ES2835712T3

ES2835712T3 - Vacuna contra klebsellia pneumoniae resistente a carbapenémicos

Info

Publication number: ES2835712T3
Application number: ES16716501T
Authority: ES
Inventors: Peter Seeberger; Claney Lebev Pereira; Guozhi Xiao; Naeem Khan; Chakkumkal Anish
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-29
Publication date: 2021-06-23
Anticipated expiration: 2036-03-29
Also published as: US20180078630A1; EP3274358A1; EP3274358B1; WO2016156338A1; US10688169B2

Abstract

Un sacárido sintético de fórmula general (II) **(Ver fórmula)** en donde **(Ver fórmula)** representa un enlace, **(Ver fórmula)** y L representa-(CH2)oy o es un número entero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra klebsellia pneumoniae resistente a carbapenémicos

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a sacáridos de síntesis de fórmula general (I) que están relacionados con polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos y conjugados de los mismos. Dichos conjugados y composiciones farmacéuticas que contienen dichos conjugados son útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos. Además, los sacáridos sintéticos de fórmula general (I) son útiles como marcadores en ensayos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra la bacteria Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

Antecedentes de la invención

[0002] Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram-negativa, anaerobia facultativa, en forma de varilla, colonizadora principalmente de los tractos respiratorio y urinario y provocando infecciones de K. pneumoniae (KPI). KPI es la principal causa de infecciones nosocomiales, que afecta principalmente a pacientes inmunodeprimidos. En los últimos diez años, las infecciones causadas por K. pneumoniae se están convirtiendo en un desafío importante en los entornos sanitarios debido a la aparición de cepas resistentes a casi todos los agentes antimicrobianos disponibles y su diseminación mundial. Infecciones causadas por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos (CRKP) son responsables de altas tasas de morbilidad y mortalidad. Por tanto, la prevención de infecciones causadas por CRKP es muy deseable y la vacunación de grupos de riesgo es el medio más rentable y más poderoso para evitar futuros brotes de CRKP. Aunque durante los últimos 40 años se informó de muchos intentos con el objetivo de desarrollar vacunas eficaces contra K. pneumoniae, hasta el momento no existe una vacuna disponible para uso profiláctico o terapéutico contra las infecciones por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0003] Como la mayoría de las bacterias, K. pneumoniae desarrollan generalmente cápsulas compuestas de polisacáridos complejos en la superficie bacteriana, que son altamente inmunogénicos y no tóxicos. En comparación con las proteínas, los carbohidratos son evolutivamente más estables y se han aprovechado en una serie de vacunas comúnmente empleadas. Cuando se conectan covalentemente a una proteína transportadora, los antígenos de oligosacáridos pueden provocar una protección duradera dependiente de las células T.

[0004] La unidad de repetición del polisacárido capsular de K pneumoniae resistente a carbapenémicos responsables de los brotes ocurridos en 2011 (Carbohydr. Res. 2013, 369, 6-9) y consistes en a-L-Rha-(1^4)-[p-D-Gal-(1^-3)]-a-D-GalA-(1^2)-a-L-Rha-(1^2)-a-L-Rha-(1^-2)-a-L-Rha (ver Figura 1).

[0005] La estructura de la repetición capsular de Klebsiella K19 también se elucidó (Carbohydr. Res. 1986, 157, 13) y se compone de una unidad de repetición de hexasacárido, que estructuralmente difiere de los sacáridos reivindicados en este documento.

Unidad de repetición de polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae K19

[0006] El polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae K19, el polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae K19 sin la ramificación a-L-Rhap y el disacárido aGlc1^3Gal-OH obtenido a través de la hidrólisis parcial de dicho polisacárido capsular se aislaron. Sin embargo, las estructuras aisladas difieren significativamente de los sacáridos reivindicados en la presente solicitud de patente.

[0007] El documento WO 9830224 A1 proporciona una composición para inhibir la producción y respuesta de anticuerpos IgE in vivo que comprende un componente de cápsula de Klebsiella oxytoca y Klebsiella pneumoniae, o un fragmento de las mismas producido por tratamiento de dicha cápsula con un ácido, una base o un agente reductor. Además del hecho de que la cepa 19 Klebsiella oxytoca y Klebsiella pneumoniae tienen una unidad repetitiva de polisacárido capsular que difiere estructuralmente de los sacáridos proporcionados en la presente solicitud de patente, los polisacáridos aislados de WO 9830224 A1 son de hecho mezclas de varios polisacáridos que tienen un peso molecular promedio superior a 1x105 es decir significativamente más alto que los sacáridos de la presente invención.

[0008] El documento EP 0735049 A2 proporciona un proceso para producir un polisacárido que tiene la siguiente unidad de repetición:

a partir de Klebsiella oxytoca TNM-3 que produce polisacáridos. El heteropolisacárido descrito que tiene un peso molecular de 1000 a 10000000 se usa como humectante, agente antiestático, agente formador de película o dispersante. La unidad repetitiva del polisacárido descrita por el documento EP 0735049 A2 se diferencia de la estructura sacárida de los compuestos reivindicados en la presente invención por la presencia de un residuo a-D-Glc en lugar de un residuo a-L-Rha. Además, los polisacáridos aislados del documento EP 0735049 A2 son de hecho mezclas de varios polisacáridos que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 106.

[0009] El objetivo de la presente invención es proporcionar un sacárido sintético bien definido de fórmula general (I) que esté relacionado con polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos y contiene un epítopo de glucano inmunogénico protector, es decir, un epítopo de glucano que provoca anticuerpos que protegen contra enfermedades causadas por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos. Dicho sacárido se puede conjugar con un vehículo inmunogénico para proporcionar un conjugado y una composición farmacéutica del mismo que son útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos. Además, el sacárido sintético de fórmula general (I) es útil como marcador en ensayos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra la bacteria Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0010] El objetivo de la presente invención se resuelve mediante la enseñanza de las reivindicaciones independientes. Otras características, aspectos y detalles ventajosos de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la descripción, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.

Descripción de la invención

Definiciones

[0011] El término "enlazador", como se usa aquí abarca fragmentos moleculares capaces de conectar el extremo reductor de monosacáridos de un sacárido con un portador inmunogénico o un soporte sólido, opcionalmente mediante la unión a al menos una molécula de interconexión. Por tanto, la función del enlazador per se o junto con la molécula de interconexión es establecer, mantener y/o puentear una distancia especial entre el monosacárido del extremo reductor y un portador inmunogénico o un soporte sólido. Más específicamente, una extremidad del enlazador está conectada al átomo de oxígeno exocíclico en el centro anomérico del monosacárido del extremo reductor y la otra extremidad está conectada a través del átomo de nitrógeno con la molécula de interconexión, o directamente con el portador inmunogénico o el soporte sólido.

[0012] Como se usa en este documento, el término "molécula de interconexión" se refiere a una molécula bifuncional que contiene grupo funcional X y el grupo funcional Y, en donde el grupo funcional X es capaz de reaccionar con el grupo amino terminal en el enlazador L y el grupo funcional Y es capaz de reaccionar con una funcionalidad presente en un portador inmunogénico o en un soporte sólido. La Figura 2 muestra ejemplos de moléculas de interconexión disponibles comercialmente, pero no restringe las moléculas de interconexión que se pueden usar de acuerdo con la presente invención a los ejemplos presentados en este documento.

[0013] El término "adyuvante" tal como se utiliza aquí, se refiere a un adyuvante inmunológico es decir, un material utilizado en una composición de vacuna que modifica o aumenta los efectos de dicha vacuna mediante la mejora de la respuesta inmune a un antígeno dado contenido en la vacuna sin ser antigénicamente relacionados con el mismo. Para el experto en la técnica, los ejemplos de adyuvantes reconocidos clásicamente incluyen:

- composiciones que contienen minerales, incluidas sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio. Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., tomando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica. También se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinos. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato de aluminio sulfato). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones y concentraciones de reacción durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal. Pueden emplearse mezclas de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio en la formulación según la presente invención;

- saponinas, que son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. Las saponinas de la corteza del árbol Molina Quillaia saponaria han sido ampliamente estudiadas como adyuvantes. Las saponinas también se pueden obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria oficianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, como QS21, así como formulaciones de lípidos, como ISCOM. Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas que utilizan estas técnicas, que incluyen QS 7, QS 17, QS 18, QS2 1, QH-A, QH-B y QH-C. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, como el colesterol. Se pueden utilizar combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM). Los ISCOM generalmente incluyen un fosfolípido como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. En los ISCOM se puede utilizar cualquier saponina conocida. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC;

- micropartículas (es decir, una partícula de 100 nm a 150 pm de diámetro, más preferiblemente de 200 nm a 30 pm de diámetro, o de 500 nm a 10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos. Dichos materiales no tóxicos y biodegradables incluyen, pero no se limitan a, poli(a-hidroxiácido), ácido polihidroxibutírico, poliortoéster, polianhídrido, policaprolactona;

- ligandos CD1d, tales como una a-glicosilceramida, a-glicosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4Rj-1 -0-(a-D-galactopiranosil)-2-(W-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101,3”-sulfogalactosilceramida;

- oligonucleótidos inmunoestimuladores, tales como motivos CpG que contienen (una secuencia de dinucleótidos que contiene un residuo de citosina no metilado unido por un enlace fosfato a un residuo de guanosina), o motivo Cpl que contiene unos (una secuencia de dinucleótidos que contiene citosina unida a inosina), o un ARN bicatenario, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica, o un oligonucleótido que contiene una secuencia poli(dG). Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o (excepto para el ARN) de hebra sencilla;

- compuestos que contienen lípidos unidos a una cadena principal acíclica que contiene fosfato, como el antagonista de TLR4 E5564;

- emulsiones oleosas (p. ej. adyuvante).

[0014] En teoría, cada molécula o sustancia que sea capaz de favorecer o amplificar una situación particular en la cascada de eventos inmunológicos, conduciendo finalmente a una respuesta inmunológica más pronunciada, puede definirse como un adyuvante.

En principio, mediante el uso de adyuvantes en las formulaciones de vacunas, se puede:

- dirigir y optimizar las respuestas inmunitarias que sean apropiadas o deseables para la vacuna;

- permitir la administración de vacunas a través de la mucosa, es decir, la administración que da como resultado el contacto de la vacuna con una superficie de la mucosa tal como el epitelio bucal o gástrico o pulmonar y el tejido linfoide asociado;

- promover respuestas inmunes mediadas por células;

- mejorar la inmunogenicidad de inmunógenos más débiles, tales como antígenos altamente purificados o recombinantes;

- reducir la cantidad de antígeno o la frecuencia de inmunización necesaria para proporcionar inmunidad protectora; y

- mejorar la eficacia de las vacunas en personas con respuestas inmunitarias reducidas o debilitadas, como los recién nacidos, los ancianos y los receptores de vacunas inmunodeprimidos.

Aunque se sabe poco acerca de su modo de acción, actualmente se cree que los adyuvantes aumentan las respuestas inmunitarias mediante uno de los siguientes mecanismos:

- aumentar la vida media biológica o inmunológica de los antígenos;

- mejorar la entrega de antígenos a las células presentadoras de antígenos (APC), así como el procesamiento y la presentación de antígenos por las APC, por ejemplo, permitiendo que el antígeno atraviese las membranas endosomales en el citosol después de la ingestión de complejos de antígeno adyuvante por APC;

- imitar señales de inducción de peligro de células estresadas o dañadas, que sirven para iniciar una respuesta inmunitaria;

- inducir la producción de citocinas inmunomoduladoras;

- sesgar la respuesta inmunitaria hacia un subconjunto específico del sistema inmunológico; y

- bloquear la rápida dispersión del desafío del antígeno.

[0015] Los sacáridos son conocidos por los expertos en la técnica como antígenos TI-2 (células T independientes-2) e inmunógenos pobres. Por tanto, para producir una vacuna basada en sacáridos, dichos sacáridos se conjugan con un portador inmunogénico para proporcionar un conjugado, que presenta una inmunogenicidad incrementada en comparación con el sacárido. En este contexto el término "portador inmunogénico" se define como una estructura, que está conjugado con el sacárido para formar un conjugado que presenta una mayor inmunidad en comparación con el sacárido per se. Así, la conjugación de los sacáridos con el portador inmunogénico tiene como efecto la estimulación de la respuesta inmune contra dicho sacárido, sin inducir una respuesta inmune contra dicho portador inmunogénico.

[0016] Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un sacárido sintético de fórmula general (II)

en donde

representa un enlace,

y L representa-(CH2)oy o es un número entero seleccionado de 1,2, 3, 4, 5 y 6

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0017] También se describe un sacárido de fórmula general (I)

V*-[U ^x+2 -U ^{x i} -U ^x ] ⁿ -V-O-L-NH ²(I)

en donde

x es un número entero seleccionado de 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

representa un enlace,

-V- representa un enlace, -Ux+²- o -Ux+²-Ux+¹-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx+1-Ux-;

L representa un enlazador,

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0018] El enlazador L descrito contiene preferiblemente entre 2 y 40 átomos de carbono (incluyendo los átomos de carbono de cadenas laterales opcionales), más preferiblemente entre 2 y 30, más preferiblemente entre 2 y 20, más preferiblemente entre 2 y 14, más preferiblemente entre 2 y 12, y aún más preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono.

[0019] La cadena de átomos más corta entre el átomo de oxígeno (es decir, el oxígeno de -OL-NH²) y el grupo NH² consiste preferiblemente de 2 a 14 átomos, más preferiblemente de 2 a 12 átomos, más preferiblemente de 2 a 10 átomos, más preferiblemente de 2 a 8 átomos. En caso de que la cadena más corta (que es la conexión más corta posible entre el oxígeno en el centro anomérico y el grupo NH2) consta de 2 a 6 átomos, estos son preferiblemente átomos de carbono. En caso de que la cadena más corta conste de 4 a 8 átomos, la cadena puede contener 1 o 2 heteroátomos seleccionados entre O, N y S. En caso de que la cadena más corta conste de 9 a 14 átomos, la cadena puede contener 1, 2, 3, o 4 heteroátomos seleccionados de O, N y S.

[0020] También se prefiere que el enlazador -L-, o la cadena más corta es fluorado total o parcialmente. El enlazador -L- puede contener un carbociclo saturado de 3 miembros o 4 miembros o 5 miembros o 6 miembros o un carbociclo parcialmente insaturado (y no aromático) de 5 miembros o un carbociclo de 4 miembros o de 5 miembros. un heterociclo de oxígeno saturado de miembros o de 6 miembros o un heterociclo de nitrógeno saturado de 4 miembros o de 5 miembros o de 6 miembros o un carbociclo aromático de 6 miembros.

[0021] El enlazador -L- también puede contener amida (-NH-CO-, -CO-NH-) y/o residuos de urea (-NH-CO-NH-), y preferiblemente sólo una amida o residuo de urea. El enlazador también puede contener sustituyentes y preferiblemente dos sustituyentes tales como R ¹⁰ y R ¹¹ o cuatro sustituyentes tales como R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹⁵ y R ¹⁴ , que tienen los significados que se definen aquí y que se seleccionan preferiblemente de: -F, -Cl, -CH3, -C2H5, -C3H7, -C5H9, -C6H13, -OCH3, -OC2H5, -CH2F, -CHF2, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHC(O)CH ³ , -N(CH ³ ) ² y -N (C2H5K

[0022] En caso de que el enlazador -L- está fluorado, más de dos sustituyentes -F son preferidos.

[0023] Preferiblemente, el enlazador -L- se selecciona de: -CH2-, -(CH2)2-, -(CH ² ) ³ -, -(CH ² ) ⁴ -, -(CH ² ) ⁵ -, -(CH2)6-, -(CH ² ) ⁷ -, -(CH2)8-, -(CH ² ) ⁹ -, -(CH2)10-, -CF2-, -(CF ² ) ² -, -(CF ² ) ³ -, -(CF ² ) ⁴ -, -(CF ² ) ⁵ -, -(CF2)6-, -(CF ² ) ⁷ -, -(CF2)8-, -(CF ² ) ⁹ -, -(CF2)10-, -(CH ² ) ² -O-(CH ² ) ² -, -CH ² -O-(CH ² ) ³ -, -(CH ² ) ³ -O-CH ² -, -CH ² -O-(CH ² ) ² -, -(CH ² ) ² -O-CH ² -, -(CH ² ) ³ -O-(CH ² ) ² -, -(CH ² ) ² -O-(CH ² ) ³ -, -(CH ² ) ⁴ -O-CH2-, -CH ² -O-(CH ² ) ⁴ - -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, -La-Lb-Ld-Lc-Le-, -La-Ld-Le-;

en donde

-La- se selecciona de:-(CH2)o-, -(CF2)o-, -(CH ² -CH ² -O)o-C ² H ⁴ -, -(CH2-CH2-O)o-CH2-, -(CR ¹⁰ R ¹¹ )o-,

-Lb- y -Lc- se seleccionan independientemente entre sí de: -O-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -NR ⁹ -, -NR ¹⁸ -, -SO2-,

-Ld- representa-(CH2)q-, -(CF2)q-, -(CR ¹² R ¹³ )q-, -(CH ² -CH ² -O)q-C ² H ⁴ -, -(CH2-CH2-O)q-CH2-,

-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C ² H ⁴ -(O-CH ² -CH ² )p ¹ -, -CH2-(O-CH2-CH2)p1-, -(CH2)p1-O-(CH2)p2-, -(CR ¹⁴ R ¹⁵ )p1- -(CR ¹⁴ R ¹⁵ )p ¹ -O-(CR ²¹ R ²² )p2-,

R ⁹ y R ¹⁸ se seleccionan independientemente entre sí de: -CH3, -C2H5, -C3H7 y -C(O)CH ³ ;

R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² , R ¹³ , R ¹⁴ , R ¹⁵ , R ¹⁶ , R ¹⁷ , R ¹⁹ , R ²⁰ , R ²¹ y R ²² se seleccionan independientemente entre sí entre: -H, -F, -CI, -CH3, -C2H5, -C3H7, -C5H9, -C6H13, -OCH3, -OC2H5, -CH2F, -CHF2, -CF3, -C(O)-NH2, -SCH3, -SC2H5, -NHC(O)CH ³ , -N(CH ³ ) ² y -N(C ² H ⁵ ) ² ;

o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí un número entero seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Los enlazadores L según la invención son los que caen bajo definición de L dada para la Fórmula (II) anterior.

[0024] Los sacáridos descritos en este documento tienen sustituyentes básicos y/o ácidos y que pueden formar sales con ácidos o bases orgánicos o inorgánicos.

[0025] Ejemplos de ácidos adecuados para tal formación de sal de adición de ácido son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido salicílico, ácido p-aminosalicílico, ácido málico, fumárico ácido, ácido succínico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido sulfónico, ácido fosfónico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido hidroximaleico, ácido pirúvico, ácido fenilacético, ácido benzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido phidroxibenzoico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido nitroso, ácido hidroxietanosulfónico, ácido etilensulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftilsulfónico, ácido sulfanílico, ácido canforsulfónico, ácido de China, ácido mandélico, ácido o-metilmandélico, ácido hidrógeno-bencenosulfónico, ácido pícrico, ácido adípico, ácido d-otoliltartárico, ácido tartrónico, ácido (o, m, pj-toluico, ácido naftilamina sulfónico y otros ácidos minerales o carboxílicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las sales se preparan poniendo en contacto la forma de base libre con una cantidad suficiente del ácido deseado para producir una sal de la manera convencional.

[0026] Los ejemplos de bases inorgánicas u orgánicas adecuadas son, por ejemplo, NaOH, KOH, NH4OH, hidróxido de tetraalquilamonio, lisina o arginina y similares. Las sales se pueden preparar de una manera convencional usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el tratamiento de una solución del compuesto de fórmula general (I) con una solución de una base, seleccionada del grupo mencionado anteriormente.

