11*
Figure pct00275
화합물 11*을 문헌[J. Org. Chem. 2014, 79, 10203-10217]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 12*
Figure pct00276
화합물 12*을 문헌[J. Org. Chem. 2014, 79, 10203-10217]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 13*
Figure pct00277
아세토니트릴(100 mL) 중의 1-O-알릴갈락토오스(10 g, 45.4 mmol), 벤즈알데하이드 디메틸 아세탈(10.37 g, 68.1 mmol) 및 캄포르 설폰산(29.5 g, 127mmol)의 용액을 RT에서 30 분 동안 교반시켰다. 30 분 후에, TLC는 출발물질의 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 트리에틸아민으로 켄칭시키고, 이어서, 짙은 시럽으로 농축시켰다. 용리액으로서 실리카겔 및 디클로로메탄/메탄올을 사용한 자동화된 정제(콤비플래시)는 생성물을 백색 고형물로서 생성시켰다(12 g, 86%). HRMS(ESI+) C16H20O6Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 331.1158, 실측치 331.1098.
화합물 14*
Figure pct00278
Bu2SnO(14.53 g, 58.4 mmol)를 RT에서 250 mL RBF 중의 톨루엔 423 mL 중의 디올 13*(12 g, 38.9 mmol)의 투명한 용액에 첨가하고, 이어서, 반응 혼합물을 130℃에서 6 시간 동안 환류 유지시켰다. 6 시간 후에, 용매를 진공 하에 제거하고, 반응물을 톨루엔(3 x 10 mL)과 공비시켰다. 용매의 완전한 제거 후에, 아세탈을 진공하에 0.5 시간 동안 건조시켰다. 아세탈을 아르곤의 존재 하에 진공 중에서 제거하고, DMF(423 mL)에 용해시켰다. 이러한 용액에, 2-(브로모메틸)나프탈렌(12.91g, 58.4mmol) 및 TBAI(28.5 g, 78 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 110℃에서 20 시간 동안 교반시키면서 유지시켰다. 반응을 TLC(n-헥산 중의 40% EtOAc)에 의해서 모니터링하였다. 20 시간 후에, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, EtOAc(2 x 30 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 회전증발기의 35℃의 배쓰 온도에서 30 분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트(구배, 0 내지 100%)를 사용한 자동화된 플래시 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제하였다. 100 mL RBF 중의 30-35℃의 배쓰 온도에서 진공 중에서 불순물 함유 생성물을 함유하는 튜브로부터의 용매의 농축은 무색 오일을 생성시켰다. 빙냉 에틸 아세테이트에 의한 추가의 세척은 순수한 생성물(14.49 g, 83%)을 생성시켰다.
화합물 15*
Figure pct00279
화합물 14*(14.30 g, 31.9 mmol)를 DCM(130 mL)에 용해시키고, 빙수조로 0℃로 냉각시켰다. 피리딘(7.74 mL, 96 mmol) 및 DMAP(0.390 g, 3.19 mmol)를 첨가하고, 이어서, BzCl(10.15 mL, 96 mmol)을 적가하였다. 용액을 실온으로 가온시키면서 교반시켰다. 밤새 교반시킨 후에, 반응물을 NaHCO3 포화 수용액으로 켄칭시키고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화 정제 시스템을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 백색 포말로서 얻었다(10.1 g, 57%).
화합물 16*
Figure pct00280
화합물 15*(8.7 g, 15.74 mmol)를 디클로로메탄(102 mL)에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 트리에틸실란(17.78 mL, 110 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로아세트산(8.44 mL, 110 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10 분 동안 교반시키고, 이어서, 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액으로 켄칭시켰다. 혼합물을 DCM으로 추출하고, 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화 정제 시스템을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 백색 포말로서 얻었다(5.8 g, 66.4%). HRMS(ESI+) C34H34O7Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 577.2202, 실측치 577.2078.
화합물 17*
Figure pct00281
화합물 16*(5.8 g, 10.46 mmol)를 THF/DMF 9:1(47 mL/ 5 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 벤질 브로마이드(2.54mL, 20.91 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 교반시켰다. 이어서, 수소화나트륨(0.837 g, 20.91 mmol)을 0℃에서 분량으로 첨가하였다. 수소화나트륨의 완전한 첨가 후에, 혼합물을 0℃에서 추가로 5 분 동안 교반시키고, 2 시간에 걸쳐서 실온으로 가온하였다. 반응물을 냉각하에 염화암모늄 포화용액의 완만한 첨가에 의해서 켄칭시키고, 이어서, 에틸 아세테이트/물 내로 부었다. 층들을 분리하고, 수성층을 에틸아세테이트로 추출하고, 합한 유기층을 NaHCO3과 염수로 세척하였다. 여액을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 고진공 하에 건조시켜 오랜지색 고형물을 얻었다. 고형물을 메탄올로 세척하고, 여과하고, 건조시켜 생성물을 백색 고형물(5.8 g, 86 %)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C41H40O7Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 667.2672, 실측치 667.2567.
화합물 18*
Figure pct00282
모노사카라이드 화합물 17*(0.995 g, 1.543 mmol)를 50 mL RBF 중의 DCM (34 mL) 및 포스페이트 완충액 pH 7.4 (17 mL)의 용액에 전달하고, DDQ(1.576 g, 6.94 mmol)를 2.5 시간에 걸쳐서 서서히 첨가하고, 6 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액 (40 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 NaHCO3(50 mL), 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제를 수행하였다. 이어서, 얻은 화합물을 디클로로메탄에 용해시키고, 진공하에 계속 증발시켜 무색의 투명한 고무질 액체를 생성시켰고, 이를 고진공 하에 건조시켜 성긴 백색 고형물(0.55 g, 71%)을 형성시켰다. HRMS(ESI+) C30H32O7Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 527.2046, 실측치 527.1978.
화합물 19*
Figure pct00283
화합물 3*(10.90 g, 21.7 mmol)를 DCM(89 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 피리딘(5.26 mL, 65 mmol) 및 DMAP(0.265 g, 2.2 mmol)를 첨가한 다음에, BzCl(6.90 mL, 65 mmol)를 적가하였다. 용액을 실온으로 가온시켰다. 밤새 교반시킨 후에, 반응물을 NaHCO3 포화 수용액으로 켄칭시키고, DCM로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화 정제 시스템을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 백색 포말(13.85 g, 90%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C44H38O7SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 733.2236, 실측치 733.2134.
화합물 20*
Figure pct00284
[1,5-사이클로옥타디엔)(피리딘)(트리사이클로헥실포스핀)-Ir(I)]PF6(0.79 g, 0.155 mmol)를 테트라하이드로푸란(30 mL)에 용해시키고, 질소를 실온에서 2 분 동안 용액을 통해서 버블링시켰고, 그 동안에 적색 촉매가 용해되었다. 이어서, 용액을 수소로 2 분 동안 퍼징하였고, 그 동안에, 적색 용액이 무색으로 변하였으며, 용액을 15 분 동안 수소 하에 교반시켰다. 이어서, 활성 촉매의 용액을 주사기를 통해서 질소하에 테트라하이드로푸란(15 mL) 중의 화합물 15*(1 g, 1.55 mmol)의 용액에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화된 수성 NaHCO3(10 mL)로 켄칭시키고, 디클로로메탄(3 x 10 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층들을 염수(10 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 알릴 이성질체화된 화합물을 얻었다. 이어서, 비닐 기질을 테트라하이드로푸란:물(2:1,45 mL)의 혼합물에 취하고, 요오드(0.787 g, 3.10 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 갈색 착색된 용액을 2 시간 동안 교반시킨 후에, 10% Na2S2O3(10 mL)으로 켄칭시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x 15 mL)로 추출하고, 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 에틸 아세테이트 30%)는 생성물을 황색 고형물(0.55 g, 59 %)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C38H36O7Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 627.2359, 실측치 627.2267.
화합물 21*
Figure pct00285
화합물 20*(0.55 g, 0910 mmol)를 디클로로메탄(11 mL)에 용해시켰다. Cs2CO3(0.593 g, 1.82 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(0.566 g, 2.73 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 Celite 패드(2 cm)를 통해서 여과하고, DCM(50 mL)으로 세척하고 여액을 농축시켜 담황색 오일을 얻었다. 정제를 플래시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸아세테이트 + 0.1% Et3N)에 의해서 수행하여 이미데이트를 황색 포말(0.608 g, 86%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C46H40F3NO7Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 798.2655, 실측치 798.2555.
화합물 22*
Figure pct00286
화합물 11*(3.65 g, 6.24 mmol)를 DCM(40 mL)에 용해시키고, 레불린산 (1.087 g, 9.36 mmol), EDC(1.795 g, 9.36 mmol) 및 DMAP(0.763g, 9.36 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 DCM과 NaHCO3 포화용액 사이에 분배시켰다. 수성층을 DCM로 추출하였다. 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 새성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템(에틸 아세테이트/사이클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(3.82 g, 90%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C38H34O10SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 705.1765, 실측치 705.1763.
화합물 23*
Figure pct00287
화합물 22*(2.8 g, 4.10 mmol)를 DCM/물 3:1(40 mL)에 용해시키고, N-브로모석신이미드(2.19 g, 12.30 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 45 분 동안 교반시켰다. 혼합물을 DCM과 NaHCO3 포화용액 사이에 분배시켰다. 수성층을 DCM로 추출하였다. 유기 층들을 0.1 M Na2S2O3으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 새성물을 얻었다. 미정제 생성물을 isolute®상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(2.30 g, 95%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C32H30O11Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 613.1680, 실측치 613.1678 .
화합물 24*
Figure pct00288
화합물 23*(2 g, 3.39 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, 및 세슘 카르보네이트(2.207 g, 6.77 mmol) 및 (E)-2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(2.109 g, 10.16 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고, DCM으로 세척하고, 여액을 증발시켜 생성물을 무색 오일(2.5 g, 97%)로서 얻었다.
화합물 25*
Figure pct00289
화합물 25*을 문헌[Nakashima, S.; Ando, H.; Imamura, A.; Yuki, N.; Ishida, H.; Kiso, M. Chem. - Eur. J. 2011, 17, 588-597]에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 26*
Figure pct00290
화합물 24*(2.5 g, 3.28 mmol) 및 화합물 25*(1.46 g, 2.74 mmol)를 100 mL RBF에 취하고, 톨루엔(40 mL)을 첨가하고, 화합물을 진공 하에 공비시켰다(2회). 고진공 하에 건조된 물질을 디클로로메탄(25 mL)에 용해시키고, 건조된 4 Å 분자체 (MS)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반시킨 후에, -10℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(50 μL, 0.274 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 교반시키는 동안에, 그것을 1.5 시간에 걸쳐서 0℃로 서서히 가온하였다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM으로 추출하였다. 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템 (에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(2.51 g, 83%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C54H50Cl3NO16SNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1128.1808, 실측치 1128.1904.
화합물 27*
Figure pct00291
화합물 26*(2.5 g, 2.26 mmol)를 DCM/물 10:1(27.5 mL)에 용해시키고, N-아이오도석신이미드(0.508 g, 2.26 mmol) 및 트리플루오로아세트산(0.173 mL, 2.26 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반시키고, 이어서, DCM과 NaHCO3 포화 수용액 사이에 분배시켰다. 수성층을 DCM으로 추출하고, 유기 층들을 0.1 M Na2S2O3으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(1.09 g, 47.4%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C48H46Cl3NO17Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1036.1724, 실측치 1036.1828.
화합물 28*
Figure pct00292
화합물 27*(1.05 g, 1.034 mmol)를 무수 DCM(10 mL)에 용해시키고, 세슘 카르보네이트(0.674 g, 2.068 mmol) 및 (E)-2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(0.644 g, 3.10 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고, DCM으로 세척하고, 여액을 증발시켜 생성물을 무색 오일(1.2 g, 98%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C56H50Cl3F3N2O17Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1207.2019, 실측치 1207.2043.
화합물 29*
Figure pct00293
화합물 28*(200 mg, 0.169 mmol) 및 5-아지도펜타놀(43.5 mg, 0.337 mmol)을 10 mL RBF에 취하였다. 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 화합물을 진공하에 증발시켰다(2회). 밤새 건조시킨 후에, 디클로로메탄(4 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반시킨 후에, -10℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(3 μL, 0.017 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 교반하는 동안에, 그것을 1.5 시간에 걸쳐서 0℃로 서서히 가온하였다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(64.4 mg, 74%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C53H55Cl3N4O17Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1147.252, 실측치 1147.2558.
화합물 30*
Figure pct00294
화합물 29*(80 mg, 0.071 mmol)를 피리딘(1 mL)에 용해시키고, 하이드라진 아세테이트(19.6 mg, 0.213 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세톤의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 45 분 동안 교반시킨 후에, 증발시켰다. 미정제 생성물을 isolute 상에 충전시키고, 자동화 정제 시스템(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하여 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(72.8 mg, 100%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C48H49Cl3N4O15Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1049.2152, 실측치 1049.2176.
A-2 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-I(O1) 사카라이드의 제조
A-2-1 클렙시엘라 뉴모니아 O1 테트라사카라이드의 제조
화합물 32*
Figure pct00295
5-아지도펜타놀(0.226 g, 1.747 mmol) 및 화합물 35*(0.9 g, 1.344 mmol) 둘 모두를 진공 중에서 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 혼합물을 RT에서 톨루엔 (6 mL) 및 1,4 디옥산 (2 mL) 혼합물에 재용해시키고, 4Å 분자체를 첨가하고, 20 분 동안 교반시켰다. RM을 -5℃로 냉각시키고, TMSOTf를 첨가하고, RM을 -5℃에서 5 분 동안 교반시키고, 1 시간에 걸쳐서 2℃로 서서히 가온하였다. RM을 10℃의 NaHCO3 포화 수용액(2 mL)으로 켄칭시키고, 층들을 분리하고, 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. 자동화된 정제 시스템 Biotage(EA/CHx를 사용한 실리카 컬럼 크로마토그래피)를 사용한 정제는 생성물을 아노머(fr1, 314 mg, 알파 생성물) 및 (fr2, 300 mg, 베타 생성물)(75%)의 혼합물로서 생성시켰다.
화합물 33*
Figure pct00296
화합물 32*(300 mg, 0.492 mmol)를 RT에서 DCM(5 mL) 및 완충 용액(10 mL)에 취하고, DDQ(335 mg, 1.476 mmol)를 20 분에 걸쳐서 분량으로 첨가하고, 1.5 시간 동안 교반시켰다. RM을 포화 NaHCO3(10 mL)으로 켄칭시키고, DCM(10 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 포화 NaHCO3(5 mL), 염수(10 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. Biotage (실리카 컬럼-용리액으로서 EA/CHx)를 사용한 정제는 생성물을 무색의 고무질 액체(210 mg, 91%)를 유도하였다.
화합물 34*
Figure pct00297
화합물 34*을 화합물 22*로부터의 화합물 23*의 합성에 대해서 기재된 절차에 따라서 화합물 2*로부터 제조하였다.
화합물 35*
Figure pct00298
화합물 34*(15.5 g, 31.1 mmol)를 회전증발기에서 고진공 하에 밤새 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 고형물을 질소 대기 하에 DCM(300 mL)에 취하고, Cs2CO3(30.4 g, 93 mmol)을 그것에 첨가하고, 10 분 동안 교반시켰다. (E)-2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(16.13 g, 78 mmol)를 순수한 RM에 첨가하고, RM을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. RM을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM(50 mLX4)로 세척하였다. 합한 여액을 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 용리액으로서 트리에틸아민 및 에틸 아세테이트/시클로헥산으로 처리한 실리카 컬럼 상에서 정제를 수행하여 생성물을 얻었고, 그것을 진공 하에 증발 및 건조시켜 엷은 황색빛 성긴 고형물(18.5 g, 89%)을 생성시켰다.
화합물 36*
Figure pct00299
DCM:H2O(1:0.3, 26 mL) 중에 용해된 티오글리코사이드 8*(1.58 g, 2.31 mmol)의 용액에 실온의 NBS(1.23 g, 6.94 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC(50% 에틸 아세테이트/시클로헥산)는 출발물질의 완전한 소모를 나타냈다. 반응물을 DCM(20 mL)으로 희석시키고, 10% Na2S2O3(10 mL) 및 포화 NaHCO3(10 mL)으로 세척하고, 유기층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 미정제 물질을 얻었다. 용리액으로서 실리카겔 및 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화된 정제(콤비플래시)는 생성물을 무색 오일(1.12 g, 1.89 mmol)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C32H30O11Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 613.1686, 실측치 613.1628.
화합물 37*
Figure pct00300
락톨 36*(18.5 g, 31.3 mmol)을 RT에서 DCM(300 mL)에 취하고, 이미다졸 (6.40 g, 94 mmol) 및 TDSCl(11.20 g, 62.7 mmol)을 그것에 첨가하고, RT에서 5 분 동안 교반시켰다. 백색 침전의 형성이 관찰되었고, 추가로 18 시간 동안 계속 교반시켰다. TLC 분석은 강한 비극성 스폿(주로 베타 및 소량의 알파) 및 매주 적은 SM의 존재를 나타냈다. 이어서, RM을 물로 켄칭시키고, DCM(100 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(100 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 무색의 고무질 잔기를 얻었다. Biotage 실리카 컬럼(220 g)상에서 EA-사이클로헥산을 사용한 정제에 의해서, 비극성 스폿을 fr1(단지 베타 아노머), 및 fr2(두 아노머의 혼합물, 주로 알파)로서 수거하였고, 극성 스폿을 fr3로서 수거하였으며, 진공 중에서 증발시켜 요망되는 생성물을 fr1(16g, 순수한 베타) 및 fr2(4.6 g, 주로 알파)로서의 무색의 고무질 액체로서 얻었다. 그래서, 반응물의 전체 수율은 90%(20.6 g)이었다.
화합물 38*
Figure pct00301
화합물 37*(15.9 g, 21.69 mmol)을 RT에서 피리딘(100 mL)에 취하고, 하이드라진 아세테이트(5.99 g, 65.1 mmol)를 그것에 첨가하고, RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. TLC는 40%EA/헥산 중의 SM 값에 약간 비극성의 당 활성 스폿의 존재를 나타냈다. 이어서, RM을 아세톤으로 켄칭시키고, 45 분 동안 RT에서 교반시켰다. 이어서, RM을 진공 중에서 건조한 상태로 증발시켰다. 잔류물을 용리액으로서 EA-사이클로헥산를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여, 당 활성 스폿을 얻었고, 고진공 중에서의 증발 및 건조시에, 화합물은 무색의 고무질 액체(12.8 g, 93%)로서 얻어졌다.
화합물 39*
Figure pct00302
