CN111448205B - 抗肺炎克雷伯菌的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2ac和O8 O‑多糖和耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌ST258 O‑多糖相关的通式(I)的合成糖及其缀合物。所述的合成糖、所述的缀合物和包含所述合成糖或所述缀合物的药物组合物可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌相关的疾病。此外，通式(I)的合成糖可用作检测抗肺炎克雷伯菌的抗体的免疫学测定法中的标记物。

Description

抗肺炎克雷伯菌的疫苗
发明领域
本发明涉及与肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)血清型O1、O2、O2ac和O8O-多糖和耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌ST258 O-多糖有关的通式(I)的合成糖及其缀合物。所述的合成糖、所述的缀合物和包含所述合成糖或所述缀合物的药物组合物可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌相关的疾病。此外，通式(I)的合成糖可用作免疫学测定法中的标记物用于检测抗肺炎克雷伯菌细菌的抗体。
发明背景
肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的、杆状细菌，其主要建群于呼吸道和泌尿道并引起肺炎克雷伯菌感染(KPI)。KPI是医院性感染的主要原因，主要影响免疫功能低下的患者。在过去的十年中，由于出现了对几乎所有可用的微生物剂都耐药的菌株以及它们在全球范围内传播，肺炎克雷伯菌引起的感染正成为医疗保健领域的一个重要挑战。肺炎克雷伯菌引起的感染导致较高的发病率和死亡率。因此，非常需要预防由肺炎克雷伯菌引起的感染，而对危险群体进行疫苗接种是最有成本效益和最有力的方式。
像大多数细菌一样，肺炎克雷伯菌通常会在细菌表面形成由复杂多糖组成的囊，这类囊具有高度的免疫原性且无毒性。与蛋白质相比，碳水化合物在进化上更加稳定，并一直在一系列常用疫苗中被利用。当与载体蛋白共价连接时，寡糖抗原可引起持久的T细胞依赖性保护。肺炎克雷伯菌典型地表达脂多糖(LPS)和荚膜多糖(CPS，K-抗原)，它们贡献该物种的毒力。LPS是一种O-特异性多糖(O-PS)主要的表面抗原构建体，其包含不同数量的寡糖重复单元(RU)、核心寡糖和脂质A。O-PS结构(O-抗原)限定了克雷伯菌株的O-血清型。肺炎克雷伯菌O-抗原的变异性目前限于9种主要的O-血清型：O1、O2、O2ac、O3(包括O3a和O3b)、O4、O5、O7、O8、O12以及这些血清型中的一些亚型，例如血清型O2的亚型O2a、O2ab、O2ae、O2aeh和O2afg。肺炎克雷伯菌也已在血清学上分为多种荚膜(K)类型。因此，具有不同K抗原的各种肺炎克雷伯氏菌菌株属于特定的O抗原血清型。例如，已经鉴定出属于O1血清型的肺炎克雷伯菌的许多K-血清型(Infection and Immunity,1983,p.56-61)。属于O1血清型的肺炎克雷伯菌菌株的最流行K-血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70。
近来，耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)出现并在全球蔓延。由于治疗选择非常有限，因此耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)是一个重大健康担忧。此类CRKP通常具有碳青霉烯酶，其能够裂解大多数β-内酰胺类抗生素。已经证明称为序列类型(ST)258的特定谱系是造成大多数产生KPC的克雷伯菌属感染的原因。还已知CRKP ST258菌株具有不同的荚膜多糖(CPS)。
脂多糖(LPS)和荚膜多糖(CPS)，即肺炎克雷伯菌的两个表面成分主要作为抗克雷伯菌属(Klebsiella)疫苗的候选物进行讨论。CPS已被证明具有高度免疫原性。但是，克雷伯菌属CPS疫苗的严重缺陷在于K型数量众多(超过80种不同抗原)。在克雷伯菌属疫苗中利用LPS抗原时，主要由LPS脂质A引起的不良毒性反应呈现用含LPS的疫苗主动免疫接种的巨大缺陷。与蛋白质相比，碳水化合物在进化上更稳定。当与载体蛋白共价连接时，多糖或寡糖可引起持久的T细胞依赖性保护(Microbiol Rev 1995,591)。有关碳水化合物疫苗当前发展的综述，参见Chem.&Biol.2014,21,38-50。有关自动化碳水化合物合成及其在基于碳水化合物的疫苗开发中的应用的综述，参见Carbohydr.Res.2008,343,1889-1896。
WO 2016/156338 A1公开了用于治疗由肺炎克雷伯菌引起的疾病的合成的耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌糖及其缀合物。后来，同一小组通过聚糖微阵列研究表明，与天然CR-肺炎克雷伯菌CPS交叉反应的单克隆抗体1C8无法识别所制备的六糖的亚结构(Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,13973-13978)。
论文Vaccine 1986，4，15报道了包括K2、K3、K10、K21、K30和K55血清型衍生的荚膜多糖的六价克雷伯菌属(Klebsiella)疫苗。发现所测试的疫苗对致命性实验性克雷伯菌属K2烧伤创面脓毒症具有高度预防作用，由此表明在接种疫苗后引发了该功能性抗体。
由于O抗原的变异性远小于CPS，因此没有核心寡糖和脂质A的肺炎克雷伯菌LPSO-抗原可能是预防性和治疗性二者免疫疗法的潜在靶抗原。
阐明了O-抗原的重复单元，即肺炎克雷伯菌的O-多糖(Journal ofBacteriology,1996,p.5205-5214；The Journal of Biological Chemistry,2002,277(28),pp.25070-25081)(参见图1和图2)。
肺炎克雷伯菌血清型O1、O2a、O2ac的O-多糖(OPS)的共同结构由二糖重复单元：→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→(半乳聚糖I)组成。
肺炎克雷伯菌血清型O1和O8的O-多糖(OPS)的共同结构由二糖重复单元：→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→(半乳聚糖II)组成。
肺炎克雷伯菌血清型O1的O-多糖的重复单元由：[→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n组成。
肺炎克雷伯菌血清型O2a的O-多糖的重复单元由：→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→组成。
肺炎克雷伯菌血清型O2ac的O-多糖的重复单元由：[→5)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→]m-[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]n组成。
肺炎克雷伯菌血清型O2ae和O2aeh的O-多糖的重复单元由如下结构组成：
肺炎克雷伯菌血清型O2afg和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)ST258菌株的O-多糖重复单元由如下结构组成：
肺炎克雷伯菌血清型O8的O-多糖的重复单元由如下结构组成：
本发明的目的是提供一种明确定义的通式(I)的合成糖，其与肺炎克雷伯菌O-多糖有关，并包含保护性免疫原性O-抗原表位即O-抗原表位，其引发抗体，该抗体保护免患肺炎克雷伯菌引起的疾病。所述的糖可与免疫原性载体缀合，得到缀合物及其药物组合物，它们可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌有关的疾病。此外，通式(I)的合成糖可用作免疫测定法中的标记物用于检测抗肺炎克雷伯菌细菌的抗体。
通过独立权利要求的教导解决了上述本发明的目的。从本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例中明显可见本发明的其他有利特征、方面和细节。
本发明的描述
定义
本申请中所用的术语“连接基”包括能够任选地通过结合至少一种互连分子而使糖的还原端单糖与免疫原性载体或固相支持体连接的分子片段。因此，连接基本身或与互连分子一起的功能是在还原端单糖与免疫原性载体或固相支持体之间建立、保持和/或桥接特定的距离。通过在糖与免疫原性载体之间保持一定距离，避免了免疫原性载体的结构(例如，载体蛋白的二级结构)对免疫原性糖表位的屏蔽。另外，连接基通过减少反应性基团的位阻而提供了与糖偶联的更高效率(Methods in Molecular Medicine 2003，87，153-174)。更具体地，连接基的一个末端与还原端单糖的异头中心的环外氧原子连接，而另一个末端通过氮原子与互连分子连接或直接与免疫原性载体或固相支持体连接。
在本发明中可以使用本领域中已知的任何糖缀合物(例如糖-载体蛋白缀合物，抗体-药物缀合物)的连接基。从大量涉及糖载体蛋白缀合物的出版物中，本领域技术人员可以容易地想到用于本申请中公开的糖和缀合物的适合连接基(参见"Antimicrobialglycoconjugate vaccines：an overview of classic and modern approaches forprotein modification"in Chem Soc Rev.2018，Advance Article，DOI：10.1039/C8CS00495A；Acc Chem Res 2017，50，1270-1279)，因为使用的连接基，即其长度和键类型，不会显著影响糖缀合物的免疫原性(参见PLoS ONE 2017，12(12)：e0189100，J.Immun.Meth.1996，191，1-10)。此类适合的连接基是无害的(即无毒性的)和非免疫原性的(即在用缀合物免疫接种时不会导致形成非保护性抗体)并且包括，但不限于可商购的双功能聚乙二醇(Journal of Controlled Release 2013，172，382-389，J.Immun.Meth.1996，191，1-10)、戊二酸衍生物(J.Org.Chem.2005，70(18)、7123-7132)、己二酸衍生物、方酸酯衍生物、炔烃、N-羟基琥珀酰亚胺，例如可商购的MFCO-NHS(单氟取代的环辛炔N-羟基琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚胺(如Acc Chem Res 2017，50，1270-1279中所公开的)或亲含水膦酸烷基酯和磺酰类化合物(如WO2014080251A1中所述)。
本申请中所用的术语“互连分子”是指包含官能团X和官能团Y的双官能分子，其中官能团X能够与连接基L上的末端氨基反应，并且官能团Y能够与存在于免疫原性载体或固相支持物上的官能团反应。图3显示了可商购的互连分子的实例，但不将根据本发明可以使用的互连分子限于本申请中所显示的实例。
本申请中所用的术语“佐剂”是指免疫佐剂，即疫苗组合物中使用的材料，其通过在抗原上与其不相关的情况下增强对疫苗中所含给定抗原的免疫应答而改进或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，传统上公认的佐剂实例包括：
-含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙。铝盐包括氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等，盐采用任意适合的形式(例如凝胶，结晶，无定形等)。优选对这些盐的吸附。也可以将含矿物质的组合物配制成金属盐的颗粒。也可以使用称作氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。本发明可以使用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称作“氢氧化铝”的佐剂典型地为羟基氧化铝，其通常至少部分是结晶。称作“磷酸铝”的佐剂典型地为羟基磷酸铝，通常还含有少量的硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可以通过沉淀获得，且沉淀过程中的反应条件和浓度影响磷酸盐取代盐中羟基的程度。在本发明的制剂中可以使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物；
-皂苷，其为一组异源广泛多种植物物种的树皮、叶、茎、根和甚至花中发现的固醇糖苷和三萜糖苷。来自皂树(Quillaia saponaria)的树皮的皂苷已被广泛作为佐剂研究。皂苷也可以从墨西哥菝葜(Smilax ornata)(洋菝葜)、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponaria oficianalis)(皂根)商购。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。皂苷组合物已使用HPLC和RP-HPLC纯化。已经鉴定出使用这些技术的特定纯化级分，包括QS 7、QS17、QS18、QS2 1、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷制剂还可包含固醇，例如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成被称作免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA&QHC的一种或多种；
-由可生物降解且无毒性的材料形成的微粒(即直径为100nm-150pm，更优选直径为200nm-30pm或直径为500nm-10pm的颗粒)。这类无毒性且可生物降解的材料包括，但不限于聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯；
-CD1d配体，例如α-糖基神经酰胺、包含植物鞘氨醇的糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CRONY-101、3"-磺基-半乳糖基-神经酰胺；7DW8-5(Funakoshi Co.，Ltd.)
-免疫刺激性寡核苷酸，例如包含CpG基元的免疫刺激性寡核苷酸(包含通过磷酸键连接至鸟苷残基的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)，或包含CpI基元的免疫刺激性寡核苷酸(包含与肌苷相连的胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或包含回文序列的寡核苷酸，或包含聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修饰物/类似物，例如硫代磷酸修饰物，并且可以是双链或(RNA除外)单链的；
-包含与含磷酸酯的无环骨架连接的脂质的化合物，例如TLR4拮抗剂E5564；
-油乳剂(例如弗氏佐剂)；
-两性离子多糖(ZPS)，在相邻单糖单元上包含正电荷和负电荷二者；
外膜囊泡(OMV)。
理论上，每种能够在免疫事件的级联中有利于或放大特定情况最终导致更明显的免疫应答的分子或物质都可以被定义为佐剂。通常，通过在疫苗制剂中使用佐剂，人们可以：
-指导和优化适合于疫苗或符合疫苗需要的免疫应答；
-能够进行疫苗粘膜递送，即导致疫苗与粘膜表面，例如颊或胃或肺上皮以及相关的淋巴组织接触的施用；
-促进细胞介导的免疫应答；
-增强较弱免疫原的免疫原性，例如高纯化或重组抗原；
-减少提供保护性免疫所需的抗原量或免疫接种频率；以及
-提高疫苗在免疫应答降低或减弱的个体(例如新生儿、老年人和免疫受损的疫苗接种者)中的效力。
尽管对其作用模式知之甚少，但目前认为佐剂可通过以下机制之一增强免疫应答：
-增加抗原的生物学或免疫学半衰期；
-改善抗原向抗原呈递细胞(APC)的递送以及由APC进行的抗原处理和呈递，例如通过使抗原在APC摄取抗原-佐剂复合物后穿过内体膜进入胞质溶胶；
-模拟来自应激或受损细胞的危险诱导信号，这些信号用于引发免疫应答；
-诱导免疫调节细胞因子的产生；
-使免疫应答偏向免疫系统的特定亚组；以及-阻断抗原攻击的快速扩散。
如果它们不是两性离子，本领域技术人员将糖称作TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和差免疫原。因此，为了生产基于糖的疫苗，将所述的糖与免疫原性载体缀合以得到缀合物，该缀合物与糖相比提供增加的免疫原性。在本发明上下文中，将术语“免疫原性载体”定义为与糖缀合以形成缀合物的结构，与糖本身相比该缀合物提供增加的免疫性。因此，糖与免疫原性载体，优选蛋白质载体的缀合具有刺激对所述糖的免疫应答的作用，而不诱导对所述免疫原性载体的免疫应答。
因此，本发明涉及通式(I)的糖
其中
U1表示
U2表示
U3表示
U4表示
U5表示共价键或
U6表示
R1、R1’、R*和R*’彼此独立地表示-H或U6，其中R1和R*不能同时为-U6，且R1’和R*’不能同时为-U6，
L表示连接基；
E表示-NH2、-N3、-CN、-O-NH2、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-CO2R′、-CO-(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CO-(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CONH-NH2、-OH、-SH或-SAc；
R′表示-H、-Me、-Et,
n为1至20的整数；
m为0至20的整数；
k为选自0至20的整数；
x和y彼此独立地为整数0或1；
且
当U1和U2为单糖且n为1时，m、x和y不同时为0；
或其异头物、水合物或药学上可接受的盐。
连接基L优选包含2-40个碳原子(包括任选的侧链的碳原子)，更优选2-30，更优选2-20，更优选2-14，更优选2-12且仍然更优选2-10个碳原子。
氧原子(即-O-L-NH2的氧)与NH2-基团之间的最短原子链优选由2-14个原子，更优选为2-12个原子，更优选为2-10个原子，更优选2-8个原子组成。如果最短的链(其为在异头中心的氧与NH2-基团之间的最短可能连接)由2-6个原子组成，则它们优选为碳原子。如果最短链由4-8个原子组成，则该链可以包含1或2个选自O、N和S的杂原子。如果最短链由9-14个原子组成，则该链可以包含1、2、3或4个选自O、N和S的杂原子。
还优选连接基-L-或最短的链是完全或部分氟化的。连接基-L-可以包含3-元或4-元或5-元或6-元饱和碳环或5元部分不饱和(而不是芳香族)碳环或4元或5元或6元饱和氧杂环或4元或5元或6元饱和氮杂环或6元芳族碳环。
连接基-L-还可以包含酰胺(-NH-CO-,-CO-NH-)和/或脲(-NH-CO-NH-)残基，且优选仅一个酰胺或脲残基。连接基还可以包含取代基，且优选2个取代基，例如R10和R11；或4个取代基，例如R10、R11、R15和R14，其具有如本申请中所定义的含义，并且优选选自：-F、-Cl、-CH3、-C2H5、-C3H7、-C5H9、-C6H13、-OCH3、-OC2H5、-CH2F、-CHF2、-CF3、-C(O)-NH2、-SCH3、-SC2H5、-NHC(O)CH3、-N(CH3)2和-N(C2H5)2。
在连接基-L-被氟化的情况下，优选超过2个取代基-F。
优选地，连接基-L-选自：-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-CF2-、-(CF2)2-、-(CF2)3-、-(CF2)4-、-(CF2)5-、-(CF2)6-、-(CF2)7-、-(CF2)8-、-(CF2)9-、-(CF2)10-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-(CH2)3-O-CH2-、-CH2-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-CH2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)4-O-CH2-、-CH2-O-(CH2)4-、-La-、-La-Le-、-La-Lb-Le-、-La-Lb-Ld-Lc-Le-、-La-Ld-Le-；
其中
-La-选自：-(CH2)o-、-(CF2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-,-(CH2-CH2-O)o-CH2-,-(CR10R11)o-、
-Lb-和-Lc-彼此独立地选自：-O-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(S)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-NR9-、-NR18-、-SO2-、-NH-CO-CH2-NH-、
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CF2)q-、-(CR12R13)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-、-(CH2-CH2-O)q-CH2-、
-Le-选自：(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-、-(CH2)p1-O-(CH2)p2-、-(CR14R15)p1-、-(CR14R15)p1-O-(CR21R22)p2-、
R9和R18彼此独立地选自：-CH3、-C2H5、-C3H7和-C(O)CH3；
R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R19、R20、R21和R22彼此独立地选自：-H、-F、-Cl、-CH3、-C2H5、-C3H7、-C5H9、-C6H13、-OCH3、-OC2H5、-CH2F、-CHF2、-CF3、-C(O)-NH2、-SCH3、-SC2H5、-NHC(O)CH3、-N(CH3)2和-N(C2H5)2；
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。
更优选，-L-表示-La-、-La-Le-、-La-Lb-Le-或-La-Ld-Le-；
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，条件是如果-E为-NH2，则L不为-C3H6-。
仍然更优选地，-L-E表示-La-E、-La-Le-E、-La-Lb-Le-E或-La-Ld-Le-E；
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
-E表示-NH2、-N3、-O-NH2、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-COOH、-COOCH3、-COOC2H5、-CO2R′、-CO-(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CO-(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CONH-NH2,-OH或-SH；
R′表示
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，条件是-L-E不为-C3H6-NH2。
仍然最优选，式(I)的糖具有残基-O-L-E，其选自由如下各项组成的组：
其中R′表示-H、-Me、-Et,X表示-Br、-Cl、-I、-CO2H或-SAc。
在一个更优选的实施方案中，-O-L-E选自由如下各项组成的组：
/>
其中R′表示-H、-Me、-Et、4-硝基苯基、五氟苯基或-N-羟基琥珀酰亚氨基、-(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)或-(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)；；
X表示-Br、-Cl、-I、-CO2H或-SAc。
特别优选，-O-L-E选自由如下各项组成的组：
本发明的糖的异头物是指基团-O-L-E所结合的在C-1-位上的α/β-异头物。对于碳水化合物化学领域的技术人员而言清楚的是，糖苷键的立体化学由对通式(I)中糖片段U1和U2的异头中心所标示的立体化学定义。
本发明的糖可以是吸湿性的，因此可以构建其各种水合物。优选的，水分子与糖的摩尔比为1-20，更优选1至10，最优选5-10。
本发明的糖可以带有碱性和/或酸性取代基，并且它们可以与有机或无机酸或碱形成盐。
用于这种酸加成盐形成的适合的酸的实例为盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，对氨基水杨酸，苹果酸，富马酸，琥珀酸酸，抗坏血酸，马来酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡糖酸，乳酸，酒石酸，羟基马来酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，对氨基苯甲酸酸，对羟基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亚硝酸，羟基乙磺酸，乙烯磺酸，对甲苯磺酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，樟脑磺酸，瓷器(china)酸，扁桃酸，邻甲基扁桃酸，氢苯磺酸酸，苦味酸，己二酸，d-邻甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(邻、间、对)-甲基苯甲酸，萘胺磺酸和本领域技术人员熟知的其他无机酸或羧酸。通过使游离碱形式与足量的期望的酸接触以常规方式产生盐，制备所述的盐。
合适的无机或有机碱的实例是，例如，NaOH、KOH、NH4OH、氢氧化四烷基铵、赖氨酸或精氨酸等。可以使用本领域中公知的方法以常规方式，例如通过用选自上述组的碱的溶液处理通式(I)的化合物的溶液，制备盐。
令人惊讶地发现，通式(I)的糖含有免疫原性保护性表位，并且能够诱导人和/或动物宿主中针对肺炎克雷伯菌细菌或血清型O1、O2、O2ac、O8和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌肺炎ST258的保护性免疫应答。通式(I)的糖引发与肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2ac、O8O-多糖以及耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ST258 O-多糖交叉反应的抗体，并调理它们由吞噬细胞杀灭。
本发明的糖克服了在纯度和容易生产方面与由细菌来源生产的糖及其缀合物有关的所有问题。尽管它是一种被确立和接受的方法，但是这种方法存在一些缺点。首先，它需要培养大量目的致病性物种以产生天然碳水化合物，接着进行碳水化合物的收获和纯化。根据目的物种的生物安全水平以及培养的容易程度，此步骤可能提供关于将该技术扩展到新型致病性物种的主要障碍。此外，熟知的是从致病细菌的荚膜多糖中分离和纯化确定长度和结构的纯糖是繁琐的且有时不可行的方法。首先，荚膜多糖的生产需要优化生长条件。其次，需要找到维持组成性单糖的结构完整性的解聚条件。最终，需要确定能够分离确定长度和结构的纯糖的纯化条件。除了通常的污染物，例如细胞多糖、核酸和蛋白质外，还必须排除通过解聚方法获得的不需要的糖。因此，从细菌来源生产确定结构和长度的纯糖是一个繁琐的、几乎不可能的过程。
优选的是通式(I)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
U3表示/>
U4表示
U5表示共价键或
U6表示
R1、R1’、R*和R*’彼此独立地表示-H或U6，其中R1和R*不能同时为-U6，且R1’和R*’不能同时为-U6，
L表示连接基；
E表示-NH2、-N3、-CN、-O-NH2、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-CO2R′、-CO-(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CO-(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CONH-NH2、-OH、-SH或-SAc；
R′表示-H、-Me、-Et、
n为1至20的整数；
m为0至20的整数；
k为选自0至10的整数；
x和y彼此独立地为整数0或1；
且
当U2-U1表示时，m不能为0且U5-U4不能为U2-U1；
当U1和U2为单糖且n为1时，m、x和y不同时为0；
或其异头物、水合物或药学上可接受的盐。
优选的是通式(I)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示
m表示选自1至10的整数；
k为0；
n表示选自1至10的整数；且
x、y、L和E具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I)的合成糖，
其中
U1表示/>
U2表示
U3表示
U5表示共价键
m、n、k、x、y、L和E具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I)的合成糖，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键或
m为选自0和1的整数；
k为0，
n、U3、x、y、L和E具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I)的合成糖，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键、
m为选自0和1的整数，
k为0，
n、U3、x、y、L和E具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I)的合成糖，其中
U1表示
U2表示
U4表示/>
U5表示共价键或
m为选自1至10的整数，
k为0，
n、U3、x、y、L和E具有权利要求1中所定义的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键或
L、E、m、n、x和y具有与本申请中所定义相同的含义，
或这些糖的异头物、水合物或药学上可接受的盐。
如上所述，U1和U2为单糖，因此当n为1时，m、x和y不同时为0；
优选的是通式(I-A)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
m为0；
L、E、n、x和y具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
m为0；
L、E、n、x和y具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键、
m为选自0和1的整数；
L、E、n、x和y具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，其中
U1表示
U2表示/>
U4表示
U5表示共价键或
m为选自0和1的整数；
L、E、n、x和y具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键或
m为1至10的整数；
L、E、n、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，其中
U1表示/>
U2表示
m、x和y为0；
L、E和n具有与本申请中所定义相同的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，其中
U1表示
U2表示
m、x和y为0；
L、E和n具有与本申请中所定义相同的含义。
优选的是通式(I-A)的合成糖，其中
U1和U4表示
U2和U5表示
m为1至10的整数。
L、E、n、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
如上所述，U1和U2为单糖，因此当n为1时，m、x和y不同时为0；
更优选的是，通式(I-A)的糖，其中n为1至10的整数。
还优选的是通式(I-B)的合成糖，
其中
U1表示
U2表示
n为选自1、2、3、4、5、6、7、8和9的整数，
x和y为1，且
L和E具有本申请中所定义的含义。
因此，式(II-1)-(II-17)中任意一个的合成糖也落入本发明的范围：
其中n、R1、m、L和E具有与上文所定义相同的含义，此时R1为-H，n为2至20的整数，优选地，n为2至12的整数；
/>
/>
/>
/>
其中R1、m、n、k、L和E具有与上文所定义相同的含义，n和m为独立选自1至20，优选1至10的整数，且k为0至20，优选0-10的整数。
优选地，通式(I)、(I-A)、(I-B)和(II-1)-(II-17)中的连接基-L-表示-La-、-La-Le-、-La-Lb-Le-或-La-Ld-Le-；其中
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，条件是如果-E为-NH2，则L不为-C3H6-。
仍然更优选地，通式(I)、(I-A)、(I-B)和(II-1)-(II-17)中的-L-E表示-La-E、-La-Le-E、-La-Lb-Le-E或-La-Ld-Le-E；其中
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
-E表示-NH2、-N3、-O-NH2、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-COOH、-COOCH3、-COOC2H5、-CO2R′、-CO-(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CO-(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、-CONH-NH2、-OH或-SH；
R′表示
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，条件是-L-E不为-C3H6-NH2。
仍然最优选的，式(I)、(I-A)、(I-B)和(II-1)-(II-17)的糖具有残基-O-L-E，其选自由如下各项组成的组：
其中R′表示-H、-Me、-Et、
X表示-Br、-Cl、-I、-CO2H或-SAc；
最优选的，式(I)、(I-A)、(I-B)或(II-1)-(II-17)的糖具有残基-O-L-E，其选自由如下各项组成的组：
其中R′表示-H、-Me、-Et、
X表示-Br、-Cl、-I、-CO2H或-SAc。
在最优选的实施方案中，-L-表示-(CH2)o-，且o为选自4、5和6的整数。因此，尤其优选的合成糖为通式(I)、(I-A)、(I-B)和(II-1)-(II-17)中任意一个的糖，其中-L-表示-(CH2)o-，且o为选自4、5和6的整数。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的糖选自由如下各项组成的组：化合物A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70、P-01-P-70和Q-1-Q-700。
