CN105492454A - 合成针对1型肺炎链球菌的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含于1型肺炎链球菌的荚膜多糖中的糖结构的全合成，涉及包含通过全合成获得的所述糖结构的糖缀合物和涉及这样的糖缀合物及其药物组合物在针对与在它们的荚膜多糖中包含所述糖结构的细菌有关且更特别是与肺炎链球菌有关的疾病免疫的用途。

Description

合成针对1型肺炎链球菌的疫苗
发明领域
本发明涉及包含在1型肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的荚膜多糖中的糖结构的全合成，涉及包含通过全合成获得的所述糖结构的糖缀合物和涉及这样的糖缀合物及其药物组合物在针对与细菌有关的疾病，且更特别是针对与肺炎链球菌有关的疾病免疫中的用途。
发明背景
革兰氏阳性荚膜细菌肺炎链球菌(肺炎球菌)是全世界发病率和死亡率的主要原因。它们聚集于上呼吸道并引起侵入性肺炎球菌疾病，如脑膜炎、菌血症和细菌性肺炎，和非侵入性肺炎链球菌疾病包括急性中耳炎和肺炎。这些疾病流行于儿童、所有年龄段的老年人和免疫力低下的个体中。在发展中国家中，肺炎链球菌相关性疾病导致每年估计120万例儿童死亡。
结构上，在细菌表面上可以观察到三层不同的层：质膜、细胞壁和荚膜。细胞壁由锚定细胞壁多糖(C-多糖)和荚膜多糖(CPS)的肽聚糖骨架组成。C-多糖为所有肺炎链球菌血清型共同的结构，而CPS对于90种已知血清型的每一种是特异的，并且为主要的毒力因子。
在所述90中血清型以外，见于世界上的最普遍和流行的血清型示于图1中。该分布变型还基于地理学和年龄差异。因此，包含含有衍生自最普遍和流行的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖的免疫原性载体和糖结构的糖缀合物的疫苗将会提供针对由该类型的革兰氏阳性细菌导致的高百分比的疾病的免疫。
至今制造了若干种多价肺炎球菌疫苗。商购可得的23价肺炎球菌多糖疫苗(PPV)包含23种血清型的经纯化的荚膜多糖(CPS)抗原。然而，该疫苗在婴儿和儿童的情况下无效。目前市场上的肺炎球菌缀合物疫苗(PCV)PCV-7(PrevnarTM)包含独立缀合至白喉CRM197的4、6B、9V、14、18C、19F和23F型血清型的荚膜抗原的糖且在婴儿中有效。
目前市场上的疫苗在北美和欧洲对于特定年龄的个体有效。这些疫苗的制造方法是复杂的并且导致较高的价格。因此，在大多数发展中国家不可提供所述疫苗。本发明的目的在于提供可提供包含发展中世界的大多数流行血清型的合成糖疫苗。
1型肺炎链球菌(SP1)是最流行的肺炎链球菌血清型之一。1型肺炎链球菌荚膜多糖是具有以下重复单元的线性聚合物：[→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]。
已报道了衍生自1型肺炎链球菌荚膜多糖的[→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]三糖重复单元的合成糖结构。然而，由Bundle(Chem.Eur.J.2010,16,3476.)开发的方法提供了α-甲氧基糖，其不适合于缀合至免疫原性载体。
本发明的目的在于提供获取用连接基官能化的糖结构的改进的合成路线，所述糖结构衍生自1型肺炎链球菌荚膜多糖的[→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]三糖重复单元。所述糖结构的有利之处在于用连接基官能化，因此适合于缀合至免疫原性载体。因此，本发明的目的在于提供针对与细菌有关的疾病免疫的糖缀合物和包含所述糖缀合物的药物组合物，所述细菌在其荚膜多糖中包含以下结构之一：α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp；α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp；α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp；α-D-GalAp；α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc；α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc；α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc；α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp。包含根据本发明的通式(I)的糖和/或通式(II)的中间体和/或糖缀合物的药物组合物用于针对与细菌有关，且特别是与肺炎链球菌的疾病免疫，所述疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性加重、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。
本发明的目的通过独立权利要求的教导得以解决。本发明的另外的有利特征、方面和细节由本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例变得显而易见。
发明描述
定义
本文中所使用的术语“连接基”包括任选地通过键合至至少一个相互连接分子的能够连接糖的还原端单糖与免疫原性载体或固体载体的分子片段。因此，所述连接基本身或与所述相互连接分子一起的功能在于在还原端单糖与免疫原性载体或固体载体之间建立、保持和/或桥接特定的距离。更具体地，使所述连接基的一个末端连接至还原端单糖的端基中心处的环外氧原子，并使另一个末端经由硫原子与相互连接分子连接，或直接与免疫原性载体或固体载体连接。
如本文中所使用的术语“相互连接分子”是指包含官能团X和官能团Y的双官能分子，其中官能团X能够与所述连接基A上的末端硫醇基团反应，且所述官能团Y能够键合至免疫原性载体或键合至固体载体。图2显示了商购可得的相互连接分子的实例，但并不将根据本发明可以使用的相互连接分子限制在本文中所显示的实例。
本文中所使用的术语“佐剂”是指免疫学佐剂，即用于疫苗组合物中通过增强对包含于疫苗中而不与其抗原相关的给定抗原的免疫响应而改变或增加所述疫苗的效果的材料。对于本领域技术人员而言，佐剂的经典公认的实例包括：
-含无机物的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等，包括采取任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定型等)的盐。优选吸附至这些盐。还可以将所述含无机物的组合物配制为金属盐的颗粒。还可以使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。本发明可以使用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂典型地是氧化氢氧化铝盐(aluminiumoxyhydroxidesalts)，其通常是至少部分结晶的。称为“磷酸铝”的佐剂典型地是氢氧化磷酸铝，通常还包含少量硫酸盐(即氢氧化磷酸硫酸铝)。它们可以通过沉淀法获得，并且沉淀期间的反应条件和浓度影响所述盐中羟基取代磷酸盐的程度。可以在根据本发明的制剂中使用氢氧化铝和磷酸铝二者的混合物；
-皂甙，其为在宽范围的植物类别的皮、叶、茎、根且甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异种组。以广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaiasaponaria,Molina)的树皮的皂甙。皂甙还可以由自丽花菝葜(Smilaxornata(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata(bridesveil))和肥皂草(Saponariaoficianalis(soaproot))商购获得。皂甙佐剂制剂包括经纯化的制剂，如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。已使用HPLC和RP-HPLC纯化皂甙组合物。以使用这些技术鉴定具体的经纯化的级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂甙制剂还可以包含固醇胆固醇。可以将皂甙和胆固醇的组合用于形成称为免疫刺激配合物(ISCOM)的独特的颗粒。ISCOM通常包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。可以将任何已知的皂甙用于ISCOM。优选地，所述ISCOM包括以下的一种或多种：
QuilA、QHA和QHC；
-微颗粒(即直径为100nm至150pm，更优选直径为200nm至30pm，或直径为500nm至10pm的颗粒)，其由生物可降解的和非毒性的材料形成。这样的非毒性和生物可降解的材料包括，但不限于聚(α-羟基酸)、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯；
-CD1d配体，如α-糖基神经酰胺、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-(N-二十六烷酰基氨基)-1,3,4-二十八烷三醇],CRONY-101,3"-磺基-半乳糖基神经酰胺；
-免疫刺激性寡核苷酸，如含CpG基序的那些(包含通过与鸟苷残基的磷酸酯键连接的未甲基化的胞嘧啶残基的二核苷酸序列)或包含CpI基序的那些(包含连接至肌苷的胞嘧啶的二核苷酸序列)或双链RNA，或包含回文序列的寡核苷酸，或包含聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸变型/类似物，如硫代磷酸酯变型并且可以为双链的或(除RNA以外的)单链的；
-包含连接至含磷酸酯非环骨架的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564；
-油乳液(例如Freund佐剂)。
理论上，能够有助于或放大免疫学事件的级联中的特定情形，最终导致更明显的免疫响应的每种分子或物质可以被定义为佐剂。
原则上，通过在疫苗制剂中使用佐剂，可以
-定向和最优化适合于疫苗或疫苗所期望的免疫响应；
-使疫苗能经粘膜递送，即导致疫苗与粘膜表面如口腔或胃或肺上皮和相关的淋巴组织接触的给药；
-促进细胞介导的免疫响应；
-增强较弱的免疫原如高度纯化的或重组的抗原的免疫原性；
-降低提供保护性免疫所需要的抗原的量或免疫的频率；和
-改进疫苗在具有降低或削弱的免疫响应的个体如新生儿、老年人和免疫功能不全的疫苗接受者中的效率。
尽管关于它们的作用模式所知甚少，但目前相信佐剂通过以下机理之一增加免疫响应：
-增加抗原的生物学或免疫学半衰期；
-改进到存在抗原的细胞(APC)的抗原递送以及通过APC(例如通过使抗原在由APC摄取抗原-佐剂复合物之后能够穿过内吞体膜进入胞浆)的抗原处理和呈现；
-模仿用来引发免疫响应的来自受压或受损细胞的危险诱导信号；
-诱导免疫调节细胞因子的产生；
-使免疫响应偏向免疫系统的特定亚组；和
-阻断抗原激发的快速散失。
糖被本领域技术人员称为TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和差的免疫原。因此，为了产生糖基疫苗，将所述糖缀合至免疫原性载体以提供糖缀合物，其相比于所述糖呈现增加的免疫原性。在本文中，将术语“免疫原性载体”定义为一种结构，其缀合至所述糖，以形成相比于所述糖本身而呈现增加的免疫力的糖缀合物。因此，所述糖到所述免疫原性载体的缀合在作用时具有针对所述糖的免疫响应的刺激，而不诱导针对所述免疫原性载体的免疫响应。
如本文中所使用的术语“O-糖苷键”是指通过氧原子将糖片段S1、S2和S3的端基碳(即所述C-1)连接至糖片段S1、S2、S3或连接至–O–A–SH片段共价键。在糖片段S1、S2和S3的端基碳连接至–O–A–SH片段的情况下，所述氧原子是片段–O–A–SH的末端氧原子。在糖片段S1、S2和S3的端基碳连接至另一糖片段S1、S2、S3的情况下，则所述氧原子是糖片段S1的3位的氧原子，或糖片段S2的3位的氧原子，或糖片段S3的4位的氧原子。换言之，根据本发明的糖不包含–O–O–键或经由它们的端基碳或C-1碳彼此连接或键合的糖片段。
因此，本发明涉及通式(I)的糖和这些糖的药学上可接受的盐：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下糖片段之一：
其中所述糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接并连接至–O–A–SH片段，每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S2，且糖片段S2不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S1，且n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次意味着M、N和P的每一个必须表示S1、S2和S3之一且所述糖片段S1、S2和S3都不能选择两次。因此，如果M为S1，则N仅可以选自S2和S3，但不能表示S1，且如果M为S1且N为S2，则P仅可以为S3。
术语“不能同时连接至”是指直接连接。“直接连接”意味着例如当所述糖片段S1直接连接至片段–O–A–SH，则所述糖片段S1通过其端基碳原子连接至片段–O–A–SH且并不直接经由另一糖片段(例如S3)连接至片段–O–A–SH。每个糖片段S1或S2或S3可以通过由虚线指示的两个位置连接。一个位置是端基碳C-1，其可以连接至片段–O–A–SH的氧或具有另一糖片段的虚线的氧原子。每个糖片段S1或S2或S3的具有虚线的氧不能连接至片段–O–A–SH且仅可以连接至氢原子(在末端糖片段的情况下)或连接至另一糖片段的端基碳C-1。然而，当将所述糖片段与–O–A–SH片段连接在一起时，必须考虑本文中所公开的例外。
因此，落入本发明的范围内的是通式(Ia)的糖
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n2＝1且n1＝n3＝0；
和通式(Ib)的糖
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0；
和通式(Ic)的糖
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0
和这些糖的药学上可接受的盐。
换言之，本发明涉及通式(I)的糖和这些糖的药学上可接受的盐：
其中A是连接基；
P表示S1，N表示S3，M表示S2；
或
P表示S3，N表示S2，M表示S1；
或
P表示S2，N表示S1，M表示S3；
和
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n2＝1且n1＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0
其中S1、S2和S3是如下定义的糖片段
且所述糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段。
优选地，n1、n2和n3的不多于一个为0，或n1＝n2＝n3＝1，且甚至更优选n1＝n2＝n3＝1。优选的还有包含所述糖S1的通式(I)的糖。因此，优选的是通式(I)表示以下的糖：H–(S1)–(S3)–(S2)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–(S3)–O–A–SH、H–(S3)–(S2)–(S1)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–O–A–SH、H–(S3)–(S2)–O–A–SH、H–(S1)–(S3)–O–A–SH、H–(S1)–O–A–SH、H–(S2)–O–A–SH且更优选H–(S1)–(S3)–(S2)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–(S3)–O–A–SH、H–(S3)–(S2)–(S1)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–O–A–SH、H–(S1)–(S3)–O–A–SH和H–(S1)–O–A–SH。
特别优选的通式(I)的糖是：
A定义为连接基且为片段–O–A–SH的一部分。因此，所述连接基A键合至氧原子和键合至SH基团，而所述氧原子和所述SH基团键合至所述连接基A的不同的碳原子。优选的是所述连接基的至少两个碳原子结余所述氧原子和所述SH基团之间，如–O–C–C–SH。
所述连接基A优选包含2至20个碳原子(包括任选的侧链的碳原子)，更优选2至18个，更优选2至16个，更优选2至14个，更优选2至12个，且还更优选2至10个碳原子。
介于所述氧(即–O–A–SH的氧)与所述SH基团之间的最短原子链优选由2至14个原子，更优选2至12个原子，更优选2至10个原子，更优选2至8个原子组成。在最短链(这是所述氧与所述SH基团之间的最短可能连接)由2至5个原子构成的情况下，这些优选是碳原子。在最短链由4至8个原子构成的情况下，所述链可以包含1、2、3、或4个选自O、N和S的杂原子。在最短链由9至14个原子组成的情况下，所述链可以包含1、2、3、4、5或6个选自O、N和S的杂原子。优选的是所述最短链包含0、1或2个硫原子和/或0、1或2个氮原子和/或0、1、2或3个氧原子。在存在多于4个氧原子的情况下，优选不存在其它杂原子。
还优选的是，所述连接基A或所述最短链全部或部分氟化。所述连接基A可以包含4元或5元或6元饱和碳环或6元部分不饱和(且非芳族)碳环或4元或5元或6元饱和氧杂环或4元或5元或6元饱和氮杂环。
所述连接基A还可以包含酰胺(–NH–CO–,–CO–NH–)和/或脲(–NH–CO–NH–)残基，且优选仅包含一个酰胺或脲残基。所述连接基还可以包含取代基且优选包含一个取代基，如R1或两个取代基如R1和R2，其具有本文中所定义的含义且其优选选自–OCH3、–OC2H5、-CH3、-C2H5、-CH2F、-CF2H、-CF3、-C(O)-NH2、–NHAc、–NH(CH3)、–NH(C2H5)、–N(CH3)2、–N(C2H5)2、–NH-C(O)-CH3和-C(O)-CH3。
在氟化所述连接基的情况下，优选的是多于两个取代基–F。
在存在氧杂环的情况下，所述氧杂环的每个碳原子可以被羟基(–OH)取代。因此，5元氧杂环可以包含一个或两个羟基且6元氧杂环可以包含一个或两个或优选3个羟基。
所述连接基A在本文中也定义为-Aa-Ab-Ac-Ad-或-Aa-Ab-Ad-，其包含优选1、2、3或4个，且更优选1、2或3个以下片段：
-(CH2)o1-、-(CR1R2)o1-、-(CH2)o3–(CH2–CH2-O)o2-(CH2)o1-、-(CH2)o1-S-(CH2)o4-、-(CH2)o1-O-(CH2)o4-、-(CH2)o1-NH-(CH2)o4-、-(CH2)o1-NAc-(CH2)o4-、-(CH2)o1-C(O)-(CH2)o4-、-(CH2)p1-、-(CR7R8)p1-、–(CH2–CH2-O)p1-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(CH2)p2-、-C(O)-NH-(CH2)p2-、-NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1-C2H4–、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1–、-(CH2)q1-、-(CR16R17)q1-、-(CH2)q1-NH-C(O)-、-(CH2)q1-C(O)-NH-、
其中，上述残基的没有两个杂原子连接在一起，如基团-S-并不连接至基团-NH-C(O)-NH-；
p2、o2、o3是彼此独立地选自以下的整数：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
p1、q1、o1、o4是彼此独立地选自以下的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
和
R1、R2、R7、R8、R16和R17彼此独立地表示–H、–OCH3、–OC2H5、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、–F、-CH2F、-CF2H、-CF3、-C(O)-NH2、–SCH3、–SC2H5、–NHAc、–NH(CH3)、–NH(C2H5)、–N(CH3)2、–N(C2H5)2、–NH-C(O)-CH3和-C(O)-CH3。
根据本发明的连接基-A-表示：-Aa-Ab-Ac-Ad-或-Aa-Ab-Ad-或-Aa-Ad-或-Aa-；
其中
Aa表示-(CH2)o1-、-(CR1R2)o1-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-(CR5R6)o3、-(CR1R2)o3–(CH2–CH2-O)o2-(CR3R4)o1-、–(CH2–CH2-O)o2-(CR1R2)o3-(CR3R4)o1-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-S-(CR5R6)o4-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-O-(CR5R6)o4-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-NH-(CR5R6)o4-、-(CR1R2)o1-S-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-S-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-O-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-O-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-NH-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-NH-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4-、-(CR1R2)o1-C(O)-(CR5R6)o3-(CR3R4)o4-、