화합물 38*(5.40 g, 8.51 mmol) 및 화합물 35*(7.41 g, 11.06 mmol)의 둘 모두를 RBF에 취하고, 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 공비 건조시켰다. 혼합물을 RT에서 톨루엔(60 ml) 및 디옥산(20 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, RT에서 30 분 동안 N2 대기 하에 교반시켰다. RM을 -2도로 빙수조를 사용하여 냉각시키고, TMSOTf(0.189 g, 0.851 mmol)을 RM에 첨가하고, RM을 5℃에서 20 분 동안 교반시켰다. TLC는 반응의 대체적인 완료를 나타냈다. 이어서, RM을 1 시간에 걸쳐서 실온으로 서서히 가온하였다. TLC 분석은 반응의 완료를 나타냈다. RM을 포화 NaHCO3(100 mL)로 켄칭시키고, 10 분 동안 교반시키고, EA(50 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 물(100 mL), 염수(50 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 상의 컬럼 정제를 Biotage 상의 EA/사이클로헥산을 사용하여 수행하였다. 그래서, 반응의 수율은 8.35 g, 88%이었다. HRMS(ESI+) C66H70O14SiNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1137.4433, 실측치 1137.4339.
화합물 40*
Figure pct00303
화합물 39*(1.15 g, 1.031 mmol)를 THF(6 mL)에 취하고, 건조된 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, RT에서 15 분 동안 교반시켰다. BH3-THF(8.25 mL, 8.25 mmol) 용액을 RM에 첨가하고, 5 분 동안 교반시킨 후에, TMSOTf를 첨가하고, RT에서 16 시간 동안 교반시켰다. RM을 RT에서 메탄올(10 mL)로 서서히(주의해서, 발포성) 켄칭시켰고, 45 분 동안 교반시키고, 이어서, NaHCO3 포화용액(25 mL) 및 EA(10 mL)로 희석시켰다. RM을 2 시간 동안 잘 교반시켰다. 층을 분리하였다. 수성층을 EA(25 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(10 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 무색의 고무질 액체를 얻었다. 미정제 생성물을 EA/사이클로헥산를 사용하여 컬럼 정제하였고, 생성물을 20-30%EA/사이클로헥산으로 용리시켰고, 회전증발기에서 생성물 스폿을 함유하는 분획들을 증발시켜 무색의 고무질 액체(0.73g, 63.4%)를 얻었다.
화합물 41*
Figure pct00304
화합물 40*(1.0 g, 0.895 mmol)을 RT에서 DCM (20 mL)에 취하고, 피리딘(1.086 mL, 13.42 mmol) 및 DMAP(0.022 g, 0.179 mmol)를 그것에 첨가하고, 5분 동안 교반시켰다. 이어서, BzCl(0.503 g, 3.58 mmol)을 그것에 첨가하고, 48 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(20%EA/CHx)은 반응의 완료를 나타냈다. RM을 DCM(25 mL) 및 NaHCO3(20 mL)로 희석시키고, 층을 분리하였다. 유기층을 염수 용액(10 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 담갈색 잔류물을 얻었다. 용리액으로서 EA 및 CHx를 사용한 Biotage-실리카 컬럼을 사용한 정제는 순수한 생성물을 생성시켰으며, 이는 진공 중의 생성물 함유 분획의 증발 시에 무색의 고무질 고체를 생성시켰다. 무수 톨루엔을 그것에 첨가하고, 물질을 회전증발기에서 2회 공비 건조시켰고, 이어서, 고진공 하에 건조시켜 무색의 고무질 고형물(900 mg, 82%)을 얻었다.
화합물 42*
Figure pct00305
화합물 41*(125 mg, 0.120 mmol)을 RT에서 DCM(3 mL) 및 완충 용액(3 mL)에 취하고, DDQ(69.7 mg, 0.307 mmol)를 20분에 걸쳐서 분량으로 첨가하였고, RM은 검은색이 되었고, 이어서, 적갈색으로 변했다. RM을 2 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(20%EA/CHx)은 극성 스폿 및 약간의 SM의 존재를 나타냈다. 그래서, 추가로 0.5 시간 동안 계속 교반시켰다. RM을 NaHCO3 용액(10 mL)으로 켄칭시키고, DCM(10 mLX3)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(10 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로의 EA/Chx을 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여, 생성물(86 mg, 78%)을 얻었다.
화합물 43*
Figure pct00306
화합물 41*(940 mg, 0.770 mmol)을 RT에서 50 mL 팔콘 튜브 중의 피리딘 (10 mL) 중에 취하고, 5 분 동안 교반시켰다. 이어서, HF-Py(1144 mg, 11.54 mmol)를 그것에 첨가하였다(주의: 버블 및 발열). RM을 RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(20%EA/Chx)은 SM이 존재하고 극성 스폿이 잘 형성되었음을 나타냈다. 그래서, 10 당량의 HF-Py를 RM에 한번 더 첨가하고, RM을 RT에서 추가로 30 시간 동안 교반시켰고, TLC 분석(20%EA/Chx)은 여전히 일부의 SM이 존재하고 주요 극성 스폿이 또한 존재함을 나타냈다. RM을 물(50 mL)로 켄칭시키고, DCM(50 mL)으로 희석시키고, RT에서 교반하면서 층들을 잘 혼합하였고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(25 mL X2)으로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 세척액(50 mLX2, 주의, 약간 발포성), 염수(3 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 백색 고무질 액체를 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로서 EA/CHx를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여, 생성물(661 mg, 80%)을 얻었다.
화합물 44*
Figure pct00307
락톨 43*(600 mg, 0.556 mmol)을 RT에서 N2 대기 하에 DCM(20 mL)에 취하고, Cs2CO3(725 mg, 2.224 mmol)를 그것에 첨가하고, 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 이미도일 클로라이드 시약(346 mg, 1.668 mmol)을 그것에 첨가하고, 2 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 반응이 완료되고, 강한 비극성 스폿이 존재하며 SM이 존재하지 않음을 나타냈다. 그래서, RM을 여과하여 고형물을 제거하고, 잔류물을 DCM로 세척하였다. 여액을 진공 중에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 용리액으로서 EA/CHx+1%TEA를 사용한 실리카 컬럼(컬럼을 로딩하기 전에 사이클로헥산 중의 TEA로 처리됨)을 사용하여 정제하여 생성물 분획을 얻었다. 진공하에 증발 및 건조시에, 회백색의 성긴 고형물이 얻어졌다(682 mg, 98%).
화합물 45*
Figure pct00308
화합물 33*(80 mg, 0.170 mmol) 및 화합물 44*(256 mg, 0.204 mmol) 둘 모두를 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 함께 공비 건조시켰다. 이들을 RT에서 DCM (5 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, N2 대기 하에 20분 동안 교반시켰다. RM을 얼음-아세톤조를 사용하여 -5℃로 냉각시키고, TMSOTf(6.16 μL, 0.034 mmol)를 RM에 첨가하고, RM을 -5℃에서 5분 동안 교반시키고, 2℃로 1 시간에 걸쳐서 서서히 가온하였다. TLC 분석(30% EA/CHx에 이어서, 20%EA/CHx)은 반응이 완료됨을 나타냈다. RM을 10℃의 NaHCO3 용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(3 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. EA/CHx를 사용한 실리카 컬럼 크로마토그래피 상의 Biotage에 의해서 정제하여 생성물 스폿을 함유하는 분획을 얻었고, 진공하에 증발시에, 요망되는 생성물을 무색의 고무질 고형물(231 mg, 89%)로서 얻었다.
화합물 46*
Figure pct00309
화합물 45*(220 mg, 0.144 mmol)를 RT에서 DCM(6 mL) 및 완충 용액(12 mL)에 취하고, DDQ(98 mg, 0.431 mmol)를 분량으로 20 분에 걸쳐서 첨가하였고, RM은 검은색이 되었고, 이어서, 그것은 적갈색으로 변하였다. RM을 1.5 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(20%EA/CHx)은 극성 스폿 및 약간의 SM의 존재를 나타냈다. 그래서, 추가로 0.5 시간 동안 계속 교반시켰다. RM을 NaHCO3 포화용액(15 mL)으로 켄칭시키고, DCM(10 mL x 3)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 NaHCO3 포화용액(5 mL), 염수 용액(10 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로서 EA/CHx를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물을 무색의 고무질 고형물(160 mg, 80%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C79H79O20N3Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 1412.5155, 실측치 1412.5040.
화합물 47*
Figure pct00310
화합물 46*(25 mg, 0.018 mmol) 및 화합물 21*(27.9 mg, 0.036 mmol) 둘 모두를 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 함께 공비 건조시켰다. 이들을 RT에서 DCM(2 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, N2 대기 하에 20분 동안 교반시켰다. RM을 얼음-아세톤조를 사용하여 -10℃로 냉각시키고, TMSOTf(0.650 μL, 3.60 μmol)를 RM에 첨가하고, RM을 -10℃에서 5분 동안 교반시키고, 2℃로 1 시간에 걸쳐서 서서히 가온하였다. TLC 분석(30% EA/CHx에 이어서, 20%EA/CHx)은 반응의 완료 및 강한 스폿의 존재를 나타냈다. RM을 10℃의 NaHCO3 용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(3 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. EA/CHx를 사용한 실리카 컬럼 크로마토그래피 상의 Biotage에 의해서 정제하여 생성물 스폿을 함유하는 분획을 얻었고, 진공하에 증발시에, 요망되는 생성물을 무색 층(6 mg, 17%)으로서 얻었다.
화합물 48*
Figure pct00311
화합물 47*(6 mg, 3.03 μmol)을 RT에서 THF-MeOH (1:1, 2 mL)에 취하고, 메탄올 중의 NaOMe 용액(0.121 mL, 0.061 mmol)을 그것에 첨가하고, 18 시간 동안 계속 교반시켰다. TLC 분석(30%EA/CHx)은 SM의 부재 및 극성 스폿의 존재를 나타냈다. 그래서, RM을 진공 중에서 증발시켰다. EA(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석시켰다. AcOH(~0.2 mL)로 산성화시켰다. EA(2 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(2 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 1H NMR 및 HRMS는 미정제 생성물은 요망되는 생성물과 또한 하나의 Bz를 가지며 분자에 두 개의 Bz 기가 여전히 존재할 수 있는 중간체 생성물을 가짐을 나타낸다. 그래서, RT에서 반응 조건에 다시 가하였다. RM을 EA(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석시켰다. AcOH (~0.1 mL)로 산성화시켰다. EA(2 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 물(2 mL), 염수 용액(2 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 1H NMR 및 HRMS는 미정제 생성물이 요망되는 생성물과 또한 소량의 단일 Bz 함유 중간체를 가짐을 나타낸다. 그래서, RM을 50℃에서 18 시간 동안 다시 반응 조건에 가하였다. RM을 실온으로 냉각시키고, 이어서, EA(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석시켰다. AcOH (~0.1 mL)로 산성화시켰다. EA(2 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 물(2 mL), 염수 용액(2 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물(3 mg, 68%)을 얻었다.
화합물 49*
Figure pct00312
화합물 48*(3 mg, 2.060 mmol)을 용매 혼합물(DCM-tBuOH-두 방울의 물)에 취하고, tBuOH (0.5 mL)중의 Pd/C를 그것에 첨가하고, RT에서 H2의 5 바(bar)의 압력에서 24 시간 동안 수소화시켰다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 잔류물을 메탄올(6 mL), (50% 메탄올-물(6 mL)로 세척하였다. 여액을 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 1H nmr 분석은 반응의 완료 및 생성물의 존재를 나타냈다. 그래서, 미정제 생성물을 C18 Sepak 컬럼을 통해서 물(3 mL x 2, fr1), 20% ACN-물(3 mL x 2, fr2) 및 ACN(3 mL, fr3)을 사용하여 정제하였다. 모든 분획을 동결시키고, 24 시간 동안 동결 건조시켜 fr1을 요구되는 생성물(무색 층, 0.71 mg, 46%)로서 얻었다. LRMS(ESI+) C29H54NO21H+에 대한 계산치 [M+H]+ 753.3222, 실측치 753.4608.
A-2-2 클렙시엘라 뉴모니아 O1 헥사사카라이드의 제조
화합물 50*
Figure pct00313
화합물 46*(125 mg, 0.090 mmol) 및 화합물 107*(227 mg, 0.135 mmol) 둘 모두를 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 함께 공비 건조시켰다. 이들을 RT에서 DCM(5 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, N2 대기 하에 20분 동안 교반시켰다. RM을 -10℃로 얼음-아세톤조를 사용하여 냉각시키고, TMSOTf(3.25 μL, 0.018 mmol)를 RM에 첨가하고, RM을 -10℃에서 5분 동안 교반시키고, 1 시간에 걸쳐서 2℃로 서서히 가온하였다. TLC 분석(30% EA/CHx에 이어서, 20%EA/CHx)은 반응의 완료 및 강한 스폿의 존재를 나타냈다. RM을 10℃의 NaHCO3 용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(3 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. EA/CHx를 사용한 실리카 컬럼 크로마토그래피 상에서 Biotage에 의해서 정제하여 요구되는 생성물 무색 층(160 mg, 62%)으로서 얻었다. LRMS(ESI+) C171H163N3O39Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2906.0795, 실측치 2906.0327.
화합물 51*
Figure pct00314
화합물 50*을 원안 A에 따라서 메탄올 분해에 가하였다:
생성물을 백색 고무질 고형물(65 mg, 91%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C115H131N3NaO31 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 2072.8664, 실측치 2073.540
화합물 52*
Figure pct00315
화합물 51*을 일반적인 원안 A에 따른 수소화 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(9 mg, 69%)로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C41H74NO31에 대한 계산치 [M+H]+ 1076.4245, 실측치 1076.4282.
1H NMR (400 MHz, 산화중수소) δ 5.26 (s, 1H), 5.22 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 3.0, 1.5 Hz, 1H), 4.37 - 4.05 (m, 12H), 4.02 - 3.89 (m, 5H), 3.87 - 3.63 (m, 19H), 3.62 - 3.53 (m, 1H), 3.11 - 2.99 (m, 2H), 1.84 - 1.64 (m, 4H), 1.58 - 1.44 (m, 2H).
화합물 52a-l*
Figure pct00316
화합물 52a-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 35* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 52*와 유사하게 제조하였다.
A-2-3 클렙시엘라 뉴모니아 O1 옥타사카라이드의 제조
화합물 53*
Figure pct00317
화합물 42*(40 mg, 0.037 mmol) 및 화합물 44*(445 mg, 0.356 mmol) 둘 모두를 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 별도로 공비 건조시켰다. 이들을 RT에서 DCM(10 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, 10 분 동안 교반시켰다. 이것에, DCM(1 mL) 중의 이미데이트 공여체를 첨가하고, RT에서 30 분 동안 N2 대기 하에 교반시켰다. RM을 -20도로 드라이아이스-ACN 배쓰를 사용하여 냉각시키고, TMSOTf(7.40 μL, 1.34 μmol)을 RM에 첨가하고, RM을 -20 도로 5 분 동안 교반시키고, 1 시간에 걸쳐서 2 도로 서서히 가온하였다. TLC 분석(30% EA/CHx에 이어서, 20%EA/CHx)은 반응이 완료되었고, SM 42*이 부재하고, 약간의 극성 스폿이 존재함을 나타냈다. RM을 10도의 NaHCO3 용액(2 mL)으로 켄칭시키고, 층들을 분리하고, 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. EA/CHx를 사용한 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 생성물을 함유하는 분획을 얻었고, 진공하에 증발시에, 요망되는 생성물을 무색 층(630 mg, 91%)으로서 얻었다. HRMS(ESI+) C127H124O29SiNa+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2164.7929, 실측치 2164.7727.
화합물 54*
Figure pct00318
화합물 53*(300 mg, 0.140 mmol)를 RT에서 DCM(5 mL) 및 완충 용액(pH 7.4, 7 mL)에 취하고, DDQ(95 mg, 0.420 mmol)를 20 분에 걸쳐서 분량으로 첨가하였고, RM이 검은색이 되었고, 이어서, 그것이 적갈색으로 변하였다. RM을 2 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(30%EA/CHx)은 극성 스폿 및 약간의 SM의 존재를 나타냈다. 그래서, 추가로 0.5 시간 동안 계속 교반시켰다. RM을 NaHCO3 용액(10 mL)로 켄칭시키고, DCM(10 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(10 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로서 EA/Chx를 사용한 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물(215 mg, 76%)을 얻었다.
화합물 55*
Figure pct00319
화합물 53*(1.0 g g, 0.467 mmol)를 RT에서 50 mL 팔콘 튜브 중의 피리딘(10 mL)에 취하고, 5 분 동안 교반시켰다. 이어서, HF-Py(1.5 ml, 16.34 mmol)를 그것에 첨가하였다(주의: 버블 및 발열). RM을 RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(30%EA/Chx)은 극성 스폿이 형성됨을 나타냈다. RM을 물(50 mL)로 켄칭시키고, DCM(50 mL)으로 희석시키고, RT에서 교반시키면서 층들을 잘 혼합하였고, 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(25 mL X2)로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 세척액(50 mLX2, 주의해서, 약간의 발포), 염수(3 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 백색 고무질 액체를 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼-용리액으로서 EA/CHx를 사용한 biotage를 사용하여 정제하여 생성물(930 mg, 정량적)을 얻었다.
화합물 56*
Figure pct00320
락톨 55*(1.1 g, 0.550 mmol)를 N2 대기 하에 RT에서 DCM (20 mL)에 취하고, Cs2CO3(717 mg, 2.200 mmol)을 그것에 첨가하고, 5 분 동안 교반시켰다. 이어서, 이미도일 클로라이드 시약(0.261 mL, 1.65 mmol)을 그것에 첨가하고, 2 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 반응이 완료되었과 강한 비극성 스폭이 존재하고 SM이 존재하지 않음을 나타냈다. 그래서, RM을 여과하여 고형물을 제거하고, 고형물을 제거하고, 잔류물을 DCM로 세척하였다. 여액을 진공 중에서 농축시켰다. 진공하에 증발 및 건조 시에, 회백색의 성긴 고형물을 얻었다(1.2 g, 100%).
화합물 57*
Figure pct00321
화합물 57*을 일반적인 절차 B에 따라서 5-아지도펜타놀에 의해서 글리코실화 반응에 의해서 화합물 56*으로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(218 mg, 90%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C124H116N3O29 +에 대한 계산치 [M+H]+ 2110.7694, 실측치 2110.169.
화합물 58*
Figure pct00322
화합물 58*을 일반적인 절차 A에 따라서 Nap 보호기의 제거를 수행함으로써 화합물 57*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(102 mg, 51%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C113H108N3O29 +에 대한 계산치 [M+H]+ 1970.7068, 실측치 1969.901.
화합물 59*
Figure pct00323
화합물 59*을 일반적인 절차 B에 따른 글리코실화 반응에 의해서 화합물 58* 및 화합물 110*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(128 mg, 63%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C232H216N3O55 +에 대한 계산치 [M+H]+ 3923.4197, 실측치 3923.293.
화합물 60*
Figure pct00324
화합물 59*을 일반적인 원안 B에 따른 메탄올 분해에 가하였다:
생성물을 백색 고형물 층(44 mg, 정량적)으로서 얻었다.
MALDI-TOF C134H160N3O41에 대한 계산치 [M+H]+ 2467.0527, 실측치 2466.377.
화합물 61*
Figure pct00325
화합물 60*을 일반적인 원안 C에 따른 수소화 반응에 가하였다.
생성물을 백색의 성긴 고형물(21 mg, 95%)로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C53H94NO41에 대한 계산치 [M+H]+ 1400.5301, 실측치 1400.5375.
1H NMR (400 MHz, 산화중수소) δ 5.19 (s, 1H), 5.17 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.13 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 4.9, 3.1 Hz, 2H), 5.02 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 2.8, 1.3 Hz, 1H), 4.31 - 4.10 (m, 11H), 4.08 - 3.53 (m, 38H), 3.02 - 2.93 (m, 2H), 1.66 (dp, J = 14.2, 7.1, 6.5 Hz, 4H), 1.52 - 1.34 (m, 2H).
화합물 61a-l*
Figure pct00326
화합물 61a-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 56* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 61*과 유사하게 제조하였다.
A-2-4 클렙시엘라 뉴모니아 O1 펜타데카사카라이드의 제조
화합물 62*
Figure pct00327
화합물 62*을 일반적인 원안 B에 따라 화합물 56* 및 화합물 46*의 글리코실화 반응에 의해서 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(293 mg, 81%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C198H184N3O48 +에 대한 계산치 [M+H]+ 3371.2049, 실측치 3372.109.
화합물 63*
Figure pct00328
화합물 63*을 일반적인 절차 A에 따라 Nap 보호기의 제거를 수행함으로써 화합물 62*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(152 mg, 63%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C187H176N3O48 +에 대한 계산치 [M+H]+ 3231.1423, 실측치 3232.291.
화합물 64*
Figure pct00329
화합물 64*을 일반적인 절차 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 화합물 63* 및 화합물 115*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(52 mg, 32%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C414H384N3O100 +에 대한 계산치 [M+H]+ 6996.5055, 실측치 7001.685.