最优选的，根据本发明的糖选自由如下各项组成的组：化合物A-01-A-07、A-11-A17、A-21-A-27、A-31-A-37、A-41-A-47、A-51-A-57、A-61-A-67、A-71-A-77、A-81-A-87、A-91-A-97、A-101-A-107、A-111-A-117、A-121-A-127、A-131-A-137、F-01、F-19、F-27、F-31、F-36、F-54、F-62、F-66、F-71、F-89、F-97、F-101、F-106、F-124、F-132、F-136、F-141、F-159、F-167、F-171、F-176、F-194、F-202、F-206、F-211、F-229、F-237、F-241、F-246、F-264、F-299、F-281、F-272、F-276、F-307、F-311、F-316、F-334、F-342、F-346、F-351、F-414、F-417、F-421、F-426、F-444、F-452、F-456、F-461、F-479、F-487、F-491、F-496、F-514、F-522、F-526、K-01、K-06、K-11、K-26、K-31、K-36、K-51、K-56、K-61、K-76、K-81、K-86、K-101、K-106、K-111、K-126、K-131、K-136、K-151、K-156、K-161、K-176、K-181、K-186、K-201、K-206、K-211、K-226、K-231、K-236、K-251、K-256、K-261、K-276、K-281、K-286、K-301、K-306、K-311、K-326、K-331、K-336、O-01、O-02、O-03、O-06、O-07、O-08、O-11、O-12、O-13、O-16、O-17、O-18、O-21、O-22、O-23、O-26、O-27、O-28、O-31、O-32、O-33、O-36、O-37、O-38、O-41、O-42、O-43、O-46、O-47、O-48、O-51、O-52、O-53、O-56、O-57、O-58、O-61、O-62、O-63、O-66、O-67、O-88、P-01-P-03、P-06-P-08、P-11-P-13、P-16-P-18、P-21-P-23、P-26-P-28、P-31-P-33、P-36-P-38、P-41-P-43、P-46-P-48、P-51-P-53、P-56-P-58、P-61-P-63、P-66-P-68、Q-1、Q-26、Q-101、Q-151、Q-251、Q-301、Q-351、Q-376、Q-451、Q-501、Q-551、Q-601和Q-651。
表1
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表2
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表3
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表4
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表5
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表6
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表7
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表8
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表9
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表10
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表11
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表12
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表13
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表14
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表15
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化学合成本发明的另一方面涉及通式(I)的合成方法，它包括：A1)提供二糖D1
其中LG1为离去基，R1P为P4或U5p；
U5p为B1)使D1与二糖D2反应
得到糖O1a
其中n为1，
当n为2至20的整数时，
然后重复如下步骤B2)和B3)n-1次：
B2)除去通过与糖D1反应得到的糖的保护基P3；
B3)使糖D1与步骤B2)后得到的糖反应，
得到糖O1a
其中n为2至20的整数；
C)除去糖O1a的保护基P6并且引入离去基LG2，得到糖O1b
D1)使糖O1b与反应剂HO-L-Ep偶联，得到糖O1c
或
D2)使糖O1b与糖M1反应
得到糖O2a
任选地，
E1)除去糖(O1c)的保护基P3，得到糖O1d,
使糖O1d与糖M2反应
得到糖O3a
或
E2)除去糖(O2a)的保护基P3，得到糖O2b，
使糖O2b与糖M2反应，
得到糖O4a
/>
并且
F1)除去糖O1c、O2a、O3a或O4a的全部保护基，得到相应的式(I-1)、(I-2)、(I-3)或(I-4)的糖，
/>
其中Ep为被保护的端基，LG1-LG3为离去基，
P1、P2、P3、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13和P14表示保护基，且L、E、R1、R1p具有与本申请中所定义相同的含义。
优选地，R1p为P4。
因此，根据上述合成方法，可以进行如下步骤的组合，得到本发明的合成糖：
步骤：A1)→B1)→C)→D1)→F1)，A1)→B1)→C)→D2)→F1)，A1)→B1)→C)→D1)→E1)→F1)或A1)→B1)→C)→D2)→E2)→F1)。
或者，用于合成通式(I)的糖的方法，它包括：
A2)提供二糖D6
其中R1P为P4或U5p；
U5p为B1′)使糖D6与糖D8反应/>
得到糖O2b
其中n为1；
当n为2至20的整数时，
然后重复如下步骤B2′)和B3′)n-1次B2′)除去通过与糖D6反应得到的糖的保护基P8；B3′)使糖D6与步骤B2′)后得到的糖反应，得到糖O3b
其中n为2至20的整数，
任选地，
E3)除去糖O3b的保护基P8，得到糖O3c，
以及
E4)使糖O3c与糖M3反应
得到糖O4b
或
E5)使糖O3c与二糖D4反应
得到糖O5a
其中m为1，
当m为2至20的整数时，
然后重复如下步骤e5)和e6)m-1次e5)除去通过与单糖D4反应得到的糖的保护基P3′；e6)使糖D4与步骤e5)后得到的糖反应，得到糖O5a
其中m为2至20的整数；
或
E6)使糖O3c与二糖D5反应
其中LG7表示离去基，
得到糖O5b
其中m为1，
当m为1至20的整数时，
然后重复如下步骤e7)和e8)m-1次
e7)除去通过与单糖D5反应得到的糖的保护基P9′；
e8)使糖D5与步骤e7)后得到的糖反应，
得到糖O5b
其中m为2至20的整数；
e9)除去保护基PN并且将得到的-NH2基团转化成-NHAc基团，得到糖O5c
F2)除去糖O3b、O4b、O5a或O5c的全部保护基，得到式(I-5)、(I-6)、(I-7)或(I-8)的相应糖，
/>
其中Ep为被保护的端基；LG4-LG7为离去基；PN、P1、P2、P2′、P3、P3′、P4、P4′、P5、P5′、P6、P7、P7′、P8、P8′、P9、P9′、P10、P10′、P11、P12、P13和P14表示保护基，且L、E、R1、R1p、m和n具有与本申请中所定义相同的含义。
优选地，R1p为P4，且R1为H。
因此，根据上述合成方法，可以进行如下步骤的组合，得到本发明的合成糖：
步骤：A2)→B1′)→E3)→F2),A2)→B1′)→B2′)→B3′)→E3)→F2)，A2)→B1′)→B2′)→B3′)→E3)→E4)→F2)，A2)→B1′)→B2′)→B3′)→E3)→E5)→F2)，A2)→B1′)→B2′)→B3′)→E3)→E5)→F2)。
P1、P2、P2′、P3、P3′、P4、P4′、P5、P5′、P6、P7、P7′、P8、P8′、P9、P9′、P10、P10′、P11、P12、P13和P14表示保护基。本申请中所用的术语“保护基”是指有机合成中常用的基团，优选用于保护羟基和巯基。PN表示用于保护胺基团的保护基。
更优选地，P1、P2′、P3、P3′、P4、P4′、P5、P5′、P6、P7、P7′、P8、P8′、P9、P9′、P10、P10′、P11、P12、P13和P14为适合的羟基保护基，更优选用于羟基的不同适合保护基，其能够随后通过一系列脱保护反应依次被除去。优选的羟基保护基为乙酰基、苯基、苄基、亚异丙基、亚苄基、亚萘基、苯甲酰基、对-甲氧基苄基、对-溴苄基、对-甲氧基亚苄基、对-甲氧基苯基、对-溴亚苄基、对-硝基苯基、烯丙基、三氯乙酰基、(2-硝基苯基)乙酰基、异丙基、对-溴苄基、二甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊酰基、氯乙酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基、甲氧基甲基、叔丁氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙酰丙酰基，且PN表示2,2,2-三氯乙基羰基(Troc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
特别地，保护基P1和P6表示苯基，保护基P3和P3′表示2-萘基甲基，保护基P2、P4、P4′、P5′、P11、P12和P14表示苄基、对-甲氧基苄基，保护基P2′、P5、P7、P7′、P8、P8′、P9、P10、P10′和P13为苯甲酰基，且保护基P6表示丁基二甲基甲硅烷基。任选地，OP4和OP5、OP4′和OP5′形成苯基半缩醛。P9′为苯甲酰基或乙酰丙酰基。PN为2,2,2-三氯乙基羰基(Troc)。
适合于本发明合成的离去基的实例为碳水化合物化学领域技术人员熟知的，并且包括卤化物、硫醚、亚氨酸酯、乙酸酯和磷酸酯。
优选地，离去基LG1、LG2、LG3、LG4、LG5、LG6和LG7选自卤素(Cl、Br、F、I)、-O-C(＝NH)-CCl3、-O-C(＝NPh)-CF3、-OAc、-SRL、-SO-Ph、-O-(CH2)3-CH＝CH2、-O-P(ORL)2、-O-PO(ORL)2、-O-CO-ORL、-O-CO-
其中RL可以为任意的烷基或芳基，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、苯基或甲苯酰基。
优选地，离去基LG1、LG2、LG3、LG4、LG5、LG6和LG7选自由如下各项组成的离去基组：
如所提及的，提供氧碳鎓中间体依赖于适宜的或适合的活化剂的异头位置上安装的离去基活化。本领域技术人员公知，磷酸酯的适合活化剂(即磷酸酯活化剂)和亚氨酸酯的适合活化剂(即亚氨酸酯活化剂)为路易斯酸，例如三氟甲磺酸甲硅烷基酯或三氟甲磺酸银，而硫醚的适合的活化剂即硫醚活化剂包括，但不限于：NIS/TfOH、NIS/TMSOTf、NIS/BF3 .Et2O、NIS/AgOTf、DMTST/Tf2O、IDPC、BSP/Tf2O、Ph2SO/Tf2O。三氟甲磺酸甲硅烷基酯的实例包括，但不限于三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯、三氟甲磺酸三异丙酯。
优选地，LG1、LG2、LG3、LG4、LG5、LG6和LG7为硫醚(参见Carbohydr.Res.2015,13-22)，且甚至更优选的是当LG1、LG2、LG3、LG4、LG5、LG6和LG7选自：时。
Ep表示受保护的端基，E表示-NH2、-N3、-CN、-O-NH2、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-CO2R′、-CONHNH2、-SH或-SAc；且相应的被保护的端基Ep表示-N(PN1)(PN2)、-N3、-CN、-O-N(PN1)(PN2)、-CH＝CH2、-C≡CH、-Br、-Cl、-I、-CO2R′、-CONHN(PN1)(PN2)、-SPs或-SAc；
PN1和PN2为胺的适合保护基，且与胺一起形成被保护的氨基甲酸酯或酰胺。形成氨基甲酸酯的保护基的实例包括叔丁氧基羰基、9-芴基甲基、羰基、烯丙基羰基、三氯乙基羰基和苄氧羰基。形成酰胺的保护基的实例包括乙酰基或三氯乙酰基。优选地，保护基P12表示苄基，且保护基P13表示苄氧羰基。
Ps为巯基的适合保护基，且选自苯基、苄基、对甲氧基苄基、对甲氧基苯基、对硝基苯基和烯丙基。
糖之间的偶联反应可以在糖基化试剂存在下进行。适合的试剂包括，但不限于：AgOTf、BF3·OEt2、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)、三氟甲磺酸(TfOH)、三氟甲磺酸酐(Tf2O,三氟甲磺酸酐)、镧系元素(III)三氟甲磺酸盐、NIS/AgOTf、NIS/TfOH或三氟甲磺酸二甲基(甲硫基)锍(DMTST)。
优选步骤B1)、B1′)、B1″)、B1″′)、B3)、B3′)、B3″)、B3″′)、B5″)、B5″′)、D1)、D2)、E1)、E2)、E4)、E5)、E6)、a4)、e6)、e8)中糖之间的偶联反应通过用NIS/TfOH或TBSOTf活化在非极性溶剂和极性疏质子溶剂混合物中、在-80℃至-60℃的温度下进行。甚至更优选，该反应通过用TBSOTf活化在甲苯和乙醚的混合物中在-70℃下进行。
优选地，步骤a4)中单糖M5与糖M3之间的偶联反应通过用TBSOTf活化在非极性溶剂中在-10℃至+10℃温度下进行。
在步骤F1)-F3)的除去保护基P1、P3、P5-P13包括：
-首先通过在过氧化氢存在下在溶剂混合物中用碱处理裂解遇碱不稳定的保护基。优选地，所述碱为NaOMe或LiOH；且
-通过使化合物在钯催化剂存在下在溶剂混合物中接触氢二次裂解对氢化敏感的保护基。
本发明的另一方面涉及用于制备通式(I)的糖的中间体化合物，其中该中间体化合物具有通式(O1b)、(O1c)、(O1d)、(O2a)、(O2b)、(O3a)、(O3b)、(O3c)、(O4a)、(O4b)、(O5a)、(O5b)和(O5c)中的任意一个：
/>
/>
/>
/>
其中LG2表示离去基；Ep为被保护的端基，
PN、P2、P2′、P3′、P4、P4′、P5、P5′、P7、P7′、P8、P8′、P9、P9′、P10、P10′、P11、P12、P13和P14表示保护基，且L、R1p、m和n具有如上文所定义相同的含义。
在式(O1b)、(O1c)、(O1d)、(O2a)、(O2b)、(O3a)、(O3b)、(O3c)、(O4a)、(O4b)、(O5a)、(O5b)和(O5c)中，优选连接基-L-表示-La-、-La-Le-、-La-Lb-Le-或-La-Ld-Le-；
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，条件是如果-E为-NH2，则L不为-C3H6-。
尤其优选的中间体为式(O1b)、(O1c)、(O1d)、(O2a)、(O2b)、(O3a)、(O3b)、(O3c)、(O4a)、(O4b)、(O5a)、(O5b)和(O5c)的中间体，其中-L-表示-(CH2)o-，且o为选自4、5和6的整数。
P2、P2′、P3′、P4、P4′、P5、P5′、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13和P14为适合的羟基保护基，更优选羟基的不同适合保护基，其能够随后通过一系列脱保护反应依次被除去。优选的羟基保护基为乙酰基、苯基、苄基、亚异丙基、亚苄基、亚萘基、苯甲酰基、对-甲氧基苄基、对-溴苄基、对-甲氧基亚苄基、对-甲氧基苯基、对-溴亚苄基、对-硝基苯基、烯丙基、三氯乙酰基、(2-硝基苯基)乙酰基、异丙基、对-溴苄基、二甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊酰基、氯乙酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基、甲氧基甲基、叔丁氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基和乙酰丙酰基。
PN表示用于保护胺基团的保护基，更优选2,2,2-三氯乙基羰基(Troc)或芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
因此，尤其优选中间体(O1b)、(O1c)、(O1d)、(O2a)、(O2b)、(O3a)、(O3b)、(O3c)、(O4a)、(O4b)、(O5a)、(O5b)和(O5c)：保护基P1和P6表示苯基，保护基P3和P3′表示2-萘基甲基，保护基P2、P4、P4′、P5′、P11、P12和P14表示苄基、对-甲氧基苄基，保护基P2′、P5、P7、P7′、P8、P8′、P9、P10、P10′和P13为苯甲酰基，P9′为苯甲酰基或乙酰丙酰基，且保护基P6表示丁基二甲基甲硅烷基。PN为2,2,2-三氯乙基羰基(Troc)。任选地，OP4和OP5、OP4′和OP5′形成苯基半缩醛。
本发明的另一方面涉及式(I-1)-(I-5)的化合物：
/>
其中m、n、L、E、R1、R*、R1’和R*’具有本申请中所定义的含义。
糖缀合物
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的糖的缀合物。令人惊奇地，经证实所述的缀合物作为针对与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病的免疫接种的疫苗有效。
优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg(半乳聚糖-III)、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
如果它们不是免疫原性的，则本领域技术人员通常将糖称作TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和差免疫原。TI-2抗原为仅由成熟B细胞通过表面暴露的免疫球蛋白受体交叉连接识别的抗原。没有T细胞辅助，则不会生成免疫记忆，从IgM到另外的IgG亚类的同种异型转换以及B细胞亲和成熟都不会发生。此外，已知糖在人体中为差的免疫原，这归因于与人糖脂和糖蛋白的结构同源性。由于其差的免疫原性特性，则糖表现出产生B细胞的抗体产生和形成记忆细胞的能力差，它们为产生有效疫苗必不可少的特征。
因此，为了产生有效的基于糖的疫苗，使通式(I)、(I-1)-(I-5)和(II-1)-(II-17)的糖，优选糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70、P-01-P-70和Q-1-Q-700与免疫原性载体缀合，得到缀合物，与糖相比该缀合物呈现增加的免疫原性。因此，在本申请范围内还涵盖通式(III)的缀合物，
其中
i为选自2至25；优选2-18的整数
-E1-表示共价键、-NH-、-O-NH-、-O-、-S-、-CO-、-CH＝CH-、-CONH-、-CO-NHNH-、
-T-表示
a表示1至10的整数；
b表示1至4的整数；
CP为载体蛋白；且
U1、U2、U3、U4、U5 L、m、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
优选地，E1为共价键、-NH-、-CH＝CH-、-CONH-、
所述缀合物由通式(I)的至少一种合成糖和免疫原性载体，优选载体蛋白组成，所述的至少一种糖(I)与所述的免疫原性载体共价结合。
令人惊讶地发现，用包含共价连接至免疫原性载体优选载体蛋白的通式(I)的糖的缀合物免疫接种导致产生高滴度的对通式(I)的糖的碳水化合物部分具有特异性的抗体。所述抗体与肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2ac、O8 O-多糖以及耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌ST258 O-多糖交叉反应并且呈现调理吞噬和杀菌活性，由此赋予针对肺炎克雷伯菌的防护作用。
优选的，肺炎克雷伯菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg(半乳聚糖-III)、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
与包含通过非选择性裂解肺炎克雷伯菌的荚膜多糖得到的分离的(且非合成的)糖混合物或其缀合物的疫苗相比，包含本发明的至少一种缀合物的疫苗几乎不会产生副作用和/或非保护性免疫应答。此外，本发明的疫苗比包含分离的非选择性裂解的荚膜多糖的混合物的疫苗更易于根据GMP法规制造，并且更易于表征，这使得稳定性和纯度控制以及杂质的种类和数量的检测更加容易。
在本发明上下文中，将术语“免疫原性载体”定义为与糖缀合形成缀合物的结构，与糖本身相比所述的缀合物提供增加的免疫性。因此，通过使通式(I)、(I-1)-(I-5)、(II-1)-(II-17)的糖，优选糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70和O-01-O-70、P-01-P-70和Q-1-Q-700缀合至免疫原性载体得到缀合物(III)，具有刺激针对通式(I)的糖的免疫应答的作用，不会诱导针对所述免疫原性载体的免疫应答。
最优选，通过缀合糖得到缀合物(III)，所述的糖选自由如下各项组成的组：化合物A-01-A-07、A-11-A17、A-21-A-27、A-31-A-37、A-41-A-47、A-51-A-57、A-61-A-67、A-71-A-77、A-81-A-87、A-91-A-97、A-101-A-107、A-111-A-117、A-121-A-127、A-131-A-137、F-01、F-19、F-27、F-31、F-36、F-54、F-62、F-66、F-71、F-89、F-97、F-101、F-106、F-124、F-132、F-136、F-141、F-159、F-167、F-171、F-176、F-194、F-202、F-206、F-211、F-229、F-237、F-241、F-246、F-264、F-299、F-281、F-272、F-276、F-307、F-311、F-316、F-334、F-342、F-346、F-351、F-414、F-417、F-421、F-426、F-444、F-452、F-456、F-461、F-479、F-487、F-491、F-496、F-514、F-522、F-526、K-01、K-06、K-11、K-26、K-31、K-36、K-51、K-56、K-61、K-76、K-81、K-86、K-101、K-106、K-111、K-126、K-131、K-136、K-151、K-156、K-161、K-176、K-181、K-186、K-201、K-206、K-211、K-226、K-231、K-236、K-251、K-256、K-261、K-276、K-281、K-286、K-301、K-306、K-311、K-326、K-331、K-336、O-01、O-02、O-03、O-06、O-07、O-08、O-11、O-12、O-13、O-16、O-17、O-18、O-21、O-22、O-23、O-26、O-27、O-28、O-31、O-32、O-33、O-36、O-37、O-38、O-41、O-42、O-43、O-46、O-47、O-48、O-51、O-52、O-53、O-56、O-57、O-58、O-61、O-62、O-63、O-66、O-67、O-88、P-01-P-03、P-06-P-08、P-11-P-13、P-16-P-18、P-21-P-23、P-26-P-28、P-31-P-33、P-36-P-38、P-41-P-43、P-46-P-48、P-51-P-53、P-56-P-58、P-61-P-63、P-66-P-68、Q-1、Q-26、Q-101、Q-151、Q-251、Q-301、Q-351、Q-376、Q-451、Q-501、Q-551、Q-601和Q-651。包括选自53
优选的免疫原性载体为具有免疫调节特性的载体蛋白或糖鞘脂。对于本领域技术人员而言，载体蛋白(CP)为蛋白质，其选自包含以下各项或由以下各项组成的组：白喉类毒素，突变的白喉类毒素，修饰的白喉类毒素，突变和修饰的白喉类毒素，破伤风类毒素，修饰的破伤风类毒素，突变的破伤风类毒素，外膜蛋白(OMP)，牛血清白蛋白(BSA)，镇眼帽贝血蓝蛋白(KLH)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的重组无毒形式或霍乱类毒素(CT)。本申请中所用的术语“类毒素”是指细菌毒素(通常是外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理被灭活或抑制，而其他特性，典型地为免疫原性得以维持。本申请中所用的突变的类毒素为重组细菌毒素，其已通过修饰野生型氨基酸序列而被改变为毒性较低乃至无毒性。这种突变可以是一个或多个氨基酸的替代。这种突变的类毒素在其表面上存在官能团，该官能团可以与互连分子的官能团Y反应而得到修饰的类毒素。所述官能团是本领域技术人员已知的，并且包括，但不限于赖氨酸残基的伯氨基官能团，其可以在还原剂的存在下与活化的酯、异氰酸酯基或醛反应，得到可以被碳二亚胺活化的谷氨酸或天冬氨酸残基的羧酸酯官能团，或得到半胱氨酸残基的巯基官能团。
活化的酯包括N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)，琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)，琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰酰氨基)丙酸酯(SBAP)，谷氨酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)，己二酸二琥珀酰亚胺酯(DSA)，2-吡啶基二硫醇-四氧杂十四烷-N-羟基琥珀酰亚胺(PEG-4-SPDP)、己二酸双-(4-硝基苯基)酯和琥珀酸双-(4-硝基苯基)酯(参见图3)。优选的活化酯为己二酸二琥珀酰亚胺酯(DSA)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、己二酸双-(4-硝基苯基)酯和琥珀酸双-(4-硝基苯基)酯。
可以将载体蛋白上的半胱氨酸残基转化为相应的脱氢丙氨酸，脱氢丙氨酸然后可以与适合的互连分子进一步反应，得到在其表面上具有互连分子的官能团X的修饰的载体蛋白。
特别优选的是，通式(I)的糖与作为载体蛋白(CP)的无毒性突变白喉毒素CRM197缀合，其提供作为官能团的赖氨酸残基的伯胺官能团。
CRM197如野生型白喉毒素为由通过二硫键连接的两个亚基组成的535个氨基酸(58kD)的单多肽链，其具有谷氨酸替代甘氨酸的单个氨基酸替代。其在许多被批准用于疾病的结合疫苗，例如肺炎球菌联合菌苗(Prevnar)中用作载体蛋白。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，所述载体蛋白在其表面上存在赖氨酸残基的伯氨基官能团，其能够与所述互连分子的官能团Y反应而得到在其表面上具有所述互连分子的所述官能团X的修饰的载体蛋白，其能够与通式(I)化合物的连接基的末端氨基反应。
互连分子的所述官能团X选自包含如下各项的组或由如下各项组成的组：马来酰亚胺；α-碘乙酰基；α-溴乙酰基；N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，醛，亚氨酸酯，羧酸，磺酸烷基酯，磺酰氯，环氧化物，酸酐，碳酸酯。
优选的是通式(IV)的缀合物
其中
i为选自2至25，优选2至18的整数
-E1-表示共价键、-NH-、-O-NH-、-S-、-CO-、-CH＝CH-、-CONH-、-CO-NHNH-、
-T-表示
a表示1至10的整数；
b表示1至4的整数；且
U1、U2、U3、U4、U5、L、m、n、k、x和y具有与本申请中例如通式(I)中所定义相同的含义。
优选的是通式(IV)的缀合物
其中
i为选自2至25，优选2至18的整数；
-E1-表示共价键、-NH-、-O-NH-、-S-、-CO-、-CH＝CH-、-CONH-、-CO-NHNH-、
-T-表示
a表示1至10的整数；
b表示1至4的整数；且
当U2-U1表示时，m不能为0，且U5-U4不能为U2-U1；
U1、U2、U3、U4、U5、L、m、n、k、x和y具有与本申请中例如通式(I)中所定义相同的含义。
检查115-129
优选E1为共价键、-NH-、-CH＝CH-、-CONH-、
优选的是通式(IV)的缀合物
其中
U1表示
U2表示/>
U5表示共价键或
k为0，L、E1、i、m、n、x和y具有与本申请中所定义相同的含义，
或其异头物、水合物或药学上可接受的盐。
还优选的是通式(IV)的缀合物
其中
U1表示
U2表示
m为0；
L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
优选的是通式(IV)的合成糖，其中
U1表示
U2表示/>
U4表示
U5表示共价键或
m为选自0和1的整数；
L、E1、i、n、k、x和y具有本申请中所定义的含义。
优选的是通式(IV)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键、
m为整数0或1，
L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
优选的是通式(IV)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键或
m为1至10的整数，
L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
还优选的是式(V)的缀合物
其中
U1表示
U2表示
U4表示/>
U5表示共价键或
L、E1、i、m、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
还优选的是式(V)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
m为0，L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
还优选的是式(V)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
U4表示
m为0，L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
还优选的是式(V)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
m为0，L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
还优选的是式(V)的缀合物，其中
U1表示
U2表示
U4表示
U5表示共价键或
m为1至10的整数；
L、E1、i、n、k、x和y具有与本申请中所定义相同的含义。
更优选的是式(V-1)-(V-14)中任意一个的缀合物：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
其中
R1和R*独立地表示-H或
其中R1和R*不能同时为
且
L、E1、T、i、m、k和n具有如所述所定义相同的含义，优选n和m为1至10的整数。
更优选的是式(III)、(IV)、(V)和(V-1)-(V-14)中任意一个的缀合物，其中n为1至10的整数。
更优选的是式(III)、(IV)、(V)和(V-1)-(V-14)中任意一个的缀合物，其中i选自4至10。
优选-T-表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。
因此，尤其优选式(IV)、(V)和(V-1)-(V-17)中任意一个的缀合物，其中-T-表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。/>
优选地，连接基-L-表示-La-、-La-Le-、-La-Lb-Le-或-La-Ld-Le-；
-La-表示-(CH2)o-、-(CH2-CH2-O)o-C2H4-或-(CH2-CH2-O)o-CH2；
-Lb-表示-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-CH2-NH-、-NH-CO-；
-Ld-表示-(CH2)q-、-(CH(OH))q-、-(CF2)q-、-(CH2-CH2-O)q-C2H4-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-；
-Le-表示-(CH2)p1-、-(CF2)p1-、-C2H4-(O-CH2-CH2)p1-、-CH2-(O-CH2-CH2)p1-或-(CH2)p1-O-(CH2)p2-；且
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数。
在最优选的实施方案中，E1为共价键、-NH-、-CH＝CH-、-CONH-、
在另一个实施方案中，所述免疫原性载体优选为具有免疫调节特性的糖鞘脂，更优选(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰氨基十八烷-3,4-二醇。本申请中所用的术语具有免疫调节特性的糖鞘脂是指能够刺激免疫系统对靶抗原的应答，但其本身并不赋予如上定义的免疫性的适合糖鞘脂。
本申请中所用的糖鞘脂为包含与鞘脂α-连接的碳水化合物部分的化合物。优选地，碳水化合物部分为六吡喃糖，最优选为α-D-吡喃半乳糖。对于本领域技术人员而言，鞘脂为一类含有通过酰胺键连接至脂肪酸的C18氨基醇的脂质。C18氨基醇优选被羟基单取代、二取代或多取代。特别优选的是，C18氨基醇为植物鞘氨醇。脂肪酸优选为具有16-28且更优选为18-26的碳数的饱和烷基链的一元羧酸。具有免疫调节特性的糖鞘脂包括，但不限于(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇，其可刺激自然杀伤细胞(NK)活性和自然杀伤T(NKT)细胞产生细胞因子，并在体内表现出有效的抗肿瘤活性(Proc.Natl Acad.Sci.USA,1998,95,5690)。
通式I的糖与具有免疫调节特性的糖鞘脂的缀合物具有热稳定的优点。另外，它们能够在小鼠中产生针对通式(I)的糖和CRKP的O-多糖的高滴度的IgG1、IgG2a和IgG3抗体。为了适合缀合，在具有免疫调节特性的糖鞘脂上引入了官能团。所述官能团易于直接与通式(I)的糖的连接基的末端氨基反应，得到通式(I)的糖的缀合物，或与互连分子的官能团Y反应，得到具有免疫调节特性的修饰的糖鞘脂。
优选地，在具有免疫调节特性的糖鞘脂的半乳糖部分的C6上引入所述官能团。因此，具有免疫调节特性的糖鞘脂被官能团官能化，该官能团易于与糖的末端氨基或与互连分子的官能团Y反应。易于与氨基反应的官能团包括但不限于活化的酯，异氰酸酯基，醛，环氧化物，亚氨酸酯，羧酸，磺酸烷基酯和磺酰氯。易于与互连分子的官能团Y反应从而得到提供互连分子的官能团X的具有免疫调节特性的修饰的糖鞘脂的官能团包括，但不限于胺、醇、硫醇、活化酯、异氰酸酯基团、醛、环氧化物、乙烯基、酰亚胺酯、羧酸、磺酸烷基酯、磺酰氯、乙烯基、炔基和叠氮基。