[0027] Está claro para el experto en la técnica de la química de carbohidratos que los sacáridos de (I) general no se contienen enlaces -O-O- y/o fragmentos de azúcar (Ux, Ux+1, Ux+2) conectados o unidos entre sí a través de sus carbonos anoméricos o C-1. También está claro para el experto en la técnica que la estereoquímica del enlace glicosídico está definida por la estereoquímica indicada para el centro anomérico del fragmento de azúcar Ux, Ux+1 y Ux+2 en la fórmula general.

[0028] Sorprendentemente, se encontró que un sacárido de fórmula general (I) contiene un epítopo inmunogénico de protección y es capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra bacterias pneumoniae K resistentes a carbapenémicos en un huésped humano y/o animal. El sacárido de fórmula general (I) provoca anticuerpos que son de reacción cruzada con el polisacárido capsular de bacterias pneumoniae K. resistentes a carbapenémicos, reconocen específicamente bacterias pneumoniae K. resistentes a carbapenémicos y los opsonizan para matar por los fagocitos.

[0029] Los sacáridos de la presente invención superan todos los problemas asociados con los sacáridos producidos a partir de fuentes bacterianas y conjugados de los mismos en términos de pureza y facilidad de producción. Es bien sabido que el aislamiento y purificación de sacáridos puros de longitud y estructura definidas a partir de polisacáridos capsulares de bacterias patógenas es un proceso tedioso y en ocasiones no factible. En primer lugar, la producción de polisacáridos capsulares requiere la optimización de las condiciones de crecimiento. En segundo lugar, es necesario encontrar las condiciones de despolimerización bajo las cuales se mantiene la integridad estructural de los monosacáridos constituyentes. Finalmente, es necesario determinar las condiciones de purificación que permitan el aislamiento del sacárido puro de longitud y estructura definidas. Además de los contaminantes habituales, tales como polisacáridos celulares, ácidos nucleicos y proteínas, también deben excluirse los sacáridos no deseados obtenidos mediante el proceso de despolimerización. Por tanto, la producción de sacáridos puros de estructura y longitud definidas a partir de fuentes bacterianas es un proceso tedioso y casi imposible.

[0030] Los sacáridos sintéticos descritos en este documento también pueden ser de fórmula general (I), en donde

U2, U3, U5, x, n, V, V* y L tienen los significados definidos en este documento y un diastereoisómero y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por lo tanto, un sacárido sintético de fórmula general (III)

V*-[U ^x+2 -U ^{x i} -U ^x ] ⁿ -V-O-L-NH ²(III)

en donde

x es un número entero seleccionado de 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1, 2 y 3;

-V- representa un enlace, -Ux+2- o -Ux+2-Ux+1-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx+1-Ux-;

L representa un enlazador,

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0031] Por lo tanto, también se describe aquí un sacárido sintético de fórmula general (III-a)

en donde

-V- representa un enlace, -U3- o -U3-U2-;

V*- representa H-, H-U1- o HU ²-U ¹-;

L representa un enlazador,

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U¹representa

U²representa

U3 representa

y un sacárido sintético de fórmula general (IlI-b)

en donde

-V- representa un enlace, -U5- o -U5-U4-;

V*- representa H-, H-U3- o H-U4-U3-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U³representa

U4 representa

U⁵representa

y un sacárido sintético de fórmula general (III-c)

en donde

-V- representa un enlace, -U4- o -U4-U3-;

V*- representa H-, H-U2- o H-U3-U2-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U²representa

U³representa

Ü4 representa

[0032] Üna forma de realización de la presente descripción se refiere a un sacárido de fórmula general (I), en donde Ü ¹ = U ⁴ =

Ü², Ü³, Ü⁵, x, n, V, V* y L tienen los significados definidos aquí, y un diastereoisómero y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0033] Por lo tanto, un sacárido sintético de fórmula general (IV)

V*-[U^x+2-U^{x i}-U^x] ⁿ-V-O-L-NH²(IV)

en donde

x es un número entero seleccionado de 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

-V- representa un enlace, -Ux+2- o -Ux+2-Ux+i-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx+1-Ux-;

L representa un enlazador,

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo también se describe.

[0034] Por lo tanto, También se describe un sacárido sintético de fórmula general (IV-a)

en donde

-V- representa un enlace, -U3- o -U3-U2-;

V*- representa H-, H-U¹- o H-U²-U¹-;

L representa un enlazador,

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

Ui representa

U²representa

U³representa

y un sacárido sintético de fórmula general (IV-b)

en donde

-V- representa un enlace, -U5- o -U5-U4-;

V*- representa H-, H-U3- o H-U4-U3-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U3 representa

U4 representa

U⁵representa

y un sacárido sintético de fórmula general (IV-c)

en donde

-V- representa un enlace, -U4- o -U4-U3-;

V*- representa H-, H-U2- o H-U3-U2-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U²representa

U2, U3, U5, x, n, V, V* y L tienen los significados definidos en el presente documento, y un diastereoisómero y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por tanto, otro sacárido sintético preferido es un sacárido de fórmula general (V)

V*-[U ^x+2 -U ^{x i} -U ^x ] ⁿ -V-O-L-NH ²(V)

en donde

x es un número entero seleccionado de 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1, 2 y 3;

-V- representa un enlace, -Ux+2- o -Ux+2-Ux+1-;

V*- representa H-, H-Ux- o H-Ux+1-Ux-;

L representa un enlazador,

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0036] Por lo tanto, también se describe aquí un sacárido sintético de fórmula general (V-a)

en donde

-V- representa un enlace, -U³- o -U³-U²-;

V*- representa H-, H-U¹- o H-U²-U¹-;

L representa un enlazador,

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U¹representa

U²representa

U³representa

y un sacárido sintético de fórmula general (Vb)

en donde

-V- representa un enlace, -U5- o -U5-U4-;

V*- representa H-, H-U3- o H-U4-U3-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U3 representa

U4 representa

U⁵representa

y un sacárido sintético de fórmula general (V-c)

en donde

-V- representa un enlace, -U4- o -U4-U3-;

V*- representa H-, H-U2- o H-U3-U2-;

L representa un enlazador;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U²representa

U³representa

U⁴representa

[0037] Por tanto, también se prefieren los sacáridos sintéticos de fórmula general (Il-a), (Il-b) o (II-c), en donde L tiene el significado definido aquí.

[0038] Preferiblemente, el enlazador -L- se selecciona entre: -La- -La-Le-, -La-Lb-Le-, -La-Ld-Le-;

en donde

-La- se selecciona de: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2;

-Lb- representa -O-;

-Ld- se selecciona entre: -(CH2)q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, y-(CH2-CH2-O)q-CH2-;

-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- y -(CH2)p1-O-(CH2)p2- y o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí un número entero seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Los enlazadores L según la invención son los que caen bajo la definición de L dada para la Fórmula (II) anterior.

[0039] Por lo tanto, un sacárido de fórmula general (I), (II), (Il-a), (Il-b), (II-c), (III), (IlI-a), (IlI-b), (III-c), (IV), (IV-a), (IVb), (IV-c), (V), (Va), (Vb) o (Vc) en donde

-L- se selecciona de : -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Ld-Le-;

-La- se selecciona de: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2;

-Lb- representa -O-;

-Ld- se selecciona de: -(CH2)q-, -(CF2)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, y -(CH2-CH2-O)q-CH2-;

-Le- se selecciona entre: -(CH2)p1-, -(CF2)p1-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH2-(O-CH2-CH2)p1- y-(CH2)p1-O-(CH2)p2-; y o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí, se prefiere especialmente un número entero seleccionado entre 1,2, 3, 4, 5 y 6, en donde los sacáridos de la invención son los que caen bajo la Fórmula (II) en donde los enlazadores L son los que caen bajo la definición dada para la Fórmula (II) anterior.

[0040] En la realización más preferente, -L- representa-(CH2)o - y o es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6. Por lo tanto, un sacárido sintético especialmente preferido es un sacárido de fórmula general (II), (II-a), (II-b), (II-c), en donde -L- representa (CH2)o- y o es un número entero seleccionado entre 2, 3, 4, 5 y 6.

[0041] Se describe un sacárido de fórmula general (I), (III), (III-a), (III-b), (III-c), (IV), (IV-a), (IV-b), (IV-c), (V), (V-a), (V-b) o (V-c), donde n representa 1. También se describe un sacárido de fórmula general (I), (III), (III-a), (III-b), (III-c), (IV), (IV-a), (IV-b), (IV-c), (V), (V-a), (V-b) o (V-c), en donde n representa 1 y -L- representa -(CH2)o- siendo o un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6.

[0042] En aún otra realización preferida, el sacárido se selecciona entre el grupo que consiste en:

5-amino-pentanilo a-L-ramnopiranosil-(1^ 4)-[p-D-galactosil-(1^ 3)]-a-D-ácido galactopiranosilurónico-(1^ 2)-a-L-ramnopiranósido;

2-(2-aminoetoxi)etoxil a-L-ramnopiranosil-(1^ 4)-[p-D-galactosil-(1^ 3)]-a-D-ácido galactopiranosilurónico-(1^ 2 )-a-L-ramnopiranósido;

2-amino pentanil a-L-ramnopiranosil-(1^ 4)-[p-D-galactosil-(1^ 3)]-a-D-ácido galactopiranosilurónico-(1^ 2)-a-L ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosido;

4-aminopentanil a-L-ramnopiranosil-(1^4)-[p-D-galactopiranosil-(1^3)]-a-D-galactopiranosilurónico-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosido;

2- amino pentanil a-L-ramnopiranosil-(1^ 4)-[p-D-galactopiranosil-(1^ 3)]-a-D-galactopiranosilurónico-(1^ 2)-a-L-ramnopiranosil-(1^ 2)-a-L-ramnopiranósido; y

3- amino-2,2-difluoropropoxil a-L-ramnopiranosil-(1^ 4)-[p-D-galactopiranosil-(1^ 3)]-a-D-ácido galactopiranosilurónico-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosido.

Síntesis química

[0043] Otro aspecto de la presente invención está dirigida a un método sintético que comprende las etapas como se define en la reivindicación 9. También se describe aquí un método sintético que comprende las etapas de: hacer reaccionar el Compuesto 7 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P11 representan grupos protectores y LG3 representa un grupo saliente seleccionado de: -OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

NH

'O ^ C C U

y

con el compuesto 10 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí para proporcionar el compuesto 15 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí;

o

con el compuesto 12 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí para proporcionar el compuesto 16 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores y L tiene el significado aquí definido;

o

con el compuesto 14 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí para proporcionar el compuesto 17 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí.

El método sintético descrito en este documento proporciona los intermedios clave 15, 16 y 17 que presentan la aestereoquímica en el nuevo estereocentro formado con al menos un 80% de rendimiento, preferiblemente un 85% de rendimiento e incluso más preferiblemente un 90% de rendimiento. Otra realización de la presente invención está dirigida a un método de síntesis de un sacárido de fórmula general (II)

en donde

y L tienen los significados definidos en el presente documento, que comprenden las siguientes etapas: A) hacer reaccionar un compuesto 1 de fórmula:

en donde P ¹ - P ³ representa grupos protectores y P ⁴ se selecciona de: -CH3, -CH2CH3, -CH(CH ³ ) ² ,

con un compuesto 2 de fórmula:

en donde P5 - P7 representan grupos protectores y LG1 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3) ² ,

y

para proporcionar un compuesto 3 de fórmula:

donde P1 - P3, P4 - P7 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

y

llevar a cabo la eliminación selectiva de grupo protector P2 en el compuesto 3 para obtener el compuesto 4 de la fórmula:

en donde P1, P3, P4 - P7 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

y

el compuesto 4 reacciona con el compuesto 5 de fórmula:

donde P8 - P11 representan grupos protectores y LG2 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

para obtener el compuesto 6 de fórmula:

donde P1, P3, P5 - P11 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH3, -CH2CH3, -CH (CH ³)²,

l compuesto de conversión 6 en el compuesto 7 de fórmula:

donde P1, P3, P5 - P11 representan grupos protectores y LG3 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

NPh

ü

'O CF3 .

y

B1) Hacer reaccionar el compuesto 2 con el compuesto 8 de fórmula:

donde P12 y P13 representan grupos protectores para proporcionar el compuesto 9 de fórmula:

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

realizar la eliminación selectiva del grupo protector P5 en el compuesto 9 para proporcionar el compuesto 10 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

B2) hacer reaccionar el compuesto 2 con el compuesto 10 para obtener el compuesto 11 de fórmula:

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

yrealizar la eliminación selectiva del grupo protector P 55 en el compuesto 11 para proporcionar el compuesto 12 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

B3) hacer reaccionar el compuesto 2 con el compuesto 12 para obtener el compuesto 13 de fórmula:

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

realizar la eliminación selectiva del grupo protector P5 en el compuesto 13 para proporcionar el compuesto 14 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

C1) hacer reaccionar el compuesto 7 obtenido en la etapa A con el compuesto 10 obtenido en la etapa B1 para proporcionar el compuesto 15 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

o

C2) hacer reaccionar el compuesto 7 obtenido en la etapa A con el compuesto 12 obtenido en la etapa B2 para proporcionar el compuesto 16 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

o

C3) hacer reaccionar el compuesto 7 obtenido en la etapa A con el compuesto 14 obtenido en la etapa B3 para proporcionar el compuesto 17 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

y

D) realizar la eliminación de los grupos protectores P1, P3, P5 - P13 en los compuestos 15, 16 y 17 para proporcionar los sacáridos de fórmula general (II).

[0044] P1, P2, P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 y P13 representan grupos protectores. El término "grupo protector" como se usa en este documento se refiere a grupos comúnmente usados en síntesis orgánica, preferiblemente usados para la protección de aminas, grupos hidroxilo, tioles, iminas, carbonils, carboxilos u otros grupos funcionales comunes, y particularmente preferido para aminas y grupos hidroxilo.

[0045] Más preferiblemente, P2, P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10 y P11 son grupos protectores adecuados para grupos hidroxilo, más preferiblemente diferentes grupos protectores adecuados para grupos hidroxilo capaces de ser eliminados posteriormente uno tras otro mediante una secuencia adecuada de reacciones de desprotección. Los grupos protectores preferidos para los grupos hidroxilo son acetil, bencil, isopropilideno, bencilideno, benzoílo, p-metoxibencil, p-metoxibencilideno, p-metoxifenil, pbromobencilideno, p-nitrofenil, alil, acetil, isopropil, 2-bromobencil, p-bromobencil naftilmetil, pivaloílo, triisopropilsilil, tere-butildimetilsilil, tere-butildifenilsilil, tere butilmetoxifenilsilil, trietilsilil, trimetilsilil, 2-trimetilsililetoximetil, 9-fluorenilmetoxicarbonil, bencilximetil, metilximetil, tere-butilximetil, metoxietilximetil, levulinoílo. Específicamente, el grupo protector P2 se selecciona entre alil, p-metoxibencil, 2-naftilmetil, triisopropilsilil y tere-butildimetilsilil, los grupos protectores P3, P6, P7, P8, P9 y P10 representan bencil y grupos protectores P5 y P11 se seleccionan entre acetil, benzoílo y levulinoílo. Más específicamente, el grupo protector P2 representa alil, los grupos protectores P3, P6, P7, P8, P9 y P10 representan bencil y los grupos protectores P5 y P11 representan acetil.

[0046] P12 y P13 son grupos protectores adecuados para grupos amino. Los grupos protectores preferidos para las aminas se forman junto con la amina a proteger como carbamatos o amidas. Los ejemplos de grupos protectores que forman carbamatos incluyen tere-butilxicarbonil, 9-fluorenilmetilcarbonil, alilcarbonil, tricloroetilcarbonil y bencilxicarbonil. Los ejemplos de grupos protectores que forman amidas incluyen acetil o tricloro acetil. Preferiblemente, el grupo protector P12 representa bencil y el grupo protector P13 representa bencilxicarbonil.

[0047] Los ácidos carboxílicos generalmente están protegidos como ásteres. Por tanto, los grupos protectores P1 pueden seleccionarse del grupo que consiste en o comprende metil, etil, alil, isopropil, ferc-butil, fenil, bencil, pmetoxibencil. Preferiblemente, P1 representa metil.

[0048] Se prefiere que la reacción entre trisacárido 7 y monosacárido 10, trisacárido 7 y disacárido 12, trisacárido 7 y trisacárido 14 se realiza por activación con TBSOTf, en una mezcla de disolvente apolar y disolvente aprótico polar a una temperatura de entre -80°C y -60°C. Incluso más preferido es que la reacción entre el trisacárido 7 y el monosacárido 10, el trisacárido 7 y disacárido 12, el trisacárido 7 y el trisacárido 14 se realiza mediante activación con TBSOTf, en una mezcla de tolueno y éter dietílico a -70°C.

[0049] También se prefiere que la reacción entre disacárido 4 y monosacárido 5 se realiza por la activación con TBSOTf en un disolvente apolar a una temperatura de -50°C y -10°C y más preferiblemente de -40°C a -20°C. Se prefiere especialmente que la reacción entre el disacárido 4 y el monosacárido 5 se realice mediante activación con TBSOTf en diclorometano a -30°C.

[0050] Preferiblemente, el acoplamiento entre monosacárido 1 y monosacárido 2, monosacárido 2 y el compuesto 8, monosacárido 2 y monosacárido 10, y monosacárido 2 y disacárido 12 se realiza por la activación con TBSOTf en un disolvente apolar a una temperatura de entre -10°C hasta 10°C. Incluso más preferido es que el acoplamiento entre el monosacárido 1 y el monosacárido 2, el monosacárido 2 y el compuesto 8 , el monosacárido 2 y el monosacárido 10, y el monosacárido 2 y el disacárido 12 se realice mediante activación con TBSOTf en diclorometano a 0°C.

[0051] La eliminación de los grupos protectores P1, P3, P5 - P13 realizada en la etapa D implica:

- primero la escisión de los grupos protectores sensibles a hidrogenación sometiendo el compuesto a hidrógeno en presencia de un catalizador de paladio en una mezcla de disolventes, y

- segunda escisión de los grupos protectores lábiles de base mediante tratamiento con una base en presencia de peróxido de hidrógeno en una mezcla de disolventes. Preferiblemente, la base es LiOH.

[0052] Un aspecto adicional de acuerdo con la presente descripción se refiere a compuestos intermedios de fórmula general (7), (10), (15), (12), (16), (14) y (17):

en donde P1, P3, P5 - P11 representan grupos protectores y LG3 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

y

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores y L tiene el significado aquí definido;

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido aquí;

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores y L tiene el significado definido en el presente documento.

[0053] En las fórmulas (10), (15), (12), (16), (14) y (17), el enlazador -L- se selecciona preferiblemente de: -La-, -La-Le--La-Lb-Le- -La-Ld-Le-;

en donde

-La- se selecciona de: -(CH²)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH²-CH²-O)o-CH²;

-Lb- representa -O-;

-Ld- se selecciona entre: -(CH²)q-, -(CF²)q-, -(CH2-CH2-O)q-C2H4-, y -(CH²-CH²-O)q-CH²-;

-Le- se selecciona entre: -(CH²)p¹-, -(CF²)p¹-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH²-(O-CH²-CH²)p¹- y-(CH²)p¹-O-(CH²)p²-; y o, q, p1 y p2 son independientemente uno de otro un número entero seleccionado de 1,2, 3, 4, 5, y 6.

[0054] Un intermedio especialmente preferido es un compuesto intermedio de fórmula (10), (15), (12), (16), (14) o (17), en donde -L- representa-(CH²)o- y o es un número entero seleccionado entre 2, 3, 4, 5 y 6.