Ab表示-(CH2)p1-、-(CR7R8)p1-、–(CH2–CH2-O)p1-、-(CR7R8)p1-S-(CR9R10)p2-、-(CR7R8)p1-O-(CR9R10)p2-、-(CR7R8)p1-NH-(CR9R10)p2-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(CH2)p2-、-C(O)-NH-(CH2)p2-、-NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-、-(CR7R8)p1-(CR9R10)p2-(CH2–CH2-O)p3-、-(CR7R8)p1-(CH2–CH2-O)p2-(CR9R10)p3-、-(CH2–CH2-O)p1-(CR7R8)p2-(CR9R10)p3-、-C(O)-NR15-、-(CR7R8)p1-(CR9R10)p2-(CR11R12)p3、-C(O)-NH-CH(R18)-、-C(O)-NH-CH(R18)-C(O)-NH-CH(R19)-、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1-C2H4–、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1–、
Ac表示-(CH2)q1-、-(CR16R17)q1-、-(CH2)q1-NH-C(O)-、-(CH2)q1-C(O)-NH-、
Ad表示-(CH2)m1-、-(CR13R14)m1-、-CH2-S-(CH2)m1-、-CH2-O-(CH2)m1-、-CH2-C(O)-(CH2)m1-、–(CH2–CH2-O)m1-(CR13R14)m2-、-(CH2)m1-(CR13R14)m2-、-(CR13R14)m2-(CH2)m1-、-(CR13R14)m1-(CH2)m2-、–(CH2)m2–(O-CH2–CH2)m1-、
R1-R14、R16和R17彼此独立地表示–H、–OCH3、–OC2H5、–OC3H7、–环-C3H5、–环-C4H7、–环-C5H9、–环-C6H11、–环-C7H13、–环-C8H15、-CH2-环-C6H11、-C(环-C6H11)3、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、-C4H9、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-C2H5、-C(CH3)3、-C5H11、-CH(CH3)–C3H7、–CH2–CH(CH3)–C2H5、–CH(CH3)–CH(CH3)2、–C(CH3)2–C2H5、–CH2–C(CH3)3、–CH(C2H5)2、–C2H4–CH(CH3)2、-C6H13、–C3H6–CH(CH3)2、–C2H4–CH(CH3)–C2H5、–CH(CH3)–C4H9、–CH2–CH(CH3)–C3H7、–CH(CH3)–CH2–CH(CH3)2、–CH(CH3)–CH(CH3)–C2H5、–CH2–CH(CH3)–CH(CH3)2、–CH2–C(CH3)2–C2H5、–C(CH3)2–C3H7、–C(CH3)2–CH(CH3)2、–C2H4–C(CH3)3、–CH(CH3)–C(CH3)3、-C7H15、-C8H17、-C6H4-OCH3、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-OCH3、-CH2-C6H4-OCH3、–F、-CH2F、-CF2H、-CF3、-C(O)-NHR15、-C(O)-NHR22、-C(O)-NHR23、-C(O)-NHR24、-C(O)-NHR25、–SCH3、–SC2H5、–NR15R22、–NHR15、–NHR22、–NHR23、–NHR24、–NHR25、–NH-C(O)-R15、–NH-C(O)-R22、–NH-C(O)-R23、–NH-C(O)-R24、–NH-C(O)-R25、-C(O)-R15、-C(O)-R22、-C(O)-R23、-C(O)-R24、-C(O)-R25。
R15、R22、R23、R24和R25表示：-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、-C4H9、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-C2H5、-C(CH3)3、-C5H11、–CH(CH3)–C3H7、–CH2–CH(CH3)–C2H5、–CH(CH3)–CH(CH3)2、–C(CH3)2–C2H5、–CH2–C(CH3)3、–CH(C2H5)2、–C2H4–CH(CH3)2、-C6H13、–C3H6–CH(CH3)2、–C2H4–CH(CH3)–C2H5、–CH(CH3)–C4H9、–CH2–CH(CH3)–C3H7、–CH(CH3)–CH2–CH(CH3)2、–CH(CH3)–CH(CH3)–C2H5、–CH2–CH(CH3)–CH(CH3)2、–CH2–C(CH3)2–C2H5、–C(CH3)2–C3H7、–C(CH3)2–CH(CH3)2、–C2H4–C(CH3)3；
R18、R19、R20和R21彼此独立地表示-CH2-OCH3、-CH2-SCH3、-CH2-SeCH3、-C2H4-OCH3、-C2H4-SCH3、-C2H4-SeCH3、–H、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)(OCH3)、-CH(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH2-Ph、-CH2-CH(CH3)(C2H5)、-CH2-C(O)-NH2、-C2H4-C(O)-NH2、-CH2–p–C6H4–OCH3；
p2、p3、o2、o3是彼此独立地选自以下的整数：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
p1、q1、o1、o4、m1、m2是彼此独立地选自以下的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
优选地，所述连接基A表示基团-Aa-。
-Aa-优选是直链碳链或选自以下的饱和碳环：
还优选的是，所述连接基A表示-(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CH2)o1-Ab-Ad-、-(CH2)o1-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ad-或-(CR1R2)o1-Ad-，其中Ab、Ac和Ad具有本文中所定义的含义，且R1和R2具有本文中所定义的含义且优选彼此独立地表示–H、–OCH3、–OC2H5、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、–F、-CH2F、-CF2H、-CF3、-C(O)-NH2、–SCH3、–SC2H5、–NHAc、–NH(CH3)、–NH(C2H5)、–N(CH3)2、–N(C2H5)2、–NH-C(O)-CH3和-C(O)-CH3。
Ab通常表示且特别是在前述通式-(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CH2)o1-Ab-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ad-中优选表示以下基团：-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(CH2)p2-、-C(O)-NH-(CH2)p2-、-NH-C(O)-C2H4-C(O)-NH-、-C(O)-NR15-、-C(O)-NH-CH(R18)-、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1-C2H4–、-C(O)-NH-(CH2–CH2-O)p1–，其中取代基R15和R18具有本文中所定义的含义且优选-CH3、-C2H5或-C3H7。
Ac通常表示且特别是在前述通式-(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-和-(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-中优选表示以下基团-(CH2)q1-、
Ad通常表示且特别是在前述通式-(CH2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CH2)o1-Ab-Ad-、-(CH2)o1-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ac-Ad-、-(CR1R2)o1-Ab-Ad-和-(CR1R2)o1-Ad-中优选表示以下基团：
-(CH2)m1-
或
所述连接基单独地或连同相互连接分子的功能在于将所述糖的还原端共价连接至免疫原性载体或连接至固体载体。根据本发明的相互连接分子是指包含官能团X和官能团Y的双官能分子，其中官能团X能够与所述连接基A上的末端硫醇基团反应且所述官能团Y能够键合至免疫原性载体或键合至固体载体。因此，本发明涉及式(I)的糖，其中所述连接基本身或连同所述相互连接分子能够在还原端单糖与免疫原性载体或固体载体之间建立、保持和/或桥接特定的距离。
在根据本发明的优选的实施方案中，所述连接基–A–表示-Aa-Ab-Ac-Ad-。优选地，片段-Aa-Ab-Ac-Ad-选自以下片段：
另一优选的实施方案涉及通式(I)的糖，其中所述连接基-A-表示-Aa-Ab-Ad-。优选地，片段-Aa-Ab-Ad-选自：
----(CH2)o1-S-(CH2)o4-NH-C(O)-NH-(CH2)m1----·
----(CH2)o1-NH-C(O)-NH-(CH2)m1----·
----(CH2)o1-CR3R4-O-(CH2)o4-C(O)-NR15-CH(C(O)NHR22)-(CH2)m1----·
----(CH2)o1-(CR3R4)o2-O-(CH2)o4-C(O)-NH-(CH2)m2-(OCH2CH2)m1----·
----(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-(CR5R6)o3-S-(CH2)m1-(CR13R14)m2-----
优选地，所述连接基A表示-Aa-Ad-，且更优选片段-Aa-Ad-选自：----(CR1R2)o3-(C2H4O)o2-(CR3R4)o1-(CH2)m1-(CR13R14)m2----
优选地，所述连接基-A-表示-Aa-，其中-Aa-选自：
-(CH2)o1-、-(CR1R2)o1-、-(CR1R2)o3–(CH2–CH2-O)o2-(CR3R4)o1-、-(CR1R2)o1-(CR3R4)o2-(CR5R6)o3、–(CH2–CH2-O)o2-(CR1R2)o3-(CR3R4)o1-、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-S-(CH2)o4-、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-O-(CH2)o4-、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-NH-(CH2)o4-、-(CR1R2)o1-S-(CR3R4)o4、-(CR1R2)o1-O-(CR3R4)o4、-(CR1R2)o1-NH-(CR3R4)o4或-(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4。
在优选的实施方案中，取代基R1-R14、R16和R17选自：
–H、–OCH3、–OC2H5、-CH3、-C2H5、-C3H7、–F、-CH2F、-CF2H、-CF3、-CH(CH3)2、-C4H9、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-C2H5、-C(CH3)3、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-OCH3、–SCH3、–SC2H5、–NR15R22、–NHR15、–NHR22、–NHR23、–NHR24、–NHR25、–NH-C(O)-R15、–NH-C(O)-R22、–NH-C(O)-R23、–NH-C(O)-R24、–NH-C(O)-R25。
甚至更优选的是连接基，其中-A-表示-Aa-。优选地，片段-Aa-具有以下含义：-(CH2)o1-、-(CR1R2)o1-、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-(CH2)o3、–(CH2–CH2-O)o2-(CH2)o1-、–(CH2–CH2-O)o2-(CR1R2)-(CH2)o1-、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-S-(CH2)o4、-(CR1R2)o1-S-(CH2)o4、-(CH2)o1-(CR3R4)o2-O-(CH2)o4、-(CR1R2)o1-O-(CH2)o4或-(CR1R2)o1-C(O)-(CR3R4)o4、
其中
o1和o4是选自以下的整数：1、2、3、4、5、6；
o2和o3是选自以下的整数：0、1、2、3、4、5、6；
和，取代基R1-R6选自：
–H、–OCH3、–OC2H5、-CH3、-C2H5、-C3H7、–F、-CH2F、-CF2H、-CF3、-CH(CH3)2、-C4H9、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-C2H5、-C(CH3)3、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-OCH3、–SCH3、–SC2H5、–NHR15、–NHR22、–NHR23、–NHR24、–NHR25、–NH-C(O)-R15、–NH-C(O)-R22、–NH-C(O)-R23、–NH-C(O)-R24、–NH-C(O)-R25。
根据本发明的连接基A可以由本领域技术人员按照文献中所描述的以下程序容易地获得。
此外，本发明涉及式(I)的合成糖，其中所述连接基是能够通式(I)的糖的还原端单糖经由硫醇基团，任选地键合至至少一个另外的相互连接分子与免疫原性载体或固体载体连接的分子片段。更特别地，所述连接基的一个末端在还原端单糖的端基中心处连接至环外氧原子，且另外的末端经由硫原子与相互连接分子连接或直接与所述免疫原性载体或固体载体连接。
本发明的化合物带有碱性和/或酸性取代基并且它们可以与有机或无机酸或碱形成盐。形成这样的酸加成盐的合适的酸的实例是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、对氨基水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、磺酸、膦酸、高氯酸、硝酸、甲酸、丙酸、葡糖酸、乳酸、酒石酸、羟基马来酸、丙酮酸、苯乙酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、亚硝酸、羟基乙磺酸、乙烯基磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸、樟脑磺酸、chinaacid、扁桃酸、邻甲基扁桃酸、氢苯磺酸、苦味酸、己二酸、d-邻甲苯基酒石酸、丙醇二酸、(邻，间，对)-甲苯酸、萘基胺磺酸，和本领域技术人员公知的其它无机酸或羧酸。通过使游离碱形式与足量的期望的酸接触以常规的方式产生盐而制备所述盐。
合适的无机或有机碱的实例例如是NaOH、KOH、NH4OH、四烷基氢氧化铵、赖氨酸或精氨酸等。可以以常规的方式使用本领域公知的方法，例如通过用选自上文提及的组的酸的溶液处理通式(I)的化合物的溶液来制备盐。
此外，还可能的是本发明的化合物同时带有碱性和酸基团。此外，还可能出现这些碱性和酸基团看起来彼此紧密邻近，使得分子内质子能够从酸性基团转移至碱性基团。因此，在本发明的优选实施方案中，式(I)化合物可以是两性离子型，带有至少例如一个–O-和一个–NH3 +基团。
因此，本发明涉及通式(I)的糖和这些糖的药学上可接受的盐：
其中，A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下糖片段之一：
其中每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次，并且如果存在糖片段S1，则其端基碳仅可以连接至–O–A–SH或连接至糖片段S3的4位的氧原子，和如果存在糖片段S2，则其端基碳仅可以连接至–O–A–SH或连接至糖片段S1的3位的氧原子，和如果存在糖片段S3，则其端基碳仅可以连接至–O–A–SH或连接至糖片段S2的3位的氧原子；
n1、n2和n3是选自0或1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
本文中对于通式(I)的糖所公开的相同连接也适用于作为中间体的本文中所命名的通式(II)的二硫化物(即二聚糖)。
因此，包括在本发明的范围内的是以下通式的三糖：H–(S1)–(S3)–(S2)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–(S3)–O–A–SH、H–(S3)–(S2)–(S1)–O–A–SH；以下通式的二糖：H–(S1)–(S3)–O–A–SH、H–(S3)–(S2)–O–A–SH、H–(S2)–(S1)–O–A–SH和以下通式的单糖：H–(S1)–O–A–SH、H–(S3)–O–A–SH，其中A定义为连接基。
本申请的优选实施方案涉及通式(I)的糖和这些糖的药学上可接受的盐
其中，A是如上文所定义的连接基，
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，糖片段S2不能连接至所述糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个是1。
换言之，本发明的优选的糖是通式(I)的糖
其中A是如上文所定义的连接基，
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，和
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n1＝0且n2＝n3＝1，或n1＝n2＝0且n3＝1。
在本发明的又一优选实施方案中，根据通式(I)的化合物选自包括以下的组或由以下组成的组：
2-巯基乙基O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)；
2-巯基乙基O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)；
2-巯基乙基O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖苷)；
2-巯基乙基O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)；
2-巯基乙基O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)；
2-巯基乙基O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)；
2-巯基乙基O-(α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯)-(1→3)-O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖苷)；
2-巯基乙基O-(2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖苷)
化学分析
本发明的另一方面涉及合成通式(I)的糖：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下糖片段之一：
其中糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S2，糖片段S2不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S1，和n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1，
所述合成包括以下步骤：
A1)使下式的化合物2：
其中P1–P3表示保护基，
与下式的化合物3反应：
其中P4表示保护基，从而获得以下通式的化合物4：
其中P1-P4和A如上文所定义；
和
除去化合物4上的保护基P1-P4以提供以下通式的单糖二硫化物5：
其中A如上文所定义，和
其中将单糖二硫化物5进一步用还原剂处理以提供以下通式的单糖6：
其中A如上文所定义；
或
对化合物4进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物7