优选地，具有免疫调节特性的糖鞘脂的碳水化合物部分的C6上引入的官能团选自包含或包括如下各项的组：胺，硫醇，醇，羧酸，乙烯基，马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)和2-吡啶基二硫醇。
互连分子的所述官能团X选自包含如下各项的组或由如下各项组成的组：马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS)，醛，羧酸，环氧化物，磺酸烷基酯，磺酰氯，酸酐和碳酸酯。
本申请中所用的术语“互连分子”是指包含官能团X和官能团Y的双官能分子，其中官能团X能够与连接基-L-上的末端氨基反应，并且官能团Y能够与存在于免疫原性载体或固相支持体上的官能团反应。
发现包含通式(I)、(I-A)、(I-B)、(I-1)-(I-5)、(II-1)-(II-17)中任意一个的至少一种糖，优选糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350,K-01-K-350,M-01-M-70,N-01-N-70、O-01-O-70、P-01-P-70和Q-1-Q-700的任意一种的缀合物，特别是通式(III)、(IV)、(V)和(V-1)-(V-14)中任意一个的缀合物在人和/或动物宿主中引发保护性免疫应答，因此可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病。因此，包含与免疫原性载体缀合的通式(I)的糖的缀合物可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病。与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病包括肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿道感染、医院性肺炎、腹腔内感染、伤口感染、血液感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎。
优选的，肺炎克雷伯菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg(半乳聚糖-III)、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac以及CRKP菌株ST 258。
药物组合物
本发明的另一方面涉及药物组合物或疫苗，其包含至少一种缀合物，该缀合物包含与免疫原性载体缀合的通式(I)的糖和/或通式(I)的至少一种糖作为活性成分连同至少一种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。所述药物组合物可用于在人和/或动物宿主中引起保护性免疫应答。理想地，该药物组合物适合用于人。
特别地，所述的药物组合物或所述疫苗在人和/或动物宿主中引发保护性免疫应答，因此可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病。因此，所述的药物组合物或所述疫苗可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病。与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病包括肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿路感染、医院性肺炎、腹腔内感染、伤口感染、血液感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎。
优选，所述的药物组合物或所述疫苗可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病，其中肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg(半乳聚糖-III)、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
优选的，所述的药物组合物或疫苗包含作为活性成分的通式(I-1)-(I-5)、(II-1)-(II-17)中任意一个的至少一种糖和/或包含通式(I-1)-(I-5)、(II-1)-(II-17)中任意一个的至少一种糖的缀合物的至少一种。特别地，所述的药物组合物或疫苗包含通式(III)、(IV)、(V)和(V-1)-(V-14)中任意一个的至少一种缀合物，更优选地，所述的药物组合物或疫苗包含糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70和P-01-P-70中的至少一种和/或包含糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70、P-01-P70和Q-1-Q-700中的至少一种的缀合物的至少一种。
更优选，所述的药物组合物或疫苗包含糖A-01-A-07、A-11-A17、A-21-A-27、A-31--A-37、A-41-A-47、A-51-A-57、A-61-A-67、A-71-A-77、A-81-A-87、A-91-A-97、A-101-A-107、A-111-A-117、A-121-A-127、A-131-A-137、F-01、F-19、F-27、F-31、F-36、F-54、F-62、F-66、F-71、F-89、F-97、F-101、F-106、F-124、F-132、F-136、F-141、F-159、F-167、F-171、F-176、F-194、F-202、F-206、F-211、F-229、F-237、F-241、F-246、F-264、F-299、F-281、F-272、F-276、F-307、F-311、F-316、F-334、F-342、F-346、F-351、F-414、F-417、F-421、F-426、F-444、F-452、F-456、F-461、F-479、F-487、F-491、F-496、F-514、F-522、F-526、K-01、K-06、K-11、K-26、K-31、K-36、K-51、K-56、K-61、K-76、K-81、K-86、K-101、K-106、K-111、K-126、K-131、K-136、K-151、K-156、K-161、K-176、K-181、K-186、K-201、K-206、K-211、K-226、K-231、K-236、K-251、K-256、K-261、K-276、K-281、K-286、K-301、K-306、K-311、K-326、K-331、K-336、O-01、O-02、O-03、O-06、O-07、O-08、O-11、O-12、O-13、O-16、O-17、O-18、O-21、O-22、O-23、O-26、O-27、O-28、O-31、O-32、O-33、O-36、O-37、O-38、O-41、O-42、O-43、O-46、O-47、O-48、O-51、O-52、O-53、O-56、O-57、O-58、O-61、O-62、O-63、O-66、O-67、O-88、P-01-P-03、P-06-P-08、P-11-P-13、P-16-P-18、P-21-P-23、P-26-P-28、P-31-P-33、P-36-P-38、P-41-P-43、P-46-P-48、P-51-P-53、P-56-P-58、P-61-P-63、P-66-P-68、Q-1、Q-26、Q-101、Q-151、Q-251、Q-301、Q-351、Q-376、Q-451、Q-501、Q-551、Q-601和Q-651中的至少一种和/或包含糖A-01-A-07、A-11-A17、A-21-A-27、A-31-A-37、A-41-A-47、A-51-A-57、A-61-A-67、A-71-A-77、A-81-A-87、A-91-A-97、A-101-A-107、A-111-A-117、A-121-A-127、A-131-A-137、F-01、F-19、F-27、F-31、F-36、F-54、F-62、F-66、F-71、F-89、F-97、F-101、F-106、F-124、F-132、F-136、F-141、F-159、F-167、F-171、F-176、F-194、F-202、F-206、F-211、F-229、F-237、F-241、F-246、F-264、F-299、F-281、F-272、F-276、F-307、F-311、F-316、F-334、F-342、F-346、F-351、F-414、F-417、F-421、F-426、F-444、F-452、F-456、F-461、F-479、F-487、F-491、F-496、F-514、F-522、F-526、K-01、K-06、K-11、K-26、K-31、K-36、K-51、K-56、K-61、K-76、K-81、K-86、K-101、K-106、K-111、K-126、K-131、K-136、K-151、K-156、K-161、K-176、K-181、K-186、K-201、K-206、K-211、K-226、K-231、K-236、K-251、K-256、K-261、K-276、K-281、K-286、K-301、K-306、K-311、K-326、K-331、K-336、O-01、O-02、O-03、O-06、O-07、O-08、O-11、O-12、O-13、O-16、O-17、O-18、O-21、O-22、O-23、O-26、O-27、O-28、O-31、O-32、O-33、O-36、O-37、O-38、O-41、O-42、O-43、O-46、O-47、O-48、O-51、O-52、O-53、O-56、O-57、O-58、O-61、O-62、O-63、O-66、O-67、O-88、P-01-P-03、P-06-P-08、P-11-P-13、P-16-P-18、P-21-P-23、P-26-P-28、P-31-P-33、P-36-P-38、P-41-P-43、P-46-P-48、P-51-P-53、P-56-P-58、P-61-P-63、P-66-P-68、Q-1、Q-26、Q-101、Q-151、Q-251、Q-301、Q-351、Q-376、Q-451、Q-501、Q-551、Q-601和Q-651中的至少一种的缀合物的至少一种。
寡糖浓度
在本发明的另一方面，所述的药物组合物或疫苗包含肺炎克雷伯菌细菌的荚膜多糖、O-多糖和/或荚膜多糖片段、O-多糖片段和/或其蛋白质缀合物的至少一种，所述的肺炎克雷伯菌细菌选自包含肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2a、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌ST258的组或由肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2a、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌ST258组成的组。
本申请中所用的术语“佐剂”是指免疫佐剂，即疫苗组合物中使用的材料，其通过增强对疫苗中所含给定抗原的免疫应答而不与涉及它的抗原相关而改变或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，传统上公认的佐剂实例包括，但不限于油乳剂(例如弗氏佐剂)、皂苷、铝或钙盐(例如明矾)、非离子嵌段聚合物表面活性剂等。
药物组合物优选为含水形式，特别是在施用时，但它们也可以非水液体形式或干燥形式存在，例如明胶胶囊或冻干物等。
药物组合物可以包括一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选无汞的组合物，并且可以制备无防腐剂的疫苗。
药物组合物可以包括生理盐，例如钠盐，例如用于控制张力。氯化钠(NaCl)为典型的，且可以以1-20mg/ml存在。可能存在的其他盐包括氯化钾，磷酸二氢钾，磷酸二钠脱水物，氯化镁，氯化钙等。
药物组合物可以具有200mOsm/kg和400mOsm/kg之间的同渗质量摩尔浓度。
药物组合物可以包括在净水(例如注射用水)中的化合物(有或没有不溶性金属盐)，但通常包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐典型地包括在5-20mM的范围内。
药物组合物典型地具有5.0-9.5的pH，例如6.0-8.0。
药物组合物优选为无菌且不含谷蛋白。
药物组合物适合于施用给动物(且特别是人)患者，因此包括人和兽医用途。它们可以用于升高患者中的免疫应答的方法中，其包含对患者施用该组合物的步骤。
可以在使受试者暴露于肺炎克雷伯菌之前和/或受试者暴露于肺炎克雷伯菌之后施用本发明的药物组合物。
优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
在本发明的另一方面，本发明涉及包含与免疫原性载体缀合的通式(I)的至少一种糖的至少一种缀合物和/或通式(I)的至少一种糖在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途，所述的药物组合物或所述疫苗可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病，特别地，与肺炎克雷伯菌细菌相关的疾病选自肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿路感染、医院性肺炎、腹腔内感染、伤口感染、血液感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎或由它们组成。
优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由它们组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST258。
优选，本发明涉及式(I-1)-(I-7)、(II-1)-(II-17)中任意一个的至少一种糖和/或包含式(I-1)-(I-7)、(II-1)-(II-17)中任意一个的至少一种糖的缀合物的至少一种在制备药物组合物或疫苗中的用途。
更优选，本发明涉及糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70、P-01-P-70和Q-1-Q-700中的至少一种和/或包含糖A-01-A-140、B-01-B-140、C-01-C-70、D-01-D-70、E-01-E-70、F-01-F-530、G-01-G-350、H-01-H-350、J-01-J-350、K-01-K-350、M-01-M-70、N-01-N-70、O-01-O-70和P-01-P-70和Q-1-Q-700中至少一种的缀合物的至少一种在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途。
特别地，本发明涉及通式(III)、(IV)、(V)和(V-1)-(V-14)中任意一个的至少一种缀合物在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途。
可以制备单位剂量形式的药物组合物。优选地，本发明缀合物的剂量为0.1至10μg，优选1至10μg，优选0.2至9μg，更优选0.5至9μg，优选1至6μg，且最优选1至5μg。在一些实施方案中，单位剂量可以具有0.1至1.0mL，例如约0.5mL的体积。
本发明还提供递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴剂等)，其包含本发明的药物组合物，例如包含单位剂量。该装置可以用于将所述组合物施用于脊椎动物受试者。
本发明还提供无菌容器(例如小瓶)，其包含本发明的药物组合物，例如包含单位剂量。
本发明还提供单位剂量的本发明药物组合物。
本发明还提供包含本发明药物组合物的气密容器。适合的容器包括，例如小瓶。
本发明的药物组合物可以以各种形式制备。例如，可以将组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式(例如冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备用于局部施用的组合物，例如软膏剂、霜剂或粉末剂。可以制备口服施用的组合物，例如为片剂或胶囊剂，喷雾剂或糖浆剂(任选矫味)。可以制备用于肺部施用的组合物，例如，通过吸入器，采用细粉或喷雾剂。可以将组合物制备成栓剂。可以将组合物制备成用于鼻、耳或眼部施用，例如作为喷雾剂或滴剂。肌内施用的注射剂是典型的。
所述药物组合物可以包含有效量的佐剂，即当以单剂量或一系列的组成部分被施用于受试者时有效增强针对共同施用的肺炎克雷伯菌抗原的免疫应答的量。
优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
这种用量可以根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学类别(例如非人类灵长类，灵长类等)、个体免疫系统合成抗体能力、期望的保护程度、疫苗的配方、主治医生对医疗状况的评估以及其他相关因素的不同而变化。该用量可以落入可以通过常规试验确定相对宽的范围。
用于配制和施用本发明疫苗的技术可以在"Remington's PharmaceuticalSciences"Mack Publishing Co.,Easton PA中找到。
根据本发明的一种缀合物或通式(I)的一种糖的治疗有效剂量是指导致对疾病的至少部分免疫接种的化合物的量。这类化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学、药理学和和毒理学方法确定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指标。组合物的实际施用量将取决于所治疗的受试者、受试者的体重、患病的严重程度、施用方式和开据处方的临床医师的判断。
本发明的另一方面涉及在人和/或动物宿主中诱导针对肺炎克雷伯菌的免疫应答的方法，该方法包括对所述人和/或动物宿主施用通式(I)的糖和/或其盐和/或其缀合物或其药物组合物。根据本发明的治疗或预防人和/或动物宿主中由肺炎克雷伯菌引起的疾病的方法包含对所述人和/或动物宿主施用通式(I)的至少一种糖和/或其盐和/或其缀合物或其药物组合物。优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优，选肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
免疫学测定法
本发明的另一方面涉及通式(I)的糖，其用作免疫学测定法中的标记物用于检测抗在其O-多糖或荚膜多糖中包含如下糖片段之一的细菌的抗体：
优选的，通式(I)的糖可用作检测抗肺炎克雷伯菌的抗体的免疫学测定法中的标记物。例如，这类测定包含微阵列ELISA，其用于检测抗肺炎克雷伯菌的抗体。
本发明的糖可易于缀合至固相支持体，以便提供用于检测抗肺炎克雷伯菌的抗体的免疫学测定法。
优选的，肺炎克雷伯菌细菌选自O-血清型和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CRKP)，所述的O-血清型包含O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型或由O1、O2、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8、O12及其亚型组成。优选，O-血清型O1、O2a、O2ac、O2ae、O2aeh、O2afg、O8和CRKP菌株ST 258，更优选O1、O2a、O2ab、O2ac、O2afg、O8、CRKP菌株ST 258。仍然更优选，肺炎克雷伯菌菌株血清型为O1：K1、O1：K2、O1：K7、O1：K8、O1：K10、O1：K12、O1：K16、O1：K19、O1：K21、O1：K22、O1：K27、O1：K34、O1：K42、O1：K45、O1：K55、O1：K57、O1：K62、O1：K65、O1：K66、O1：K69和O1：K70、O2a、O2ac和CRKP菌株ST 258。
所述固相支持体在其表面上存在易于与通式(I)的糖的氨基或与互连分子的官能团Y反应以提供改性的固相支持体的官能团，从而在其表面上呈现互连分子的官能团X，其可以进一步与通式(I)的糖的氨基反应。在本发明的一个实施方案中，固相支持体为微阵列载玻片，在其表面上存在易于与互连分子的官能团Y反应的官能团，以提供修饰的微阵列载玻片，使得在其表面上存在互连分子的官能团X。这样的微阵列载玻片的实例包括，但不限于环氧化物涂层包被的载玻片或/>GAPSTM II包被的载玻片。
在一个优选的实施方案中，固相支持体为微阵列载玻片，其表面上呈现易于与通式(I)的糖的氨基且更优选N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的酯反应的官能团。这类微阵列载玻片例如为NHS载玻片。
附图说明
图1显示肺炎克雷伯菌O-多糖的重复单元的化学结构。
图2显示肺炎克雷伯菌O-多糖的重复单元的化学结构。
图3提供本发明互连分子的官能团X的实例。
图4(A)图示提供本发明寡糖的缀合物；且(B)列出缀合至CRM197载体蛋白的本发明糖的一些实例。
图5显示用于采用10％聚丙烯酰胺凝胶解析的免疫接种实验的糖缀合物(2.5μg/孔)61*-CRM197、167*-CRM197、172*-CRM197和158*-CRM197的SDS-PAGE。
图6提供KPC糖缀合物61*-CRM197、167*-CRM197、172*-CRM197和158*-CRM197的SEC色谱图。
图7显示用61*-CRM197、167*-CRM197或158*-CRM197制剂免疫接种的小鼠(n＝6)的第0天和第35天合并血清的ELISA滴度。针对相应的O-抗原BSA缀合物61*-BSA或158*-BSA测试了所述制剂的血清。血清均用1％BSA-PBS稀释为1：100、1000和10,000。在微量滴定板的每孔中加入稀释的血清(100μL)，并用0.5μg相应的BSA缀合物包被。使用稀释至1：10000的HRP缀合的山羊抗小鼠二抗进行检测，并使用TMB底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用GraphPad prism软件绘制数据图。
图10显示来自用158*-CRM197制剂免疫接种的兔(n＝4)的第0天、第7天、第21天和第35天合并血清的ELISA滴度。针对相应的O-抗原/BSA缀合物158*-BSA测试了血清158*-CRM197制剂。用1％BSA-PBS以1∶1000和10,000稀释血清。将稀释的血清(100μL)每孔加入微量滴定板，用0.5μg相应的O-抗原/BSA缀合物包被。使用稀释至1：10000的HRP缀合的山羊抗兔二抗进行检测，并使用TMB底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用GraphPad prism软件绘制数据图。
图11显示来自用158*-CRM197制剂免疫接种的兔(n＝4)的第0天和第35天合并血清的交叉反应性。针对LPS(O1)、商品-LPS(O2a,c)、LPS(O2a)和LPS(Gal III)测试了血清。用1％BSA-PBS以1∶200稀释血清，并且将100μL稀释的血清每孔加入微量滴定板，用1.0μg相应的LPS包被。使用稀释至1：10000的HRP缀合的山羊抗兔二抗进行检测，并使用TMB底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用GraphPad prism软件绘制数据图。
图12显示本发明寡糖内使用的另外的连接基L’和原料。
实施例
A.化学合成
一般信息：
除非另有说明，否则使用了商业级溶剂。干燥溶剂得自Waters干燥溶剂系统。色谱溶剂在使用前要进行蒸馏。敏感反应在热干燥的玻璃器皿中和氩气气氛下进行。在预先涂有0.25mm厚度硅胶的Kieselgel 60F254玻璃板上进行分析型薄层色谱法(TLC)。通过用香草醛溶液(95％EtOH中的6％(w/v)香草醛和10％(v/v)硫酸)或Hanessian染色剂(5％(w/v)钼酸铵、1％(w/v)硫酸铈(II)和10％(v/v)硫酸的水溶液)染色使斑点显现。硅胶柱色谱法使用Fluka Kieselgel 60(230-400目)进行。
1H、13C和二维NMR光谱使用Varian 400-MR光谱仪在296K下测定。化学位移(d)相对于相应的残留溶剂峰(CDCl3：在1H中d 7.26和在13C NMR中77.16；CD3OD：在1H中d 3.31和在13C NMR中49.15)每百万中的份数报告。以下缩写用于表示峰多重性：s单峰；d双峰；dd双联双峰；t三重峰；dt双联三重峰；q四重峰；m多重峰。偶合常数(J)以赫兹(Hz)表示。使用Schmidt&Haensch UniPol L1000旋光仪在λ＝589nm处进行旋光度(OR)测量，并在括号中以g/100mL表示浓度(c)。高分辨率质谱(HRMS)在Free University Berlin,MassSpectrometry Core Facility使用Agilent 6210 ESI-TOF质谱仪进行。红外(IR)光谱是使用Perkin Elmer 100FTIR光谱仪在申请人的设施中测定。
缩写
AcOH 乙酸
Alloc 烯丙氧羰基
aq. 含水
BH3 硼烷
BBr3 三溴化硼
BnBr 苄基溴
Boc 叔丁氧羰基
br. 宽峰
CAS CAS注册号(CAS＝化学文摘社)
CHCl3 氯仿
cHex 环己烷
d 双峰
dd 双联双峰
DCM 二氯甲烷
DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
DIPEA N,N-二异丙基-乙胺
DME 二甲氧基乙烷
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DPPA 叠氮化磷酸二苯酯
EA 乙酸乙酯
EDC·HCl N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙烷-1,3-二胺盐酸盐
ES 电喷雾
Et2O 乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
h 小时
HCl 盐酸
H2O 水
HOBt.H2O 1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇水合物
K2CO3 碳酸钾
LiAlH4 氢化锂铝
m 多重峰
ACN 乙腈
MeOH 甲醇
MeI 碘甲烷
MgSO4 硫酸镁
min 分钟
MS 质谱法
Na2CO3 碳酸钠
NaCNBH3 氰基硼氢化钠
NaHCO3 碳酸氢钠
NaH 氢化钠
NaOH 氢氧化钠
Na2SO4 硫酸钠
NCS N-氯琥珀酰亚胺
NMR 核磁共振
PBS 磷酸缓冲盐水
Pd/C 披钯碳
q 四重峰
RM 反应混合物
RBF 圆底烧瓶
rt 室温
s 单峰
sat. 饱和
sep 七重峰
SM 原料
t 三重峰
TFA 三氟乙酸
THF 反四氢呋喃
TsOH 对甲苯磺酸
Wt 重量
通用方案
亚氨酸酯合成-通用方案A：在旋转蒸发器中采用甲苯在高度真空下共沸干燥底物(1eq)过夜。将固体在氮气气氛中溶于DCM，向其中加入Cs2CO3(4eq)，搅拌10min。将(E)-2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(3eq)加到纯净RM中，在室温搅拌RM 3h。通过硅藻土过滤RM，用DCM洗涤。真空蒸发合并的滤液，得到粗产物。用三乙胺处理和乙酸乙酯/环己烷作为洗脱剂处理的硅胶柱进行纯化。除去溶剂，真空干燥，得到了化合物，为淡黄白色固体。
亚氨酸酯合成-通用方案B：在旋转蒸发器中采用甲苯在高度真空下共沸干燥底物(1eq)过夜。将固体在氮气气氛中溶于DCM，向其中加入Cs2CO3(4eq)，搅拌10min。将(E)-2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(3eq)加到纯净RM中，在室温搅拌RM 3h。通过硅藻土过滤RM，用DCM洗涤。蒸发合并的滤液，真空干燥，得到了淡黄色产物。
糖基化方法-通用方案A：将受体(1eq)和供体(1eq-1.5eq)溶于RBF，采用无水甲苯真空共沸干燥。将混合物在室温溶于甲苯-二噁烷(3：1)，向其中加入4A分子筛，在室温(rt)在N2气氛中搅拌30min。采用冰水浴将RM冷却至-2℃，向RM中加入TMSOTf(0.2eq)，在5℃搅拌RM 20min。然后将RM缓慢地温热至室温，历时1hr。进行TLC分析以监测反应完成。用饱和NaHCO3使RM猝灭，搅拌10min，用EA萃取。用水、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空蒸发，得到粗产物。采用EA/环己烷，用Biotage，应用硅胶柱进行硅胶柱纯化。蒸发包含产物的级分，真空干燥，得到期望的产物。
糖基化方法-通用方案B：将受体(1eq)和供体(1eq-1.5eq)溶于RBF，采用无水甲苯真空共沸干燥。将混合物在室温溶于DCM，向其中加入4A分子筛，在室温在N2气氛中搅拌30min。采用冰水浴将RM冷却至-2℃，向RM中加入TMSOTf(0.2eq)，在5℃搅拌RM 20min。然后将RM缓慢地温热至室温，历时1hr。进行TLC分析以监测反应完成。用饱和NaHCO3(或用TEA)使RM猝灭，搅拌10min，用DCM萃取。用水、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空蒸发，得到粗产物。采用EA/环己烷，用Biotage，应用硅胶柱进行硅胶柱纯化。蒸发包含产物的级分，真空干燥，得到期望的产物。
Lev基团脱保护-通用方案A：将包含Lev的底物(1eq)在室温溶于吡啶，向其中加入乙酸肼(3eq)，在室温搅拌18h。通过TLC分析监测反应。然后用丙酮(100eq)使RM猝灭，在室温搅拌45min。然后将RM真空蒸发至干。采用Biotage，用硅胶柱与EA-环己烷作为洗脱剂纯化残余物，得到糖活性斑点，蒸发和高度真空干燥时得到期望的化合物，为无色树胶状液体。
Nap基团脱保护-通用方案A：在室温将包含NAP的底物(1eq)溶于DCM-缓冲溶液(1-2)，分批加入DDQ(3-4eq)，历时20min-1h，RM吧变成黑色，然后变成淡红棕色。将RM搅拌2-5h。通过TLC分析监测反应完成。用NaHCO3溶液使RM猝灭，用DCM萃取。用盐水溶液洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到粗产物。用Biotage，应用硅胶柱-EA/Chx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物。
TDS基团脱保护-通用方案A：在室温将底物(1eq)在50mL falcon试管中溶于吡啶，搅拌5min。然后向其中加入HF-Py(15eq)(谨慎：起泡和放热)。将RM在室温搅拌18h。TLC分析显示存在SM且还形成极性斑点。因此，向RM中加入10当量的HF-Py 1次以上，将RM在室温搅拌30h以上，TLC分析显示仍然存在一些SM，还存在主要的极性斑点。用水使RM猝灭，用DCM稀释，充分混合各层，同时在室温搅拌，分离各层。用DCM萃取水层。用NaHCO3洗涤液(谨慎一定程度的泡腾)、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到白色树胶状液体。采用Biotage与硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物。
TDS基团脱保护-通用方案B：在室温将底物(1eq)在50mL falcon试管中溶于吡啶，搅拌5min。然后向其中加入HF-Py(50-150eq)(谨慎：起泡和放热)。将RM在室温搅拌18h。通过TLC分析监测反应。用水使RM猝灭，用DCM稀释，充分混合各层，同时在室温搅拌，分离各层。用DCM萃取水层。用NaHCO3洗涤液(谨慎一定程度的泡腾)、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到白色树胶状液体。采用Biotage与硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物。
甲醇分解-通用方案A：在室温将底物(1eq)溶于THF-MeOH(1：1mL)，向其中加入过量0.5M NaOMe的甲醇溶液，在55℃持续搅拌18h。真空蒸发RM。用EA和水稀释。用AcOH酸化直至中性pH。用EA萃取。用盐水溶液洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物，为淡黄色层状物。
甲醇分解-通用方案B：在室温将底物(1eq)溶于THF-MeOH(1：1mL)，向其中加入过量0.5M NaOMe的甲醇溶液，在55℃持续搅拌3天。真空蒸发RM。用EA和水稀释。用AcOH酸化直至中性pH。用EA萃取。用盐水溶液洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物，为淡黄色层状物。
氢化-通用方案A：将底物(1eq)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物，向其中加入Pd/C(1eq,w/w)在丁醇(0.2mL)中的混悬液，在～10巴H2气氛中氢化18-24h。通过PTFE滤器过滤RM，用甲醇、50％甲醇水溶液洗涤。真空浓缩滤液，得到粗产物。采用C18 sepak柱，应用水-乙腈作为洗脱剂纯化产物。将包含产物的级分冻干24h，得到白色松散固体，为期望的产物。
氢化-通用方案B：将底物(1eq)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物，向其中加入Pd(OH)2(1eq,w/w)在丁醇(0.2mL)中的混悬液，在～10巴H2气氛中氢化18-24h。通过PTFE滤器过滤RM，用甲醇、50％甲醇水溶液洗涤。真空浓缩滤液，得到粗产物。采用C18 sepak柱，应用水-乙腈作为洗脱剂纯化产物。将包含产物的级分冻干24h，得到白色松散固体，为期望的产物。
氢化-通用方案C：将底物(1eq)溶于DCM：IPA：H2O的混合物，向其中加入Pd/C(1eq,w/w)在IPA中的混悬液，在～10巴H2气氛中氢化18-24h。通过PTFE滤器过滤RM，用甲醇、50％甲醇水溶液洗涤。真空浓缩滤液，得到粗产物。采用C18 sepak柱，应用水-乙腈作为洗脱剂纯化产物。将包含产物的级分冻干24h，得到白色松散固体，为期望的产物。
A-1单糖结构单元的制备
化合物1*
根据J.Org.Chem.,2007,72(17)，pp 6513-6520中所述的方法制备了化合物1*。
化合物2*
将化合物1*(40g,80mmol)溶于无水THF/DMF 9：1(390mL)，用冰/水浴冷却至0℃。加入BnBr(20.9g,120mmol)，将该混合物在0℃搅拌5分钟。然后在0℃分5部分加入NaH(6.39g,160mmol)。添加NaH完成后，将该混合物在0℃再搅拌5分钟，然后移除冰浴，将该混合物温热至室温。在室温搅拌过夜。通过缓慢添加甲醇在用冰/水浴冷却下猝灭反应，然后倾倒在EtOAc/盐水上，分离各层，用EtOAc将水层萃取2次。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，高度真空干燥，得到橙色固体。用甲醇洗涤固体，过滤。蒸发溶剂，得到产物为，为白色固体(47.1g,100％)。HRMS(ESI+)C37H34O5SNa+[M+Na]+计算值613.2025,测定值613.2024.