[0055] P1, P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 y P13 representan grupos protectores. Preferiblemente, los grupos protectores P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11 se seleccionan entre acetil, bencil, isopropilideno, bencilideno, benzoílo, pmetoxibencil, p-metoxibencilideno, p-metoxifenil, p-bromobencil, p-bromobenciledeno, p-nitrofenil, alil, acetil, isopropil, p-bromobencil, dimetoxitritilo, tritilo, 2-naftilmetil, pivaloilo, triisopropilsilil, terc-butildimetilsilil, terc-butildimetilsilililo, terc-butildimetilsilil trimetilsilil, 2-trimetilsililetoximetil, 9-fluorenilmetoxicarbonil, bencilximetil, metilximetil, tercbutilximetil, metoxietilximetil y levulinoílo.

[0056] Se prefiere además que los grupos protectores P12 y P13 se seleccionan entre bencil, ferc-butilxi carbonil, 9-fluorenilmetil carbonil, alil carbonil, tricloroetil carbonil y bencilxi carbonil, acetil y tricloro acetil.

[0057] También se prefiere que el grupo protector P1 se selecciona de metil, etil, alil, isopropil, ferc-butil, fenil, bencil y p-metoxibencil.

[0058] En una realización más preferida, los grupos protectores P3, P6, P7, P8, P9 y P10 representan bencil, la protección de grupos P5 y P11 se seleccionan entre acetil, benzoilo y levulinoílo, los grupos protectores P12 y P13 se seleccionan independientemente entre sí de bencil y bencilxicarbonil y P1 representa metil.

[0059] Por lo tanto, los intermedios divulgados (7a), (10a), (15a). (12a), (16a), (14a) y (17a) son especialmente preferidos:

en donde P5 y P11 se seleccionan independientemente entre sí entre acetil (Ac), benzoílo (Bz) y levulinoílo (Lev), y LG3 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

en donde L tiene el significado definido aquí;

en donde P5 y P11 se seleccionan independientemente entre sí entre acetil (Ac), benzoílo (Bz) y levulinoílo (Lev) y L tiene el significado definido aquí;

en donde L tiene el significado definido aquí;

en donde P5 y P11 se seleccionan independientemente entre sí entre acetil (Ac), benzoílo (Bz) y levulinoílo (Lev) y L tiene el significado definido en la presente;

en donde P5 y P11 se seleccionan independientemente entre sí entre acetil (Ac), benzoílo (Bz) y levulinoílo (Lev) y L tiene el significado definido aquí. En las fórmulas (10a), (15a), (12a), (16a), (14a) y (17a), el enlazador -L- se selecciona preferiblemente de: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, -La-Ld-Le-;

en donde

-La- se selecciona de: -(CH²)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH²-CH²-O)o-CH²;

-Lb- representa -O-;

[0060] Un intermedio especialmente preferido descrito es un compuesto intermedio de fórmula (10a), (15a), (12a), (16a), (14a) o (17a), en donde -L- representa -(CH²)o- y o es un número entero seleccionado entre 2, 3, 4, 5 y 6.

Glicoconiuaados

[0061] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjugado que comprende un sacárido según la presente invención. Sorprendentemente, dicho conjugado demostró ser eficaz como vacuna para la inmunización contra enfermedades asociadas a la bacteria Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0062] Los sacáridos son conocidos por los expertos en la técnica como antígenos generalmente TI-2 (independientes de células T-2) e inmunógenos pobres. Los antígenos TI-2 son antígenos, que son reconocidos solo por las células B maduras a través del entrecruzamiento de los receptores de inmunoglobulina expuestos a la superficie. Sin la ayuda de las células T, no se genera memoria inmunológica y no se produce el cambio de isotipo de IgM a otras subclases de IgG, ni la maduración de la afinidad de las células B. Además, los sacáridos son inmunógenos pobres conocidos en humanos debido a la homología estructural con glicolípidos y glicoproteínas humanos. Debido a sus escasas propiedades inmunogénicas, los sacáridos manifiestan una escasa capacidad para producir tanto la producción de anticuerpos por las células B como la formación de células de memoria, características que son esenciales para la producción de vacunas potentes.

[0063] Por lo tanto, para producir una vacuna potente basada en sacárido, los sacáridos de fórmulas generales (I), (II), (N-a)-(M-c), (III), (III-a)-(III-c), (IV), (IV-a)-(IV-c), (V) y (V-a)-(V-c) se conjugan con un portador inmunogénico para proporcionar conjugados, que presentan mayor inmunogenicidad en comparación con el sacárido. Por lo tanto, en el presente documento también se describe un conjugado que consiste en un fragmento de sacárido

V*-[U ^x+2 -U ^x+1 -U ^x ] ⁿ -V-O-

donde V*, Ux⁺², Ux⁺¹, Ux, V, x y n tienen los significados definidos aquí, unidos covalentemente a través del átomo de O a un portador inmunogénico.

[0064] Dicho conjugado consta de al menos un sacárido sintético de la fórmula general (I) y un portador inmunogénico al que el al menos un sacárido (I) se une covalentemente.

[0065] Sorprendentemente, se encontró que la inmunización con un conjugado que comprende un sacárido de fórmula general (I) unido covalentemente a un portador inmunogénico resulta en la producción de altos títulos de anticuerpos específicos a la parte de carbohidrato del sacárido de fórmula general (I) (ver, por ejemplo, la Figura 4). Dichos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con el polisacárido capsular natural de Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos (véase, por ejemplo, Figura 5, Figura 7) y presentan opsonofagocitosis y actividad bactericida, confiriendo así protección contra Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0066] Las vacunas que contienen el conjugado de la presente invención provocan menos efectos secundarios y/o respuestas inmunes no protectoras en comparación con las vacunas que contienen mezclas aisladas (y no sintetizadas) de sacáridos obtenidas por escisión no selectiva del polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae o conjugados de los mismos. Además, las vacunas de la invención se pueden fabricar más fácilmente de acuerdo con las regulaciones GMP que las vacunas que contienen mezclas aisladas de polisacáridos capsulares no escindidos selectivamente y se caracterizan más fácilmente, lo que facilita el control de la estabilidad y la pureza, así como la detección del tipo y cantidad de impurezas.

[0067] En este contexto, el término "portador inmunogénico" se define como una estructura, que está conjugada con el sacárido para formar un conjugado que presenta una mayor inmunidad en comparación con el sacárido per se. Así, la conjugación de los sacáridos de las fórmulas generales (I), (II), (II-a)-(II-c), (III), (III-a)-(III-c), (IV), (IV-a)-(IV-c), (V) y (V-a)-(V-c) al portador inmunogénico tiene como efecto la estimulación de la respuesta inmune contra el sacárido de fórmula general (I) sin inducir una respuesta contra dicho portador inmunogénico.

[0068] Portadores inmunogénicos preferidos son proteínas portadoras o glicoesfingolípidos con propiedades inmunomoduladoras. Para el experto en la materia, una proteína portadora es una proteína seleccionada del grupo que comprende o consiste en: un toxoide diftérico, un toxoide diftérico mutado, un toxoide diftérico modificado, un toxoide diftérico mutado y modificado, un toxoide tetánico, un toxoide diftérico modificado toxoide tetánico, un toxoide tetánico mutado, proteína de la membrana externa (OMP), albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide del cólera (CT). El término "toxoide" como se usa en este documento se refiere a una toxina bacteriana (normalmente una exotoxina), cuya toxicidad ha sido inactivada o suprimida por tratamiento químico (formalina) o térmico, mientras que se mantienen otras propiedades, típicamente inmunogenicidad. Un toxoide mutado como se usa en el presente documento es una toxina bacteriana recombinante, que se ha modificado para que sea menos tóxica o incluso no tóxica modificando la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. Tal mutación podría ser una sustitución de uno o más aminoácidos. Tal toxoide mutado presenta en su superficie una funcionalidad que puede reaccionar con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar un toxoide modificado. Dicha funcionalidad es conocida por el experto en la técnica e incluye, pero no se limita a la funcionalidad amino primaria de un residuo de lisina que puede reaccionar con ésteres activados, un grupo isocianato o un aldehído en presencia de un agente reductor a la funcionalidad de carboxilato de un residuo de glutamato o aspartato que puede ser activado por carbodiimidas o de la funcionalidad tiol de un residuo de cisteína.

[0069] Los ésteres activados incluyen N-(Y-maleimidobutiriloxi) sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (sulfo-SIAB), succinimidil-3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), glutarato de disuccinimidilo (DSG), adipato de disuccinimidilo (DSA), 2-piridilditiol-tetraoxatetradecano-W-hidroxisuccinimida (PEG-4-SPDP), adipato de bis-(4-nitrofenil) y succinato de bis-(4-nitrofenil) (ver Figura 2). Los ésteres activados preferidos son adipato de disuccinimidilo (DSA), glutarato de disuccinimidilo (DSG), adipato de bis-(4-nitrofenil) y succinato de bis-(4-nitrofenil).

[0070] El resto de cisteína en la proteína portadora se puede convertir en la correspondiente deshidroalanina que se puede reaccionar adicionalmente con una molécula de interconexión adecuada para proporcionar proteína transportadora modificada que tiene en su superficie el grupo X funcional de la molécula de interconexión.

[0071] Se prefiere especialmente que los sacáridos de la fórmula general (I) se conjugan a la toxina de difteria mutada no tóxica CRM¹⁹⁷se presenta como una funcionalidad de amina primaria de un residuo de lisina.

[0072] La toxina diftérica de tipo salvaje similar a CRM¹⁹⁷es una cadena polipeptídica única de 535 aminoácidos (58 kD) que consta de dos subunidades unidas por puentes disulfuro que tienen una sustitución de un solo aminoácido de ácido glutámico por glicina. Se utiliza como proteína transportadora en varias vacunas conjugadas aprobadas para enfermedades, como Prevnar.

[0073] Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención la proteína portadora presenta en su superficie funcionalidades de amino primarias de residuos de lisina que son capaces de reaccionar con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar proteína transportadora modificada que tiene en su superficie dicho grupo funcional X de la molécula de interconexión, que es capaz de reaccionar con el grupo amino terminal del enlazador de los compuestos de fórmula general (I).

Dicho grupo funcional X de las moléculas interconectadas se selecciona del grupo que comprende o consiste en maleimida, a-yodoacetil, a-bromoacetil, éster de W-hidroxisuccinimida (NHS), aldehído, imidoéster, ácido carboxílico, alquil sulfonato, cloruro de sulfonilo, epóxido, anhídrido, carbonato (ver Figura 3).

[0074] Se describe un conjugado de fórmula general (VI)

[V*-[U^x+2-U^x+1-U^x]ⁿ-V-O-L-NH-T] ^m-CRM¹⁹⁷(VI)

en donde m está compuesto entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

a representa un número entero de 1 a 10;

b representa un número entero de 1 a 4; y

V*-, Ux⁺², Ux⁺¹, Ux, x, -V-, n y L tienen los significados definidos aquí.

[0075] También se describe un conjugado de fórmula general (VII)

[V*-[U^x+2-U^x+1-U^x]ⁿ-V-O-L-NH-T]^m-CRM¹⁹⁷(VII)

en donde

x es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

-V- representa un enlace, -Ux⁺²- o -Ux⁺²-Ux⁺¹-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx⁺¹-Ux-;

L representa un enlazador,

m está comprendido entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

a representa un número entero de 1 a 10; y

b representa un número entero de 1 a 4.

[0076] También se describe un conjugado de fórmula general (VIII)

[V*-[U^x+2-U^{x+ i}-U^x]ⁿ-V-O-L-NH-T]^m-CRM ⁱ⁹⁷(VIII)

en donde

x es un número entero seleccionado entre 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1, 2 y 3;

-V- representa un enlace, -Ux⁺²- o -Ux⁺²-Ux+i-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx⁺¹-Ux-;

L representa un enlazador;

m está comprendido entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

a representa un número entero de 1 a 10; y

b representa un número entero de 1 a 4.

[0077] También se describe un conjugado de fórmula general (IX)

[V*-[Ux+2-Ux+i-Ux]n-V-O-L-NH-T]m-CRMi97 (IX)

en donde

x es un número entero seleccionado entre 1, 2 y 3;

n es un número entero seleccionado entre 1,2 y 3;

U1 = U4 =

U2 = U5 =

U3 =

-V- representa un enlace, -Ux⁺²- o -Ux⁺²-Ux+i-;

V*- representa H-, H-Ux- o HUx⁺¹-Ux-;

L representa un enlazador;

m está comprendido entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

y

a representa un número entero de 1 a 10; y

b representa un número entero de 1 a 4.

y L tienen los significados definidos en el presente documento,

m está comprendido entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

a representa un número entero de 1 a 10; y

b representa un número entero de 1 a 4.

[0079] Preferiblemente -T- representa

y a es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6.

[0080] Por lo tanto, un conjugado de fórmula general (X), en donde -T- representa

y a es un número entero seleccionado entre 2, 3, 4, 5 y 6 es especialmente preferido.

[0081] Preferiblemente, el enlazador -L- se selecciona entre: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le-, y -La-Ld-Le-;

-La- se selecciona de: -(CH²)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH²-CH²-OVCH ²-;

-Lb- representa -O-;

-Le- se selecciona entre: -(CH²)p¹-, -(CF²)p¹-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH²-(O-CH²-CH²)p¹- y-(CH²)p¹-O-(CH²)p²-; y o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí un número entero seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6. 6, en donde los enlazadores L de la invención son los que caen bajo la definición dada para la Fórmula (II) encima.

[0082] Por lo tanto, un conjugado de fórmula general (X), en donde -T-representa

a es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6;

-L- se selecciona de: -La-, -La-Le-, -La-Lb-Le- y -La-Ld-Le-;

-La- se selecciona de: -(CH2)o-, -(CH2-CH2-O)o-C2H4-, -(CH2-CH2-O)o-CH2-;

-Lb- representa -O-;

-Le- se selecciona entre: -(CH²)p¹-, -(CF²)p¹-, -C2H4-(O-CH2-CH2)p1-, -CH²-(O-CH²-CH²)p¹- y -(CH²)p¹-O-(CH²)p²-; y o, q, p1 y p2 son independientemente entre sí un número entero seleccionado entre 1,2, 3, 4, 5 y 6; es especialmente preferido, en donde los enlazadores L de la invención son los que caen bajo la definición dada para la Fórmula (II) anterior.

[0083] Por lo tanto, el -más preferido es un conjugado de fórmula general (X), en donde el enlazador -L- representa-(CH²)o-, o es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6;

-T- representa

y a es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 y 6.

[0084] Preferiblemente m está comprendido entre 5 y 15, incluso más preferiblemente entre 8 y 12.

[0085] En otra realización, dicho portador inmunogénico es preferiblemente un glucoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras y más preferiblemente (2S,3S,4fíj-1-(a-D-galactopiranosil)-2-hexacosanoilaminooctadecano 3,4-diol. El término glucoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras, como se usa en este documento, se refiere a un glucoesfingolípido adecuado capaz de estimular la respuesta del sistema inmunológico a un antígeno diana, pero que en sí mismo no confiere inmunidad como se define anteriormente.

[0086] Glicoesfingolípidos utilizados en la presente memoria son compuestos que contienen un resto de hidrato de carbono a-vinculado a un esfingolípido. Preferiblemente, el resto de carbohidrato es una hexopiranosa y lo más preferiblemente es a-D-galactopiranosa. Para el experto en la materia, los esfingolípidos son una clase de lípidos que contienen un aminoalcohol C18 conectado mediante un enlace amida a un ácido graso. El aminoalcohol C18 está preferiblemente mono, di o polisustituido con grupos hidroxilo. Especialmente preferido, el aminoalcohol C18 es fitoesfingosina. El ácido graso es preferiblemente un ácido monocarboxílico que tiene una cadena de alquilo saturada de un número de carbonos que varía de 16 a 28 y más preferiblemente de 18 a 26. Los glicoesfingolípidos con propiedades inmunomoduladoras incluyen, pero no se limitan a (2S,3S,4R)-1-(a-D-galactopiranosil)-2-hexacosanoilaminooctadecano-3,4-diol, que puede estimular actividad aniquilante natural (NK) y producción de citoquinas por células T aniquilantes naturales (NKT) y exhibe una potente actividad antitumoral in vivo (Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 1998, 95, 5690).

[0087] Los conjugados de los sacáridos de la fórmula general I con un glicoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras tienen la ventaja de ser estable al calor. Además, son capaces de producir en ratones altos títulos de anticuerpos IgG1, IgG2a e IgG3 contra el sacárido de fórmula general (I) y el polisacárido capsular de CRKP. Para que sea adecuado para la conjugación, se introduce una funcionalidad en el glucoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras. Dicha funcionalidad es propensa a reaccionar directamente con el grupo amino terminal del enlazador de los sacáridos de fórmula general I para proporcionar conjugados de los sacáridos de fórmula general I, o con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar el glucoesfingolípido modificado con propiedades inmunomoduladoras.

[0088] Preferiblemente, dicha funcionalidad se introduce en el carbono 6 del resto de galactosa de la glicoesfingolípidos con propiedades inmunomoduladoras. Así, el glucoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras se funcionaliza con una funcionalidad, que es propensa a reaccionar con el grupo amino terminal de los sacáridos o con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión. Una funcionalidad propensa a reaccionar con un grupo amino incluye, pero no se limita a éster activado, grupo isocianato, aldehído, epóxido, imidoéster, ácido carboxílico, alquil sulfonato y cloruro de sulfonilo. Una funcionalidad propensa a reaccionar con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión de modo que proporcionar al glucoesfingolípido modificado propiedades inmunomoduladoras que presenten el grupo funcional X de la molécula de interconexión incluye, pero no se limita a amina, alcohol, tiol, éster activado, grupo isocianato, aldehído, epóxido, vinilo, imidoéster, ácido carboxílico, alquilsulfonato, cloruro de sulfonilo, grupo vinilo, grupo alquinilo y grupo azido.

[0089] Preferiblemente, la funcionalidad introducida en el C6 del resto carbohidrato del glicoesfingolípido con propiedades inmunomoduladoras se selecciona entre el grupo que comprende o que contiene una amina, un tiol, un alcohol, un ácido carboxílico, un vinilo, maleimida, éster de a-yodoacetil, a-bromoacetil, W-hidroxisuccinimida (NHS) y 2-piridilditioles.

[0090] Dicho grupo funcional X de las moléculas de interconexión se selecciona del grupo que comprende o que consiste en: maleimida, a-yodoacetil, a-bromoacetil, W-hidroxisuccinimida éster (NHS), aldehído, ácido carboxílico, epóxido, alquilo sulfonato, sulfonilo cloruro, anhídrido y carbonato.

[0091] Como se usa en este documento, el término "molécula de interconexión" se refiere a una molécula bifuncional que contiene grupo funcional X y el grupo funcional Y, en donde el grupo funcional X es capaz de reaccionar con el grupo amino terminal en el enlazador -L- y el grupo funcional Y es capaz de reaccionar con una funcionalidad presente en el portador inmunogénico o en el soporte sólido.

[0092] Se encontró que un conjugado que comprende un sacárido de fórmula general (I), (II), (Il-a), (Il-b), (II-c), (III), (lll-a), (III-b), (III-c), (IV), (IV-a), (IV-b), (IV-c), (V), (Va), (Vb) o (Vc), y particularmente un conjugado de fórmula general (VI), (VII), (VII), (IX) y (X), provoca una respuesta inmune protectora en un huésped humano y/o animal, y por lo tanto es útil para la prevención y/o o tratamiento de enfermedades asociadas con la bacteria Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos. Por tanto, los conjugados que comprenden sacáridos de fórmula general I conjugados a un vehículo inmunogénico son útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la bacteria Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

Composiciones farmacéuticas

[0093] Otro aspecto de la presente descripción está dirigida a una composición farmacéutica o una vacuna que comprende un conjugado que comprende un sacárido de fórmula general (I) conjugado a un portador inmunogénico y/o un sacárido de fórmula general (I) junto con al menos un adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria protectora en un huésped humano y/o animal. Idealmente, la composición farmacéutica es adecuada para su uso en humanos.

