KR102549847B1

KR102549847B1 - 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항하는 백신으로서 안정한 가수분해-내성 합성 폴리리보실리비톨포스페이트 유도체

Info

Publication number: KR102549847B1
Application number: KR1020197005229A
Authority: KR
Inventors: 페터 하. 제에베르거; 클라니 레베브 페레이라
Original assignee: 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2023-06-29
Also published as: CN109843899A; BR112019001486A2; US20190153015A1; EP3491000A1; CA3030521A1; US11014952B2; KR20190034571A; SG11201811350QA; AU2017302136B2; JP2019527243A; BR112019001486B1; MX2019001167A; AU2017302136A1; JP6784841B2; IL264418A; CN109843899B; WO2018020046A1

Abstract

본 발명은 Hib 폴리리보실리비톨 포스페이트 (PRP) 유도체의 안정한 합성 사카라이드 및 이의 컨주게이트를 제공한다. 상기 사카라이드, 상기 컨주게이트 및 이의 약제학적 조성물은 가수분해-내성이고, 장기간 안정하며, 헤모필루스 인플루엔자와 연관된 질환, 더욱 특히, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환, 바람직하게는 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염으로부터 선택되는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

Description

헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항하는 백신으로서 안정한 가수분해-내성 합성 폴리리보실리비톨포스페이트 유도체

본 발명은 Hib 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP) 유도체의 안정한 합성 사카라이드 및 이의 컨주게이트(conjugate)를 제공한다. 상기 사카라이드, 상기 컨주게이트 및 이의 약제학적 조성물은 가수분해-내성이고, 장기간 안정하며, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 관련된 질환, 및 더욱 특히, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Hib)는 수막염, 폐렴, 후두덮개염을 포함한 다양한 질환, 및 특히, 연령 5세 미만의 어린이에서 호흡기관의 다른 질환의 원인인 전세계적으로 심각한 인간 건강 문제이다. 질환의 생존자 중 30%는 청력 문제로부터 정신 지체에 이르는 후유증을 보인다.

헤모필루스 인플루엔자의 정제된 피막 폴리사카라이드는 성인에서의 보호 면역을 유도할 수 있다. 그러나, 어린이에서의 면역 반응은 매우 불량하고, 2세 미만의 유아에서는 실질적으로 없다. Hib 박테리아로부터 분리된 피막 폴리사카라이드는 리보실리비톨포스페이트 반복 단위를 제시한다:

Hib 감염증의 예방을 위한 다양한 백신이 개발되었으며 담체 단백질에 컨주게이션된 상이한 길이의 합성 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP) 또는 합성 PRP의 혼합물로 이루어진다(WO 9210936 A1, EP 0276516 A2, EP 0320942 A2, WO 0116146 A1). 여러 백신들이 최근에 USA 및 다른 곳에서 소아 사용에 대해서 허가를 받았다.

Hib 올리고사카라이드의 합성은 박테리아로부터의 Hib PRP의 값비싸고 불편한 분리에 대한 유용한 대안인 것으로 보고되었다(IN 2013/DEL/02989, US 6,765,091, WO2016044164 A1 및 EP 0320942A). 문헌[Journal of Carbohydrate Chemistry 1992, 11, 265]에서는, Hib 올리고사카라이드의 고형상 합성이 기재되어 있다. 아세틸화된 및 메틸화된 Hib 디사카라이드가 문헌[Carbohydrate Research 1979, 73, 59]에서 질량 분광법에 의해서 조사되었다.

상기 언급된 바와 같이, 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b (Hib)에 의해서 유발된 질환을 방지하는데 있어서 성공을 보인 다양한 백신에서의 활성 성분이다.

Hib 백신의 장기간 안정성은 상기 백신의 면역원성을 유지시키기 위해서 요구되며, 이는 PRP 폴리머 내의 포스포디에스테르 결합의 가수분해 절단에 대한 잠재적 민감성을 고려할 때 Hib-컨주게이트 백신에 대한 과제일 수 있다. 일반적으로, 백신의 피막 폴리사카라이드의 대사는 백신의 면역원성을 감소시킨다. 애주번트(adjuvant)로서 사용되는 산화알루미늄이 PRP의 가수분해를 촉진하고, PRP의 해중합(depolymerization)이 Hib 백신의 불안정성 및 Hib 백신의 감소된 면역원성을 유발시키는 것으로 공지되어 있다[Vaccine 19, 1999, p1169-1178].

결과적으로 상업적으로 이용 가능한 허가된 Hib 백신은 2℃ 내지 8℃에서 저정되어야 하며, 일반적으로 이들 조건에서 단지 24 내지 36 개월 동안 안정하다. 게다가, 액체 Hib 백신 제형은 동결에 의해서 손상되기 쉬우며, 이는 액체 제형에 존재하는 알루미늄 염에 의해서 유발되는 듯하다. 동결 손상에 대한 민감성은 냉각되어야 하는 액체 Hib 백신의 저장 및 수송을 방해하는데, 그 이유는 얼음의 사용이 동결을 방지하기 위해서 회피되어야 하기 때문이다.