化合物3*
将化合物2*(47.1g,80mmol)溶于无水DCM(500mL)，依次加入乙硫醇(35.4mL,478mmol)和pTSOH(9.1g,47.8mmol)。将该混合物在室温搅拌0.5h。用三乙胺(50mL)猝灭反应，蒸发溶剂，得到粗产物，为淡黄色油状物。通过柱色谱法，使用乙酸乙酯/环己烷纯化粗产物，蒸发溶剂后得到产物(38.18g,95％)。HRMS(ESI+)C30H30O5SNa+[M+Na]+计算值525.1712,测定值525.1708.
化合物4*
将二醇3*(15g,29.8mmol)溶于无水DMF(300mL)，用冰/水浴冷却至0℃。加入tBu2Si(OTf)2(19.72g,44.8mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌30分钟。用Et3N(9mL)中和该混合物，再搅拌5分钟。然后用水稀释该混合物，用乙酸乙酯萃取3次。用盐水洗涤合并的有机级分，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，使粗化合物上用自动化纯化系统与乙酸乙酯/环己烷纯化，得到产物(18.18g,95％)。HRMS(ESI+)计算值C38H46O5SSiNa+[M+Na]+665.2733,测定值665.2682.
化合物5*
根据J.Org.Chem.2006,71,9658中所述的方法制备了化合物5*。
化合物6*
将化合物5*(8.6g,20.65mmol)溶于无水DCM(86mL)，依次加入乙酰丙酸(3.6g,31mmol)、EDC(5.94mmol,31mmol)和DMAP(2.5g,20.65mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h。使该混合物分配在DCM与盐水之间。用DCM将水层萃取2次。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到粗产物。使粗产物上isolute，用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(12.26g,99％)。HRMS(ESI+)计算值C27H30O8SNa+[M+Na]+537.1559,测定值537.1544.
化合物7*
将化合物6*(6.59g,12.81mmol)溶于THF/水1：1(250mL)，加入pTsOH(2.92g,15.37mmol)。将该混合物回流搅拌(～80℃)，通过TLC监测。1.5h后，将该混合物冷却至室温，用饱和NaHCO3水溶液中和。用EtOAc将水层萃取3次。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到无色油状物(5.76g,95％)。HRMS(ESI+)计算值C24H26O8SNa+[M+Na]+497.1246,测定值497.1230.
化合物8*
将二醇7*(4.5g,9.48mmol)溶于无水DCM(45mL)，用冰/水浴冷却至0℃。加入吡啶(4.5g,56.9mmol)和DMAP(0.116g,0.948mmol)，然后滴加BzCl(8g,56.9mmol)。搅拌该溶液，同时使其缓慢温热至室温。搅拌过夜后，用饱和NaHCO3水溶液猝灭反应，用DCM萃取2次。用Na2SO4干燥有机层，过滤，减压浓缩，得到粗产物。使粗产物上isolute，使用自动化纯化系统与二氧化硅纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为白色泡沫体(5.78g,89％)。HRMS(ESI+)计算值C38H34O10SNa+[M+Na]+705.1770,测定值705.1744.
化合物9*
根据Tetrahedron 2015,71,33,5315-5320中所述的方法制备了化合物9*。
化合物10*
根据J.Carb.Chem.2001,20,9,855-865中所述的方法制备了化合物10*。
化合物11*
根据J.Org.Chem.2014,79,10203-10217中所述的方法制备了化合物11*。
化合物12*
根据J.Org.Chem.2014,79,10203-10217中所述的方法制备了化合物12*。
化合物13*
在室温将1-O-烯丙基半乳糖(10g,45.4mmol)、苯甲醛缩二甲醇(10.37g,68.1mmol)和樟脑磺酸(29.5g,127mmol)在乙腈(100mL)中的溶液搅拌30min。30min后，TLC显示原料完全转化成产物。用三乙胺猝灭反应，然后浓缩至得到浓稠糖浆状物。采用硅胶和二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂的自动化纯化(Combiflash)得到产物，为白色固体(12g,86％)。HRMS(ESI+)计算值C16H20O6Na+[M+Na]+331.1158,测定值331.1098.
化合物14*
在室温将在250mL RBF中Bu2SnO(14.53g,58.4mmol)加到二醇13*(12g,38.9mmol)在甲苯423mL中的澄清溶液中。然后将该反应混合物在130℃保持回流6h。6h后，真空除去溶剂，将该反应体系与甲苯共沸(3x10mL)。完全除去溶剂后，真空干燥乙缩醛0.5h。在氩气存在下从真空中取出乙缩醛，溶于DMF(423mL)。向该溶液中加入2-(溴甲基)萘(12.91g,58.4mmol)和TBAI(28.5g,78mmol)，将该反应混合物保持在110℃下搅拌20h。通过TLC(40％EtOAc的正己烷溶液)监测反应。20h后，用乙酸乙酯和水稀释反应混合物。分离水层，用EtOAc(2x30mL)洗涤。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，在旋转蒸发器的35℃浴温下真空浓缩滤液30min，得到粗产物。将粗产物用自动化急骤柱色谱法纯化，使用乙酸乙酯的环己烷溶液(梯度0-100％)作为洗脱剂。在30-35℃浴温下在100mL RBF中从包含不纯产物的试管中真空浓缩溶剂，得到无色油状物。再用冰冷乙酸乙酯洗涤，得到纯产物(14.49g,83％)。
化合物15*
化合物14*(14.30g,31.9mmol)溶于DCM(130mL)，用冰/水浴冷却至0℃。加入吡啶(7.74mL,96mmol)和DMAP(0.390g,3.19mmol)，然后滴加BzCl(10.15mL,96mmol)。搅拌该溶液，同时使其缓慢温热至室温。搅拌过夜后，用饱和NaHCO3水溶液猝灭反应，用DCM萃取2次。用Na2SO4干燥有机层，过滤，减压浓缩，得到粗产物。使粗产物上isolute，使用自动化纯化系统与乙酸乙酯/环己烷纯化。蒸发溶剂，得到产物，为白色泡沫体(10.1g,57％)。
化合物16*
将化合物15*(8.7g,15.74mmol)溶于二氯甲烷(102mL)。将该溶液冷却至0℃，加入三乙基硅烷(17.78mL,110mmol)和2,2,2-三氟乙酸(8.44mL,110mmol)。将该混合物在0℃搅拌10分钟，然后在室温搅拌过夜。用饱和NaHCO3水溶液猝灭反应。用DCM萃取该混合物，用盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到粗产物。使粗产物上isolute，使用自动化纯化系统与乙酸乙酯/环己烷纯化。蒸发溶剂，得到产物，为白色泡沫体(5.8g,66.4％)。HRMS(ESI+)C34H34O7Na+[M+Na]+计算值577.2202,测定值577.2078.
化合物17*
将化合物16*(5.8g,10.46mmol)溶于THF/DMF 9：1(47mL/5mL)，冷却至0℃。加入苄基溴(2.54mL,20.91mmol)，将该混合物在0℃搅拌5分钟。然后在0℃分批加入氢化钠(0.837g,20.91mmol)。完全添加氢化钠后，将该混合物在0℃再搅拌5分钟，温热至室温，历时2h。通过添加饱和氯化铵水溶液在冷却下猝灭反应，然后倾入乙酸乙酯/水。分离各层，用乙酸乙酯萃取水层，用NaHCO3和盐水洗涤合并的有机层。用Na2SO4干燥滤液，过滤，蒸发，高度真空干燥，得到橙色固体。用甲醇洗涤该固体，过滤，干燥，得到产物，为白色固体(5.8g,86％)。HRMS(ESI+)C41H40O7Na+[M+Na]+计算值667.2672,测定值667.2567.
化合物18*
单糖化合物17*(0.995g,1.543mmol)转移至DCM(34mL)和磷酸盐缓冲液pH 7.4(17mL)在50mL RBF中的溶液中，缓慢地加入DDQ(1.576g,6.94mmol)，历时2.5h期限，搅拌6h。通过添加饱和NaHCO3水溶液(40mL)猝灭反应，用DCM萃取。用饱和NaHCO3(50mL)、盐水(100mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，为淡黄色油状物。用采用乙酸乙酯的环己烷溶液的硅胶柱色谱法进行纯化。然后将得到的化合物溶于二氯甲烷，持续真空蒸发，得到无色透明树胶状液体，高度真空干燥，形成松散白色固体(0.55g,71％)。HRMS(ESI+)C30H32O7Na+[M+Na]+计算值527.2046,测定值527.1978.
化合物19*
将化合物3*(10.90g,21.7mmol)溶于DCM(89mL)，冷却至0℃。加入吡啶(5.26mL,65mmol)和DMAP(0.265g,2.2mmol)，然后滴加BzCl(6.90mL,65mmol)。将该溶液温热至室温。搅拌过夜后，用饱和NaHCO3水溶液猝灭反应，用DCM萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩，得到粗产物。使粗产物上isolute，使用自动化纯化系统与乙酸乙酯/环己烷纯化，蒸发溶剂，得到产物，为白色泡沫体(13.85g,90％)。HRMS(ESI+)C44H38O7SNa+[M+Na]+计算值733.2236,测定值733.2134.
化合物20*
将[1,5-环辛二烯)(吡啶)(三环己基膦)-Ir(I)]PF6(0.79g,0.155mmol)溶于四氢呋喃(30mL)，在室温使氮气通过该溶液起泡2分钟，同时红色催化剂溶解。然后用氢气吹扫该溶液2分钟，截止到此时，红色溶液变成无色，将该溶液在氢气气氛中搅拌15min。然后在氮气气氛中将活性催化剂溶液通过注射器加到在四氢呋喃(15mL)中的化合物15*(1g,1.55mmol)，在室温搅拌2h。用饱和NaHCO3水溶液(10mL)使该反应混合物猝灭，用二氯甲烷(3x10mL)萃取。用盐水(10mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到烯丙基异构化化合物。然后将乙烯基底物溶于四氢呋喃：水混合物(2：1,45mL)，在室温加入碘(0.787g,3.10mmol)。将棕色溶液搅拌2h，然后用10％Na2S2O3(10mL)猝灭。用乙酸乙酯(3x15mL)萃取水相，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发。进行急骤柱色谱法(乙酸乙酯的己烷溶液30％)，得到产物，为黄色固体(0.55g,59％)。HRMS(ESI+)C38H36O7Na+[M+Na]+计算值627.2359,测定值627.2267.
化合物21*
将化合物20*(0.55g,0910mmol)溶于二氯甲烷(11mL)。加入Cs2CO3(0.593g,1.82mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(0.566g,2.73mmol)，将该反应混合物在室温搅拌过夜。通过硅藻土垫(2cm)过滤该反应混合物，用DCM(50mL)洗涤，浓缩滤液，得到淡黄色油状物。通过硅胶急骤柱色谱法进行纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到亚氨酸酯，为黄色泡沫体(0.608g,86％)。HRMS(ESI+)C46H40F3NO7Na+[M+Na]+计算值798.2655,测定值798.2555.
化合物22*
将化合物11*(3.65g,6.24mmol)溶于DCM(40mL)，依次加入乙酰丙酸(1.087g,9.36mmol)、EDC(1.795g,9.36mmol)和DMAP(0.763g,9.36mmol)。将该反应混合物在室温搅拌17h。使该混合物分配在DCM与饱和NaHCO3溶液之间。用DCM萃取水层。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到粗产物。使粗产物上isolute，用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(3.82g,90％)。HRMS(ESI+)C38H34O10SNa+705.1765计算值[M+Na]+,测定值705.1763.
化合物23*
将化合物22*(2.8g,4.10mmol)溶于DCM/水3：1(40mL)，加入N-溴琥珀酰亚胺(2.19g,12.30mmol)。将该混合物在室温搅拌45分钟。使该混合物分配在DCM与饱和NaHCO3溶液之间。用DCM萃取水层。用0.1MNa2S2O3洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到粗产物。使粗产物上用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(2.30g,95％)。HRMS(ESI+)C32H30O11Na+计算值613.1680[M+Na]+,测定值613.1678.
化合物24*
将化合物23*(2g,3.39mmol)溶于DCM(20mL)，依次加入碳酸铯(2.207g,6.77mmol)和(E)-2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(2.109g,10.16mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h。用硅藻土过滤该混合物，用DCM洗涤，蒸发滤液，得到产物，为无色油状物(2.5g,97％)。
化合物25*
根据Nakashima,S.；Ando,H.；Imamura,A.；Yuki,N.；Ishida,H.；Kiso,M.Chem.-Eur.J.2011,17,588-597中所述的方法制备了化合物25*。
化合物26*
将化合物24*(2.5g,3.28mmol)和化合物25*(1.46g,2.74mmol)溶于100mL RBF，加入甲苯(40mL)，真空共沸化合物(2次)。将高度真空干燥的物质溶于二氯甲烷(25mL)，加入干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌10min，然后冷却至-10℃。将TMS-OTf(50μL,0.274mmol)加到该反应混合物中，搅拌，同时缓慢地温热至0℃，历时1.5h。通过添加饱和NaHCO3水溶液猝灭反应。分离各层，用DCM萃取水层。用干燥Na2SO4有机层，过滤，蒸发。使粗产物上isolute，采用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(2.51g,83％)。HRMS(ESI+)C54H50Cl3NO16SNa+计算值1128.1808[M+Na]+,测定值1128.1904.
化合物27*
将化合物26*(2.5g,2.26mmol)溶于DCM/水10：1(27.5mL)和N-碘代琥珀酰亚胺(0.508g,2.26mmol)，在0℃加入三氟乙酸(0.173mL,2.26mmol)。将该混合物在0℃搅拌2h，然后使其分配在DCM与饱和NaHCO3水溶液之间。用DCM萃取水层，用0.1M Na2S2O3洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发。使粗产物上isolute，采用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(1.09g,47.4％)。HRMS(ESI+)C48H46Cl3NO17Na+计算值1036.1724[M+Na]+,测定值1036.1828.
化合物28*
将化合物27*(1.05g,1.034mmol)溶于无水DCM(10mL)，依次加入碳酸铯(0.674g,2.068mmol)和(E)-2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(0.644g,3.10mmol)。将该反应混合物在室温搅拌3h。用硅藻土过滤该混合物，用DCM洗涤，蒸发滤液，得到产物，为无色油状物(1.2g,98％)。HRMS(ESI+)C56H50Cl3F3N2O17Na+计算值1207.2019[M+Na]+,测定值1207.2043.
化合物29*
将化合物28*(200mg,0.169mmol)和5-叠氮基戊醇(43.5mg,0.337mmol)溶于10mLRBF。加入甲苯(3mL)，真空蒸发化合物(2次)。干燥过夜后，加入二氯甲烷(4mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌10min，然后冷却至-10℃。将TMS-OTf(3μL,0.017mmol)加到该反应混合物中，搅拌，同时缓慢地温热至0℃，历时1.5h。通过添加饱和NaHCO3水溶液猝灭反应。分离各层，用DCM萃取水层。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发。使粗产物上isolute，采用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(64.4mg,74％)。HRMS(ESI+)C53H55Cl3N4O17Na+计算值1147.252[M+Na]+,测定值1147.2558.
化合物30*
将化合物29*(80mg,0.071mmol)溶于吡啶(1mL)，加入乙酸肼(19.6mg,0.213mmol)。将该反应混合物在室温搅拌17h。通过添加丙酮猝灭反应，搅拌45分钟，然后蒸发。使粗产物上isolute，采用自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(72.8mg,100％)。HRMS(ESI+)C48H49Cl3N4O15Na+计算值1049.2152[M+Na]+,测定值1049.2176.
A-2肺炎克雷伯菌半乳聚糖-I(O1)糖的制备
A-2-1肺炎克雷伯菌O1四糖的制备
化合物32*
采用甲苯共沸真空干燥5-叠氮基戊醇(0.226g,1.747mmol)和化合物35*(0.9g,1.344mmol)。在室温使化合物再溶于甲苯(6mL)和1,4二噁烷(2mL)混合物，加入4A分子筛，搅拌20min。使RM冷却至-5℃，加入TMSOTf，在-5℃搅拌RM 5min，缓慢地温热至2℃，历时1小时。在10℃用饱和NaHCO3水溶液(2mL)使RM猝灭，干燥有机层(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。采用自动化纯化系统Biotage(硅胶柱色谱法，采用EA/CHx)纯化，得到产物，为异头物混合物(fr1,314mg,α产物)和(fr2,300mg,β产物)(75％)。
化合物33*
在室温将化合物32*(300mg,0.492mmol)溶于DCM(5mL)和缓冲溶液(10mL)，分批加入DDQ(335mg,1.476mmol)，历时20min，搅拌1.5h。用饱和NaHCO3(10mL)使RM猝灭，用DCM(10mL X 3)萃取。用饱和NaHCO3(5mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到粗产物。采用Biotage(硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂)纯化，得到产物，为无色树胶状液体(210mg,91％)。
化合物34*
根据对由22*合成化合物23*所述的方法由化合物2*制备了化合物34*。
化合物35*
采用甲苯在旋转蒸发器中共沸干燥化合物34*(15.5g,31.1mmol)，高度真空干燥过夜。将该固体在氮气气氛中溶于DCM(300mL)，向其中加入Cs2CO3(30.4g,93mmol)，搅拌10min。将(E)-2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(16.13g,78mmol)加到纯净RM中，在室温搅拌RM 3h。通过硅藻土过滤RM，用DCM洗涤(50mLX4)。真空蒸发合并的滤液，得到粗产物。用三乙胺处理的硅胶柱进行纯化，乙酸乙酯/环己烷作为洗脱剂，产物析出，蒸发和高度真空干燥时得到淡黄色松散固体(18.5g,89％)。
化合物36*
在室温向溶于DCM：H2O(1：0.3,26mL)中的硫糖苷8*(1.58g,2.31mmol)溶液中加入NBS(1.23g,6.94mmol)。将该反应体系在相同温度下搅拌1h。TLC(50％乙酸乙酯/环己烷)显示原料完全耗尽。用DCM(20mL)稀释该反应体系，用10％Na2S2O3(10mL)和饱和NaHCO3(10mL)洗涤，分离有机层，用Na2SO4干燥，蒸发溶剂，得到粗物质。采用硅胶和乙酸乙酯/环己烷作为洗脱剂的自动化纯化(Combiflash)得到产物，为无色油状物(1.12g,1.89mmol)。HRMS(ESI+)C32H30O11Na+计算值[M+Na]+613.1686,测定值613.1628.
化合物37*
在室温将乳醇36*(18.5g,31.3mmol)溶于DCM(300mL)，向其中加入咪唑(6.40g,94mmol)和TDSCl(11.20g,62.7mmol)，在室温搅拌5min。观察到白色沉淀，持续搅拌18小时以上。TLC分析显示存在强烈非极性斑点(主要为β和少量α)和极少SM。然后用水使RM猝灭，用DCM(100mLX3)萃取。用盐水溶液(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到无色树胶状产物。使用Biotage硅胶柱(220g)、采用EA-环己烷纯化，采集到非极性斑点，为fr1(仅β异头物)和fr2(两种异头物混合物，主要为α)和极性斑点，为fr3，真空蒸发，得到期望的产物，为无色树胶状液体，为fr1(16g,纯β)和fr2(4.6g,主要为α)。因此，反应的总收率为90％(20.6g)。
化合物38*
在室温将化合物37*(15.9g,21.69mmol)溶于吡啶(100mL)，向其中加入乙酸肼(5.99g,65.1mmol)，在室温搅拌18h。TLC显示存在糖活性斑点，在40％EA/环己烷中适度非极性至SM的Rf值。然后用不同使RM猝灭，在室温搅拌45min。然后真空蒸发RM至干。采用Biotage与EA-环己烷作为洗脱剂出残余物，得到糖活性斑点，蒸发和高度真空干燥时得到期望的化合物，为无色树胶状液体(12.8g,93％)。
化合物39*
将化合物38*(5.40g,8.51mmol)和化合物35*(7.41g,11.06mmol)溶于RBF，采用无水甲苯真空共沸干燥。在室温将该混合物溶于甲苯(60ml)和二噁烷(20mL)，向其中加入4A分子筛，在室温在N2气氛中搅拌30min。采用冰水浴将RM冷却至-2℃，将TMSOTf(0.189g,0.851mmol)加到RM中，在5℃搅拌RM 20min。TLC显示反应大部分完成。然后将RM缓慢地温热至室温，历时1hr。TLC分析显示反应完成，用饱和NaHCO3(100mL)使RM猝灭，搅拌10min。用EA(50mLX3)萃取。用水(100mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，真空蒸发，得到粗产物。采用Biotage的EA/环己烷进行硅胶柱色谱法。因此，反应收率为8.35g,88％.HRMS(ESI+)C66H70O14SiNa+计算值[M+Na]+1137.4433,测定值1137.4339.