[0094] El término "adyuvante" tal como se utiliza aquí, se refiere a un adyuvante inmunológico, es decir, un material utilizado en una composición de vacuna que modifica o aumenta los efectos de dicha vacuna mediante la mejora de la respuesta inmune a un antígeno dado contenido en la vacuna sin ser antigénicamente relacionado. Para los expertos en la técnica, los ejemplos clásicamente reconocidos de adyuvantes inmunológicos incluyen, pero no se limitan a, emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvante de Freund), saponinas, sales de aluminio o calcio (por ejemplo, alumbre), tensioactivos de polímero de bloques no iónicos y muchos otros.

[0095] Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en forma acuosa, particularmente en el punto de administración, pero que también se pueden presentar en formas líquidas no acuosas o en formas secadas por ejemplo, como cápsulas de gelatina, o como liofilizados, etc.

[0096] Las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más conservantes, como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren las composiciones sin mercurio y se pueden preparar vacunas sin conservantes.

[0097] Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio por ejemplo, para controlar la tonicidad. El cloruro de sodio (NaCl) es típico y puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro potásico, fosfato de dihidrógeno de potasio, dihidrato de fosfato de disodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

[0098] Las composiciones farmacéuticas pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg.

[0099] Las composiciones farmacéuticas pueden incluir compuestos (con o sin una sal de metal insoluble) en agua pura (p. ej. w.f.i.), pero por lo general incluyen uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Las sales tampón se incluirán típicamente en el rango de 5-20 mM.

[0100] Las composiciones farmacéuticas típicamente tienen un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo entre 6,0 y 8,0.

[0101] Las composiciones farmacéuticas son preferiblemente estériles y libres de gluten.

[0102] Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a pacientes animales (y, en particular, ser humano), y por lo tanto incluyen tanto usos humanos como veterinarios. Se pueden usar en un método para generar una respuesta inmune en un paciente, que comprende el paso de administrar la composición al paciente.

[0103] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar antes de que un sujeto se expone a un Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos y/o después de que un sujeto se expone a un Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0104] Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1 y 1,0 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.

[0105] La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención, por ejemplo contiene una dosis unitaria. Este dispositivo puede usarse para administrar la composición a un sujeto vertebrado.

[0106] La invención también proporciona un recipiente estéril (por ejemplo, un vial) que contiene una composición farmacéutica de la invención, por ejemplo contiene una dosis unitaria.

[0107] La invención también proporciona una dosis unitaria de una composición farmacéutica de la invención.

[0108] La invención también proporciona un recipiente herméticamente cerrado que contiene una composición farmacéutica de la invención. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, un vial.

[0109] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición liofilizada por pulverización). La composición se puede preparar para administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula, como un aerosol o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición se puede preparar como supositorio. La composición se puede preparar para administración nasal, auditiva u ocular, p. ej., en forma de spray o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicos.

[0110] Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad eficaz de un adyuvante es decir, una cantidad que, cuando se administra a un individuo, bien en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para aumentar la respuesta inmune a un antígeno Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos co-administrado. Esta cantidad puede variar según la salud y la condición física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primates no humanos, primates, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. La cantidad caerá en un rango relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina.

[0111] Las técnicas para la formulación y administración de la vacuna de la presente invención se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA.

[0112] Una dosis terapéuticamente eficaz de un conjugado de acuerdo con la presente invención o de un sacárido de fórmula general (I) se refiere a aquella cantidad del compuesto que resulta en una al menos una inmunización parcial contra una enfermedad. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos, farmacológicos y toxicológicos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación. La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. La cantidad real de composición administrada dependerá del sujeto que se esté tratando, del peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la forma de administración y el criterio del médico que prescribe.

Ensayos inmunológicos

[0113] Todavía otro aspecto de la presente descripción se refiere a sacáridos de fórmula general (I) para su uso como marcador en ensayos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0114] Dichos ensayos comprenden, por ejemplo, micromatrices y ELISA útiles para la detección de anticuerpos contra Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

[0115] Los sacáridos de la presente invención se pueden conjugar fácilmente a soportes sólidos para proporcionar ensayos inmunológicos útiles para la detección de anticuerpos contra Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos. Dichos soportes sólidos presentan en su superficie una funcionalidad propensa a reaccionar con el grupo amino de los sacáridos de fórmula general (I) o con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar soportes sólidos modificados, presentando en su superficie el grupo funcional X de la molécula de interconexión que además puede reaccionar con el grupo amino de los sacáridos de fórmula general (I). En una realización según la presente invención los soportes sólidos son portaobjetos de micromatrices, los cuales presentan en su superficie una funcionalidad propensa a reaccionar con el grupo funcional Y de la molécula de interconexión para proporcionar portaobjetos de micromatrices modificados, presentando en su superficie el grupo funcional X de la molécula de interconexión. Ejemplos de tales portaobjetos de micromatrices incluyen, pero no se limitan a portaobjetos revestidos con epóxido Corning® o portaobjetos revestidos con Corning® GAPS™ II.

[0116] En una realización preferida, los soportes sólidos son portaobjetos de micromatrices que presentan en su superficie una funcionalidad que es propensa a reaccionar con el grupo amino de sacáridos de fórmula general (I), y más preferiblemente un W-hidroxisuccinimida (NHS) éster activado. Dichos portaobjetos de micromatrices son, por ejemplo, portaobjetos CodeLink® NHS.

Descripción de las figuras

[0117]

La Figura 1 muestra la estructura química de la unidad repetida de polisacárido capsular de Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

La Figura 2 proporciona ejemplos de moléculas de interconexión disponibles comercialmente según la presente invención.

La Figura 3 proporciona ejemplos del grupo funcional X de la molécula de interconexión según la presente invención.

La Figura 4 : Evaluación de la inmunogenicidad del hexasacárido 23* en ratones mediante micromatrices. La inmunización con el conjugado CRM¹⁹⁷-23* induce altos títulos de anticuerpos en ratones.

(A) ratones C57BL/6 (n = 3) se inmunizaron por vía subcutánea con 3 dosis, conteniendo cada 3 pg de hexasacárido 23* en adyuvante de Freund. Se combinaron los sueros hiperinmunes y se determinó el título de punto final de los isotipos de IgG, IgM e IgG totales (lgG1, IgG2a e IgG3) mediante micromatriz de glucanos (B - F); respectivamente. Los títulos totales de IgG e IgM en suero en el día 49 se muestran en (G y H), respectivamente. Los títulos de anticuerpos se representaron gráficamente como valores de MFI de n = 3 ± SEM. Las barras representan valores medios SEM * P < 0,1, ** P < 0,05, *** P < 0,01 y **** P < 0,001.

Figura 5: Análisis de micromatrices de los sueros policlonales producidos en ratones por el conjugado CRM 197-23*. Los sueros hiperinmunes cultivados en ratones inmunizados con el conjugado CRM¹⁹⁷- 23* formulado con adyuvante de Freund se sometieron a análisis de micromatrices.

(A) Patrón de inmunización.

(B) Panel izquierdo que muestra el patrón de impresión de los portaobjetos de micromatrices

posición 1: hexasacárido 23* Gal(p1-3)[Rha(a1-4)]GalA(a1-2)Rha(a1-2)Rha(a1-2)Rha(a1 -1 )aminopentanol),

posición 2: trisacárido Rha(a1-2)Rha(a1-2)Rha(a1-1)aminopentanol,

posición 3: trisacárido Gal(p1- 3)[Rha(a1-4)]GalA(a1-2)aminopentanol),

posición 4: Polisacárido (C200, clado 1) correspondiente a CPS de la cepa de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos, cepa 34 (CPS-K34),

posición 5: polisacárido (clado 2) correspondiente a CPS de K. pneumoniae, y posición 6: polisacárido (no tipificable) correspondiente a CPS de K. pneumoniae.

Panel derecho es la exploración de micromatrices representante con sueros combinados de ratones (n = 3) inmunizados con el conjugado CRM¹⁹⁷-23* con inmunización de dos refuerzos.

(C) La reactividad cruzada del suero con oligosacáridos expresada como valores de MFI de n = 3 ± SEM.

(D) La reactividad cruzada en suero con polisacárido capsular de cepa de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos cepa 34 (CPS-K34) expresada como valores MFI de n = 3 ± SEM

Figura 6: Análisis de títulos de punto final. La inmunización con CRM ¹⁹⁷ -23* conjugado induce altos títulos de anticuerpos en conejos. Tres conejos (conejos Zika femenino, 10-12 semanas, 2,5-3 kg) se inmunizaron por vía subcutánea con 10 pg de azúcar equivalente CRM ¹⁹⁷ -23* conjugado en la formulación de alumbre el día 0 y 14. Los sueros se recogieron antes y después de la inmunización y la respuesta de anticuerpos se analizó mediante ELISA.

(A) Representación esquemática de inmunización y recolección de sueros.

(B) El título de punto final (IgG total) se determinó en los sueros combinados de los días 0, 14 y 21 (n = 3).

(C) La respuesta del anticuerpo se analizó en cada punto de tiempo y se representó como posibilidad de fold.

(D) El título de anticuerpos de conejo individual en los días 0 y 21. Cada punto representa el animal individual. Los datos se representaron como media geométrica con IC del 95%.

Figura 7: Análisis de micromatrices de los sueros obtenidos en conejos por el conjugado CRM ¹⁹⁷ -23*.

(A) Patrón de impresión de portaobjetos de micromatrices.

(B) análisis de micromatrices glucano después de la incubación de los portaobjetos con sueros conjugados agrupados (n = 3) anti-CRMw -23* (día 21).

(C) La intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada punto de concentración de 0,2 mM.

Ejemplos

A. Síntesis química

Información general:

[0118] Se utilizaron disolventes de calidad comercial a menos que se indique lo contrario. Los disolventes secos se obtuvieron de un Waters Dry Solvent System. Los disolventes para cromatografía se destilaron antes de su uso. Las reacciones sensibles se llevaron a cabo en material de vidrio secado con calor y bajo una atmósfera de argón. La cromatografía analítica en capa fina (TLC) se realizó sobre placas de vidrio Kieselgel 60 F254 prerrevestidas con un espesor de 0,25 mm de gel de sílice. Las manchas se visualizaron mediante tinción con solución de vainillina (6% (p/v) de vainillina y 10% (v/v) de ácido sulfúrico en 95% de EtOH) o tinción de Hanessian (5% (p/v) de molibdato de amonio, 1% (p/v) sulfato de cerio (II) y ácido sulfúrico al 10% (v/v) en agua). La cromatografía en columna de sílice se realizó en Fluka Kieselgel 60 (230-400 mesh).

Los espectros de RMN de 1H, 13C y bidimensionales se midieron con un espectrómetro Varian 400-MR a 296 K. Los cambios químicos (d) se informan en partes por millón (ppm) en relación con los respectivos picos de disolvente residual (CDCh: d 7,27 en 1H y 77,23 en 13C RMN; CD³OD: d 3,31 en 1H y 49,15 en 13C r Mn ). Las siguientes abreviaturas se utilizan para indicar multiplicidades de picos: s singlete; d doblete; dd doblete de dobletes; t triplete; dt doblete de tripletes; q cuarteto; m multiplete. Las constantes de acoplamiento (J) se expresan en hercios (Hz). Las medidas de rotación óptica (OR) se llevaron a cabo con un polarímetro Schmidt & Haensch UniPol L1000 a A = 589 nm y una concentración (c) expresada en g/100 mL en el solvente indicado entre paréntesis. La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se realizó en la Free University Berlin, Mass.

[0119] Spectrometry Core Facility, con un espectrómetro de masas Agilent 6210 ESI-TOF. Los espectros de infrarrojos (IR) se midieron con un espectrómetro Perkin Elmer 100 FTIR.

Abreviaturas

[0120]

Al: alilo;

TBAI: yoduro de tetrabutilamonio;

Bn: bencilo;

Cbz: benciloxicarbonilo;

EtOAc: acetato de etilo;

Lev: levulinoilo;

PMB: 4-metoxibenciloxilo;

Tr: trifenilmetilo.

Ejemplo A-1: Síntesis de 1,2-0-isopropilideno-3-0-alil-5-O-trifenilmetil-a-D-xilofuranósido (2*)

[0121]

[0122] El alcohol 1* (Chem Eur. J. 2013, 19, 3995-4002) (21 g, 48,6 mmol) se disolvió en DMF seca (140 ml) y se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente NaH al 60% (3,88 g, 97 mmol). Después de 5 min, se añadieron AIlBr (8,4 ml, 97 mmol) y TBAI (1,79 g, 4,86 mmol). Se dejó agitar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se inactivó con una solución sat. NH4Cl y luego se vierte en agua helada. La mezcla se extrajo con CH²Cl². La capa orgánica combinada se lavó con una solución sat. NH4Cl y agua, se secó y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 20/1 a 10/1 a 1/1) para dar el compuesto diana 2* (22,9 g, cant.). [a]D25 = -2,85 (c = 1,07, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,46- 7,21 (m, 15 H), 5,88 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,71 (m, 1H), 5,13 (m, 2 H), 4,54 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,04 (dd, J = 5,6, 12,8 Hz, 1H), 3,98 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 5,6, 12,8 Hz, 1H), 3,50 (dd, J = 5,2, 8,8 Hz, 1H), 3,31 (dd, J = 7,6, 8,8 Hz, 1H), 1,54 (s, 3 H), 1,33 (s, 3 H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5143,9, 134,2, 128,8, 127,9, 127,1, 117,6, 111,7, 105,0, 86,9, 82,6, 81,5, 79,4, 71,3, 60,7, 26,9, 26,3; HRMS (ESI): calculado para C30H32O5Na [M+Na]+ : 495,2147, encontrado: 495,2167.

Ejemplo A-2: Síntesis de 3-0-alil-4,5-0-isopropilideno-D-xilosa di(etiltio)acetal (3*)

[0123]

[0124] Acetónido 2* (9,5 g, 20,1 mmol) se disolvió en CH²Cl²(80,4 ml) y se enfrió a 0°C. Se añadieron EtSH (29,7 ml, 402 mmol) y ZnBr²(22,64 g, 101 mmol) y la mezcla se agitó a 0°C durante 75 min. La reacción se detuvo añadiendo una solución acuosa al 5% de hidróxido de amonio y la suspensión resultante se diluyó con CH²CL y 1 M HCI ac.. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con CH²Cl². Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/3 a EtOAc) para dar el alcohol (5,44 g, 18,36 mmol). Se añadió pTsOH (524 mg, 2,75 mmol) a una solución del triol anterior (5,44 g, 18,36 mmol) en acetona (124 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y la reacción se interrumpió con una solución acuosa sat. NAHCO³. La suspensión se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexano/EtOAc = 4,5/1) para dar alcohol 3* (4,13 g, 61% para dos pasos). [a]D25 = 43,76 (c = 0,98, CHCta); 1H RMN (400 MHz, CDCh) 55,92 (m, 1H), 5,22 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,38 (m, 2 H), 4.14 (dd, J = 6,8, 12,4 Hz, 1H), 4,02 (m, 2H), 3,79 (dd, J = 1,6, 6,8 Hz, 1H), 3,69 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 3,43 (dd, J = 1,2, 8,4 Hz, 1H), 3,10 (br, 1H), 2,56-2,75 (m, 4H), 1,40 (s, 3H), 1,34 (s, 3H), 1,25 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,24 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5 135,0, 117,0, 109,3, 78,7, 77,7, 73,4, 72,2, 65,9, 55,3, 26,7, 25,5, 25,2, 24,1, 14,6, 14,5; HRMS (ESI): calculado para C15H2sO4S2Na [M+Na]+: 359,1327, encontrado: 359,1331.

Ejemplo A-3: Síntesis de 2-0-Bencil-3-0-alil-4,5-0-isopropiliden-D-xilosa di(etiltio)acetal (4*)

[0125]

3* 4*

[0126] El alcohol 3* (4,12 g, 12,27 mmol) se disolvió en THF seco (40 ml) y se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente NaH al 60% (0,98 g, 24,54 mmol). Después de 5 min, se añadieron BnBr (2,2 ml, 18,41 mmol) y TBAI (0,29 g, 1,23 mmol). Se dejó agitar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se inactivó con MeOH y se concentró al vacío. El residuo se diluyó con EtOAc. La mezcla se lavó con agua, se secó y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 12/1) para dar el compuesto objetivo 4* (5,2 g, 99%). [a]^D25= 11,80 (c = 0,98, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,32-7,17 (m, 5H), 5,81 (m, 1H), 5,14 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,08 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 3,86 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 3,81 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 3,71 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 3,63 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 2,52-2,75 (m, 4H), 1,35 (s, 3H), 1,26 (s, 3H), 1,20 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,17 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCL) 5 138,3, 134,9, 128,2, 127,9, 127,6, 116,8, 108,8, 82,7, 79,9, 76,4, 74,7, 73,8, 65,8, 52,4, 26,5, 25,7, 25,6, 25,2, 14,5, 14,4 ; HRMS (ESI): calculado para C22H34O4SaNa [M+Na]+: 449,1796, encontrado: 449,1802.

Ejemplo A-4: Síntesis de 2-0-bencil-3-0-alil-D-xilosa di(etiltio)acetal (5*)

[0127]

[0128] Acetónido 4* (5,2 g, 12,19 mmol) se disolvió en 70% HOAc ac. (121 ml). Se dejó agitar la mezcla a 50°C durante 3 h. La mezcla se concentró al vacío. El residuo se co-evaporó dos veces con tolueno y luego se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/1,4) para dar el compuesto 5 * (4,59 g, 98%). [a]D25 = 1,60 (c = 0,78, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,33-7,20 (m, 5H), 5,80 (m, 1H), 5,13 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,21 (dd, J = 5,6, 12,4 Hz, 1H), 3,97-4.03 (m, 3H), 3,76 (br, 1H), 3,58-3,69 (m, 3H), 2,54-2,75 (m, 6 H), 1,19 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) 5138,3, 134,5, 128,3, 127,9, 127,6, 117,7, 83,1,80,9, 75,3, 74,1,71,1,64,4, 53,1,26,0, 25,2, 14,5, 14,5; HRMS (ESI): calculado para C1gH3üO4S2Na [M+Na]+: 409,1483, encontrado: 409,1488.

Ejemplo A-5: Síntesis de 2-0-Alil-3-0-bencil-L-freo-dialdosis di(etiltio)acetal (6*)

[0129]

[0130] NalO4 (1,508 g, 7,05 mmol) en H²O (20 ml) se añadió a una solución de diol 5* (2,42 g, 6,27 mmol) en THF (79 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 2 h, la mezcla se diluyó con CH²Cl²y se lavó con una solución acuosa sat. NaHCO3 y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 7/1) para dar el aldehído 6* (1,34 g, 60%) y el diol de partida 5* (474 mg, 20%). [a]D25 = 1,27 (c = 34,61, CHCls); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 59,79 (s, 1H), 7,28 - 7,20 (m, 5H), 5,81 (m, 1H), 5,16 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 6,0, 12,8 Hz, 1H), 3,98-4,07 (m, 3H), 2,51-2,70 (m, 4H), 1,20 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,14 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5201,8, 137,5, 133,9, 128,5, 128,3, 128,0, 118,6, 83,1,83,0, 74,8, 72,9, 52,3, 26,1, 25,5, 14,5, 14,3; HRMS (ESI): calculado para C1sH26O3S2Na [M+Na]+: 377,1221, encontrado: 377,1220.