상업적으로 이용 가능한 백신에 함유된 박테리아 세포벽의 정제된 천연 폴리사카라이드 성분이 증가된 기관지 수축을 유도하는 b 수용체의 억제에 대해서 원인일 수 있다고 또한 보고되어 있다. 더욱이, Hib 백신은 3세 미만의 유아에서의 발작 증상의 위험을 증가시킨다고 공지되어 있다. 따라서, 소량의 투여량을 투여함으로써 향상된 면역원성 및 감소된 부작용을 갖는 새로운 Hib 백신이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 액체 제형에서 대사 안정하고, 가수분해-내성이며, 저장 안정성인 Hib 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP) 유도체의 합성 사카라이드 및 이의 컨주게이트를 제공하는 것이다. 상기 사카라이드, 상기 컨주게이트 및 이의 약제학적 조성물은 향상된 면역원성을 가지며, 그에 따라서, 헤모필루스 인플루엔자와 연관된 질환, 및 더욱 특히, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환의 예방 및/또는 치료에 실질적으로 유용할 것이다.

본 발명의 목적은 독립항의 교시내용에 의해서 해결된다. 본 발명의 추가의 유리한 특징, 양태 및 상세사항은 종속항, 상세한 설명, 도면 및 본 발명의 실시예로부터 입증된다.

본 발명의 목적은 화학식(I)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머(anomer), 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다:

(I)

상기 식에서,

A는

,

, 또는

이고,

B는

이고, C는

이고,

D는

이고, E는

이고,

F는

,

,

또는

이고,

T¹ 및 T²는 -H, -L-NH₂ 또는 -L-COOH를 나타내고; 여기에서, T¹이 -L-NH₂ 또는 -L-COOH이면, T²는 -H이고, T¹이 -H이면, T²는 -L-NH₂ 또는 -L-COOH이거나, T¹와 T² 중 하나는 -H를 나타내고, T¹와 T² 중 다른 하나는 -L-NH₂ 또는 -L-COOH를 나타내고;

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆은 서로 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -CH₃, -C₂H₅, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH(CH₃)₂, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂, -O-C₂H₄-O-CH₃, -O-CH₂-CF₃을 나타내고, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 하나는 -OH가 아니고; 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 50%는 -OH가 아니고; 더욱 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 두 개는 -OH가 아니고; 가장 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 의 모두가 -OH가 아니고;

n은 1, 2, 3, 또는 4로부터 선택된 정수이고;

n1, n2, n3 및 n4는 서로 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고; n1+n2+n3+n4 ≥1이고;

단, n1+n2+n3+n4 = 1이고, n=1이고, A가

이면,

F는

또는

이고;

단, n1+n2+n3+n4 = 1이고, n=1이고, F는

또는

이면,

A는

또는

이고;

L은 -L^a-, -L^a-L^e-, -L^a-L^b-L^e-, -L^a-L^b-L^d-L^c-L^e-, -L^a-L^d-L^e-로부터 선택되고,

여기에서, -L^a-는 -(CH₂)_a-, -(CF₂)_a-, -(CH₂-CH₂-O)_a-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_a-CH₂-, -(CR¹⁰R¹¹)_a-,

로부터 선택되고;

-L^b- 및 -L^c-는 서로 독립적으로 -O-, -S-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -S-S-, -NH-C(O)-O-, -NR⁹-, -NR¹⁸-, -SO₂-, -OP(O)(OH)-O-,

로부터 선택되고;

-L^d-는 -(CH₂)_d-, -(CF₂)_d-, -(CR¹²R¹³)_d-, -(CH₂-CH₂-O)_d-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_d-CH₂-,

를 나타내고;

-L^e-는 -(CH₂)_e1-, -(CF₂)_e1-, -C₂H₄-(O-CH₂-CH₂)_e2-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)_e2-, -(CH₂)_e1-O-(CH₂)_e2-, -(CH₂)_e1-S-(CH₂)_e2-, -(CR¹⁴R¹⁵)_e1-, -(CR¹⁴R¹⁵)_e1-O-(CR²¹R²²)_e2-, -(CR¹⁴R¹⁵)_e1-S-(CR²¹R²²)_e2-,

로부터 선택되고;

R⁹와 R¹⁸은 서로 독립적으로 -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, 및 -C(O)CH₃로부터 선택되고;

R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷, R¹⁹, R²⁰, R²¹ 및 R²²는 서로 독립적으로 -H, -F, -Cl, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₅H₉, -C₆H₁₃, -OCH₃, -OC₂H₅, -CH₂F, -CHF₂, -CF₃, -C(O)-NH₂, -SCH₃, -SC₂H₅, -NHC(O)CH₃, -N(CH₃)₂, 및 -N(C₂H₅)₂로부터 선택되고;

a, d, e1 및 e2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10로부터 선택된 정수이다.