化合物40*
将化合物39*(1.15g,1.031mmol)溶于THF(6mL)，向其中加入干燥的4A分子筛，在室温搅拌15min。向RM中加入BH3-THF(8.25mL,8.25mmol)，搅拌5min，然后添加TMSOTf，在室温搅拌16hr。在室温用甲醇(10mL)缓慢地使RM猝灭(谨慎，泡腾)，搅拌45min，然后用饱和NaHCO3溶液(25mL)和EA(10mL)稀释。将RM充分搅拌2hr。分离各层。用EA(25mLX3)萃取水层。用盐水溶液(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到无色树胶状液体。采用EA/环己烷柱纯化粗产物，用20-30％EA/环己烷洗脱产物，用旋转蒸发器蒸发斑点中包含产物的级分，得到无色树胶状液体(0.73g,63.4％)。
化合物41*
在室温将化合物40*(1.0g,0.895mmol)溶于DCM(20mL)，向其中加入吡啶(1.086mL,13.42mmol)和DMAP(0.022g,0.179mmol)，搅拌5min。然后向其中加入BzCl(0.503g,3.58mmol)，搅拌48h。TLC分析(20％EA/CHx)显示反应完成。用DCM(25mL)和NaHCO3(20mL)稀释RM，分离各层。用盐水(10mL)溶液洗涤有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到浅棕色产物。采用Biotage-硅胶柱与EA和CHx作为洗脱剂纯化，得到粗产物，真空蒸发包含产物的级分时得到无色树胶状固体。向其中加入无水甲苯，用旋转蒸发器共沸干燥该物质2次，然后高度真空干燥，得到无色树胶状固体(900mg,82％)。
化合物42*
在室温将化合物41*(125mg,0.120mmol)溶于DCM(3mL)和缓冲溶液(3mL)，分批加入DDQ(69.7mg,0.307mmol)，历时20min，RM变成黑色，然后变成淡红棕色。将RM搅拌2h。TLC分析(20％EA/CHx)显示存在极性斑点，几乎没有SM。由此持续搅拌0.5h以上。用NaHCO3溶液(10mL)使RM猝灭，用DCM(10mLX3)萃取。用盐水溶液(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到粗产物。采用Biotage与硅胶柱-EA/Chx作为洗脱剂出粗产物，得到产物(86mg,78％)。
化合物43*
在室温将化合物41*(940mg,0.770mmol)在50mL falcon管中溶于吡啶(10mL)，搅拌5min。然后向其中加入HF-Py(1144mg,11.54mmol)(谨慎：起泡和放热)。将RM在室温搅拌18h。TLC分析(20％EA/Chx)显示存在SM且还析出极性斑点。因此，向RM中加入10当量的HF-Py 1次以上，将RM在室温搅拌30h以上，TLC分析(20％EA/Chx)显示仍然存在一些SM且还存在主要极性斑点。用水(50mL)使RM猝灭，用DCM(50mL)稀释，充分混合各层，同时在室温搅拌，分离各层。用DCM(25mL X2)萃取水层。用NaHCO3洗涤液洗涤合并的有机层(50mLX2,谨慎一定程度的泡腾)、盐水(3mL)，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到白色树胶状液体。采用Biotage与硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物(661mg,80％)。
化合物44*
在室温在1N2气氛中将乳醇43*(600mg,0.556mmol)溶于DCM(20mL)，向其中加入Cs2CO3(725mg,2.224mmol)，搅拌5min。然后向其中加入亚氨酰氯试剂(346mg,1.668mmol)，搅拌2h。TLC分析显示反应完成，存在强烈非极性斑点，且不存在SM。因此，过滤RM以除去固体，用DCM洗涤产物。真空浓缩滤液。采用硅胶柱(用环己烷中的TEA处理，然后上柱)、应用EA/CHx+1％TEA作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物级分。蒸发和真空干燥时得到黄白色松散固体(682mg,98％)。
化合物45*
采用无水甲苯共同真空共沸干燥化合物33*(80mg,0.170mmol)和化合物44*(256mg,0.204mmol)。在室温将它们溶于DCM(5mL)，向其中加入4A分子筛，在N2气氛中搅拌20min。采用冰-丙酮浴将RM冷却至-5℃，向RM中加入TMSOTf(6.16μL,0.034mmol)，在-5℃将RM搅拌5min，缓慢地温热至2℃，历时1h。TLC分析(30％EA/CHx，然后在20％EA/CHx中)显示反应完成。在10℃用NaHCO3溶液(5mL)使RM猝灭，分离各层。用DCM(3mL X 2)萃取水层。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。通过采用硅胶柱色谱法的Biotage、应用EA/CHx纯化，得到包含产物斑点的级分，真空蒸发时得到期望的产物，为无色树胶状固体(231mg,89％)。
化合物46*
在室温将化合物45*(220mg,0.144mmol)溶于DCM(6mL)和缓冲溶液(12mL)，分批加入DDQ(98mg,0.431mmol)，历时20min，RM变成黑色，然后变成淡红棕色。将RM搅拌1.5h。TLC分析(20％EA/CHx)显示存在极性斑点，几乎没有SM。由此持续搅拌0.5h以上。用饱和NaHCO3溶液(15mL)使RM猝灭，用DCM(10mL X 3)萃取。用饱和NaHCO3溶液(5mL)、盐水溶液(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到粗产物。采用Biotage与硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂纯化粗产物，得到无色树胶状固体(160mg,80％)。HRMS(ESI+)C79H79O20N3Na[M+Na]+计算值1412.5155,测定值1412.5040.
化合物47*
采用无水甲苯共同真空共沸干燥化合物46*(25mg,0.018mmol)和化合物21*(27.9mg,0.036mmol)。在室温将它们溶于DCM(5mL)，向其中加入4A分子筛，在N2气氛中搅拌20min。采用冰-丙酮浴将RM冷却至-10℃，向RM中加入TMSOTf(0.650μL,3.60μmol)，在-10℃将RM搅拌5min，缓慢地温热至2℃，历时1h。TLC分析(30％EA/CHx，然后在20％EA/CHx中)显示反应完成且存在明显的斑点。在10℃用NaHCO3溶液(5mL)使RM猝灭，分离各层。用DCM(3mLX 2)萃取水层。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。通过采用硅胶柱色谱法的Biotage、应用EA/CHx纯化，得到包含产物斑点的级分，真空蒸发时得到期望的产物，为无色层状物(6mg,17％)。
化合物48*
在室温将化合物47*(6mg,3.03μmol)溶于THF-MeOH(1：1,2mL)，向其中加入NaOMe的甲醇溶液(0.121mL,0.061mmol)，持续搅拌18h。TLC分析(30％EA/CHx)显示不存在SM且存在极性斑点。因此，真空蒸发RM。用EA(3mL)和水(2mL)稀释。用AcOH(～0.2mL)酸化。用EA(2mL X 3)萃取。用盐水溶液(2mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物。1H NMR和HRMS显示该粗产物具有期望的产物，也具有中间体产物，其中分子上存在一个Bz，且可以存在两个Bz基团。因此，使RM在室温再接触反应条件。用EA(3mL)和水(2mL)稀释RM。用AcOH(～0.1mL)酸化。用EA(2mL X 3)萃取。用水(2mL)、盐水溶液(2mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物。1HNMR和HRMS显示该粗产物具有期望的产物以及很少的包含单Bz的中间体。因此，使RM在50℃再接触反应条件18h。将RM冷却至rt，然后用EA(3mL)和水(2mL)稀释。用AcOH(～0.1mL)酸化。用EA(2mL X 3)萃取。用水(2mL)、盐水溶液(2mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物(3mg,68％)。
化合物49*
将化合物48*(3mg,2.060mmol)溶于溶剂混合物(DCM-tBuOH-2滴水)，向其中加入在tBuOH中的Pd/C(0.5mL)，在室温在5巴H2压力下氢化24h。通过PTFE滤器过滤RM，用甲醇(6mL)、(50％甲醇-水(6mL)洗涤产物。真空蒸发滤液，得到粗产物。1H nmr分析显示反应完成，且存在产物。因此，通过C18 Sepak柱、采用水(3mL X 2,fr1)、20％ACN-水(3mL X 2,fr2)和ACN(3mL,fr3)纯化粗产物。冷冻全部级分，冻干24h，得到fr1，为期望的产物(无色层状物,0.71mg,46％)。LRMS(ESI+)C29H54NO21H+[M+H]+计算值753.3222,测定值753.4608.
A-2-2肺炎克雷伯菌O1六糖的制备
化合物50*
采用无水甲苯共同真空共沸干燥合物46*(125mg,0.090mmol)和化合物107*(227mg,0.135mmol)。在室温将它们溶于DCM(5mL)，向其中加入4A分子筛，在N2气氛中搅拌20min。采用冰-丙酮浴将RM冷却至-10℃，向RM中加入TMSOTf(3.25μL,0.018mmol)，在-10℃将RM搅拌5min，缓慢地温热至2℃，历时1h。TLC分析(30％EA/CHx，然后在20％EA/CHx中)显示反应完成且存在明显的斑点。在10℃用NaHCO3溶液(5mL)使RM猝灭，分离各层。用DCM(3mLX 2)萃取水层。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。通过采用硅胶柱色谱法的Biotage、应用EA/CHx纯化，得到期望的产物，为无色层状物(160mg,62％)。LRMS(ESI+)C171H163N3O39Na+[M+Na]+计算值2906.0795,测定值2906.0327.
化合物51*
根据通用方案A使化合物50*进行甲醇分解：
得到产物，为白色树胶状固体(65mg,91％)。
MALDI-TOF C115H131N3NaO31 +[M+Na]+计算值2072.8664,测定值2073.540
化合物52*
根据通用方案A使化合物51*进行氢化反应：
得到产物，为白色松散固体(9mg,69％)。
HRMS(ESI+)C41H74NO31[M+H]+计算值1076.4245,测定值1076.4282.
1H NMR(400MHz,氧化氘)δ5.26(s,1H)，5.22(d,J＝3.9Hz,1H)，5.14(d,J＝2.8Hz,1H)，5.00(d,J＝3.3Hz,1H)，4.71(d,J＝7.4Hz,1H)，4.66(d,J＝7.6Hz,1H)，4.46(dd,J＝3.0,1.5Hz,1H)，4.37-4.05(m,12H)，4.02-3.89(m,5H)，3.87-3.63(m,19H)，3.62-3.53(m,1H)，3.11-2.99(m,2H)，1.84-1.64(m,4H)，1.58-1.44(m,2H)。
化合物52a-l*
如图12中所示，按照与化合物52*类似的方式由化合物35*制备了化合物52a-l*。
A-2-3肺炎克雷伯菌O1八糖的制备
化合物53*
采用无水甲苯单独地真空共沸干燥化合物42*(40mg,0.037mmol)和化合物44*(445mg,0.356mmol)。将它们在室温溶于DCM(10mL)，向其中加入4A分子筛，搅拌10min。向其中加入亚氨酸酯供体的DCM溶液(1mL)，在室温在N2气氛中搅拌30min。采用干冰-CAN浴将RM冷却至-20℃，将TMSOTf(7.40μL,1.34μmol)加到RM中，在-20℃搅拌RM 5min，缓慢地温热至2℃，历时1h。TLC分析(30％EA/CHx，然后在20％EA/CHx中)显示反应完成，不存在SM 42*且存在适度极性的斑点。在10℃用NaHCO3溶液(2mL)使RM猝灭，分离各层，干燥有机层(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。通过采用EA/CHx的硅胶柱色谱法纯化，得到包含产物的级分，真空蒸发时得到期望的产物，为无色层状物(630mg,91％)。HRMS(ESI+)C127H124O29SiNa+[M+Na]+计算值2164.7929,测定值2164.7727.
化合物54*
在室温将化合物53*(300mg,0.140mmol)溶于DCM(5mL)和缓冲溶液(pH 7.4,7mL)，分批加入DDQ(95mg,0.420mmol)，历时20min，RM变成黑色，然后其变成淡红棕色。将RM搅拌2h。TLC分析(30％EA/CHx)显示存在极性斑点，几乎没有SM。由此持续搅拌0.5h以上。用NaHCO3溶液(10mL)使RM猝灭，用DCM(10mLX3)萃取。用盐水溶液(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩，得到粗产物。用Biotage与硅胶柱-EA/Chx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物(215mg,76％)。
化合物55*
在室温将化合物53*(1.0g g,0.467mmol)在50mL Falcon管溶于中吡啶(10mL)，搅拌5min。然后向其中加入HF-Py(1.5ml,16.34mmol)(谨慎：起泡和放热)。将RM在室温搅拌18h。TLC分析(30％EA/Chx)显示形成极性斑点。用水(50mL)使RM猝灭，用DCM(50mL)稀释，充分混合各层，同时在室温搅拌，分离各层。用DCM(25mL X2)萃取水层。用NaHCO3洗涤液(50mLX2,谨慎一定程度泡腾)、盐水(3mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到白色树胶状液体。采用与硅胶柱-EA/CHx作为洗脱剂纯化粗产物，得到产物(930mg,定量)。
化合物56*
在室温在N2气氛中将乳醇55*(1.1g,0.550mmol)溶于DCM(20mL)，向其中加入Cs2CO3(717mg,2.200mmol)，搅拌5min。然后向其中加入亚氨酰氯试剂(0.261mL,1.65mmol)，搅拌2h。TLC分析显示反应完成，存在强烈非极性斑点，无SM存在。因此，过滤RM以除去固体，用DCM洗涤产物。真空浓缩滤液。蒸发和真空干燥时得到黄白色松散固体(1.2g,100％)。
化合物57*
根据通用方案B通过与5-叠氮基戊醇的糖基化反应由化合物56*得到了化合物57*：
得到产物，为白色松散固体(218mg,90％)。
MALDI-TOF C124H116N3O29 +[M+H]+计算值2110.7694,测定值2110.169.
化合物58*
根据通用方案A通过除去Nap保护基由化合物57*得到了化合物58*：
得到产物，为白色松散固体(102mg,51％)。
MALDI-TOF C113H108N3O29 +[M+H]+计算值1970.7068,测定值1969.901.
化合物59*
根据通用方案B通过糖基化反应由化合物58*和化合物110*得到了化合物59*：
得到产物，为白色松散固体(128mg,63％)。
MALDI-TOF C232H216N3O55 +[M+H]+计算值3923.4197,测定值3923.293.
化合物60*
根据通用方案B使化合物59*进行甲醇分解：
得到产物，为白色固体层状物(44mg,定量)。
MALDI-TOF C134H160N3O41[M+H]+计算值2467.0527,测定值2466.377.
化合物61*
根据通用方案C使化合物60*进行氢化反应。
得到产物，为白色松散固体(21mg,95％)。
HRMS(ESI+)C53H94NO41[M+H]+计算值1400.5301,测定值1400.5375.
1H NMR(400MHz,氧化氘)δ5.19(s,1H)，5.17(d,J＝3.9Hz,1H)，5.13(d,J＝3.9Hz,1H)，5.06(dd,J＝4.9,3.1Hz,2H)，5.02(d,J＝1.6Hz,1H)，4.67(d,J＝7.4Hz,1H)，4.64(d,J＝7.6Hz,1H)，4.40(dd,J＝2.8,1.3Hz,1H)，4.31-4.10(m,11H)，4.08-3.53(m,38H)，3.02-2.93(m,2H)，1.66(dp,J＝14.2,7.1,6.5Hz,4H)，1.52-1.34(m,2H)。
化合物61a-l*
如图12中所示，按照与化合物61*类似的方式由化合物56*制备了化合物61a-l*。
A-2-4肺炎克雷伯菌O1十五糖的制备
化合物62*
根据通用方案B通过化合物56*和化合物46*的糖基化反应得到了化合物62*：
得到产物，为白色松散固体(293mg,81％)。
MALDI-TOF C198H184N3O48 +[M+H]+,计算值3371.2049测定值3372.109.
化合物63*
根据通用方案A通过除去Nap保护基由化合物62*得到了化合物63*：
得到产物，为白色松散固体(152mg,63％)。
MALDI-TOF C187H176N3O48 +[M+H]+计算值3231.1423,测定值3232.291.
化合物64*
根据通用方案B，通过糖基化反应由化合物63*和化合物115*得到了化合物64*：
得到产物，为白色松散固体(52mg,32％)。
MALDI-TOF C 414H384N3O100+[M+H]+计算值6996.5055,测定值7001.685.
化合物65*
根据通用方案B使化合物64*进行甲醇分解：
得到产物，为白色固体(25mg,97％)。
MALDI-TOF C246H288N3O76[M+H]+计算值4499.8763,测定值4500.132.
化合物66*
根据通用方案B C使化合物65*进行氢化反应。
化合物66a-l*
如图12中所示，按照与化合物66*类似的方式由化合物35*和相应的醇制备了化合物66a-l*。
A-3肺炎克雷伯菌O2(2c)糖的制备
A-3-1肺炎克雷伯菌O2二糖的制备
化合物67*
/>
将化合物29*(15mg,0.013mmol)溶于无水THF(1mL)，加入1MTBAF的THF溶液(133μL,0.133mmol)。将该反应混合物在室温搅拌18h。蒸发该混合物，使残余物分配中乙酸乙酯与水之间，用乙酸乙酯将水层萃取2次，用Na2SO4干燥有机层，蒸发，得到产物，为淡黄色油状物(13.2mg)。HRMS(ESI+)C50H54N4O15H+计算值951.3658[M+H]+,951.3650实测值。
化合物68*
将化合物67*(13mg,0.014mmol)溶于5mL RBF，加入无水甲苯(2mL)，真空蒸发30min至干，再重复该共沸干燥过程1次。高度真空干燥物质30min。将其溶于无水DCM(1mL)，在0℃加入乙酐(3.88μL,0.041mmol)和三乙胺(9.53μL,0.068mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1.5h。蒸发该混合物，使残余物分配在乙酸乙酯与饱和NaHCO3水溶液之间。用乙酸乙酯萃取水层2次，用Na2SO4干燥有机层，蒸发。将残余物溶于5mL RBF，加入无水甲苯(2mL)，真空蒸发30min至干，再重复该共沸干燥过程1次。高度真空干燥物质30min。将其溶于无水THF/甲醇1：1(1mL)，加入0.5M甲醇钠的甲醇溶液(1.108mL,0.70mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16h。蒸发该混合物，使残余物分配在乙酸乙酯与水之间。用乙酸乙酯将水层萃取2次，用Na2SO4干燥有机层，蒸发，得到产物，为淡黄色油状物(5.4mg)。
HRMS(ESI+)C26H38N4O11Na+计算值605.2435[M+Na]+,605.2548实测值。
化合物69*
根据通用方案C使化合物68*(5mg,8.58μmol)进行氢化反应。首先通过SEC色谱法(G-25,水)、然后通过C18 Sepak柱(水/乙腈)纯化该混合物，得到产物(0.81mg,13.3％，历时5步)。
HRMS(ESI+)C19H36N2O11H+计算值469.2392[M+H]+,469.2419实测值。
A-3-2肺炎克雷伯菌O2(2c)六糖的制备
化合物70*
将化合物28*(38mg,0.032mmol)和化合物30*(30mg,0.029mmol)溶于10mL RBF，加入无水甲苯(4mL)，真空蒸发30min至干，重复该共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥物质12h。在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(1mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌10min，然后冷却至-10℃。将TMSOTf(0.53μL,2.92μmol)加到该反应混合物中，搅拌，同时将其缓慢地温热至0℃，历时2h时间期限。TLC分析显示供体斑点消失，且存在新斑点。通过添加饱和NaHCO3溶液猝灭反应。分离各层，用DCM萃取水层。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到粗产物。通过柱色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(40.5mg,68.5％)。HRMS(ESI+)C96H93Cl6N5O31K+计算值2064.6023[M+K]+,2064.3657实测值。
化合物71*
将化合物70*(40mg,0.020mmol)溶于无水吡啶(1mL)，加入乙酸肼(5.46mg,0.059mmol)。将该反应混合物在室温搅拌17h。通过添加丙酮猝灭反应。将其搅拌45分钟，然后蒸发，得到粗产物。通过柱色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(32.9mg,86％)。HRMS(ESI+)C91H87Cl6N5O29Na+计算值1950.3928[M+Na]+,1950.3255测定值.
化合物72*
将化合物28*(20.3mg,0.017mmol)和化合物71*(30mg,0.016mmol)溶于10mL RBF，加入无水甲苯(4mL)，真空蒸发30min至干，重复该共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥物质2h。在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(1mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌10min，然后冷却至-10℃。将TMS-OTf(0.28μL,1.56μmol)加到该反应混合物中，搅拌，同时将其缓慢地温热至0℃，历时1.5h时间期限。TLC分析显示供体斑点消失，且存在新斑点。通过添加饱和NaHCO3溶液猝灭反应。分离各层，用DCM萃取水层。用Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发，得到粗产物。通过柱色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂，得到产物，为白色固体(18.9mg,41.5％)。HRMS(ESI+)C139H131Cl9N6O45Na+计算值2947.6132[M+Na]+,2947.5147实测值。
化合物73*
根据对合成化合物67*所述的方法由化合物72*制备了化合物73*。
化合物74*
根据对合成化合物68*所述的方法由化合物73*制备了化合物74*。
化合物75*
根据对合成化合物69*所述的方法由化合物74*制备了化合物75*。
A-4肺炎克雷伯菌O2ac糖的制备
A-4-1肺炎克雷伯菌O2ac四糖的制备
化合物76*
将Cs2CO3(2.2g,6.77mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基-亚氨代乙酰氯(2.1g,3.39mmol)加到乳醇36*(2.0g,3.39mmol)在DCM(20mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过TLC监测。2小时后，全部原料耗尽。通过硅藻土过滤该反应体系，用DCM(20mL)洗涤。蒸发溶剂，通过采用硅胶和乙酸乙酯/环己烷+1％Et3N作为洗脱剂的柱色谱法纯化产物。合并通过TLC的包含产物的试，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(2.58g,100％)。
化合物77*
根据通用方案B，通过化合物76*与化合物33*之间的糖基化反应制备了化合物77*：
得到产物，为白色松散固体(249mg,75％)。
HRMS(ESI+)C57H59N3NaO16计算值[M+Na]+1064.3793,测定值1064.3801.
化合物78*
根据用于除去Lev保护基的通用方案A由化合物77*制备了化合物78*：
得到产物，为白色松散固体(171mg,79％)。
HRMS(ESI+)C52H53N3NaO14计算值[M+Na]+966.3425,测定值966.3422.
化合物79*
根据通用方案B，通过化合物78*与化合物28*之间的糖基化反应制备了化合物79*：
得到产物，为白色松散固体(44mg,46％)。
MALDI-TOF C100H97Cl3N4NaO30 +计算值[M+Na]+1961.5151,测定值1963.686.
化合物80*
在室温将化合物79*(10mg,5.48μmol)溶于THF(2mL)，将1M TBAF在THF中的溶液(0.11mL,0.11mol)加到反应混合物中，在室温搅拌18h。用水(5mL)使RM猝灭，用EA(5mL)稀释。分离各层，用EA(5mLX3)萃取水层。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗胺产物。将这种粗产物溶于DCM，向其中加入TEA(50eq)和Ac2O(40eq)，搅拌过夜。用水(5mL)使该反应混合物猝灭，用DCM(5mL)稀释。分离各层，用DCM(5mLX3)萃取水层。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗的NHAc产物。然后将该粗混合物在室温溶于THF-MeOH(1：1mL)，将过量0.5MNaOMe的甲醇溶液加入其中，在55℃持续搅拌18h。真空蒸发RM。用EA和水稀释。用AcOH酸化至中性pH。用EA萃取。用盐水溶液洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物，为淡黄色层状物(5mg,84％,历时3步)。
化合物81*
根据通用方案C使化合物80*进行氢化反应：
得到产物，为白色松散固体。
HRMS(ESI+)C31H57N2O21计算值[M+H]+793.3454,测定值793.3455.
A-4-2肺炎克雷伯菌O2ac八糖的制备
化合物82*
根据通用方案B通过化合物76*与化合物46*之间的糖基化反应制备了化合物82*：
得到产物，为无色玻璃层状物(155mg,73％)。
MALDI-TOF C111H108N3O30 +计算值[M+H]+1962.7018,测定值1963.426.
化合物83*
根据用于除去Lev保护基的通用方案A由化合物82*制备了化合物83*：
得到产物，为白色松散固体(140mg,98％)。
MALDI-TOF C106H102N3O28 +计算值[M+H]+1864.6650,测定值1864.973.
化合物84*
根据通用方案B通过化合物83*与化合物28*之间的糖基化反应制备了化合物84*：
得到产物，为无色玻璃层状物(85mg,55％)。
MALDI-TOF C154H146Cl3N4O44 +计算值[M+H]+2859.8376,测定值2859.868.
化合物85*
根据用于除去Lev保护基的通用方案A由化合物84*制备了化合物85*：
得到产物，为白色松散固体(70mg,91％)。
MALDI-TOF C149H140Cl3N4O42+计算值[M+H]+2761.8008,测定值2763.646.
化合物86*
根据通用方案B通过化合物85*与化合物28*之间的糖基化反应制备了化合物86*：
得到产物，为无色玻璃层状物(31mg,46％)。
MALDI-TOF C197H184Cl6N5O58 +计算值[M+Na]+3756.9733,测定值3759.266.