Ejemplo A-6: Síntesis de (R)-4-Bencil-3-((2S, 3R, 4S, 5R)-4-alilxi-5-bencilxi-6,6-bis (etiltio)-3-hidroxi-2-(4- bencilxi) hexanoilo)oxazolidin-2-ona (8*)

[0131]

[0132] Una solución agitada de di-/'sopropilamina (0,978 ml, 6,86 mmol) en THF (11 ml) se enfrió a -20°C y n-BuLi (2,74 ml, 2,5 M en hexano, 6,86 mmol) se añadió gota a gota y se agitó durante 30 min, luego se volvió a enfriar a -78°C y el 7* auxiliar (2,44 g, 6,86 mmol) como una solución en 5,5 ml de THF se añadió a la mezcla durante un período de 20 min. Después de 1,5 h, se disolvió el aldehído 6* (1,2 g, 3,43 mmol) en 9,8 ml de THF y se añadió a la mezcla durante un período de 30 min. La reacción se interrumpió después de 2 h mediante la adición de 33 ml de solución sat. ac. de NH4Cl y luego se calentó a ta, donde la mezcla se agitó durante otros 30 min. La mezcla se extrajo con CH²Cl²(3 x 150 ml) y se secó sobre MgSO4, El disolvente se eliminó a vacío y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna flash sobre gel de sílice (gradiente de hexanos/EtOAc = 8:1-3:1) para proporcionar 8* (1,78 g, dr = 10,4/1, 73%). [a]D25 = -30,3 (c = 1,09, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,31 - 7,10 (m, 12H), 6,79 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,79 (m, 1H), 5,42 (br s, 1H), 5,18 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,62 (m, 1H), 4,55 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,28 (m, 1H), 4,17 3,91 (m, 7 H), 3,70 (s, 3H), 3,11 (dd, J = 2,8, 13,2 Hz, 1H), 2,81 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 2,71-2,49 (m, 5 H), 1,17 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 1,14 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5171,4, 159,6, 153,1, 138,4, 135,0, 134,9, 130,2, 129,5, 129,4, 129,0, 128,3, 128,2, 128,1, 127,9, 127,4, 127,3, 116,2, 113,9, 113,8, 83,0, 78,5, 77,5, 74,7, 72,9, 72,4, 71,9, 66,9, 55,3, 54,9, 52,8, 37,8, 25,8, 25,3, 14,5, 14,5; HRMS (ESI): calculado para Cse^/NOeSaNa [M+Na]+: 732,2641, encontrado: 732,2650.

Ejemplo A-7: Síntesis de (R)-4-Bencil-3-((2S,3R,4S,5R)-4-alilxi-5-bencilxi-6,6-bis(etiltio)-3-levulinoxi-2-(4-bencilxi)hexanoilo)oxazolidin-2-ona (9*)

[0133]

[0134] Alcohol 8* (1,65 g, 2,32 mmol) se disolvió en CH²Cl²(43 ml). A la solución se agitó a ta, ácido levulínico, (0,35 ml, 3,49 mmol) de 4-dimetilaminopiridina (455 mg, 3,72 mmol) y di-/'sopropilcarbodiimida (0,55 ml, 3,49 mmol) se añadieron. Después de 12 h, se añadió la misma cantidad de ácido levulínico, 4-dimetilaminopiridina y di /sopropilcarbodiimida y la mezcla se agitó durante 6 h más. Después de filtrar sobre celite, el disolvente se eliminó al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexanos/EtOAc = 2:1) para producir el éster 9* (1,88 g, cant.) Como el aceite amarillo pálido. [a]D25 = 3,72 (c = 0,96, CHCl3); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 57,32-7,15 (m, 12H), 6,77 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,83 (m, 1H), 5,68 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 5,45 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,53 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,45 (s, 2H), 4,36-4,26 (m, 3H), 4,11-4,00 (m, 3H), 3,94 (m, 1H), 3,74-3,64 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,16 (dd, J = 2,8, 13,6 Hz, 1H), 2,68-2,44 (m, 9 H), 1,96 (s, 3H), 1,18 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 1,14 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CHClg) 5 206.1, 172,0, 170,1, 159,5, 153,0, 138,6, 135,9, 135,0, 130,6, 130,0, 129,4, 129,1, 128,9, 128,0, 128,0, 127,2, 127,1, 116.1, 113,9, 113,6, 81,9, 75,3, 74,5, 72,8, 72,6, 71,9, 66,8, 66,3, 55,4, 55,3, 53,4, 37,8, 37,1, 29,8, 28,1, 25,6, 24,7, 14,4, 14,4; HRMS (ESI): calculado para C43H53NO1üS2Na [M+Na]+: 830,3009, encontrado: 830,2964.

Ejemplo A-8: Síntesis de (R)-4-Bencil-3-((etil 3-0-alil-2-0-bencil-4-0-levulinoil-1-tio-a-D-galactopiranósido)oxazolidin-2-ona)uronato (10*)

[0135]

[0136] Parametoxibencil éter 9* (1,85 g, 2,29 mmol) se disolvió en una mezcla de 5% de TFA en CH²Cl²(30,2 ml) y se agitó a ta. Después de 5 min, se añadió anisol anhidro (0,45 ml, 4,14 mmol). La reacción se detuvo después de 13 h mediante la adición de solución sat. ac. de NaHCO3 (195 ml) y CH²CL (98 ml). La capa acuosa se separó y se extrajo con CH²Cl²(3 x 200 mL). El disolvente se eliminó al vacío y el producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,2:1 a 1:1,2) para proporcionar 10* (1,26 g, a/p = 3,9/1, 88%) como espuma blanca. [a]D25 = 82,49 (c = 1,12, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,34-7,15 (m, 10H), 5,87-5,75 (m, 3H), 5,47 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H), 4,16-3,99 (m, 5 H), 3,75 (dd, J = 3,2, 10,0 Hz, 1H), 3,20 (dd, J = 3,2, 13,6 Hz, 1H), 2,64-2,39 (m, 7 H), 2,02 (s, 3H), 1,19 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CHClg) 5205,8, 172,3, 166,9, 153,3, 138,0, 135,5, 134,3, 129,3, 129,1, 128,4, 128,0, 127,8, 127,3, 117,4, 84,3, 75,6, 74,0, 72,9, 71,1,69,5, 68,7, 67,3, 55,4, 37,9, 37,3, 29,8, 28,0, 24,2, 14,6; HRMS (ESI): calculado para C³³H³gOgNS²Na [M+Na]+: 648,2243, encontrado: 648,2237.

Ejemplo A-9: Síntesis de (etil 3-0-alil-2-0-bencil-4-0-levulinoil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato de metil (11*)

[0137]

[0138] Oxazolidinona 10* (1,02 g, 1,63 mmol) se disolvió en MeOH (9,7 ml) y se añadió Sm(OTf)3 (293 mg, 0,49 mmol). La mezcla se agitó vigorosamente durante 60 h a ta. Después, los disolventes se eliminaron al vacío y el producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna flash de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,2/1) para producir el compuesto 11* (634 mg, 81%). [a]D25 = 122,62 (c = 1,05, CHClg); 1H RMN (400 MHz, CDClg) 5 7,31 - 7,19 (m, 5H), 5,78 (m, 1H), 5,64 (dd, J = 1,6, 3,6 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,86 (br s, 1H), 4,65 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4,05 (dd, J = 5,2, 12,8 Hz, 1H), 3,95 (dd, J = 5,6, 12,8 Hz, 1H), 3,88 (dd, J = 5,6, 9,6 Hz, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,63 (dd, J = 3,6, 10,0 Hz, 1H), 2,71 -2,39 (m, 6 H), 2,08 (s, 3H), 1,18 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CHClg) 5205,9, 171,3, 168,0, 137,9, 134,3, 128,3, 127,9, 127,8, 117,2, 83,9, 75,4, 74,0, 72,9, 71,0, 69,0, 68,8, 52,6, 37,9, 29,7, 27,9, 24,0, 14,6; HRMS (ESI): calculado para C²⁴H³²O⁸NSNA [M+Na]+: 503,1716, encontrado: 503,1701.

Ejemplo A-10: Síntesis de (etil 3-0-alil-2-0-bencil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato de metil (12*)

[0139]

NH2NH2-H2 .

[0140] Ester de levulinato 11* (322 mg, 0,67 mmol) se disolvió en CH²CI²(7 ml). Posteriormente, se añadieron piridina (1,6 ml), AcOH (1,1 ml) e hidrato de hidrazina (65 ml). Después de agitar a ta durante 2,5 h, la mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de acetona (7 ml) y los disolventes se eliminaron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna flash de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,5/1 a 1/1) para dar alcohol 12* (244 mg, 95%). [a]D25 = 84,74 (c = 0,23, CHCls); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,31 - 7,20 (m, 5H), 5,85 (m, 1H), 5,39 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,77 (br s, 1H), 4,61 (s, 2H), 4,31 (br s, 1H), 4,19 4,06 (m, 2H), 3,97 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,58 (dd, J = 3,2, 9,6 Hz, 1H), 2,58-2,42 (m, 3H), 1,20 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5169,2, 137,8, 134,3, 128,4, 128,0, 127,8, 117,6, 83,4, 74,4, 72,7, 71,8, 70,1,68,5, 52,5, 24,0, 14,7; HRMS (ESI): calculado para C19H26O6SNa [M+Na]+: 405,1348, encontrado: 405,1329.

Ejemplo A-11: Síntesis de metil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^4)-(etil 3-0-alil-2-0-bencil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato (14*)

[0141]

[0142] Donante 13* (Eur. J. Org. Chem. 2008, 5526-5542) (885 mg, 1,66 mmol) y aceptor 12* (319 mg, 0,83 mmol) se disolvieron en CH²Cl²seco (8 ml). Se añadieron 4Á MS (800 mg). La mezcla se agitó a ta durante 20 min y luego se enfrió a 0°C, seguido de la adición lenta de TBSOTf (38 gl, 0,16 mmol). Después de 1 h, la reacción se inactivó con Et3N. La mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 3/1) para dar 14* (612 mg, 98%). [a]D25 = 50,77 (c = 0,25, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,34-7,15 (m, 15H), 5,84 (m, 1H), 5,44 (br, 1H), 5,39 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,20 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,07 (br, 1H), 4,79 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,76 (br, 1H), 4,65 (s, 2H), 4,55 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,38 (br s, 1H), 4,30 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,20-4.08 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,62 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 3,28 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 2,55-2,39 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,19 (m, 6H); 13C RMN (101 MHz, CHCls) 5170,1, 168,8, 139,0, 138,2, 137,8, 134,6, 128,5, 128,5, 128,4, 128,2, 128,2, 128,2, 128,1, 128,0, 127,7, 127,5, 127,4, 117,0, 99,3, 84,1, 79,6, 78,1, 78,0, 75,1,74,8, 73,7, 72,8, 72,0, 71,9, 70,4, 68,8, 68,4, 52,6, 24,2, 21,2, 18,1, 14,8; HRMS (ESI): calculado para C41H50OnSNa [M+Na]+: 773,2972, encontrado: 773,2953.

Ejemplo A-12: Síntesis de metil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^4)-(etil 2-0-bencil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato (15*)

[0143]

[0144] Bajo una atmósfera de argón, una solución de Ir[COD(PCH³PH²)²]PF⁶(5,63 mg, 6,66 pmol) en THF (1 ml) se desgasificó mediante vacío y gaseado con H²(~ 5 ciclos). La reacción se agitó bajo una atmósfera de H²a ta durante 20 min antes de desgasificar la solución al vacío y gasificarla con argón (~ 5 ciclos). A este matraz de reacción, una solución de un alil disacárido protegido 14* (25 mg, 33 pmol) en THF (1 ml) se añadió mediante una jeringa en una porción a ta. La reacción se agitó a ta durante 21 h antes de concentrarse al vacío. El producto crudo se trató con p-TsOH (1,3 mg, 6,66 pmol) en una mezcla de CH²Cl²y MeOH (2 ml, v/v = 1/1) durante 12 h a ta. La mezcla se diluyó con EtOAc, se lavó con NaHCO3 sat., se secó sobre Mg2SO4 y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2/1) para dar alcohol 15* (16 mg, 68%).

[a]D25 = 38,5 (c = 0,16, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,34-7,19 (m, 15H), 5,55 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,41 (br s, 1H), 5,11 (br s, 1H), 4,80 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,78 (br s, 1H), 4,65 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,40 (br s, 1H), 4,34 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 3,94 (m, 1H), 3,86 (dd, J = 2,4, 10,0 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,55 (m, 1H), 3,29 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 2,40-2,57 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,20 (m, 6H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5170,3, 168,7, 139,0, 138,2, 137,0, 128,7, 128,4, 128,4, 128,3, 128,2, 127,7, 127,5, 127,4, 99,4, 83,2, 79,7, 78,0, 75,6, 74,9, 74,9, 71,9, 71,9, 70,7, 70,2, 68,8, 68,4, 52,6, 29,8, 24,3, 21,3, 18,1, 14,9; HRMS (ESI): calculado para C38H46OnSNa [M+Na]+: 733,2659, encontrado: 733,2680.

Ejemplo A-13: Síntesis de 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1—4)-[2-0-acetil-3,4,6-tri-0-bencil-p-D-galactopiranosil-(1 —^ 3)]-(etil 2-0-bencil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato de metil (17*)

[0145]

[0146] Donante 16* (J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 15556-15562) (323 mg, 0,51 mmol) y el aceptor 15* (90 mg, 0,12 mmol) se disolvieron en CH²Cl²(2 ml). Se añadieron 4Á MS (200 mg). La mezcla se agitó durante 30 min a ta, luego se enfrió a -30°C, seguido de la adición lenta de TBSOTf (9 pl, 0,038 mmol). Después de agitar a -30°C durante 1,5 h, la mezcla de reacción se inactivó con Et³N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 3/1 a 2/1) para producir el trisacárido 17* (123 mg, 82%). [a]D25 = 20,48 (c = 0,18, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,30 a 7,14 (m, 30H), 5,43 (m, 1H), 5,31 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,28 - 5,24 (m, 2H), 4,86 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,70-4,47 (m, 9 H), 4,41 -4,32 (m, 4H), 4,05 (dd, J = 6.0, 10,0 Hz, 1H), 3,94 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1H), 3,81 (br, 1H), 3,74 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,64 (s, 3H), 3,55 (m, 2H), 3,49-3,44 (m, 2H), 3,38 (dd, J = 2,8, 10,0 Hz, 1H), 3,27 (t, J = 12,0 Hz, 1H), 2,52-2,35 (m, 2H), 1,97 (s, 3H), 1,87 (s, 3H), 1,17 (m, 6H); 13C RMN (101 MHz, CDCh) 5170,2, 169,3, 168,6, 163,4, 139,0, 138,5, 138,4, 137,8, 137,8, 137,4, 128,6, 128,4, 128,4, 128,4, 128,3, 128,3, 128,2, 128,1, 128,1, 127,8, 127,8, 127,7, 127,5, 127,5, 127.4, 127,3, 102,1,98,6, 83,8, 80,0, 79,5, 78,4, 77,1,76,1, 74,7, 74,4, 73,8, 73,7, 73,5, 72,7, 72,6, 71,9, 71,7, 71,2, 70.4, 68,6, 68,2, 68,1, 52,5, 24,0, 21,1, 20,9, 18,0, 14,7; HRMS (ESI): calculado para C s/H /sO ^N a [M+Na]+: 1207,4701, encontrado: 1207,4667.

Ejemplo A-14: Síntesis de 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1—4)-[2-0-acetil-3,4,6-tri-0-bencil-p-D-galactopiranosil-(1—3)]-(metil 2-0-bencil-D-galactopiranósido)uronato 1 -W-feniltrifluoroacetimidato (18*)

[0147]

[0148] A una solución de trisacárido 17* (140 mg, 0,118 mmol) en acetona y agua (4/1,5 ml), ácido tricloroisocianúrico (27 mg, 0,118 mmol) se añadió a 0°C. Luego, la mezcla de reacción se calentó gradualmente a ta y se agitó durante la noche. La acetona se evaporó al vacío. El residuo se diluyó con CH²CI²y se lavó con una solución sat. NaHCÜ³y agua. La capa orgánica se secó sobre MgSÜ4 anhidro. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (Hexanos/EtOAc = 1/1,5 -1/2) para dar el hemiacetal (90 mg, 72%). A una solución de hemiacetal (90 mg, 0,079 mmol) en acetona (4 ml) se le añadió K²CO³(33 mg, 0,24 mmol) y PhN = C(Cl)CF3 (49 mg, 0,24 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a ta. La solución se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,5/1) para dar imidato 18* (97 mg, 94%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 7,37-7,26 (m, 32 H), 7,09 (m, 1H), 6,83 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 5,53 (br, 1H), 5,44 (br, 1H), 5,40 (dd, J = 8,4, 10,0 Hz, 1H), 4,99-4.90 (m, 2H), 4,85-4,80 (m, 3H), 4,70-4,50 (m, 8 H), 4,43 (s, 2H), 3,97-3.90 (m, 4H), 3,78 (s, 3H), 3,64-3,56 (m, 2H), 3,53-3,37 (m, 4H), 2,14 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,31 (d, J = 8,0 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5 170,2, 169,1, 167,2, 143,3, 139,1, 138,5, 138,4, 137,9, 137,8, 137,3, 128,6, 128,5, 128,5, 128,4, 128,3, 128,3, 128,2, 128,2, 127,9, 127,9, 127,6, 127,6, 127,5, 127,5, 127,3, 124,3, 119,3, 101,6, 98,3, 79,9, 79,5, 78,2, 78,0, 77,5, 75,5, 74,8, 74,5, 74,4, 73,9, 73,8, 73,6, 72,6, 71,9, 71,8, 71,0, 68,5, 68,2, 68,2, 52,8, 21,3, 20,8, 18,0; HRMS (ESI): calculado para C⁷³H76F3NO18Na [M+Na]+: 1334,4912, encontrado: 1334,4892.

Ejemplo A-15: Síntesis de W-fbencil) bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 3,4-di-O-bencil-a-L-ramnopiranósido (19*)

[0149]

[0150] Donante 13* (209 mg, 0,39 mmol) y el enlazador (Org. Lett. 2013, 15, 2270-2273) (99 mg, 0,3 mmol) se disolvieron en CH²CL seco (4 ml). Se añadió 4Á MS (200 mg). La mezcla se agitó a ta durante 30 min y luego se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente TBSOTf (18 gl, 0,079 mmol) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 1 h, la mezcla de reacción se inactivó con Et³N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,8/1) para dar el monosacárido intermedio. Dicho monosacárido se disolvió en MeOH/CH²Cl²seco (3 ml, v/v = 1/1). Se añadió una solución de NaOMe (0,09 ml, 0,5 M) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a ta. Luego, la reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,8/1 a 1/1) para dar alcohol 19* (102 mg, 53% para dos pasos). [a]D25 = -23,36 (c = 1,02, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,27 - 7,09 (m, 20H), 5,07 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 4,78 (dd, J = 2,4, 10,8 Hz, 1H), 4,67 (br, 1H), 4,59 (br, 2H), 4,52 (dd, J = 2,4, 11,2 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 3,92 (br, 1H), 3,73 (m, 1H), 3,61 (br, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 3,24-3.10 (m, 3H), 1,44 (m, 4H), 1,22 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,18 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCL) 5156,7, 156,1, 138,3, 138,0, 137,9, 136,8, 136,7, 128,5, 128,5, 128,4, 128,0, 127,9, 127,8, 127,8, 127,7, 127,3, 127,2, 98,9, 80,1, 80,0, 75,4, 71,9, 68,5, 67,2, 67,2, 50,5, 50,2, 47,1,46,1,29,1,27,9, 27,5, 23,4, 17,9; HRMS (ESI): calculado para C⁴⁰H⁴⁷NO⁷Na [M+Na]+: 676,3250, encontrado: 676,3265.