화학식(I)에 의해서 청구된 가장 작은 사카라이드는 디사카라이드이어서, 단, n1+n2+n3+n4=1이고, n=1이고, A가

이면,

F는

또는

이고;

단, n1+n2+n3+n4=1이고, n=1이고, F는

또는

이면,

A는

또는

임을 단서로 하는 배제 부분이 "화학식(I)의 사카라이드가 적어도 디사카라이드"인 조건에 의해서 대체될 수 있게 한다.

대안적으로는, 상기 언급된 배제 부분은 다만 n1+n2+n3+n4=1이면 n≠1(n은 1과 상이함)이고, n=1이면, n1+n2+n3+n4≠1(n1+n2+n3+n4는 1과 상이함)인 조건에 의해서 대체될 수 있다.

따라서, 대안적으로는, 하기 화학식(I)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:

(I)

상기 식에서,

A는

,

, 또는

이고,

B는

이고, C는

이고,

D는

이고, E는

이고,

F는

,

,

또는

이고,

T¹과 T²는 -H, -L-NH₂ 또는 -L-COOH를 나타내고; 여기에서, T¹이 -L-NH₂ 또는 -L-COOH이면, T²는 -H이고, T¹이 -H이면, T²는 -L-NH₂ 또는 -L-COOH이거나, T¹과 T² 중 하나는 -H를 나타내고, T¹과 T² 중 다른 하나는 -L-NH₂ 또는 -L-COOH를 나타내고;

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆은 서로 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -CH₃, -C₂H₅, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH(CH₃)₂, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂, -O-C₂H₄-O-CH₃, -O-CH₂-CF₃이고, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 하나는 -OH가 아니고; 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 50%는 -OH가 아니고; 더욱 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 80%는 -OH가 아니고; 가장 바람직하게는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆의 모두가 -OH가 아니고;

n은 1, 2, 3, 또는 4로부터 선택된 정수이고;

n1, n2, n3 및 n4는 서로 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고; n1+n2+n3+n4 ≥2이고;

로부터 선택되고;

-L^b- 및 -L^c-는 서로 독립적으로 -O-, -S-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -S-S-, -NH-C(O)-O-, -NR⁹-, -NR¹⁸-, -SO₂-,

로부터 선택되고;

를 나타내고;

로부터 선택되고;

더욱 바람직하게는, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆은 서로 독립적으로 -H, -F, -CH₃, -C₂H₅, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH(CH₃)₂, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂, -O-C₂H₄-O-CH₃, -O-CH₂-CF₃, 및 더욱더 바람직하게는 -H, -F, -CH₃, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂를 나타낸다.

화학식(I)의 사카라이드는 적어도 디사카라이드인 반면에, 적어도 트리사카라이드가 바람직하고, 화학식(I)의 사카라이드가 적어도 테트라사카라이드인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사카라이드는 염기성 및/또는 산성 기를 함유하고, 이들은 유기 또는 무기 산 또는 염기와 염을 형성할 수 있다. 그러한 산부가염 형성에 적합한 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말론산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말산, 푸마르산, 석신산, 아스코르브산, 말레산, 설폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 플루콘산, 락트산, 타르타르산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아질산, 하이드록시에탄설폰산, 에틸렌설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프틸설폰산, 설파닐산, 캄포르설폰산, 차이나 애시드(china acid), 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐-벤젠설폰산, 피크릭산(picric acid), 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산(tartronic acid), (o, m, p)-톨루산, 나프틸아민 설폰산, 및 통상의 기술자에게는 공지된 다른 미네랄 또는 카르복실산이다. 염은 통상의 방식으로 유리 염기 형태를 충분한 양의 요망되는 산과 접촉시켜 염을 생성시킴으로써 제조된다.

적합한 무기 또는 유기 염기에 대한 예는, 예를 들어, NaOH, KOH, NH₄OH, 트리알킬아민, 트리에틸아민, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 라이신 또는 아르기닌 등이다. 염은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하는 통상적인 방법으로, 예를 들어, 상기 언급된 군으로부터 선택된 염기의 용액에 의한 화학식(I)의 사카라이드의 용액의 처리에 의해서 제조될 수 있다.

가장 바람직하게는, 화학식(I)의 사카라이드의 포스페이트 기는 소듐 또는 트리에틸암모늄 양이온의 염 또는 짝이온 형태(zwitterionic form)를 형성시킨다.

무기 양이온과의 염이 바람직하고, Li⁺, Na⁺, 및 K⁺와 같은 단일 양전하를 갖는 무기 양이온과의 염이 더욱 바람직하다. Na⁺ 염이 가장 바람직하다.

