JPS63190896A - 新規なオリゴ糖、免疫原およびワクチン、ならびにそのようなオリゴ糖、免疫原およびワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｄ−リボース単位（ユニット）ｍＤ−リビト
ール単位およびホスフェート単位を含有するオリゴ糖、
そのようなオリゴ糖を含有する免疫原、そのような免疫
原を含有するワクチン、ならびにそのようなオリゴ糖、
免疫原およびワクチンの製造方法に係る。

インフルエンザ菌（Ｈａｅｓｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌ
ｕａｎｚａｅ）ｂ型の莢膜多糖は多くのＤ−リボース−
Ｄ−リビトール−ホスフェート（→３）−Ｄ−リボフラ
ノース（ｒｉｂｆ）　−（１−＋１）−リビトール−５
−＋ＰＯ４−）単位から構成されている。中でもインフ
ルエンザ菌す型は１ｌＩｌｌ！炎やその他の感染病を引
き起こす病原菌である。

インフルエンザ菌す型（ＨＩＢ）の莢膜多糖を投与する
と免疫が得られることは既に判っている。

また、特に二歳以下の子供では、得られた免疫の持続期
間が短いこと、さらに−成牛以下の子供ではまったく免
疫が見られないことも既に判明している。これは、いわ
ゆる胸腺依存性担体（タンパク質）に結合した＊膜多糖
を投与すると改善することができる。そのような多糖−
タンパク質結合体には、その構造が正確には決められず
、生成物中の多糖部分が均質ではないという欠点がある
。

この結果、そのような結合体を含有するワクチンの新し
いバッチを作成するたびにそのワクチンの有効性につい
て実験動物および／または人で試験してみなければなら
ない。加えて、そのような生成物をワクチン中に使用す
ると望ましくない抗体や毒性を生じるかもしれない。

ＨＩＢ多糖の分解によって得られたオリゴ糖はより明確
に定義されているとはいってもやはり純粋ではない。こ
の場合も有効性は常に試験しなおさなければならない。

したがって、正確に定義された純粋なオリゴ糖断片、す
なわち異なる構造や異なる鎖長を為するオリゴ糖を含有
しないオリゴ糖断片を含む、ＨＩＢ病に対するワクチン
が切望されている。

この程、そのように純粋なオリゴ糖が合成経路で得られ
ること、またそメ′ような断片を担体に結合することに
よって適切な免疫原を得ることができることが発見され
た。そのような免疫原はワクチン中に使用することがで
きる。また、このようなオリゴ糖を合成経路によって製
造することができるという事実には、その入手可能性が
病原菌ＨＩＢの入手可能性に依存しないという利点もあ
る。

したがって、本発明は、Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール
−ホスフェート、Ｄ−リビトール−ホスフェート−Ｄ−
リボースまたはホスフェート−Ｄ−リボース−〇−リビ
トールを２個、３個、４個、・・・・・・１９個または
２０個含むオリゴ糖に関し、特に次式を有するオリゴ糖
に関する。

式ま ただし、 １−１であればに−０または１であり、Ｌ−０であれば
に−０であり、 Ｌ−０または１であり、 ｍ　−２，３，・・・・・・１９または２０であり（た
だし、ｋｌＬおよびｎ−１であるかまたは１．ｎおよび
ｑ＝１であればｍは１であることもできる）ｍｎ−０ま
たは１であり、 ｎ−１であればＱ−０または１であり、ｎ−ｏであれば
ｑ−０であり、 Ｘ−水素、または直接もしくは間接に担体との結合を形
成することができる反応性の基、または非結合末端に疎
水性の鎖を含有する基であるか、あるいは、末端のＸＯ
−基が反応性の基Ｈ２Ｎ＝またはＨ８−によって置換さ
れており、 Ｙ−水素、または直接もしくは間接に担体との結合を形
成することができる反応性の基、または非結合末端に疎
水性の鎖を有する基であるか、あるいは、末端の一０Ｙ
Ｗが反応性の基−ＮＨ２または一３Ｈによって置換され
ている（ただし、Ｘ≠水素であればＹ＝水素であり、Ｙ
≠水素であればＸ−水素である）。

これらオリゴ糖の塩も包含される。

また本発明は上記のオリゴ糖を３為する免疫原にも係り
、その際このオリゴ糖は担体と結合（ａｓｓｏｃｉａｔ
ｉｏｎ）　Ｌ／ているか、あるいはこの免疫原は上記の
オリゴ糖数分子の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、会合
）を含有している。さらに本発明はそのような免疫原を
含有するワクチンにも係る。

本発明はまた、本発明のオリゴ糖、免疫原およびワクチ
ンの製造方法にも係る。

式１に示したＤ−リボース−Ｄ−リビトール−ホスフェ
ート骨格の末端は、Ｘ　（ＸＯ−）とＹ（−０Ｙ　）を
無視すれば、右端も左端もリボース残基、リビトール残
基またはホスフェート残基のいずれでもよい。しかし、
Ｘ　（ＸＯ−）とＹ（−０Ｙ）を無視して、左の末端が
リビトールかリボースの残基であり右の末端がホスフェ
ート基であるオリゴ糖か、または右の末端がリビトール
かりボースの残基であり左の末端がホスフェート基であ
るオリゴ糖が好ましい。ｍは２，３，４．５または６で
あるのが好ましい。なぜならば、そのよりな長さのオリ
ゴ糖骨格は一般に所望の目的に関して明らかに適してい
るからである。ｍが３．４．５または６であるとさらに
好ましい。

ｋｌ（−１ｎ、ｑが０で、ＸＩｆｉＨであり、ＹがＨで
ないものが好ましい。

本発明のオリゴ糖中のホスフェート基はたとえば中性ｐ
Ｈの溶液中ではイオン化状態にあるから、本発明のオリ
ゴ糖は塩たとえばナトリウム塩の形態で製造するのが好
ましい。

本発明のオリゴ糖自体は免疫原性を全く、あるいは不適
当な免疫原性をもたないので、このオリゴ糖を担体に結
合させる必要があり、その結果実際に前記免疫原性が充
分な程度で得られる。このオリゴ糖を担体と結合する様
式は担体のタイプに応じて変化する。オリゴ糖と担体の
結合は式１のＸ　（ＸＯ−）かＹ　（−０Ｙ）を介して
直接または間接に行なわれる。

ＸとＹが水素の場合、これらの部位のひとつを担体との
結合が可能になるように修飾しなければならない。式１
に示した一ＯＨ基と一０基は多少とも活性であり、本発
明のオリゴ糖の製造中の間保護されているので、担体と
の結合に必要な修飾は保３基を除去する館に導入するの
が有利である。

既に述べた通り、オリゴ糖と担体との結合はＸ（ＸＯ−
）かＹ（−〇Ｙ）のいずれかを介して行なわれる。そこ
でもしＸとＹが水素であれば、担体との結合に必要な基
を導入する前に再度保護基を導入しなければならないこ
とになろう。したがって、Ｘが水素でＹ　（−０Ｙ）が
伯の特定の基のひとつであるか、あるいはＹが水素でＸ
　（ＸＯ−）が他の特定の基のひとつであるのが好まし
い。

以後本明ｍｓ中でｒＸＪまたはｒＹＩまたは「反応性の
基」という用語を用いる場合、反応性の基が反応性の−
ＮＨ２または−８）−１１である場合も意味しており、
その際にはＸＯ−または−ＯＹの代わりにそれぞれＮＨ
２または一８Ｈと読み替えることにする。したがって本
発明のオリゴ糖は、一方の末端がヒドロキシル基であり
、他の末端が反応性の基であるかまたは非結合末端に疎
水性の鎖を有する基であるものが好ましい。これら二種
類の基のどちらを選択するかは、オリゴ糖と担体の結合
を実施する様式によって決まる。

この目的には原理的にいって二通りの公知の方法が使用
できる。第一の方法ではオリゴ糖を担体に結合する。こ
の場合担体は通常タンパク質である。

二番目の方法では、非結合末端に疎水性の基を有しオリ
ゴ糖に結合している基と担体との間の疎水性の相互作用
（この場合担体はミセル、ベシクルまたはリポソームで
ある）か、またはオリゴ朝間の疎水性の相互作用を利用
してオリゴ糖を結合する。前者の場合、疎水性の基がミ
セル、ベシクルまたはリポソームの中の両親媒性の化合
物（リビド）の疎水性の領域との疎水性相互作用に関与
し、オリゴ糖はミセル、ベシクルまたはリポソームの界
面にとどまる。

直接または間接にタンパク質との結合を形成することが
できる反応性の基は公知である。ここで間接結合とは、
反応性の基とタンパク質との結合が別の付加的な化合物
を介して行なわれることを意味している。式１中のＸか
Ｙが反応性の基である場合、原理的にいって、カルボキ
シル、アミンまたは必要に応じてタンパク質中に導入さ
れているその他の反応性官能基との結合を形成すること
ができる反応性の基、または別の付加的な化合物を介し
てカルボキシル、アミンまたは必要に応じてタンパク質
に導入されている反応性官能基と結合することができる
反応性の基はいずれも適切である。

そのような反応性の基の例は次の反応性官能基を有する
基である。

ただし、Ｒ−−ＯＨ，−Ｎ、−０−（Ｃ）アルキル、−
００６Ｆ５、−Ｈｌ−８ｒ、−〇○ 反応性の基はこれらの反応性官能基のうちのひとつで構
成されていてもよいし、あるいは反応性の基・が大きめ
である場合前記の反応性官能基のうちのひとつを含んで
いてもよく、この場合この基は末端に前記反応性官能基
のうちのひとつがあるのが好ましい。

オリゴ糖をタンパク質に結合した後にこのオリゴ糖中の
リボース−リビトール−ホスフェート単位がタンパク質
から多少の距離離れている場合、反応性の基は上記の反
応性官能基のひとつを有するかなり長い残基であるのが
好ましい。免疫原性を助長するからである。