Ejemplo A-16: Síntesis de W-fbencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-3,4-di-O-bencil-a-L-ramnopiranósido (20*)

[0151]

[0152] El aceptor 19* (303 mg, 0,46 mmol) y el donante 13* (369 mg, 0,69 mmol) se disolvieron en CH²CL seco (4,5 ml). Se añadieron 4Á MS (600 mg). La mezcla se agitó a ta durante 30 min y luego se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente TBSOTf (21 gl, 0,093 mmol) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 1 h, la reacción se inactivó con Et3N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,8/1) para dar el disacárido intermedio. Dicho disacárido se disolvió en ChbCb/MeOH (2 ml, v/v = 1/1). Se añadió NaOMe (50 mg, 0,93 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a ta. La mezcla de reacción se inactivó con resina ácida y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hex/EA = 2/1) para producir alcohol 20* (389 mg, 86%). [a]D25 = -20,34 (c = 0,88, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,27 - 7,09 (m, 30H), 5,07 (d, J = 12,8 Hz, 2H), 5,00 (br, 1H), 4,79 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,62 (s, 2H), 4,60-4,56 (m, 3H), 4,52 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 9,6 Hz, 2H), 4,05 (m, 1H), 3,90 (br, 1H), 3,79 (dd, J = 7,2, 9,2 Hz, 1H), 3,76-3,70 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,39 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 3,29 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,23-3,09 (m, 3H), 1,41 (m, 4H), 1,21 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,19 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,16 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5 156,7, 156,2, 138,5, 138,4, 138,3, 138,0, 137,9, 128,8, 128,6, 128,5, 128,4, 128,4, 128,2, 128,2, 128,0, 128,0, 128,0, 127,9, 127,8, 127,7, 127,3, 127,2, 100.7, 98,8, 80,4, 80.0, 79.9, 79,5, 75,4, 74.7, 72,2, 72,2, 68.7, 67.9, 67,8, 67,2, 50,5, 50,2, 47,1,46,1, 29,2, 28,0, 27,6, 23,4, 18,1, 18,0; HRMS (ESI): calculado para C6üH69NO11Na [M+Na]+: 1002,4768, encontrado: 1002,4791.

Ejemplo A-17: Síntesis de W-(bencil) bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-3,4-di-O-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranósido (21*)

[0153]

[0154] Aceptor 20* (389 mg, 0,39 mmol) y el donante 13* (316 mg, 0,59 mmol) se disolvieron en CH²Cl²seco (4 ml). Se añadieron 4Á MS (650 mg). La mezcla se agitó a ta durante 30 min y luego se enfrió a 0°C, seguido de la adición lenta de TBSOTf (18 gl, 0,079 mmol). Después de 1 h de agitación a 0°C, la mezcla de reacción se inactivó con Et3N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,8/1) para dar el trisacárido intermedio. Dicho trisacárido se disolvió en CH²Cl²/MeOH (2 ml, v/v = 1/1). Se añadió NaOMe (43 mg, 0,79 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a ta, luego la mezcla de reacción se inactivó con resina ácida y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,5/1) para producir alcohol 21 * (449 mg, 87%). [a]D25 = -25,55 (c = 1,00, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,44-7,21 (m, 40H), 5,23 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 5,19 (br, 1H), 5,14 (br, 1H), 4,95-4,90 (m, 3H), 4,76-4,62 (m, 9 H), 4,55 (d, J = 9,6 Hz, 2H), 4,19 (br, 2H), 3,96-3,78 (m, 7 H), 3,65-3,37 (m, 6H), 3,34-3,21 (m, 3H), 1,56-1,45 (m, 4H), 1,42 (m, 2H), 1,36 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,27 (d, J = 6,0 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5 156,7, 156,2, 138,5, 138,4, 138,3, 138,3, 138,0, 137,9, 136,9, 136,8, 128,6, 128,6, 128,6, 128,5, 128,4, 128,4, 128,2, 128,1, 128,0, 128,0, 127,9, 127,9, 127,8, 127,7, 127,7, 127,6, 127,3, 127,2, 100,5, 100,5, 98,8, 80,4, 80,3, 80,1, 79,7, 79,6, 79,2, 75,5, 75,3, 74,6, 74,5, 72,4, 72,2, 72,0, 68,8, 68,4, 68,0, 67,9, 67,2, 50,5, 50,2, 47,1, 46,1, 29,7, 29,2, 28,0, 27,6, 23,4, 18,1, 18,1, 17,9; HRMS (ESI): calculado para C80H91NO15Na [M+Na]+: 1328,6286, encontrado: 1328,6217.

Ejemplo A-18: Síntesis de W-(bencil) bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^4)-[2-0-acetil-3,4,6-tri-0-bencil-p-D-galactopiranosil-(1^3)]-(metil 2-0-bencil-a-D-galactopiranosiluronato)-(1^2)-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranósido (22*)

[0155]

[0156] N-feniltrifluoroacetimidato 18* (65 mg, 0,050 mmol) y aceptor de trisacárido 21 * (32 mg, 0,025 mmol) en Tol/Et²O (1,1 ml, v/v 10/1). Se añadieron 4Á MS (100 mg). La mezcla se agitó a ta durante 20 min y luego se enfrió a -702C. Se añadió lentamente una solución de TBSOTf en tolueno (0,10 ml, 0,05 M). Después de agitar a -70°C durante 3 h, la mezcla de reacción se calentó lentamente a ta. La mezcla de reacción se inactivó con Et3N. La mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Tolueno/EtOAc = 10/1) para dar el isómero a 22* de hexasacárido (48,8 mg, 81%) y el isómero p 22* (10,2 mg, 17%). Hexasacárido isómero a 22*: [a]D25 = 15,01 (c = 0,11, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,35-7,09 (m, 70H), 5,56 (br, 1H), 5,39-5,35 (m, 2H), 5,17 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 5,09 (br, 1H), 4,98 (br, 1H), 4,95-4.77 (m, 8 H), 4,73-4,66 (m, 3H), 4,63-4,53 (m, 11 H), 4,48-4,28 (m, 9 H), 4,18-4.11 (m, 3H), 4,09 (m, 1H), 3,89-3,84 (m, 4H), 3,82 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,80- 3,74 (m, 3H), 3,73-3,68 (m, 2H), 3,67-3,61 (m, 2H), 3,58-3,53 (m, 3H), 3,51-3,48 (m, 2H), 3,47 (s, 3H), 3,42 (dd, J = 2,8, 10,0 Hz, 1H), 3,37-3,32 (m, 2H), 3,31 (m, 1H), 3,28-3.15 (m, 5 H), 2,01 (s, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,50-1,41 (m, 4H), 1,33-1,15 (m, 14 H); 13C RMN (151 MHz, CDCla) 5169,9, 169,2, 169,0, 139,2, 138,8, 138,6, 138,4, 138,0, 137,9, 128.6, 128,5, 128,5, 128,5, 128,5, 128,4, 128,4, 128,4, 128,3, 128,2, 128,2, 128,1, 128,0, 128,0, 127.9, 127,8, 127,8, 127.7, 127.7, 127,6, 127,5, 127,4, 127,3, 127,3, 113,6, 102,4, 100,6, 98,8, 98,7, 98,5, 96,9, 80,7, 80,5, 80,4, 80,3, 79,7, 79,5, 79,1, 78,5, 78,4, 76,6, 75,5, 75,3, 74,8, 74,6, 74,6, 74,4, 74,2, 73,8, 73,7, 72,9, 72,4, 72,3, 72,0, 72,0, 71,9, 71,7, 71,4, 70,6, 68,9, 68,7, 68,6, 68,4, 68,1,67,9, 67,3, 67,3, 52,2, 32,0, 31,9, 29,8, 29,5, 29,2, 23,5, 22,8, 21,1,20,9, 18,2, 18,1, 18,1, 14,2, 1,1; HRMS (ESI): calculado para C145H161O32NNa [M+Na]+: 2451,0899, encontrado: 2451,0881.

Ejemplo A-19: Síntesis de 5-amino-pentanil a-L-ramnopiranosil-(1^4)-[p-D-galactopiranosil-(1^3)]-a-D-ácido galactopiranosilurónico-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-a-L-ramnopiranósido (23*)

[0157]

[0158] Una mezcla de hexasacárido 22* (32 mg, 0,013 mmol) y Pd/C (143 mg, 10%) en MeOH/hbO/HOAc (140/10/1, v/v/v, 7,55 ml) se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de H². Después de agitar durante 24 h, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó por una columna Sephadex LH-20 (MeOH/H²O = 8/1) para dar el bencil hexasacárido desprotegido (10 mg, 77%). El hexasacárido anterior (6 mg, 5,34 ummol) se disolvió en MeOH y agua (1 ml, v/v = 1/1) y se enfrió a 0°C. Solución premezclada de LiOH 1 M (0,27 ml, 0,27 mmol) y 30% H²O²se añadió (0,12 ml, 1,17 mmol). Se dejó calentar la mezcla de reacción a ta. Después de 8 h, la reacción se neutralizó con AcOH (18 ul, 0,32 mmol) y se concentró al vacío. El residuo se purificó por Sep-Pak C18 (H²O, 10% MeOH, 25% MeOH, 50% de MeOH) para dar hexasacárido diana 23* (5,4 mg, 99%) como un sólido blanco.

[a]D25 = 8,36 (c = 0,11, H²O); 1H RMN (400 MHz, D²O) 55,41 (br, 1H), 5,10 (br, 1H), 5,07 (br, 1H), 5,06 (br, 1H), 4,85 (br, 1H), 4,66 (br, 2H), 4,58 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 2,8, 10,8 Hz, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,11 (m, 1H), 4,08 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,90 (m, 3H), 3,86 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,71 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,68 (m, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 3,49 (m, 2H), 3,46 (m, 1H), 3,36 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 2,98 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 1,71 -1,60 (m, 4H), 1,47-1,38 (m, 2H), 1,29 (m, 9 H), 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H); 13C RMN (151 MHz, D²O) 5 176,4, 106,4, 102,4, 101,4, 101,2, 99,9, 98,9, 81,4, 80,2, 80,1, 78,1, 77,1, 76,8, 74,2, 73,8, 73,7, 73,6, 73,3, 73,0, 72,9, 71,9, 71,7, 71,7, 71,4, 70,9, 70,9, 70,4, 70,3, 70,3, 69,2, 68,8, 62,7, 40,9, 29,5, 28,1,24,0, 18,2, 18,2, 18,2, 18,1; h RMs (ESl): calculado para C41H71O28NNa [M+Na]+: 1048,4060, encontrado: 1048,4002.

Ejemplo A-20: Síntesis de 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^4)-(metil 2-0-bencil-3-0-levulinoil-D-galactopiranósido)uronato 1-W-feniltrifluoroacetimidato (24*)

[0159]

[0160] Alcohol 15* (136 mg, 0,19 mmol) se disolvió en CH²Cl²(2 ml). Ácido levulínico (0,1 ml, 0,96 mmol), 4-dimetilaminopiridina (140 mg, 1,15 mmol) y di-/'sopropilcarbodiimida (0,15 ml, 0,96 mmol) se añadieron. La mezcla de reacción se agitó a ta durante la noche. La mezcla se diluyó con CH²Cl², se lavó con salmuera y luego se concentró al vacío. El producto bruto se purificó mediante una columna de cromatografía sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1:1) para producir el éster de levulinato (150 mg, 97%). El éster de levulinato (161 mg, 0,199 mmol) se disolvió en acetona y agua (6,25 ml, v/v = 4/1) a 0°C. Se añadió TCCA (46 mg, 0,199 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a ta durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etil, se lavó con NaHCÜ3 sat. y salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/2) para dar el hemiacetal (121 mg, 79%). A una solución de hemiacetal (121 mg, 0,158 mmol) en acetona (3 ml) se le añadió K²CO³(66 mg, 0,48 mmol) y PhN = C(Cl)CF3 (98 mg, 0,48 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a ta. La solución se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,2/1 a 1/1) para dar el imidato 24* (139 mg, 94%). [a]D25 = 59,57 (c = 0,25, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,31 - 7,25 (m, 16H), 7,19 (m, 1H), 7,09 (m, 1H), 6,73 (m, 3H), 5,42 (br s, 1H), 5,31 (dd, J = 2,0, 10,8 Hz, 1H), 4,97 (br, 1H), 4,86 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,74-4,56 (m, 6H), 4,37 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,01 (dd, J = 2,8, 10,4 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,77 (m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,36 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 2,89 2,69 (m, 3H), 2,52 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,29 (d, J = 6,4 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5206,31, 172,54, 170,44, 167,16, 143,40, 138,75, 138,08, 137,33, 128,88, 128,64, 128,53, 128,38, 128,23, 128,20, 127,89, 127,76, 127,67, 127,61, 124,44, 119,45, 100,57, 79,70, 77,76, 77,31,75,19, 73,11,72,07, 72,01,71,75, 71,18, 68,94, 68,86, 52,79, 37,97, 29,81, 27,86, 21,27, 18,08; HRMS (ESI): calculado para C49H52F3NO14Na [M+Na]+: 958,3238, encontrado: 958,3303.

Ejemplo A-21: Síntesis de N-(bencil) bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1 —^ 4)-(metil 2-0-bencil-3-levulinoil-a-D-galactopiranósido)uronato (25*)

[0161]

[0162] Donante 24* (139 mg, 0,149 mmol) y el enlazador (49 mg, 0,149 mmol) se disolvieron en una mezcla tolueno/1,4-dioxano (4 ml, 1/3). Se añadieron 4Á MS (200 mg). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 20 min y luego se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente TBSOTf (7 pl, 0,03 mmol) en tolueno. La reacción se agitó a 0°C. Después de 3 h, la reacción se inactivó con Et3N y se filtró, luego se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/1 a 1/2) para dar el disacárido 25* (119 mg, 75%, a/p = 1,3/1). a-isómero 25*: [a]D25 = 33,46 (c = 0,20, CHCls); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,36-7,17 (m, 30 H), 5,46 (m, 1H), 5,30 (dd, J = 2,8, 10,8 Hz, 1H), 5,18 (m, 3H), 4,94 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,89 (m, 2H), 4,67 (m, 1H), 4,61-4,55 (m, 2H), 4,51 -4,41 (m, 5 H), 3,88 (dd, J = 3,6, 10,4 Hz, 1H), 3,84 (dd, J = 3,2, 9,6 Hz, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,68 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 3,54 (m, 1H), 3,36 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,29 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 2,87-2,66 (m, 3H)), 2,55-2,48 (m, 1H), 2,16 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,51 (m, 4H), 1,34 (m, 2H), 1,27 (d, J = 6,0 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5 206,2, 172.4, 170,4, 168,2, 138,8, 138,1, 137,9, 137,9, 128,6, 128,5, 128,4, 128,2, 128,1, 128,0, 127,9, 127,9, 127,7, 127,5, 127.4, 127,3, 100,1,97,5, 79,7, 77,7, 77,6, 75,0, 72,9, 72,6, 71,9, 71,5, 69,6, 68,9, 68,7, 67,2, 52,5, 37,9, 32,3, 29,7, 29,1,27,8, 23,4, 21,2, 18,0; HRMS (ESI): calculado para C61H71NO16Na [M+Na]+: 1096,4671, encontrado: 1096,4595.

Ejemplo A-22: Síntesis de N-(bencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1—4)-(metil 2-0-bencil-a-D-galactopiranósido)uronato (26*)

[0163]

[0164] Levulinato éster 25* (52 mg, 48 umol) se disolvió en piridina (2 ml) y se enfrió a 0°C. Posteriormente, una solución de NH²NH²(1 M en 3:2 PiridinaAcOH, 0,2 ml). La mezcla se agitó a ta. Después de 4 h de agitación, la reacción se detuvo mediante la adición de acetona (2 ml) y los disolventes se eliminaron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna flash de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,3/1) para dar el producto 26* (46 mg, 97%). [a]D25 = 28,84 (c = 0,14, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,36-7,17 (m, 30 H), 5,51 (br, 1H), 5,19 (m, 3H), 4,90 (m, 2H), 4,69-4,57 (m, 4H), 4,50-4,38 (m, 5 H), 4,12 (m, 1H), 3,86 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,74 (m, 1H), 3,65-3,58 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,37 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,18 (m, 1H), 2,13 (s, 3H), 1,55 1,45 (m, 4H), 1,31 (m, 2H), 1,29 (d, J = 6,0 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5 170,3, 168,8, 138,9, 138,2, 137,9, 137.7, 128,7, 128,6, 128,5, 128,4, 128,3, 128,3, 128,2, 128,1, 128,0, 127,9, 127,7, 127,6, 127,5, 127,2, 99,4, 96,9, 79.7, 78,0, 77,3, 76,2, 75,9, 75,0, 72,8, 71,9, 70,1, 69,5, 68,8, 68,4, 67,3, 52,6, 29,8, 29,2, 23,5, 21,3, 18,1; HRMS (eS i): calculado para CseHesNOuNa [M+Na]+: 998,4303, encontrado: 998,4289.

Ejemplo A-23: Síntesis de W-(bencil) bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1^4)-[2-0-acetil-3,4,6-tri-O-bencil-p-D-galactopiranosil-(1^3)]-(metil 2-0-bencil-D-galactopiranósido)uronato (27*)

[0165]

[0166] El aceptor de disacárido 26* (20 mg, 0,020 mmol) y el donante de monosacárido 16* (52 mg, 0,082 mmol) se disolvieron en tolueno seco (1 ml). Se añadieron 4Á MS (100 mg). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 30 min y luego se enfrió a -30°C. Se añadió lentamente TBSOTf (0,1 ml, 0,08 M) en tolueno. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 3 h de agitación, la mezcla se inactivó con Et3N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hex/EA = 1,8/1) para dar el trisacárido 27* (24 mg, 80%). [a]D25 = 6,74 (c = 0,11, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,35-7,22 (m, 40 H), 5,52 (br, 1H), 5,40 (br, 1H), 5,37 (dd, J = 8,0, 10,0 Hz, 1H), 5,16 (m, 2H), 4,96 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,78-4,72 (m, 4H), 4,66-4,41 (m, 11 H), 4,35 (m, 1H), 4,16 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,87 (dd, J = 3,6, 10,4 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,64-3,49 (m, 5 H), 3,47 (dd, J = 2,4, 10,0 Hz, 1H), 3,35 (m, 2H), 3,24 (m, 1H), 3,16 (m, 1H), 2,05 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,57-1,45 (m, 4H), 1,27 (m, 2H), 1,26 (d, J = 5,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCh) 5 170,1, 169,1, 168,9, 139,1, 138,7, 138,5, 138,0, 128,7, 128,6, 128,5, 128,5, 128,3, 128,3, 128,3, 128,2, 128,1, 128,1, 127,9, 127,9, 127,9, 127,8, 127,6, 127,5, 127,5, 127,3, 102,2, 98,5, 97,7, 80,3, 79,6, 78,5, 77,3, 76,6, 76,2, 74,7, 74,4, 74,4, 73,7, 73,6, 73,5, 72,8, 72,0, 71,8, 71,2, 70,3, 68,7, 68,3, 68,1,67,3, 52,6, 29,8, 23,3, 21,2, 21,0, 18,1; HRMS (ESl): calculado para C85H95NO20Na [M+Na]+: 1472,6345, encontrado: 1472,6374.