놀랍게도, 화학식(I)의 사카라이드는 염기성 수성 매질에서 뿐만 아니라 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드를 함유하는 현탁액, 예컨대, 일반적으로 사용되는 애주번트 Alhydrogel에서 안정하다는 것이 밝혀졌다. 천연 Hib PRP는 염기성 수성 매질 중에서 또는 알루미늄 염의 존재하에 하루 이내에 가수분해되는 반면에, 화학식(I)의 사카라이드 뿐만 아니라 이의 컨주게이트가 상승된 온도에서도 수 일에 걸쳐서 안정하다. 증가된 안정성은 헤모필루스 인플루엔자에 대항하는 백신에서의 이들의 사용에 특히 유리하다. 따라서, 화학식(I)의 사카라이드 뿐만 아니라 이의 컨주게이트는 헤모필루스 인플루엔자에 대항하는 저장 안정성 액체 백신에 특히 유용하며, 이는 주위 온도에서 저장될 수 있으며, 예를 들어, 수송 동안 발생할 수 있는 동결에 의해서 손상되기 쉽지 않다.

놀랍게도, 면역원성 담체에 컨주게이션된 화학식(I)의 사카라이드가 인간 및/또는 동물 숙주에서의 헤모필루스 인플루엔자 박테리아에 대항하는 방어 면역 반응을 제공할 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 추가적으로, 면역원성 담체에 컨주게이션된 화학식(I)의 사카라이드는 키네틱 및 IgG 생산과 관련하여 상응하는 상업적으로 이용 가능한 Hib PRP 컨주게이트 백신과 비견되는 토끼에서의 실질적인 IgM 및 IgG 반응을 유발시킬 수 있다. 면역원성 담체에 컨주게이션된 화학식(I)의 사카라이드에 의해서 유발된 항체는 천연 Hib PRP과 교차-반응하여, 헤모필루스 인플루엔자 박테리아에 결합하고 헤모필루스 인플루엔자 감염증에 대항하는 방어를 부여하는 이들 항체의 능력을 나타낸다.

화학식(II-1)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:

(II-1)

상기 식에서,

A는

이고; F는

이고;

B, C, D, E, L, n1, n2, n3 및 n4는 상기 정의된 의미를 가지며;

n은 1 또는 2이고;

X₂ - X₆은 -H, -F, 또는 -OCH₃이다.

또한, 화학식(II-2)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:

(II-2)

상기 식에서,

A는

이고; F는

이고;

B, C, D, E, L, n1, n2, n3 및 n4는 상기 정의된 의미를 가지며;

n은 1 또는 2이고;

X₁ - X₅는 -H, -F, 또는 -OCH₃이다.

또한, 화학식(II-3)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:

H-F-[-(E)_n4-(D)_n3-(C)_n2-(B)_n1-]_n-A-L-COOH (II-3)

상기 식에서,

A는

이고; F는

이며;

B, C, D, E, L, n1, n2, n3 및 n4는 상기 정의된 의미를 가지며;

n은 1 또는 2이고;

X₂ - X₆은 -H, -F, 또는 -OCH₃이다.

또한, 화학식(II-4)의 사카라이드, 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염이 바람직하다:

HOOC-L-F-[-(E)_n4-(D)_n3-(C)_n2-(B)_n1-]_n-A-H (II-4)

상기 식에서,

A는

이고; F는

이고;

B, C, D, E, L, n1, n2, n3 및 n4는 상기 정의된 의미를 가지며;

n은 1 또는 2이고;

X₁ - X₅는 -H, -F, 또는 -OCH₃이다.

추가로, 화학식(III-1)의 사카라이드가 바람직하다:

(III-1)

상기 식에서,

L은 상기 정의된 의미를 가지며;

m은 1 내지 9로부터 선택된 정수이고;

X_a는 -H, -F 또는 -OCH₃이다.

추가로, 화학식(III-2)의 사카라이드가 바람직하다:

(III-2)

상기 식에서,

L은 상기 정의된 의미를 가지며;

m은 1 내지 9로부터 선택된 정수이고;

X_b는 -H, -F 또는 -OCH₃이다.

화학식(IV-1)의 사카라이드가 더욱 바람직하다:

(IV-1)

상기 식에서,

m은 1 내지 9로부터 선택된 정수이고;

X_a는 -H, -F 또는 -OCH₃이다.

화학식(IV-2)의 사카라이드가 더욱 바람직하다:

(IV-2)

상기 식에서,

m은 1 내지 9로부터 선택된 정수이고;

X_b는 -H, -F 또는 -OCH₃이다.

하기 군으로부터 선택된 사카라이드가 가장 바람직하다:

합성 방법

1. 본 발명의 사카라이드의 단계별 합성법

적절한 보호기에 의해서 보호된 리보실리비톨 골격을 갖는 디사카라이드 반복 단위 A1^*-3 - A1^*-5, B1^*-1 - B1^*-6, C^*1-3, 리보오스 또는 리비톨 골격을 갖는 반쪽 단위 A1^*-1, A1^*-2, C1^*-1, C1^*-2, 및 링커 L을 포함하는 말단 단위 또는 T1^* - T3^*가 본 발명의 사카리이드의 다양한 합성 경로를 위해서 적용될 수 있다. A1^*-1 - A1^*-5, B1^*-1 - B1^*-6, C1^*-1 - C1^*-3 및 T1^* - T3^*는 하기 구조식을 갖는다.