其中P5是保护基且P1、P3、P4和A如上文所定义。
或
A2)使以下通式的化合物8
其中P6和P7表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物9
其中P6、P7和A如上文所定义；
和
对化合物9进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去保护基P4、P6和P7，以提供以下通式的单糖二硫化物10：
其中A如上文所定义，和
其中将单糖二硫化物10进一步用还原剂处理以提供以下通式的单糖11：
其中A如上文所定义；
或
对化合物9进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物12：
其中P4、P7和A如上文所定义。
或
A3)使以下通式的化合物13
其中，P8–P11表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物14：
其中P4、P8–P11如上文所定义
和
对化合物14进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物15：
其中P4、P8、P9、P11和A如上文所定义。
和
B1)使化合物7与化合物13反应，以提供以下通式的化合物16：
其中P1、P3-P5、P8-P11和A如上文所定义；
和
对化合物16除去保护基P1、P3-P5、P8-P11，以提供以下通式的二糖二硫化物17：
其中A如上文所定义，和
其中将二糖二硫化物17进一步用还原剂处理，以提供以下通式的二糖18：
其中A如上文所定义；
或
对化合物16选择性除去保护基P10，以提供以下通式的化合物19：
其中P1、P3-P5、P8、P9、P11和A如上文所定义。
或
B2)使化合物15与化合物8反应，以提供以下通式的化合物20：
其中P4、P6-P9、P11和A如上文所定义
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去化合物20上的保护基P4、P6-P9、P11，以提供以下通式的二糖二硫化物21：
其中A如上文所定义和其中将二糖二硫化物21用还原剂处理，以提供以下通式的二糖22：
其中A如上文所定义；
或
选择性除去化合物20上的保护基P6，以提供以下通式的化合物23：
其中P4、P7-P9、P11和A如上文所定义；
或
B3)使化合物12与化合物2反应，以提供以下通式的化合物24：
其中P1-P4、P7和A如上文所定义，
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化和除去化合物24上的保护基P1-P4和P7，以提供以下通式的二糖二硫化物25：
其中A如上文所定义，和
其中将二糖二硫化物25进一步用还原剂处理，以提供以下通式的二糖26：
其中A如上文所定义；
或
对化合物24进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物27：
其中P12是保护基且P1、P3、P4、P7和A如上文所定义。
和
C1)使化合物19与化合物8反应，以提供以下通式的化合物28：
其中P1、P3-P9、P11和A如上文所定义；
和
其中将保护基P6用保护基P13替换，从而获得以下化学式的化合物29：
其中P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基并裂解保护基P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13而将化合物29转化成三糖二硫化物30，其中化合物30具有通式：
和其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物30转化成三糖31，其中化合物31具有通式：
和其中A如上文所定义。
或
C2)使化合物23与化合物2反应，以提供以下通式的化合物32：
其中P1–P4、P7–P9、P11和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基和裂解保护基P1–P4、P7–P9、P11将化合物32转化成三糖二硫化物33，其中化合物33具有通式：
其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物33转化成三糖34，其中化合物34具有通式：
其中A如上文所定义；
或
C3)使化合物27与化合物13反应，以提供以下通式的化合物35：
其中P1、P3、P4、P7-P11和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基和裂解保护基P1、P3、P4、P7-P11将化合物35转化成三糖二硫化物36，其中化合物36具有通式：
其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物36转化成三糖37，其中化合物37具有通式：
其中A如上文所定义。
本文中所使用的术语“保护基”是指有机合成中通常使用的基团，优选用于保护胺、羟基、硫醇、亚胺、羰基、羧基或其它常规官能团，且特别优选用于保护胺、羟基、硫醇和羧基。
更特别地，P1、P2、P5、P6、P8-P10、P12和P13优选是对于羟基的合适保护基，更优选能够通过合适的脱保护反应顺序被随后依次除去的羟基的不同的合适保护基。因此，羟基的保护基，即P1、P2、P5、P6、P8-P10、P12和P13可以选自由以下组成的组或包括以下的组：乙酰基、苄基、亚异丙基、亚苄基、苯甲酰基、对甲氧基苄基、对甲氧基亚苄基、对甲氧基苯基、对溴苄基、对溴亚苄基(p-bromobenzyledene)、对硝基苯基、烯丙基、乙酰基、异丙基、对溴苄基二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基、甲基氧基甲基、叔丁基氧基甲基、甲氧基乙基氧基甲基、乙酰丙酰基(levulinoyl)。
更特别地，在本发明的优选实施方案中，保护基P1、P5、P8、P9和P12是苄基，P2是亚苄基，P6是乙酰丙酰基，P10是9-芴基甲氧基羰基和P13是苄氧基甲基。
通常以氨基甲酸酯的形式保护胺。因此，保护基P7可以选自由以下组成的组或包括以下的组：叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙基氧基羰基、苄氧基羰基。在本发明的优选实施方案中，P7是苄氧基羰基。
通常以酯的形式保护羧酸。因此，保护基P3和P11可以选自由以下组成的组或包括以下的组：甲基、乙基、烯丙基、异丙基、叔丁基、苯基、苄基、对甲氧基苄基。在本发明的优选实施方案中，保护基P3和P11是甲基。
羟基的保护基也可以充当硫醇的保护基。因此，硫醇基团的优选的保护基是苄基、苄氧基、4-O-对甲氧基苄基、烯丙基、乙酰基、甲基磺基乙氧基羰基、乙酰丙酸基(levulinyl)、二甲氧基三苯甲基、2-萘基甲基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基。特别是，在本发明的优选实施方案中，保护基P4是苄基。
用于通式(I)的糖的合成中的保护基可以区分为永久保护基和临时保护基。永久保护基是在整个合成期间稳定并且可以在合成的晚期阶段有效除去的保护基。这样的永久保护基包括，但不限于苄基、亚苄基、苯甲酸酯、乙酸酯、烷基酯。临时保护基通常是能够在合成的不同的程度选择性除去以释放羟基用于随后引入不同取代基(包括单糖或其它保护基)的正交保护基。保护基的独创选择允许有利地有权使用资源库的用硫醇基团官能化的通式(I)的糖，用于随后缀合至载体免疫原或固体载体。
本发明的优选实施方案涉及合成通式(I)的糖
其中A是如上文所定义的连接基，
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接或连接至–O–A–SH片段，糖片段S2不能连接至糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1
和所述合成包括如下步骤：
A1)使下式的化合物2：
其中P1–P3表示保护基，
与下式的化合物3反应
其中P4表示保护基，
从而获得以下通式的化合物4：
其中P1-P4和A如上文所定义；
和
除去化合物4上的保护基P1-P4，以提供以下通式的单糖二硫化物5：
其中A如上文所定义，和
其中将单糖二硫化物5进一步用还原剂处理，以提供以下通式的单糖6：
其中A如上文所定义；
或
对化合物4进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物7
其中P5是保护基且P1、P3、P4和A如上文所定义。
或
A2)使以下通式的化合物8
其中P6和P7表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物9
其中P6、P7和A如上文所定义；
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去化合物9上的保护基P4、P6和P7，以提供以下通式的单糖二硫化物10：
其中A如上文所定义，和
其中将单糖二硫化物10进一步用还原剂处理，以提供以下通式的单糖11：
其中A如上文所定义。
或
A3)使以下通式的化合物13
其中P8–P11表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物14：
其中P4、P8–P11如上文所定义
和
对化合物14进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物15：
其中P4、P8、P9、P11和A如上文所定义。
和
B1)使化合物7与化合物13反应，以提供以下通式的化合物16：
其中P1、P3-P5、P8-P11和A如上文所定义；
和
除去化合物16上的保护基P1、P3-P5、P8-P11，以提供以下通式的二糖二硫化物17：
其中A如上文所定义，和
其中将二糖二硫化物17进一步用还原剂处理，以提供以下通式的二糖18：
其中A如上文所定义；
或
选择性除去化合物16上的保护基P10，以提供以下通式的化合物19：
其中P1、P3-P5、P8、P9、P11和A如上文所定义。
或
B2)使化合物15与化合物8反应，以提供以下通式的化合物20：
其中P4、P6-P9、P11和A如上文所定义；
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去化合物20上的保护基P4、P6-P9、P11，以提供以下通式二糖二硫化物21：
其中A如上文所定义，和
其中将二糖二硫化物21用还原剂处理，以提供以下通式的二糖22：
其中A如上文所定义。
和
C1)使化合物19与化合物8反应，以提供以下通式的化合物28：
其中P1、P3-P9、P11和A如上文所定义；
和
其中将保护基P6用保护基P13替换，从而获得以下化学式的化合物29：
其中P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13和A如上文所定义；
和
通过叠氮基到乙酰氨基的转化和裂解保护基P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13，将化合物29转化成三糖二硫化物30，其中化合物30具有以下通式：
和其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物30转化成三糖31，其中化合物31具有以下通式：
和其中A如上文所定义。
所述糖二硫化物36、33、30、25、21、17、10和5到所述糖37、34、31、26、22、18、11和6的转化分别在还原剂存在下进行。本领域技术人员已知的还原剂包括，但不限于：巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧基乙基)膦、镁/甲醇、钠/氨然后氯化铵/盐酸。优选地，糖二硫化物到相应的糖的转化采用三(2-羧基乙基)膦进行。
优选的是，化合物2与3、化合物2与12、化合物5*与11*、化合物19*与21*、化合物2与23之间的反应在(二甲硫基)甲基锍三氟甲磺酸盐(DMTST)和2,4,6-三叔丁基吡啶(TTBPy)存在下在非极性和极性非质子溶剂的混合物中进行。除了经活化的分子筛(MS)如分子筛以外，可以使用分子筛或酸洗分子筛。反应温度为介于–20℃与室温之间，优选所述温度为介于–10℃与室温之间，更优选所述温度为介于–5℃与室温之间，且最优选所述温度为介于0℃与室温之间。优选的极性非质子溶剂是四氢呋喃、乙醚和二氧六环。优选的非质子溶剂为甲苯、卤代溶剂如氯仿和二氯甲烷。非极性和极性非质子溶剂的混合物为：二氯甲烷/四氢呋喃、二氯甲烷/乙醚、甲苯/乙醚、甲苯/四氢呋喃。
还优选的是，化合物13与7、化合物8与3、化合物12*与9*、化合物13*与2*、化合物2*与21*、化合物2*与11*、化合物19与8、化合物27与13和化合物8与15的反应在非极性溶剂或非极性溶剂与极性非质子溶剂的混合物中在三氟甲磺酸三甲基硅酯存在下进行。三氟甲磺酸三甲基硅酯的实例包括，但不限于三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯、叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯、三异丙基三氟甲磺酸酯。合适的非极性溶剂是甲苯、氯仿和二氯甲烷。优选的极性非质子溶剂是四氢呋喃、乙醚和二氧六环。反应温度为介于–20℃与+20℃之间，优选所述温度为介于–10℃与+10℃之间且更优选所述温度为介于–5℃与+5℃之间且最优选约0℃。优选地，使用经活化的分子筛(MS)如分子筛、分子筛或酸洗分子筛。
优选地，将化合物28上的保护基P6用保护基P13替换以获得化合物29在两个步骤中进行，第一步包括化合物28与肼或肼盐在溶剂或溶剂混合物中的反应且第二步通过将在第一步之后获得的产物用BnOCH2SCy、DMTST和TTBPy在非极性溶剂中处理。对于第一步而言，优选的是弱酸的肼盐如乙酸肼或丙酸肼。该反应的合适的溶剂是非极性溶剂如二氯甲烷，极性溶剂如吡啶和乙酸，及其混合物。第二步优选在如上文之一提及的经活化的分子筛存在下于优选介于-10℃与20℃之间，最优选介于0℃与10℃之间的温度进行。上文提及了合适的非极性溶剂。已发现将保护基P6用保护基P13替换对于在裂解永久保护基期间避免副反应是重要的。
化合物4到5、16到17、13*到27*和20*到22*的转化需要裂解所述保护基，且更特别是永久保护基。裂解所述保护基包括通过在极性非质子和极性质子溶剂的混合物中用碱处理而第一裂解碱不稳定性保护基；和通过暴露至极性质子和极性非质子溶剂的混合物中的钠和氨第二裂解对水解敏感的保护基。对于第一步而言，合适的非质子溶剂包括四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和N,N-二甲亚砜，将其与合适的质子溶剂如水和醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或叔丁醇)混合。
保护基的碱性裂解优选在室温(包括介于0℃与室温之间)进行。进行第一步的合适的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾。对水解敏感的保护基的裂解通过在包括介于-78℃与室温之间的温度暴露至在极性质子和极性非质子溶剂的混合物中的钠和氨而进行。任选地，在对水解敏感的保护基的裂解期间，可以将锂用作钠的等价物。
上述永久保护基的裂解之前，化合物9到10、20到21、24到25、29到30、32到33、36到37和16*到18*的转化包括将叠氮基转化成乙酰氨基，这优选在硫代乙酸和吡啶存在下进行。替代性方法在于在两个步骤中进行叠氮基到乙酰氨基的转化：首先是叠氮基的化学选择性还原，然后乙酰化。化学选择性还原可以使用通过在Pd/C上在氨、乙酸铵、三苯基膦或吡啶存在下氢解进行。乙酰化可以使用乙酰氯或乙酸酐在碱存在下完成。
糖I、5、6、10、11、17、18、21、22、25、26、30、31、33、34、36、37、27*、26*、24*、22*和18*带有碱性和/或酸性取代基，并且它们可以与有机或无机酸或碱形成盐。对于这样的酸加成盐的形成的合适的酸的实例是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、对氨基水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、磺酸、膦酸、高氯酸、硝酸、甲酸、丙酸、葡糖酸、乳酸、酒石酸、羟基马来酸、丙酮酸、苯乙酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、亚硝酸、羟基乙磺酸、乙烯基磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸、樟脑磺酸、chinaacid、扁桃酸、邻甲基扁桃酸、氢苯磺酸、苦味酸、己二酸、d-邻甲苯基酒石酸、丙醇二酸、(邻、间、对)-甲苯酸、萘基胺磺酸，和本领域技术人员公知的其它无机酸或羧酸。通过使游离碱形式与足量的期望的酸接触以常规的方式产生盐而制备所述盐。
游离碱形式可以通过用合适的碱稀水溶液如氢氧化钠、碳酸钾、氨和碳酸氢钠稀水溶液处理所述盐来产生。所述游离碱形式在某些物理性质如在极性溶剂中的溶解度方面一定程度上不同于它们的相应盐形式，但所述盐出于本发明的目的在其它方面相当于它们的相应游离碱形式。
合适的无机或有机碱的实例例如是NaOH、KOH、NH4OH、四烷基氢氧化铵、赖氨酸或精氨酸等。可以以常规的方式使用本领域公知的方法，例如通过用选自上文所提及的组的酸溶液处理通式(I)的化合物的溶液制备盐。
此外，还可能的是本发明的化合物同时带有碱性和酸基团。此外，还可能出现这些碱性和酸基团看起来彼此紧密邻近，使得分子内质子能够从酸性基团转移至碱性基团。因此，在本发明的优选实施方案中，式(I)化合物可以是两性离子型，带有至少例如一个–O-和一个–NH3 +基团。
本发明在其范围内包括化学计量溶剂，包括水合物以及包含可变量的水的化合物，其可以通过诸如冻干法的方法制备。
因此，通式(I)的糖的合成可以还包括步骤D：
D)制备通式(I)化合物的盐或制备通式(I)化合物的冻干物或通式(I)化合物的盐的冻干物。
在另一优选实施方案中，通式(II)的中间体的合成可以进一步包括步骤D：
D)制备通式(II)化合物的盐或制备通式(II)化合物的冻干物或通式(II)化合物的盐的冻干物。
在优选的实施方案中，通式(I)的糖的合成
其中A是如上文所定义的连接基,
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，糖片段S2不能连接至糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1，
可以进一步包括步骤D)
D)制备通式(I)化合物的盐或制备通式(I)化合物的冻干物或通式(I)化合物的盐的冻干物。
中间体
本发明的另一方面涉及通式(II)的中间体和这些糖的药学上可接受的盐：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下片段之一：
其中糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–S–片段，每个糖片段S1、S2和S3在片段H–(P)n3–(N)n2–(M)n1–O–A–S–中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S2，糖片段S2不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
因此，落入本发明的范围内的是通式(IIa)的中间体
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n2＝1且n1＝n3＝0；
和通式(IIb)的中间体
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0；
和通式(IIc)的中间体
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0
和这些糖的药学上可接受的盐。
换言之，本发明涉及通式(II)的中间体：
其中A是连接基；
P表示S1，N表示S3，M表示S2；
or
P表示S3，N表示S2，M表示S1；
或
P表示S2，N表示S1，M表示S3，和
其中
n1＝n2＝n3＝1，或n1＝n2＝1且n3＝0，或n2＝n3＝1且n1＝0，或n1＝1且n2＝n3＝0，或n2＝1且n1＝n3＝0，或n3＝1且n1＝n2＝0；
其中
且糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接或连接至–O–A–S–片段，
和这些糖的药学上可接受的盐。
优选的是通式(II)的中间体和这些糖的药学上可接受的盐
其中
A是如上文所定义的连接基，
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–S–片段且糖片段S2不能连接至糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
更优选的是通式(II)的中间体
其中A是如上文所定义的连接基，
P表示S1，
N表示S3，
M表示S2，
糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–S–片段，和
其中n1＝n2＝n3＝1或其中n1＝n2＝1且n3＝0，或其中n1＝1且n2＝n3＝0，或其中n1＝0且n2＝n3＝1，或其中n1＝n2＝0且n3＝1。
甚至更优选的是以下中间体：
H–(S1)–(S3)–(S2)–O–A–S–S–A–O–(S2)–(S3)–(S1)–H、