化合物87*
根据对合成化合物80*所述的方法由化合物86*制备了化合物87*。
化合物88*
根据通用方案C使化合物87*进行氢化反应。
A-4-3肺炎克雷伯菌O2ac六糖的制备
化合物88*
化合物89*
根据通用方案B通过与化合物46*的糖基化反应由化合物88*得到了化合物89*：
得到产物，为无色玻璃层状物(9mg,17％)。
MALDI-TOF C154H145Cl3KN4O44 +计算值[M+K]+2897.7934,测定值2898.015.
化合物90*
根据对合成化合物80*所述的方法由化合物89*制备了化合物90*。
化合物91*
根据通用方案C使化合物90*进行氢化反应。
A-5肺炎克雷伯菌O2aeh糖的制备
化合物92*
向硫糖苷1*(1g,1.998mmol)在DCM(26mL)中的溶液中加入4A MS。加入二甲基甲酰胺(0.928mL,11.99mmol)，将该溶液搅拌30min。然后加入NIS(0.674g,3.00mmol)，将该反应体系冷却至0℃，加入TMSOTf(0.397mL,2.197mmol)。将该反应体系温热至室温，历时2.5h。TLC(50％乙酸乙酯/环己烷)显示原料完全耗尽。用DCM(20mL)稀释该反应体系，用10％Na2S2O3(10mL)和饱和NaHCO3(10mL)洗涤，分离有机层，用Na2SO4干燥，这份溶剂，得到粗物质。采用硅胶和乙酸乙酯/环己烷作为洗脱剂的自动化纯化得到产物，为无色油状物(360mg,35％)。HRMS(ESI+)C29H33N3O6Na+计算值[M+Na]+542.2267,测定值542.2293.
化合物93*
向化合物9*(687mg,1.039mmol)和化合物92*(360mg,0.693mmol)在甲苯：二噁烷(3：1,13.5mL)中的溶液中加入4A MS，将该混合物在室温搅拌2h。然后加入NIS(312mg,1.386mmol)，将该反应体系冷却至0℃。加入TMSOTf(0.013mL,0.069mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1h。用乙酸乙酯(10mL)稀释该反应体系，过滤，用Na2SO3和NaHCO3饱和水溶液萃取。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。通过自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯的环己烷溶液,0-50％)，得到产物与一些杂质(685mg,92％)。HRMS(ESI+)计算值C63H63N3O13Na+[M+Na]+1092.4259,测定值1092.4306.
化合物94*
在0℃向化合物93*(250mg,0.234mmol)在DCM：磷酸盐缓冲液7.4(2：1,9mL)在25mLRBF中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(80mg,0.350mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1.5h。用DCM(10mL)稀释反应体系，用饱和NaHCO3(5mL)猝灭。用饱和NaHCO3(5mL)和盐水(5mL)洗涤有机层。用Na2SO4(0.2g)干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液15min，得到粗产物。通过采用硅胶的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到无色油状物(178mg,82％)。HRMS(ESI+)计算值C52H55N3O13Na+[M+Na]+952.3633,测定值952.3665.
化合物95*
/>
如下制备了化合物95*：
在室温向溶于DCM：H2O(1：0.3,14mL)中的硫糖苷10*(1g,1.45mmol)溶液中加入NBS(0.775g,4.36mmol)。将该反应体系在相同温度搅拌1h。TLC(50％乙酸乙酯/环己烷)显示原料完全耗尽。用DCM(20mL)稀释该反应体系，用10％Na2S2O3(10mL)和饱和NaHCO3(10mL)洗涤，分离有机层，用Na2SO4干燥，蒸发溶剂，得到粗物质。采用硅胶和乙酸乙酯/环己烷作为洗脱剂的自动化纯化(Combiflash)得到乳醇产物，为无色油状物(0.85g,98％)。将Cs2CO3(1.3mg,4.02mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基-亚氨代乙酰氯(0.557mg,2.68mmol)加到乳醇(0.8g,1.34mmol)在DCM(5mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过TLC监测。2小时后，区别原料耗尽，通过硅藻土过滤该反应体系，用DCM(20mL)洗涤。蒸发溶剂，通过采用硅胶的柱色谱法纯化产物(乙酸乙酯/环己烷+1％Et3N)。合并通过TLC的包含产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(850mg,83％)。
化合物96*
向化合物95*(198mg,0.258mmol)和化合物94*(120mg,0.129mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入4A MS，将该混合物在室温搅拌20min。然后将该反应混合物冷却至-50℃,TMSOTf(0.005mL,0.028mmol)中的溶液中加入，将该反应混合物温热至-5℃ over 2h。过滤反应体系，蒸发溶剂。通过自动化纯化系统纯化(在环己烷中的乙酸乙酯)，得到产物(120mg,62％)。HRMS(ESI+)C86H81N3O22Na+计算值[M+Na]+1531.5234,测定值1531.5304.
化合物97*
将化合物96*(120mg,0.080mmol)溶于无水DCM(2mL)，依次加入乙硫醇(0.071mL,0.955mmol)和pTSOH(18mg,0.095mmol)。将该混合物在室温搅拌30min。TLC分析显示原料转化和新的更具极性的斑点。用三乙胺(0.2mL)猝灭反应，蒸发溶剂，得到粗产物，为淡黄色油状物。通过使用环己烷/乙酸乙酯的自动化柱色谱法纯化粗产物，得得产物，为油状物(110mg,97％)。HRMS(ESI+)C79H77N3O22Na+计算值[M+Na]+1442.4896,测定值1441.4948.
化合物98*
将甲醇钠的MeOH溶液25％w/w(0.319mL,1.478mmol)加到化合物97*(105mg,0.074mmol)在MeOH：THF混合物(2：1,1.5mL)中的溶液中。将该反应体系在相同温度搅拌20h。通过添加AcOH(1mL)猝灭反应，蒸发溶剂。使粗物质上isolute。通过硅胶柱色谱法纯化，采用如下洗脱剂顺序：1)环己烷；2)乙酸乙酯；以及3)MeOH的DCM 5％溶液，蒸发溶剂后得到产物，为白色固体(29mg,49％)。
化合物99*
将化合物98*(29mg,0.036mmol)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物(0.4：1.6：0.4,2.4mL)。加入PdC(25mg,0.023mmol)，将该反应混合物用氢气吹扫(5次)，将该反应体系在氢气压力(5巴)下搅拌22h。然后将该反应混合物通过采用H2O：ACN(1：1)的PTFE滤器过滤，用旋转蒸发器蒸发有机溶剂，冻干粗物质。通过SepPack、采用miliQ H2O纯化粗产物，得到产物，为白色固体(17.7mg,82％)。计算值C23H44NO16[M+H]+590.2660,测定值590.2656.1H NMR(400MHz,D2O)δ5.21(d,J＝3.5Hz,1H)，5.18(d,J＝1.9Hz,1H)，5.11(d,J＝3.7Hz,1H)，4.16-4.05(m,4H)，4.06-3.90(m,5H)，3.89-3.49(m,11H)，2.99(t,J＝1.9Hz,2H)，1.73-1.62(m,4H)，1.51-1.41(m,2H)；13C NMR(101MHz,D2O)δ108.9,95.2,95.1,82.5,81.8,77.3,75.1,71.0,70.7,70.6,70.0,69.6,69.4,69.3,68.2,67.8,62.7,61.2,39.4,28.0,26.5,22.4.
A-6肺炎克雷伯菌半乳聚糖-II糖的制备
A-6-1肺炎克雷伯菌半乳聚糖-II六糖的制备
化合物100*
将化合物19*(85mg,0.119mmol)和化合物18*(50mg,0.099mmol)溶于添加无水甲苯(5mL)的10mL RBF中，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥该物质12h。然后在氮气气氛中向其中加入脱水无水二氯甲烷(1mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃(等温线上的冰水混合物)。向该反应混合物中加入NIS(31mg,0.139mmol)和三氟甲磺酸(0.8μL,9.91μmol)，搅拌15min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。将粗化合物萃取入DCM，用饱和Na2S2O3溶液、饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤。分离后，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物，得到淡黄色固体(70mg,63％)。HRMS(ESI+)C68H64O14Na+计算值[M+Na]+1127.4194,测定值1127.4009.
化合物101*
在氮气气氛中将二糖100*(0.14g,0.127mmol)转入DCM(2.8mL)和磷酸盐缓冲液ph7.4(1.4mL)在10mL RBF中的搅拌溶液。缓慢地加入DDQ(0.129g,0.570mmol)，历时2.5h期限，TLC分析(40％乙酸乙酯/环己烷)显示存在新的适度极性的斑点，甚至2h后仍然存在大量原料，由此将该反应混合物在室温再搅拌4h。TLC显示不存在原料，但存在产物以及模糊的极性斑点。通过添加饱和NaHCO3水溶液(10mL)猝灭反应，萃取入DCM。用饱和NaHCO3溶液(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，在30-35℃的旋转蒸发器浴温在100mL RBF中真空浓缩1h，得到粗产物，为淡黄色油状物。用硅胶柱色谱法，采用乙酸乙酯的环己烷溶液进行纯化。然后向其中加入二氯甲烷，持续真空蒸发30min，得到无色透明树胶状液体，高度真空干燥16 -18h，形成松散白色固体(81mg,66％)。HRMS(ESI+)C57H56O14Na+计算值[M+Na]+987.3569,测定值987.3387.
化合物102*
将(1,5-环辛二烯)(吡啶)(三环己基膦)-Ir(I)]PF6(7.65mg,9.05μmol)溶于四氢呋喃(2mL)，在室温使氮气通过该溶液起泡2分钟，同时红色催化剂溶解。然后用氢气吹扫该溶液2分钟，此时红色溶液变成无色，将该溶液在氢气气氛中搅拌15min。然后在氮气气氛中通过注射器将活性催化剂溶液加到化合物100*(0.1g,0.09mmol)在四氢呋喃(1mL)中的溶液中，在室温搅拌2h。用饱和NaHCO3水溶液(5mL)使该反应混合物猝灭，用二氯甲烷萃取(3x5mL)。用盐水(5mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到烯丙基异构化的化合物(异构化通过1H NMR证实)。然后将乙烯基底物溶于四氢呋喃：水混合物(2：1,3mL)，在室温加入碘(46mg,0.18mmol)。将棕色溶液搅拌2h，然后用10％Na2S2O3溶液(5mL)猝灭。用乙酸乙酯(3x5mL)萃取水相，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发溶剂。通过急骤柱色谱法纯化(乙酸乙酯的环己烷溶液30％)，得到产物，为黄色固体(60mg,63％)。HRMS(ESI+)C65H60O14Na+计算值[M+Na]+1087.3881,测定值1087.3766.
化合物103*
将化合物102*(60mg,0.06mmol)溶于无水二氯甲烷(0.7mL)，向该溶液中加入Cs2CO3(37mg,0.113mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(0.03mL,0.17mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。TLC分析显示原料完全转化和新斑点。将该反应混合物通过硅藻土垫(1cm)过滤。用DCM(20mL)洗涤垫，减压浓缩滤液，高度真空干燥，得到淡黄色油状物。
通过硅胶急骤柱色谱法进行纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到黄色泡沫体(60mg,86％)。HRMS(ESI+)C73H64F3NO14Na+计算值[M+Na]+1258.4177,测定值1258.3969.
化合物104*
/>
将化合物103*(13mg,0.097mmol)和5-叠氮基戊醇(60mg,0.049mmol)溶于添加无水甲苯(20mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥该物质12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(1mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(1.8μL,9.7μL)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色泡沫体(35mg,61％)。HRMS(ESI+)C70H69O14Na+计算值[M+Na]+1198.4677,测定值1198.4798.
化合物105*
将化合物21*(355mg,0.458mmol)和化合物101*(0.340mg,0.352mmol)溶于添加无水甲苯(10mL)的25mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料(0.355g,0.458mmol)12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(7mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(13μL,0.07mmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色泡沫体(0.380g,70％)。HRMS(ESI+)C95H90O20Na+计算值[M+Na]+1573.5923,测定值1573.5657.
化合物106*
将(1,5-环辛二烯)(吡啶)(三环己基膦)-Ir(I)]PF6(18mg,0.02mmol)溶于四氢呋喃(4mL)，在室温使氮气通过该溶液起泡2分钟，同时红色催化剂溶解。然后用氢气吹扫该溶液2分钟，此时红色溶液变成无色，将该溶液在氢气气氛中搅拌15min。然后在氮气气氛中通过注射器将活性催化剂溶液加到化合物105*(0.33g,0.21mmol)在四氢呋喃(2mL)中的溶液中，在室温搅拌2h。用饱和NaHCO3水溶液(5mL)使该反应混合物猝灭，用二氯甲烷萃取(3x5mL)。用盐水(5mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到烯丙基异构化的化合物(异构化通过1H NMR证实)。然后将乙烯基底物溶于四氢呋喃：水混合物(2：1,3mL)，在室温加入碘(0.11g,0.43mmol)。将棕色溶液搅拌2h，然后用10％Na2S2O3溶液(5mL)猝灭。用乙酸乙酯(3x5mL)萃取水相，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发溶剂。通过急骤柱色谱法纯化(乙酸乙酯的环己烷溶液30％)，得到产物，为黄色固体(240mg,75％)。HRMS(ESI+)C92H86O20Na+计算值[M+Na]+1533.5610,测定值1533.5387.
化合物107*
将化合物106*(0.242g,0.160mmol)溶于无水二氯甲烷(2.0mL)，向该溶液中加入Cs2CO3(0.104g,0.320mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(0.08mL,0.480mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。TLC分析显示原料完全转化和新斑点。将该反应混合物通过硅藻土垫(1cm)过滤。用DCM(20mL)洗涤垫，减压浓缩滤液，高度真空干燥，得到淡黄色油状物。通过硅胶急骤柱色谱法进行纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到黄色泡沫体(240mg,89％)。HRMS(ESI+)C100H90F3NO20Na+计算值[M+Na]+1704.5906,测定值1704.5603.
化合物108*
将化合物107*(0.666g,0.539mmol)和化合物101*(0.4g,0.414mmol)溶于添加无水甲苯(10mL)的25mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(8mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(15μL,0.018mmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色固体(0.650g,78％)。HRMS(ESI+)C122H114O27Na+计算值[M+Na]+2033.7445,测定值2033.7077.
化合物109*
将(1,5-环辛二烯)(吡啶)(三环己基膦)-Ir(I)]PF6(6.3mg,7.45μmol)溶于四氢呋喃(1.5mL)，在室温使氮气通过该溶液起泡2分钟，同时红色催化剂溶解。然后用氢气吹扫该溶液2分钟，此时红色溶液变成无色，将该溶液在氢气气氛中搅拌15min。然后在氮气气氛中通过注射器将活性催化剂溶液加到化合物108*(0.15g,0.075mmol)在四氢呋喃(0.8mL)中的溶液中，在室温搅拌2h。用饱和NaHCO3水溶液(5mL)使该反应混合物猝灭，用二氯甲烷萃取(3x5mL)。用盐水(5mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到烯丙基异构化的化合物(异构化通过1H NMR证实)。然后将乙烯基底物溶于四氢呋喃：水混合物(2：1,2.5mL)，在室温加入碘(37.8mg,0.149mmol)。将棕色溶液搅拌2h，然后用10％Na2S2O3溶液(5mL)猝灭。用乙酸乙酯(3x5mL)萃取水相，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发溶剂。通过急骤柱色谱法纯化(乙酸乙酯的环己烷溶液30％)，得到产物，为黄色固体(94mg,64％)。HRMS(ESI+)C119H110O27Na+计算值[M+Na]+1993.7132,测定值1993.6822.
化合物110*
将化合物109*(0.094g,0.048mmol)溶于无水二氯甲烷(0.6mL)，向该溶液中加入Cs2CO3(31mg,0.095mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(23μL,0.143mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。TLC分析显示原料完全转化和新斑点。将该反应混合物通过硅藻土垫(1cm)过滤。用DCM(20mL)洗涤垫，减压浓缩滤液，高度真空干燥，得到淡黄色油状物。通过硅胶急骤柱色谱法进行纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到淡黄色固体。
通过硅胶急骤柱色谱法纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到，为黄色泡沫体(85mg,83％)。HRMS(ESI+)C127H114F3NO27Na+计算值[M+Na]+2164.7428,测定值2164.7056.
化合物111*
/>
在氮气气氛中将化合物108*(0.100g,0.050mmol)转入DCM(1.3mL)和甲醇(0.3mL)在配备搅棒的10mL RBF中和400rpm搅拌下的搅拌溶液。加入DDQ(0.056g,0.248mmol)，TLC分析(40％乙酸乙酯/环己烷)显示存在适度极性的新斑点，甚至2h后仍然存在大量原料，由此在室温将该反应混合物再搅拌4h。TLC显示不存在原料，但存在产物以及模糊的极性斑点。通过添加饱和NaHCO3水溶液(10mL)猝灭反应，萃取入DCM。用饱和NaHCO3溶液(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，在30-35℃的旋转蒸发器浴温下在100mL RBF中真空浓缩1h，得到粗产物，为淡黄色油状物。用硅胶柱色谱法、采用乙酸乙酯的环己烷溶液进行纯化。然后向其中加入二氯甲烷，持续真空蒸发30min，得到无色透明树胶状液体，高度真空干燥16 -18h，形成松散白色固体(43mg,46％)。HRMS(ESI+)C111H106O27Na+计算值[M+Na]+1893.6819,测定值1893.6498.
化合物112*
将化合物103*(29mg,0.024mmol)和化合物111*(34mg,0.018mmol)溶于添加无水甲苯(3mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(0.3mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(0.6μL,3.63μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色固体(35mg,66％)。Maldi C176H164O40Na+计算值[M+Na]+2942.2,测定值2942.3.
化合物113*
将化合物110*(64mg,0.030mmol)和化合物111*(43mg,0.023mmol)溶于添加无水甲苯(3mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(0.5mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(0.8μL,4.59μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(66mg,75％)。Maldi C230H214O53Na+计算值[M+Na]+3849.2,测定值3849.4.
化合物114*
将(1,5-环辛二烯)(吡啶)(三环己基膦)-Ir(I)]PF6(8.18mg,9.7μmol)溶于四氢呋喃(1.9mL)，在室温使氮气通过该溶液起泡2分钟，同时红色催化剂溶解。然后用氢气吹扫该溶液2分钟，此时红色溶液变成无色，将该溶液在氢气气氛中搅拌15min。然后在氮气气氛中通过注射器将活性催化剂溶液加到化合物113*(0.370g,0.097mmol)在四氢呋喃(0.9mL)中的溶液中，在室温搅拌2h。用饱和NaHCO3水溶液(5mL)使该反应混合物猝灭，用二氯甲烷萃取(3x5mL)。用盐水(5mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到烯丙基异构化的化合物(异构化通过1H NMR证实)。然后将乙烯基底物溶于四氢呋喃：水混合物(2：1,2.5mL)，在室温加入碘(49mg,0.193mmol)。将棕色溶液搅拌2h，然后用10％Na2S2O3溶液(5mL)猝灭。用乙酸乙酯(3x5mL)萃取水相，用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，蒸发溶剂。通过急骤柱色谱法纯化(乙酸乙酯的环己烷溶液30％)，得到产物，为黄色固体(270mg,57％)。Maldi C227H210O53Na+计算值[M+Na]+3809.1,测定值3809.0.
化合物115*
将化合物114*(0.210g,0.055mmol)溶于无水二氯甲烷(0.7mL)，向该溶液中加入Cs2CO3(36mg,0.111mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基亚氨代乙酰氯(26μL,0.166mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。TLC分析显示原料完全转化和新斑点。将该反应混合物通过硅藻土垫(1cm)过滤。用DCM(20mL)洗涤垫，减压浓缩滤液，高度真空干燥，得到淡黄色油状物。通过硅胶急骤柱色谱法进行纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到淡黄色固体。
通过硅胶急骤柱色谱法纯化(环己烷/乙酸乙酯+0.1％Et3N)，得到，为黄色泡沫体(180mg,82％)。Maldi C235H214O53Na+计算值[M+Na]+3980.2,测定值3981.3.
化合物116*
将化合物110*(0.013mg,0.103mmol)和5-叠氮基戊醇(0.110g,0.05mmol)溶于添加无水甲苯(20mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中用配备的搅棒和300rpm搅拌下向其中加入无水二氯甲烷(1mL)。加入干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(1.9μL,10.26μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(0.091g,85％)。HRMS(ESI+)C124H119N3O27Na+计算值[M+Na]+2104.7929,测定值2104.7905.
化合物117*
在氮气气氛中将化合物116*(0.091g,0.044mmol)转入DCM(0.8mL)和磷酸盐缓冲液pH 7.4(0.8mL)在配备搅棒的10mL RBF中和400rpm搅拌下的搅拌溶液。加入DDQ(0.02g,0.087mmol)，TLC分析(40％乙酸乙酯/环己烷)显示存在适度极性的新斑点，甚至2h后仍然存在大量原料，由此在室温将该反应混合物再搅拌4h。TLC显示不存在原料，但存在产物以及模糊的极性斑点。通过添加饱和NaHCO3水溶液(10mL)猝灭反应，萃取入DCM。用饱和NaHCO3溶液(50mL)、盐水(100mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，在30-35℃的旋转蒸发器浴温下在50mL RBF中真空浓缩1h，得到粗产物，为淡黄色油状物。用硅胶柱色谱法、采用乙酸乙酯的环己烷溶液进行纯化。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(0.041g,47％)。HRMS(ESI+)C113H111N3O27Na+计算值[M+Na]+1964.7303,测定值1964.7309.
化合物118*
将化合物103*(33mg,0.027mmol)和化合物117*(40mg,0.021mmol)溶于添加无水甲苯(3mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(0.4mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(0.7μL,4.12μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色固体(37mg,60％)。Maldi C178H169N3O40Na+计算值[M+Na]+3013.3,测定值3014.2.
化合物119*
在配备搅棒的氮气气氛中将化合物118*(27mg,0.009mmol)溶于THF(0.6mL)。加入0.5M甲醇钠的甲醇溶液(18μL,9.03μmol)。将得到的溶液在50℃搅拌25h。通过HRMS和TLC[(50％乙酸乙酯的环己烷溶液)监测反应。真空蒸发该反应混合物15min至最小体积，然后用乙酸乙酯和水稀释。用50％AcOH水溶液(5mL)酸化该反应混合物，分离各层。然后用乙酸乙酯(5mL X 3)萃取水层。用水、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，在30-35℃旋转蒸发器浴温下在10mL RBF中真空浓缩1h，得到黄色固体。然后在RBF中向该固体中加入～2％乙酸乙酯/己烷(～5mL)，在水浴中将RBF温热至45℃，研磨，冷却至rt，过滤。用温热～2％乙酸乙酯/己烷洗涤固体2次以上，高度真空干燥，得到淡黄色固体，为期望的产物。真空浓缩全部滤液，然后高度真空干燥16h，得到产物，为黄色固体(14mg,76％)。HRMS(ESI+)C115H113N3O31Na+计算值[M+Na]+2074.8821,测定值2074.8574.
化合物120*
在室温在氮气气氛中在配备搅棒和250rpm搅拌下(Heidolph搅拌器)的20mLWheaton小瓶(10min烘干)中将化合物119*溶于iPrOH、DCM和H2O的溶剂混合物。向其中加入10％Pd/C混悬液。将该反应混合物在氢气气氛中吹扫，随后在室温在10巴压力下用室内氢化器搅拌24h。然后将该反应混合物通过PTFE疏含水滤器(0.45μm)过滤，用甲醇(3mL X 5)、水-甲醇(6：4,3mL X 5)充分洗涤滤器。在30-35℃旋转蒸发器浴温下真空干燥滤液1h，得到黄白色固体，为粗产物。粗产物的1H NMR显示反应完成，但存在中间体。然后采用C18 Sepak柱，应用水和乙腈作为洗脱剂纯化粗产物，得到在水级分中的期望的纯产物(fr1)。副产物洗脱在50％水-乙腈级分(fr2)中，杂质洗脱在乙腈洗涤液(fr3)中。再通过SEC柱纯化不纯的水级分(fr1)，以水作为洗脱剂。冻干水级分，得到期望的纯的产物，为白色泡沫固体(2mg,28％)。HRMS(ESI+)C115H113N3O31H+计算值[M+H]+1076.4245,测定值1076.4256.
1H NMR(400MHz,D2O)δ5.20-5.11(m,3H)，4.70-4.66(m,2H)，4.45(d,J＝7.9Hz,1H)，4.30-4.11(m,9H)，4.07-3.91(m,6H)，3.87-3.62(m,23H)，2.91(t,J＝7.3Hz,2H)，1.81-1.57(m,4H)，1.50-1.41(m,2H)。
化合物120a-l*
如图12中所示，按照与化合物120*类似的方式由化合物110*和相应的醇制备了化合物120-l*。
A-6-2肺炎克雷伯菌半乳聚糖-II八糖的制备
化合物121*
/>
将化合物110*(0.172mg,0.080mmol)和化合物117*(120mg,0.062mmol)溶于添加无水甲苯(3mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(1.2mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(2.2μL,12μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(125mg,52％)。Maldi C230H214O53Na+计算值[M+Na]+3920.3,测定值3921.1.
化合物122*
在配备搅棒的氮气气氛中将化合物121*(24mg,6.2μmol)溶于THF(0.6mL)。加入0.5M甲醇钠的甲醇溶液(12μL,6.2μmol)。将得到的溶液在50℃搅拌25h。通过HRMS和TLC[(50％乙酸乙酯的环己烷溶液)监测反应。真空蒸发该反应混合物15min至最小体积，然后用乙酸乙酯和水稀释。用50％AcOH水溶液(10mL)酸化该反应混合物，分离各层。然后用乙酸乙酯(5mL X 3)萃取水层。用水、盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，在30-35℃旋转蒸发器浴温下在50mL RBF中真空浓缩1h，得到黄色固体。然后在RBF中向该固体中加入～2％乙酸乙酯/己烷(～5mL)，在水浴中将RBF温热至45℃，研磨，冷却至rt，过滤。用温热～2％乙酸乙酯/己烷洗涤固体2次以上，高度真空干燥，得到淡黄色固体，为期望的产物。真空浓缩全部滤液，然后高度真空干燥16h，得到产物，为黄色固体(11mg,66％)。HRMS(ESI+)C148H171N3O41Na+计算值[M+Na]+2669.1286,测定值2669.1233.