Ejemplo A-24: Síntesis de ácido 5-amino-pentanil a-L-ramnopiranosil-(1^4)-a-D-galactopiranosilurónico (28*)

[0167]

[0168] Disacárido 26* (13 mg, 0,013 mmol) se disolvió en MeOH y HOAc (100/1, 5,05 ml). Se añadió Pd/C (56,7 mg, 10%). La mezcla de reacción se agitó bajo atmósfera de H²a temperatura ambiente. Después de 24 h de agitación, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante LH-20 (MeOH) para dar el producto (6 mg, 94%). El disacárido anterior (6 mg, 12 ummol) se disolvió en MeOH y agua (2 ml, v/v = 1/1) y se enfrió a 0°C. Solución premezclada de 1 M LiOH (0,62 ml, 0,62 mmol) y 30% H²O²se añadió (0,28 ml, 2,74 mmol). Se dejó calentar la mezcla de reacción a ta. Después de 8 h de agitación, la reacción se neutralizó con AcOH (43 pl, 0,75 mmol) y se concentró al vacío. El residuo se purificó por Sep-Pak® C18 (H²O, 10% MeOH, 25% MeOH, 50% de MeOH) para dar el producto 28* (3 mg, 57%). [a]D25 = 51,50 (c = 0,03, H²o ); 1H RMN (400 m Hz , D²O) 55,20 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-1 '), 4,93 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-1), 4,36 (br, 1H, H-4), 4,19 (m, 1H, H-5), 4,03 (m, 1H, H-2'), 4,01 (m, 1H, H-3), 3,09 (m, 1H, H-2), 3,79-3,72 (m, 2 H, H-3 ', H-5'), 3,65 (m, 1H, OCH²), 3,53 (m, 1H, OCH²), 3,32 (t, J = 9,6 Hz, 1H, H-4'), 3,13 (m, 1H, NCH²), 2,96 (t, J = 7,6 Hz, 1H, NCH²), 1,65-1,55 (m, 4 H, CCH²C), 1,46-1,33 (m, 2 H, CCH²C), 1,21 (d, J = 6,4 Hz, 3H, H-6'); 13C RMN (151 MHz, D²O) 5177,3, 103,1, 100,9, 78,8, 74,7, 73,5, 73,3, 72,9, 72,6, 71,3, 70,6, 70,5, 41,9, 30,6, 28,9, 24,9, 19,2; HRMS (ESI): calculado para C17H31NOnNa [M+Na]+: 448,1795, encontrado: 448,1808.

Ejemplo A-25: Síntesis de ácido 5-aminopentanil (a-L-ramnopiranosil-(1^4)-[p-D-galactopiranosil-(1^3)]-a-D-galactopiranosilurónico (29*)

[0169]

[0170] El trisacárido 27* (12 mg, 0,013 mmol) se disolvió en MeOH, H²O y HOAc (100/1/1, 5,1 ml). Pd/C (70,4 se añadió mg, 10%). La mezcla de reacción se agitó en una atmósfera de H²a ta. Después de 24 h de agitación, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante LH-20 (MeOH) para dar el producto desbencilado (5 mg, 88%). El trisacárido desbencilado (5 mg, 7,3 mmol) se disolvió en MeOH y agua (1,2 ml, v/v = 1/1) y se enfrió a 0°C. Solución premezclada de 1 M LiOH (0,37 ml, 0,37 mmol) y 30 % H²O²(0,17 ml, 1,6 mmol) fue añadida. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente. Después de 18 h, la reacción se neutralizó con AcOH (25 pL, 0,44 mmol) y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante Sephadex® LH 20 para dar el producto 29 * (4 mg, 93%). [a]D25 = 32,62 (c = 00,05, H²O); 1H RMN (400 MHz, D²O) 55,41 (br, 1H), 4,96 (br, 1H), 4,63 (br, 1H), 4,55 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,24 (br, 1H), 4,10-3,97 (m, 3H), 3,90-3,63 (m, 8 H), 3,58-3,54 (m, 2H), 3,37 (t, J = 10,0 Hz, 1H), 2,99 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, NCH²), 1,69-1,57 (m, 4 H, CCH²C), 1,48-1,39 (m, 2 H, CCH²C), 1,22 (d, J = 6,0 Hz, 3H); 13C RMN (151 MHz, D²O) 5 177,2, 107,5, 102,4, 100,7, 83,0, 79,0, 77,8, 75,1, 74,7, 73,9, 73,5, 72,9, 72,6, 71,4, 71,3, 70,5, 69,8, 63,8, 41,9, 30,7, 28,9, 24,9, 19,2; HRMS (ESI): calculado para C²³H⁴³NO¹⁶ [M+H]+: 588,2504, encontrado: 588,2517.

Ejemplo A-26: Síntesis de (etil 2-0-bencil-4-0-levulinoil-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato de metil (30*)

[0171]

11 ^* 30*

[0172] En una atmósfera de argón, una solución de Ir[COD(PCH3PH2)2]PF6 (29,6 mg, 0,035 mmol) en THF (2,5 ml) se desgasificó al vacío y se gaseó con balón de H²(~ 5 ciclos). La reacción se agitó en una atmósfera de H²a ta durante 20 min antes de que la solución se desgasificara al vacío y se gasificara con argón (~ 5 ciclos). A este matraz de reacción se le añadió una solución de monosacárido 11* (84 mg, 0,18 mmol) en THF (2,5 ml) mediante una jeringa en una porción a ta. La reacción se agitó a ta durante 3,5 h antes de concentrarse al vacío. El producto bruto se trató con p-TsOH (7 mg, 0,035 mmol) en MeOH (2,5 ml) a ta. Después de 16,5 h, la mezcla se diluyó con acetato de etil y se lavó con una solución sat. NaHCO3, se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/2) para dar el producto 30x (59 mg, 77%). [a]D25 = 135,61 (c = 0,50, CHCl3); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,39-7,26 (m, 5 H), 5,66 (dd, J = 1,2, 3,2 Hz, 1H), 5,56 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,92 (dd, J = 5,2; 10,0 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,74-2,67 (m, 3H), 2,60-2,48 (m, 4H), 2,14 (s, 3H), 1,23 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5206,6, 172,0, 168,1, 137,3, 128,5, 128,4, 128,3, 128,2, 128,0, 83,4, 75,3, 72,4, 71,0, 69,0, 68,7, 52,7, 38,1, 29,8, 28,0, 24,2, 14,7; HRMS (ESI): calculado para C²¹H²⁸OeSNa [M+Na]+: 463,1403, encontrado: 463,1412.

Ejemplo A-27: Síntesis de 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-bencil-p-D-galactopiranosil-(1^3)-metil (etil 2-O-bencil-4-O-levulinoílo-1-tio-a-D-galactopiranósido)uronato (31*)

[0173]

[0174] El donante 16* (286 mg, 0,45 mmol) y el aceptor 30* (59 mg, 0,13 mmol) se disolvieron en tolueno (1,3 ml). Se añadió 4Á MS (300 mg). La mezcla se agitó durante 30 min a ta y luego se enfrió a -40°C. Se añadió TBSOTf (10 pl, 0,046 mmol). Se dejó que la reacción se calentara a ta. Después de 2,5 h, la reacción se inactivó con Et3N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,2/1) para dar el producto 31* (92 mg, 75%). [a]D25 = 83,33 (c = 0,63, CHCh); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,36-7,28 (m, 20 H), 5,62 (br, 1H), 5,41 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,31 (dd, J = 8,0, 10,0 Hz, 1H), 4,92-4,87 (m, 2H), 4,67-4,43 (m, 8 H), 4,02 (m, 1H), 3,95 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,67-3,52 (m, 3H), 3,43 (m, 1H), 2,76-2,44 (m, 6H), 2,08 (s, 3H), 1,88 (s, 3H), 1,23 (t, J = 7,6 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5206,6, 171,4, 169,5, 168,0, 138,6, 138,0, 137,9, 137,7, 128,5, 128,4, 128,2, 128,2, 128,0, 128,0, 127,8, 127,8, 127,5, 127,5, 101,8, 83,5, 79,9, 75,6, 74,5, 74,5, 73,6, 73,5, 73,1,72,6, 71,8, 71,3, 70,9, 69,0, 68,3, 52,7, 38,4, 29,7, 28,2, 23,9, 21,0, 14,6; HRMS (ESI): calculado para C50H58O14SNa [M+Na]+: 937,3445, encontrado: 937,3445.

Ejemplo A-28: Síntesis de 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-bencil-p-D-galactopiranosil-(1^3)-metil 2-O-bencil-4-O-levulinoil-a-D-galactopiranósido)uronato 1-W-feniltrifluoroacetimidato (32*)

[0175]

[0176] A una solución de disacárido 31 * (92 mg, 0,10 mmol) en acetona y agua (4/1,3 ml), TCCA (24 mg, 0,10 mmol) se añadió a 0°C. Luego, la reacción se calentó gradualmente a ta. Después de 5 h, se evaporó la acetona al vacío. El residuo se diluyó con acetato de etil y se lavó con una solución sat. NaHCO3 y agua. La capa orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexanos/acetato de etil = 1/1,8) para dar el hemiacetal intermedio (80 mg, 91%). Al hemiacetal anterior (80 mg, 0,092 mmol) en acetona (3 ml) se le añadió K²CO³(38 mg, 0,28 mmol) y PhN = C(Cl)CF3 (57 mg, 0,28 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 6 h. La solución se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 2,2/1) para dar el producto diana 32* (94 mg, 98%).

Ejemplo A-29: Síntesis de W-(bencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-bencil-p-D-galactopiranosil-(1^3)-(2-O-bencil-D-galactopiranósido)urinato (33*)

[0177]

[0178] Donante 32* (44 mg, 0,042 mmol) y el enlazador (14 mg, 0,042 mmol) se disolvió en tolueno/1,4-dioxano (1,2 ml, v/v = 1/3). Se añadió 4A MS (100 mg). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 20 min y luego se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente TBSOTf (0,1 ml, 0,08 M) en tolueno. La mezcla de reacción se agitó a 0°C. Después de 3 h, la reacción se detuvo con Et3N y se filtró, luego se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1/1 a 1/2) para dar el producto diana 33* (35 mg, 70%, a/p = 1/2,2). aisómero: [a]D25 = 21,93 (c = 0,18, CHCls); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,36-7,14 (m, 30 H), 5,55 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 8,0, 10,0 Hz, 1H), 5,19 (m, 3H), 4,92 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,83 (m, 1H), 4,68 (m, 2H), 4,58 (m, 2H), 4,51 (m, 2 H)), 4,45 (m, 3H), 4,29 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,95-3,90 (m, 2H), 3,81 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,63 3,54 (m, 3H), 3,48 (m, 1H), 3,42 (m, 1H), 3,29 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 2,79-2,53 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,56 1,46 (m, 4H), 1,33-1,29 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5206,7, 171,6, 169,4, 167,3, 138,6, 138,4, 138,0, 128,6, 128,6, 128,5, 128,5, 128,4, 128,3, 128,1, 128,0, 127,9, 127,9, 127,7, 127,6, 127,5, 127,4, 103,3, 101,6, 79,9, 78,8, 77,3, 75,1, 74,6, 73,6, 72,6, 72,6, 71,8, 71,4, 70,5, 68,3, 67,3, 67,2, 62,8, 60,5, 52,8, 50,6, 50,2, 47,0, 46,2, 38,3, 32,4, 29,8, 29,3, 28,2, 23,4, 23,0, 21,0, 14,3;

HRMS (ESI): calculado para C68H77N017Na [M+Na]+: 1202,5089, encontrado: 1202,5129.

Ejemplo A-30: Síntesis de ácido 5-amino-pentanil p-D-galactopiranosil-(1^-3)-p-D-galactopiranosilurónico (34p*)

[0179]

[0180] Ester de levulinato 33* (20 mg, 0,017 mmol) se disolvió en piridina (1 ml) y se enfrió a 0°C. Posteriormente, se añadió una solución de NH²NH²(1 M en 3:2 PiridinaAcOH, 0,1 ml). La mezcla se agitó a ta. Después de 5 h, la reacción se detuvo mediante la adición de acetona (2 ml) y los disolventes se eliminaron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna flash de gel de sílice (Hex/EA = 1,3/1) para dar el alcohol. El alcohol anterior se disolvió en MeOH, H²O y HOAc (100/1/1, 5,1 ml). Se añadió Pd/C (83 mg, 10%). La mezcla de reacción se agitó bajo la atmósfera de H²a ta. Después de agitar durante 24 h, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante la columna de Sephadex® LH-20 (MeOH/H²O = 10/1) para dar el disacárido correspondiente. El disacárido anterior se disolvió en MeOH y agua (1,6 ml, v/v = 1/1) y se enfrió a 0°C. Solución premezclada de 1 M LiOH (0,51 ml, 0,51 mmol) y 30% H²O²se añadió (0,23 ml, 2,26 mmol). Se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Después de 18 h, la reacción se neutralizó con AcOH (35 gl, 0,62 mmol) y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante una columna Sephadex® LH-20 para dar el disacárido 34* (2,5 mg, 38% para 3 pasos) como un sólido blanco. [a]D25 = 61,8 (c = 0,02, H²O); 1H RMN (400 MHz, D²O) 54,61 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H-1'), 4,48 (m, 1H, H-4), 4,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-1), 4,08 (m, 1H, H-5), 3,98 (m, 1H, OCH²), 3,90 (m, 1H, H-4'), 3,84 (m, 1H, H-3), 3,79 (m, 1H, H-6'), 3,72 (m, 1H, H-5'), 3,69 (m, 1H, H-6'), 3,67 (m, 1H, OCH²), 3,65 (m, 1H, H-2), 3,63 (m, 1H, H-3'), 3,59 (m, 1H, H-2'), 3,01 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, NCH²), 1,72 (m, 2 H, CCH²C), 1,64 (m, 2 H, CCH²C), 1,50 (m, 2 H, CCH²C); 13C RMN (151 MHz, D²O) 5 106,9, 104,3, 85,2, 77,8, 77,5, 75,1, 73,6, 72,6, 72,2, 72,1, 71,2, 71,2, 63,6, 41,9, 30,5, 28,7, 24,5; HRMS (ESI): calculado para C17H31NO12Na [M+Na]+: 464,1744, encontrado: 464,1723.

Ejemplo A-31: Síntesis de ácido 5-amino-pentanil p-D-galactopiranosil-(1^3)-a-D-galactopiranosilurónico (34a*)

[0181]

[0182] Ester de levulinato 33a* (10 mg, 8,47 gmol) se disolvió en piridina (1 ml) y se enfrió a 0°C. Posteriormente, se añadió una solución de NH²NH²(1 M en 3:2 PiridinaAcOH, 0,1 ml). La mezcla se agitó a ta. Después de 5 h, la reacción se detuvo mediante la adición de acetona (2 ml) y los disolventes se eliminaron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna flash de gel de sílice (Hex/EA = 1,3/1) para dar el alcohol secundario intermedio. El anterior alcohol secundario se disolvió en MeOH, H²O y HOAc (100/1/1, 5,1 ml). Se añadió Pd/C (53 mg, 10%). La mezcla de reacción se agitó bajo la atmósfera de H²a ta. Después de agitar durante 24 h, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante Sephadex® columna LH-20 (MeOH/H²O = 10/1) para dar el disacárido correspondiente. El disacárido se disolvió en metanol y agua (1,2 ml, v/v = 1/1) y se enfrió a 0°C. Solución premezclada de 1 M LiOH (0,17 ml, 0,17 mmol) y 30% H²O²se añadió (0,077 ml, 0,75 mmol). Se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Después de 18 h, la reacción se neutralizó con AcOH (12 ul, 0,21 mmol) y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante una columna Sephadex® LH-20 para dar el disacárido 34a* (1,1 mg, 29% para 3 pasos) como un sólido blanco. [a]D25 = 113,30 (c = 0,02, H²O); 1H RMN (400 MHz, D²O) 54,95 (br, 1H, H-1), 4,58 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H-1'), 4,53 (br, 1H, H-4), 4,22 (br, 1H, H-5), 3,98 (m, 2 H, H-2, H-3), 3,89 (m, 1H, H-4'), 3,79 (m, 1H, H-6'), 3,72 (m, 1H, H-5'), 3,68 (m, 1H, H-6'), 3,65 (m, 1H, OCH²), 3,63 (m, 1H, H-3'), 3,59 (m, 1H, H-2'), 3,56 (m, 1H, OCH²), 3,01 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, NCH²), 1,68 (m, 2H, CCH²C), 1,60 (m, 2 H, CCH²C), 1,44 (m, 2 H, CCH²C); 13C RMN (151 MHz, D²O) 5 178,1, 107,0, 100,7, 82,5, 77,8, 75,1, 73,7, 73,6, 73,1, 71,2, 70,5, 69,5, 63,6, 41,9, 30,7, 28,9, 25,8, 24,9; HRMS (ESI): calculado para C17H31NO12Na [M+Na]+: 464,1744, encontrado: 464,1737.

Ejemplo A-32: Síntesis de W-(bencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 4,6-di-0-bencil-2-0-benzoil-3-0-fluorenilmetoxicarbonil galactopiranósido (36*)

[0183]

[0184] El tioglucósido 35* (117 mg, 0,16 mmol) y el enlazador (79 mg, 0,24 mmol) se disolvieron en DCM (2 ml). Se añadió 4A MS (200 mg). La mezcla se agitó a ta durante 30 min. Luego, la mezcla se enfrió a -20°C. Se añadió NIS (47 mg, 0,21 mmol) en DCM (1 ml), seguido de TMSOTf (12 ul, 0,064 mmol). Se dejó que la reacción se calentara a temperatura ambiente. Después de 3 h, se filtró la mezcla. La solución se diluyó con DCM, se lavó con sat.NaHCO3, 1 M Na2S2O3 y salmuera. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = 2/1) para dar el monosacárido 36* (114 mg, 72%) como una espuma blanca. [a]D25 = 15,50 (c = 0,37, CHCla); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 58,02 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,67 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 7,48-7,06 (m, 29 H), 5,71 (dd, J = 8,0, 10,4 Hz, 1H), 5,14 (br, 2H), 5,04 (dd, J = 2,8, 10,4 Hz, 1H), 4,79 (D, J = 11,6 Hz, 1H), 4,57- 4,45 (m, 4H), 4,39-4,34 (m, 2H), 4,32-4,29 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,11-4.07 (m, 2H), 3,87 (m, 1H), 3,77 (m, 1H), 3,71-3,64 (m, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 1,45-1,27 (m, 4H), 1,12 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5 165,1, 154,6, 143,3, 142,9, 141,2, 141,1, 137,8, 137,8, 133,1, 129,8, 129,8, 128,5, 128,4, 128,3, 127,9, 127,9, 127,8, 127,2, 127,1, 125,2, 125,0, 120,0, 101,5, 77,9, 75,2, 73,8, 73,6, 73,3, 70,3, 70,1,69,7, 69,6, 68,1, 67,1, 50,5, 50,2, 47,1,46,5, 46,1, 29,1, 27,7, 27,3, 23,1; HRMS (ESI): calculado para C⁶²H⁶¹NO¹¹Na [M+Na]+: 1018,4142, encontrado: 1018,4133.

Ejemplo A-33: Síntesis de W-(bencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 4,6-di-O-bencil-2-O-benzoil galactopiranósido (37*)

[0185]

[0186] Monosacárido 36* (37 mg, 0,037 mmol) se disolvió en DCM (1,5 ml). Se añadió Et3N (0,4 ml). La mezcla se agitó a ta. Después de 5 h, la mezcla se diluyó con tolueno y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Hex/EtOAc = 1,8/1) para dar el alcohol objetivo 37* (28 mg, 97%) como una espuma. [a]D25 = -8,52 (c = 0,27, CHCls); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 58,00 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49-7,10 (m, 23 H), 5,24 (dd, J = 8,0, 9,6 Hz, 1H), 5,12 (br, 2H), 4,73 (s, 2H), 4,54-4,43 (m, 3H), 4,38-4,36 (m, 2H), 3,94 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,69- 3,66 (m, 3H), 3,41 (m, 1H), 3,06 (m, 1H), 1,48-1,33 (m, 4H), 1,16-1,09 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5166,6, 156,6, 156,0, 138,0, 137,6, 133,1, 129,8, 129,7, 128,5, 128,4, 128,2, 128,0, 127,8, 127,7, 127,1, 101,0, 76,5, 75,4, 74,1, 73,5, 73,4, 73,1, 69,6, 69,5, 68,2, 67,0, 50,4, 50,1,47,0, 46,0, 29,6, 29,0, 27,7, 27,3, 23,1; HRMS (ESI): calculado para C47H51NOgNa [M+Na]+: 796,3462, encontrado: 796,3464.