H–(S2)–(S1)–(S3)–O–A–S–S–A–O–(S3)–(S1)–(S2)–H、
H–(S3)–(S2)–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–(S2)–(S3)–H、
H–(S1)–(S3)–O–A–S–S–A–O–(S3)–(S1)–H、
H–(S3)–(S2)–O–A–S–S–A–O–(S2)–(S3)–H、
H–(S2)–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–(S2)–H、
H–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–H，和
H–(S3)–O–A–S–S–A–O–(S3)–H。
特别优选的是包括糖片段S1的通式(II)的中间体，如：
H–(S1)–(S3)–(S2)–O–A–S–S–A–O–(S2)–(S3)–(S1)–H、
H–(S2)–(S1)–(S3)–O–A–S–S–A–O–(S3)–(S1)–(S2)–H、
H–(S3)–(S2)–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–(S2)–(S3)–H、
H–(S1)–(S3)–O–A–S–S–A–O–(S3)–(S1)–H、
H–(S2)–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–(S2)–H，和
H–(S1)–O–A–S–S–A–O–(S1)–H。
糖缀合物
本发明的另一方面涉及通过使通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物。所述糖缀合物经证实有效作为用于针对与细菌有关的疾病免疫的疫苗。因此，包含共价连接至免疫原性载体的通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖的糖缀合物可用于在人和/或动物宿主中增加保护性免疫响应并因此可用于预防和/或治疗与细菌相关的疾病。
本领域技术人员已知糖通常作为TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和差的免疫原。TI-2抗原是仅被成熟的B细胞通过表面暴露的免疫球蛋白受体交联识别的抗原。没有T细胞的帮助则不产生免疫记忆，并且既不出现从IgM转换到其它IgG亚类的同种型，也不出现B细胞亲和力成熟。此外，糖由于对人糖脂和糖蛋白的结构同源性而是在人类中的已知的差免疫原。由于它们的差的免疫原性性质，糖表现出产生通过B细胞的抗体生产以及形成记忆细胞的差的能力，这对潜在的疫苗的生产产生重要作用。
因此，为了生产潜在的糖基疫苗，使通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖缀合至免疫原性载体，以提供糖缀合物，其相比于所述糖呈现出增加的免疫原性。
在本文上下文中，将术语“免疫原性载体”定义为缀合至所述糖以形成相比于所述糖本身呈现增加的免疫力糖缀合物的结构。因此，将通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖缀合至免疫原性载体具有刺激针对通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖的免疫响应而不诱导针对所述免疫原性载体的免疫响应的效果。
优选的免疫原性载体是具有免疫调节性质的载体蛋白或鞘糖脂。对于本领域技术人员而言，载体蛋白是选自包括以下的组或由以下组成的组的蛋白：白喉类毒素、突变的白喉类毒素、改性的白喉类毒素、突变和改性的白喉类毒素、破伤风类毒素、改性的破伤风类毒素、突变的破伤风类毒素、外膜蛋白(OMP)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)或霍乱毒素(CT)。本文中所使用的术语“类毒素”是指细菌毒素(通常为外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理失活或抑制，而其它性质(典型地为免疫原性)得以保持。本文中所使用的突变的类毒素为重组的细菌毒素，将其通过修改野生型氨基酸序列而修改成较低毒性或甚至非毒性的。这样的变异可以是取代一个或多个氨基酸。这样的变异的类毒素在其表面上存在可以与相互连接分子的官能团Y反应，以提供经修饰的类毒素的官能度。所述官能度是本领域技术人员已知的并且包括，但不限于可以与经活化的酯、异氰酸酯基团或醛在还原剂存在下反应的赖氨酸残基的伯氨基官能度，可以通过碳二亚胺活化的谷氨酸酯或天冬氨酸酯残基的羧酸酯官能度或半胱氨酸的硫醇官能度。经活化的酯包括N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯(DSG)、2-吡啶基二硫醇基-四氧杂十四烷-N-羟基琥珀酰亚胺(PEG-4-SPDP)(参见图2)。可以将载体蛋白上的半胱氨酸残基转化成相应的脱氢丙氨酸，所述脱氢丙氨酸可以进一步与合适的相互连接分子反应，以提供在表面上具有相互连接分子的官能团X的经修饰的载体蛋白。在该情况下，相互连接分子上的官能团Y可以是硫醇基团且基团X可以是烯烃。这样的相互连接分子包括烯丙基硫醇。在与这样的相互连接分子反应之后，载体蛋白转化成具有相互连接分子的烯丙基X的经修饰的载体蛋白，其适合于与通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖反应。
特别优选的是，使通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖且优选糖37、34、31、26、22、18、11和6缀合至具有赖氨酸残基的伯胺官能度作为官能度的非毒性变异的白喉类毒素CRM197。
类CRM197野生型白喉类毒素是由通过对于赖氨酸具有谷氨酸的单个氨基酸取代的二硫桥连接的两个亚单元组成的535个氨基酸(58kD)的多肽单链。其在许多疾病的经批准的缀合疫苗如Prevnar中被用作载体蛋白。
因此，在本发明的优选实施方案中，载体蛋白在其表面上具有赖氨酸残基的伯氨基官能度，其能够与相互连接分子的官能团Y反应，以提供在它们的表面上具有能够与通式(I)化合物的连接基的末端硫醇基团反应的相互连接分子的所述官能团X经修饰的载体蛋白。相互连接分子的所述官能团X选自包括以下的组或由以下组成的组：马来酰亚胺；α-碘乙酰基；α-溴乙酰基；N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、2-吡啶基二硫醇、硫醇和乙酰基(参见图3)。
优选地，将通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖缀合至通过马来酰亚胺修饰的非毒性变异的白喉类毒素CRM197。在又一优选实施方案中，将通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖缀合至通过乙烯基修饰的非毒性变异的白喉类毒素CRM197。在最优选的实施方案中，将通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖缀合至通过α-溴乙酰胺修饰的非毒性变异的白喉类毒素CRM197。
在另一实施方案中，所述免疫原性载体优选为具有免疫调节性质的鞘糖脂，且更优选(2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇。本文中所使用的术语“具有免疫调节性质的鞘糖脂”是指能够刺激免疫系统对目标抗原的响应的合适的鞘糖脂，但是其本身并不赋予如上文所定义的免疫性。
本文中所使用的鞘糖脂是包含α-连接至鞘脂的糖结构部分的化合物。优选地，所述糖结构部分是吡喃己糖且最优选是α-D-吡喃半乳糖。对于本领域技术人员而言，鞘脂类是包含经由酰胺键连接至脂肪酸的C18氨基醇的脂质类别。所述C18氨基醇优选被羟基单取代、二取代或多取代。特别优选的是，所述C18氨基醇为植物鞘氨醇。所述脂肪酸优选为具有16至28且更优选18至26的碳原子数的饱和烷基链的单羧酸。具有免疫调节性质的鞘糖脂包括，但不限于(2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇，其可以刺激天然杀伤(NK)活性和通过天然杀伤T(NKT)细胞的细胞因子产生并且表现出潜在的体内抗肿瘤活性(Proc.NatlAcad.Sci.USA,1998,95,5690)。
通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖与具有免疫调节性质的鞘糖脂的缀合物的有利之处在于热稳定。为了适合于缀合，在具有免疫调节性质的鞘糖脂上引入官能度。所述官能度易于直接与通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖的连接基的末端硫醇基团反应，以提供通式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的糖的糖缀合物，或与相互连接分子的官能团Y反应，以提供经修饰的具有免疫调节性质的鞘糖脂。
优选地，所述官能度于具有免疫调节性质的鞘糖脂的糖结构部分的C6处引入。因此，将具有免疫调节性质的鞘糖脂用官能度官能化，所述官能度易于与硫醇基团、经活化的酯、异氰酸酯基团、醛、乙烯基、氨基和叠氮基反应，以直接提供具有的相互连接分子的官能团X的经修饰的具有免疫调节性质的鞘糖脂或通式(I)的糖的糖缀合物。
优选地，在具有免疫调节性质的鞘糖脂的糖结构部分的C6处引入的官能度选自包括或包含以下的组：胺、硫醇、醇、羧酸、乙烯基、马来酰亚胺、α-碘乙酰基、α-溴乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、2-吡啶基二硫醇。
所述相互连接分子的官能团X选自包括以下的组或由以下组成的组：马来酰亚胺、α-碘乙酰基、α-溴乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、2-吡啶基二硫醇、硫醇和乙烯基。
如本文中所使用的术语“相互连接分子”是指包含官能团X和官能团Y的双官能分子，其中官能团X能够与连接基A上的末端硫醇基团反应且官能团Y能够键合至免疫原性载体或键合至固体载体。
已发现通过通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物适合于在动物中引起免疫响应并因此可用作针对与在其荚膜多糖中包含选自以下的糖结构的细菌有关的疾病免疫的疫苗：
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp。
优选地，在荚膜多糖中包含上述糖结构之一的细菌是1型肺炎链球菌。
在优选的实施方案中，通过使通式(I)、(Ia)、(Ib)和(Ic)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物可作为疫苗用于针对与细菌有关的疾病免疫，其中所述疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性加重、关节炎、鼻窦炎和结膜炎。
本发明的一个方面涉及药物组合物，特别是疫苗，其包含至少一种通过使任意通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物和/或一种通式(I)的糖和/或通式(II)的中间体，连同至少一种药学上可接受的冷冻保护剂、冻干保护剂、辅料和/或稀释剂。
所述疫苗可以以混悬剂形式制备或可以冻干。可以冷冻储存所述混悬剂形式。在冻干的形式中，优选添加一种或多种稳定剂。任选地，也可以添加一种或多种佐剂。根据本发明，疫苗中可以包括任何常规的稳定剂和佐剂。
本文中所使用的术语“佐剂”是指免疫学佐剂，即用于疫苗组合物中通过增强对包含于疫苗中而不与其抗原相关的给定抗原的免疫响应而改变或增加所述疫苗的效果的材料。对于本领域技术人员而言，公认经典的免疫学佐剂实例包括，但不限于油乳液(例如Freund佐剂)、皂甙、铝或钙盐(例如明矾)、非离子型嵌段聚合物表面活性剂等。
可以在任意年龄进行疫苗接种。所述疫苗可以皮下、通过喷雾、通过注射、经口、眼内、气管内或鼻内施用。
本发明的另一方面涉及药物制剂和药物组合物，其包含疫苗作为活性成分，连同至少一种药学上可接受的载体、辅料、溶剂和/或稀释剂。
进一步优选地，将所述药物组合物配制成冻干物或液体缓冲溶液形式。
所述疫苗也可以以其药学活性盐形式任选地施用基本上无毒的药学上可接受的载体、辅料、佐剂或稀释剂施用。在常规的固体或液体载体或稀释剂和常规制药佐剂中以合适的剂量水平以已知的方式制备本发明的疫苗。优选的配制剂和制剂呈适合于口服的可施用的形式。这些可施用形式例如包括丸剂、片剂、薄膜衣片剂、包衣片剂、胶囊、粉末剂和沉淀物。不同于可经口施用的形式也是可能的。本发明的疫苗可以通过任意合适的方式施用，包括，但不限于吸入；注射(静脉内、腹膜内、肌内、皮下)；通过经上皮或粘膜皮肤内层(口腔粘膜/直肠和阴道上皮内层、鼻咽粘膜、肠黏膜)吸收；经口、经直肠、透皮、局部、皮内(intradermally)、胃内、皮内(intracutaneously)、阴道内、血管内、鼻内、颊内、经皮、舌下或药物领域内可获得的任意其它方式。
包含通过使通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的本发明的疫苗将典型地与适宜地关于施用所要的形式选择的合适的载体材料混合施用并且符合常规的药学实践，所述形式为口服片剂、胶囊(固体填充的、半固体填充的或液体填充的)、用于重构的粉末剂、口服凝胶、酏剂、可分散颗粒、糖浆、混悬剂等。例如，对于以片剂或胶囊形式口服应用而言，可以将活性成分与任意口服无毒的药学上可接受的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、滑石、甘露醇、乙醇(液体形式)等组合。此外，当期望或需要时，还可以将合适的粘结剂、润滑剂、崩解剂和着色剂引入混合物中。
合适的粘结剂包括淀粉、明胶、天然糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。用于这些剂型中可提及的润滑剂是硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜尔胶等。当合适时还可以包括甜味和矫味剂和防腐剂。下文更详细地讨论上文所提及的一些术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘结剂等。
此外，可以将本发明的疫苗配制成缓释剂型，以提供受控速率地释放任一种或多种组分或活性成分来最优化治疗效果。用于缓释的合适的剂型包括包含变化的崩解速率或受控释放用活性组分浸渍的聚合物基质的层并成型为片剂形式的层状片剂或包含这样的经浸渍或包封的多孔聚合物基质的胶囊。
液体形式配制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。作为实例，可以提及水或水-聚丙二醇溶液，其用于肠胃外注射或添加甜味剂和遮光剂用于口服溶液剂、混悬剂和乳剂。液体形式配制剂还可以包括用于鼻内施用的溶液。
适合于吸入的气溶胶配制剂可以包括溶液和粉末形式的固体，其可以与药学上可接受的载体如惰性压缩气体例如单体组合。
对于制备栓剂而言，首先熔化低熔点蜡如脂肪酸甘油酯的混合物如可可脂并通过搅拌或类似的混合将活性成分均匀地分散于其中。然后将熔融的均质混合物倒入适宜尺寸的模具中，使其冷却并由此固化。
还包括意图在使用前短时间内转化成液体形式配制剂用于经口或肠胃外施用的固体形式配制剂。这样的液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明的疫苗还可以是可透皮递送的。透皮组合物可以采取膏剂、洗液、气溶胶和/或乳剂形式并且可以包括在本领域为此目的的常规的基质或储库类型的透皮贴剂中。
术语“胶囊”是指特别的容器或包封物，其由甲基纤维素、聚乙烯醇或变性明胶或淀粉制成，用于保持或容纳包括活性成分的组合物。硬壳胶囊典型地由相对高的胶凝强度的骨和猪皮明胶的混合物制成。胶囊本身可以包含少量染料、避光剂、增塑剂和防腐剂。
片剂表示包含活性成分与合适的稀释剂的经压制或成型的固体剂型。可以通过压制由湿法造粒、干法造粒获得的粒料或混合物或通过本领域技术人员公知的压实制备片剂。
口服凝胶是指分散或溶于亲水性半固体基质的活性成分。
用于重构的粉末是指包含活性成分和合适的稀释剂的粉末混合物，其可以悬浮于水或汁液中。
合适的稀释剂是通常弥补组合物或剂型的主要部分的物质。合适的稀释剂包括糖如乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨糖醇，来自小麦、玉米水稻和马铃薯的淀粉，和纤维素如微晶纤维素。稀释剂在组合物中的量可以在总组合物的约5重量％至约95重量％，优选约25重量％至约75重量％，更优选约30重量％至约60重量％，且最优选约40重量％至50重量％的范围内。
术语“崩解剂”是指添加至组合物以帮助其破碎开(崩解)并释放药物的材料。合适的崩解剂包括淀粉，“冷水溶性”改性淀粉如羧甲基淀粉钠，天然和合成树胶如槐豆胶、刺梧桐胶、瓜尔胶、黄芪胶和琼脂，纤维素衍生物如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，微晶纤维素和交联的微晶纤维素如交联羧甲纤维素钠，藻酸盐如藻酸和藻酸钠，粘土如膨润土，和泡腾混合物。崩解剂在组合物中的量可以在组合物的约1重量％至约40重量％，优选组合物的2重量％至约30重量％，更优选组合物的约3重量％至20重量％，且最优选约5重量％至约10重量％范围内。
粘结剂描述将粉末粘结或“胶合”在一起并且通过形成粒料而使得它们结合，因此在制剂中充当“粘合剂”的物质。粘结剂增加在稀释剂或填充剂中已可获得的粘合强度。合适的粘合剂包括糖如蔗糖，来自小麦、玉米水稻和马铃薯的淀粉；天然树胶如阿拉伯胶、明胶和黄芪胶；海藻的衍生物如藻酸、藻酸钠和藻酸铵钙；纤维素材料如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；聚乙烯基吡咯烷酮；和无机物如硅酸镁铝。组合物中的粘结剂的量可以在组合物的约1重量％至30重量％，优选组合物的约2重量％至约20重量％，更优选约3重量％至约10重量％，甚至更优选约3重量％至约6重量％的范围内。
润滑剂是指添加至剂型以在经压制之后成为片剂、粒料等以通过减少摩擦或磨损而从模具或模口脱模的物质。合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；和水溶性润滑剂如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和D,L-亮氨酸。通常在压制前的最后步骤添加润滑剂，因为它们必须存在于粒料的表面上以及它们之间和片剂压制的部分。润滑剂在组合物中的量可以在组合物的约0.05重量％至约15重量％，优选组合物的0.2重量％约5重量％，更优选约0.3重量％至约3重量％，且最优选组合物的约0.3重量％至约1.5重量％的范围内。
助滑剂是防止结块并改进造粒的流动特性，从而使流动平滑和均匀的材料。合适的助滑剂包括二氧化硅和滑石。组合物中助滑剂的量可以在组合物的约0.01重量％至10重量％，优选总组合物的0.1重量％至约7重量％，更优选约0.2重量％至5重量％，且最优选约0.5重量％至约2重量％的范围内。
着色剂是为组合物或剂型提供着色的辅料。这样的辅料可以包括食品级染料和吸附在合适的吸附剂如粘土或氧化铝上的食品级染料。着色剂的量可以在组合物的约0.01重量％至10重量％，优选约0.05重量％至6重量％，更优选组合物的约0.1重量％至约4重量％，且最优选约0.1％至约1％的变化。
本发明的疫苗的制剂和施用技术可见于"Remington'sPharmaceuticalSciences"MackPublishingCo.,EastonPA。包含至少一种本发明的糖缀合物和/或其药学上可接受的盐的合适的疫苗组合物可以为通过使任意的通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的一种糖缀合物在合适的液体药物载体中的溶液剂或任意其它制剂如片剂、丸剂、薄膜衣片剂、包衣片剂、糖衣丸剂、胶囊、粉末剂和沉淀物、凝胶剂、糖浆、悬浮剂(slurries)、混悬剂、乳剂等。
通过使任意的通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的一种糖缀合物的治疗有效剂量是指对疾病产生至少部分免疫的化合物的量。这样的化合物的毒性和治疗效力可以通过标准的药学、药理学和毒理学程序在细胞培养或实验动物中测定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。施用的组合物的实际量将取决于治疗的受试者、取决于受试者的体重、病痛的严重性、施用的方式和处方医师的判断。
本发明的另一优选实施方案涉及药物组合物，其包含通过使任意的通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物和/或通式(I)的糖和/或通式(II)的中间体连同至少一种药学上可接受的冷冻保护剂、冻干保护剂、辅料和/或稀释剂。所述药学组合物可用于针对与肺炎链球菌有关的疾病免疫。
本文中所称的肺炎链球菌包括以下血清型：1型肺炎链球菌、4型肺炎链球菌、9V型肺炎链球菌、2型肺炎链球菌、19F型肺炎链球菌、3型肺炎链球菌、19A型肺炎链球菌、12F型肺炎链球菌、31型肺炎链球菌、7F型肺炎链球菌、5型肺炎链球菌、14型肺炎链球菌、6A型肺炎链球菌、6B型肺炎链球菌、18C型肺炎链球菌和23F型肺炎链球菌。
本发明的优选实施方案涉及药物组合物，特别是疫苗，其包含通过使任意的通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物和/或通式(I)的糖和/或通式(II)的中间体连同至少一种药学上可接受的冷冻保护剂、冻干保护剂、辅料和/或稀释剂，用于针对与1型肺炎链球菌有关的疾病免疫。