화합물 65*
Figure pct00330
화합물 64*을 일반적인 원안 B에 따라 메탄올 분해에 가하였다:
생성물을 백색 고형물(25 mg, 97%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C246H288N3O76에 대한 계산치 [M+H]+ 4499.8763, 실측치 4500.132.
화합물 66*
Figure pct00331
화합물 65*를 일반적인 원안 B C에 따라 수소화 반응에 가하였다.
화합물 66a-l*
Figure pct00332
화합물 66a-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 35* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 66*과 유사하게 제조하였다.
A-3 클렙시엘라 뉴모니아 O2 (2c) 사카라이드의 제조
A-3-1 클렙시엘라 뉴모니아 O2 디사카라이드의 제조
화합물 67*
Figure pct00333
화합물 29*(15 mg, 0.013 mmol)를 무수 THF(1 mL)에 용해시키고, THF 중의 1M TBAF 용액(133 μL, 0.133 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 생성물을 단황색 오일(13.2 mg)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C50H54N4O15H+에 대한 계산치 [M+H]+ 951.3658, 실측치 951.3650.
화합물 68*
Figure pct00334
화합물 67*(13 mg, 0.014 mmol)을 5 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(2 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시키고, 이러한 공비 건조 과정을 1회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 30 분 동안 건조시켰다. 그것을 무수 DCM(1 mL)에 용해시키고, 아세트산 무수물(3.88 μL, 0.041 mmol) 및 트리에틸아민 (9.53 μL, 0.068 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트과 NaHCO3 포화 수용액 사이에 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 5 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(2 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시키고, 이러한 공비 건조 과정을 1회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 30 분 동안 건조시켰다. 그것을 무수 THF/메탄올 1:1(1 mL)에 용해시키고, 메탄올 중의 0.5M 소듐 메톡사이드 용액(1.108 mL, 0.70 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 생성물을 단황색 오일(5.4 mg)로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C26H38N4O11Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 605.2435, 실측치 605.2548.
화합물 69*
Figure pct00335
화합물 68*(5 mg, 8.58 μmol)을 일반적인 원안 C에 따라 수소화 반응에 가하였다. 혼합물을 먼저 SEC 크로마토그래피(G-25, 물)에 의해서 정제하고, 이어서, C18 Sepak 컬럼(물/아세토니트릴)에 의해서 정제하여, 생성물(0.81 mg, 5 단계에 걸쳐서 13.3%)을 얻었다.
HRMS(ESI+) C19H36N2O11H+에 대한 계산치 [M+H]+ 469.2392, 실측치 469.2419.
A-3-2 클렙시엘라 뉴모니아 O2(2c) 헥사사카라이드의 제조
화합물 70*
Figure pct00336
화합물 28*(38 mg, 0.032 mmol) 및 화합물 30*(30 mg, 0.029 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(4 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로로 증발시키고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 무수 디클로로메탄(1 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하였고, 실온에서 10분 동안 교반시키고, 이어서, -10℃로 냉각시켰다. TMSOTf(0.53 μL, 2.92 μmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 교반시키는 동안에, 그것을 2 시간에 걸쳐서 0℃로 서서히 가온하였다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 NaHCO3 포화용액의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM로 추출하였다. 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 새성물을 얻었다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/시클로헥산)에 의해서 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(40.5 mg, 68.5%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C96H93Cl6N5O31K+에 대한 계산치 [M+K]+ 2064.6023, 실측치 2064.3657.
화합물 71*
Figure pct00337
화합물 70*(40 mg, 0.020 mmol)를 무수 피리딘(1 mL)에 용해시키고, 하이드라진 아세테이트(5.46 mg, 0.059 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세톤의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 그것을 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/시클로헥산)에 의해서 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(32.9 mg, 86%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C91H87Cl6N5O29Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1950.3928, 실측치 1950.3255.
화합물 72*
Figure pct00338
화합물 28*(20.3 mg, 0.017 mmol) 및 화합물 71*(30 mg, 0.016 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(4 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시키고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 무수 디클로로메탄(1 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반시키고, 이어서, -10℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(0.28 μL, 1.56 μmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 교반하는 동안에, 그것을 1.5 시간에 걸쳐서 0℃로 서서히 가온하였다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응을 NaHCO3 포화용액의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 층들을 분리하고, 수성층을 DCM로 추출하였다. 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 새성물을 얻었다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/시클로헥산)에 의해서 정제하고, 용매를 증발시켜 생성물을 백색 고형물(18.9 mg, 41.5%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C139H131Cl9N6O45Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2947.6132, 실측치 2947.5147.
화합물 73*
Figure pct00339
화합물 73*을 화합물 67*의 합성에 대해서 기재된 절차에 따라서 화합물 72*로부터 제조하였다.
화합물 74*
Figure pct00340
화합물 74*를 화합물 68*의 합성을 대해서 기재된 절차에 따라 화합물 73*로부터 제조하였다.
화합물 75*
Figure pct00341
화합물 75*를 화합물 69*의 합성에 대해서 기재된 절차에 따라 화합물 74*로부터 제조하였다.
A-4 클렙시엘라 뉴모니아 O2ac 사카라이드의 제조
A-4-1 클렙시엘라 뉴모니아 O2ac 테트라사카라이드의 제조
화합물 76*
Figure pct00342
Cs2CO3(2.2 g, 6.77 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐-아세트이미도일 클로라이드(2.1 g, 3.39 mmol)를 DCM (20 mL) 중의 락톨 36*(2.0 g, 3.39 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 2 시간 후에 모든 출발물질이 소모되었고, 반응물을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM(20 mL)로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 용리액으로서 실리카겔 및 에틸 아세테이트/시클로헥산 + 1% Et3N을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. TLC에 의해서 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(2.58 g, 100%)로서 얻었다.
화합물 77*
Figure pct00343
화합물 77*을 일반적인 원안 B에 따라 화합물 76*과 화합물 33* 사이의 글리코실화 반응에 의해서 제조하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(249 mg, 75%)로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C57H59N3NaO16에 대한 계산치 [M+Na]+ 1064.3793, 실측치 1064.3801.
화합물 78*
Figure pct00344
화합물 78*을 Lev 보호기의 제거에 대한 일반적인 원안 A에 따라 화합물 77*로부터 제조하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(171 mg, 79%)로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C52H53N3NaO14에 대한 계산치 [M+Na]+ 966.3425, 실측치 966.3422.
화합물 79*
Figure pct00345
화합물 79*를 일반적인 원안 B에 따라 화합물 78*과 화합물 28* 사이의 글리코실화 반응에 의해서 제조하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(44 mg, 46%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C100H97Cl3N4NaO30 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 1961.5151, 실측치 1963.686.
화합물 80*
Figure pct00346
화합물 79*(10 mg, 5.48 μmol)를 RT에서 THF(2 mL)에 취하고, THF 중의 1M TBAF 용액(0.11 mL, 0.11 mol)을 반응 혼합물에 첨가하고, RT에서 18 시간 동안 교반시켰다. RM을 물(5 mL)로 켄칭시키고, EA(5 mL)로 희석시켰다. 층를 분리하였다. 수성층을 EA(5 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 아민 생성물을 얻었다. 이러한 미정제 생성물을 DCM에 취하고, TEA(50 eq) 및 Ac2O(40 eq)를 그것에 첨가하고, 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(5 mL)로 켄칭시키고, DCM (5 mL)으로 희석시켰다. 층을 분리하였다. 수성층을 DCM(5 mLX3)으로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 용액(5 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 NHAc 생성물을 얻었다. 이어서, 이러한 미정제 혼합물을 RT에서 THF-MeOH (1:1 mL)에 취하고, 메탄올 중의 과량의 0.5 M NaOMe 용액을 그것에 첨가하고, 55℃에서 18 시간 동안 계속 교반시켰다. RM을 진공 중에서 증발시켰다. EA 및 물로 희석시켰다. 중성 pH까지 AcOH로 산성화시켰다. EA로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 엷은 황색빛 층(5 mg, 84%, 3 단계에서 걸쳐서)으로서 얻었다.
화합물 81*
Figure pct00347
화합물 80*을 일반적인 원안 C에 따라 수소화 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다.
HRMS(ESI+) C31H57N2O21에 대한 계산치 [M+H]+ 793.3454, 실측치 793.3455.
A-4-2 클렙시엘라 뉴모니아 O2ac 옥타사카라이드의 제조
화합물 82*
Figure pct00348
화합물 82*를 일반적인 원안 B에 따라 화합물 76*과 화합물 46* 사이의 글리코실화 반응에 의해서 제조하였다:
생성물을 무색의 유리질 층(155 mg, 73%)을 얻었다.
MALDI-TOF C111H108N3O30+에 대한 계산치 [M+H]+ 1962.7018, 실측치 1963.426.
화합물 83*
Figure pct00349
화합물 83*을 Lev 보호기의 제거에 대한 일반적인 원안 A에 따라 화합물 82*로부터 제조하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(140 mg, 98%)로서 얻었다.
MALDI-TOF C106H102N3O28 +에 대한 계산치 [M+H]+ 1864.6650, 실측치 1864.973.
화합물 84*
Figure pct00350
화합물 84*를 일반적인 원안 B에 따라 화합물 83*과 화합물 28* 사이의 글리코실화 반응에 의해서 제조하였다:
생성물을 무색의 유리질 층(85 mg, 55%)으로서 얻었다.
MALDI-TOF C154H146Cl3N4O44 +에 대한 계산치 [M+H]+ 2859.8376, 실측치 2859.868.
화합물 85*
Figure pct00351
화합물 85*를 Lev 보호기의 제거에 대한 일반적인 원안 A에 따라 화합물 84*로부터 제조하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물(70 mg, 91%)로서 얻었다..
MALDI-TOF C149H140Cl3N4O42+에 대한 계산치 [M+H]+ 2761.8008, 실측치 2763.646.
화합물 86*
Figure pct00352
화합물 86*을 일반적인 원안 B에 따라 화합물 85*와 화합물 28* 사이의 글리코실화 반응에 의해서 제조하였다:
생성물을 무색의 유리질 층(31 mg, 46%)으로서 얻었다.
MALDI-TOF C197H184Cl6N5O58 + 에 대한 계산치 [M+Na]+ 3756.9733, 실측치 3759.266.
화합물 87*
Figure pct00353
화합물 87*을 화합물 80*의 합성에 대해서 기재된 절차에 따라서 화합물 86*으로부터 제조하였다.
화합물 88*
Figure pct00354
화합물 87*을 일반적인 원안 C에 따라 수소화 반응에 가하였다.
A-4-3 클렙시엘라 뉴모니아 O2ac 헥사사카라이드의 제조
화합물 88*
Figure pct00355
화합물 89*
Figure pct00356
화합물 89*를 일반적인 절차 B에 따라 화합물 46*에 의한 글리코실화 반응에 의해서 화합물 88*로부터 얻었다:
생성물을 무색의 유리질 층(9 mg, 17%)으로서 얻었다.
MALDI-TOF C154H145Cl3KN4O44 +에 대한 계산치 [M+K]+ 2897.7934, 실측치 2898.015.
화합물 90*
Figure pct00357
화합물 90*을 화합물 80*의 합성에 대한 절차에 따라서 화합물 89*로부터 제조하였다.
화합물 91*
Figure pct00358
화합물 90*을 일반적인 원안 C에 따라서 수소화 반응에 가하였다.
A-5 클렙시엘라 뉴모니아 O2aeh 사카라이드의 제조
화합물 92*
Figure pct00359
DCM(26 mL) 중의 티오글리코사이드 1*(1 g, 1.998 mmol)의 용액에 4Å MS를 첨가하였다. 디메틸포름아미드(0.928 mL, 11.99 mmol)를 첨가하고, 용액을 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, NIS(0.674 g, 3.00 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, TMSOTf(0.397 mL, 2.197 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 2.5 시간에 걸쳐서 실온으로 가온하였다. TLC(50% 에틸 아세테이트/시클로헥산)는 출발물질의 완전한 소모를 나타냈다. 반응물을 DCM(20 mL)으로 희석시키고, 10% Na2S2O3(10 mL) 및 포화 NaHCO3(10 mL)으로 세척하고, 유기층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 미정제 물질을 얻었다. 실리카겔 및 용리액으로서 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화된 정제는 생성물을 무색 오일(360 mg, 35%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C29H33N3O6Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 542.2267, 실측치 542.2293.
화합물 93*
Figure pct00360
톨루엔:디옥산(3:1, 13.5 mL) 중의 화합물 9*(687 mg, 1.039 mmol) 및 화합물 92*(360 mg, 0.693 mmol)에 4 Å MS를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 이어서, NIS(312 mg, 1.386 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. TMSOTf(0.013 mL, 0.069 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 0℃에서 교반시켰다. 반응물을 에틸 아세테이트(10 mL)로 의석시키고, 여과하고, Na2SO3 및 NaHCO3 포화 수용액으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 자동화된 정제 시스템(사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트, 0-50%)에 의한 정제는 생성물을 약간의 불순물과 함께 생성시켰다(685 mg, 92%). HRMS(ESI+) C63H63N3O13Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1092.4259, 실측치 1092.4306.
화합물 94*
Figure pct00361
25 mL RBF 중의 DCM:포스페이트 완충액 7.4(2:1, 9 mL) DCM:포스페이트 완충액 7.4 (2:1, 9 mL) 중 화합물 93*(250 mg, 0.234 mmol)의 용액에 0℃의 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(80 mg, 0.350 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(5 mL)로 켄칭시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3(5 mL) 및 염수(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 15 분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 무색의 오일(178 mg, 82%)을 생성시켰다. HRMS(ESI+) C52H55N3O13Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 952.3633, 실측치 952.3665.
화합물 95*
Figure pct00362
화합물 95*를 다음과 같이 제조하였다:
DCM:H2O(1:0.3, 14 mL)에 용해된 티오글리코사이드 10*(1 g, 1.45 mmol)의 용액에 NBS(0.775 g, 4.36 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC(50% 에틸 아세테이트/시클로헥산)는 출발물질의 완전한 소모를 나타냈다. 반응물을 DCM(20 mL)으로 희석시키고, 10% Na2S2O3(10 mL) 및 포화 NaHCO3(10 mL)로 세척하고, 유기층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 미정제 물질을 얻었다. 실리카겔 및 용리액으로서 에틸 아세테이트/시클로헥산을 사용한 자동화된 정제(콤비플래시)는 락톨 생성물을 무색의 오일(0.85 g, 98%)로서 생성시켰다. Cs2CO3(1.3 mg, 4.02 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐-아세트이미도일 클로라이드(0.557 mg, 2.68 mmol)를 DCM(5 mL) 중의 락톨 (0.8 g, 1.34 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 2 시간 후에 모든 출발물질이 소모되었고, 반응물을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM(20 mL)로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산 + 1% Et3N)을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. TLC의한 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(850 mg, 83%)로서 얻었다.
화합물 96*
Figure pct00363
DCM(3 mL) 중의 화합물 95*(198 mg, 0.258 mmol) 및 화합물 94*(120 mg, 0.129 mmol)의 용액에, 4 Å MS를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 -50℃로 냉각시키고, TMSOTf(0.005 mL, 0.028 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2 시간에 걸쳐서 -5℃로 가온하였다. 반응물을 여과하고, 용매를 증발시켰다. 자동화된 정제 시스템(사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트)에 의한 정제는 생성물(120 mg, 62%)을 생성시켰다. HRMS(ESI+) C86H81N3O22Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1531.5234, 실측치 1531.5304.
화합물 97*
Figure pct00364
화합물 96*(120 mg, 0.080 mmol)를 무수 DCM(2 mL)에 용해시키고, 에탄디올(0.071 mL, 0.955 mmol) 및 pTSOH(18 mg, 0.095 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. TLC 분석은 출발물질의 전환 및 새로운 더욱 극성의 스폿을 나타냈다. 반응물을 트리에틸아민(0.2 mL)으로 켄칭시키고, 용매를 증발시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 미정제 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트를 사용한 자동화 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 생성물을 오일(110 mg, 97%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C79H77N3O22Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1442.4896, 실측치 1441.4948.
화합물 98*
Figure pct00365
MeOH 25% w/w (0.319 mL, 1.478 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 용액을 MeOH:THF(2:1, 1.5 mL)의 혼합물 중의 화합물 97*(105 mg, 0.074 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 AcOH(1 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 증발시켰다. 미정제 물질을 isolute에 부하시켰다. 용리 순서: 1) 사이클로헥산, 2) 에틸 아세테이트 및 3) DCM 중 MeOH 5%를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 백색 고형물(29 mg, 49%)로서 얻었다.
화합물 99*
Figure pct00366
화합물 98*(29 mg, 0.036 mmol)을 DCM:tBuOH:H2O (0.4:1.6:0.4, 2.4 mL)의 혼합물에 용해시켰다. PdC(25 mg, 0.023 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소(5 회)로 퍼징시키고, 반응물을 수소 압력(5 바)하에 22 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 PTFE 필터를 통해서 H2O:ACN(1:1)를 사용하여 여과하고, 유기 용매를 회전증발기에서 증발시키고, 미정제 물질을 동결 건조시켰다. 미정제 생성물을 miliQ H2O를 사용한 SepPack에 의해서 정제하여 생성물을 백색 고형물(17.7 mg, 82%)로서 얻었다. C23H44NO16에 대한 계산치 [M+H]+ 590.2660, 실측치 590.2656. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.21 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.16 - 4.05 (m, 4H), 4.06 - 3.90 (m, 5H), 3.89 - 3.49 (m, 11H), 2.99 (t, J = 1.9 Hz, 2H), 1.73 - 1.62 (m, 4H), 1.51 - 1.41 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 108.9, 95.2, 95.1, 82.5, 81.8, 77.3, 75.1, 71.0, 70.7, 70.6, 70.0, 69.6, 69.4, 69.3, 68.2, 67.8, 62.7, 61.2, 39.4, 28.0, 26.5, 22.4.
A-6 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-II 사카라이드의 제조