Ejemplo A-34: Síntesis de W-(Bencil)bencilxicarbonil-5-amino-pentanil 2-0-acetil-3,4-di-0-bencil-a-L-ramnopiranosil-(1 —^ 3)-4, 6-di-0-bencil-2-0-benzoil galactopiranósido (38*)

[0187]

[0188] Aceptor 37* (25 mg, 0,032 mmol) y el donante 13* (34 mg, 0,065 mmol) se disolvieron en tolueno (1 mL). Se añadió 4A MS (100 mg). La mezcla se agitó a ta durante 30 min y luego se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente TBSOTf (0,1 ml, 0,06 M) en tolueno. Después de 3 h, la reacción se inactivó con Et3N. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hexanos/EtOAc = 1,8/1 a 1/1) para dar el disacárido 38* (22 mg, 60%) como una espuma blanca. [a]D25 = 10,42 (c = 0,22, CHCL); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 58,02 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,46-7,07 (m, 33 H), 5,67 (dd, J = 8,0, 10,0 Hz, 1H), 5,21 (m, 1H), 5,11 (m, 2H), 4,93-4,82 (m, 3H), 4,56-4,50 (m, 2H), 4,47-4,40 (m, 3H), 4,37-4,33 (m, 3H), 4,15 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,86-3,81 (m, 2H), 3,75 (dd, J = 3,2, 9,2 Hz, 1H), 3,67 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 3,39-3,30 (m, 2H), 3,04 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 1,83 (s, 3H), 1,38 (m, 4H), 1,29 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,13 (m, 2 H); 13C RMN (101 MHz, CDCls) 5 169,4, 165,0, 138,5, 138,3, 137,8, 137,8, 133,1, 129,8, 129,7, 128,5, 128,4, 128,3, 128,3, 128,2, 128,0, 127,9, 127,9, 127,7, 127,2, 101,5, 99,2, 79,6, 78,6, 77,5, 77,3, 75,4, 75,2, 74,9, 73,8, 73,7, 72,4, 71,5, 69,0, 68,5, 68,3, 67,1, 50,5, 50,2, 47,1, 46,1, 29,8, 29,1,23,1, 21,2, 20,7, 18,2; HRMS (ESI): calculado para C69H75NO14Na [M+Na]+: 1164,5085, encontrado: 1164,5069.

Ejemplo A-35: Síntesis de 5-amino-oxopentanil a-L-ramnopiranosil-(1—3)-p-D-galactopiranósido (39*)

[0189]

[0190] El disacárido 38* (22 mg, 0,019 mmol) se disolvió en DCM y MeOH (1,2 ml, v/v = 1/1). Se añadió metóxido de sodio (5,2 mg, 0,096 mmol). La mezcla se agitó a ta durante la noche, luego la mezcla se neutralizó con resina ácida, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hex/AcOEt = 1/1,5) para dar el alcohol secundario intermedio, que se disolvió adicionalmente en MeOH/hbO/HOAc (5,55 ml, v/v/v = 100/10/1) y se trató con Pd/C (101 mg, 10%). La mezcla se agitó bajo H²a ta. Después de 18 h, la mezcla se filtró y se concentró. El residuo se purificó por Sep-Pak® C18 (H²O, 10% MeOH, 20% MeOH, 30% de MeOH) para obtener disacárido 39* (7,6 mg, 96% para dos pasos) como un sólido blanco. [a]D25 = 173,72 (c = 0,01, H²O); 1H RMN (400 MHz, D²O) 54,99 (br, 1H, H-1'), 4,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-1), 4,04 (m, 1H, H -2'), 3,97 (m, 1H, H-4), 3,91 (m, 1H, OCH²), 3,82 (m, 1H, H-5'), 3,79 (m, 1H, H-6), 3,74 (m, 1H, H-3'), 3,71 (m, 1H, H-5), 3,67-3,64 (m, 3 H, OCH², H-6, H-3), 3,59 (m, 1H, H-2), 3,43 (t, J = 9,6 Hz, 1H, H-4'), 2,97 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, NCH²), 1,69 (m, 2 H, CCH2C), 1,63 (m, 2 H, CCH2C), 1,43 (m, 2 H, CCH2C), 1,26 (d, J = 6,4 Hz, 3 H, H-6'); 13C RMN (101 MHz, D²O) 5102,3, 102,2, 80,4, 74,9, 71,7, 70,0, 69,9, 69,9, 69,8, 69,0, 68,2, 60,7, 39,2, 28,0, 26,2, 21,9, 16,4; HRMS (ESI): calculado para C¹⁷H³⁵NO¹⁰[M+H]+: 412,2183, encontrado: 412,2180.

B. Experimentos biológicos:

Ejemplo B-1: Conjugación de los sacáridos de la invención a CRM ¹⁹⁷

[0191] El sacárido (1 equivalente) y adipato de bis-(4-nitrofenil) (7 equivalentes) se añadieron a una solución de piridina y DMSO (1:1). La mezcla resultante se agitó durante 5 minutos para completar la solubilización. Entonces, trietilamina (0,83 pL, 6 pmol, 10 equivalentes) se añadió y la mezcla se agitó durante 20 minutos más. La TLC indicó el consumo completo del material de partida. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se lavó con diclorometano (3 x 1 ml) para eliminar el exceso de bis-(4-nitrofenil) adipato y el sólido blanco obtenido se secó al vacío.

[0192] 40 equivalentes de CRM¹⁹⁷liofilizado se disolvió en 0,4 ml de fosfato de sodio 0,1 M estéril, pH 8,0 y se transfirió a la cámara superior de 10.000 Da Millipore filtro centrífugo (0,5 ml). El vial de vidrio se enjuagó con 3 x 0,4 ml de fosfato de sodio 0,1 M estéril, pH 8,0 y la solución de enjuague se transfirió al mismo filtro centrífugo. Después de la centrifugación a 10,000 rpm durante 6-8 min (si es necesario, el paso de centrifugación se prolonga de manera que el volumen en la cámara superior sea de 80 a 100 pl), la solución de CRM¹⁹⁷se transfirió a un tubo de 1,5 ml que contenía el sacárido liofilizado derivatizado con éster de PNP y se agitó lentamente (alrededor de 180 - 200 rpm) durante 18 a 24 h a temperatura ambiente. El conjugado se lavó una vez con fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0 y 2-3 veces con agua desionizada esterilizada en autoclave usando filtros centrífugos de 10.000 Da Millipore. El tamaño molecular medio del conjugado se determinó mediante análisis MALDI-MS usando CRM¹⁹⁷como estándar y calculó el promedio de las uniones de oligosacáridos con molécula de CRM¹⁹⁷.

[0193] Siguiendo el procedimiento, el hexasacárido 23* se conjugó con CRM¹⁹⁷. Conjugado CRM ¹⁹ -23*: ca. m/z 65705,7 (incorporación de 8 moléculas de hexasacáridos en promedio);

Ejemplo B-2: Evaluación de la respuesta inmune contra el conjugado CRM ¹⁹⁷ -23* en ratones

[0194] Preparación de los micromatrices de diapositivas: Los portaobjetos de vidrio activados por CodeLink NHS (Surmodics) fueron vistos con glicanos sintéticos, polisacáridos, proteínas (CRM¹⁹⁷) y BSA-Spacer-dimanosa a dos concentraciones diferentes (100 pM y 200 pM) en tampón de impresión (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5) utilizando una impresora de micromatrices piezoeléctricos S3 (Scienion) equipada con una boquilla revestida de tipo 4 (vea la Figura 7A). La humedad relativa de la cámara manchada se mantuvo constantemente al 65%. Los portaobjetos manchados se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una cámara de humidificación. Los grupos no reactivos de los portaobjetos se bloquearon con fosfato de sodio 50 mM, etanolamina 100 mM pH 9,0 a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 min con agua, se secaron por centrifugación a 300 g durante 5 min (sistema CombiSlide, Eppendorf) y se almacenaron a 4°C hasta su uso.

[0195] Ratones: Se obtuvieron cepas endogámicas hembras C57BL/6J de ratones de seis a ocho semanas de edad de Charles River, Sulzfeld (Alemania). Los animales se dejaron reposar y manipular de acuerdo con las pautas de ética animal institucional.

Inmunización de ratones y generación de sueros policlonales

[0196] Los grupos de 3 ratones C57BL/6J hembra de 6-8 semanas de ratones endogámicos de edad se inmunizaron por vía subcutánea con conjugado CRM ¹⁹⁷ -23* emulsionado con 1:1 (v/v) de adyuvante de Freund (3 pg de hexasacárido 23*). El día 14 y 35, los ratones recibieron una inyección de refuerzo con la misma cantidad de antígeno emulsionado con adyuvante de Freund 1:1 (v/v). Los ratones se sangraron por vía submandibular semanalmente utilizando lancetas de sangre estériles de un solo uso. Los ratones de control recibieron solo alumbre en PBS. Las respuestas de anticuerpos se midieron mediante micromatrices de glicanos.

[0197] Los títulos de anticuerpos de punto final específicos a hexasacárido 23* de IgG e IgM en el suero agrupado se analizaron por micromatriz de glucano para cada semana después de la inmunización como se expresa en MFI (Figura 4B, 4C, 4G y 4H). Las subclases de IgG específicas de hexasacáridos se cuantificaron mediante micromatrices de glucanos (Figura 4D - 4F). Los resultados indicaron que IgG1 e IgG2a contribuyeron con la mayor parte del título de IgG específico de antígeno.

[0198] Los sueros policlonales (1 en 200 diluciones en 1% BSA-PBS) se analizaron adicionalmente utilizando portaobjetos de micromatrices impresos con oligosacáridos relacionados con los polisacáridos capsulares de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos y polisacáridos (polisacáridos capsulares de bacterias K. pneumoniae).

[0199] Los portaobjetos se bloquearon con PBS-BSA (1%) durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBS. Los portaobjetos se secaron mediante centrifugación a 1200 rpm durante 5 min antes de su uso. Se aplicó una rejilla FlexWell 64 (Grace Bio-Labs, Bend, OR, EE. UU.) A los portaobjetos de micromatrices. Los portaobjetos se incubaron con sueros policlonales criados en ratones contra el conjugado CRMw -hexasacárido 23* a múltiples diluciones, se diluyeron en BSA al 1 % en PBS (p/v) y se incubaron en una cámara húmeda durante 1 h a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBST (Tween-20 al 0,1% en PBS) y se secaron por centrifugación (300 x g, 5 min). Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra marcados con fluorescencia (Life Technologies) diluidos en BSA al 1% en PBS (p/v) en una cámara húmeda durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBST, se enjuagaron una vez con agua desionizada y secada por centrifugación (300 x g, 5 min) antes de escanear con un escáner de micromatrices GenePix 4300A (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). El análisis de imágenes se realizó con el software GenePix Pro 7 (Molecular Devices). El voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) se ajustó de manera que los escaneos estuvieran libres de señales de saturación.

[0200] Los datos de micromatrices muestran que el conjugado CRM¹⁹⁷-23* es inmunogénico en ratones y exhíbe respuestas de anticuerpo robusto (véase Figura 5B). Los datos de micromatrices también certifican que el suero hiperinmune en relieve en ratones inmunizados con conjugado CRM¹⁹⁷-23* emulsionado con adyuvante de Freund reconocen no sólo el hexasacárido 23*, sino también trisacáridos Rha(a1-2)Rha(a1-2)Rha(a1-1)aminopentanol, Gal(p1-3)Rha(a1-2)GalA(a1-2)aminopentanol y polisacárido capsular de la cepa 34 de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos (CPS k 34).

Ejemplo B-3: Evaluación de la respuesta inmune contra el conjugado CRM ¹⁹⁷ -23* en conejos

[0201] Inmunización de conejos y generación de sueros policlonales: Conejos Zika hembra de diez a doce semanas de edad (n = 3) se inmunizaron por vía subcutánea en cuatro diferentes sitios con CRM ¹⁹⁷ -23* conjugado en formulación de alhidrogel (hidróxido de aluminio) en el día 0 y se reforzaron el día 14 y los sueros se recogieron en el día 0, 14 y 21. La respuesta de anticuerpos se analizó mediante micromatriz glicano y ELISA.

[0202] ELISA: El título de anticuerpos de sueros de conejo se analizó mediante ELISA. Las placas de microtitulación de poliestireno de noventa y seis pocillos de alta unión (Corning, EE. UU.) Se recubrieron durante la noche a 4°C con polisacárido capsular de cepas de K. pneumoniae resistentes a carbapenémicos ("Carbohydr. Res. 2013, 369, 6-9) (50 de 10 pg/ml por pocilio) en PBS, pH 7,2. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% (PBST) y se bloquearon con FCS al 10% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBST, la placa se incubó con el suero de conejo individual y combinado (n = 3) a diferentes diluciones por duplicado a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó 4-5 veces con PBST y se incubó con anticuerpos Ig totales anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluidos 1 en 10.000 en FCS-PBS al 10%) seguido de incubación a temperatura ambiente durante otra hora. La placa se lavó minuciosamente con PBST y se reveló usando sustrato HRP 3,3’,5,5'-tetrametilbencidina (Thermo Scientific, EE. UU.). La reacción se detuvo añadiendo H²SO⁴al 2% y se registró la absorbancia a 450 nm.

[0203] Análisis de micromatrices de glicanos: El análisis de micromatrices de glicanos se realizó como se describe en el Ejemplo B-2 usando los mismos portaobjetos impresos. Se representó gráficamente la intensidad de fluorescencia media de las manchas.

Análisis de la respuesta de anticuerpos por ELISA

[0204] La respuesta de anticuerpos se analizó mediante ELISA en sueros de conejo (n = 3) inmunizados con 10 pg de equivalente de glicano conjugado en el día 0 y aumentó en el día 14 por vía subcutánea. La respuesta inmune se analizó en diferentes momentos. Se cuantificaron las inmunoglobulinas específicas por título de punto final (Figura 6B). Los datos de ELISA que demuestra CRM ¹⁹⁷ -23* conjugado es alta de anticuerpo inmunogénico e induce títulos. La respuesta de refuerzo después de la inmunización en términos de cambio de veces se analizó adicionalmente (Figura 6C). Se calculó la respuesta de anticuerpos para cada animal y se representó gráficamente como cambio de veces el día 0 y el día 21. Por tanto, el análisis ELISA muestra que el hexasacárido 23* es inmunogénico en conejos y genera anticuerpos de reacción cruzada.

Análisis de la respuesta de anticuerpos por micromatriz

[0205] Para analizar la respuesta inmune específica a hexasacárido 23*, los micromatrices de portaobjetos se incubaron con sueros de conejo (n = 3) recogidos en diferentes puntos de tiempo antes y después de la inmunización con CRM ¹⁹⁷ -23* conjugado. Los datos de la micromatriz muestran que los anticuerpos específicos de hexasacáridos 23* tienen reactividad cruzada con polisacáridos nativos y otros glicanos sintéticos (Figura 7B). Se analizó y representó la intensidad de fluorescencia media de los anticuerpos (Figura 7C). Los datos de la micromatriz atestiguan además que el hexasacárido 23* es inmunogénico en conejos e induce anticuerpos de reacción cruzada. Por lo tanto, los datos de micromatrices da fe de que los sueros hiperinmunes en conejos inmunizados con conjugado CRM197-23* reconocen no sólo el hexasacárido 23*, sino también trisacáridos Rha(a1-2)Rha(a1-2)Rha(a1-1)aminopentanol, Gal(p1-3)Rha(a1-2)GalA(a1-2)aminopentanol y polisacárido capsular de la cepa 34 de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos (CPS k 34).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sacárido sintético de fórmula general (II)

en donde

representa un enlace,

y L representa-(CH²)oy o es un número entero seleccionado de 1,2, 3, 4, 5 y 6

o un diastereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un conjugado que comprende el sacárido según la reivindicación 1 de fórmula general (X)

donde

y L tienen los significados definidos en la reivindicación 1;

m está comprendido entre 2 y 18;

-T- se selecciona de:

a representa un número entero de 1 a 10; y

b representa un número entero de 1 a 4,

3. El conjugado según la reivindicación 2, en donde -T- representa

y a es un número entero seleccionado entre 2, 3, 4, 5 y 6.

4. Un sacárido según la reivindicación 1 o un conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 2 ó 3 para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria protectora en un huésped humano y/o animal.

5. Un sacárido según la reivindicación 1 o un conjugado según la reivindicación 2 o 3 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

6. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado según la reivindicación 2 o 3 y/o el sacárido según la reivindicación 1 junto con al menos un adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en la generación de una respuesta inmune protectora en un huésped humano y/o animal.

8. Un sacárido según la reivindicación 1 para su uso como marcador en ensayos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos.

9. Un método de síntesis de un sacárido de fórmula general (II)

en donde

y L tienen los significados definidos en la reivindicación 1,

que comprende las siguientes etapas:

A) hacer reaccionar un compuesto 1 de fórmula:

en donde P1 - P3 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

donde P5 - P7 representan grupos protectores y LG1 representa una salida grupo seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

'Ox ^NH

CCI3

y

N P h

'_'oX _{c f 3}

para proporcionar un compuesto 3 de fórmula:

en donde P1 - P3, P5 - P7 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

y

realizar la eliminación selectiva del grupo protector P2 en el compuesto 3 para obtener el compuesto 4 de fórmula:

en donde P1, P3, P5 - P7 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: -CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

l compuesto 4 reacciona con el compuesto 5 de fórmula:

donde P8 - P11 representan grupos protectores y LG2 representa un grupo saliente seleccionado d de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

y

para obtener el compuesto 6 de fórmula

en donde P1, P3, P5 - P11 representan grupos protectores y P4 se selecciona de: - CH³, -CH²CH³, -CH(CH3)2,

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

y

y

B1) haciendo reaccionar el compuesto 2 con el compuesto 8 de fórmula:

8

en donde P12 y P13 representan grupos protectores para proporcionar el compuesto 9 de fórmula:

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

realizar la eliminación selectiva del grupo protector P5 en el compuesto 11 para proporcionar el compuesto 12 de fórmula:

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

en donde P5 - P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

en donde P6, P7, P12 y P13 representan grupos protectores;

y

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

o

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

o

en donde P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores;

y

D) realizar la eliminación de los grupos protectores P1, P3, P5 - P13 en los compuestos 15, 16 y 17 para proporcionar los sacáridos de fórmula general (II).

10. Un compuesto intermedio de fórmula (7), (15), (12), (16), (14) o (17):

en donde L tiene el significado definido en la reivindicación 1;

y LG3 representa un grupo saliente seleccionado de:

-OPO3(CH2CH2CH2CH3)2,

y

y P1, P3, P5 - P13 representan grupos protectores, donde

P1 se selecciona del grupo que consiste en o comprende metil, etil, alil, isopropil, ferc-butil, fenil, bencil, p-metoxibencil; P3, P5 - P11 se selecciona del grupo que consiste en o que comprende acetil, bencil, isopropilideno, bencilideno, benzoilo, p-metoxibencil, p-metoxibencilideno, p-metoxifenil, p-bromobencilideno, p-nitrofenol, alil, isopropil, pbromobencil, dimetoxitritilo, tritilo, 2-naftilmetil, pivaloilo, triisopropilsilil, ferc-butildimetilsilil, ferc-butildifenilsilil, ferc-butilmetoxifenilsilil, trietilsilil, trimetilsilil, 2-trimetilsililetoximetil, 9-fluorenilmetoxicarbonil, bencilximetil, metilximetil, ferc-butilximetil, metoxietilximetil, levulinoilo;

P12 y P13 se seleccionan del grupo que consiste en o comprende ferc-butilxicarbonil, 9-fluorenilmetilcarbonil, Ċ

alilcarbonil, tricloroetilcarbonil, bencilxicarbonil, acetil y tricloroacetil.