前述したように、反応性の基をオリゴ糖骨格の末端に導
入するが、これは前記の骨格が保護されている状態で行
なうのが好ましい。前記反応性官能基のひとつを含有す
る反応性の基を導入した後、この反応性の官能基は、オ
リゴ糖骨格が未だ保護されていれば他の反応性官能基の
ひとつに変換することができるが、しかしこの骨格が既
に完全に脱保護されていても同様に他の反応性官能基の
ひとつに変換することができる。

たとえば、−Ｎ　Ｈ２官能基を含有する反応性の基、た
とえば次式 （ただし、ａ−０〜１６、ｂ−０〜２　、Ｃ−１〜１０
であり、末端゛のアミノ酸はグリシンが好ましい）のよ
うな基は、活性のエステルとマレイミド官能基を含有す
る化合物を利用して、マレイミド官能基を含有する反応
性の基に変換することができる。

ずなわら、上に挙げた基と （Ｒ＜、を前記と同じ意味である）とは、それぞれ次式
の基になる。

ざらに、−ＮＨ２官能基を含有する反応性の基は、活性
のエステルまたはアルデヒド官能基を２個含有する化合
物によって、反応性の官能基として活性のエステルまた
はアルデヒドを含有する反応性の基、たとえば （ただし、Ｒは前記と同じ意味をもち、ｄ−１−・６で
ある）に変換することができ、あるいは活性のエステル
と一８Ｈ官能鵡を含有する化合物によって、−ＳＨ官能
基を含有する反応性の基、たとえば ＯＮＨＡＣ （ただし、ｄ−１〜６、ＡＣ−アセチルである）に変換
することができる。

一８Ｈ官能基を含有する反応性の基は、活性のエステル
とマレイミド官能基とを含有する化合物によって、活性
のエステルを反応性の官能基として含有する反応性の基
、たとえば 反応性の官能基として一〇−Ｒｉ！を含有する反応性の
基は、−ＮＨ２および−ＳＨ官能基またはマレイミドお
よび−ＮＨ２官能基を含有する化合物との反応によって
、それぞれ−８Ｈ基またはマレイミド基を反応性の官能
基として含有する反応性の基に変換することができる。

このような反応基の変換自体は文献によって公知である
。

こうして製造した本発明のオリゴ糖をタンパク質または
ペプチドに結合する。タンパク質中の反応性の−ＮＨ２
、−Ｃ００Ｈまたは一３Ｈ基は、前述した手順と類似の
手順によって前述した他の反応性の基のひとつに変換す
ることができる。

次に本発明のオリゴ糖とタンパク質とをたとえば以下の
ようにして互いに結合させることができる。

オリゴ糖−マレイミド　＋　Ｈ８−タンパク質→　免疫
原 オリゴ糖−８Ｈ＋　マレイミド−タンパク質→　免疫原 オリゴ糖−Ｃ−Ｒ＋　　Ｈ２Ｎ−タンパク質→　免疫原 オリゴ糖−ＮＨ＋Ｒ−Ｃ−タンパク質 →　免疫原 ここでＲは前述の意味をもつ。このような結合（カップ
リング）は直接または間接に起こすことができる。

さらにまた、反応性の−ＮＨ２官能基を有するオリゴ糖
は、たとえばビス［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］エ
ステルやグルタルジアルデヒドのようなカップリング剤
を用いてタンパク質のＮＨ４Ｉにカップルさゼることが
できる。

式１のＸかＹが非結合末端に疎水性の鎖を含有する基で
ある場合、ミセル、ベシクルまたはリポソームとの疎水
性相互作用に関与することができる基かあるいは疎水性
相互作用によってミセルを形成することができる基がこ
の目的にふされしい。

この疎水性の鎖は炭素原子を１２〜２４個含有するアル
キル基が好ましい。最も好ましいのは、炭素原子を１２
〜２４個含有するアルキル基で構成されている基である
。

さらに好ましいのは炭素原子を１４〜２２個含有し分岐
をもたないアルキル基である。

本発明のオリゴ糖はＨＩ３病に対するワクチンをｖＡ造
するのに適切に使用することができる。本発明のオリゴ
糖自体は免疫原性ではないので、結合の結果できる結合
体に免疫原性を付与する担体と結合しなければならない
。この原理自体はいわゆるハブテンで知られており、こ
の場合ハブテンはそれ自体では免疫原性でないが、担体
と結合することによって免疫原性にすることができる。

適切な担体はタンパク質、ペプチド、ミセル、ベシクル
およびリポソームである。最も好ましいのはタンパク質
またはミセルである。

（以下余白） 特に適当なタンパク質及びペプチドは、破傷風トキシン
、破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ジフテリア
トキソイド、百日咳トキシン、百日咳トキソイド、百日
咳繊維状赤血球凝集素、百日咳繊毛、百日咳外層膜タン
パク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ）外層膜タンパク質、インフルエンザ菌（
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）外層
膜タンパク質、インフルエンザ菌繊毛、ポリオウィルス
サブユニットタンパク質、はしがウィルスサブユニット
タンパク質である。インフルエンザ菌タンパク質が最も
好ましい、ががる担体の利点は既存のＤＰＴＰワクチン
に於いて使用されているが又は使用され得ることである
。これらのタンパク質は公知であり、その単離方法も公
知である。また、これらのタンパク質と糖とを結合させ
る方法も公知である０通常は糖とタンパク質との間の共
有結合が関与する。

式１（明細書末尾に記載）のＸ又はＹが非結合末端に疎
水性鎖を含有する基であるとき、オリゴ糖をミセル、ベ
シクル又はリポソームと結合させることによってオリゴ
糖の適当な免疫原性が得られる。

疎水性鎖とミセル、ベシクル又はリポソームの疎水性部
分との疎水性相互作用によって結合が得られる。かかる
結合方法も公知である。

式１のＸ又はＹが反応性基のときは、反応性基と疎水性
鎖とを含有する化合物との反応を任意にまず行なわせて
もよい、このようにして得られた生成物を次にミセル、
ベシクル又はリポソームと結合させ得る。

本発明のオリゴ糖に免疫原性を与える別の方法では、非
結合末端に疎水性部を含むＸ又はＹをもっオリゴ糖を処
理して疎水性相互作用によって該疎水性鎖にミセル構造
を形成させる。この場合、免疫原性は、オリゴ糖と担体
との結合によって得られるのでなく、オリゴ糖の複数分
子が互いに結合することによって得られる。

免疫原を調製するための可能な別の方法では、Ｘ又はＹ
が反応性基である式１のオリゴ糖を該反応性基を介する
共有結合によって両親媒性アジュバント分子に結合させ
る。この結合は直接又は間接のいずれでもよい、オリゴ
糖とアジュバントとの結合後、アジュバントの非結合末
端が任意に非結合アジュバント又はその他の脂質と共に
ミセルを形成し得る。適当な両親媒性アジュバントは例
えば、アブリジン（Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’　、
Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミ
ン）ｍ脂肪アミン４−アミノメチル−１（２，３−（ジ
−ｎ−デシルオキシ）−ｎ−プロピル）−４−フェニル
ピペリジン、ジメチル−ジオクタデシル−アンモニウム
プロミド、ラウリルムラミルジペプチド、ラウリルテト
ラペプチド、（Ｎ２−［Ｎ−（Ｎ−ラウリル−し−アラ
ニル）−γ−Ｄ−グルタミル］−Ｎ’−（グリシル）−
Ｄ、Ｄ−Ｌ、Ｌ−２，６−ジアミツピメル酸、し−チロ
シン及びそのアルキル誘導体、マルトーステトラパルミ
テート、プルロニックポリオール、し−チロシンアゾベ
ンゼン−ｐ−アルソネート、ソルビタンモノオレエート
（Ｓｐａｎ８０）ｍトレハロース誘導体（例えばトレハ
ロースジミコレート）ｍレチノイル酸及びその誘導体、
Ｄ、Ｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）ｍリビド＾
及びその須似体、及び、グリコシド例えばサポニン（例
えばＱｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎａｒｉａ　Ｍｏ１ｉｎ
ａの靭皮のＱｕｉｌ＾）である。

これらの免疫原及びその調製方法は欧州特許出願筒８６
，２００，２０３．７号より公知である。リビド＾及び
その類似体はオランダ特許出願第８，５００，４９９号
よりアジュバントとして公知である。アジュバントとし
てサポニンを使用し、抗原決定基に結合したサポニンに
よるミセル形成はオランダ特許出願第８，３０３，６４
６号より公知である。

本発明の免疫原は旧Ｂ疾患に対するワクチンを調製する
ために使用され得る。免疫原性を更に向上させるために
アジュバントを使用するのが有利である。かかるアジュ
バントの使用及びがかるアシュバント自体は公知である
。アジュバントが免疫原に添加されてもよい、またアジ
ュバントを免疫原と結合させてもよい、このような免疫
原性の向上方法も公知である。従って、本発明の免疫原
は、オリゴ糖と担体との結合及びオリゴ糖相互間の結合
、並びに、アジュバントが加入する上記２種類の結合を
含む。

本発明のワクチンは少なくとも本発明の免疫原を含有す
る。免疫原は通常、常用のワクチン用添加物、例えばア
ジュバント、安定剤、バッファ及びその他の免疫原が添
加された水溶液、乳濁液又は懸濁液の形態のワクチン中
に存在する。添加可能な適当なアジュバントは、アルミ
ニウムの水酸化物、リン酸塩もしくは酸化物、又は鉱油
例えばＭａｒｃｏｌ　５２もしくは植物油と１種類以上
の乳化剤例えばＴｗｅｅｎ２０もしくは５ｐａｎ８０と
から成る組成物、又は前記のごとき両親媒性アジュバン
トの一種である。

適当な安定剤は、ソルビトール、ラクトース、マンニト
ール、澱粉、ショ糖、デキストラン及びグルコースのご
とき炭水化物、又はアルブミンもしくはカゼインのごと
きタンパク質である。