A-6-1 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-II 헥사사카라이드의 제조
화합물 100*
Figure pct00367
화합물 19*(85 mg, 0.119 mmol) 및 화합물 18*(50 mg, 0.099 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(5mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(1mL) 및 건조된 4 Å 분자체 (MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃(등온 얼음-물 혼합물)로 냉각시켰다. NIS(31 mg, 0.139 mmol) 및 트리플산 (0.8 μL, 9.91μmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 15 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 화합물을 DCM으로 추출하고, Na2S2O3 포화용액, NaHCO3 포화용액, 및 염수로 세척하였다. 분리 후에, 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하여 담황색 고형물(70mg, 63%)을 얻었다. HRMS(ESI+) C68H64O14Na+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 1127.4194, 실측치 1127.4009.
화합물 101*
Figure pct00368
디사카라이드 100*(0.14 g, 0.127 mmol)을 질소 대기 하에 10 mL RBF 중의 DCM(2.8 mL) 및 포스페이트 완충액 ph 7.4(1.4mL)의 교반 용액에 전달하였다. DDQ (0.129 g, 0.570 mmol)를 2.5 시간에 걸쳐서 서서히 첨가하였고, TLC 분석(40% 에틸 아세테이트/시클로헥산)은 2 시간 후에도 주된 양의 출발물질에 약간 극성인 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 그래서, 반응 혼합물을 추가로 4 시간 동안 RT에서 교반시켰다. TLC는 출발물질의 부재를 나타냈지만, 생성물의 존재 뿐만 아니라 희미한 극성 스폿을 나타냈다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액(10 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM 내로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 포화용액(10 mL), 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 100 mL RBF 중의 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 1 시간 동안 농축시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 정제를 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 수행하였다. 이어서, 디클로로메탄을 이에 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 계속 증발시켜 무색의 투명한 고무질 액체를 얻었고, 이를 고진공 하에 16 -18 시간 동안 건조시켜 성긴 백색 고형물(81 mg, 66%)을 형성시켰다. HRMS(ESI+) C57H56O14Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 987.3569, 실측치 987.3387.
화합물 102*
Figure pct00369
(1,5-사이클로옥타디엔)(피리딘)(트리사이클로헥실포스핀)-Ir(I)]PF6(7.65 mg, 9.05μmol)를 테트라하이드로푸란(2 mL)에 용해시키고, 적색 촉매를 용해시키면서, 질소를 실온에서 2 분 동안 용액을 통해서 버블링시켰다. 이어서, 용액을 수소로 2 분 동안 퍼징시켰고, 그 동안에, 적색 용액이 부색으로 변화되었고, 용액을 15 분 동안 수소 하에 교반시켰다. 이어서, 활성 촉매의 용액을 주사기를 통해서 질소하에 테트라하이드로푸란(1 mL) 중의 화합물 100*(0.1 g, 0.09 mmol)의 용액에 첨가하였고, 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 디클로로메탄(3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층들을 염수(5 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 알릴 이성질체화된 화합물(1H NMR에 의해서 확인된 이성질체화)을 얻었다. 이어서, 비닐 기질을 테트라하이드로푸란:물(2:1, 3mL)의 혼합물에 취하고, 요오드(46 mg, 0.18 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 갈색 착색된 용액을 2 시간 동안 교반시킨 후에, Na2S2O3 용액(5 mL)의 10% 용액으로 켄칭시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x 5 mL)로 추출하고, 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트 30%)에 의한 정제는 생성물을 황색 고형물(60 mg, 63 %)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C65H60O14Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1087.3881, 실측치 1087.3766.
화합물 103*
Figure pct00370
화합물 102*(60 mg, 0.06 mmol)를 무수 디클로로메탄(0.7 mL)에 용해시키고, Cs2CO3(37 mg, 0.113 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(0.03 mL, 0.17 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. TLC 분석은 출발물질의 완전한 전환 및 새로운 스폿을 나타냈다. 반응 혼합물을 Celite 패드(1cm)를 통해서 여과하였다. 패드를 DCM (20 mL)으로 세척하고, 여액을 감압하에 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜 담황색 오일을 얻었다.
플래시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/에틸 아세테이트 + 0.1% Et3N)에 의해서 정제를 수행하여 황색 포말(60 mg, 86%)을 얻었다. HRMS(ESI+) C73H64F3NO14Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1258.4177, 실측치 1258.3969.
화합물 104*
Figure pct00371
화합물 103*(13 mg, 0.097 mmol) 및 5-아지도펜타놀(60 mg, 0.049 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(20 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄 및 건조된 4 Å 분자체 (MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(1.8 μL, 9.7 μL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온시키고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색 포말(35 mg, 61 %)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C70H69O14Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1198.4677, 실측치 1198.4798.
화합물 105*
Figure pct00372
화합물 21*(355 mg, 0.458 mmol) 및 화합물 101*(0.340 mg, 0.352 mmol)을 25 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔 (10 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질 (0.355g, 0.458 mmol) 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(7 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(13 μL, 0.07 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색 포말(0.380 g, 70 %)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C95H90O20Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1573.5923, 실측치 1573.5657.
화합물 106*
Figure pct00373
1,5-사이클로옥타디엔)(피리딘)(트리사이클로헥실포스핀)-Ir(I)]PF6(18 mg, 0.02 mmol)를 테트라하이드로푸란(4 mL)에 용해시키고, 적색 촉매를 용해시키면서, 질소를 실온에서 2 분 동안 용액을 통해서 버블링시켰다. 이어서, 용액을 수소로 2 분 동안 퍼징시켰고, 이러한 동안에, 적색 용액이 무색으로 변화되었고, 용액을 15 분 동안 수소 하에 교반시켰다. 이어서, 활성 촉매의 용액을 주사기를 통해서 질소 하에 테트라하이드로푸란(2 mL) 중의 화합물 105*(0.33 g, 0.21 mmol)의 용액에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 디클로로메탄(3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층들을 염수(5 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 알릴 이성질체화된 화합물(1H NMR에 의해서 확인된 이성질체화)을 얻었다. 비닐 기질을 테트라하이드로푸란:물(2:1, 3mL)의 혼합물에 취하고, 요오드(0.11 g, 0.43 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 갈색 착색된 용액을 2 시간 동안 교반시킨 후에, Na2S2O3 용액(5 mL)의 10% 용액으로 켄칭시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x 5 mL)로 추출하고, 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트 30%)에 의한 정제는 생성물을 황색 고형물(240 mg, 75 %)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C92H86O20Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1533.5610, 실측치 1533.5387.
화합물 107*
Figure pct00374
화합물 106*(0.242 g, 0.160 mmol)를 무수 디클로로메탄(2.0 mL)에 용해시키고, Cs2CO3(0.104 g, 0.320 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(0.08 mL, 0.480 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. TLC 분석은 출발물질의 완전한 전환 및 새로운 스폿을 나타냈다. 반응 혼합물을 Celite 패드(1cm)를 통해서 여과하였다. 패드를 DCM(20 mL)으로 세척하고, 여액을 감압하에 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜 담황색 오일을 얻었다. 플래시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/에틸 아세테이트 + 0.1% Et3N)에 의해서 정제를 수행하여 황색 포말(240 mg, 89%)을 얻었다. HRMS(ESI+) C100H90F3NO20Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1704.5906, 실측치 1704.5603.
화합물 108*
Figure pct00375
화합물 107*(0.666g, 0.539 mmol) 및 화합물 101*(0.4 g, 0.414 mmol)을 25 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(10 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(8 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(15 μL, 0.018 mmol)를 반응 혼합물 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색 고형물(0.650 g, 78 %)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C122H114O27Na+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 2033.7445, 실측치 2033.7077.
화합물 109*
Figure pct00376
(1,5-사이클로옥타디엔)(피리딘)(트리사이클로헥실포스핀)-Ir(I)]PF6(6.3 mg, 7.45 μmol)를 테트라하이드로푸란(1.5 mL)에 용해시키고, 적색 촉매를 용해시키면서, 질소를 실온에서 2 분 동안 용액을 통해서 버블링시켰다. 이어서, 용액을 수소로 2 분 동안 퍼징시켰고, 이러한 동안에, 적색 용액이 무색으로 변화되었고, 용액을 15 분 동안 수소 하에 교반시켰다. 이어서, 활성 촉매의 용액을 주사기를 통해서 질소 하에 테트라하이드로푸란(0.8 mL) 중의 화합물 108*(0.15 g, 0.075 mmol)의 용액에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 디클로로메탄(3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층들을 염수(5 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 알릴 이성질체화된 화합물(1H NMR에 의해서 확인된 이성질체화)을 얻었다. 비닐 기질을 테트라하이드로푸란:물(2:1, 2.5mL)의 혼합물에 취하고, 요오드(37.8 mg, 0.149 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 갈색 착색된 용액을 2 시간 동안 교반시킨 후에, Na2S2O3 용액(5 mL)의 10% 용액으로 켄칭시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x 5 mL)로 추출하고, 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트 30%)에 의한 정제는 생성물을 황색 고형물(94 mg, 64 %)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C119H110O27Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1993.7132, 실측치 1993.6822.
화합물 110*
Figure pct00377
화합물 109*(0.094 g, 0.048 mmol)를 무수 디클로로메탄(0.6 mL)에 용해시키고, Cs2CO3(31 mg, 0.095 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(23 μL, 0.143 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. TLC 분석은 출발물질의 완전한 전환 및 새로운 스폿을 나타냈다.
반응 혼합물을 Celite 패드(1cm)를 통해서 여과하였다. 패드를 DCM(20 mL)으로 세척하고, 여액을 감압하에 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜 엷은 황색빛 고형물을 얻었다.
플래시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸 아세테이트 + 0.1% Et3N)의해서 정제를 수행하여 황색 포말(85 mg, 83%)을 얻었다. HRMS(ESI+) C127H114F3NO27Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2164.7428, 실측치 2164.7056.
화합물 111*
Figure pct00378
화합물 108*(0.100 g, 0.050 mmol)을 교반 막대가 구비되고 400 rpm의 교반을 수행하는 질소 대기 하의 10 mL RBF 내의 DCM(1.3 mL) 및 메탄올(0.3 mL)의 교반 용액에 전달하였다. DDQ(0.056g, 0.248 mmol)를 첨가하였고, TLC 분석(40% 에틸 아세테이트/시클로헥산)은 2 시간 후에도 주된 양의 출발물질에 약간 극성인 새로운 스폿의 존재를 나타냈고, 그래서, 반응 혼합물을 추가로 4 시간 동안 RT에서 교반시켰다. TLC는 출발물질의 부재를 나타냈지만, 생성물의 존재 뿐만 아니라 희미한 극성 스폿을 나타냈다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액(10 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM 내로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 포화용액(10 mL), 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 100 mL RBF 내의 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 1 시간 동안 농축시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제를 수행하였다. 이어서, 디클로로메탄을 이에 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 계속 증발시켜 무색의 투명한 고무질 액체를 생성시켰고, 이를 고진공 하에 16 -18 시간 동안 건조시켜 성긴 백색 고형물(43 mg, 46%)을 형성시켰다. HRMS(ESI+) C111H106O27Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1893.6819, 실측치 1893.6498.
화합물 112*
Figure pct00379
화합물 103*(29 mg, 0.024 mmol) 및 화합물 111*(34 mg, 0.018 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(0.3 mL) 및 건조된 4 Å 분자체 (MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(0.6 μL, 3.63 μmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서 RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시키고. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색 고형물(35 mg, 66 %)로서 얻었다. Maldi C176H164O40Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2942.2, 실측치 2942.3.
화합물 113*
Figure pct00380
화합물 110*(64 mg, 0.030 mmol) 및 화합물 111*(43 mg, 0.023 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(0.5 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(0.8 μL, 4.59 μmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온시키고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시키켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(66 mg, 75 %)로서 얻었다. Maldi C230H214O53Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3849.2, 실측치 3849.4.
화합물 114*
Figure pct00381
(1,5-사이클로옥타디엔)(피리딘)(트리사이클로헥실포스핀)-Ir(I)]PF6(8.18 mg, 9.7 μmol)를 테트라하이드로푸란(1.9 mL)에 용해시키고, 적색 촉매를 용해시키면서, 질소를 실온에서 2 분 동안 용액을 통해서 버블링시켰다. 이어서, 용액을 수소로 2 분 동안 퍼징시켰고, 이러한 동안에, 적색 용액이 무색으로 변화되었고, 용액을 15 분 동안 수소 하에 교반시켰다. 이어서, 활성 촉매의 용액을 주사기를 통해서 질소 하에 테트라하이드로푸란(0.9 mL) 중의 화합물 113*(0.370 g, 0.097 mmol)의 용액에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시키고, 디클로로메탄(3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층들을 염수(5 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 알릴 이성질체화된 화합물(1H NMR에 의해서 확인된 이성질체화)을 얻었다. 비닐 기질을 테트라하이드로푸란:물(2:1, 2.5mL)의 혼합물에 취하고, 요오드(49 mg, 0.193 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 갈색 착색된 용액을 2 시간 동안 교반시킨 후에, Na2S2O3 용액(5 mL)의 10% 용액으로 켄칭시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x 5 mL)로 추출하고, 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트 30%)에 의한 정제는 생성물을 황색 고형물(270 mg, 57 %)로서 생성시켰다. Maldi C227H210O53Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3809.1, 실측치 3809.0.
화합물 115*
Figure pct00382
화합물 114*(0.210 g, 0.055 mmol)를 무수 디클로로메탄(0.7 mL)에 용해시키고, Cs2CO3(36 mg, 0.111 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐아세트이미도일 클로라이드(26 μL, 0.166 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. TLC 분석은 출발물질의 완전한 전환 및 새로운 스폿을 나타냈다. 반응 혼합물을 Celite 패드(1cm)를 통해서 여과하였다. 패드를 DCM(20 mL)으로 세척하고, 여액을 감압하에 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜 엷은 황색빛 고형물을 얻었다.
플래시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/에틸 아세테이트 + 0.1% Et3N)에 의해서 정제를 수행하여 황색 포말(180 mg, 82%)을 얻었다. Maldi C235H214O53Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3980.2, 실측치 3981.3.
화합물 116*
Figure pct00383
화합물 110*(0.013mg, 0.103mmol) 및 5-아지도펜타놀(0.110g, 0.05mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(20mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(1mL)을 교반 막대가 구비된 질소 대기 하의 그것에 첨가하고, 300 rpm으로 교반시켰다. ~100mg의 건조된 4 Å 분자체(MS)를 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(1.9 μL, 10.26 μmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(0.091g, 85%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C124H119N3O27Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2104.7929, 실측치 2104.7905.
화합물 117*
Figure pct00384
화합물 116*(0.091g, 0.044mmol)을 교반 막대가 구비되고 400 rpm의 교반을 수행하는 질소 대기 하의 10 mL RBF 내의 DCM(0.8mL) 및 포스페이트 완충액 pH 7.4 (0.8mL)의 교반 용액에 전달하였다. DDQ(0.02g, 0.087mmol)를 첨가하였고, TLC 분석(40% 에틸 아세테이트/시클로헥산)은 2 시간 후에도 주된 양의 출발물질에 약간 극성인 새로운 스폿의 존재를 나타냈고, 그래서, 반응 혼합물을 추가로 4 시간 동안 RT에서 교반시켰다. TLC는 출발물질의 부재를 나타냈지만, 생성물의 존재 뿐만 아니라 희미한 극성 스폿을 나타냈다. 반응을 NaHCO3 포화 수용액의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM 내로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 포화용액(50 mL), 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 50 mL RBF 내의 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 1 시간 동안 농축시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(0.041g, 47%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C113H111N3O27Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1964.7303, 실측치 1964.7309.
화합물 118*
Figure pct00385
화합물 103*(33 mg, 0.027 mmol) 및 화합물 117*(40 mg, 0.021 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(0.4 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(0.7 μL, 4.12 μmol)를 반응 혼합물 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색 고형물(37 mg, 60 %)로서 얻었다. Maldi C178H169N3O40Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3013.3, 실측치 3014.2.
화합물 119*
Figure pct00386