将衍生自[→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→]的糖用合适的连接基官能化，这允许它们缀合至免疫原性载体，如本文中所定义，以提供糖缀合物。所述糖缀合物经证实作为用于针对与细菌有关的疾病且尤其是针对与肺炎链球菌有关的疾病，且尤其是针对1型肺炎链球菌免疫的疫苗是有效的。所述疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性加重、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。
本发明的又一方面涉及通式(I)的糖和/或通式(II)的中间体，其用作免疫学分析中的标记物用于诊断由细菌导致的疾病，所述细菌在它们的荚膜多糖中包含选自以下的糖结构：
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp。
这样的分析例如包括微阵列和ELISA，其可用于诊断由包含或包括本发明的糖的细菌导致的疾病，所述疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性加重、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。
本发明的糖可以容易地缀合至固体载体用于提供可用于诊断由包含或包括本发明的糖的细菌导致的疾病的分析。所述固体载体在它们的表面上存在易于与相互连接分子的官能团Y反应以提供经修饰的固体载体的官能度，所述经修饰的固体载体在它们的表面上存在相互连接分子的官能团X，所述官能团X能够与通式(I)的糖的硫醇基团反应。所述固体载体包括，但不限于微阵列玻片，其在它们的表面上存在易于与相互连接分子的官能团Y反应以提供经修饰的微阵列玻片的官能度，所述微阵列玻片在它们的表面上存在相互连接分子的官能团X。优选地，所述微阵列玻片在它们的表面上存在氨基。在它们的表面上存在氨基的微阵列玻片包括，但不限于经胺涂覆的GAPSII玻片(Corning)或CodeLinkNHS玻片，在其上通过用牛血清白蛋白(BSA)温育引入氨基官能度。
用通式(I)的糖涂覆的微阵列玻片通过将通式(I)的糖缀合至所述经修饰的微阵列玻片并用兔抗1型肺炎链球菌型血清人肺炎球菌血清007sp在存在或不存在天然1型肺炎链球菌多糖下温育来合成。结合实验显示抗1型肺炎链球菌型血清和人肺炎球菌血清007sp二者结合至α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp和α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp糖结构(参见图4-8)。此外，所述结合可以采用天然1型肺炎链球菌多糖抑制，暗示根据本发明的糖共享由免疫系统识别的表位(参见图5和图6)。
附图描述
图1显示了肺炎链球菌血清型的全球分布
图2提供了根据本发明的商购可得的相互连接分子的实例。
图3提供了根据本发明的相互连接分子的官能团X的实例。
图4显示了通式(I)的糖在微阵列玻片上的印刷图案
图5显示了人肺炎球菌血清007sp(用Pneumovax疫苗免疫的287人的混合定值血清(pooledsera))对通式(I)的糖的结合，其在存在和不存在天然1型肺炎链球菌多糖下涂覆在经修饰的CodeLinkNHS玻片上。
图6显示了兔抗1型肺炎链球菌型血清结合至通式(I)的糖，其在存在和不存在天然1型肺炎链球菌多糖下涂覆在经修饰的经胺涂覆的GAPSII玻片(Corning)上。
图7显示了兔抗1型肺炎链球菌型血清结合至通式(I)的糖，其涂覆在经修饰的经胺涂覆的GAPSII玻片(Corning)上。
图8显示了兔抗1型肺炎链球菌型血清结合至通式(I)的糖，其涂覆在经修饰的CodeLinkNHS玻片上。
列入以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当意识到的是实施例(以下代表由发明人公开的技术在本发明的实践中良好地起作用)中所公开的技术因此可以被视为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员鉴于本公开应当意识到的是可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。
本发明的不同方面的另外的变型和替代实施方案鉴于说明书将会对本领域技术人员而言显而易见。因此，本说明书待被解释为仅说明性的并且出于为本领域技术人员教导实施本发明的一般方式的目的。将要理解的是本文中所示和所描述的本发明的形式将被当做实施方案的实例。可以将要素和材料替代为本文中所阐释和描述的那些，可以倒转部分和工艺，并且可以独立地使用本发明的某些特征，这一切如对于本领域技术人员在得益于本发明的该描述之后将会变得显而易见那样。可以在本文中描述的元素中进行改变而不脱离在所附的权利要求中所描述的发明的精神和范围。
实施例
化学合成
化学合成的一般信息。除非注明，否则不经进一步纯化使用市售试剂。在使用前以通常的方式干燥和再蒸馏溶剂。除非另有注明，所有反应在经烘箱干燥的玻璃仪器中在惰性气氛下进行。分析薄层色谱法(TLC)在用0.25mm厚度的硅胶预涂覆的Kieselgel60F254玻璃板上进行。所述TLC板用UV光显像并通过用Hanessian溶液(硫酸铈和钼酸铵在含水硫酸中)或硫酸-乙醇溶液着色。柱色谱法在FlukaKieselgel60(230-400目)上进行。旋光度(OR)采用Schmidt&HaenschUniPolL1000旋光剂在以g/100mL表示的浓度(c)进行。1H和13CNMR光谱采用Varian400-MR或Varian600光谱仪用Me4Si作为内标测量。NMR化学位移(δ)以ppm记录并且耦合常数(J)以Hz报告。高分辨率质谱(HRMS)采用Agilent6210ESI-TOF质谱仪于FreieBerlin,MassSpectrometryCoreFacility记录。
实施例1：4-(苄氧羰基)氨基-3-O-乙酰丙酰基-4,6-二脱氧-D-半乳糖烯(1*):
于0℃向4-O-(苄氧羰基)氨基-3-羟基-4,6-二脱氧-D-半乳糖烯(Org.Lett.2010,12,1624)(1.64g,6.21mmol)(1.64g,6.21mmol)在CH2Cl2(40ml)中的搅拌的溶液添加吡啶(0.501ml,6.21mmol)、乙酰丙酸(0.96ml,9.31mmol)、DMAP(0.152g,1.242mmol)和EDC(1.205ml,6.83mmol)。将混合物升温至室温并与该温度搅拌。在3h后，添加0.5当量的乙酰丙酸和0.5当量的EDC以驱动反应完成。在5h后，将混合物用100mlDCM稀释并用水(50ml)、饱和NH4Cl水溶液(50ml)、饱和NaHCO3水溶液(50ml)和盐水(50ml)洗涤。使有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(EtOAc/己烷：1:1)纯化以产生无色油状酯1*(2.07g,5.73mmol,92％)。HRMS(ESI)C19H23NO6(M+Na+)计算值：384.1423，实测值：384.1415m/z。
实施例2：[2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-乙酰丙酰基-2,4,6-三脱氧-D-半乳吡喃糖基]磷酸二丁酯(2*)：
于-25℃向半乳糖烯1*(3.17g,8.77mmol)在干燥MeCN(44ml)中的搅拌的溶液添加硝酸铈铵(14.42g,26.3mmol)和叠氮化钠(0.86g,13.15mmol)。将反应在介于-25℃和-20℃之间强烈搅拌6h。将混合物用冷Et2O(50ml)稀释。将有机层用冷水(3x30ml)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶塞过滤(EtOAc/己烷/Et3N：1:1:0.01)以产生浅黄色油状作为4:1的半乳糖基/塔罗糖基混合物(2.01g)的粗糖基硝酸酯。
于室温向粗糖基硝酸酯(2.01g)添加磷酸二丁酯铈(2.21g,6.45mmol)在干燥DMF(28ml)中的溶液。将混合物于室温搅拌4.5h，用EtOAc(100ml)稀释并倒入水(100ml)中。将有机相用水(5x50ml)洗涤并将合并的含水级分用EtOAc(50ml)萃取。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：45:55至50:50)以提供澄清油状糖基磷酸酯2*(1.84g,3.00mmol,37％,1:10α/β)。HRMS(ESI)C27H41N4O10P(M+Na+)计算值：635.2458，实测值：635.2422m/z。
实施例3：乙基2-O-苄基-3,4-异丙叉基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(3*)：
于0℃向乙基6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3,4-异丙叉基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(Bioorg.Med.Chem.2001,9,1395)(45.7g,121mmol)在DMF(150ml)和THF(75ml)中的搅拌的溶液分批添加氢化钠(60％,7.24g,181mmol)，然后添加溴苄(17.2ml,145mmol)。将混合物于0℃搅拌1h，缓慢升温至室温并于该温度搅拌16h。将反应于0℃用NH4Cl水溶液(20ml)猝灭，用水(200ml)和EtOAc(150ml)稀释并于0℃搅拌15min。在分离之后，将有机相用水(5x100ml)洗涤并将合并的含水级分用EtOAc(2x100ml)重新萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并浓缩，以产生黄色油状粗苄基醚(61g)。
于0℃向粗苄基醚(61g)在THF(370ml)中的搅拌的溶液添加四丁基氟化铵(1M于THF中，166ml,166mmol)。将混合物升温至室温并搅拌1h。将反应用NaHCO3水溶液(200ml)和EtOAc(100ml)稀释。在分离之后，将水相用EtOAc(3x100ml)萃取，将合并的有机级分经MgSO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：0:1至1:3至1:1)以提供白色固体状醇3*。HRMS(ESI)C18H26O5S(M+Na+)计算值：377.1398，实测值377.1416m/z。
实施例4：(乙基2-O-苄基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷)醛酸甲酯(4*)：
于0℃向醇4*(6.0g,16.93mmol)在CH2Cl2(50ml)和H2O(25ml)中的强烈搅拌的溶液添加TEMPO(0.53g,3.39mmol)和BAIB(10.9g,33.9mmol)。将混合物升温至室温并于该温度搅拌1h。将反应用10％Na2S2O3水溶液(10ml)猝灭并用EtOAc(30ml)稀释。在分离之后，将有机相用10％Na2S2O3(4x20ml)洗涤。将水相用EtOAc(2x20ml)萃取并将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩，以提供黄色油状粗酸(7.92g)。
于0℃向乙酰氯(6.04ml,85mmol)在MeOH(300ml)中的搅拌的溶液滴加所述粗酸(7.92g)在MeOH(40ml)中的溶液。将混合物升温至室温，于该温度搅拌2h并冷却至0℃。将反应用NaHCO3水溶液(30ml)猝灭并用固体NaHCO3中和至pH7。蒸发挥发物并将混合物用EtOAc(70ml)稀释。在分离之后，将水相用EtOAc(5x50ml)萃取。将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。进行快速色谱法(EtOAc/己烷：2:3至1:1，然后1:0)以提供粗产物，将其在甲醇中于-20℃结晶(5ml/g粗产物)以提供白色固体状二醇4*(3.47g,10.13mmol,60％)。HRMS(ESI)C16H22O6S(M+Na)+计算值：365.1034，实测值365.1058m/z。
实施例5：(乙基2-O-苄基-3,4-O-内型-亚苄基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷)醛酸甲酯(5*)和(乙基2-O-苄基-3,4-O-外型-亚苄基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷)醛酸甲酯(6*)：
于室温向二醇4*(2.99g,8.73mmol)在干燥乙腈(29ml)中的搅拌的溶液添加苯甲醛二甲缩醛(6.57ml,43.6mmol)和DL-樟脑磺酸(0.51g,2.18mmol)。将混合物于室温搅拌5h并将反应通过添加三乙胺(0.35ml)猝灭。将混合物在降低的压力下浓缩，已提供残余物，将其通过硅胶短塞过滤(己烷/EtOAc8:1(2％Et3N)至1:1(2％Et3N))以提供亚苄基缩醛5*(内型)和6*(外型)的1:1混合物(3.46g,8.03mmol,92％)。通过从EtOAc/己烷中选择性结晶外型异构体6*并色谱法分离母液而分离异构体(Biotage，平坦梯度：10％至40％EtOAc于己烷中，+0.5％Et3N)。5*的分析数据：澄清油状。HRMS(ESI)C23H26O6S(M+Na)+计算值：453.1348，实测值：453.1352m/z。6*的分析数据：白色固体。HRMS(ESI)C23H26O6S(M+Na)+计算值：453.1348，实测值453.1338m/z。
实施例6：(乙基2,3-O-苄基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯(7*)：
于室温向缩醛6*(162mg,0.38mmol)和氰基硼氢化钠(296mg,4.70mmol)在THF(9.4ml)中的溶液添加氯化氢(1M于Et2O中)的溶液直至停止气体释放。在10min之后，添加氰基硼氢化钠(296mg,4.70mmol)，然后添加HCl。将反应于室温搅拌，用EtOAc(30ml)稀释并用NaHCO3水溶液(30ml)猝灭。在分离之后，将有机层用NaHCO3水溶液(20ml)洗涤并将水层用EtOAc(2x20ml)重新萃取。累积有机萃取物，经MgSO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:1)以提供白色固体状醇7*(67.5mg,0.156mmol,42％)。HRMS(ESI)C23H28O6S(M+Na+)计算值：455.1504，实测值：455.1511m/z。
实施例7：(乙基2,3-O-苄基-4-O-芴基甲氧基羰基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯(8*)：
于0℃向醇7*(160mg,0.370mmol)在吡啶(1.2ml)中的搅拌的溶液添加FmocCl(383mg,1.48mmol)。将混合物升温至室温并搅拌3h。然后将混合物用EtOAc(50ml)稀释并用1NHCl(2x30ml)和NaHCO3饱和水溶液(30ml)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:2)以提供白色泡沫状碳酸酯8*(217mg,0.331mmol,90％)。HRMS(ESI)C38H38O8S(M+Na)+计算值：677.2185，实测值：677.2167m/z。
实施例8：[(2,3-O-苄基-4-O-芴基甲氧基羰基-α/β-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯]磷酸二丁酯(9*)：
将硫代糖苷8*(200mg,0.305mmol)与干燥甲苯(2x30ml)共蒸发，保持在高真空下1h并溶于干燥CH2Cl2(3ml)。添加经活化的分子筛 并将溶液于室温搅拌15min。然后将溶液冷却至0℃，用磷酸二丁酯(128mg,0.611mmol)处理并搅拌另外的15min。然后将混合物用NIS(89mg,0.397mmol)处理，升温至室温并于该温度搅拌3h。将反应用CH2Cl2(20ml)稀释并用10％的Na2S2O3水溶液和NaHCO3饱和水溶液(20ml)的1:1(v/v)混合物猝灭。将水相用CH2Cl2(3x30ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:1至2:1)，以提供澄清油状糖基磷酸酯9*(218mg,0.272mmol,89％,10:1α/β。9*α的分析数据：HRMS(ESI)C44H51O12P(M+Na)+计算值：825.3015，实测值：825.3020m/z。9*β的分析数据：HRMS(ESI)C44H51O12P(M+Na)+计算值：825.3015，实测值825.2970m/z。
实施例9：(2-O-苄基-3,4-O-内型-亚苄基-α/β-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫基)乙醇(10*)：
将硫代糖苷5*(102mg,0.237mmol)、2-(苄基硫基)乙醇11*(60mg,0.355mmol)和TTBPy.(117mg,0.474mmol)与无水甲苯(3x10ml)共蒸发并保持在高真空下30min。将混合物溶于THF(4.8ml)中并于室温在经活化的分子筛存在下搅拌30min。将溶液冷却至0℃并用DMTST(92mg,0.355mmol于0.2ml干燥CH2Cl2中)处理。将反应升温至室温并于该温度搅拌2h。将反应用1:1(v/v)MeOH/Et3N混合物(0.1ml)猝灭并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷/Et3N0:1:0.01至30:70:0.01至45:55:0.01)，以提供澄清油状硫醚10*α(59mg,0.110mmol,46％)，连同相应的β-异构体10*β(35mg,0.065mmol,27％)。10*α的分析数据：HRMS(ESI)C30H32O7S(M+Na)+计算值：559.1766，实测值：559.1731m/z。
实施例10：(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖苷)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫基)乙醇(12*)：
于室温向缩醛10*α(100.0mg,0.186mmol)在干燥THF(5.3ml)中的搅拌的溶液首先添加硼烷三甲胺络合物(57.4mg,0.745mmol)，然后添加氯化铝(149mg,1.118mmol)。将混合物搅拌4.5h。将反应通过添加水(10ml)和1MHCl水溶液(5ml)猝灭。将混合物用EtOAc(3x10ml)萃取并将合并的有机级分经Na2SO4干燥和浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：2:5至1:1)以提供澄清油状醇12*(70.0mg,0.13mmol,70％)。HRMS(ESI)C30H34O7S(M+Na)+计算值：561.1923，实测值：561.1879m/z。
实施例11：(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2-(苄基硫基)乙醇(13*):
将醇12*(90mg,0.166mmol)和糖基磷酸酯9*(208mg,0.259mmol)与干燥甲苯(3x10ml)共蒸发并在高真空下保持1h。于室温将混合物溶于干燥CH2Cl2(3.3ml)并在经活化的分子筛存在下搅拌30min。将溶液冷却至0℃并滴加TBSOTf(0.133mmol于0.2ml干燥CH2Cl2中)处理。将溶液升温至室温并搅拌20h。将反应用CH2Cl2(10ml)稀释并用1:1(v/v)MeOH/吡啶混合物(0.2ml)猝灭。将溶液通过Celite过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶短塞过滤(EtOAc/己烷：1:1)，以提供澄清油状中间体二糖混合物(150mg,0.133mmol,80％,3:1α/β)。
于室温向所述碳酸酯混合物(150mg)在CH2Cl2(2.6ml)中的搅拌的溶液添加三乙胺(1.1ml,7.96mmol)。将反应于该温度搅拌3h并与甲苯(2x10ml)共蒸发。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:6至2:3至1:1)，以提供醇13*(62mg,0.068mmol,51％)连同相应的β-端基异构体(20mg,0.022mmol,17％)。HRMS(ESI)C51H56O13S(M+Na)+计算值：931.3339，实测值931.3340m/z。
实施例12：2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-乙酰丙酰基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫基)乙醇(14*)：
将醇13*(65mg,0.062mmol)和糖基磷酸酯2*(61mg,0.100mmol)与干燥甲苯(3x10ml)共蒸发并在高度真空下保持30min。将混合物溶于CH2Cl2(2.1ml)在经活化的分子筛存在下于室温搅拌1h。然后将溶液冷却至0℃并用TMSOTf(17μl,0.093mmol于0.2ml干燥CH2Cl2中)处理。将混合物于0℃搅拌3h，此时TLC(EtOAc/己烷：2:3)指示受体完全消耗。将反应用1:1(v/v)MeOH/NEt3混合物(0.5ml)猝灭，用CH2Cl2(20ml)稀释并通过Celite过滤。将粗产物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:2至1:1)以提供澄清油状三糖14*(69mg,0.053mmol,85％)。HRMS(ESI)C70H78N4O19S(M+Na)+计算值：1333.4879，实测值：1333.4911m/z。