バッファとしては例えば、アルカリ金属リン酸塩、アル
カリ金属炭酸塩又はアルカリ土類金属炭酸塩バッファの
使用が可能である。

前記のごとくワクチンは別の免疫原をも含有し得る。そ
の場合には、−回の投与で複数の病原体に対する免疫を
獲得できるという利点をもつ所謂混合ワクチンが得られ
る。別の免疫原として例えば、公知のＤＰＴＰワクチン
に使用される免疫原の使用も可能である０本発明の免疫
原を使用するワクチンは公知の方法、例えば、免疫原を
水性環境に溶解、乳濁又は懸濁させることによって調製
できる。１挿間以上の常用の添加剤が前記水性環境に添
加されてもよく又は該環境に存在していてもよい。

かかるワクチンはＨＩＢ疾患に対する免疫獲得のために
使用され得るが同時に所謂「プライミング（ｐｒｉｍｉ
ｎｇ）」（身体が直接刺激されて特異的遊Ｍ抗体を形成
するのでなく、後日の感染又は再接種のときに強力な免
疫反応が生起するようにプレコンディショニングされる
）にも使用され得る。ワクチンは通常、筋肉内注射又は
皮下注射によって投与される。一般に、−回の注射で投
与される免疫原の量は０．１へ１００１１ｙ／投与の範
囲である。

本発明のワクチンは、Ｉ（ｒｅ疾患から個体を防御する
特性をもち、特に（２歳以下の）小児のワクチン接種に
極めて適している０本発明のオリゴ糖は純度が高いので
、かかるオリゴ糖を含有するワクチンの効力をワクチン
の各調製バッチ毎に毎回検査する必要がない、また、か
かるワクチンを使用すると、好ましくない刺激抗体の量
、中毒のごときその他の副作用の発生も少ない。

本発明のオリゴ糖は、必要な保護基を備えたリボース、
リボース−リビトール、リボース−リビトール−ホスフ
ェート、リビトール、リビトール−ホスフェート、リビ
トール−ホスフェート−リボース、ホスフェート、ホス
フェート−リボース及びホスフェート−リボース−リビ
トールユニットを含む化合物のグループから選択された
複数の化合物を複数の段階で互いに反応させ、最終的に
保護基を除去することによって調製される０本発明のオ
リゴ糖は最終的に、（Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール−
ホスフェート）鴫、（Ｄ−リビトール〜ホスフェートー
Ｄ−リボース）Ｍ又は（ホスフェート−〇−リボースー
Ｄ−リビトール）１１構造を含み簡が２．３，４．、、
．１９又は２０であり遊離ヒドロキシ基の水素原子が保
護基でＴＬ換されているオリゴ糖の保護基を、水素原子
で置換することによって調製される。必要な保護基を備
えており最終オリゴ糖を構成する大小の構造単位を複数
の反応によって互いに結合させることによってオリゴ糖
が調製され得ることは一般的に知られている。所望のオ
リゴ環の構造形成後に保護基が除去される０式１の基Ｘ
及びＹの１つが水素でなくこれらの基がオリゴ環の構造
形成に用いられた化合物中に生じたものでないとき、こ
れらの基もまた保護基の除去以前に組み込まれる必要が
ある。

本発明のオリゴ環は式２（明細書の末尾に記載）の化合
物を出発物質として調製され得る。この化合物を出発物
質として本発明のオリゴ環の多数の調製方法が可能であ
る。

第一の方法では、小ユニツ・トを連続的に組み込むこと
によってオリゴ環の構造形成を行なう、このためには、
式２の化合物を式３（明細書の末尾に記載）の化合物で
ホスホリル化し、式５（明細書の末尾に記載）の化合物
をリン基に結合し、上記の２つの段階を必要回数だけ反
復し、最後に弐６（明細書の末尾に記載）の化合物と反
応させて構造形成を終了し、その後に保護基を除去する
。別の方法では、式５の「ヒ合物と式３のｆヒ合物とを
ホスホリル化ヒし、得られた生成物をリン基によって式
２の化合物に結合し、この段階を必要回数反復し、最終
的に式６の化合物と反応させて構造形成を終了し、その
後に保護基を除去する。従って、本発明は特に、 （１）式２の化合物と弐３の化合物 ［式中、 Ｌ＝Ｏのときに＝ｏ、 Ｌ＝１のときに＝ｏ又は１、 Ｌ＝Ｏ又は１、 Ｒ１＝永久保護基、 直接又は間接に担体と結合を形成することができ永久保
護基を備えた反応性官能基を含む反応性基、又は、 非結合末端に疎水性鎖を備えるか又は永久保護基を備え
た反応性基１１．８−又はＩ（Ｓ−で末端基Ｒ，Ｏ−が
置換されている基、 Ｒ２＝永久保護基、 ＾＝二重結合によってリン原子に結合された酸素原子又
は存在しない（後者の場合リン原子は遊Ｍ電子対である
）ｍ Ｒ，＝反応性基、 Ｒ，＝反応性基、又は、 式４（明細書末尾に記載）（式中ｑ＝＝Ｑ又は１、Ｒ２
＝永久保護基、Ｒ，＝永久保護基）で示される基、又は
、 直接もしくは間接に担体との結合を形成でき永久保護基
を備えた反応性官能基を含む基、又は、 非結合末端に疎水性鎖をもつが又は永久保護基を備えた
反応性基Ｈ２Ｎ−又はＩｔｓ−で末端基−０Ｒ１が置換
された反応性基］ とを反応させること、 （２）Ｒ，が式４の基でないとき、段階（１）で得られ
た生成物を式５［Ｒ２は永久保護基、Ｒ６は一時的保護
基コの「ヒ合物と反応させ、得られた生成物のＲ６を水
素原子で置換することによって脱保護すること、（３）
段階（１）で得られた生成物の代わりに段階（２）で得
られた生成物を用いて段階（２）をｍ−２回反復するこ
と、及び、 （４）段階（２）又は段階（３）で得られた生成物を式
６［式中 Ｒ２＝永久保護基、 Ｒ３＝反応性基、 Ｒ）＝永久保護基、 直接又は間接に担体と結合を形成することができ永久保
π基を偏えた反応性官能基を含む基、又は、 非結合末端に疎水性銀を備えるか又は永久保護基を備え
た反応性基１１２Ｎ−又はｌｌ５−で外部Ｒ，Ｏ−が置
換されている基、 ｎ＝ｏ又は１、 ｎ＝ｏのときｑ＝Ｑ、 ｎ＝１のときｑ＝Ｑ又は１である］、 のｆヒ金物と反応させること、 （５）前記のごとく得られた生成物中に任意に存在する
永久保護基Ｒ５又はＲ２を必要に応じて、水素でないＸ
又はＹによって置換すること、及び、（６）段階（１）
ｍ（４）又は（５）で得られた生成物の永久保護基を水
素で置換することによって脱保護することを特徴とする
本発明のオリゴ糖の調製方法に係る。

本発明はまた、 （１）式２の化合物［式中、ｋ、　Ｌ、　Ｒ，及びＲ２
は前記と同義］を、式３の化合物［式中、Ｒ２、Ｒ３及
びＲ４は前記と同義であるが但しＲ１が式４の基でない
］と式５の化合物［式中、Ｒ２及びＲ８は前記と同義コ
との反応生成物と反応させ、このように得られた生成物
のＲ＠を水素原子でπ喚することによって脱保護するこ
と、 （２）段階（１）で得られた生成物を式３の化合物と式
５の化合物との反応生成物と反応させ、このように得ら
れた生成物のＲ５を水素原子で置換することによって脱
保護すること、及び、得られた生成物を用いてこの手順
をｍ−３回反復すること、（３）段階（１）又は（２）
で得られた生成物を式６の化合物［式中、ｎ、ｑ、Ｒ２
、Ｒ１及びＲ１は前記と同義］と反応させること、 （４）このように得られた生成物中に任意に存在する永
久保護基Ｒ＋又はＲ７を必要に応じて、水素でないＸ又
はＹによってｆｆＡすること、及び、（５）段階（３）
又は（４）で得られた化合物の永久保護基を水素原子で
置換することによって脱保護することを特徴とする本発
明のオリゴ糖の調製方法に係る。

Ｒ，は永久保護基でもよく、又は所望のオリゴ糠中のＸ
が水素でないときは、反応性官能基が永久保護基を備え
その結果として反応性官能基がオリゴ糖骨格の構造形成
のいかなる反応にも関与しないという条件付きでＸと同
じでもよい６式１のＸは好ましくは水素なので、Ｒ３は
好ましくは永久保護基である。

Ｒ２は永久保護基である。弐３のＲ１は反応性基であり
、Ｒ４は反応性基又は式４の基である。Ｙが好ましくは
水素でないので、式４のＲ２は好ましくは永久保護基以
外の基である。　ｋ、　Ｌ、ｎ及びｑが好ましくは０な
ので、Ｒ４は好ましくは反応性基であり従って式４の基
でない。

「永久保護基」なる用語は、本発明のオリゴ糖調製の全
段階で、保護されていないと反応性になる基を保護する
基を忘味する０合成が完全に終了してから永久保護基は
水素原子で置換されることによって除去される。かかる
ｇＡ護基は符及びヌクレオチド化学で公知である。

式２．３．４．５及び６の基Ｒ２は同じ基でも異なる基
でもよく、好ましくはベンゾイル、ベンジル、ベンジル
オキシメチル、２−クロロフェニル、ベンジルオキシカ
ルボニル、ｔｅｒｔ、ブチルジフェニルシリル、炭素原
子１０〜２０回を含むアルキル、テトラヒドロピラニル
、ｔｅｒｔ、ブチルジメチルシリル及びトリチルから成
るグループから選択される。

リビトールユニット中の８２は好ましくはベンジルであ
る。

Ｒ１又はＲ６が永久保護基であるか又は永久保護基を含
有するとき、これらの基は前記グループから適宜選択さ
れ得る０式３のＲ２も同様に定義できる。

式３のＲ２は好ましくは２−クロロフェニルである。

好ましくは式２のＲ３がリボースユニットの５゛位のＲ
２と共に基 （この場合ｋ及びＬはＯ）を形成するか、又はリボース
ユニットの５°位のＲ２及びＲ，がベンジルである。