화합물 118*(27mg, 0.009mmol)을 교반 막대가 구비된 질소 대기 하의 THF (0.6mL)에 취하였다. 소듐 메톡사이드(18 μL, 9.03 μmol)의 0.5M 메탄올성 용액을 첨가하였다. 생성되는 용액을 50℃에서 25 시간 동안 교반시켰다. 반응을 HRMS 및 TLC[(50 % 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트)에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 진공 중에서 15 분 동안 최소 용적으로 증발시키고, 이어서, 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 반응 혼합물을 50% 수성 AcOH 용액(5 mL)을 사용하여 산성화시키고, 층을 분리하였다. 이어서, 수성층을 에틸 아세테이트(5 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 10 mL RBF 내의 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 1 시간 동안 진공 하에 농축시켜 황색 고형물을 었었다. 이어서, ~2% 에틸아세테이트/헥산(~5 mL)를 RBF 중의 고형물에 첨가하고, 수조에서 RBF을 45℃로 가온하고, 분쇄시키고, 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 고형물을 따뜻한 ~2% 에틸아세테이트/헥산으로 두번 더 세척하고, 고진공 중에서 건조시켜 담황색 고형물을 요구되는 생성물로서 얻었다. 모든 여액들을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 황색 고형물(14 mg, 76%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C115H113N3O31Na+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 2074.8821, 실측치 2074.8574.
화합물 120*
Figure pct00387
화합물 119*을 RT에서 교반 막대가 구비되고 250 rpm의 교반을 수행하는(Heidolph 교반기) 질소 대기 하의 20 mL Wheaton Vial(10 분 오븐 건조됨) 내에서 iPrOH, DCM, 및 H2O의 용매 혼합물에 취하였다. 10% Pd/C의 현탁액을 그것에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 가스 하에 퍼징시키고, 후속하여 인 하우스 수소화기(in house Hydrogenator)를 사용하여 RT에서 24 시간 동안 10 바의 압력 하에 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 PTFE 소수성 필터(0.45μm)를 통해서 여과하고, 필터를 메탄올(3 mL x 5), 물-메탄올(6:4, 3 mL x 5)로 완전히 세척하였다. 여액을 건조한 상태로 진공하에 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 1 시간 동안 증발시켜 회백색 고형물을 미정제 생성물로서 얻었다. 미정제 생성물의 1H NMR은 반응의 완료를 나타냈지만, 중간체의 존재를 나타냈다. 이어서, 미정제 생성물을 용리액으로서 물 및 아세토니트릴을 사용한 C18 Sepak 컬럼을 사용하여 정제하여 물 분획(fr1) 중의 요망되는 순수한 생성물을 얻었다.
부산물을 50% 물-아세토니트릴 분획(fr2) 중에 용리시키고, 불순물을 아세토니트릴 세척액(fr3)에 용리시켰다. 불순물 함유 물 분획(fr1)을 용리액으로서 물을 사용한 SEC 컬럼을 통해서 추가로 정제하였다. 물 분획의 동결 건조는 요망되는 순수한 생성물을 백색 포말성 고형물(2 mg, 28%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C115H113N3O31H+에 대한 계산치 [M+H]+ 1076.4245, 실측치 1076.4256.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.20 - 5.11 (m, 3H), 4.70 - 4.66 (m, 2H), 4.45 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.30 - 4.11 (m, 9H), 4.07 - 3.91 (m, 6H), 3.87 - 3.62 (m, 23H), 2.91 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.81 - 1.57 (m, 4H), 1.50 - 1.41 (m, 2H).
화합물 120a-l*
Figure pct00388
화합물 120-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 110* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 120*과 유사하게 제조하였다.
A-6-2 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-II 옥타사카라이드의 제조
화합물 121*
Figure pct00389
화합물 110*(0.172 mg, 0.080 mmol) 및 화합물 117*(120 mg, 0.062 mmol)을 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(1.2 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(2.2 μL, 12 μmol)를 반응 혼합물 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, 이어서, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(125 mg, 52 %)로서 얻었다. Maldi C230H214O53Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3920.3, 실측치 3921.1.
화합물 122*
Figure pct00390
화합물 121*(24mg, 6.2 μmol)을 교반 막대가 구비된 질소 대기 하의 THF (0.6mL)에 취하였다. 소듐 메톡사이드(12 μL, 6.2μmol)의 0.5 M 메탄올성 용액을 첨가하였다. 생성되는 용액을 50℃에서 25 시간 동안 교반시켰다. 반응을 HRMS 및 TLC(50 % 사이클로헥산 중의 에틸 아세테이트)에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 진공 중에서 15 분 동안 최소 용적으로 증발시키고, 이어서, 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 반응 혼합물을 50% AcOH 수용액(10 mL)을 사용하여 산성화시키고, 층을 분리하였다. 이어서, 수성층을 에틸 아세테이트(5 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공하에 1 시간 동안 50 mL RBF 중의 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 진공 중에서 농축시켜 황색 고형물을 얻었다. 이어서, ~2% 에틸아세테이트/헥산(~5 mL)을 RBF 중의 고형물에 첨가하고, RBF를 45℃로 수조에서 가온하고, 분쇄시키고, 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 고형물을 따뜻한 ~2% 에틸아세테이트/헥산으로 2회 더 세척하고, 고진공 중에서 건조시켜 담황색 고형물을 요구되는 생성물로서 얻었다. 모든 여액들을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 황색 고형물(11mg, 66%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C148H171N3O41Na+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 2669.1286, 실측치 2669.1233.
화합물 123*
Figure pct00391
화합물 122*(11 mg, 4.2 μmol)를 실온에서 교반 막대가 구비되고 250 rpm의 교반을 수행하는(Heidolph 교반기) 질소 대기 하의 20 mL Wheaton Vial(10 분 오든 건조됨) 내의 iPrOH, DCM, 및 H2O의 용매 혼합물 중에 취하였다. 수소화 반응을 일반적인 원안 C에 따라서 수행하였다. 미정제 생성물의 1H NMR은 반응의 완료를 나타냈지만 중간체의 존재를 나타냈다. 이어서, 미정제 생성물을 용리액으로서 물 및 아세토니트릴을 사용한 C18 Sepak 컬럼을 사용하여 정제하여 물 분획(fr1) 중의 요망되는 순수한 생성물을 얻었다. 부산물을 50% 물-아세토니트릴 분획(fr2)에 용리시켰고, 불순물을 아세토니트릴 세척액(fr3)에 용리시켰다. 불순물 함유 물 분획(fr1)을 용리액으로서 물을 사용하는 SEC 컬럼을 통해서 추가로 정제하였다. 물 분획의 동결 건조는 요망되는 순수한 생성물을 백색 포말성 고형물(2 mg, 34%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C115H113N3O31H+에 대한 계산치 [M+H]+ 1400.5301, 실측치 1400.5376. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.20 - 5.16 (m, 3H), 5.15 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.70 - 4.66 (m, 3H), 4.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.33 - 4.09 (m, 12H), 4.07 - 3.88 (m, 5H), 3.88 - 3.58 (m, 33H), 3.00 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.50 - 1.40 (m, 4H), 1.42 - 1.29 (m, 2H).
화합물 123a-l*
Figure pct00392
화합물 123-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 110* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 123*과 유사하게 제조하였다.
A-6-3 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-II 도데카사카라이드의 제조
화합물 124*
Figure pct00393
화합물 121*(0.105g, 0.027mmol)을 교반 막대가 구비되고 400 rpm의 교반을 수행하는 질소 대기 하의 10 mL RBF 내의 DCM(0.5 mL) 및 포스페이트 완충액 ph 7.4(0.5 mL)의 교반 용액에 전달하였다. DDQ(0.028 g, 0.121 mmol)를 첨가하였다. TLC 분석(40% 에틸 아세테이트/시클로헥산)은 2 시간 후에도 주된 양의 출발물질에 약간 극성인 새로운 스폿의 존재를 나타냈고, 그래서, 반응 혼합물을 추가로 4 시간 동안 RT에서 교반시켰다. TLC는 출발물질의 부재를 나타냈지만, 생성물 뿐만 아니라 희미한 극성 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 NaHCO3 포화 수용액의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM 내로 추출하였다. 합한 유기층을 NaHCO3 포화용액(10 mL), 염수(20 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 1 시간 동안 50 mL RBF에서 회전증발기의 30-35℃의 배쓰 온도에서 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 담황색 오일로서 얻었다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용한 플래시 크로마토그래피 시스템에 이해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(0.044g, 44%)로서 얻었다. MALDI C221H211O53H+에 대한 계산치 [M+H]+ 3758.1, 실측치 3758.4.
화합물 125*
Figure pct00394
화합물 110*(26 mg, 0.012 mmol) 및 화합물 124*(45 mg, 0.012 mmol)를 10 mL RBF에 취하고, 무수 톨루엔(3 mL)을 첨가하고, 진공하에 30 분 동안 건조한 상태로로 증발시켰고, 이러한 공비 건조 과정을 2회 더 반복하였다. 출발물질을 고진공 하에 12 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 무수 디클로로메탄(0.2 mL) 및 건조된 4 Å 분자체(MS)를 질소 대기 하에 그것에 첨가하고, 실온에서 45 분 동안 교반시키고, 이어서, 0℃로 냉각시켰다. TMS-OTf(0.2 μL, 2.4 μmol)를 반응 혼합물 반응 혼합물에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 이어서, 그것을 10℃로 0.5 시간 동안 서서히 가온하고, RT에서 1 시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 공여체 스폿의 사라짐 및 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 반응물을 5℃에서 트리에틸아민의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 미정제 유기 생성물을 사이클로헥산/에틸 아세테이트 구배 시스템을 사용하여 플래시 크로마토그래피 시스템에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서, 고진공 하에 16 시간 동안 건조시켜 생성물을 백색의 성긴 고형물(22 mg, 32 %)로서 얻었다. Maldi C340H319N3O53H+에 대한 계산치 [M+H]+ 5711.2, 실측치 5715.6.
화합물 126*
Figure pct00395
화합물 126*을 화합물 119*의 합성에 대한 절차에 따라 화합물 125*로부터 제조하였다.
화합물 127*
Figure pct00396
화합물 127*을 화합물 120*의 합성에 대한 절차에 따라 화합물 126*로부터 제조하였다.
A-7 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-III 사카라이드의 제조
A-7-1 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-III 트리사카라이드의 제조
화합물 128*
Figure pct00397
DCM(13 mL) 중의 화합물 4*(420 mg, 0.653 mmol)의 용액에, 4 Å MS, Ph2SO (172 mg, 0.849 mmol) 및 2,4,6-트리-3차-부틸피리미딘 (404 mg, 1.633 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. Tf2O(240 mg, 0.849 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반시켰다. 이어서, 5-아지도펜타놀(169 mg, 1.307 mmol)을 적가하고, 2 mL DCM에 용해시켰다. 반응 혼합물을 3 시간에 걸쳐서 -40℃로 가온시키고, 이어서, 트리에틸아민(3 mL)로 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 DCM(20 mL)으로 희석시키고, 염수(30 mL)로 세척하고, 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 미정제 혼합물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 정제를 사용하여 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 농축은 생성물을 무색 오일(350 mg, 81%)로서 생성시켰다. C37H51N3O6Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 684.3445, 실측치 684.3371.
화합물 129*
Figure pct00398
THF(5 mL) 중의 화합물 128*(350 mg, 0.529 mmol)의 용액에, HF.py(0.11 mL, 4.23 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 출발물질의 완전한 소모 후에(TLC), 반응물을 트리에틸아민(0.5 mL)으로 켄칭시키고, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 반응 혼합물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템에 의해서 정제하여 생성물을 무색 오일(199 mg, 72%)로서 얻었다.
화합물 130*
Figure pct00399
벤조산 무수물(99 mg, 0.437 mmol) 및 트리에틸아민(295 mg, 2.91 mmol)을 DCM(2 mL) 중의 디올 129*(190 mg, 0.364 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 정제 시스템(콤비플래시)을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(225 mg, 99%)로서 얻었다. C36H39N3O7Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 648.2686, 실측치 648.2625.
화합물 131*
Figure pct00400
톨루엔:디옥산(3:1, 1.2 mL) 중의 화합물 9*(65 mg, 0.100 mmol) 및 화합물 130*(55 mg, 0.088 mmol)의 용액에 4 Å MS를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 이어서, NIS(28 mg, 0.123 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. TMSOTf(1.6 μL, 8.8 μmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 0℃에서 교반시켰다. 반응물을 트리에틸아민(0.1 mL)로 켄칭시키고, DCM (10 mL)로 희석시키고, 10% Na2SO3 및 포화 NaHCO3로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)를 사용한 자동화된 정제 시스템에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 무색의 오일(60 mg, 59%)로서 얻었다. C70H71N3O13Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 1184.4885, 실측치 1184.4783.
화합물 132*
Figure pct00401
아르곤 대기의 10 mL RBF 내의 DCM:MeOH(4:1, 2 mL) 중의 화합물 131*(60 mg, 0.052 mmol)의 용액에 0℃에서 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 40 분 동안 실온에서 교반시켰다. 반응을 TLC(사이클로헥산 중 EtOAc, 2:1)에 의해서 모니터링하였다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(5 mL)으로 켄칭시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3(5 mL) 및 염수(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 15 분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서 생성물(TLC를 기준으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 무색의 오일(35 mg, 66%)을 생성시켰다. C59H63N3O13Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 1044.4259, 실측치 1044.4156.
화합물 133*
Figure pct00402
화합물 10*(33 mg, 0.032 mmol) 및 화합물 132*(30 mg, 0.044 mmol)를 톨루엔과 동시 증발시키고, 20 분 동안 고진공 중에서 건조시켰다. DCM(6 mL) 중의 공여체 및 수용체의 용액에 4 Å MS를 첨가하고, 혼합물을 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시켰다. NIS(11 mg, 0.048 mmol) 및 AgOTf(2 mg, 8.07 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1 시간에 걸쳐서 -20℃로 가온시켰다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 트리에틸아민(0.2 mL)으로 켄칭시키고, DCM(10 mL)로 희석시키고, Na2SO3 및 포화 NaHCO3으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 자동화된 정제 시스템(에틸 아세테이트/시클로헥산)에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 무색의 오일(34 mg, 66%)을 얻었다. C93H89N3O22Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 1623.5869, 실측치 1623.5714.
화합물 134*
Figure pct00403
MeOH 25% w/w (0.029 mL, 0.127 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 용액을 MeOH:THF(2:1, 1.5 mL)의 혼합물 중의 화합물 133*(17 mg, 0.010 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 AcOH(0.2 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 증발시켰다. 용리액으로서 DCM 중의 5% MeOH를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 백색 오일(9 mg, 87%)로서 얻었다.
화합물 135*
Figure pct00404
화합물 134*(9 mg, 0.009 mmol)를 MeOH:DCM:EtOAc(2:0.5:0.5, 3 mL)의 혼합물에 용해시켰다. Pd/C(10 mg, 0.009 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소(5회)로 퍼징하고, 반응물을 수소 압력(10 바)하에 60 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O:MeOH(1:1)를 사용하여 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 유기 용매를 회전증발기에서 증발시키고, 미정제 물질을 동결 건조시켰다. 미정제 생성물을 miliQ H2O를 사용하여 SepPack에 의해서 정제하여 생성물을 백색 고형물(1 mg, 18%)로서 얻었다. C23H44NO16Na에 대한 계산치 [M+H]+ 590.2660, 실측치 590.2593. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.26 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.10 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.05 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.31 - 4.21 (m, 3H), 4.17 - 4.04 (m, 5H), 4.03 - 3.94 (m, 2H), 3.94 - 3.67 (m, 9H), 3.66 - 3.57 (m, 1H), 3.07 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.82 - 1.65 (m, 4H), 1.59 - 1.45 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 109.0, 100.1, 98.3, 82.2, 80.9, 78.3, 76.8, 76.1, 71.6, 70.8, 70.5, 69.1, 68.9, 68.0, 67.9, 62.7, 60.7, 60.4, 39.4, 28.1, 26.5, 22.4.
A-7-2 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-III 헥사사카라이드의 제조
화합물 137*
Figure pct00405
DCM(40 mL) 중의 이미데이트 공여체 76*(2.6 g, 3.41 mmol) 및 4-메톡시페놀(1.06, 8.53 mmol)의 용액에 4 Å MS를 첨가하고 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반시켰다. TMSOTf(0.076 g, 0.341 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 트리에틸아민(0.2 mL)으로 켄칭시키고, 여과하고, 용매를 회전증발기에서 증발시켰다. 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 정제 시스템에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 포말(2.14 g, 90%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C39H36O12Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 719.2104, 실측치 719.2036.
화합물 138*
Figure pct00406
DCM(30 mL) 중의 화합물 137*(2.14 g, 3.07 mmol)의 용액에, 아세트산(2.4 mL, 41.9 mmol) 및 피리딘(3.6 mL, 44.5 mmol)에 용해된 하이드라진 수화물(0.394 g, 12.29 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성되는 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세톤(3 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 진공하에 제거하여 미정제 생성물(약간의 피리딘이 잔류됨)을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 생성물을 백색 포말(1.79 g, 97%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C34H30O10Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 621.1737, 실측치 621.1672.
화합물 139*
Figure pct00407
DCM(60 mL) 중의 화합물 4*(2.5 g, 3.89 mmol)의 용액에, 4 Å MS, Ph2SO (1.15 g, 5.68 mmol) 및 2,4,6-트리-3차-부틸피리미딘(2.6 g, 10.47 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. Tf2O (1.8 g, 6.37 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반시켰다. 이어서, 화합물 138*을 적가하고, 10 mL DCM에 용해시켰다. 반응 혼합물을 3 시간에 걸쳐서 -50℃로 가온하고, 이어서, 트리에틸아민(3 mL)으로 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 DCM(50 mL)으로 희석시키고, 염수(30 mL)로 세척하고, 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 미정제 혼합물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제를 사용하여 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 생성물을 무색 오일(3.05 g, 90%)로서 생성시켰다. HRMS(ESI+) C66H70O15Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1153.4392, 실측치 1153.4268.
화합물 140*
Figure pct00408