实施例13：2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫基)乙醇(15*)：
于室温向乙酰丙酰基酯14*(30mg,0.023mmol)在干燥CH2Cl2(1.0ml)中的搅拌的溶液首先添加吡啶(56μl,0.692mmol)和乙酸(37μl,0.646mmol)的混合物，然后添加水合肼(2μl,0.041mmol)。将混合物于室温搅拌4h，用EtOAc(2ml)稀释，用丙酮(0.1ml)洗涤并倒入水(15ml)中。将水相用EtOAc(4x10ml)萃取，并将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并在降低的压力下浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：0:1至1:2至2:3)以提供澄清油状醇15*(28mg,0.023mmol,100％)。HRMS(ESI)C65H72N4O17S(M+Na)+计算值：1235.4511，实测值：1235.4539m/z。
实施例14：2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-苄氧甲基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫基)乙醇(16*)：
醇15*(8.6mg,7.1μmol)、苄氧甲基硫代环己烷(79mg,0.354mmol)和TTBPy.(105mg,0.425mmol)与干燥甲苯(3x10ml)共蒸发并在高度真空下保持30min。将混合物溶于干燥CH2Cl2(0.4ml)并在经活化的分子筛存在下于室温搅拌30min。将混合物冷却至0℃并在45min内滴加DMTST(7.1mg,0.18mmol于0.1mlCH2Cl2中)，同时将反应温度保持在低于10℃。将反应搅拌另外的45min，通过添加1:1(v/v)MeOH/Et3N混合物猝灭并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:10至1:2)，以提供澄清油状缩醛16*(6.0mg,4.5μmol,64％)。HRMS(ESI)C73H80N4O18S(M+Na)+计算值：1355.5086，实测值1355.5071m/z。
实施例15：2-乙酰氨基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-苄氧甲基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-(2,4-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→1)-2-(苄基硫代)乙醇(17*)：
于0℃向叠氮化物16*(14.0mg,10.5μmol)在干燥吡啶(0.35ml)中的搅拌的溶液添加硫代乙酸(0.35ml)。将混合物升温至室温并于该温度搅拌24h。将溶液与甲苯(2x5ml)共蒸发并将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:10至丙酮/己烷：1:7至1:5至1:3)以提供白色固体状乙酰胺17*(9.4mg,7.0μmol,66％)。HRMS(ESI)C75H84N2O19S(M+Na)+计算值：1371.5281，实测值：1371.5314m/z。
实施例16:2,2’-二硫代双[2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→3)-α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→1)-1-乙醇](18*):
于0℃向二酯17*在THF(4.0ml)和MeOH(0.8ml)中的搅拌的溶液添加NaOH在水(1.5ml)中的1M溶液。将反应缓慢升温至室温并搅拌16h。将反应用EtOAc(5ml)稀释并用0.5M的NaHSO4水溶液酸化至pH4。在分离之后，将含水级分用EtOAc(8x10ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩，以提供白色固体状中间体二酸。
于-78℃向液氨(5ml)的搅拌的溶液添加所述粗二酸在THF(1.5ml)中的溶液。将混合物用tBuOH(0.5ml)处理并添加新鲜切割的钠块(45mg)直至持续深蓝色。将反应于-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(200mg)猝灭。在氩气流下将溶液升温至室温并与MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物在空气下放置16h，通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，1:1MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以提供白色固体状二硫化物18*(1.4mg,1.65μmol,32％)。HRMS(MALDI)C44H70N4O32S2(M-H+)计算值：1229.3330，实测值：1229.3342m/z。
实施例17：(乙基2,3-O-苄基-4-O-乙酰丙酰基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯(19*)：
于室温向醇7*(94mg,0.217mmol)在CH2Cl2(1.9mL)中的搅拌的溶液添加乙酰丙酸(386mg,3.26mmol)、DCC(673mg,3.26mmol)和吡啶(0.26mL,3.26mmol)。将混合物于该温度搅拌35h，用CH2Cl2(5mL)稀释并通过Celite过滤。浓缩混合物，将残余物溶于小体积的CH2Cl2(1-3mL)并通过脱脂棉过滤。重复相同程序3次。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/甲苯：1:1)以提供浅黄色油状酯19*(91mg,0.171mmol,79％)。HRMS(ESI)C28H34O8S(M+Na)+理论值：553.1872，实测值：553.1872m/z。
实施例18：(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖苷)醛酸甲酯-(1→1)-6-(苄基硫代)己醇(20*)：
将硫代糖苷19*(87mg,0.164mmol)、6-(苄基硫代)己醇21*(85mg,0.379mmol)和TTBPy.(97mg,0.392mmol)与无水甲苯(3x10ml)共蒸发并在高度真空下保持30min。将混合物溶于Et2O(2.5ml)和CH2Cl2(0.83ml)并在经活化的分子筛存在下于室温搅拌30min。将溶液冷却至0℃并用DMTST(63.5mg,0.246mmol)处理。将反应升温至室温并于室温搅拌8h。将反应用1:1(v/v)的MeOH和三乙胺(0.1ml)混合物猝灭并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/CH2Cl2/己烷：0:0:1至1:2:1)，以提供相应的糖苷(60mg)，其为不可分离的α/β混合物。
于室温向所述糖苷混合物在干燥CH2Cl2(2.2ml)中的搅拌的溶液首先添加吡啶(195μl,2.411mmol)和乙酸(137μl,2.393mmol)的混合物，然后添加水合肼(5.9μl,0.121mmol)。将混合物在该温度搅拌2h，用EtOAc(2ml)稀释，用丙酮(0.1ml)猝灭并倒入水(15ml)中。将水相用EtOAc(4x10ml)萃取，将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:2)，以提供澄清油状醇20*(29mg,0.049mmol,30％经两个步骤)连同相应的β-异构体(22mg,0.037mmol,22％)。HRMS(ESI)C34H42O7S(M+Na)+计算值：617.2544，实测值：617.2542m/z。
实施例19：6,6’-二硫代双[α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→1)-1-己醇](22*)：
于0℃向酯20*(10mg,0.017mmol)在THF(1.0ml)和MeOH(0.5ml)中的搅拌的溶液添加NaOH在水中的1M溶液(0.8ml)。将反应缓慢升温之室温并搅拌16h。将反应用EtOAc(5ml)和水(5ml)稀释并用0.5MNaHSO4水溶液酸化至pH4。在分离之后，将含水级分用EtOAc(8x5ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩，以提供白色固体状中间体酸。
于-78℃向液氨(8ml)的搅拌的溶液添加所述粗二酸在THF(2ml)中的溶液。将混合物用tBuOH(0.4ml)处理并添加新鲜切割的钠块(45mg)，直至持续深蓝色。将反应于-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(100mg)猝灭。在氩气流下将反应升温至室温并用MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物在空气下放置16h,通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，9:1MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以提供白色固体状二硫化物22*(3.1mg,5.1μmol，经两步60％)。HRMS(MALDI)C24H42O14S2(M-H+)理论值：617.1938，实测值：617.1954m/z。
实施例20：2-乙酰氨基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-乙酰丙酰基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-6-(苄基硫代)己醇(23*)：
将6-(苄基硫代)己醇21*(29mg,0.171mmol)和糖基磷酸酯2*(70mg,0.114mmol)与干燥甲苯(3x10ml)共蒸发并在高度真空下保持30min。将混合物溶于CH2Cl2(1.8ml)并在经活化的分子筛存在下于室温搅拌1h。然后将溶液冷却至0℃并用TMSOTf(31μl,0.171mmol于0.2ml干燥CH2Cl2中)处理。将混合物在该温度搅拌3h，用MeOH和三乙胺(0.5ml)的1:1(v/v)混合物处理，用CH2Cl2(20ml)稀释并通过Celite过滤。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：2:3至3:2)，以提供相应的糖苷(57mg)，其为不可分离的α/β混合物。
于0℃向所述糖苷混合物在干燥吡啶(0.9ml)中的搅拌的溶液添加硫代乙酸(0.9ml)。将混合物升温至室温并在该温度搅拌24h。将溶液与甲苯(2x5ml)共蒸发并将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:2至2:1至6:1)，以提供白色固体状乙酰胺23*(22mg,0.034mmol,29％，经两步)，连同相应的β-异构体(21.6mg,0.034mmol,29％).HRMS(ESI)C34H46N2O8S(M+Na)+计算值665.2872，实测值：665.2865m/z。
实施例21：6,6’-二硫代双[2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-1-己醇](24*)：
于室温向酯23*(10mg,0.016mmol)在干燥CH2Cl2(1.0ml)中的搅拌的溶液首先添加吡啶(38μl,0.467mmol)和乙酸(24.9μl,0.436mmol)的混合物，然后添加水合肼(1.0μl,0.020mmol)。将混合物在该温度搅拌2h，用丙酮(0.1ml)猝灭并通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexLH-20，CH2Cl2/MeOH2:1)以提供澄清油状相应的醇。
于-78℃向液氨的搅拌的溶液(5ml)添加中间体醇在THF(1.2ml)中的溶液。将混合物用tBuOH(0.5ml)处理并添加新鲜切割的钠块(80mg)直至持续深蓝色。将反应于-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(100mg)猝灭。在氩气流下将溶液升温至室温并与MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物防止在空气下16h，通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，9:1MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以提供白色固体状二硫化物24*(1.7mg,2.7μmol，33％，经两步)。HRMS(ESI)C28H54N4O8S2(M+Na)+理论值：661.3281，实测值：661.3306m/z。
实施例22：2-乙酰氨基-4-(苄氧羰基)氨基-3-O-乙酰丙酰基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-2-(苄基硫代)乙醇(25*):
将2-(苄基硫代)乙醇11*(71mg,0.421mmol)和糖基磷酸酯2*(171mg,0.281mmol)与干燥甲苯(3x10ml)共蒸发并在高度真空下保持30min。将混合物溶于CH2Cl2(1.8ml)并在经活化的分子筛存在下于室温搅拌1h。然后将溶液冷却至-40℃并用TMSOTf(56μl,0.309mmol与0.2ml干燥CH2Cl2中)处理。将混合物缓慢升温至0℃(2h)，用MeOH和三乙胺(0.5ml)的1:1(v/v)混合物猝灭，用CH2Cl2(20ml)稀释，通过Celite过滤并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:3至1:1)以提供相应的α-糖苷(55mg,0.096mmol,34％)连同相应的β-糖苷(22mg,0.039mmol,14％)。
于0℃向中间体α-糖苷(40mg,0.070mmol)在干燥吡啶(0.4ml)中的搅拌的溶液添加硫代乙酸(0.4ml)。将混合物升温至室温并在该温度搅拌24h。将溶液与甲苯(2x5ml)共蒸发并将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:3到丙酮/己烷：1:2至2:3)，以提供白色固体状乙酰胺25*(31mg,0.053mmol,76％)。HRMS(ESI)C30H38N2O8S(M+Na)+计算值：609.2246，实测值：609.2256m/z。
实施例23：6,6’-二硫代双[2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-1-乙醇](26*)：
于室温向酯25*(20.7mg,0.035mmol)在干燥CH2Cl2(3.0ml)中的搅拌的溶液首先添加吡啶(86μl,1.058mmol)和乙酸(57μl,0.988mmol)的混合物，然后添加水合肼(3.4μl,0.071mmol)。将混合物在该温度搅拌5h，用EtOAc(2ml)稀释，用丙酮(0.1ml)猝灭并倒入水(10ml)中。将水相用EtOAc(4x5ml)萃取，并将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(丙酮/己烷：1:1)，以提供白色固体状中间体醇(17.5mg)。
于-78℃向液氨的搅拌的溶液(6ml)添加所述中间体醇在THF(1.5ml)中的溶液。将混合物用tBuOH(0.5ml)处理并添加新鲜切割的钠块(45mg)直至持续深蓝色。将反应于-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(100mg)猝灭。在氩气流下将溶液升温至室温并于MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物在空气下放置16h，通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，1:10MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以提供白色固体状呈二乙酸盐形式的二硫化物26*(7.91mg,12.3μmol，70％经两步)。HRMS(ESI)C20H38N4O8S2(M+Na)+计算值：549.2029，实测值：549.2086m/z。
实施例24：2,2’-二硫代双[α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→3)-α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→1)-1-乙醇](27*)：
于0℃向酯13*(8.6mg,9.5μmol)在THF(0.6ml)和MeOH(0.3ml)中的搅拌的溶液添加NaOH在水(0.5ml)中的1M溶液。将反应缓慢升温至室温并搅拌16h。将反应用EtOAc(5ml)和水(5ml)稀释并用0.5MNaHSO4水溶液酸化至pH4。在分离之后，将含水级分用EtOAc(8x5ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩，以提供白色固体状中间体二酸。
于-78℃向液氨的搅拌的溶液(6ml)添加粗二酸在THF(1.5ml)中的溶液。将混合物用tBuOH(0.4ml)处理并添加新鲜切割的钠块(75mg)直至持续深蓝色。将反应在-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(100mg)猝灭。在氩气流下将溶液升温至室温并与MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物在空气下放置16h，通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，1:9MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以提供白色固体状二硫化物27*(2.5mg,2.9μmol,61％经两步)。HRMS(MALDI)C28H42O26S2(M-H+)计算值：901.0966，实测值：901.0981m/z。
实施例25：合成糖缀合物-将通式(I)的糖缀合至CRM197：于室温向CRM197(1mg,17.2nmol)在0.1M磷酸钠缓冲液(NaPi)pH7.4(1ml)中的搅拌的溶液添加琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)(264μg,863nmol)在DMF(20μl)中的溶液。将混合物在该温度搅拌1h，并使用膜过滤浓缩(AmiconUltra离心膜，10kDa截留)。将蛋白质溶液用0.1MNaPipH7.4稀释并再次浓缩。重复该过程三次并使用0.1MNaPipH7.4将溶液稀释至1ml。将在120μl0.1MNaPipH7.4中的通式(II)的中间体(690mmol)于室温用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(690mmol)处理，于该温度在氩气气氛下放置1h并于室温添加至溴乙酰氨基-修饰的CRM197蛋白质的溶液。将混合物于室温放置2h，然后于4℃放置16h，并使用膜过滤纯化(参见上文)。然后将在0.1MNaPipH7.4(1ml)中的经纯化的糖缀合物于室温用在100μl水中的L-半胱氨酸(417μg,3.45μmol)处理。将混合物在该温度放置2h并通过膜过滤纯化。通过MALDI-TOF-MS、SDS-PAGE和具有正确角度光散射检测的尺寸排阻色谱法(SEC-RALS)评估通式(I)的糖引入糖缀合物。
实施例26：合成糖缀合物-通式(I)的糖流动缀合至具有免疫调节性质的鞘糖脂
通过使用配备TeflonAF2400管回路(566μL)的光化学流动反应器(Chem.Eur.J.2013,19,3090)，将通式(I)的糖(1.5当量)在水(300μL)中的溶液与经戊烯基修饰的(2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇(1当量)于水(300μL)和AcOH中反应(8μL；停留时间：10min，流速：28.3μL/min-1每注射器)。将反应器输出物冻干并将粗物质使用尺寸排阻色谱法纯化(Sephadex-G25，5％EtOH于水中，10mmx150mm)，以生成白色固体状共价连接至经修饰的(2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇的通式(I)的糖的糖缀合物。
实施例27：合成糖缀合物-将2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇缀合至BSA