リボースユニットの２゛位のＲ２は好ましくはべ〉ジル
、ベンジルオキシメチル、テトラヒド口ビラニル又はｔ
ｅｒｔ、ブチルジメチルシリルである。ベンジル及びベ
ンジルオキシメチルが最も好ましい。

また、式４．５．６のリボースユニットの５゛位のＲ２
がベンジル、ベンジルオキシメチル、テトラヒドロピラ
ニル、トリチル又はｔｅｒｔ、ブチルジフェニルシリル
であり、ベンジル及びｔｅｒｔ、ブチルジフェニルシリ
ルが最も好ましい。

式３の反応性基Ｒ１及びＲ４とが一緒に、式５及び式２
の化合物中のの遊離ＯＨ基間を結合させ得る基を形成し
てもよい０式３の化合物の適当な例を以下に示す。

式２の化合物と式３の化合物との間の反応は通常、常圧
及び温度０℃〜６０℃で２０分から３時間行なわれる。

このように得られた生成物を次に、Ｒ２が永久保護基で
Ｒ６が一時的保護基である式５の化合物と反応させる。

Ｒ２は式２に関する前記の定義と同義である。この場合
の一時的保護基なる用語は、オリゴ糖骨格の構造形成段
階の一部で保護機能を果たし構造形成が終了する前に選
択的に除去されるべき基即ち永久保護基を除去すること
なく除去され得る基を意味する。かかる基は糖及びヌク
レオチド化学において公知である。適当な基はアリル、
１−プロペニル、ジメトキシトリチル、クロロアセチル
、ブロモアセチル、レブリノイル及びアリルオキシカル
ボニルである。Ｒ６は最も好ましくはアリル及び１−プ
ロペニルである。

式５の化合物との反応は通常、常圧及び温度０℃〜６０
℃で２０分から３時間行なわれる。

式５の化合物との反応後、基Ｒ６は通常は常圧及び温度
０℃〜６０℃で１０〜６０分間で除去され水素原子で置
換される。

Ｒ１が反応性基の場合、必要に応じて次に弐３の化合物
と反応させる０式５の化合物との反応と水素原子による
Ｒ６の置換とをｍ−２回反復し得る。これらの段階の処
理条件は同様の前記段階と同じである。

得られた生成物を次に、式６の化合物と反応させる。Ｒ
２及びＲ１は式２及び式３のＲ２及びＲ３に関する前記
の定義と同義である。ｎ及びｑは好ましくは０である。

Ｒ７はＲ１と同義である。しかしながらＲ１とＲγとは
必ずしも同じでなくてもよい、所望のオリゴ糖のＹが好
ましくは水素でないので、反応性官能基が永久保護基を
備えるという条件付きでＲｔはＹと同じでない（Ｙ≠Ｉ
＋）のが好ましい、この目的に適う基は前記のごとき永
久呆護基であり、最も好ましい基はベンジルオキシカル
ボニル基である。

弐６の化合物との反応には以下の処理条件、即ち常圧、
温度１０〜６０℃及び時間１５分から６時間３用いる。

このようにしてオリゴ糖骨格の構造形成が完了する。Ｒ
１と８７とが永久保護基でありＸ又はＹがＨでない場合
に限りＲ，及びＲ７は必要に応じてＸ又はＹによって置
換され得る０本発明のオリゴ糖においてＸは好ましくは
水素である。この場合、Ｒ，は好ましくは永久保護基で
ある。Ｙが好ましくは水素でないので、永久保護基を備
えたＲ、は好ましくはＹ（Ｙ≠Ｈ）と同じである。この
場合、Ｘ又はＹが水素でない限りＲ１及びＲ２のいずれ
もがＸ又はＹで置換される必要はない、従ってこの段階
を省略するのが好ましい。

最後に、永久保護基が水素原子で置換される。

永久保護基の使用及び導入が糖及びヌクレオチド化学で
公知であるのと同様に脱保護も公知である。

しかしながら、ｋ、Ｌ、ｎ及びｑ＝＝Ｑである本発明の
オリゴ糖の調製は、式３の（ヒ合物と式５の化合物との
反応生成物に式２の化合物企反応させて行なうのが好ま
しい、得られた生成物の８６を除去することによって脱
Ｃａ　ｔ？し、式３のｆヒ合物と式５の化合物との反応
生成物との反応、及び、得られた生成物のＲ５除去によ
る脱保護を反復することによってオリゴ糖骨格を更に延
長し得る。オリゴ糖骨格の所要の長さを考慮しながら必
要な回数だけ処理を反復する０式６の化合物と反応させ
ることによってオリゴ糖骨格の構造形成と終了する。

この方法の利点は、弐３の化合物と式５の化合物との反
応生成物を調製する必要が一回で済むので処理段階数が
減少することである。第二の利点は、式３の化合物が式
２の化合物によりも式５の化合物に選択的に反応するこ
とである０両方の場合に、式３の（ヒ合物は式２又は５
で示される１つの１ヒ合鞠だけと結合し式３の化合物の
別の反応性基は不変（ｉｎｔａｃｔ）である。式２の化
合物と反応する場合、あまり好ましくない二量体の形成
が生じる。

式３の化音物と式５の１ヒ合鞠との間の反応は、温度１
０〜６０℃及び常圧で行なわれ一般に１０〜６０分で終
了する。このように形成された生成物は同じ＜１０〜６
０°Ｃ及び常圧で式２の化合物とも反応する。

この反応は一般に０．５〜３時間後に終了し、好ましく
は、Ｎ−メチルイミダゾールもしくはテトラゾールのご
とき触媒の存在下に行なわれるか、又は、１−（２，４
，６−ドリイソブロビルベンゼンー２″−スルホニル）
−３−二トロー１．２．４−　トリアゾールもしくは１
−（メシチレン−２′−スルホニル）−３−二ｌ・ロー
１．２．４−トリアゾールのごとき活性化剤の存在下に
任意に活性化した後に行なわれる。

適宜使用できる弐３の化合物は、原則として前記（ヒ合
物と同じである。

本発明のオリゴ糖はまた、弐６の（ヒ金物を出発物質と
して調製されてもよい。

ＨがＲ６でＷ換されＲ６がＨて置換された式５の化合物
を式６の］ヒき物と反応させる。次にＲ６を１１で置換
して脱保護し、得られた生成物を弐３及び式２の化合物
と順次反応させる。可能な別の方法では、ＨがＲ６で置
換されＲ６がＨで置換された式５の化合物と式３の化合
物との反応生成物に弐６の化合物を反応させ、得られた
化音物を式２の化合物と反応させる。この中間段階もｒ
ｍ−２回反復できる。

式３の化合物の代わりに別のリン化合物を使用して本発
明のオリゴ糖を調製することも可能である。これは前記
の方法及び後述する方法のいずれにも通用する。この場
合、ＰＣｌ、又はサリチルクロロホスフィンのごとき反
応性基をもつリン化合物を式２又は式５の（ヒ合物と反
応させ、得られた生成物を次に加水分解して対応するホ
スフェートに変換し、これ登塩化ピバロイルのごとき活
性剤で活性化してから式５又は式２の化合物と反応させ
る。

弐３の化合物と式２又は式５の１ヒ合物との反応後、こ
れにより形成された生成物を、（この場合一時的ｃＡ護
基である）永久１呆護基と残りのａ社反応性基との除去
を伴って加水分解して対応するホスフェートとし、これ
を活性剤で活性化してから式５又は式２の化合物と反応
させてもよい。

弐３中の八が存在せず従ってリン化き物が遊雛電子対を
もつか、又は、本発明のオリゴ糖の調製中に完全には酸
（ヒされないリン（ヒ合物が形成されるとき、対応する
オスフェー１〜を得るためには例えばｒｚ／ピリジン又
はｔｅｒｔ、ブチルペルオキシｌ？　３用いて酸「ヒを
生起する必要がある。

本発明のオリゴ糖の別の調製方法では、所謂ブロンク合
成を使用する。この場合、所望のオリゴ糖のかなり大き
いフラグメンｌ−を別々に調製しこれら３互いに結合さ
せる。更に別の方法では、かなり大きいフラグメントを
調製し、得られたフラグメントの１つの部分を別の部分
から異なる部位で脱保護し、両方の部分を互いに接きす
る。従って本発明はまた、特に、 （１）ｋ、Ｌ、Δ、Ｒ２、Ｒ２、Ｒｏ及びＲ６が前記と
同義でありＲ４が反応性基である式３及び式５の化合物
の反応生成物を式２の化合物と反応させ、このように得
られた生成物のＲ６を水素原子で置換することによって
脱保護すること、 （２）式２の化合物の代わりに段階（１）で得られた生
成物を用いて段階（１）を所望回数反復すること、（３
）ｋ＝０．Ｌ＝１及びＲ１が一時的保護基である式２の
１ヒ合物を出発物質として段階（１）及び必要ならば段
階（２）を反復して最終段階でＲ５の代わりにＲ１を水
素原子で置換すること、 （４）段階（１）又は（２）で得られた生成物と段階（
３）で得られた生成物とを互いに反応させ、このように
形成された生成物のＲ６を水素原子で置換すること、（
５）段階（４）で得られた生成物をＲ２、Ｒ５、Ｒ７、
ｎ及びｑが前記と同義の式６の化合物と反応させること
、 （６）このように得られた生成物中に必要に応じて任意
に存在する永久保護基Ｒ１又はＲ７を水素でないＸ又は
Ｙで１換すること、及び、 （７）段階（５）又は（６）で得られた化合物の永久保
護基を水素原子て置換することによって脱保護すること
を特徴とするオリゴ糖の調製方法にｆ系る。