상기 식에서,

X_i와 X_j는 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내며;

P¹, P², P³, P⁴ 및 P⁵는, -O-에 결합되는 때에, X_i 및/또는 X_j와 동일할 수 없는 보호기를 나타내며;

L은 상기 정의된 의미를 갖고;

M⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, H⁺ 또는 Et₃NH⁺를 나타낸다.

통상의 기술자는 본 발명의 화학식(I), (II-1), (II-2), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드 뿐만 아니라, 이의 면역원성 담체와의 컨주게이트의 합성에 사용되는 보호기 P¹ 내지 P⁵가, 산소 원자에 결합되는 때에, X_i 및/또는 X_j와 동일할 수 없다는 것을 예상할 것이다.

유용한 합성 경로 중 일부는 상기 언급된 빌딩 블록의 조합에 의해서 이용 가능하다.

본 발명의 구체예에서, 다음 빌딩 블록 A1^*-3, B1^*-1 및 T1^* 또는 T3^*는 본 발명의 사카라이드의 합성(도식 1)을 위해서 사용될 수 있다.

출발 빌딩 블록으로서, A1^*-3가 사용될 수 있다.

합성 방법 A는 하기 단계를 포함한다:

i) X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P² 및 P³는, -O-에 결합되는 때에, X_i과 동일하지 않는 보호기인 출발 빌딩 블록

A1^*-3을 제공하는 단계;

ii) A1^*-3으로부터 P³기를 제거하는 단계;

iii) 단계 ii) 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기를 도입하는 단계;

iv) X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³는, -O-에 결합되는 때에, X_i과 동일하지 않는 보호기인 빌딩 블록

B1^*-1을 단계 iii) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

v) 임의로, 단계 i)에서의 출발 빌딩 블록 A1^*-3 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 0 내지 20의 정수인 t 시간 동안 단계 i) - iv)를 반복하는 단계;

vi) 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P² 보호기를 제거하는 단계;

vii) 화합물 T1^*을 단계 vi) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

viii) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

상기 언급된 합성 방법 A에서, 화합물 T3^*가 또한 단계 vii)에서의 T1^* 대신 사용될 수 있다. 단계 viii)에서, P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

반쪽 반복 단위 A1^*-1이 상기 언급된 합성 방법 A에서 출발 빌딩 블록 A1^*-3 대신에 출발 빌딩 블록으로서 사용되는 때에, 단계 v) 후에, 하기 단계 vi') 및 vii')가 단계 vi) - viii) 대신에 수행될 수 있다:

vi') 단계 v) 후에 생성되는 화합물을 T2^*와 커플링시키는 단계;

vii') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

반쪽 반복 단위 C1^*-1이 상기 언급된 합성 방법 A에서 단계 v) 후의 종료 빌딩 블록으로서 사용될 수 있고, 이어서, 하기 단계 vi'') - xi'')가 단계 vi) - viii) 대신에 수행될 수 있다:

vi'') 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P³ 보호기를 제거하는 단계;

vii'') 단계 vi') 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기를 도입하는 단계;

viii'') 단계 vii'') 후에 생성되는 화합물을 P¹과 P⁵가 보호기가 보호기인

C1*-1과 커플링시키는 단계;

ix'') 단계 viii'') 후에 생성되는 화합물로부터 P² 보호기를 제거하는 단계;

x'') 화합물 T1^*을 단계 ix'') 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

xi'') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

합성 방법 A의 단계 iii) 및 vii'')에서, 포스포르아미다이트 기가 또한 단계 ii) 단계 vi'') 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기 대신에 도입될 수 있다. T1^*은 이어서 비스(디이소프로필아미노)벤질옥시포스핀 및 HO-L-N₃에 의해서 대체된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 하기 빌딩 블록 A1^*-4 또는 A1^*-5, 및 B1^*-1이 본 발명의 사카라이드의 합성(도식 2)에 사용될 수 있다.

출발 빌딩 블록으로서, A1^*-4 또는 A1^*-5가 사용될 수 있다.

합성 방법 B은 하기 단계를 포함한다:

i) L이 링커이고 상기 정의된 의미와 동일한 의미를 지니며, X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹및 P³는, -O-에 결합되는 때에, X_i과 동일하지 않는 보호기인 출발 빌딩 블록

A1^*-4 또는 L이 링커이고 상기 정의된 의미와 동일한 의미를 지니며, X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹및 P³는, -O-에 결합되는 때에, X_i과 동일하지 않는 보호기인 출발 빌딩 블록

A1^*-5를 제공하는 단계;

ii) A1^*-4 또는 A1^*-5로부터 P³ 기를 제거하는 단계;

iv) X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹및 P³은, -O-에 결합되는 때에, X_i와 동일하지 않는 보호기인 빌딩 블록

v) 임의로, 단계 i)에서의 출발 빌딩 블록 A1^*-4 또는 A1^*-5 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 0 내지 20의 정수인 t 시간 동안 단계 i) - iv)를 반복하는 단계;

vi) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vi)에서, P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

반쪽 반복 단위 C1^*-1이 상기 언급된 합성 방법 B에서 단계 v) 후의 종료 빌딩 블록으로서 사용될 수 있고, 이어서, 하기 단계 vi'') - xi'')가 단계 vi) 대신에 수행될 수 있다:

vii'') 단계 vi'') 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기를 도입하는 단계;

viii'') 단계 vii'') 후에 생성되는 화합물을 P¹과 P⁵가 보호기인

C1^*-1과 커플링시키는 단계;

ix'') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

합성 방법 B의 단계 iii) 및 vii'')에서, 포스포아미다이트 기가 단계 ii) 또는 단계 vi'') 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기 대신 도입될 수 있다. 이어서, 출발 빌딩 블록 A1^*-5이 A1^*-5' 또는 A1^*-5''에 의해서 대체된다.