2 x 50 mL 팔콘 튜브 내의 THF(40 mL) 중의 화합물 139*(3 g, 2.65 mmol)의 용액(큰 용적으로 인해서 2개의 튜브에 분할된 용액)에, HF·py(21 mL, 21 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 출발물질의 완전한 소모 후에(TLC), 반응물을 트리에틸아민(5 mL)으로 켄칭시키고, DCM(30 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(20 mL) 및 염수(20 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 제거하였다. 오일 잔류물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템(콤비플래시)을 사용하여 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 생성물을 무색 오일(2.4 g, 91%)로서 생성시켰다.
화합물 141*
Figure pct00409
벤조산 무수물(0.66 g, 2.91 mmol) 및 트리에틸아민(1.96 g, 19.37 mmol)을 DCM(48 mL) 중의 디올 140*(2.4 g, 2.42 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응물을 DCM(30 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(20 mL)으로 세척하였다. 층들을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 x 30 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층들을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템(콤비플래시)를 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(2.4 g, 90%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C65H58O16Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1117.3623, 실측치 1117.3515.
화합물 142*
Figure pct00410
톨루엔:디옥산(3:1, 40 mL) 중의 화합물 9*(2.216 g, 3.29 mmol) 및 화합물 141*(2.4 g, 2.191 mmol)의 용액에, 4 Å MS를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 이어서, NIS(0.986 g, 4.38 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. TMSOTf(0.049 g, 0.219 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 0℃에서 교반시켰다. 반응물을 트리에틸아민(3 mL)으로 켄칭시키고, DCM(70 mL)으로 희석시키고, Na2SO3 및 포화 NaHCO3으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기에서 농축시켰다. 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)를 사용하는 자동화된 정제 시스템에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 황색빛 고형물(3.27 g, 91%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C99H90O22Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1654.5855, 실측치 1654.5658.
화합물 143*
Figure pct00411
세릭 암모늄 니트레이트(ceric ammonium nitrate)(249 mg, 0.453 mmol)를 0℃의 ACN/H2O(8:1, 4.5 mL) 중의 화합물 142*(370 mg, 0.227 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반시키고, 실온으로 가온하였다. 4 시간 후에, CAN(100 mg, 0.182 mmol)의 또 다른 분취물을 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 30 분 후에, 반응물을 DCM(20 mL)으로 희석시키고, 염수(10 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기(수조 ~35℃)에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 황색 오일(275 mg, 79%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C92H84O21Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1548.5436, 실측치 1548.5278.
화합물 144*
Figure pct00412
Cs2CO3(141 mg, 0.433 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐-아세트이미도일 클로라이드(135 mg, 0.649 mmol)을 DCM(10 mL) 중의 락톨 143*(330 mg, mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 2 시간 후에 모든 출발물질이 소모되었고, 반응물을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM(20 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 실리카겔(에틸 아세테이트/시클로헥산 + 1% Et3N) 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. TLC에 의한 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(310 mg, 84%)로서 얻었다.
화합물 145*
Figure pct00413
화합물 144*(250 mg, 0.147 mmol) 및 화합물 132*(137 mg, 0.134 mmol)를 DCM(5 mL)에 용해시켰다, 4 Å MS를 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -30℃로 냉각시키고, TMSOTf(6 mg, 0.028 mmol)를 첨가하고, 반응물을 3 시간에 걸쳐서 -5℃로 가온하였다. 반응을 트리에틸아민(0.5 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, DCM(20 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 잔류물을 얻었다. 미정제 반응 혼합물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템에 의해서 정제하였다. TLC에 의한 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(259 mg, 76%)로서 얻었다.
화합물 146*
Figure pct00414
아르곤 대기 하의 10 mL RBF 내의 DCM:MeOH(4:1, 2 mL) 중 화합물 145*(255 mg, 0.101 mmol)의 용액에, 0℃의 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 40 분 동안 실온에서 교반시켰다. 반응을 TLC(사이클로헥산 중 EtOAc, 2:1)에 의해서 모니터링하였다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(5 mL)으로 켄칭시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3(5 mL) 및 염수(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 15 분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 무색의 오일(120 mg, 50%)을 생성시켰다. HRMS(ESI+) C140H137N3O33Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2411.9066, 실측치 2411.8844.
화합물 147*
Figure pct00415
화합물 95*(54 mg, 0.070 mmol) 및 화합물 146*(84 mg, 0.035 mmol)를 톨루엔과 동시 증발시키고, 진공 하에 밤에 정치시켰다. 이어서, 혼합물을 DCM(5 mL)에 용해시키고, 4 Å MS를 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -50℃로 냉각시키고, TMSOTf(6 mg, 0.028 mmol)를 첨가하고, 반응물을 4 시간에 걸쳐서 -5℃로 가온하였다. 반응을 트리에틸아민(0.03 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 증발시켜 오일 잔류물을 얻었다. 미정제 반응 혼합물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템에 의해서 정제하여 생성물을 무색 오일(80 mg, 77%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C174H163N3O42Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 2411.9066, 실측치 2411.8844.
화합물 148*
Figure pct00416
MeOH 25% w/w (0.12 mL, 0.539 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 용액을 MeOH:THF(2:1, 3 mL)의 혼합물 중의 헥사사카라이드 147*(80 mg, 0.027 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 AcOH(0.2 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 증발시켰다. 미정제 물질을 isolute에 부하시켰다. 용리 순서: 1) 사이클로헥산, 2) 에틸 아세테이트 및 3) DCM 5% 중의 MeOH를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 백색 오일(44 mg, 90%)로서 얻었다. C97H119N3O31Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1845.7759, 실측치 1845.7556.
화합물 149*
Figure pct00417
헥사사카라이드 148*(40 mg, 0.022 mmol)을 DCM:tBuOH:H2O(1:0.8:0.2, 2 mL)의 혼합물에 용해시켰다. PdC(40 mg, 0.038 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소(5회)로 퍼징하고, 반응물을 수소 압력(5 바) 하에 22 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O:ACN(1:1)을 사용한 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 유기 용매를 회전증발기에서 증발시키고, 미정제 물질을 동결 건조시켰다. 미정제 생성물을 miliQ H2O를 사용한 SepPack에 의해서 정제하여 생성물을 백색 고형물(17 mg, 72%)로서 얻었다. C41H74NO31에 대한 계산치 [M+H]+ 1076.4245, 실측치 1076.4123. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.08 - 5.04 (m, 2H), 4.94 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.88 - 4.81 (m, 2H), 4.18 (dd, J = 5.4, 2.9 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 8.5, 3.0 Hz, 1H), 4.11 - 3.84 (m, 13H), 3.83 - 3.37 (m, 22H), 2.85 (t, J = 7.54 Hz 1H), 1.62 - 1.43 (m, 2H), 1.38 - 1.23 (m, 1H). 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 109.5, 109.1, 100.3, 100.2, 98.4, 84.7, 82.3, 81.0, 80.5, 79.8, 78.3, 78.2, 76.9, 76.6, 76.1, 72.1, 71.9, 70.9, 70.7, 70.6, 70.1, 69.2, 69.2, 69.0, 68.7, 68.1, 67.9, 67.9, 62.9, 62.8, 60.6, 60.4, 60.0, 39.5, 28.2, 26.6, 22.5.
화합물 149a-l*
Figure pct00418
화합물 149a-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 4* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 149*와 유사하게 제조하였다.
A-7-3 클렙시엘라 뉴모니아 갈락탄-III 노나사카라이드의 제조
화합물 150*
Figure pct00419
아르곤 대기의 25 mL RBF 내의 DCM:MeOH (4:1, 3.75 mL) 중의 화합물 142*(500 mg, 0.306 mmol)의 용액에, 0℃의 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(348 mg, 1.532 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응을 TLC(사이클로헥산 중 EtOAc, 2:1)에 의해서 모니터링하였다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 포화 NaHCO3(5 mL)로 켄칭시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3(5 mL) 및 염수(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4(0.2 g)상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)를 사용한 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 무색의 오일(350 mg, 77%)을 생성시켰다. C88H82O22Na에 대한 계산치 [M+Na]+ 1514.5229, 실측치 1514.5256.
화합물 151*
Figure pct00420
아르곤 대기 하의 25 mL RBF 내의 DCM(3 mL) 중의 트리사카라이드 150*(340 mg, 0.228 mmol)의 용액에, 레불린산(119 mg, 1.026 mmol)을 첨가하였다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(197 mg, 1.026 mmol) 및 DMAP(84 mg, 0.684 mmol). 생성되는 반응 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 반응물을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 5 시간 후에, 반응이 완료되지 않았다. 반응 혼합물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, 염수(5 mL)로 세척하였다. 수성층을 DCM(1 x 5 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 사이클로헥산 중 EtOAc를 사용하는 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 백색 오일(260 mg, 72%)을 생성시켰다.
화합물 152*
Figure pct00421
세릭 암모늄 니트레이트(179 mg, 0.327 mmol)를 0℃의 ACN/H2O(8:1, 3.3 mL) 중의 화합물 151*(260 mg, 0.164 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반시키고, 실온으로 가온하였다. 4 시간 후에, CAN(100 mg, 0.182 mmol)의 또 다른 분취물을 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 30 분 동안 실온에서 교반시켰다. 30 분 후에, 반응물을 DCM(20 mL)으로 희석기키고, 염수(10 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 회전증발기(수조 ~ 35℃)에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용하는 자동화된 정제 시스템을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 황색 오일(209 mg, 86%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C86H82O23Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 1505.5145, 실측치 1505.5186.
화합물 153*
Figure pct00422
Cs2CO3(115 mg, 0.354 mmol) 및 2,2,2-트리플루오로-N-페닐-아세트이미도일 클로라이드(49 mg, 0.236 mmol)를 DCM(20 mL) 중의 락톨 152*(175 mg, 0.118 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 2 시간 후에 모든 출발물질이 소모되었고, 반응물을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM(2 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 실리카겔 및 용리액으로서의 에틸 아세테이트/시클로헥산 + 1% Et3N를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. TLC에 의한 생성물을 함유하는 튜브들을 합하고, 용매를 증발시켜 생성물을 무색 오일(188 mg, 96%)로서 얻었다.
화합물 154*
Figure pct00423
트리사카라이드 153*(69 mg, 0.042 mmol) 및 화합물 146*(50 mg, 0.021 mmol)을 톨루엔과 동시 증발시키고, 진공하에 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서, 혼합물을 DCM(1.5 mL)에 용해시키고, 4 Å MS를 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -50℃로 냉각시키고, TMSOTf(5 μL, 0.028 mmol)를 첨가하고, 반응물을 4 시간에 걸쳐서 -10℃로 가온시켰다. 반응물을 트리에틸아민(0.03 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 증발시켜 오일 잔류물을 얻었다. 미정제 반응 혼합물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 정제 시스템에 의해서 정제하여 생성물을 무색 오일(50 mg, 62%)로서 얻었다. HRMS(ESI+) C226H217N3O55Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3877.4240, 실측치 3877.3947.
화합물 155*
Figure pct00424
DCM(3 mL) 중의 화합물 154*(100 mg, 0.026 mmol)의 용액에, 아세트산(0.04 mL) 및 피리딘(0.06 mL)에 용해된 하이드라진 수화물(8.14 μL)의 용액을 첨가하였다. 생성되는 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세톤(0.3 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 진공하에 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산(0-80%) 중의 EtOAc를 사용한 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 진공 중에서의 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 백색 오일(97 mg, 100%)을 생성시켰다. HRMS(ESI+) C221H211N3O53Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 3779.3873, 실측치 3779.3708.
화합물 156*
Figure pct00425
화합물 95*(25 mg, 0.033 mmol) 및 화합물 155*(50 mg, 0.013 mmol)를 톨루엔과 동시 건조시켰고, 진공 하에 30 분 동안 정치시켰다. 이어서, 혼합물을 DCM(2 mL)에 용해시키고, 4 Å MS를 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -50℃로 냉각시키고, TMSOTf(5 μL, 0.028 mmol)를 첨가하고, 반응물을 2 시간에 걸쳐서 -5℃로 가온하였다. 반응을 트리에틸아민(0.03 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 증발시켜 오일 잔기를 얻었다. 미정제 반응 혼합물을 실리카(에틸 아세테이트/시클로헥산)을 사용한 자동화된 정제 시스템에 의해서 정제하여 생성물을 무색 오일(27 mg, 47%)로서 얻었다. LRMS(ESI+) C255H237N3O62Na+에 대한 계산치 [M+Na]+ 4358.5483, 실측치 4358.5.
화합물 157*
Figure pct00426
MeOH 25% w/w (0.025 mL, 0.115 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 용액을 MeOH:THF(2:1, 1.5 mL)의 혼합물 중의 화합물 156*(25 mg, 5.77 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 60 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 AcOH(0.1 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 증발시켰다. 미정제 물질을 isolute에 부하시켰다. 용리 순서: 1) 사이클로헥산, 2) 에틸 아세테이트 및 3) DCM 5% 중의 MeOH를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 용매를 증발시켜, 생성물을 백색 오일(13 mg, 84%)로서 얻었다.
화합물 158*
Figure pct00427
노나사카라이드 157*(13 mg, 4.87 μmol)을 DCM:tBuOH:H2O(1:0.8:0.2, 1.4 mL)의 혼합물에 용해시켰다. PdC(12 mg, 0.011 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소(5회)로 퍼징하고, 반응물을 수소 압력(5바) 하에 22 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O:ACN(1:1)을 사용하여 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 유기 용매를 회전증발기에서 증발시키고, 미정제 물질을 동결 건조시켰다. 미정제 생성물을 miliQ H2O를 사용하여 SepPack에 의해서 정제하여 생성물을 백색 고형물(5.6 mg, 74%)로서 얻었다. C59H103NO46에 대한 계산치 [M+H]+ 1561.5751, 실측치 1562.5728. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 5.23 - 5.17 (m, 3H), 5.10 - 5.06 (m, 2H), 5.04 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.02 - 4.94 (m, 3H), 4.37 - 4.27 (m, 4H), 4.26 - 4.13 (m, 8H), 4.12 - 3.98 (m, 11H), 3.98 - 3.62 (m, 32H), 3.59 - 3.52 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 2.99 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.75 - 1.61 (m, 4H), 1.53 - 1.38 (m, 2H).
화합물 158a-l*
Figure pct00428
혼합물 158a-l*을 도 12에 도시된 바와 같은 화합물 4* 및 상응하는 알코올로부터 화합물 158*과 유사하게 제조하였다.
A-8 클렙시엘라 뉴모니아 O2a (갈락탄-I) 사카라이드의 제조
화합물 159*
Figure pct00429
화합물 44*(35 mg, 0.028 mmol)를 진공 중에서 무수 톨루엔을 사용하여 별도로 공비 건조시켰다. 그것을 RT에서 DCM(2 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, 10 분 동안 교반시켰다. 이것에, 5-N-카르복시벤질-N-벤질아미노펜타놀(18.33 mg, 0.056 mmol)을 첨가하고(순수하게), RT에서 N2 대기 하에 10 분 동안 교반시켰다. 드라이아이스-ACN 배쓰를 사용하여 RM을 -20 도로 냉각시키고, TMSOTf(1.2 mg, 5.60 μmol)를 RM에 첨가하고, RM을 -20 도에서 5 분 동안 교반시키고, 1 시간에 걸쳐서 2도로 서서히 가온하였다. TLC 분석은 새로운 강한 스폿의 존재 및 공여체 물질의 부재를 나타냈다. 그래서, RM을 NaHCO3 용액(5 mL)로 켄칭시키고, 층을 분리하였다. 수성층을 하고, 유기층을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 물질을 얻고, 이를 용리액으로서 EtOAc 및 사이클로헥산을 사용한 실리카 컬럼 상에서 Biotage를 사용하여 정제하여 생성물을 무색 층(21.4 mg, 55%)으로서 얻었다.
화합물 160*
Figure pct00430
화합물 159*(21 mg, 0.015 mmol)를 RT에서 THF-MeOH(2 mL)에 취하고, 메탄올 (0.605 mL, 0.0302 mmol) 중의 NaOMe 용액을 그것에 첨가하고, 18 시간 동안 계속 교반시켰다. TLC 분석(30%EA/CHx)은 SM의 부재 및 극성 스폿의 존재를 나타냈다. 그래서, RM을 진공 중에서 증발시켰다. EA(5 mL) 및 물(5 mL)로 희석시켰다. 중성 pH까지 AcOH로 산성화시켰다(~0.3 mL). EA(5 mLX3)로 추출하였다. 합한 유기물들을 염수 용액(5 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 엷은 황색빛 층(11.7 mg, 80%)으로서 얻었다.
화합물 161*
Figure pct00431
화합물 160*(11 mg, 0.011 mmol)을 DCM:tBuOH:H2O(1:1:0.2, 2.2 mL)의 혼합물에 취하고, 부탄올(0.2 mL) 중의 Pd/C(1 mg, 0.011 mmol)의 현탁액을 그것에 첨가하고, ~10 바의 H2 대기 하에 23 시간 동안 수소화시켰다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 메탄올(2 mLX3), 물 중의 50% 메탄올(2 mLX3)로 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 무색 층을 얻었다. 1H nmr에 의하면, 분자에 하나의 벤질기가 여전히 남아있는 듯하였고, 그래서, 물질을 용매로서 물과 부탄올 및 ~10 mg의 Pd/C을 사용하는 수소화에 14 시간 동안 다시 가하였다. RM을 PTFE 필터를 통해서 여과하고, 메탄올(2 mLX3), 물 중의 50% 메탄올(2 mLX3)로 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 무색 층(2.7 mg, 56%)을 얻었다. LRMS(ESI+) C17H33NO11H+에 대한 계산치 [M+H]+ 428.2132, 실측치 428.2037.
화합물 162*
Figure pct00432