この調製方法はまた、式２の化合物の代わりに段階（３
）の式６の化合物を使用し式３の化合物と式５の化合物
との反応生成物を利用することによって行なわれてもよ
い。

この調製方法はまた、式６の１ヒ合鞠を出発物質とし弐
６の化合物に関する前記の記載と同様に行なわれてもよ
い。

本発明はまた、 （１）＾、Ｒ２、Ｒ１及びＲ６が前記と同義でありＲ４
が反応性基であり、Ｋ＝Ｏ，Ｌ＝Ｏ及びＲ１が保護基で
ある式３及び式５の化合物の反応生成物を式２の化合物
と反応させ、このように得られた生成物のＲ３を水素原
子で置換することによって脱保護すること、（２）式２
の化合物の代わりに段階（１）で得られた生成物を用い
て段階（１）を所望回数反復すること、（３）段階（２
）で得られた生成物の一部を、Ｒａの代わりにＲ５を水
素原子で置換することによって脱保護すること、 （４）Ｒ，及びＲ６が置換された生成物を、該生成物の
１つが式３の化合物と反応した後に互いに反応させるこ
と、 （５）得られた生成物のＲ６を水素原子で置換すること
、 （６）段階（５）で得られた生成物をｎ、ｑ、Ｒ２、Ｒ
１及びＲ２が前記と同義の弐６の１ヒ合物と反応させる
こと、（７）このように得られた生成物中に必要に応じ
て任急に存在する永久保訛基Ｒ１又はＲ７を水素でない
Ｘ又はＹで置換すること、及び、 （８）段階（６）又は（７）で得られた化合物の永久保
護基を水素原子で置換することによって脱閑設すること
を特徴とするオリゴ糖の調製方法に係る。

この調製方法は逆の順序、即ち弐６の化合物から出発し
式２の化合物を得るための編入処理によって終了する順
序で行なわれてもよい。

これらのブロック合成のもう１つの変形例で、は２つの
ブロックを結きする前に、一方のブロックに対して、（
式６又は式２の化合物との反応による）末端基の編入を
行なう、このブロック合成はかなり大きいオリゴ糖を調
製するときに特に有利である。この方法によれば反応段
階数をかなり減少し得る。ブロックの相互結合を行なう
ための処理条件は別の調製方法に関する前記の条件と基
本的には変わらない、このような調製方法は全部又は一
部を固相で行なうのが適当である。

次に本発明を実施例に基づいて説明する。

火」Ｅ倒」一式２の　ム　の；８１ Ｄ−リボノラクトンを出発物質とし、１３種の中間生成
物を介して１−０−［２−ベンジルオキシメチル−３゜
５−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−
ジイル）−β−Ｄ−リボフラノジルコー２．３．４−）
ソー０−ベンジルーＤ−リビトール（スキーム１の化合
物１５）を調製した。

スキーム１の化合物２はスキーム１の化合物１を出発物
質としＣａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　ＣｈｅＩｍ、　３６（
１９５８）１７２０に記載の方法で調製した。

１０ｄの無水アセトニトリル中の４．５０のアリルクロ
ロホーメートを、０°Ｃの１０ｍ１の無水アセトニトリ
ル中の３．５ｘｌの無水ピリジンと４２の化合物２とに
攪拌しながら滴下した。０℃で１時間攪拌を維持した。

氷を加えて余剰クロロホーメートを破壊した０反応混合
物を１００１Ｎのエーテルで希釈し、５０ｍ／ｌの水で
３回洗浄した。有機層をＭｇ５Ｏ１で乾燥し、真空下に
濃縮した。残渣を１０１１のジクロロメタンに溶解し、
６ｇのシリカゲル６０を充填した小カラムで濾過した。

カラムを４０ｚｌのジクロロメタンで洗浄した。ＰＦＩ
ｔと洗浄液とを合わせて真空下に濃縮した。エーテル／
ジイソプロピルエーテルを用いて化合物３を晶出した。

２０Ｍ１のジオキサン中の５ｇの化合物３をヘリウム雰
囲気下に維持した。１５Ｂのテトラキス（トリフェニル
ホスフィン）パラジウムの添加後、溶液を１５分間還流
させ、化合物４との反応混合物念濃縮した。

８．６ｇの化合物４と３，５ｇの水素化ホウ素ナトリウ
ムと１５０ｚｌの無水テトラヒドロフランとを５５℃に
加熱し、３０ｚｌのメタノールを攪拌しながら４５分間
で添加した。更に５５℃で１時間攪拌した。

冷却後、反応混合物を真空下に濃縮した。残渣を無水メ
タノール（３ｘ５０ｉ１）とともに蒸発させ、１００ｉ
＋４のジクロロメタンに入れ、塩化アンモニウムの９０
％飽和水溶液１００ｚｌで洗浄した。水相をジクロロメ
タン（２ｘ　１００ｚｊりで抽出した０合わせた有機層
を乾燥しくＭｇ５Ｏ，）ｍ真空下に濃縮した。残渣をク
ロマトグラフィーにより精製した（ジクロロメタン／メ
タノール１００１０→９５１５で溶出）ｍ適当な画分は
化合物５を含有した。６．２．の化合物５を１００ｘｉ
の酢酸に溶解し、４０ｘ１の水を添加した。溶液を５０
℃で４時間攪拌した６反応混合物を真空下に濃縮した。

残渣を無水トルエン（３ｘ　２５Ｍ１）及び無水ピリジ
ン（３ｘ　２５ｚ１）と共に蒸発し、４０ｘｌのピリジ
ンに再溶解した。　７．５ｇのトリチルクロリドの添加
後、溶液を室温で１２時間攪拌した。　５ｔｊ！のメタ
ノール添加後反応混合物を真空下に濃縮した。

残渣をトルエン（３ｘ　２５ｚ１）とともに蒸発させ、
１５０ｍ１のジクロロメタンに入れ、１５０ｚ１の１Ｍ
炭酸水素ナトリウム溶液及び１５０ｚｊ！の水によって
洗浄した。有機層を乾燥しくＭ＃ＳＯ，）ｍ真空下に濃
縮した。

前記段階と同様にクロマトグラフィー精製すると化合物
６が得られた。　７．３ｇの化合物６を４０１１の無水
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、次に２１の水
素化ナトリウムを少しずつ添加した。攪拌した反応混合
物を０℃に冷却し、１０１１の無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド中の６．２ｘｌのベンジルプロミドを３０分
間で滴下した。更に０°Ｃで３０分間及び室温で１２時
間攪拌を維持した０次に１’Ｏｘｌのメタノールをゆっ
くりと添加し、反応混合物を真空下に濃縮した。残渣を
１５０ｚ／のエーテルに入れ、５０Ｍ１の水で３回洗浄
した。有機層を乾燥しくＭｙＳＯ＜）ｍ真空下に濃縮し
た。濃縮物をクロマトグラフィーイー精製処理しくヘキ
サン／ジクロロメタン２／　１　（４００１１Ｎ）及び
１／１（４００１ｊ））及びジクロロメタンを１＠次用
いて溶出）ｍ正しい画分を蒸発させると化合物７が得ら
れた。８．５ｇの化合物７を１３５ｚｌの酢酸と１５ｚ
ｌの水とに溶解し、８０℃で９０分間加熱した。溶液を
真空下に濃縮した。残渣をエーテルに入れ、水（５０ｉ
ｆ）及び１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（２Ｘ　５０ｚＮ
）で洗浄した。

有機層を乾燥しくＭｙＳＯ，）ｍ真空下に濃縮した。１
０ｊ１のジクロロメタン／ヘキサン１／１を残渣に添加
し、濾過した。Ｆ液をクロマトグラフィーで精製しく４
００ｚ１のクロロホルム／ヘキサン１／１．４００ｘｌ
のジクロロメタン及びジクロロメタン／メタノール９８
／２で溶出）ｍ化き物８を得た。　３．４ｇの市販の化
合物つと３．１３の化合物８とをジオキサン（３ｘ　５
０ｘｅ）と共に蒸発し、５０１１の無水１．２−ジクロ
ロエタンに溶解した。モレキュラーシーブ（４人、１０
．の活性ベレット）を添加し、混合物を窒素流下に室温
で９０分間撹拌した。３ｘ３０μβのトリメチルシリル
トリフロオロメタンスルホネートを１時間毎に添加した
。最終添加の１時間後に１００μ！のトリエチルアミン
を添加した。モレキュラーシーブを濾過によって除去し
、クロロホルム及びトルエンで洗浄した。

Ｆ液と洗浄液とを合わせて真空下に濃縮した。残渣をク
ロマトグラフィーで精製した（トルエン／アセトン１０
０１０→９８／２で溶出）ｍ正しい画分から化合物１０
を得た。　５ｇの化合物１０を２５Ｍ１の無水ジオキサ
ンに溶解し、２５１１の無水メタノールと１．２５ｚｌ
のＩＭのナトリウムメトキシドのメタノール液とを添加
した０反応混合物を室温で４時間撹拌した。０．２５＋
ｆのＩＭのナトリウムメトキシドのメタノール液を添加
し、更に１時間攪拌した０次に、１．２５ｇのＤｏｕ＋
ｅｘ５０　ＷＸ４（ｔｌ”形態）を添加し、３０分後に
濾過によって除去し、メタノール及びクロロホルムで洗
浄した。

Ｆ液と洗浄液とを合わせて真空下に濃縮した。クロマト
グラフィーで精製して（ジクロロメタン／メタノール１
００１０→９５１５）化合物１１を得た。　２．４ｇの
化合物１１を２０１１の無水ピリジン中で２回濃縮した
。

次に、２０ｚ／の無水ピリジンを添加した。得られた溶
液を０℃の窒素雰囲気下に攪拌し、１．４ｚｆの１．３
−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシ
ロキサンを１５分間で滴下した９次に室温で１時間撹拌
した０反応混合物を真空下に濃縮し、トルエン（３Ｘ　
２０ｚｉ’）とともに蒸発させた。残渣を７５ｚｌのジ
エチルエーテルに入れ１ＭのＫＨ２ＰＯ−（３Ｘ　５０
ｚ１）及びＩＭのＮａＨＣＯｚ（３Ｘ　５０ｄ）で洗浄
した。有機層を乾燥しくＭｇ５Ｏ４）ｍ真空下に濃縮し
た。クロマトグラフィー精製後（ジクロロメタン／アセ
トン１００１０→９８／２で溶出）ｍ化合物１２を得た
。１．４９ｇの化合物１２を５ｚ１のアセトニトリルか
ら２回濃縮した０次に４．５ｘ１のアセトニトリルを添
加した。溶液を０℃の窒素雰囲気下に攪拌し、１．３５
ｚｆの無水Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンと０．
５ｉ＋ｆのベンジルオキシメチルクロリドとを順次添加
した。２時間後、０．２５ｚｉのベンジルオキシメチル
クロリドを添加し、更に１時間攪拌した。５０℃の２１
１の無水メタノールを添加した。放冷後、反応混合物を
真空下に濃縮した。