도식 1. 합성 방법 A에 의한 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체의 합성

도식 2. 합성 방법 B에 의한 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체의 합성

본 발명의 구체예에서, 하기 빌딩 블록 A1^*-3, B1^*-1 및 T1^* 또는 T3^*이 본 발명의 사카라이드의 합성(도식 1)을 위해서 사용될 수 있다.

출발 빌딩 블록으로서, A1^*-3가 사용될 수 있다.

합성 방법 C는 하기 단계를 포함한다:

A1^*-3 을 제공하는 단계;

ii) A1^*-3으로부터 P³기를 제거하는 단계;

vi) 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P³보호기를 제거하는 단계;

vii) 화합물 T1^* 또는 T^*3을 단계 vi) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

viii) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 및 P² 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 viii)에서, P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

반쪽 반복 단위 A1^*-1는 상기 언급된 합성 방법 C에서 단계 i)에서의 A1^*-3 대신에 출발 빌딩 블록

A1^*-1로서 사용될 수 있고, 이어서, P⁴ 보호기를 제거하는 단계가 단계 viii)에 추가된다.

반쪽 반복 단위 C1^*-1이 상기 언급된 합성 방법 C에서 단계 v) 후의 종료 빌딩 블록으로서 사용될 수 있고, 이어서, 하기 단계 vi'') - xi'')가 단계 vi)-viii) 대신에 수행될 수 있다:

C1^*-1과 커플링시키는 단계;

ix'') 단계 viii'') 후에 생성되는 화합물로부터 P⁵ 보호기를 제거하는 단계;

x'') 화합물 T1^* 또는 T3^*를 단계 ix'') 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

xi'') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

합성 방법 C의 단계 iii) 및 vii'')에서, 포스포아미다이트 기가 또한 단계 ii) 또는 단계 vi'') 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기 대신 도입될 수 있다. 이어서, T1^*가 비스(디이소프로필아미노)벤질옥시포스핀 및 HO-L-N₃에 의해서 대체된다.

도식 3. 합성 방법 C에 의한 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체의 합성

본 발명의 또 다른 구체예에서, 하기 빌딩 블록 A1^*-3, B1^*-1, 및 C1^*-2 또는 C1^*-3이 본 발명이 사카라이드의 합성을 위해서 사용될 수 있다.

출발 빌딩 블록으로서, A1^*-3이 사용될 수 있다.

합성 방법 D는 하기 단계를 포함한다:

i) L이 링커이고 상기 정의된 의미와 동일한 의미를 지니며, X_i은 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P², 및 P³는, -O-에 결합되는 때에, X_i과 동일하지 않는 보호기인 출발 빌딩 블록

A1^*-3을 제공하는 단계;

ii) A1^*-3로부터 P³ 기를 제거하는 단계;

vii) P¹이 보호기인 빌딩 블록

또는 X_j가 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆를 나타내고; P¹이, -O-에 결합하는 때에, X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

을 단계 vi) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

단계 viii)에서, P¹ 및 P² 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

단계 iii)에서, 포스포아미다이트 기는 또한 단계 ii) 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기 대신 도입될 수 있다. 이어서, 출발 빌딩 블록 C1^*-3는 C1^*-3' 또는 C1^*-3''에 의해서 대체된다.

본 발명의 일 구체예에서, 두 개의 반복 단위로 이루어진 하기 빌딩 블록은 [2+2] 합성 방법에 의한 본 발명의 사카라이드의 합성에 유용하다:

합성 방법 E-1은 하기 단계를 포함한다(도식 4):

i) L이 링커이고 상기 정의된 이미와 동일한 의미를 갖고; X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이, -O-에 결합되는 때에, X_i와 X_j와 동일하지 않는 보호기를 나타내는

A2^*-2,

A2^*-3, 또는

A2^*-4로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이, -O-에 결합되는 때에, X_i와 X_j와 동일하지 않는 보호기인 빌딩 블록