화합물 54*(500 mg, 0.250 mmol) 및 화합물 56*(651 mg, 0.30 mmol) 둘 모두를 RBF에 함께 취하고, 무수 톨루엔을 사용하여 진공 중에서 공비 건조시켰다. 혼합물을 RT에서 DCM (20 mL)에 취하고, 4Å 분자체를 그것에 첨가하고, 30 분 동안 교반시켰다. RM을 -10 도로 얼음-아세톤조를 사용하여 냉각시키고, TMSOTf(9.20 μL, 0.05 μmol)를 RM에 첨가하고, RM을 -10 도에서 5 분 동안 교반시키고, 1 시간에 걸쳐서 5 도로 서서히 가온하였다. TLC 분석(30% EA/CHx)은 반응이 완료되고, 수용체 SM이 부재하고 약간의 극성 스폿이 존재함을 나타냈다. RM을 NaHCO3 용액(2 mL)으로 10 도에서 켄칭시키고, 층들을 분리하고, 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 증발시켰다. EA/CHx를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 생성물을 함유하는 분획을 얻고, 진공 하에 증발시켜 요망되는 생성물(890 mg, 89%)을 얻었다. MALDI-TOF C235H220NaO57Si에 대한 계산치 [M+Na]+ 4004.3983, 실측치 4007.795.
화합물 163*
Figure pct00433
화합물 162*를 일반적인 원안 B에 따라 TDS 제거 반응에 가하였다:
생성물 163*을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(617 mg, 97%).
MALDI-TOF C227H202NaO57 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 3862.2806, 실측치 3864.889.
화합물 164*
Figure pct00434
화합물 163*을 일반적인 원안 B에 따라 2,2,2-트리플루오로-N-페닐-아세트이미도일의 존재 하에 이미데이트 164*로 전환시켰다.
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(625 mg, 정량적).
MALDI-TOF C235H206F3NNaO57 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 4033.3101, 실측치 4037.043.
화합물 165*
Figure pct00435
화합물 165*을 일반적인 원안 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 5-아지도펜타놀 및 화합물 164*로부터 얻었다:
생성물을 백색 고무질 고형물로서 얻었다(310 mg, 79%).
MALDI-TOF C232H212N3O57 + 에 대한 계산치 [M+H]+ 3951.3783, 실측치 3954.175.
화합물 165L1-L10 *
화합물 165L1-L10*을 일반적인 원안 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 화합물 164* 및 상응하는 알코올로부터 제조하였다.
L1:
Figure pct00436
백색 고형물 층, 16 mg, 64%
MALDI-TOF C239H226NaO58 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 4046.4633, 실측치 4046.458.
Figure pct00437
백색 고형물 층, 23.4mg, 95%
MALDI-TOF C235H218N3O60 +에 대한 계산치 [M+H]+ 4041.4100, 실측치 4041.378.
Figure pct00438
백색 고형물 층, 23.7 mg, 96%
MALDI-TOF C234H214NaO59 + 에 대한 계산치 [M+Na]+ 3990.3643, 실측치 3990.379.
Figure pct00439
백색 고형물 층, 23.9 mg, 98%
MALDI-TOF C233H212NaO59 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 3976.3486, 실측치 3979.155.
Figure pct00440
백색 고형물 층, 22 mg, 85%
MALDI-TOF C241H229N3NaO63에 대한 계산치 [M+Na]+ 4195.4705, 실측치 4195.435.
Figure pct00441
백색 고형물 층, 24mg, 99%.
MALDI-TOF C232H212NaO58 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 3948.3537, 실측치 3950.639.
Figure pct00442
백색 고형물 층, 16.5 mg, 67%
MALDI-TOF C231H209N3NaO58 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 3975.3395, 실측치 3977.916.
Figure pct00443
백색 고형물 층, 21.4mg, 86%
MALDI-TOF C237H221N3NaO57 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 4043.4385, 실측치 4043.431
Figure pct00444
백색 고형물 층, 20.3 mg, 83%
MALDI-TOF 고형물 층 C232H210NaO57+ 에 대한 계산치 [M+Na]+ 3930.3432, 실측치 3933.349.
L10:
Figure pct00445
백색 고형물 층, 24mg, 98%
MALDI-TOF C231H209ClNaO58 +에 대한 계산치 [M+Na]+ 3968.2991, 실측치 3969.032.
화합물 166*
Figure pct00446
화합물 165*을 원안 A에 따라서 메탄올 분해에 가하였다:
생성물을 백색 고무질 고혈물로서 얻었다(43 mg, 99%).
MALDI-TOF C120H147KN3O41 + 에 대한 계산치 [M+K]+ 2324.9147, 실측치 2327.888.
화합물 167*
Figure pct00447
화합물 166*을 일반적인 원안 A에 따라 수소화 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(8 mg, 64%).
1H NMR (400 MHz, 산화중수소) δ 5.06 (s, 3H), 4.93 (s, 3H), 4.90 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.32 - 4.22 (m, 3H), 4.15 - 4.06 (m, 4H), 4.04 - 3.42 (m, 43H), 2.91 - 2.78 (m, 2H), 1.52 (dp, J = 13.9, 7.2, 6.6 Hz, 4H), 1.29 (p, J = 7.7, 7.1 Hz, 2H).
HRMS(ESI+) C53H94NO41 + 에 대한 계산치 [M+H]+ 1400.5301, 실측치 1400.5381.
화합물 168*
Figure pct00448
화합물 165*를 일반적인 원안 A에 따라 Nap-탈보호 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(153 mg, 88%).
MALDI-TOF C221H204N3O57 +에 대한 계산치 [M+H]+ 3811.3157, 실측치 3812.015.
화합물 169*
Figure pct00449
화합물 169*를 일반적인 원안 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 화합물 168* 및 화합물 56*으로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(43 mg, 70%).
MALDI-TOF C340H307KN3O85 +에 대한 계산치 [M+K]+ 5829.9430, 실측치 5834.474.
화합물 170*
Figure pct00450
화합물 170*을 일반적인 원안 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 화합물 168* 및 화합물 164*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(105 mg, 58%).
MALDI-TOF C448H403KN3O113 + 에 대한 계산치 [M+K]+ 7670.5518, 실측치 7670.338.
화합물 171*
Figure pct00451
화합물 170*을 일반적인 원안 B에 따라 메탄올 분해에 가하였다:
생성물을 백색 고무질 고형물로서 얻었다(29 mg, 79%).
MALDI-TOF C224H276N3O81 + 에 대한 계산치 [M+H]+ 4303.7570, 실측치 4305.070.
화합물 172*
Figure pct00452
화합물 171*을 일반적인 원안 A에 따라 수소화 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(4.8 mg, 77%).
1H NMR (400 MHz, 산화중수소) δ 5.27 - 5.17 (m, 7H), 5.04 (d, J = 19.4 Hz, 9H), 4.43 - 4.38 (m, 7H), 4.30 - 4.00 (m, 31H), 4.00 - 3.55 (m, 60H), 2.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.66 (dp, J = 13.4, 7.3, 6.6 Hz, 4H), 1.50 - 1.36 (m, 2H).
MALDI-TOF C101H174NNaO812 +에 대한 계산치 [M+Na+H]2+ 1359.4827, 실측치 1359.4820.
화합물 173*
Figure pct00453
화합물 170*을 일반적인 원안 A에 따라 Nap-탈보호 반응에 가하였다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(77 mg, 78%).
MALDI-TOF C437H395N3O113 +에 대한 계산치 [M+H]+ 7492.5333, 실측치 7496.204.
화합물 174*
Figure pct00454
화합물 174*를 일반적인 원안 B에 따라 글리코실화 반응에 의해서 화합물 173* 및 화합물 164*로부터 얻었다:
생성물을 백색의 성긴 고형물로서 얻었다(39 mg, 57%). MALDI C664H595KN3O169 + 에 대한 계산치 [M+K]+ 11351.7694, 실측치 11355.171.
화합물 175*
Figure pct00455
화합물 174*를 일반적인 원안 B에 따라 메탄올 분해에 가하였다.
화합물 176*
Figure pct00456
화합물 175*를 일반적인 원안 A에 따라 수소화 반응에 가하였다.
B 글리코컨주게이트의 제조 및 특성화
KPC 합성 항원 52*, 61*, 66*, 69*, 75*, 81*, 88*, 91*, 99*, 120*, 123*, 149* 및 158*을 아래 기재된 절차에 따라서 면역화 실험을 위한 캐리어 단백질 CRM197 (XX-CRM197) 및 ELISA(참조 실시예 C)를 위한 코팅 항원으로서의 소 혈청 알부민(BSA; (XX-BSA)에 컨주게이션시켰다.
일반적인 컨주게이션 원안
단계 1: PNP-에스테르 합성
화합물 52*, 61*, 66*, 69*, 75*, 81*, 88*, 91*, 99*, 120*, 123*, 149* 또는 158*(1 eq)를 실온에서 8 mL 바이알 내의 DMSO 또는 DMSO-피리딘 또는 DMSO-H2O에 용해시켰다. 활성화된 비스-(4-니트로페닐) 아디페이트(20 eq)를 그것에 첨가하고, 5분 동안 교반시켰다. 트리에틸아민(50 eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3-5 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 액체 질소를 사용하여 동결시키고, 이어서, 18 시간 동안 건조한 상태로 동결 건조시켜 담황색 미정제 생성물을 과량의 시약과 함께 얻었다. 미정제 생성물을 충분한 CHCl3에 이어서 DCM으로 완전히 세척하여 과량의 시약을 제거하였다. 고형물 파라-니트로페닐(PNP) 에스테르를 건조시키고, 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: 단백질에 대한 컨주게이션
컨주게이션 절차: NaPi 완충액 중의 50 μL의 0.15 M NaCl 중의 52*, 61*, 66*, 69*, 75*, 81*, 88*, 91*, 99*, 120*, 123*, 149* 또는 158*의 PNP 에스테르를 완충액(~150 μL) 중의 CRM197 또는 BSA을 함유하는 반응 바이알에 적가하였다. 바이알을 50 μL의 완충 용액으로 최종적으로 세정하고, 반응 바이알에 완전히 전달하였다. 따라서, 바이알 내의 반응물의 용적이 ~200 μL가 되게 하였다. 반응 혼합물은 색상이 황색이 되었다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반시켰다. 컨주게이트 용액을 Amicon® Ultra-0.5 mL 원심분리 필터에 전달하고, 6 분 동안 2-8℃에서 원심분리하였다. 300 μL의 완충액을 반응 바이알에 첨가하고, 세정하고, 필터에 전달하고, 다시 원심분리하였다. 1X PBS 용액을 사용하여 추가의 세척을 수행하고, 황색이 사라질 때까지 원심분리하였고, 컨주게이트는 투명한 용액이 되었다. 최종 세척 후에, 컨주게이트를 2-8℃의 1X PBS 용액 중에 저장하였다.
컨주게이트를 SDS-PAGE, SEC 크로마토그래피, 및 MALDI 분석에 의해서 분석하였다. 상이한 항원에 대해서 1-15인 것으로 밝혀졌다. 캐리어 상의 당의 부하는 특히 MALDI 분석을 사용하여 컨주게이션된 단백질과 비컨주게이션된 단백질 사이의 질량을 감산함으로써 계산되었다. 단백질 함량을 제조 원안 후의 마이크로 BCA 방법을 사용하여 추정하였다.
SDS-PAGE 분석.
샘플들을 원심분리 튜브에서 혼합하고 서모사이클러(thermocycler) 상에서 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 5분 동안 실온으로 냉각시킨 후에, 약 2,5 μg의 샘플을 10 μL의 마커와 함께 10 % 폴리아크릴아미드 겔의 각각의 웰(well) 상으로 부하시켰다. 샘플을 120V의 일정한 전압에서 1 시간 동안 가동시켰다. 제조자 지시에 따라서 GelCode™ Blue Safe Protein Stain을 사용하여 염색을 수행하였다. 겔을 탈이온수로 밤새 세척하고, 겔 다큐멘테이션 시스템(gel documentation system)을 사용하여 스캐닝하였다(도 5 참조).
글리코컨주게이트의 크기 배제 크로마토그래피(SEC).
면역화 연구를 위해서 사용된 글리코컨주게이트를 SEC에 의해서 분석하여 컨주게이션된 CRM 단백질과 비컨주게이션된 CRM 단백질 사이의 질량 차이를 관찰하였다. 샘플을 50 mM Tris, 20 mM NaCl, pH 7,2로 희석시키고, Tosoh TSK G2000 컬럼 (SWxl, 7.8 mm x 30 cm, 5μm) 및 Tosoh TSKgel® Guard 컬럼 (SWxl 6.0mm x 4cm, 7μm)을 구비한 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서 진행시켰다. 유속은 1 mL/min로 유지되었다(도 6 참조).
글리코컨주게이트 61 * -CRM 197 및 158 * -CRM 197 의 특성화.
면역화 연구를 위해서 사용된 KPC 항원 글리코컨주게이트 61*-CRM197 및 158*-CRM197을 컨주게이션 효율 및 항원 함량에 대해서 분석하였다. 글리코컨주게이트의 MALDI 분석은 매우 우수한 건주게이션 효율을 나타냈다. 컨주게이션된 CRM197 단백질과 비컨주게이션된 CRM197 단백질 사이의 질량 차이는 상이한 글리코컨주게이트에 대해서 3-10 항원/CRM197 분자의 부하를 생성시켰다.
글리코컨주게이트를 또한 10 % SDS-PAGE 및 SEC에 의해서 분석하였고, 이는 비컨주게이션된 CRM197 단백질에 비한 명확한 질량 이동을 나타냈다(도 5 및 도 6).
C 면역화 연구
재료:
· ELISA 플레이트(높은-결합(high-binding), EIA/RIA Plate, 96 웰, 평탄 바닥 및 낮은 증발 뚜껑, 회사: Costar® 3361)
· 검출 항체: 염소 항 토끼 IgG 퍼옥시다제 컨주게이트 (Sigma, #A4914) 및 염소 항-마우스 IgG (H+L) 퍼옥시다제 컨주게이트(Dianova Code: 115-035-068).
· 블로킹 용액(Blocking solution): PBS 중 1 % FCS (v/v).
· 항체 희석액: PBS+1% BSA (w/v).
· 세척 완충액: PBS+0.1% Tween 20 (PBS-T)
· 전개 용액: 1 StepTM Ultra TMB-ELISA developer. (ThermoScientific, Cat #: 34028)
· 정지 용액- 2M 황산 (H2SO4).
· 플레이트 판독기: Anthos HT 2.
· 소프트웨어: 흡광도 측정을 위한 WinRead 2.36 및 데이터 플로팅 및 분석을 위한 GraphPad Prism 7.
· 알럼(Alum): 알루미늄 하이드록사이드 겔 애주번트(Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant)(Alhydrogel® 2%), Brenntag, Batch #:5447 Exp Dt: Feb 2020.
· 불완전 프로인트 애주번트(Incomplete Freund's Adjuvant: IFA). InvivoGen; Cat: vac-ifa-10, Batch#: IFA-39-03; Exp Dt: Sept 2019
· QuantiPro™ BCA 분석 키트 (SIGMA) Product: QPBCA-1KT; Lot#: SLBR7451V; Pcode: 1002296464
· Mini-PROTEAN® TGX™ Gels- 10 %, 10 well (30μL/well) Control Nr:64175708,
· Precision Plus Dual Color, Cat: 1610374; Control Nr: 641798899
· GelCode™ Blue Safe Protein Stain; ThermoScientific; Ref: 1860957; Lot#: TA260266
· 클렙시엘라 뉴모니아 LPS. SIGMA- L4268; Lot#: 116 M 4057 V
방법:
1. 박테리아 균주 및 LPS.
협막이 있고/없는 LPS(O-항원)에서 차이가 있는 클렙시엘라 뉴모니아(KPC) 균주를 사용하여 상응하는 LPS를 분리하고 정제하였다. 정제된 LPS를 효소 결합 면역흡착 분석(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA)에서 코팅 항원으로서 사용하였다. O2a,c LPS를 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다.
표 1. LPS 분리를 위해서 사용된 클렙시엘라 뉴모니아 균주
Figure pct00457
2. 면역화를 위한 백신의 제형
글리코컨주게이트를 마우스 연구를 위한 알루미늄 하이드록사이드(알럼) 애주번트 및 토끼에서의 면역화를 위한 불완전 프로인트 애주번드(IFA)에 제형화하였다.
2.1 알럼 중의 제형.
모든 제형을 무균 조건 하에 제조하였다. 글리코컨주게이트(DS) 및 PBS를 요망되는 알럼(0.25 mg/mL)의 용적을 생성시키는 최종 제형 용적에 상응하는 50 mL Falcon™ 튜브에서 적절히 사전-계산된 비율로 혼합하였다. 이는 DS-PBS 혼합물을 형성시켰다. 동물 당 항원/DS 투여량은 5μg/100 μL/동물로 유지되었다. DS-PBS 혼합물을 혈청학적 피펫(serological pipette)을 사용하여 가볍게 혼합(5X)하였다. DS-PBS 혼합물에, 상응하는 용적의 원액 알럼(10 mg/mL)을 첨가하여 1:40 또는 0.250 mg/mL의 최종 알럼 비율을 생성시켰다. 혼합물을 5 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 가볍게 피펫팅(pipetting)(20X)하여 즉각적으로 혼합하였다. Falcon™ 튜브를 캡핑하고, Parafilm®으로 감싸고, 셰이커(shaker) 상에서 250 rpm에서 2 시간 동안 실온(RT)에서 혼합시켰다. 2 시간의 인큐베이션 시간 후에, 제형을 무균 실험대(clean bench) 하에 두고, 분취하고, 추가의 사용까지 4℃에서 추가로 저장하였다.
2.2 IFA 중의 제형.
InvivoGen으로부터의 불완전 프로인트 애주번트(IFA)를 토끼 면역화 연구를 위한 백신을 제형화하기 위해서 사용하였다. 원안은 제조자에 따랐다. 항원: IFA 농도를 1:1로 유지시켰다. 동물 당 항원 투여량은 5μg/200 μL/동물(100 μL의 항원 +100 μL IFA)로 유지시켰다. 요망되는 계산된 용적(최종 면역화 용적의 50%)의 IFA를 15 mL 무균 Falcon™ 튜브에 취하였다. 계산된 양의 희석된 항원 용액(용적은 PBS에 의해서 최종 면역화 용적의 50%로 조절됨)을 3 mL 무균 주사기에 취하고, 20 G 바늘을 끼웠다. DS 용액을 IFA를 함유하는 Falcon™ 튜브 내로 첨가하고 즉각적으로 15초(5X) 동안 와동(vortex)시켰다. 제형의 색상이 와동시에 담황색에서 우윳빛-백색으로 변하며, 이는 안정한 에멀션의 형성을 나타낸다. 생성되는 백신 제형을 가볍게 와동시키고, 요망되는 투여 용적을 갖는 2mL 무균 튜브에 분취하였다. 면역화 전에, 백신 제형을 함유하는 튜브를 와동시키고, 이어서, 동물에게 주입하였다.
3.3 알럼 제형의 특성화.
알럼에 제형화된 글리코컨주게이트를 특성화하여 최종 알럼 농도 및 제형의 pH를 측정하였다.
3. 면역화 스케줄:
마우스 및 토끼 면역화를 특이적 무-병원체 조건 하에 수행하였고, 사료와 물을 자유롭게 제공하였다. 마우스(n=6) 및 토끼(n=4)를 100 μL/마우스, 및 200 μL/토끼의 주입 용적으로 백신 제형(표 2)으로 피하 면역화시켰다. 마우스에 대한 항원 투여량은 5 μg/동물로 유지시켰다. 마우스 및 토끼를 0일, 14일 및 28일째에 면역화시켰다. 항체 역가의 측정을 위해서, 마우스의 경우에는 -1일, 7일 및 22일째에, 토끼의 경우에는 0일, 7일 및 21일째에 각각 채혈하였다. 35일째에, 동물을 희색시키고, 혈액을 수거하였다.
표 2. 마우스(n=6) 및 토끼(n=4)의 면역화 스케줄 및 항원 투여량 정보. * 마우스 혈청 분석에 대한 모든 값은 PBS/알럼(음성 대조군)으로부터의 값을 사용하여 감산하였다.
Figure pct00458
4. 인-하우스(in-house) 항원 코팅된 플레이트를 사용한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA):
항원에 의한 플레이트의 코팅:
컨주게이트 61*-BSA 및 158*-BSA, 및 LPS #1-#4를 코팅 항원으로서 사용하였다. LPS를 10/20 μg/mL으로 농도로 시소프로판올에 용해시켰다. 각각의 웰을 코팅시키기 위해서 100 μL를 사용하여 1-2 μg/웰의 코팅 농도를 생성시켰다. LPS 용액을 웰에 부하시키고 무균 실험대(sterile bench) 내의 실온에서 밤새 증발시켰다. 컨주게이트 61*-BSA 및 158*-BSA의 경우에, 각각의 컨주게이트를 포스페이트 완충된 염수(PBS) pH 7.4 중에 5 μg/mL의 농도로 용해시켰다. 웰 당 100 μL를 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 0.5 μg/웰의 항원 농도를 얻었다.
세척:
항원의 밤새 흡착 후에, 플레이트를 PBS-T (200 μL/웰)로 1X 세척하였고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집어 놓고 깨끗한 건조 티슈 타올(clean dry tissue towel) 상에서 탭핑(tapping)하여 제거하였다.
블로킹(Blocking):
플레이트를 200 μL의 상업적 블로킹 용액을 사용하여 블로킹하고, RT에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
세척:
블로킹 후에, 플레이트를 PBS-T (200 μL/웰)로 3X 세척하였고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집어 놓고 깨끗한 건조 티슈 타올상에서 탭핑(tapping)하여 제거하였다.
혈청의 희석 및 인큐베이션:
상이한 실험 그룹의 상이한 시점에서 모든 혈청(n=4 토끼 또는 n=6 마우스/그룹)을 항체 희석제(PBS+1% BSA) 중에 이들의 각각의 희석액으로 희석시켰다. 상이한 실험 그룹으로부터의 100 μL의 희석된 혈청 샘플을 이중으로 상응하는 웰에 첨가하고, 250 rpm 설정된 셰이커 상에서 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 항체 희석제(PBS+1 % BSA)가 실험 블랭크를 형성하였다 혈청과 함께 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS-T (200 μL/웰)로 4X 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집어 놓고 깨끗한 건조 티슈 타올상에서 탭핑(tapping)하여 제거하였다.
인큐베이션(검출 항체):
상응하는 검출 항체, 항-토끼 또는 항-마우스 IgG HRP 컨주게이트를 항체 희석제(PBS+1% BSA) 중에 1:10,000으로 희석시키고, 100 μL/웰을 첨가하고, RT에서 1 시간 동안 셰이커 상에서 250 rpm에서 인큐베이션시켰다. 검출 항체와 함께 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 PBS-T (200 μL/웰)로 5X 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집어 놓고 깨끗한 건조 티슈 타올상에서 탭핑하여 제거하였다.
기질 첨가:
각각의 웰에, 100 μL의 사용 준비된 TMB (3,3,',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질(4℃로부터 실온으로 표준화됨)을 첨가하고, 15 분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 청색의 효소 반응에 50 μL/웰의 2M H2SO4 용액을 첨가함으로써 중지되어 황색 용액을 생성시켰다. 황색 용액의 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
결과:
흡광도 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프를 플롯팅함으로써 분석하였다.
결과.
61*-CRM197, 158*-CRM197, 167*-CRM197 또는 172*-CRM197 면역화된 마우스로부터의 혈청은 상응하는 항원을 인식한다(도 7 참조). 혈청은 또한 상응하는 클렙시엘라 뉴모니아 LPS와 가교-반응한다(도 8a 및 8b 참조). 61*-CRM197 면역화된 토끼로부터의 혈청은 구조적으로 관련된 클렙시엘라 뉴모니아 LPS O1, O2, O2a,c, O2a 및 갈락탄-III을 인식한다(도 9 참조). 61*-CRM197/158*-CRM197 면역화된 토끼로부터의 혈청은 각각 관련된 BSA 컨주게이트 61*-BSA 및 158*-BSA 내의 상응하는 O-항원을 인식한다(도 10 참조). 158*-CRM197 면역화된 토끼로부터의 혈청은 상응하는 클렙시엘라 뉴모니아 LPS를 선택적으로 인식한다(도 11 참조).
본원에서 제공된 데이터는 본 발명의 컨주게이트에 의한 면역화 후에, 본 발명의 올리고사카라이드 뿐만 아니라 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac 및 카르바파넴-내성 ST258의 천연 O-폴리사카라이드에 대한 기능성 항체가 토끼 및 마우스에서 유발되었음을 입증하고 있다. 항체는 클렙시엘라 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O2ac 및 카르바파넴-내성 ST258의 천연 O-폴리사카라이드(LPS)와 가교-반응하여, 클렙시엘라 뉴모니아 박테리아에 결합하고 클렙시엘라 뉴모니아 감염증에 대한 방어를 부여하는 이들 항체의 잠재성을 나타낸다.
ELISA 데이터는 추가로 본 발명의 컨주게이트가 면역원성이고 높은 항체 역가를 유도함을 입증하고 있다. 따라서, ELISA 분석은 본 발명의 화학식(I)의 사카라이드가 토끼 및 마우스에서 면역원성이고 가교-반응성 항체를 생성시킴을 나타내고 있다.