残渣を４０１１のジエチルエーテルに入れ、ＩＭのＫｔ
ｌｚＰＯ−＜３　Ｘ　２０ｍ（）及びＩＭのＮａｔｌＣ
Ｏ＝（２０ｉ＋１）で洗浄した。有機層を乾燥しくＭＩ
ＩＳＯ４）ｍ真空下に濃縮した。

クロマトグラフィー精製後（ヘキサン／酢酸エチル１０
１０−９／１で溶出）ｍ化合物１３を得た。化合物１３
（１，３２Ｆりを４ｘ（ｌのテトラヒドロフランに溶解
した。

溶液を３回ガス抜きし、ヘリウム下に維持した。

１．５−シクロオクタジエンビス（メチルジフェニルホ
スフィン）−イリジウムへキサフルオロホススェード（
２〜３ｍｇ）を添加し、溶液を更に３回ガス抜きし、ヘ
リウム下に維持した。溶液にＨ２流を２時間通し、再度
ガス抜きしてヘリウム下に維持した。

４時間後反応混合物を真空下に濃縮した。このように得
られた化合物１４（１，２ｙ）をアセトン（１５ｚ１）
及び水（ｌｚｌ）に溶解した０次に３００ｚｇの）Ｉｇ
Ｏと３７５ｘｇのｈｃ１２とを添加し、懸濁液を室温で
３０分間攪拌した。？過によってｌ（ｇＯを除去し、洗
浄した。Ｆ液と洗浄液とを合わせて真空下に濃縮した。

残渣を７５１１のジエチルエーテルに入れ、４０ｘ１の
５０％飽和Ｋｌ溶液（３×）ｍ４０ｚＲの１％Ｎａ１ｌ
ＳＯ３溶液及び４０１１のＩＭｋＮａＨｃＯｓで洗浄し
た。有機層を乾燥しくＭｙＳｏ　４　）ｍ真空下に濃縮
した。

クロマトグラフィー精製後（ヘキサン／酢酸エチル９／
１→７／３で溶出）ｍ０．９７．の純粋化合物１５が得
られた。Ｒｆ＝０．３４（ヘ−１ｒｔン／酢酸エチル７
／３）ｍ［αコ２６＝＋３９°（ｃ　＝　１．０−ＣＨ
ＣＬ）。

Ｌ１匠１　５の　合　の調制 スキーム１の化合物１４を出発物質とし、スキーム２に
よって化合物１７を調製した。

化合物１４（４２５ｚｙ）を２ｘｌの無水ジオキサン（
２×）から濃縮し、ジオキサン中の２．２ｘｌの０．５
Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリドに溶解し
た。室温で３０分間静置後、溶媒を真空下に蒸発させ、
残渣に２５ｚｆのＩＮのＮａＨＣＯｚを添加し、混合物
を２５１１のジクロロメタン（３×）で抽出した０合わ
せた抽出物を乾燥しくＭｙＳＯ＋）ｍ真空下に濃縮した
。クロマトグラフィー精製後（ジクロロメタン／メタノ
ール１００１０→９８／２で溶出）ｍ正しい画分を真空
下に濃縮し、２００ｚｙの化合物１６を含有する生成物
２３９Ｉ１ｇを得な、この生成物を２．５ｚｉ’の無水
とリジンから２回濃縮し、２．５ｚｆのジクロロメタン
に溶解した。６５μｌのＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミンと９０μｐのｔｅｒｔ　。

ブチルジフェニルシリルクロリドとを添加し、反応混合
物を室温で１２時間攪拌した。６５μｌのＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミンと９０μｌのｔｅｒｔ、ブチル
ジフェニルシリルクロリドとの添加後、更に２４時間攪
拌し、０．５ｚＮのメタノールを添加し、真空下に濃縮
した。残渣をジエチルエーテル（２５ｄ’）に入れ、Ｉ
ＭのＫＨ２ＰＯ−（３Ｘ　１０ｄ）及びＩＭのＮａＨＣ
Ｏｓ　（１０ｚｆ）で洗浄した。有機層を乾燥しくＭｇ
５Ｏ，）ｍ真空下に濃縮した。クロマトグラフィー精製
（ヘキサン／酢酸エチル１０１０→７／３で溶出）によ
って２５４Ｂの化合物１７が得られた。Ｒｆ＝０．４１
（ヘキサン／酢酸エチル７／３）及び［αコ２◇＝−２
４．８°（ｃ　＝　１．０−ＣＨＣＬ）。

ひ 実」１舛」−工３の′ム　の；己胛１ ２−クロロフェニル−０，０−ビス（１−ベンゾＩ・リ
アゾリル）ホスフェート’ｒ　ｉＲ，Ｌ、　Ｐｒｅｓｓ
、０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、Ｋ。

（１９８４）１５３−１８３の方法で調製した。この化
合物を以後化合物１８と指称する。

夾１１」エエ１の　ム　の； スキーム３に従って本発明のオリゴ糖を調製した。

２２９ｚｙの化合物１５と２５４ｍｇの化合物１７とを
２．５ｘｌのピリジンから別々に濃縮した（３×、最終
容量１１１にする）０次に、１．４６ｚｌの０．２Ｍの
化合物１８のジオキサン溶液を化合！１１１！１１７に
添加し、溶液を室温で３０分間攪拌した。この溶液を無
水条件下に化合物１５と５０μｌのＮ−メチルイミダゾ
ールとの混合物に添加した。室温で２時間攪拌後、溶液
を５０１１のジエチルエーテルで希釈し、ＩＭのトリエ
チルアンモニウムビカーボネート（２Ｘ　２５ｚ１）ｍ
１ＭのＫＨｚＰＯ＊（２５ｚ１２）及びＩＭのトリエチ
ルアンモニウムビカーボネート（２５ｚ１）で洗浄した
。有機層を乾燥しくＭｇ５Ｏ４）ｍ真空下に濃縮した。

クロマトグラフィー精製（ヘキサン／酢酸エチル１０１
０→８／２で溶出）によって３６８Ｂの化合物１９（ｎ
−１）が得られた。これを化合物１５の調製に関する前
記の記載と同様にＨｙＯ／ＨｇＣＬで処理した。クロマ
トグラフィー分離（ヘキサン／酢酸エチル９／１→７／
３で溶比）によって化合物２０（ｎ＝１）が得られた。

ベンジルオキシカルボニルグリシンのペンタクロロフェ
ニルエステルと３−アミノ−１−プロパツールとをジオ
キサン中で反応（室温、１時間）させて調製された化合
物２１（０，２２ｍｏ＋ｏｆ）を化合物１８（１，１ｊ
ｊ！の０．２Ｍジオキサン溶液）でホスホリル化した。

溶液を２９６Ｂの化合物２０（ｎ＝１）と２０ｔｔ１の
Ｎ−メチルイミダゾールとの混合物に添加した。室温で
２時間攪拌後、０．３０ａ＋ｍｏ／の化合物２１を１．
５ｚ１の０．２Ｍの化合物１８のジオキサン溶液で（３
０分間）ホスホリル化して得られた溶液を、反応混合物
に再度添加した。

２時間後、前記の化合物１９（ｎ＝１）の場合と同様の
洗浄手順とクロマトグラフィー精製（クロロホルム／ア
セトン１００１０→９５１５で溶出）とを用いて化合物
２２（ｎ＝１）が得られた。

化合物２２（ｎ＝　１）（２８５ｖｇ＞を以下の手順で
脱保護した。

一テトラヒドロフラン中５ｙｎ−ピリジン−２−カルボ
キサルドキシム及び）７１　、Ｎ１　、Ｎ５Ｊｐ−テ１
〜ラメチル−グアニジンと室温で４８時間反応させて２
−クロロフェニル基を除去する。

一ジオキサン中でテトラ−ｎ−プチルアンモニウムフル
オリドと室温で１６時間反応させて１，１，３．３−テ
トライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル及びｔ
ｅｒｔ、ブチルジフェニルシリル基を除去する。

−１０％Ｐｄ／Ｃ（６００ｚｙ）とグリシンアミドとの
存在下にｔｅｒｔ　、ブタノール／水（２４時間）及び
水（２４時間）を順次用いて水素化分解してベンジルオ
キシカルボニル、ベンジルオキシメチル及びベンジル基
な除去する。

濾過によって触媒を除去し、ｒ液をクロロホルムで洗浄
しく３×）ｍクロロホルムを蒸発させ、凍結乾燥し、５
ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでゲル濾過しく０．０１
ＨのトリエチルアンモニウムビカーボネートｐＨ７で溶
出）ｍ糖陽性画分を凍結乾燥し、得られた物質な水中で
Ｄｏｗｅｘ　５０　ＷＸ４（Ｎａ”形態）カラムに通し
た。

凍結乾燥後、５ｌｚｇの固体化合物２３（ｎ＝２）が得
られた。

コ’Ｐ　ＮＭＲ：δ１．５４及び０．７４．’ＨＮＨＲ
（標準ＨＤＯ１４，６５ｐｐｍ）：δ４．９０（ｓ、１
８）；４．８６（ｓ、ＩＨ）：４．５−４．４（ｍ、８
　１ｉ−ｎｅｓ、ＬＨ）　；３．２１（ｔ、−ＮＨ−Ｃ
１ｌｚ−ＣＨｚ−、スペーサ）；１．７１（ｔ。