B2^*-3을 A2^*-2, A2^*-3, 또는 A2^*-4로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

iii) 단계 ii) 후에 생성되는 화합물로부터 P³ 기를 제거하는 단계;

iv) 단계 iii) 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트를 도입하는 단계;

v) 임의로, 단계 i)에서의 출발 빌딩 블록 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 0 내지 20의 정수인 t 시간 동안 단계 i) - iv)를 반복하는 단계;

vi) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vi)에서, P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 E-1의 단계 v) 후에, 추가의 빌딩 블록 B2^*-4이 대안적으로 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링될 수 있다. 이러한 경우에, 합성 방법 E-1은 단계 vi) 대신에 하기 단계를 포함한다:

vi') X_j가 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P⁵가, -O-에 결합된 때에, X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-4를 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

vii') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 vi') 후에 생성되는 화합물로부터 P¹과 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

반응도식 4. 방법 E-1에 의한 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체의 합성

물론, B2^*-3 또는 B2^*-4가 출발 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 대안적인 합성 방법 E-2은 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인

B2^*-3, 또는 X_j가 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P⁵가, -O-에 결합된 때에, X_j와 동일하지 않은 보호기인

B2^*-4로부터 선택되는 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P²가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-1을 B2^*-3, 또는 B2^*-4로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

iii) 단계 ii) 후에 생성되는 화합물로부터 P² 보호기를 제거하는 단계;

iv) 임의로, 단계 i)에서 출발 빌딩 블록 대신에 단계 iii) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iii)을 반복하는 단계;

v) 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 L이 링커이고 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖고, X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이, -O-에 결합된 때에, X_i 및/또는 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

,

또는

로부터 선택된 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

vi) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹, P³ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vi)에서, P¹, P³ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

대안적인 합성 방법 E-3은 포스포르아미다이트가 포스포네이트 화학 대신 사용된다는 점에서 합성 방법 E-1과 다르다. 따라서, 합성 방법 E-3은 하기 단계를 포함한다:

i) L이 링커이고 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지며; X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이, -O-에 결합되는 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

,

또는

로부터 선택되는 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이, -O-에 결합되는 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-3''을 A2^*-2'', A2^*-3'', 또는 A2^*-4''로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

iv) 단계 iii) 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치에 포스포아미다이트 기를 도입하는 단계;

v) 임의로, 단계 i)에서 출발 빌딩 블록 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iv)를 반복하는 단계;

vi) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 보호기 P¹ 및 P³을 제거하고 아지도기를 아민기로 변화시키는 단계.

단계 vi)에서, 보호기 P¹ 및 P³을 제거하고 아지도기를 아민기로 변화시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 E-3의 단계 v) 후에, 추가의 빌딩 블록 B2^*-4''이 대안적으로 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링될 수 있다. 이러한 경우에, 합성 방법 E-3은 단계 vi) 대신에 하기 단계를 포함한다:

B2^*-4''를 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

합성 방법 F-1은 하기 단계를 포함한다(반응도식 5):

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P², 및 P⁴가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인

A2^*-1, 또는

B2^*-1로부터 선택되는 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-3을 A2^*-1 또는 B2^*-1로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

v) 임의로, 단계 i)에서 출발 빌딩 블록 대신에 단계 iii) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iv)을 반복하는 단계;

vi) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인

로부터 선택되는 빌딩 블록을 커플링시키는 단계;

vii) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 vi) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹, P², P³ 및 P⁴ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vii)에서, P¹, P², P³ 및 P⁴ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계는 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

물론, C2^*-1, C2^*-2, C2^*-3, 또는 C2^*-4가 출발 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 대안적인 합성 방법 F-2은 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인

로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P²가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-1을 C2^*-1, C2^*-2, C2^*-3, 또는 C2^*-4로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

v) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이 P² 및 P⁴가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

A2^*-1 또는

B2^*-1로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 커플링시키는 단계;

vi) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 v) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹, P², P³ 및 P⁴ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vi)에서, P¹, P², P³ 및 P⁴ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

반응도식 5. 방법 F-1에 의한 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체의 합성

추가로, 두 개의 반복 단위로 이루어진 하기 빌딩 블록이 [2+2] 합성 방법에 의한 본 발명의 사카라이드의 합성에 유용하다:

합성 방법 G-1은 하기 단계를 포함한다:

i) L이 링커이고 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지며; X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

B2^*-3'을 A2^*-2', A2^*-3', 또는 A2^*-4'로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

v) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 iv) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 v)에서, P¹ 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 G-1의 단계 iv) 후에, 추가의 빌딩 블록 B2^*-4'가 대안적으로 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링될 수 있다. 이러한 경우에, 합성 방법 G-1은 단계 vi) 대신에 하기 단계를 포함한다:

v') X_j가 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹과 P⁵가, -O-에 결합된 때에, X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

B2^*-4'를 단계 vi) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

vi') 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 v') 후에 생성되는 화합물로부터 P¹과 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

물론, B2^*-3'또는 B2^*-4'가 출발 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 대안적인 합성 방법 G-2은 하기 단계를 포함한다:

B2^*-3' 또는 X_j가 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P⁵가, -O-에 결합된 때에, X_j와 동일하지 않은 보호기인