于室温向BSA(0.5mg,7.6nmol)在0.1M磷酸钠缓冲液(NaPi)pH7.4(1mL)中的搅拌的溶液添加N-琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)(89μg,290nmol)在DMF(20μL)中的溶液。将混合物于室温搅拌1h，并使用膜过滤浓缩(Amicon0.5mLUltra离心膜，10kDa截留)。将蛋白质溶液用0.1MNaPipH7.4稀释并再次浓缩。重复该过程三次并使用水将溶液稀释至0.5mL。提取20μL用于分析，并使用膜过滤将蛋白质溶液再次缓冲至0.1MNaPipH7.4。于室温将在120μL0.1MNaPipH7.4中的二硫化物18*(140μg,228nmol分别对单体)用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(250nmol)处理，于该温度在氩气气氛下放置1h并于室温添加至经活化的蛋白质的溶液。将混合物于4℃放置16h，并使用膜过滤纯化(参见上文)。在用水洗涤并稀释至0.5mL之后，提取另一分析样品(20μL)，并将溶液重新缓冲。然后将在0.1MNaPipH7.4(0.5mL)中的经纯化的糖缀合物于室温用在100μl水中的L-半胱氨酸(417μg,3.45μmol)处理。将混合物在该温度放置2h并通过膜过滤纯化。通过MALDI-TOF-MS(主动模式)评估将2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇引入所述糖缀合物：
测量的分子量：
BSA:66341m/z；
BSA-SBAP缀合物：68316m/z(引入大约10个SBAP基团)；
BSA-SBAP糖缀合物：69101m/z(引入大约1.3分子的2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇)。
在L-半胱氨酸用猝灭之后的BSA-SBAP糖缀合物：72074m/z(引入大约24.5个L-半胱氨酸分子)。
实施例28：合成糖缀合物-将2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇缀合至BSA
于室温向BSA(0.5mg,7.6nmol)在0.1M磷酸钠缓冲液(NaPi)pH7.4(1mL)中的搅拌的溶液添加N-琥珀酰亚氨基-3-马来酰亚氨基丙酸酯(101μg,380nmol)在DMF(20μL)中的溶液。将混合物于室温搅拌1h，并使用膜过滤浓缩(Amicon0.5mLUltra离心膜，10kDa截留)。将蛋白质溶液用0.1MNaPipH7.4稀释并再次浓缩。重复该过程三次并使用水将溶液稀释至0.5mL。提取20μL用于分析，并使用膜过滤将蛋白质溶液再次缓冲至0.1MNaPipH7.4。于室温将在120μL0.1MNaPipH7.4中的二硫化物18*(140μg,228nmol分别对单体)用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(250nmol)处理，于该温度在氩气气氛下放置1h并于室温添加至经活化的蛋白质的溶液。将混合物于4℃放置16h，并使用膜过滤纯化(参见上文)。在用水洗涤并稀释至0.5mL之后，提取另一分析样品(20μL)，并将溶液重新缓冲。然后将在0.1MNaPipH7.4(0.5mL)中的经纯化的糖缀合物于室温用在100μl水中的L-半胱氨酸(417μg,3.45μmol)处理。将混合物在该温度放置2h并通过膜过滤纯化。通过MALDI-TOF-MS(主动模式)评估将聚糖引入所述糖缀合物：
测量的分子量：
BSA：66341m/z；
BSA-马来酰亚胺缀合物：69254m/z(引入大约19个马来酰亚胺基团)；
BSA-马来酰亚胺糖缀合物：71340m/z(引入大约3.4分子的2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇)；
在L-半胱氨酸用猝灭之后BSA-马来酰亚胺糖缀合物：72106m/z(引入大约6.3个L-半胱氨酸分子)。
实施例29：缀合至固体载体-使用GAPSII玻片合成微阵列
通过于室温将氨涂覆的玻片(GAPSII玻片，Corning)浸没于在具有二异丙基乙胺的干燥DMF(2.5％v/v)中的6-马来酰亚氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(2mM)中24h产生马来酰亚胺官能化的微阵列。将玻片用水洗涤三次并用乙醇洗涤三次，离心至干，并在氩气下储存直至测定点位(spotting)。通过自动压电阵列机器人(Scienion,Berlin,Germany)以0.4nL每点位将经稀释的通式(I)的糖印刷至改性的微阵列玻片上。为了完成免疫反应，经经印刷的玻片在加湿室中储存24h。
将微阵列玻片用水洗涤三次。通过将所述玻片于室温浸没于在PBS中的β-巯基乙醇(0.1％,v/v)1h而猝灭未反应的马来酰亚胺。将玻片用水和用乙醇洗涤三次，离心至干，并用在PBS中的BSA(1％,w/v)于室温阻断(block)1h。将经阻断的玻片洗涤(2xPBS,3x水)，离心并用血清稀释液温育。
实施例30：缀合至固体载体-使用CodeLinkNHS玻片合成微阵列
于4℃将CodeLinkNHS玻片温育24h(1％w/v于PBS中)。将玻片在阻断缓冲液(100mM乙醇胺于50mMNaPi中，pH>9)中于室温温育30min，每次用水和乙醇洗涤三次并干燥。然后使玻片经受马来酰亚胺官能化并印刷(参见实施例29)。
实施例31：使用根据在实施例29和30描述的程序合成的微阵列的结合试验。
结合试验通过以下进行：温育在存在或不存在天然SP1多糖的情况下显示的以稀释剂形式涂覆有具有兔抗-SP1型血清或人肺炎球菌参考血清007sp(用Pneumovax疫苗免疫的287人的混合定值血清)的通式(I)的糖的微阵列玻片，并使用荧光标记的抗兔或抗人第二抗体。
实施例32：评价连接基A的和相互连接分子的免疫原性
为了核实制备根据本发明的糖缀合物1中所使用的连接基A的和相互连接分子的免疫原性，所述糖缀合物包含
存在经由相互连接分子1连接至免疫原性载体1的连接基A的通式I的糖如：
H–(P)n3–(N)n2–(M)n3–O–A–S–残余的相互连接分子1–免疫原性载体1，
需要合成三种糖缀合物：
糖缀合物2：
H–(P)n3–(N)n2–(M)n3–O–A–S–残余的相互连接分子2–免疫原性载体2；
糖缀合物3：
半乳糖–O–A–S–残余的相互连接分子1–免疫原性载体2；
糖缀合物4：
半乳糖–O–A–S–残余的相互连接分子2–免疫原性载体2；
所述免疫原性载体2必须与免疫中使用的免疫原性载体1不相关。例如，如果将CRM197用于制备糖缀合物1，则可以将BSA用作免疫原性载体2。
选择半乳糖用于制备糖缀合物3，因为其不与根据本发明的糖相关，即与H–(P)n3–(N)n2–(M)n3–OH不相关。
用于制备糖缀合物2的相互连接分子2必须与相互连接分子1不相关。例如，如果将磺基-GMBS用作相互连接分子1，则不相关的相互连接分子2将会是磺基SIAB。
免疫原性载体2、相互连接分子2和不相关的糖地选择对于合成糖缀合物的本领域技术人员而言是显而易见的。
ELISA的规程：
于37℃将96孔板用50μl在PBS中的各糖缀合物(50μg/ml)涂覆1h。将所述板用100μl洗涤缓冲液(PBS+0.1％(v/v)Tween-20)洗涤一次并使用200μl阻断溶液(1％(w/v)BSA在PBS中)于37℃阻断1h。将所述板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后用在阻断溶液中的抗血清的稀释液(50μl)于4℃温育16h。将所述版洗涤3次并用50μl稀释于阻断溶液中的合适的第二抗体(例如羊抗小鼠IgGH&L(HRP),abcamab6789)于37℃温育1h。将所述板用洗涤缓冲液洗涤3次并根据制造商的手册用ELISA培养基(例如来自Pierce的ABTS，No.37615)温育。
对比所施加的糖缀合物之间的光密度将会给出抗连接基、抗相互连接分子和抗糖免疫响应之间的定量对比。
实施例33：2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-6-(苄基硫代)乙醇(28*)
于室温向中间体Lev酯25*(17mg,0.03mmol)在干燥CH2Cl2(1mL)中的搅拌的溶液首先添加吡啶(72μl,0.894mmol)和乙酸(48μl,0.834mmol)的混合物，然后添加水合肼(3μl,0.062mmol)。将混合物于该温度搅拌5h，用EtOAc(2ml)稀释，用丙酮(0.1mL)猝灭并倒入水(10mL)中。将水相用CH2Cl2(4x5ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：3:1)以提供澄清油状醇28*(13mg,0.028mmol,92％)。HRMS(ESI)C23H28N4O5S(M+Na)+计算值：495.1678，实测值：495.1679m/z。
实施例34：(2,3-二-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖基)醛酸甲酯-(1→3)-2-叠氮基-4-(苄氧羰基)氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-2-(苄基硫代)乙醇(29*)
将醇28*(13mg,0.028mmol)、TTBPy(45,0.138mmol)和硫代糖苷19*(37mg,0.069mmol)与干燥甲苯(3x10mL)共蒸发并在高度真空下保持1h。将混合物溶于干燥THF(1.5mL)并在经活化的分子筛存在下于室温搅拌30min。将溶液冷却至0℃并逐滴用DMTST(17mg,0.069mmol于0.2mLDCM中)处理。将混合物升温至室温并在2h之后用另外的在DCM中的DMTST溶液(2当量)处理。将反应搅拌16h并用10％Na2S2O3水溶液和NaHCO3饱和水溶液的1:1(v/v)混合物(5mL)猝灭。将混合物用CH2Cl2(3x10mL)萃取，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:2)以提供澄清油状二糖。
于0℃向中间体二糖在干燥吡啶(0.2ml)中的搅拌的溶液添加硫代乙酸(0.2ml)。将混合物升温至室温并于该温度搅拌24h。将溶液与甲苯(2x5ml)共蒸发并将残余物通过快速色谱法纯化(EtOAc/己烷：1:3到丙酮/己烷：1:2)，以提供白色泡沫状中间体乙酰胺。
于室温向中间体乙酰胺在干燥CH2Cl2(0.6mL)和MeOH(60μL)中的搅拌的溶液首先添吡啶(12μl,0.16mmol)和乙酸(8μl,0.15mmol)的混合物，然后添加水合肼(1μl,0.021mmol)。将混合物在该温度搅拌3h，用CH2Cl2(2ml)稀释，用丙酮(0.1mL)猝灭并倒入水(5mL)中。将水相用CH2Cl2(4x5ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(丙酮/己烷：0:1至1:1)，以提供白色泡沫状乙酰胺29*(2.7mg,3.14μmol,21％，基于回收的28*经3步)。HRMS(ESI)C46H54N2O12S(M+Na)+计算值：881.3295，实测值：881.3286m/z。
实施例35：2,2’-二硫代双[α-D-半乳吡喃糖基醛酸酯-(1→3)-2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→1)-1-乙醇](30*)
于0℃向酯29*(2.7mg,3.14μmol)在THF(1mL)和MeOH(0.25mL)中的搅拌的溶液添加NaOH在水中的1M溶液(0.4mL)。将反应缓慢升温至室温并搅拌16h。将反应用EtOAc(5ml)和水(5ml)稀释并用0.5MNaHSO4水溶液酸化至pH4。在分离之后，将含水级分用EtOAc(8x5ml)萃取，将合并的有机级分经Na2SO4干燥并浓缩，以产生白色固体状中间体二酸。
于-78℃向液氨的搅拌的溶液(10ml)添加在THF(1.5ml)中的粗二酸的溶液。将混合物用tBuOH(0.4ml)处理并添加新鲜切割的钠块(80mg)直至持续深蓝色。将反应于-78℃搅拌45min并通过添加固体乙酸铵(100mg)猝灭。在氩气流下将溶液升温至室温并与MeOH(2x10ml)和水(2x5ml)共蒸发。将残余物在空气下放置16h，通过尺寸排阻色谱法纯化(SephadexG-25，1:3MeOH/5mMNH4OAc水溶液)并重复冻干，以产生白色固体状二硫化物30*(1.15mg，2.61μmol，83％经两步)：
1HNMR(600MHz,D2O)δ5.16(d,J＝2.0Hz,1H),5.02(d,J＝3.2Hz,1H),4.49(d,J＝5.9Hz,1H),4.44–4.35(m,1H),4.34–4.20(m,2H),4.15–4.04(m,1H),4.00–3.78(m,5H),3.06(t,J＝5.6Hz,2H),2.09(s,3H),1.41(d,J＝6.6Hz,3H).LRMSC32H54N4O20S2(M+2H)2+理论值：440.4，实测值：440.2m/z。
实施例36：用于评价根据本发明的通式3化合物的一般程序：
实施例36.1
向异氰酸酯A12(2.70mmol)在12mlCH2Cl2中的溶液添加胺(1.05eq,2.83mmol)。将反应混合物于环境温度搅拌12小时，然后在真空中浓缩。将粗物质溶于Et2O，随后添加己烷。然后将脲沉淀并过滤，以得到产物。
经由导管将经对甲氧基苄基醚保护的脲化合物(0.4mmol)和1,3,5-三甲氧基苯(0.2mmol)在无水CH2Cl2(3mL)中的混合物添加至六氟锑酸银(20μmol,5mol％)在无水CH2Cl2(1mL)中的溶液。将反应混合物加热至回流直至完全并采用二氯甲烷作为洗脱液通过Celite的小垫过滤。在真空中除去溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法纯化以得到A10。
实施例36.2
其中：R3表示Me且R4表示OH
醛A17(1.0mmol)和酮A16(1.0mmol)在i-PrOH(100íL)中的混合物添加丙酸(0.1mmol,10mol％)和吡咯烷酮(0.1mmol,10mol％)。将反应混合物于45℃搅拌1-25h。添加NaHCO3，并将混合物用CH2Cl2(35mL)萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，以得到中间体不饱和酮A15。
将中间体不饱和酮A15(0.05mmol)在THF中的9.5×10-3M溶液和新近制备的Stryker试剂(0.025mmol)混合在一起形成均质溶液，将其于室温搅拌2h。将反应用NH4Cl饱和水溶液猝灭。将混合物搅拌1h。将反应混合物过滤并将残余物用乙酸乙酯洗涤。分离有机相，然后用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机相用MgSO4干燥并在真空下除去溶剂。将残余物通过柱色谱法在硅胶上纯化，以产生酮A14。
将纯三壬氧基甲基钛(10.1mmol)置于两颈圆底烧瓶中并经受Ar气氛。添加在THF中的酮A14(4.65mmol)并将混合物于室温搅拌30min。添加油酸(17.8mmol)并将混合物加热至110℃。浓缩产物并通过快速色谱法纯化，以产生中间体叔醇。
PMB醚(0.1mmol)在二氯乙烷(5mL)中的溶液添加POCl3(0.5mmol)并于室温搅拌。在完成反应之后，将反应在冰水中猝灭并分离有机层和将水层用二氯乙烷(2×5mL)萃取。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，在降低的压力下浓缩，并将残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，EtOAc:己烷)，以提供醇A13。
实施例36.3
向经烘箱干燥的250-mL圆底烧瓶装入在干燥THF(100mL)中的四丁基碘化铵(0.40mmol,2.2mol％)和1,3-丙烷二硫醇(20mmol,1.1当量)。将混合物于室温搅拌并分批添加氢化钠(60％悬浮液于矿物油，20mmol,1.1当量)。将产生的混合物搅拌30min，然后滴加溴苄(18mmol)。将溶液于室温搅拌1h，然后在烧结漏斗上过滤并在真空下浓缩。将产生的粗制油在真空下蒸馏，以提供无色油状标题化合物A20。
向A19(0.11mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液添加硫醇A20(0.22mmol)。将混合物于25□C搅拌18h，然后在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法过滤，以提供A18。
通式A20的许多二硫醇衍生物是市售可得的。
实施例36.4
将新鲜切割的钠金属(4.67mmol)溶于异丙醇(10mL)并添加苄基硫醇(6.23mmol)。添加4-(溴甲基)环戊-1-烯(1.55mmol)在异丙醇(5mL)中的溶液并将溶液在回流下加热4天。使溶液冷却至室温，用水(50mL)稀释并用乙醚(3X50mL)萃取。将合并的有机萃取物用0.1M氢氧化钾水溶液(2X50mL)洗涤，干燥并蒸发，以生成粗A25。柱色谱法在硅胶上用乙酸乙酯/己烷洗脱提供标题化合物A25。
将配备磁力搅拌子、隔膜入口、油封鼓泡器和回流冷凝器的干燥的50-mL烧瓶用氮气吹扫。向所述烧瓶添加烯烃A25(5.5mmol)和干燥THF(2.5mL)，然后于0℃添加9-BBN的溶液(0.5M溶液于THF中,5.5mmol)。使混合物缓慢升温至室温，然后搅拌4-6h，以得到B-烷基-9-BBNA24的溶液。
向上述A24的硼烷溶液添加DMF-THF(25mL)、PdCl2(dppf)(0.15mmol)、卤代烯烃(5mmol)和粉末K3PO4(6mmol)。将混合物于50℃搅拌8h，然后倒入水中。将产物用苯萃取，用水洗涤四次并经MgSO4干燥。柱色谱法在硅胶上用乙酸乙酯/己烷洗脱提供标题化合物A22。
实施例36.5
于0℃在氩气气氛下向1.1当量的醛A30在干燥甲醇中的溶液滴加在甲醇中的1.3当量的胺A28。将混合物于室温搅拌另外的10min，随后接着添加在干燥甲醇中的1.0当量的酸A27和1.1当量的异氰化物A29。将反应混合物于室温搅拌24-48h。将产生的溶液用二氯甲烷稀释并用1NHCl水溶液、随后饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化(己烷/乙酸乙酯)。
实施例36.6
合成A33：
向叠氮化物A35(0.03mol)和氯化铵(0.07mol)在乙醇(80mL)和水(27mL)中的溶液添加锌粉末(0.04mol)，将混合物于室温或在回流下强烈搅拌。在反应完之后，添加乙酸乙酯(200mL)和氨水(10mL)。将混合物过滤并将滤液用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并在降低的压力下浓缩。
合成A31：
将酸A32(1mmol)和胺A33(1mmol)用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐(1mmol)在3.5mL甲醇中于室温偶联3h。将混合物用EtOAc(20mL)稀释并用水(10mL)、1MHCl水溶液(10mL)和NaHCO3饱和水溶液(10mL)萃取。有机层经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，以产生中间体醇。
将NaH(0.83mmol)在THF(2mL)中的悬浮液冷却至0℃，然后向所述悬浮液缓慢添加在THF(4mL)中的所述中间体醇(0.17mmol)。将混合物回流2h，然后使之冷却至室温。于室温向混合物滴加在THF(2mL)中的A34(0.11mmol)。将反应混合物回流12h，然后使之冷却至室温。在通过旋转蒸发仪除去溶剂之后，将残余物溶于CHCl3并过滤。将滤液通过旋转蒸发仪蒸发并色谱分离。
向PMB醚(0.1mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液添加POCl3(0.5mmol)并于室温搅拌。在完成反应之后，将其在冰水中猝灭并分离有机层和将水层用二氯甲烷(2×5mL)萃取。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，在降低的压力下浓缩并将残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，EtOAc:己烷)，以提供相应的醇A31。
实施例36.7
在试管中引入环氧化物A42(5mmol)和水(2mL)。一次添加胺A41(6mmol)并将试管保持于0℃并升温至室温在强烈搅拌下24h。添加水(2ml)并将含水混合物用10ml乙酸乙酯萃取并经无水Na2SO4干燥，在降低的压力下除去溶剂，以产生中间体β-氨基醇。将在EtOAc(2mL)和NaHCO3饱和水溶液(1mL)中的胺于室温用CbzCl(6mmol)处理并与该温度搅拌5h。将混合物用EtOAc(3x5mL)萃取，将有机级分经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，以产生醇A40。
实施例36.8
使溴化物A47(8.26mmol)与硫醇A48在用NaOMe调节至pH9的MeOH(5mL)中反应。将混合物于室温搅拌16h并在降低的压力下浓缩，以产生中间体PMB醚。
向PMB醚(0.1mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液添加POCl3(0.5mmol)并于室温搅拌。在完成反应之后，将其在冰水中猝灭并分离有机层和将水层用二氯乙烷(2×5mL)萃取。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，在降低的压力下浓缩并将残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，EtOAc:己烷)，以提供相应的醇A46。