化合物123*
在r.t.在氮气气氛中在配备搅棒和250rpm搅拌下(Heidolph搅拌器)的20mLWheaton小瓶(10min烘干)中将化合物122*(11mg,4.2μmol)溶于iPrOH、DCM和H2O的溶剂混合物。根据通用方案C进行氢化反应。粗产物的1H NMR显示反应完成，但存在中间体。然后采用C18 Sepak柱，应用水和乙腈作为洗脱剂纯化粗产物，得到在水级分中的期望的纯产物(fr1)。副产物洗脱在50％水-乙腈级分(fr2)中，杂质洗脱在乙腈洗涤液(fr3)中。再通过SEC柱纯化不纯的水级分(fr1)，以水作为洗脱剂。冻干水级分，得到期望的纯的产物，为白色泡沫固体(2mg,34％)。HRMS(ESI+)C115H113N3O31H+计算值[M+H]+1400.5301,测定值1400.5376.1H NMR(400MHz,D2O)δ5.20-5.16(m,3H)，5.15(d,J＝3.4Hz,1H)，4.70-4.66(m,3H)，4.46(d,J＝7.9Hz,1H)，4.33-4.09(m,12H)，4.07-3.88(m,5H)，3.88-3.58(m,33H)，3.00(t,J＝7.6Hz,2H)，1.50-1.40(m,4H)，1.42-1.29(m,2H)。
化合物123a-l*
如图12中所示，按照与化合物123*类似的方式由化合物110*和相应的醇制备了化合物123-l*。
A-6-3肺炎克雷伯菌半乳聚糖-II十二碳糖的制备
化合物124*
在氮气气氛中在配备搅棒的10mL RBF中和400rpm搅拌下将化合物121*(0.105g,0.027mmol)转入DCM(0.5mL)和磷酸盐缓冲液ph 7.4(0.5mL)的搅拌溶液中。加入DDQ(0.028g,0.121mmol)，TLC分析(40％乙酸乙酯/环己烷)显示存在新的适度极性的斑点，甚至2h后仍然存在大量原料，由此将该反应混合物在室温再搅拌4h。TLC显示不存在原料，但存在产物以及模糊的极性斑点。通过添加饱和NaHCO3水溶液(10mL)猝灭反应，萃取入DCM。用饱和NaHCO3溶液(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，在30-35℃的旋转蒸发器浴温在50mL RBF中真空浓缩1h，得到粗产物，为淡黄色油状物。通过快速色谱系统，采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(0.044g,44％)。MALDI C221H211O53H+计算值[M+H]+3758.1,测定值3758.4.
化合物125*
将化合物110*(26mg,0.012mmol)和化合物124*(45mg,0.012mmol)溶于添加无水甲苯(3mL)的10mL RBF，真空蒸发30min至干，重复这种共沸干燥过程2次以上。高度真空干燥原料12h。然后在氮气气氛中向其中加入无水二氯甲烷(0.2mL)和干燥的4A分子筛(MS)，在室温搅拌45min，然后冷却至0℃。向该反应混合物中加入TMS-OTf(0.2μL,2.4μmol)，搅拌30min。然后将该体系缓慢地温热至10℃ 0.5h，然后在室温搅拌1h。TLC分析显示供体斑点消失且存在新的斑点。通过添加三乙胺在5℃猝灭反应。通过快速色谱系统、采用环己烷/乙酸乙酯梯度系统纯化粗有机产物。真空浓缩采集的级分，然后高度真空干燥16h，得到产物，为白色松散固体(22mg,32％)。Maldi C340H319N3O53H+计算值[M+H]+5711.2,测定值5715.6.
化合物126*
根据对合成化合物119*所述的方法由化合物125*制备了化合物126*。
化合物127*
根据对合成化合物120*所述的方法由化合物126*制备了化合物127*。
A-7肺炎克雷伯菌半乳聚糖-III糖的制备
A-7-1肺炎克雷伯菌半乳聚糖-III三糖的制备
化合物128*
向化合物4*(420mg,0.653mmol)在DCM(13mL)中的溶液中加入MS、Ph2SO(172mg,0.849mmol)和2,4,6-三叔丁基嘧啶(404mg,1.633mmol)，将该混合物搅拌20min。将该反应混合物冷却至-78℃。加入Tf2O(240mg,0.849mmol)，将该反应混合物在相同温度搅拌20min。然后滴加溶于2mL DCM的5-叠氮基戊醇(169mg,1.307mmol)。将该反应混合物温热至-40℃，历时3h，然后用三乙胺(3mL)猝灭。用DCM(20mL)稀释该反应混合物，用盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥有机层。采用自动化纯化，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化粗混合物。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到产物，为无色油状物(350mg,81％)。C37H51N3O6Na计算值[M+Na]+684.3445,测定值684.3371.
化合物129*
向化合物128*(350mg,0.529mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入HF.py(0.11mL,4.23mmol)，将该反应体系在室温搅拌2h。原料完全耗尽后(TLC)，用三乙胺(0.5mL)猝灭反应，用饱和NaHCO3和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，真空除去溶剂。通过自动化纯化系统、采用硅胶纯化粗反应混合物(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物，为无色油状物(199mg,72％)。
化合物130*
将苯甲酸酐(99mg,0.437mmol)和三乙胺(295mg,2.91mmol)加到二醇129*(190mg,0.364mmol)在DCM(2mL)中的溶液中，将该反应体系在室温搅拌过夜。用DCM(10mL)稀释该反应体系，用饱和NaHCO3(5mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。采用自动化纯化系统(combiflash)，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化残余物。合并包含产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(225mg,99％)。C36H39N3O7Na计算值[M+Na]+648.2686,测定值648.2625.
化合物131*
向化合物9*(65mg,0.100mmol)和化合物130*(55mg,0.088mmol)在甲苯：二噁烷(3：1,1.2mL)中的溶液中加入MS，将该混合物在室温搅拌1h。然后加入NIS(28mg,0.123mmol)，将该反应混合物冷却至0℃。加入TMSOTf(1.6μL,8.8μmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。用三乙胺(0.1mL)猝灭反应，用DCM(10mL)稀释，用10％Na2SO3和饱和NaHCO3萃取。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。通过采用硅胶的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色油状物(60mg,59％)。C70H71N3O13Na计算值[M+Na]+1184.4885,测定值1184.4783.
化合物132*
在0℃在氩气气氛中向在10mL RBF中化合物131*(60mg,0.052mmol)在DCM：MeOH(4：1,2mL)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。将该反应混合物在室温搅拌2h 40min。通过TLC监测反应(EtOAc的环己烷溶液,2：1)。用DCM(10mL)稀释反应体系，用饱和NaHCO3(5mL)猝灭。用饱和NaHCO3(5mL)和盐水(5mL)洗涤有机层。用Na2SO4(0.2g)干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液15min，得到粗产物。通过采用硅胶的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到无色油状物(35mg,66％)。C59H63N3O13Na计算值[M+Na]+1044.4259,测定值1044.4156.
化合物133*
将化合物10*(33mg,0.032mmol)和化合物132*(30mg,0.044mmol)与甲苯共蒸发，高度真空干燥20min。向在DCM(6mL)中的供体和受体中加入4A MS，将该混合物在室温搅拌30min。然后将该反应混合物冷却至-40℃。加入NIS(11mg,0.048mmol)和AgOTf(2mg,8.07mmol)，将该反应混合物温热至-20℃，历时1h。将该反应体系在相同温度搅拌1h。用三乙胺(0.2mL)猝灭反应，用DCM(10mL)稀释，用Na2SO3和饱和NaHCO3萃取。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。通过自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色油状物(34mg,66％)。C93H89N3O22Na计算值[M+Na]+1623.5869,测定值1623.5714.
化合物134*
将甲醇钠的MeOH 25％w/w溶液(0.029mL,0.127mmol)加到化合物133*(17mg,0.010mmol)在MeOH：THF混合物(2：1,1.5mL)中的溶液中。将该反应体系在相同温度搅拌20h。通过添加AcOH(0.2mL)猝灭反应，蒸发溶剂。通过硅胶色谱法纯化，采用5％MeOH的DCM溶液作为洗脱剂，蒸发溶剂后得到产物，为白色油状物(9mg,87％)。
化合物135*
将化合物134*(9mg,0.009mmol)溶于MeOH：DCM：EtOAc的混合物(2：0.5：0.5,3mL)。加入Pd/C(10mg,0.009mmol)，用氢吹扫该反应混合物(5次)，将该反应体系在氢气压力(10巴)下搅拌60h。然后采用H2O：MeOH(1：1)将该反应混合物通过PTFE滤器过滤，用旋转蒸发器蒸发有机溶剂，冻干粗物质。通过采用miliQ H2O的SepPack纯化粗产物，得到产物，为白色固体(1mg,18％)。C23H44NO16Na计算值[M+H]+590.2660,测定值590.2593。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.26(d,J＝2.7Hz,1H)，5.10(d,J＝3.6Hz,1H)，5.05(d,J＝3.7Hz,1H)，4.31-4.21(m,3H)，4.17-4.04(m,5H)，4.03-3.94(m,2H)，3.94-3.67(m,9H)，3.66-3.57(m,1H)，3.07(t,J＝7.4Hz,2H)，1.82-1.65(m,4H)，1.59-1.45(m,2H)。13C NMR(101MHz,D2O)δ109.0,100.1,98.3,82.2,80.9,78.3,76.8,76.1,71.6,70.8,70.5,69.1,68.9,68.0,67.9,62.7,60.7,60.4,39.4,28.1,26.5,22.4.
A-7-2肺炎克雷伯菌半乳聚糖-III六糖的制备
化合物137*
向亚氨酸酯供体76*(2.6g,3.41mmol)和4-甲氧基苯酚(1.06,8.53mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入MS，将该混合物在室温搅拌30min。加入TMSOTf(0.076g,0.341mmol)，将该反应混合物在室温搅拌2h。用三乙胺(0.2mL)猝灭反应，过滤，用旋转蒸发器蒸发溶剂。通过采用硅胶的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为泡沫体(2.14g,90％)。HRMS(ESI+)C39H36O12Na+计算值[M+Na]+719.2104,测定值719.2036.
化合物138*
向化合物137*(2.14g,3.07mmol)在DCM(30mL)中的溶液中加入溶于乙酸(2.4mL,41.9mmol)和吡啶(3.6mL,44.5mmol)的水合肼(0.394g,12.29mmol)的溶液。将得到的反应混合物在室温搅拌2h。通过添加丙酮(3mL)猝灭反应，真空蒸发溶剂，得到粗产物(保留一些吡啶)。通过采用硅胶的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到产物，为白色泡沫体(1.79g,97％)。HRMS(ESI+)C34H30O10Na+计算值[M+Na]+621.1737,测定值621.1672.
化合物139*
/>
向化合物4*(2.5g,3.89mmol)在DCM(60mL)中的溶液中加入MS,Ph2SO(1.15g,5.68mmol)和2,4,6-三叔丁基嘧啶(2.6g,10.47mmol)，将该混合物搅拌20min。将该反应混合物冷却至-78℃。加入Tf2O(1.8g,6.37mmol)，将该反应混合物在相同温度搅拌20min，然后滴加溶于10mL DCM的化合物138*。将该反应混合物温热至-50℃，历时3h，然后用三乙胺(3mL)猝灭。用DCM(50mL)稀释该反应混合物，用盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥有机层。采用自动化纯化、应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化粗混合物。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到产物，为无色油状物(3.05g,90％)。HRMS(ESI+)计算值C66H70O15Na+[M+Na]+1153.4392,测定值1153.4268.
化合物140*
在2x50mL falcon管(由于体积较大分入2支试管的溶液)中向化合物139*(3g,2.65mmol)在THF(40mL)的溶液中加入HF·py(21mL,21mmol)，将该反应体系在室温搅拌2h。原料完全耗尽后(TLC)，用三乙胺(5mL)猝灭反应，用DCM(30mL)稀释，用饱和NaHCO3(20mL)和盐水(20mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，真空除去溶剂。采用自动化纯化系统(Combiflash)，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化油性残余物。从饱和产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到产物，为无色油状物(2.4g,91％)。
化合物141*
将苯甲酸酐(0.66g,2.91mmol)和三乙胺(1.96g,19.37mmol)加到二醇140*(2.4g,2.42mmol)在DCM(48mL)中的溶液中，将该反应体系在室温搅拌过夜。用DCM(30mL)稀释该反应体系，用饱和NaHCO3(20mL)洗涤。分离各层，用DCM(2x30mL)萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。采用自动化纯化系统(combiflash)，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化残余物。合并包含产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(2.4g,90％)。HRMS(ESI+)C65H58O16Na+计算值[M+Na]+1117.3623,测定值1117.3515.
化合物142*
向化合物9*(2.216g,3.29mmol)和化合物141*(2.4g,2.191mmol)在甲苯：二噁烷(3：1,40mL)中的溶液中加入MS，将该混合物在室温搅拌1h。然后加入NIS(0.986g,4.38mmol)，将该反应混合物冷却至0℃。加入TMSOTf(0.049g,0.219mmol)中的溶液中，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。用三乙胺(3mL)猝灭反应，用DCM(70mL)稀释，用Na2SO3和饱和NaHCO3萃取。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂。通过采用硅胶的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为淡黄色固体(3.27g,91％)。HRMS(ESI+)C99H90O22Na+计算值[M+Na]+1654.5855,测定值1654.5658.
化合物143*
在0℃将硝酸铈铵(249mg,0.453mmol)加到化合物142*(370mg,0.227mmol)在ACN/H2O(8：1,4.5mL)中的溶液中。将该反应混合物在相同温度搅拌20min，温热至室温。4h后，在0℃再加入等份的CAN(100mg,0.182mmol)，将该反应混合物在相同温度搅拌30min。30min后，用DCM(20mL)稀释该反应体系，用盐水(10mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂(水浴～35℃)。采用自动化纯化系统，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化残余物。合并包含产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为黄色油状物(275mg,79％)。HRMS(ESI+)C92H84O21Na+计算值[M+Na]+1548.5436,测定值1548.5278.
化合物144*
将Cs2CO3(141mg,0.433mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基-亚氨代乙酰氯(135mg,0.649mmol)加到乳醇143*(330mg,mmol)在DCM(10mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过TLC监测。2小时后，全部原料耗尽，将该反应体系通过硅藻土过滤，用DCM(20mL)洗涤。蒸发溶剂，通过采用硅胶的柱色谱法纯化残余物(乙酸乙酯/环己烷+1％Et3N)。合并包含通过TLC的产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(310mg,84％)。
化合物145*
将化合物144*(250mg,0.147mmol)和化合物132*(137mg,0.134mmol)溶于DCM(5mL)，加入M，搅拌30min。将该反应混合物冷却至-30℃，加入TMSOTf(6mg,0.028mmol)，将该反应体系温热至-5℃，历时3h。通过添加三乙胺(0.5mL)猝灭反应，用DCM(20mL)稀释，用饱和NaHCO3洗涤。用Na2SO4干燥有机相，蒸发溶剂，得到油状残余物。通过自动化纯化系统、采用硅胶纯化粗反应混合物(乙酸乙酯/环己烷)。合并包含通过TLC的产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(259mg,76％)。
化合物146*
在0℃在氩气气氛中在10mL RBF中向化合物145*(255mg,0.101mmol)在DCM：MeOH(4：1,2mL)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。将该反应混合物在室温搅拌2h 40min。通过TLC监测反应(EtOAc的环己烷溶液,2：1)。用DCM(10mL)稀释反应体系，用NaHCO3(5mL)饱和猝灭。用饱和NaHCO3(5mL)和盐水(5mL)洗涤有机层。用Na2SO4(0.2g)干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液15min，得到粗产物。通过采用硅胶的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到无色油状物(120mg,50％)。HRMS(ESI+)C140H137N3O33Na+计算值[M+Na]+2411.9066,测定值2411.8844.
化合物147*
将化合物95*(54mg,0.070mmol)和化合物146*(84mg,0.035mmol)与甲苯共蒸发，保持在真空中过夜。然后将该混合物溶于DCM(5mL)，加入MS，搅拌30min。将该反应混合物冷却至-50℃，加入TMSOTf(6mg,0.028mmol)，将该反应混合物温热至-5℃，历时4h。通过添加三乙胺(0.03mL)猝灭反应。过滤该反应混合物，蒸发溶剂得到油状残余物。通过自动化纯化系统、采用硅胶纯化粗反应混合物(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物，为无色油状物(80mg,77％)。HRMS(ESI+)C174H163N3O42Na+计算值[M+Na]+2411.9066,测定值2411.8844.
化合物148*
将甲醇钠的MeOH溶液25％w/w(0.12mL,0.539mmol)加到六糖147*(80mg,0.027mmol)在MeOH：THF混合物(2：1,3mL)中的溶液中。将该反应体系在相同温度搅拌20h。通过添加AcOH(0.2mL)猝灭反应，蒸发溶剂。使粗物质上isolute。通过硅胶色谱法纯化，采用如下洗脱剂顺序：1)环己烷，2)乙酸乙酯，和3)MeOH的DCM溶液5％，蒸发溶剂后得到产物，为白色油状物(44mg,90％)。C97H119N3O31Na+计算值[M+Na]+1845.7759,测定值1845.7556.
化合物149*
将六糖148*(40mg,0.022mmol)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物(1：0.8：0.2,2mL)。加入PdC(40mg,0.038mmol)，用氢气吹扫该反应混合物(5次)，将该反应体系在氢气压力(5巴)下搅拌22h。然后采用H2O：ACN(1：1)将该反应混合物通过PTFE滤器过滤，用旋转蒸发器蒸发有机溶剂，冻干粗物质，通过SepPack、采用miliQ H2O纯化粗产物，得到产物，为白色固体(17mg,72％)。C41H74NO31计算值[M+H]+1076.4245,测定值1076.4123。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.08-5.04(m,2H)，4.94(d,J＝3.9Hz,1H)，4.90(d,J＝3.7Hz,1H)，4.88-4.81(m,2H)，4.18(dd,J＝5.4,2.9Hz,1H)，4.14(dd,J＝8.5,3.0Hz,1H)，4.11-3.84(m,13H)，3.83-3.37(m,22H)，2.85(t,J＝7.54Hz 1H)，1.62-1.43(m,2H)，1.38-1.23(m,1H)。13CNMR(101MHz,D2O)δ109.5,109.1,100.3,100.2,98.4,84.7,82.3,81.0,80.5,79.8,78.3,78.2,76.9,76.6,76.1,72.1,71.9,70.9,70.7,70.6,70.1,69.2,69.2,69.0,68.7,68.1,67.9,67.9,62.9,62.8,60.6,60.4,60.0,39.5,28.2,26.6,22.5.
化合物149a-l*
如图12中所示，按照与化合物149*类似的方式由化合物4*和相应的醇制备了化合物149a-l*。
A-7-3肺炎克雷伯菌半乳聚糖-III九糖的制备
化合物150*
在0℃在氩气气氛中在25mL RBF中向化合物142*(500mg,0.306mmol)在DCM：MeOH(4：1,3.75mL)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(348mg,1.532mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h。通过TLC监测反应(EtOAc的环己烷溶液,2：1)。用DCM(10mL)稀释反应体系，用饱和NaHCO3(5mL)猝灭。用饱和NaHCO3(5mL)和盐水(5mL)洗涤有机层。用Na2SO4(0.2g)干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液，得到粗产物。通过采用硅胶的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到无色油状物(350mg,77％)。C88H82O22Na计算值[M+Na]+1514.5229,测定值1514.5256.
化合物151*
/>
在氩气气氛中在25mL RBF中向三糖150*(340mg,0.228mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入乙酰丙酸(119mg,1.026mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(197mg,1.026mmol)和DMAP(84mg,0.684mmol)。在室温搅拌得到的反应混合物。通过TLC监测反应。5h后，反应未进行完全。用DCM(10mL)稀释该反应混合物，用盐水(5mL)洗涤。用DCM(1x5mL)萃取水层。用Na2SO4(0.2g)干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液，得到粗产物。通过自动化快速色谱法纯化粗产物，采用EtOAc的环己烷溶液作为洗脱剂。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到白色油状物(260mg,72％)。
化合物152*
在0℃将硝酸铈铵(179mg,0.327mmol)加到化合物151*(260mg,0.164mmol)在ACN/H2O(8：1,3.3mL)中的溶液中。将该反应混合物在相同温度搅拌20min，温热至室温。4h后，在0℃再加入等份的CAN(100mg,0.182mmol)，将该反应混合物在相同温度搅拌30min。30min后，用DCM(20mL)稀释该反应体系，用盐水(10mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，用旋转蒸发器浓缩溶剂(水浴～35℃)。采用自动化纯化系统，应用硅胶(乙酸乙酯/环己烷)纯化残余物。合并包含产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为黄色油状物(209mg,86％)。HRMS(ESI+)C86H82O23Na+[计算值M+Na]+1505.5145,测定值1505.5186.
化合物153*
将Cs2CO3(115mg,0.354mmol)和2,2,2-三氟-N-苯基-亚氨代乙酰氯(49mg,0.236mmol)加到乳醇152*(175mg,0.118mmol)在DCM(20mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过TLC监测。2小时后，全部原料耗尽，将该反应体系通过硅藻土过滤，用DCM(2mL)洗涤。蒸发溶剂，通过采用硅胶的柱色谱法纯化残余物，乙酸乙酯/环己烷+1％Et3N作为洗脱剂。合并包含通过TLC的产物的试管，蒸发溶剂，得到产物，为无色油状物(188mg,96％)。
化合物154*
将三糖153*(69mg,0.042mmol)和化合物146*(50mg,0.021mmol)与甲苯共蒸发，保持在真空中1h。然后将该混合物溶于DCM(1.5mL)，加入MS，搅拌30min。将该反应混合物冷却至-50℃，加入TMSOTf(5μL,0.028mmol)，将该反应体系温热至-10℃，历时4h。通过添加三乙胺(0.03mL)猝灭反应。过滤该反应混合物，蒸发溶剂，得到油状残余物。通过自动化纯化系统、采用硅胶纯化粗反应混合物(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物，为无色油状物(50mg,62％)。HRMS(ESI+)C226H217N3O55Na+计算值[M+Na]+3877.4240,测定值3877.3947.
化合物155*
向化合物154*(100mg,0.026mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入溶于乙酸(0.04mL)和吡啶(0.06mL)的水合肼(8.14μL)的溶液。将得到的反应混合物在室温搅拌2h。通过添加丙酮(0.3mL)猝灭反应，真空除去溶剂，得到粗产物。通过自动化快速色谱法纯化粗产物，采用EtOAc的正己烷溶液(0-80％)作为洗脱剂。从包含产物(基于TLC)的试管中真空浓缩溶剂，得到白色油状物(97mg,100％)。HRMS(ESI+)C221H211N3O53Na+计算值[M+Na]+3779.3873,测定值3779.3708.
化合物156*
将化合物95*(25mg,0.033mmol)和化合物155*(50mg,0.013mmol)与甲苯共蒸发，保持在真空中30min。然后将该混合物溶于DCM(2mL)，加入MS，搅拌30min。将该反应混合物冷却至-50℃，加入TMSOTf(5μL,0.028mmol)，将该反应体系温热至-5℃，历时2h。通过添加三乙胺(0.03mL)猝灭反应。过滤该反应混合物，蒸发溶剂，得到油状残余物。通过自动化纯化系统、采用硅胶纯化粗反应混合物(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物，为无色油状物(27mg,47％)。LRMS(ESI+)C255H237N3O62Na+计算值[M+Na]+4358.5483,测定值4358.5.
化合物157*
将甲醇钠的MeOH溶液25％w/w(0.025mL,0.115mmol)加到化合物156*(25mg,5.77μmol)在MeOH：THF混合物(2：1,1.5mL)中的溶液中。将该反应体系在相同温度搅拌60h。通过添加AcOH(0.1mL)猝灭反应，蒸发溶剂。使粗物质上isolute。通过硅胶色谱法纯化，采用如下洗脱剂顺序：1)环烷基，2)乙酸乙酯，和3)MeOH的DCM溶液5％，蒸发溶剂后得到产物，为白色油状物(13mg,84％)。
化合物158*
将九糖157*(13mg,4.87μmol)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物(1：0.8：0.2,1.4mL)。加入PdC(12mg,0.011mmol)，用氢气吹扫该反应混合物(5次)，将该反应体系保持在氢气压力(5巴)下22h。然后采用H2O：ACN(1：1)将该反应混合物通过PTFE滤器过滤，用旋转蒸发器蒸发有机溶剂，冻干粗物质。通过SepPack、采用miliQ H2O纯化粗产物，得到产物，为白色固体(5.6mg,74％)。C59H103NO46计算值[M+H]+1561.5751,测定值1562.5728。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.23-5.17(m,3H)，5.10-5.06(m,2H)，5.04(d,J＝3.7Hz,1H)，5.02-4.94(m,3H)，4.37-4.27(m,4H)，4.26-4.13(m,8H)，4.12-3.98(m,11H)，3.98-3.62(m,32H)，3.59-3.52(d,J＝9.8Hz,1H)，2.99(t,J＝7.5Hz,2H)，1.75-1.61(m,4H)，1.53-1.38(m,2H)。
化合物158a-l*
如图12中所示，按照与化合物158*类似的方式由化合物4*和相应的醇制备了化合物158a-l*。
A-8肺炎克雷伯菌O2a(半乳聚糖-I)糖的制备
化合物159*
将化合物44*(35mg,0.028mmol)采用无水甲苯分别共沸真空干燥。在室温将其溶于DCM(2mL)，向其中加入4A分子筛，搅拌10min。向其中加入5-N-羧基苄基-N-苄氨基戊醇(18.33mg,0.056mmol)(净)，在室温在N2气氛中搅拌10min。用冰-CAN浴将RM冷却至-20℃，将TMSOTf(1.2mg,5.60μmol)加到RM中，在-20℃搅拌RM 5min，缓慢地温热至2℃，历时1h。TLC分析显示存在新的明显斑点，且不存在供体物质。因此，用NaHCO3溶液(5mL)使RM猝灭，分离各层。用盐水溶液(5mL)洗涤水层、有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物，采用Biotage硅胶柱纯化，使用EtOAc和环己烷作为洗脱剂，得到产物，为无色层状物(21.4mg,55％)。
化合物160*
在室温将化合物159*(21mg,0.015mmol)溶于THF-MeOH(2mL)，向其中加入NaOMe的甲醇溶液(0.605mL,0.0302mmol)，持续搅拌18h。TLC分析(30％EA/CHx)显示不存在SM且存在极性斑点。因此，真空蒸发RM。用EA(5mL)和水(5mL)稀释。用AcOH酸化至中性pH(～0.3mL)。用EA(5mLX3)萃取。用盐水溶液(5mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发，得到粗产物，为淡黄色层状物(11.7mg,80％)。
化合物161*
将化合物160*(11mg,0.011mmol)溶于DCM：tBuOH：H2O的混合物(1：1：0.2,2.2mL)，向其中加入Pd/C(1mg,0.011mmol)在丁醇(0.2mL)中的混悬液，在～10巴H2气氛中氢化23h。将RM通过PTFE滤器过滤，用甲醇(2mLX3)、50％甲醇水溶液(2mLX3)洗涤。真空浓缩滤液，得到无色层状物。1H nmr显示分子上仍然存在一个苄基，因此，再使用水和丁醇作为溶剂和10mg Pd/C使该物质进行氢化14h。将RM通过PTFE滤器过滤，用甲醇(2mLX3)、50％甲醇水溶液(2mLX3)洗涤。真空浓缩滤液，得到无色层状物(2.7mg,56％)。LRMS(ESI+)C17H33NO11H+计算值[M+H]+428.2132,测定值428.2037.