−ＣＨｌ−ＣＨｚ−ＣＨｚ、スペーサ）。

１３ＣＮＭＲ（外部標準テトラメチルアンモニウムクロ
リドδ５６．２）　：δ１６７．８（ｓ）；１０７．７
（ｓ、Ｃ−Ｉ　Ｒｉｂｒ）；１０７．５（ｓ、Ｃ−Ｉ　
Ｒｉｂｆ）；８３．５（ｓ、Ｃｔｌ）；８２．８（ｄ、
ＣＩ、Ｊ（ｐ５．８Ｈｚ）；７５．２（ｓ、ＣＩ）；７
５．１（ｄ、ＣＩ、ＪｃＰ３．４Ｈｚ）；７４．６（ｂ
ｒ　ｓ、ＣＩ（。

Ｊ（ｐｕｎｒｅｓｏ　Ｉ　ｗｅｄ）　；７２．３　（ｓ
　、２ｘＣＨ）　；７１．８　（ｄ　、２ＸＣＨ、ＪＣ
ｐ８．８Ｈｚ）　；７１．４（ｓ　、ＣＩ）　；７１．
０　（ｓ　、２ｘＣＨ）　；６９．５　（ｓ　、　ＣＨ
２）　；６９．３（ｓ　、ＣＨｚ）　；６７．５（ｄ　
、Ｃ１２，Ｊ（ｐ４．４Ｈｚ）　；６７．３　（ｄ　、
　ＣＨ’ｉ　、　Ｊｃｐ４．４Ｈｚ）　：６４．４（ｄ
　、ＣＨ２，Ｊｃｐ５．９Ｈｚ）　：６３　、４（ｓ　
、Ｃ１１２）　：６３．２（ｓ　。

ＣＬ）；４１．３（ｓ、ＣＬ　Ｇｌｙ）：３７．２（ｓ
、ＣＨｚ）；３０．０（ｄ、ＣＨ２゜Ｊ（ｐ７．３Ｈｚ
＞。

ＦＡＢ　ＭＳ（高速原子衝撃質量スペクトロメトリー）
によれば、高質量領域の最多シグナルがＩａ／ｚ　８２
３［化合物２３、ｎ＝２、−Ｎａミコーあった。

及１１１　　ム　２３ｎ＝３）の；　１０．５６ｎｎｏ
ｌの化合物１７と３ｚｌの０．２Ｍの化合物１８のジオ
キサン／ピリジン溶液とを３０分間ホスホリル化して得
られた溶液に化合物２０（ｎ＝　１）（０，４６ｍｍｏ
ｆｆｉ）を添加した。３時間後、０．３６ｍｍｏｅの化
合物１９（ｎ＝２）が播られた。前記と同様の手順で０
．３０ｍｍｏＺの化合物２０（Ｎ＝２）を調製し、０．
１５ｗ＋請ｏ／の化合物２０（ｎ＝２）を出発物質とし
て４７８■の化合物２２（ｎ＝２）が得られな、この化
合物４５μｌｌｌＯＲの脱保護によって化合物２３（ｎ
＝３）が得られた。収量２２Ｈ０”Ｐ　ＮＨＲ：δ１．
６６及び０．８５（２つのオーバーラツプシグナル）　
、Ｄ、０中の’ＨＮＭＲ（ｒｅ「、ＨＤＯ，δ４．６５
）　：４．９２（ｓ、２Ｈ）　；４．８８（ｓ、ＩＩＩ
）　、４．５５−４．４２（輪、２１１）　；３．２５
（ｔ、２１．スペーサーＮＨ−ＣＩ！。

−ＣＨｚ−）：１．７４（ｔ、２Ｈ，スペーサーＣＨ２
−惺２−ＣＩ＋２−）；［αコ２０＝−３０．１°　（
ｃ＝１．０、　Ｈ，０）。

寒１」１［免ヌｍ 化合物２３（ｎ＝２）及び化合物２３（ｎ＝３）を破傷
風トキソイド（ＴＴ）及びインフルエンザ菌す型の外層
膜タンパク質（ＭＰ）に結合して免疫原を調製した。

まず、末端アミノ基をＮ−スクシニミジルＳ−アセチル
メルカプトアセテートと反応させることによってオリゴ
Ｆ２３（ｎ＝２．３＞を変性して化合物２４（ｎ＝２又
は３）を生成した。リシンのε−ＮＨ，基とトスクシニ
ミジルー２−ピリジルジチオプロピオネート（Ｓｒ’Ｄ
Ｐ）とを反応させて２−ピリジルジチオ（ＦＤＰ）基を
タンパク質に導入した。化合物２４と２５とをバッファ
（ｐＨ６，１）に添加した。ヒドロキシルアミンを添加
してオリゴ糖成分のＳ−アセチル基を開裂した。

その結果、遊離−５ｔｌ基が生成された０次にチオール
２６がタンパク質のＦＤＰ基と反応し、化合物２７が形
成された。オリゴ糖の取り込みの程度は、遊離した２−
チオピリドンの量のＵｖ測定値の差（Δε３４３＝８，
０００８−１）によって測定した。

社１− 破傷風トキソイド溶液（１０％ｇ／ｌｌ２）及びインフ
ルエンザ菌外層膜タンパク質溶液（０，１４ＭのＮａＣ
１＋０．１％ＺｗｉＬｔｅｒｇｅｎｔ３４４中に２．５
％ｇ／ｚ１）及びトスクシニミジルＳ−アセチルメルカ
プトアセテートは＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２（
１９８３）６８−７３により調製されたもの、　５ＰＤ
ＰはＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
及びＺｗｉｔ−ｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４（Ｎ−テトラ
デシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロ
パンスルホネート）はＣａｌｂｉｏ−ｃｈｅｍ、から入
手、Ｎ−エチルモルフォリン及びジメチルアセトアミド
はフルオロジニトロベンゼンから蒸留した。

バッファ＾：２ＭのＮ−エチルモルフォリン／ＨＣｊ！
　ｐＨ８゜５バッファＢ：０．０ＩＭのトリエチルアン
モニウムビカーボネートｐＨ７，０ バッファＣ：０．ＩＭのナトリウムホスフェート＋　０
．００５ＨのＥＤＴ＾（エチレンジアミンテトラ酢酸二
ナトリウム２水和物）ｐＨ６，１バッファＤ：０．ＩＭ
のナトリウムホスフェートｐｌ＋７．８ＰＯ−１０カラ
ム：Ｐｈａｒ＋＊ａｃｉａのプレパック５ｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５使い捨てカラム（容積９　、　Ｌｘｌ、高さ
５ｃｍ） Ｇ−２５カラム：１００Ｘ　１．Ｏｃ＋＊　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（超微４Ｉ）。

化遣」ｌ工久団ｌ− 化合物２３（ｎ＝２）のトリエチルアンモニウム形態１
９．８ｚｙ（２１，４１１ｍｏｉ’）を０．２１ｚ１の
バッファ＾に溶解し、０．８５ｚ１のジメチルアセトア
ミド中の２５ｚｙのＮ−スクシニミジルＳ−アセチルメ
ルカプトアセテートを添加した。均質な反応混合物を室
温で１暗闇維持した０次に酢酸（１００μｍ）を添加し
て酸性化した。５１１のア七トンを添加して粘質を沈殿
させた。シロップ状沈殿物を遠心し、少量のバッファＢ
に溶解し、このバッファを溶出剤として使用しＧ−２５
カラムで精製した。Ｎ含有画分を合わせて凍結乾燥した
。

得られた生成物を更に水から２回凍結乾燥し、０．５０
１１のバッファＣに溶解した。生成物は１１．５μＩＩ
ｏｌの化合物２４（ｎ＝２）を含有していた。

ｌｉｍｙの化合物２３（ｎ＝３）を同様にして化合物２
４（ｎ＝３）に転化した。生成物は４．２μｍｏｌの化
合物２４（ｎ＝３）を含有していた。

化１ＪＩＢλ皿１− ＰＤ−１０カラムを２５ｘｌのバッファＤで平衡させた
。

次に、１．５０ｚｆｆｉ（１５１９、約１００１００ｎ
、分子量約１５０．０００）のＴＴ浴溶液導入し、バッ
ファＤで溶出した。このように得られたバッファＤ中の
ＴＴ浴溶液溶出量２．５−６、Ｏ１ｉ’）に０．４５ｚ
１のエタノール中の４．５％ｇの５ＰＤＰを添加した。

室温で１時間反応させ、反応混合物をＧ−２５カラムに
導入しバッファＣで、溶出した。タンパク質含有画分を
合わせて、バッファＣで２０ｚＮに希釈した（タンパク
質濃度約５ｎｍｏ１７ｚ１）　、このバッファＣには少
量のナトラムアジドを溶解しておく。

３．０Ｒ１のこの溶液をヘリウム下で１．０μｍｏｌの
ジチオトレイトールで処理した。室温で２４時間靜静置
、ΔＥコ４３は＝　１．６４８（標準：非処理ＰＤＰ−
ＴＴ）であった。

Δε、＝ｓ、ｏｏｏなので、２−チオピリドンの含量は
２０６ｎｍｏｌ／ｘｌである。取り込みは４１ＰＤＰ／
ＴＴであった。

１５＋＋＋ｇのＴＴを１．０μ輸Ｏ４の５ＰＤＰで同様
にして処理した。　Ｇ−２５画分を１５ｊｆに希釈した
。取り込み：４．５ＰＤＰ／ＴＴ　。

同様にして、３．７’５ｚｙ（約９５ｎｍｏ１、分子量
約４０，０００）のＭＰを３．５ｚＮのバッファＤに２
回移した。タンパク質を夫々１４，４及び０．４Ｉｌ＋
ａｏ１の５ＰＤＰで処理した。

Ｃ−２５カラムでゲルｒ通抜、タンパク質両分を１５ｍ
１に希釈した（タンパク質濃度約５．．２５ｒ＋ｌｌ１
ｏ１／ｚ１）ｍＭＰが極めて疎水性なのでこの場合には
、０．１％のＺｕ＋１ｔ−ｔｅＢｅｎＬ　３−１４をバ
ッファＣ及びバッファＤに添加した。取り込み：約４．
９及び約１．３Ｐ’ＤＰ／ＭＰ。