实施例36.9
将酸A51(1mmol)和胺A50(1mmol)用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐(1mmol)在3.5mL甲醇中于室温偶联3h。将混合物用EtOAc(20mL)稀释并用水(10mL)、1MHCl(10mL)水溶液和NaHCO3饱和水溶液(10mL)萃取。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，以产生醇A49。
实施例36.10
向A53(80mmol)在吡啶(60mL)中的溶液分批添加MsCl(80mmol)，于20℃有效搅拌30min。在搅拌30min之后，将反应混合物于室温保持20h，用CH2Cl2(100mL)稀释并用2NHCl水溶液洗涤直至含水洗涤物变成酸性。将H2O层用CH2Cl2(3X50mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)，浓缩并浓缩，以产生中间体甲磺酸酯。
于室温将苄基硫化钠(4.1mmol)分批添加至中间体甲磺酸酯(2.7mmol)在DMF(5mL)中的搅拌的溶液。在3h后，将混合物用甲苯(100mL)稀释，用水(25mL)和盐水(25mL)洗涤，干燥(MgSO4)并在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，以产生硫醚A52。
实施例36.11
向二醇A55(8mmol)在吡啶(6mL)中的溶液分批添加TsCl(8mmol)，于20℃有效搅拌30min。在搅拌30min之后，将反应混合物于室温保持20h，用CH2Cl2(100mL)稀释并用2NHCl水溶液洗涤直至含水洗涤物变成酸性。将H2O层用CH2Cl2(3X50mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩，以产生中间体甲苯磺酸酯。
将甲苯磺酸酯(0.67mmol)在5mL干燥HMPA中的溶液在冰浴中在N2下冷却。将该混合物添加至NaSBn(10mmol)在20mL干燥HMPA中的冷溶液(由400mg钠和过量BnSH在干燥的乙醚中，随后除去乙醚并用HMPA替换而制备)。在添加之后，将溶液在冰箱(-15℃)中储存14h。然后用100mL水处理并用乙醚萃取三次。将乙醚萃取物用水洗涤四次并经MgSO4干燥。然后在真空下除去溶剂并将残余物(140mg)经硅胶色谱分离，以产生硫醚A54。
实施例36.12
在N2下向新鲜蒸馏的CH2Cl2(20mL)添加Et2Zn(1.0M在己烷中)(20.0mmol)。将溶液在冰浴中冷却，然后经由注射器将三氟乙酸(20.0mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液滴加至反应混合物。在搅拌20min时，添加CH2I2(20.0mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液。在搅拌另外20min之后，添加二醇A58(10.0mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液，并移除冰浴。在搅拌另外30min之后，将反应混合物用0.1NHCl(50mL)(或者用NH4Cl或Et3N饱和水溶液，随后NaHCO3饱和水溶液)和己烷(25mL)猝灭，分层。将水层用己烷萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3、H2O和盐水洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩并且通过柱色谱法纯化(己烷/乙醚＝50/1)以提供二醇A57。
向二醇A57(8mmol)在吡啶(6mL)中的溶液分批添加TsCl(8mmol)，于20℃有效搅拌30min。在搅拌30min之后，将反应混合物于室温保持20h，用CH2Cl2(100mL)稀释并用2NHCl水溶液洗涤直至水洗涤物变成酸性。将H2O层用CH2Cl2(3X50mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩，以产生中间体甲磺酸酯。
将中间体甲磺酸酯(0.67mmol)在5mL干燥HMPA中的溶液在冰浴中在N2下冷却。将该混合物添加至NaSBn(10mmol)在20mL干燥HMPA中的冷溶液(由400mg钠和过量BnSH在干燥乙醚中，随后除去乙醚并用HMPA替换而制备)。在添加之后，将溶液在冰箱(-15℃)中储存14h。然后用100mL水处理并用乙醚萃取三次。将乙醚萃取物用水洗涤四次并经MgSO4干燥。然后在真空下除去溶剂并将残余物(140mg)经硅胶色谱分离，以产生硫醚A56。
实施例36.13
于0℃向二醇A61(16.1mmol)、三乙胺(24.1mmol)和DMAP(0.16mmol)在CH2Cl2(120mL)中的溶液在1h内分5批添加TBDMSCl(19.3mmol)。将产生的均质反应混合物逐渐升温至室温。将混合物搅拌12h，然后用水和CH2Cl2稀释。将有机层连续用NaHCO3饱和水溶液、NH4Cl饱和水溶液、水和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将淡黄色油状物通过真空色谱法纯化，以产生中间体甲硅烷基醚。
将中间体甲硅烷基醚(1.0mmol)和催化剂(活性炭上的Rh或Ru，N.E.Chemcat；10重量％基底)在iPrOH(1mL)中的混合物在密封管中于60℃在5atmH2下搅拌。在冷却至室温之后，将反应混合物用MeOH(20mL)稀释并通过膜过滤器(Millipore,Millex-LH,0.45mm)过滤除去催化剂。在真空中浓缩滤液，以产生相应的十氢化萘。
向中间体十氢化萘醇(8mmol)在吡啶(6mL)中的溶液分批添加TsCl(8mmol)，于20℃有效搅拌30min。在搅拌30min之后，将反应混合物于室温保持20h，用CH2Cl2(100mL)稀释并用2NHCl水溶液洗涤，直至含水洗涤物变成酸性。将H2O层用CH2Cl2(3X50mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并浓缩，以产生甲苯磺酸酯A60。
甲苯磺酸酯A60(0.67mmol)在5mL干燥HMPA中的溶液在冰浴中在N2下冷却。将该混合物添加至NaSBn(10mmol)在20mL干燥HMPA中的冷溶液(由400mg钠和过量BnSH在干燥乙醚中，随后除去乙醚并用HMPA替换而制备)。在添加之后，将溶液在冰箱(-15"C)中储存14h。然后用100mL水处理并用乙醚萃取三次。将乙醚萃取物用水洗涤四次并经MgSO4干燥。然后在真空下除去溶剂并将残余物(140mg)经硅胶色谱分离，以产生中间体甲硅烷基醚。
将中间体甲硅烷基醚(0.235mmol)于室温溶于THF(1mL)，随后添加70％HF·吡啶(0.2mL)。在搅拌两天之后，将反应混合物小心地用NaHCO3饱和水溶液猝灭并将产生的溶液用EtOAc稀释。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，以产生醇A59。
实施例36.14
将乙基方酯A67(0.5mmol)、A68(100mg,0.588mmol)和Et3N(15滴)在CH2Cl2(10mL)中的溶液于室温搅拌过夜。然后将其在降低的压力下浓缩。将产生的粗残余物、A66(1.1mmol)和Et3N(15drops)在CH2Cl2(10mL)中于室温搅拌过夜。然后将其在降低的压力下浓缩并通过柱色谱法纯化。将PMB-醚(0.444mmol)溶于丙酮(4.5ml)和水(0.5ml)。以固体形式添加CAN(0.845mmol)，随后在70分钟内滴加CAN(0.845mmol)在丙酮(0.9ml)和水(0.1ml)中的溶液。在另外15分钟之后，将反应倒入碳酸氢钠水溶液中并用氯仿萃取。将产物经色谱法纯化，以产生65。
实施例36.15
将三乙胺(0.359mL)添加至市售可得的S-苄基-(R)-半胱氨醇(2.56mmol)在THF(7.50mL)中的溶液。在搅拌10min之后，于0℃添加二碳酸二丁酯(2.56mmol)。将反应混合物于室温搅拌2h。然后在降低的压力下蒸发溶剂；将残余物溶于乙酸乙酯并用水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤，并在降低的压力下蒸发，以产生无色油状A69。
实施例37：根据本发明的糖的另外的实例：
化学式：C25H41N3O17S；分子量＝687.68；
化学式：C23H36F2N2O16S；分子量＝666.61；
化学式：C19H32N2O10S，分子量＝480.54；
化学式：C12H22O6S2，分子量＝326.43；
化学式：C24H40N2O10S，分子量＝548.66；
化学式：C18H32N2O11S，分子量＝484.53；
实施例38：合成糖缀合物-将2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇缀合至CRM197
于室温向CRM197(2mg,34.5nmol)在0.1M磷酸钠缓冲液(NaPi)pH7.4(1.33mL)中的搅拌的溶液添加N-琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)(1.05mg,3.4μmol)在DMF(40μL)中的溶液。将混合物在该温度搅拌1h，并使用膜过滤浓缩(Amicon4mLUltra离心膜，10kDa截留)。将蛋白质溶液用无菌水稀释至4mL并再次浓缩。将该方法重复三次并使用无菌水将溶液稀释至0.5mL。提取20μL用于分析，并使用膜过滤将蛋白质溶液在此缓冲至0.1MNaPipH8.0(0.5mL)。将在0.1MNaPipH8.0(0.2mL)中的二硫化物18*(1.44mg,2.33μmol，分别对于单体)于室温用三(2-羧乙基)膦(TCEP,25μL的100mM储备溶液，pH7.4)处理，于该温度在氩气气氛下放置1h并添加至经活化的蛋白质的溶液。将混合物于室温搅拌16h并使用膜过滤用无菌水洗涤(参见上文)。提取另一分析样品并将溶液重新缓冲至0.1MNaPipH7.4(0.5mL)。然后将糖缀合物于室温用在100μl无菌水中的L-半胱氨酸(0.625mg,5.1μmol)处理。将混合物在该温度放置2h并通过膜过滤纯化。通过MALDI-TOF-MS(主动模式)评价将聚糖引入所述糖缀合物：
测量的分子量：
CRM197：58100m/z
CRM197-SBAP缀合物：61700m/z(引入大约19个SBAP基团)
CRM197-SBAP-糖缀合物：66000m/z(引入大约5.9分子的2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→3)-(α-D-半乳吡喃糖基)醛酸酯-(1→1)-2-(硫代)乙醇)。
实施例39：免疫试验
将小鼠(6-8周龄雌性NMRI小鼠，CharlesRiver)在第0、14和28天以100μL的总体积采用有或没有Alum(Alhydrogel,Brenntag)配制的在实施例38中合成的CRM197-SBAP-糖缀合物皮下免疫(相当于4μg合成聚糖)。包括小鼠的对照组同等地仅用Alum或PBS处理。在第0、14、28和35天采集血液并通过聚糖微阵列和ELISA分析免疫响应。
在用Alum辅助的糖缀合物免疫的小鼠的亚组中发现针对天然Sp1多糖的免疫响应，其中在第35天相比于第0天，端点滴度分别为500和2500。

Claims (15)

1.通式(I)的糖和这些糖的药学上可接受的盐：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下糖片段之一：
其中所述糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S2，和糖片段S2不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
2.通式(I)的糖的合成：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下糖片段之一：
其中所述糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–SH片段，每个糖片段S1、S2和S3在通式(I)中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S2，和糖片段S2不能同时连接至–O–A–SH和糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1，
所述合成包括以下步骤：
A1)使下式的化合物2：
其中P1–P3表示保护基，
与下式的化合物3反应
其中P4表示保护基，从而获得以下通式的化合物4：
其中P1-P4和A如上文所定义；
和
除去化合物4上的保护基P1-P4，以提供以下通式的单糖二硫化物5：
其中A如上文所定义，
和其中将单糖二硫化物5进一步用还原剂处理，以提供以下通式的单糖6：
其中A如上文所定义；
或
对化合物4进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物7
其中P5是保护基和P1、P3、P4和A如上文所定义，
或
A2)使以下通式的化合物8
其中，P6和P7表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物9
其中，P6、P7和A如上文所定义；
和
对化合物9进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去保护基P4、P6和P7，以提供以下通式的单糖二硫化物10：
其中A如上文所定义，和其中将单糖二硫化物10进一步用还原剂处理，以提供以下通式的单糖11：
其中，A如上文所定义；
或
对化合物9进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物12：
其中P4、P7和A如上文所定义，
或
A3)使以下通式的化合物13
其中P8–P11表示保护基，
与化合物3反应，以提供以下通式的化合物14：
其中P4、P8–P11如上文所定义
和
进行化合物14的选择性脱保护，以提供以下通式的化合物15：
其中P4、P8、P9、P11和A如上文所定义，
和
B1)使化合物7与化合物13反应，以提供以下通式的化合物16：
其中P1、P3-P5、P8-P11和A如上文所定义；
和
除去化合物16上的保护基P1、P3-P5、P8-P11，以提供以下通式的二糖二硫化物17：
其中A如上文所定义和其中将二糖二硫化物17进一步用还原剂处理，以提供以下通式的二糖18：
其中A如上文所定义；
或
选择性除去化合物16上的保护基P10，以提供以下通式的化合物19：
其中P1、P3-P5、P8、P9、P11和A如上文所定义，
或
B2)使化合物15与化合物8反应，以提供以下通式的化合物20：
其中P4、P6-P9、P11和A如上文所定义
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去化合物20上的保护基P4、P6-P9、P11，以提供以下通式的二糖二硫化物21：
其中A如上文所定义和其中将二糖二硫化物21用还原剂处理，以提供以下通式的二糖22：
其中A如上文所定义；
或
选择性除去化合物20上的保护基P6，以提供以下通式的化合物23：
其中P4、P7-P9、P11和A如上文所定义；
或
B3)使化合物12与化合物2反应，以提供以下通式的化合物24：
其中P1-P4、P7和A如上文所定义，
和
进行叠氮基到乙酰氨基的转化并除去化合物24上的保护基P1-P4和P7，以提供以下通式的二糖二硫化物25：
其中A如上文所定义，和其中将二糖二硫化物25进一步用还原剂处理，以提供以下通式的二糖26：
其中A如上文所定义；
或
对化合物24进行选择性脱保护，以提供以下通式的化合物27：
其中P12是保护基且P1、P3、P4、P7和A如上文所定义，
和
C1)使化合物19与化合物8反应，以提供以下通式的化合物28：
其中P1、P3-P9、P11和A如上文所定义；
和
其中将保护基P6用保护基P13替换，从而获得以下化学式的化合物29：
其中P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基并裂解保护基P1、P3-P5、P7-P9、P11、P13而将化合物29转化成三糖二硫化物30，其中化合物30具有通式：
和其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物30转化成三糖31，其中化合物31具有通式：
和其中A如上文所定义，
或
C2)使化合物23与化合物2反应，以提供以下通式的化合物32：
其中P1–P4、P7–P9、P11和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基和裂解保护基P1–P4、P7–P9、P11将化合物32转化成三糖二硫化物33，其中化合物33具有通式：
其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物33转化成三糖34，其中化合物34具有通式：
其中A如上文所定义；
或
C3)使化合物27与化合物13反应，以提供以下通式的化合物35：
其中P1、P3、P4、P7-P11和A如上文所定义；
和
通过将叠氮基转化成乙酰氨基和裂解保护基P1、P3、P4、P7-P11将化合物35转化成三糖二硫化物36，其中化合物36具有通式：
其中A如上文所定义；
和
通过用还原剂处理将三糖二硫化物36转化成三糖37，其中化合物37具有下式：
其中A如上文所定义。
3.根据权利要求2所述的合成，还包括步骤D：
D)制备通式(I)化合物的盐或制备通式(I)化合物的冻干物或通式(I)化合物的盐的冻干物。
4.根据权利要求2所述的合成，其中化合物2与3之间、化合物2与12之间和化合物2与23之间的反应在DMTST和TTBPy存在下于非极性和极性非质子溶剂的混合物中进行。
5.根据权利要求2所述的合成，其中将化合物28上的保护基P6用保护基P13替换以获得化合物29在两个步骤中进行，第一步包括化合物28与肼或肼盐在溶剂或溶剂混合物中的反应且第二步通过将在第一步之后获得的产物用BnOCH2SCy、DMTST和TTBPy在非极性溶剂中处理。
6.根据权利要求2所述的合成，其中裂解所述保护基包括通过在极性非质子和极性质子溶剂的混合物中用碱处理而第一裂解碱不稳定性保护基；和通过暴露至极性质子和极性非质子溶剂的混合物中的钠和氨第二裂解对水解敏感的保护基。
7.通式(II)的中间体和这些糖的药学上可接受的盐：
其中A是连接基；
M、N和P彼此独立地表示以下片段之一：
其中糖片段S1、S2、S3经由O-糖苷键彼此连接和连接至–O–A–S–片段，每个糖片段S1、S2和S3在片段H–(P)n3–(N)n2–(M)n1–O–A–S–中出现不多于一次，糖片段S1不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S3，糖片段S3不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S2，糖片段S2不能同时连接至–O–A–S–和糖片段S1，和
n1、n2和n3是选自0和1的整数，其中所述整数n1、n2和n3的至少一个为1。
8.通过使根据权利要求1所述的通式(I)的糖与免疫原性载体反应获得的糖缀合物。
9.根据权利要求8所述的糖缀合物，其作为疫苗用于针对与细菌相关的疾病免疫，所述细菌在它们的荚膜多糖中包含选自以下的糖结构：
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp。
10.根据权利要求9所述的糖缀合物，其中所述细菌为1型肺炎链球菌。
11.根据权利要求9所述的糖缀合物，其中所述与细菌有关的疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症、慢性支气管炎的急性加重、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。
12.药物组合物，其包含根据权利要求8所述的糖缀合物和/或根据权利要求1所述的糖和/或根据权利要求7所述的中间体，连同至少一种药学上可接受的冷冻保护基、冻干保护基、赋形剂和/或稀释剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其用于针对与肺炎链球菌有关的疾病免疫。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述肺炎链球菌选自1型肺炎链球菌、4型肺炎链球菌、9V型肺炎链球菌、2型肺炎链球菌、19F型肺炎链球菌、3型肺炎链球菌、19A型肺炎链球菌、12F型肺炎链球菌、31型肺炎链球菌、7F型肺炎链球菌、5型肺炎链球菌、14型肺炎链球菌、6A型肺炎链球菌、6B型肺炎链球菌、18C型肺炎链球菌和23F型肺炎链球菌。
15.根据权利要求1所述的糖和/或根据权利要求7所述的中间体，其用作免疫学分析中的标记物用于诊断由细菌导致的疾病，所述细菌在它们的荚膜多糖中包含选自以下的糖结构：
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp
α-D-GalAp
α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc
α-D-GalAp-(1→3)-α-2,4,6-三脱氧-4-氨基-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalAp。
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