化合物162*
将化合物54*(500mg,0.250mmol)和化合物56*(651mg,0.30mmol)一起溶于RBF，采用无水甲苯共沸真空干燥。将该混合物在室温溶于DCM(20mL)，向其中加入4A分子筛，搅拌30min。采用冰-丙酮浴将RM冷却至-10℃，向RM中加入TMSOTf(9.20μL,0.05μmol)，在-10℃搅拌RM 5min，缓慢地温热至5℃，历时1h。TLC分析(30％EA/CHx)显示反应完成，且不层状受体SM，而层状适度极性的斑点。在10℃用NaHCO3溶液(2mL)使RM猝灭，分离各层，干燥有机层(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。通过采用EA/CHx的硅胶柱色谱法纯化，得到包含产物的级分，真空蒸发时得到期望的产物(890mg,89％)。MALDI-TOF C235H220NaO57Si计算值[M+Na]+4004.3983,测定值4007.795.
化合物163*
根据通用方案B使化合物162*进行TDS去除反应：
得到产物163*，为白色松散固体(617mg,97％)。
MALDI-TOF C227H202NaO57 +计算值[M+Na]+3862.2806,测定值3864.889.
化合物164*
根据通用方案B，在2,2,2-三氟-N-苯基-亚案代乙酰氯存在下将化合物163*转化成亚氨酸酯164*。
得到产物，为白色松散固体(625mg,定量)。
MALDI-TOF C235H206F3NNaO57 +计算值[M+Na]+4033.3101,测定值4037.043.
化合物165*
根据通用方案B，通过糖基化反应由5-叠氮基戊醇和化合物164*得到了化合物165*：
得到产物，为白色树胶状固体(310mg,79％)。
MALDI-TOF C232H212N3O57 +计算值[M+H]+3951.3783,测定值3954.175.
化合物165L1-L10*
根据通用方案B，通过糖基化反应由化合物164*和相应的醇制备了化合物165L1-L10*：
L1：
白色固体层状物,16mg,64％
MALDI-TOF C239H226NaO58+计算值[M+Na]+4046.4633,测定值4046.458.
白色固体层状物,23.4mg,95％
MALDI-TOF C235H218N3O60+计算值[M+H]+4041.4100,测定值4041.378.
白色固体层状物,23.7mg,96％
MALDI-TOF C234H214NaO59+计算值[M+Na]+3990.3643,测定值3990.379.
白色固体层状物,23.9mg,98％
MALDI-TOF C233H212NaO59+计算值[M+Na]+3976.3486,测定值3979.155.
白色固体层状物,22mg,85％
MALDI-TOF C241H229N3NaO63计算值[M+Na]+4195.4705,测定值4195.435.
白色固体层状物,24mg,99％.
MALDI-TOF C232H212NaO58+计算值[M+Na]+3948.3537,测定值3950.639.
白色固体层状物,16.5mg,67％
MALDI-TOF C231H209N3NaO58+计算值[M+Na]+3975.3395,测定值3977.916.
白色固体层状物,21.4mg,86％
MALDI-TOF C237H221N3NaO57+计算值[M+Na]+4043.4385,测定值4043.431
白色固体层状物,20.3mg,83％
MALDI-TOF C232H210NaO57+计算值[M+Na]+3930.3432,测定值3933.349.
L10：
白色固体层状物,24mg,98％
MALDI-TOF C231H209ClNaO58+计算值[M+Na]+3968.2991,测定值3969.032.
化合物166*
根据通用方案A使化合物165*进行甲醇分解：
得到产物，为白色树胶状固体(43mg,99％)。
MALDI-TOF C120H147KN3O41 +计算值[M+K]+2324.9147,测定值2327.888.
化合物167*
根据通用方案A使化合物166*进行氢化反应：
得到产物，为白色松散固体(8mg,64％)。
1H NMR(400MHz,氧化氘)δ5.06(s,3H)，4.93(s,3H)，4.90(d,J＝3.5Hz,1H)，4.88(d,J＝1.8Hz,1H)，4.32-4.22(m,3H)，4.15-4.06(m,4H)，4.04-3.42(m,43H)，2.91-2.78(m,2H)，1.52(dp,J＝13.9,7.2,6.6Hz,4H)，1.29(p,J＝7.7,7.1Hz,2H)。
HRMS(ESI+)C53H94NO41 +计算值[M+H]+1400.5301,测定值1400.5381.
化合物168*
根据通用方案A使化合物165*进行Nap-脱保护反应：
得到产物，为白色松散固体(153mg,88％)。
MALDI-TOF C221H204N3O57+计算值[M+H]+3811.3157,测定值3812.015.
化合物169*
根据通用方案B，通过糖基化反应由化合物168*和化合物56*得到了化合物169*：
得到产物，为白色松散固体(43mg,70％)。
MALDI-TOF C340H307KN3O85+计算值[M+K]+5829.9430,测定值5834.474.
化合物170*
根据通用方案B，通过糖基化反应由化合物168*和化合物164*得到了化合物170*：
得到产物，为白色松散固体(105mg,58％)。
MALDI-TOF C448H403KN3O113+计算值[M+K]+7670.5518,测定值7670.338.
化合物171*
根据通用方案B使化合物170*进行甲醇分解：
得到产物，为白色树胶状固体(29mg,79％)。
MALDI-TOF C224H276N3O81+计算值[M+H]+4303.7570,测定值4305.070.
化合物172*
根据通用方案A使化合物171*进行氢化反应：
得到产物，为白色松散固体(4.8mg,77％)。
1H NMR(400MHz,氧化氘)δ5.27-5.17(m,7H)，5.04(d,J＝19.4Hz,9H)，4.43-4.38(m,7H)，4.30-4.00(m,31H)，4.00-3.55(m,60H)，2.98(t,J＝7.6Hz,2H)，1.66(dp,J＝13.4,7.3,6.6Hz,4H)，1.50-1.36(m,2H)。
MALDI-TOF C101H174NNaO812+计算值[M+Na+H]2+1359.4827,测定值1359.4820.
化合物173*
根据通用方案A使化合物170*进行Nap-脱保护反应：
得到产物，为白色松散固体(77mg,78％)。
MALDI-TOF C437H395N3O113+计算值[M+H]+7492.5333,测定值7496.204.
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B糖缀合物的制备和表征
使KPC合成抗原52*、61*、66*、69*、75*、81*、88*、91*、99*、120*、123*、149*和158*与载体蛋白CRM197(XX-CRM197)缀合用于免疫接种实验以及与作为包被抗原的牛血清白蛋白(BSA；(XX-BSA)缀合用于ELISA，根据如下所述方法。
通用缀合方案
步骤1：PNP-酯合成
在室温在8mL小瓶中将化合物化合物52*、61*、66*、69*、75*、81*、88*、91*、99*、120*、123*、149*或158*(1eq)溶于DMSO或DMSO-吡啶或DMSO-H2O。将活化的己二酸双-(4-硝基苯基)酯(20eq)加入其中，并搅拌5分钟。加入三乙胺(50eq)，并将该反应混合物在室温搅拌3-5h。用液氮冷冻反应混合物，然后冻干18h至干，得到浅黄色粗产物以及过量的试剂。粗产物用足量的CHCl3和随后的DCM充分洗涤以除去过量的试剂。干燥固体对硝基苯基(PNP)酯，并且进行下一步。
步骤2：与蛋白质缀合
缀合方法：将在50μL 0.15M NaCl的NaPi缓冲液溶液中的52*、61*、66*、69*、75*、81*、88*、91*、99*、120*、123*、149*或158*的PNP酯滴加到NaPi缓冲液中包含CRM197或BSA的反应小瓶中(～150μL)。最终用50μL缓冲溶液冲洗小瓶，然后将其完全转移到反应小瓶中。因此，使得小瓶中的反应体积～200μL。反应混合物变为黄色，并在r.t.搅拌反应混合物24h。将缀合溶液转移到Ultra-0.5mL离心滤器中，在2-8℃下离心6分钟。向反应小瓶中加入300μL缓冲液，冲洗并转移至滤器中且再次离心。使用1X PBS溶液再进行洗涤，并离心直至黄色消失，且缀合物变为澄清溶液。最终洗涤后，将缀合物储存在2-8℃在1XPBS溶液中。
通过SDS-PAGE、SEC色谱和MALDI分析来分析缀合物。发现不同抗原为1-15。通过使用MALDI分析扣除缀合蛋白与未结合蛋白之间的质量来具体计算糖在载体上的载量。按照制造方案，使用微量BCA方法估算蛋白质含量。
SDS-PAGE分析
将样品在微量离心管中混合，并在热循环仪上于95℃加热5min。冷却至室温5min后，将约2.5μg样品与10μL标记物分别上样至10％聚丙烯酰胺凝胶的孔中。将样品在120V恒定电压下运行1h。根据制造说明使用GelCodeTM蓝色安全蛋白染色剂进行染色。将凝胶用去离子水洗涤过夜，并使用凝胶记录系统扫描(参见图5)。
糖缀合物的尺寸排阻色谱法(SEC)
通过SEC分析用于免疫接种研究的糖缀合物，以观察缀合与未缀合的CRM蛋白之间的质量差异。将样品在50mM Tris,20mM NaCl,PH 7,2中稀释，并在配备Tosoh TSK G2000柱(SWxl,7.8mm x 30cm,5μm)和Tosoh保护柱(SWxl 6.0mm x 4cm,7μm)的Agilent1100 HPLC系统上运行。将流速保持在1mL/min(参见图6)。
糖缀合物61*-CRM197和158*-CRM197的表征
分析了用于免疫接种研究的KPC抗原糖缀合物61*-CRM197和158*-CRM197的缀合效率和抗原含量。糖缀合物的MALDI分析揭示出非常良好的缀合效率。缀合和未缀合的CRM197蛋白之间的质量差异对不同糖缀合物产生了3-10个抗原/CRM197分子的载量。
还通过10％SDS-PAGE和SEC分析了糖缀合物，揭示出与未缀合的CRM197蛋白相比明显的质量转移(图5和图6)。
C免疫接种研究
材料：
·ELISA板(高结合率,EIA/RIA板,9孔,平底，具有低蒸发盖,公司：3361)
·检测抗体：山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(Sigma,#A4914)和山羊抗小鼠IgG(H+L)过氧化物酶缀合物(Dianova代码：115-035-068)。
·封闭溶液：1％在PBS中的FCS(v/v)。
·抗体稀释剂：PBS+1％BSA(w/v)。
·洗涤缓冲液：PBS+0.1％吐温20(PBS-T)
·展开溶液：1StepTM Ultra TMB-ELISA展开剂。(ThermoScientific,Cat#：34028)
·终止溶液-2M硫酸(H2SO4)。
·平板读出器：Anthos HT 2.
·软件：用于吸光度测定的WinRead 2.36和用于数据绘图和分析的GraphPadPrism 7.
·明矾：氢氧化铝凝胶佐剂(2％)，Brenntag,批号：5447Exp Dt：2020年2月.
·弗氏不完全佐剂(IFA)。InvivoGen；目录号：vac-ifa-10,批号：IFA-39-03；ExpDt：2019年9
·QuantiProTM BCA测定试剂盒(SIGMA)产品：QPBCA-1KT；批号：SLBR7451V；Pcode：1002296464
·小型-TGXTM Gels-10％,10孔(30μL/孔)对照号：64175708,
·Precision Plus Dual Color,目录号：1610374；对照号：641798899
·GelCodeTM蓝色安全蛋白染色剂；ThermoScientific；参考号：1860957；批号：TA260266
·肺炎克雷伯菌LPS.SIGMA-L4268；批号：116M 4057V
方法：
1.细菌菌株和LPS.
有/没有囊的LPS(O-抗原)不同的肺炎克雷伯菌(KPC)菌株用于分离和纯化相应的LPS。纯化的LPS在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用作包被抗原。O2a,c LPS购自Sigma-Aldrich。
表1.用于LPS分离的肺炎克雷伯菌菌株
# LPS/O-抗原
1 O1
2 O2a
3 O2a,c
4 半乳聚糖-III
2.用于免疫接种的疫苗制剂。
用氢氧化铝佐剂(明矾)配制糖缀合物配用于小鼠研究，并且用弗氏不完全佐剂(IFA)配制用于兔免疫接种。
2.1明矾中的制剂。
所有制剂均在无菌条件下制备。将糖缀合物(DS)和PBS以适当的预先计算的比例在相当于最终制剂体积的50mL FalconTM管中混合，省去了所需的明矾体积(0.25mg/mL)。这形成了DS-PBS混合物。每只动物的抗原/DS剂量保持在5μg/100μL/动物。使用血清移液器将DS-PBS混合物适度混合(5X)。对于DS-PBS混合物，将加入相应体积的明矾原液(10mg/mL)，得到最终明矾比为1：40或0.250mg/mL。通过使用5mL血清移液管轻轻移液(20X)将混合物即刻混合。封盖FalconTM管，用包裹，并在室温(RT)在振动器上以250rpm混合2h。在2h的温育时间之后，将制剂置于清洁台下，等分，进一步在4℃下储存直至进一步使用为止。
2.2IFA中的制剂。
来自InvivoGen的不完全弗氏佐剂(IFA)用于配制兔免疫接种研究的疫苗。方案遵循按照制造商的规程。抗原：IFA浓度保持在1：1。每只动物的抗原剂量保持在5μg/200μL/动物(100μL抗原+100μL IFA)。将期望的计算体积(最终免疫接种体积的50)IFA放入15mL无菌FalconTM管中。将计算量的稀释抗原溶液(用PBS将体积调节至最终免疫体积的50％的体积)放入配备20G针头的3mL无菌注射器中。将DS溶液加到包含IFA的FalconTM管中，并立即涡旋振荡15秒(5X)。制剂的颜色在涡旋时从浅黄色变为乳白色，这表明形成稳定的乳液。将得到的疫苗制剂短暂涡旋并等分到具有期望剂量体积的2mL无菌试管中。免疫接种前，将包含疫苗制剂的试管涡旋，且然后注入动物体内。
3.3明矾制剂的表征。
表征在明矾中配制的糖缀合物以确定最终明矾浓度和制剂的pH。
3.免疫接种方案：
在特定的无病原体条件下进行小鼠和兔免疫接种，并随意提供食物和水。用疫苗制剂(表2)皮下免疫接种小鼠(n＝6)和兔(n＝4)，注射体积为100μL/只小鼠和200μL/只兔。小鼠的抗原剂量保持在5μg/动物。兔的抗原剂量保持在5μg/动物。在第0、14和28天免疫接种小鼠和兔。相应地，对于小鼠在第-1、7和22天抽血，对于兔在第0、7和21天抽血，以确定抗体滴度。在第35天，处死动物，并采血。
表2.小鼠(n＝6)和兔(n＝4)的免疫接种方案和抗原剂量信息。*采用所述值从PBS/明矾(阴性对照)中扣除小鼠血清分析的全部值。
组 糖缀合物 小鼠/组 兔/组
1 61*-CRM197(O1) 6 0
2 158*-CRM197(Gal-III) 6 4
4.应用自身抗原包被的平板的血清的酶联免疫吸附测定法(ELISA)：
用抗原包被平板：
将缀合物61*-BSA和158*-BSA以及LPS#1-#4用作包被抗原。将LPS溶于异丙醇，浓度为10/20μg/mL。用100μL的溶液包被每个孔，得到包被浓度为1-2μg/孔。将LPS溶液装入孔中，使其在r.t.在无菌工作台内过夜蒸发。对于缀合物61*-BSA和158*-BSA，将相应的缀合物以5μg/mL的浓度溶于pH 7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)中。每孔包被100μL涂层，在4℃下温育过夜，得到抗原浓度0.5μg/孔。
洗涤：
抗原吸附过夜后，将板用PBS-T(200μL/孔)洗涤1次，然后将板倒置并在干净的干纸巾上轻拍以除去每孔过量的流体。
封闭：
用200μL商品封闭溶液封闭平板，并在室温温育2h。
洗涤：
封闭后，将板用PBS-T(200μL/孔)洗涤3次，然后通过翻转板并通过用洁净的干纸巾轻拍除去每孔过量的流体。
血清稀释和温育：
将来自不同实验组的不同时间点的合并血清(n＝4只兔或n＝6只小鼠/组)在抗体稀释剂(PBS+1％BSA)中稀释至其相应的稀释度。将100μL不同实验组的稀释血清样品一式两份添加到相应的孔中，在设定为250rpm的振荡器上于RT温育2h。100μL/孔的抗体稀释剂(PBS+1％BSA)形成实验空白。与血清一起温育后，将板用PBS-T(200μL/孔)洗涤4次。然后，通过将板倒置并用干净的干纸巾轻拍除去每孔过量的流体。
温育(检测抗体)：
将相应的检测抗体、抗兔或抗小鼠IgG HRP缀合物在抗体稀释剂(PBS+1％BSA)中按1：10,000稀释，加入100μL/孔，在室温在振荡器上以250rpm温育1h。与检测抗体一起温育后，将板用PBS-T(200μL/孔)洗涤5次，通过将板倒置并用干净的干纸巾轻拍除去每孔过量的流体。
底物添加：
向每个孔中加入100μL随时可用的TMB(3,3,’,5,5’-四甲基联苯胺)底物(从4℃标准化至r.t.)，并在黑暗中温育15minh。通过加入50μL/孔的2MH2SO4溶液终止酶促反应的蓝色，从而得到黄色的溶液。使用平板读出器在450nm处测量黄色溶液的吸收。
结果：
通过使用GraphPad Prism软件制图来分析了吸收值。
结果
来自61*-CRM197、158*-CRM197或167*-CRM197免疫接种的小鼠的血清识别了相应的抗原(参见图7)。该172*-CRM197血清还与相应的肺炎克雷伯菌LPS发生了交叉反应。来自158*-CRM197/172*-CRM197免疫接种的兔的血清分别识别了相关BSA缀合物158*-BSA和172-*BSA中的相应O-抗原(参见图10)。来自158*-CRM197免疫接种的兔的血清选择性识别了相应的肺炎克雷伯菌LPS(参见图11)。
本说明书中提供的数据证明，在用本发明的缀合物免疫接种后，在兔和小鼠中引发了抗本发明的寡糖以及抗肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2ac和耐碳青霉烯类的ST258的天然O-多糖的功能性抗体。该抗体与肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O2ac和耐碳青霉烯类的ST258的天然O-多糖(LPS)确实交叉反应，这表明这些抗体与肺炎克雷伯菌结合的潜能和赋予对抗肺炎克雷伯菌感染的防护作用的潜能。
ELISA数据进一步证明，本发明的缀合物具有免疫原性并诱导高抗体滴度。因此，ELISA分析显示，本发明的式(I)的糖在兔和小鼠中具有免疫原性并产生交叉反应性抗体。

Claims (35)

1.具有式(II-4)或(II-8)的糖
(II-4)，或
(II-8),
其中R1表示–H或 ；
–L– 表示–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–或 –La–Ld–Le– ；
–La–表示–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–或–(CH2–CH2–O)o–CH2 ；
–Lb–表示–O–、–NH–CO–NH–、–NH–CO–CH2–NH–、–NH–CO–；
–Ld–表示–(CH2)q–、–(CH(OH))q–、–(CF2)q–、–(CH2–CH2–O)q–C2H4–或–(CH2–CH2–O)q–CH2–；
–Le–表示–(CH2)p1–、–(CF2)p1–、–C2H4–(O–CH2–CH2)p1–、–CH2–(O–CH2–CH2)p1–或–(CH2)p1–O–(CH2)p2– ；且
o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，
E表示–NH2、–N3、–CN、–O–NH2、–CH=CH2、–C≡CH、–Br、–Cl、–I、–CO2R´、–CO–(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、–CO–(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚氨基)、–CONH–NH2、–OH、–SH或 –SAc；
R´表示–H、–Me、–Et、 、/> 或/>；
n为1至20的整数；
m为0至20的整数；
或其药学上可接受的盐，条件是如果–E为–NH2，则L不为–C3H6–。
2.根据权利要求1所述的糖，其中
n是1-10的整数；
m为1至10的整数，
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的糖，其中
–L– 表示–(CH2)o–且o为选自4、5和6的整数，或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求2所述的糖，其中糖具有式(II-4)
(II-4)，
其中R1表示H，
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的糖，其中n是从3到10的整数，且m是1，或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的糖，其中所述糖是选自包含以下的所述组：
化合物167*;或
化合物172*; 或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的糖，其中糖是
化合物172*;或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的糖，其中糖是
化合物158*;或其药学上可接受的盐。
9.具有式(III-4)或(III-8)的缀合物：
(III-4)，或
(III-8)，
其中
n表示1至20的整数；
m表示1至20的整数；
i为选自2至25；
R1表示–H或 ；
–E1–表示共价键、–NH–、–O–NH–、–O–、–S–、–CO–、–CH=CH–、–CONH–、–CO–NHNH–、 、/> 、/>或/>；
–T–表示、/>或/>；
a表示1至10的整数；
b表示1至4的整数；
–L– 表示–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–或 –La–Ld–Le– ；
–La–表示–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–或–(CH2–CH2–O)o–CH2 ；
–Lb–表示–O–、–NH–CO–NH–、–NH–CO–CH2–NH–、–NH–CO–；
–Ld–表示–(CH2)q–、–(CH(OH))q–、–(CF2)q–、–(CH2–CH2–O)q–C2H4–或–(CH2–CH2–O)q–CH2–；
–Le–表示–(CH2)p1–、–(CF2)p1–、–C2H4–(O–CH2–CH2)p1–、–CH2–(O–CH2–CH2)p1–或–(CH2)p1–O–(CH2)p2– ；且
o、q、P1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数
CP为载体蛋白，其选自包含以下各项或由以下各项组成的组：白喉类毒素，突变的白喉类毒素，修饰的白喉类毒素，突变和修饰的白喉类毒素，破伤风类毒素，修饰的破伤风类毒素，突变的破伤风类毒素，外膜蛋白(OMP)，牛血清白蛋白(BSA)，镇眼帽贝血蓝蛋白(KLH)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的重组无毒形式或霍乱类毒素(CT)。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中
n表示1至10的整数；且
m表示1至10的整数。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的缀合物，其中–L–表示–(CH2)o–，且o是选自4、5、6的整数。
12.根据权利要求9-10中任一项所述的缀合物，其中缀合物具有式(III-4)：
(III-4)， 其中R1是H。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中n是从3到10的整数，且m是1。
14.根据权利要求9所述的缀合物，其中该缀合物具有式(V-1*)或(V-4)：
(V-1*)；或
(V-4)。
15.根据权利要求9-10任一项所述的缀合物，其中
a 是选自2、3、4、5和6的整数。
16.根据权利要求9-10任一项所述的缀合物，其中
E1是共价键，–NH–、–CH=CH–、–CONH–、或/>。
17.根据权利要求14所述的缀合物，其中
n表示1至10的整数；且
m表示1至10的整数。
18.根据权利要求14所述的缀合物，其中–L–表示–(CH2)o–，且o是选自4、5、6的整数。
19.根据权利要求14所述的缀合物，其中缀合物具有式(V-4)：
(V-4)， 其中R1是H。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中n是从3到10的整数，且m是1。
21.根据权利要求14所述的缀合物，其中i是选自2-18的整数。
22.根据权利要求14所述的缀合物，其中i是选自4-10的整数。
23.根据权利要求9-10任一项所述的缀合物，其中i是选自2-18的整数。
24.根据权利要求9-10任一项所述的缀合物，其中i是选自4-10的整数。
25.以下式的缀合物：
，
其中i是选自2-25的整数。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其是以下式：
，
其中i是选自2-18的整数。
27.根据权利要求25所述的缀合物，其是以下式：
，
其中i是选自4-10的整数。
28.以下式的缀合物：
。
29.以下式的缀合物：
，
其中i是选自2-25的整数。
30.根据权利要求29所述的缀合物，其是以下式：
，
其中i是选自2-18的整数。
31.根据权利要求29所述的缀合物，其是以下式：
，
其中i是选自4-10的整数。
32.以下式的缀合物：
。
33.药物组合物，它包含根据权利要求中1 – 8任一项的至少一种糖和/或根据权利要求9 – 32中任一项的至少一种缀合物作为活性成分以及至少一种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
34.根据权利要求1 – 8中任一项的糖、根据权利要求9 – 32中任一项的缀合物或根据权利要求33的药物组合物用于制造用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌相关的疾病的药物的用途，其中该疾病为脑膜炎、尿道感染、医院性肺炎、腹腔内感染、伤口感染、血液感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎。
35.根据权利要求34中所述的糖、缀合物或药物组合物用于所述制造使用的药物的所述用途，其中所述的肺炎克雷伯菌选自O-血清型和耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌菌株ST258，所述的O-血清型包含O1、O2a、O2ac、O2aeh、O2afg、O8或由O1、O2a、O2ac、O2aeh、O2afg、O8组成。
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