仁１１旺Δ１礼 前記で得られた化合物２４（ｎ＝２）のバッファＣ中の
溶液４３μｍ（１，０μｍｏｌ）を３．Ｏｘ（Ｎｌｘｇ
ｈｌ＞の４．５ＰＤＰ／ＴＴと４．５ｚｌ（０，７５％
ｇ／ｘｉ＞の４１Ｐ［ＩＰ／ＴＴと４．５ｍ１Ｃ０，２
５ｘｇ／１１）の１．３ＦＤＰ／ＭＰと４．５ｘｌの４
．９ＰＤＰ／ＭＰ（バッファＣ中のＣ−２５画分、前記
参照）に添加した。溶液をヘリウムでガス抜きした０次
に１０μｌの０．２ＭのヒドロキシルアミンｐＨ６，１
５を添加した。室温で１晩反応させ、形成された２−チ
オピリドンの量を測定した。

予想量のチオピリドンはタンパク質４．５ＰＤＰ／ＴＴ
、１．３ＰＤＰ／ＨＰ及び４．９ＰＤＰ／ＭＰから成り
、対応する量の化合物２７が形成された。化合物２６の
平均２０個の分子が４１ＰＤＰ／ＴＴに結合していた。

追加量の化合物２４（ｎ＝２）を添加しても、糖取り込
みの程度は変わらなかった。短い反応時間後に１７分子
の二量体を含有していた類似の複合体（ｃｏｎ　ｊｕｇ
ａｔｅ）に、１μ＋ｌｌ０１のシスティンを添加した。

予想量のチオピリドンの総量が速やかに形成された。

化合物２４（ｎ＝３）を使用し同様の方法で化合物２７
の三量体−タンパク質複合体を調製した。

要約すれば、以下の複合体が形成された。

１．３及び４．９二型体及び三１体／ＨＰ４．５二量体
及び三量体／ＴＴ ２００二量／ＴＴ（２１個のＰＣＩＰ残基）１７７二量
／ＴＴ　（システィンによる後処理の結果としてＰＤＰ
残基無し） １３三盟体／ＴＴ（２８個のＰＤＰ残基）。

これらの複合体の抗原性を測定し天然のＨＩＢ多糖（Ｃ
ａ塩）ｍヒト多糖ワクチン及びマウス抗体を産生ずる類
似抗原（＝多Ｐ／ＭＰ）の抗原性と比較した。

被検物質を一定量の抗血清を用いる倍加希釈系列に混合
した。室温で１時間インキュベーション後、直接ＥＬＩ
Ｓ＾阻害試験で残留遊離抗体の抗体価を測定した。結果
を以下に示す。

（μｉ／口）％ １．３二重体／ＨＰ　　　　　　　　１０　　　４５１
．３玉量体／ＭＰ−１０８６ ４，９二型体／ＨＰ　　　　　　　　１０　　　４９４
．９三重体／ＨＰ　　　　　　　１０　　８１４．５二
型体／ＨＰ　　　　　　　１０　　２１４．５玉量体／
ＨＰ　　　　　　　　１０　　５６２〇６２〇二量Ｔ　
　　　　　　　１０　　１９１７９１７二量Ｔ　　　　
　　　　　１０　　　２０１３０１３三景Ｔ　　　　　
　　　　１０　　　５３天然多糖（Ｃａ塩’）　　　　
　　１０　　９１ヒト多糖ワクチン　　　　１０　　９
０頚似抗原（チラミン化多糖）１０　　１２この表から
明らかなごとく、二量体複合体は抗体に対するかなりの
結合を示すが、この結合は天然の多糖の結合よりも顕著
に少ない、天然多糖の抗体結合能力は三量体複合体とほ
ぼ等しい。

Ｘｌ」ＬＬ　’）９＋７（７）ｊｕ’ 三量体−多糖（化合物２３、ｎ＝３）をグルタルジアル
デヒドによって破傷風トキソイドに結合した。

即ち、〈モルベースで）１０〜１００倍過剰量の三！Ｅ
体と破傷風トキソイドとを混合し、リガンドに対して過
剰量（３×）のグルタルジアルデヒドを１時間毎に３回
添加した０反応混合物を室温で５時間静置し、（リガン
ドに対して）２０倍過剰量のグリシンを添加した。室温
で１時間維持後、Ｎａ’ＣＮＢＨ，を添加した。

室温で５時間維持後、反応混合物を透析した。２．４ｍ
ｍｏｌの三量体を出発物質として１２０μｍｏｌの複合
体が得られた。破傷風トキソイド当たり３つの三量体が
取り込まれた（３三景体／ＴＴ）　、三量体／ＴＴの重
旦比は０．１：３であった６ アジビン−ジヒドラジド（ＰＳ−ＭＰ）によって結合さ
せたインフルエンザ菌す型多糖とインフルエンザ菌す型
外層膜タンパク質との複合体をマウスに注射した。複合
体におけるタンパク質と多糖との重量比は１：１であっ
た。注射当たりの投与量は複合体５μｇに相当した。第
１回の注射の３週後及び５週後に注射を繰り返した。６
週後にＩｇＧ価を測定し１００に調整した。

別のマウスには３．１２μりの３三重体／ＴＴ複合体を
注射した。４週後にこの注射を繰り返し、６週後にＩｇ
Ｇ価を測定した。この値は１００に調整されたＰＳ−Ｍ
Ｐの力価に対して３６であった。

７．５μｇの多糖の注射によって得られたＩｇＧ価の１
７３が僅か０．２５μｇのオリゴ糖によって得られるこ
とから３三重体／ＴＴ複合体の強力な免疫原性が証明さ
れる。　１／３０の重量で１７３の効果が得られた。更
に、多糖の注射が２回繰り返されたのに比較して三量体
の注射は１回しか繰り返さない。

以下に本明細書中に引用した各式及び各反応スキームを
示す。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）（Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール−ホスフェート
   ）＿ｍ、〈Ｄ−リビトール−ホスフェート−Ｄ−リボー
   ス〉＿ｍまたは（ホスフェート−Ｄ−リボース−Ｄ−リ
   ビトール）＿ｍ［ただしｍは２、３、４、・・・・・・
   １９または２０である］の構造からなることを特徴とす
   るオリゴ糖。
2. （２）オリゴ糖が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｌ＝１であればＫ＝０または１であり、 Ｌ＝０であればＫ＝０であり、 Ｌ＝０または１であり、 ｍ＝２、３、・・・・・・１９または２０であり（ただ
   し、Ｋ、Ｌおよびｎ＝１であるかまたはＬ、ｎおよびｑ
   ＝１であればｍは１であることもできる）、ｎ＝０また
   は１であり、 ｎ＝１であればｑ＝０または１であり、 ｎ＝０であればｑ＝０であり、 Ｘ＝水素、または直接もしくは間接に担体との結合を形
   成することができる反応性の基、または非結合末端に疎
   水性の鎖を含有する基であるか、あるいは、末端基ＸＯ
   −が反応性のＨ＿２Ｎ−またはＨＳ−基によって置換さ
   れており、 Ｙ＝水素、または直接もしくは間接に担体との結合を形
   成することができる反応性の基、または非結合末端に疎
   水性の鎖を含有する基であるか、あるいは、末端基−Ｏ
   Ｙが反応性の−ＮＨ＿２または−ＳＨ基によって置換さ
   れている（ただし、Ｘ≠水素であればＹ＝水素であり、
   Ｙ≠水素であればＸ＝水素である）］を有するか、また
   はその塩の形態であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載のオリゴ糖。
3. （３）ｍ＝２、３、４、５または６であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項または第２項に記載のオリゴ
   糖。
4. （４）Ｘ＝水素であり、Ｙ≠水素であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のオ
   リゴ糖。
5. （５）Ｙ＝水素であり、Ｘ≠水素であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のオ
   リゴ糖。
6. （６）反応性の基が、次の反応性の官能基：−ＮＨ＿２
   、−ＳＨ、▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ ［ただし、Ｒ＝−ＯＨ、−Ｎ＿３、−Ｏ−アルキル（Ｃ
   ＿１＿−＿１＿２）、−ＯＣ＿６Ｆ＿５、−Ｈ、−Ｂｒ
   ）−Ｃｌまたは▲数式、化学式、表等があります▼であ
   る］のうちのひとつを含有する基であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のオ
   リゴ糖。
7. （７）ＸまたはＹが炭素原子を１２〜２４個含有するア
   ルキル基を非結合末端に有する基であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のオ
   リゴ糖。
8. （８）オリゴ糖が純粋であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のオリゴ糖。
9. （９）オリゴ糖が合成されたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載のオ
   リゴ糖。
10. （１０）特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記
    載のオリゴ糖を担体に結合されている状態で含有するか
    、または、特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに
    記載のオリゴ糖数分子を互いに結合されている状態で含
    有する免疫原。
11. （１１）担体がタンパク質であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１０項に記載の免疫原。
12. （１２）タンパク質がインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐ
    ｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の表面タンパク
    質であることを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記
    載の免疫原。
13. （１３）担体がミセル、ベシクルまたはリボソームであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の免
    疫原。
14. （１４）特許請求の範囲第１０項〜第１３項のいずれか
    に記載の免疫原を含有するワクチン。
15. （１５）（Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール−ホスフェー
    ト）＿ｍ、（Ｄ−リビトール−ホスフェート−Ｄ−リボ
    ース）＿ｍまたは（ホスフェート−Ｄ−リボース−Ｄ−
    リビトール）＿ｍ［ただしｍは２、３、４、・・・・・
    ・１９または２０であり、遊離のヒドロキシ基中の水素
    原子は保護基によって置換されている］の構造からなる
    オリゴ糖中の保護基を水素原子で置換することからなる
    、特許請求の範囲第１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
16. （１６）特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記
    載のオリゴ糖を担体に結合すること、または、特許請求
    の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の数分子を互い
    に結合することを特徴とする、特許請求の範囲第１０項
    に記載の免疫原の製造方法。
17. （１７）特許請求の範囲第１０項に記載の免疫原を公知
    の方法で使用することを特徴とする、特許請求の範囲第
    １４項に記載のワクチンの製造方法。