Claims (15)

  1. 화학식(I)의 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00459

    상기 식에서,
    U1은
    Figure pct00460
    를 나타내고;
    U2는
    Figure pct00461
    를 나타내고;
    U3은
    Figure pct00462
    를 나타내고;
    U4는
    Figure pct00463
    를 나타내고;
    U5는 공유결합 또는
    Figure pct00464
    를 나타내고;
    U6은
    Figure pct00465
    를 나타내고;
    R1, R1', R* 및 R*'는 서로 독립적으로 -H 또는 U6을 나타내고, 여기에서, R1 및 R*는 동시에 -U6일 수 없고, R1' 및 R*'는 동시에 -U6일 수 없고,
    L은 연결기를 나타내고;
    E는 -NH2, -N3, -CN, -O-NH2, -CH=CH2, -C≡CH, -Br, -Cl, -I, -CO2R', -CO-(3-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CO-(디벤조사이클로옥틴-설포-N-하이드록시석신이미딜), -CONH-NH2, -OH, -SH, 또는 -SAc를 나타내고;
    R'는 -H, -Me, -Et,
    Figure pct00466
    를 나타내고;
    n은 1 내지 20의 정수이고;
    m은 0 내지 20의 정수이고;
    k는 0 내지 10으로부터 선택된 정수이고;
    x 및 y는 서로 독립적으로 0 또는 1의 정수이고;
    U1 및 U2가 모노사카라이드이고 n이 1인 경우, m, x, 및 y는 동시에 0이 아니고,
    단, -E가 -NH2이면, L은 -C3H6-이 아니다
  2. 청구항 1에 있어서,
    U1은
    Figure pct00467
    를 나타내고;
    U2는
    Figure pct00468
    를 나타내고;
    U3은
    Figure pct00469
    를 나타내고;
    U5는 공유결합 또는
    Figure pct00470
    을 나타내고;
    m, n, k, x, y, L 및 E는 청구항 1에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는, 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 청구항 1에 있어서,
    U1은
    Figure pct00471
    를 나타내고;
    U2는
    Figure pct00472
    를 나타내고;
    U4은
    Figure pct00473
    를 나타내고;
    U5는 공유결합, 또는
    Figure pct00474
    을 나타내고;
    m이 1 내지 10의 정수이고;
    k가 0이고,
    n, U3, x, y, L 및 E는 청구항 1에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는, 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    -L-은 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 또는 -La-Ld-Le-을 나타내고;
    -La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
    -Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
    -Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
    -Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
    o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이고, 단, L은 -C3H6-가 아닌, 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    잔기 -O-L-E가
    Figure pct00475
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기에서, R'는 -H, -Me, -Et,
    Figure pct00476
    를 나타내고;
    X는 -Br, -Cl, -I, -CO2H, 또는 -SAc를 나타내는, 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  6. 화학식(III)의 컨주게이트:
    Figure pct00477

    상기 식에서,
    i는 2 내지 25; 바람직하게는 2 내지 18로부터 선택된 정수이고;
    -E1-은 공유결합, -NH-, -O-NH-, -O-, -S-, -CO-, -CH=CH-, -CONH-, -CO-NHNH-,
    Figure pct00478
    를 나타내고;
    -T-는
    Figure pct00479
    를 나타내고;
    a는 1 내지 10의 정수를 나타내고;
    b는 1 내지 4의 정수를 나타내고;
    CP는 캐리어 단백질이고;
    U1, U2, U3, U4, U5 L, m, n, k, x, 및 y는 청구항 1에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
  7. 청구항 6에 있어서,
    컨주게이트가 화학식(IV)를 갖는, 컨주게이트:
    Figure pct00480

    상기 식에서,
    i는 2 내지 25, 바람직하게는 2 내지 18로부터 선택된 정수이고;
    -E1-은 공유결합, -NH-, -O-NH-, -S-, -CO-, -CH=CH-, -CONH-, -CO-NHNH-,
    Figure pct00481
    를 나타내고;
    -T-는
    Figure pct00482
    를 나타내고;
    a는 1 내지 10의 정수를 나타내고;
    b는 1 내지 4의 정수를 나타내고;
    U1, U2, U3, U4, U5, L, m, n, k, x, 및 y는 청구항 1에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
  8. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
    컨주게이트가 화학식(V-1) - (V-14) 중 어느 하나를 갖는, 컨주게이트:
    Figure pct00483

    Figure pct00484

    Figure pct00485

    Figure pct00486

    Figure pct00487

    Figure pct00488

    Figure pct00489

    상기 식에서,
    R1 및 R*는 독립적으로 -H, 또는
    Figure pct00490
    를 나타내고;
    여기에서 R1 및 R*는 동시에
    Figure pct00491
    일 수 없고;
    L, E1, T, i, m, k, 및 n은 청구항 6에서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
  9. 청구항 6 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    -L-은 -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, 또는 -La-Ld-Le-을 나타내고;
    -La-는 -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)o-CH2를 나타내고;
    -Lb-는 -O-, -NH-CO-NH-, -NH-CO-CH2-NH-, -NH-CO-를 나타내고;
    -Ld-는 -(CH2)q-, -(CH(OH))q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, 또는 -(CH2-CH2-O)q-CH2-를 나타내고;
    -Le-는 -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- 또는 -(CH2)p1-O-(CH2)p2-를 나타내고;
    o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수인, 컨주게이트.
  10. 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 애주번트 및/또는 부형제와 함께 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 사카라이드 및/또는 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 컨주게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 클렙시엘라 뉴모니아와 연관된 질환의 방지 및/또는 치료에서의 사용을 위한 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 사카라이드, 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 컨주게이트, 또는 청구항 10에 따른 약제학적 조성물로서, 질환이 수막염(meningitis), 요로 감염증(urinary tract infection), 병원내 폐렴(nosocomial pneumonia), 복강내 감염증(intra-abdominal infection), 상처 감염증(wound infection), 혈액의 감염증(infection of blood), 골수염(osteomyelitis), 균혈증(bacteremia), 패혈증(septicemia) 또는 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)인, 사카라이드, 컨주게이트 또는 약제학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    클렙시엘라 뉴모니아가 O1, O2a, O2ac, O2aeh, O2afg, O8, 및 카르바파넴-내성 클렙시엘라 뉴모니아 균주 ST 258을 포함하거나 이로 이루어진 O-혈청형으로부터 선택되는, 사카라이드, 컨주게이트 또는 약제학적 조성물.
  13. 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 항체의 검출을 위한 면역학적 분석에서의 마커로서의 사용을 위한 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 사카라이드 또는 이의 아노머, 수화물, 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  14. 화학식(I)의 사카라이드의 합성 방법으로서,
    A2) R1P는 P4 또는 U5p이고, U5p는
    Figure pct00492
    인 디사카라이드 D6을 제공하는 단계;
    B1') 사카라이드 D6을 사카라이드 D8과 반응시켜 n이 1인 사카라이드 O3b를 얻는 단계로서,
    n은 2 내지 20의 정수인 경우에, 하기 단계 B2') 및 B3'), 즉,
    B2') 사카라이드 D6와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P8을 제거하는 단계;
    B3') 사카라이드 D6를 단계 B2') 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 n이 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O3b를 얻는 단계를 n-1회 반복하는 단계; 임의로,
    E3) 사카라이드 O3b의 보호기 P8을 제거하여 사카라이드 O3c를 얻는 단계, 및
    E4) 사카라이드 O3c를 사카라이드 M3와 반응시켜 사카라이드 O4b를 얻는 단계; 또는
    E5) 사카라이드 O3c를 디사카라이드 D4와 반응시켜 m이 1인 사카라이드 O5a를 얻는 단계로서,
    m이 2 내지 20의 정수인 경우에,
    하기 단계 e5) 및 e6), 즉
    e5) 모노사카라이드 D4와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P3'를 제거하는 단계;
    e6) 사카라이드 D4를 단계 e5) 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 m이 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O5a를 얻는 단계를 m-1회 반복하는 단계; 또는
    E6) 사카라이드 O3c를 디사카라이드 D5와 반응시켜 m이 1인 사카라이드 O5b를 얻는 단계로서,
    m이 1 내지 20의 정수인 경우에,
    다음 단계 e7) 및 e8), 즉,
    e7) 모노사카라이드 D5와 반응시킴으로써 얻은 사카라이드의 보호기 P9'를 제거하는 단계;
    e8) 사카라이드 D5를 단계 e7) 후에 얻은 사카라이드와 반응시켜 m is 2 내지 20의 정수인 사카라이드 O5b를 얻는 단계를 m-1회 반복하는 단계;
    e9) 보호기 PN를 제거하고 -NH2 기를 -NHAc로 전환시켜 사카라이드 O5c를 얻는 단계;
    F2) 사카라이드 O3b, O4b, O5a, 또는 O5c의 모든 보호기를 제거하여 화학식(I-2), (I-3), (I-4), 또는 (I-5)의 상응하는 사카라이드를 얻는 단계를 포함하는, 화학식(I)의 사카라이드의 합성 방법:
    Figure pct00493

    Figure pct00494

    Figure pct00495

    Figure pct00496

    Figure pct00497

    Figure pct00498

    Figure pct00499

    Figure pct00500

    Figure pct00501

    Figure pct00502

    Figure pct00503

    Figure pct00504

    Figure pct00505

    Figure pct00506

    상기 식에서, Ep는 보호 말단기이고; LG4, LG5, LG6 및 LG7은 이탈기이고; PN, P1, P2, P2', P3, P3', P4, P4', P5, P5', P6, P7, P7', P8, P8', P9, P9', P10, P10', P11, P12 , P13, 및 P14는 보호기를 나타내고, L, E, R1, R1p, R*, R*', m, 및 n은 청구항 1 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
  15. 화학식(I)의 사카라이드를 제조하기 위한 중간체 화합물로서, 중간체 화합물이 화학식(O1b), (O1c), (O1d), (O2a), (O2b), (O3a), (O3b), (O3c), (O4a), (O4b), (O5a), (O5b), 및 (O5c) 중 어느 하나를 갖는, 중간체 화합물:
    Figure pct00507

    Figure pct00508

    Figure pct00509

    Figure pct00510

    Figure pct00511

    상기 식에서, LG2는 이탈기를 나타내고; Ep는 보호 말단기이고,
    PN, P2, P2', P3', P4, P4', P5, P5', P7, P7', P8, P8', P9, P9', P10, P10', P11, P12, P13 및 P14는 보호기를 나타내고, L, R1p, m, 및 n은 청구항 14에 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
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KR20240097876A (ko) * 2021-10-29 2024-06-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규한 올리고당, 그 올리고당의 제조 중간체, 및 그들의 제조 방법
WO2023118033A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10131682B2 (en) 2012-11-24 2018-11-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to a cell binding molecules
JP2016533719A (ja) * 2013-10-11 2016-11-04 グリコヴァキシン アーゲー 宿主細胞改変方法
WO2016044773A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 University Of Maryland, Baltimore Broad spectrum conjugate vaccine to prevent klebsiella pneumoniae and pseudomonas aeruginosa infections
ES2835712T3 (es) * 2015-03-27 2021-06-23 Max Planck Gesellschaft Vacuna contra klebsellia pneumoniae resistente a carbapenémicos
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