B2^*-4'로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

B2^*-1'을 B2^*-3 또는 B2^*-4로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

iv) 단계 iii) 후에 생성되는 화합물의 리비톨의 C-5 위치에 하이드로겐 포스포네이트를 도입하는 단계;

v) 임의로, 단계 i)에서 출발 빌딩 블록 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iv)을 반복하는 단계;

vi) 단계 v) 후에 생성되는 화합물을 L이 링커이고 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖고, X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

,

또는

로부터 선택된 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

vii) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 단계 vi) 후에 생성되는 화합물로부터 P¹, P³ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vii)에서, P¹, P³ 및 P⁵ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 H-1은 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P² 및 P⁴가 보호기를 나타내는

로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

ii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이 보호기인

B2^*-3'를 A2^*-1' 또는 B2^*-1'로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

v) 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이 보호기인

로부터 선택된 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

물론, C2^*-1', C2^*-2', C2^*-3', 또는 C2^*-4'가 출발 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 대안적인 합성 방법 H-2는 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인

로부터 선택된 출발 빌딩 블록을 제공하는 단계;

을 C2^*-1', C2^*-2', C2^*-3', 또는 C2^*-4'로부터 선택된 출발 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

iv) 단계 iii) 후에 생성되는 화합물의 리비톨 C-5 위치에 하이드로겐 포스포네이트를 도입하는 단계;

vi) 단계 v) 후에 생성되는 화합물을 X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P² 및 P⁴가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는

로부터 선택된 빌딩 블록과 커플링시키는 단계;

단계 vii)에서, P¹, P², P³ 및 P⁴ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 동일한 반응 조건하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 J-1는 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P² 및 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는 출발 빌딩 블록

를 제공하는 단계;

ii) 출발 블록 B2^*-1''의 리보오스의 C-3 위치에 포스포아미다이트 기를 도입하는 단계;

iii) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹ 및 P³이, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기인 빌딩 블록

을 단계 ii) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

iv) 단계 iii) 후에 생성되는 화합물로부터 P³ 기를 제거하는 단계;

v) 임의로, 단계 iii)에서 빌딩 블록 B2^*-3'' 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iv)을 반복하는 단계;

vi) 화합물 HO-L-N₃을 단계 v) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

vii) 화학식(I)의 화합물을 얻기 위해서 P¹, P² 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계.

단계 vii)에서, P¹, P² 및 P³ 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계가 단계별로 수행될 수 있거나, 동일한 반응 조건 하에 동시에 수행될 수 있다.

합성 방법 J-2는 하기 단계를 포함한다:

i) X_i와 X_j가 서로 독립적으로 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 또는 X₆을 나타내고; P¹, P² 및 P³가, -O-에 결합된 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내는 출발 빌딩 블록

을 제공하는 단계;

ii) 출발 블록 B2^*-1'''의 리보오스의 C-3 위치에 포스포아미다이트 기를 도입하는 단계;

을 단계 ii) 후에 생성되는 화합물과 커플링시키는 단계;

v) 임의로, 단계 iii)에서 빌딩 블록 B2^*-3''' 대신에 단계 iv) 후에 생성되는 화합물을 사용함으로써 정수 0 내지 10의 t 시간 동안 단계 i) - iv)을 반복하는 단계;

추가로, 본 발명의 Hib 피막 올리고사카라이드 유도체는 중축합 방법 I에 의해서 합성될 수 있다. 하기 빌딩 블록이 중축합 방법 I에 적합하다:

상기 식에서, X_i, X_j, P₁, P₂, P₃, 및 L은 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.

두 가지의 작용기, 즉, 하이드로겐 포스포네이트 또는 포스포르아미다이트 및 하이드록시 기를 갖는 반복 단위가 중축합 반응에 적합하다. 중축합 반응을 켄칭(quenching)시키기 위해서, 하이드록실 기를 갖는 켄칭 빌딩 블록이 사용될 수 있다. 반복 단위로서, 디사카라이드 B1^*-5, B1^*-6 및 테트라사카라이드 B2^*-2, B2^*-3'가 중축합에 적합하다. 켄칭 빌딩 블록으로서, T2^*, A1^*-6, A1^*-7, A1^*-8, B1^*-1, B1^*-4, C1^*-1, C1^*-2, 및 C1^*-3이 사용될 수 있다.

B1^*-5 또는 B2^*-2가 반복 단위로서 사용되는 때에, T2^*, C1^*-1, C1^*-2, 및 C1^*-3이 켄칭 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. B1^*-6 또는 B2^*-2'가 반복 단위로서 사용되는 때에, T2^*, A1^*-6, A1^*-7 및 A1^*-8가 켄칭 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다.

중축합에 의한 합성 방법 I은 하기 단계를 포함한다:

i) 중축합 반응에 적합한 적어도 하나의 반복 단위를 제공하는 단계;

ii) 적어도 하나의 반복 단위의 중축합을 수행하는 단계;

iii) 적어도 하나의 반복 단위의 중축합 반응을 켄칭 빌딩 블록에 의해서 켄칭시키는 단계;

iv) 화학식(I)의 화합물 또는 화학식(I)의 화합물의 혼합물을 얻기 위해서 P 보호기를 제거하고 아지도기를 아민기로 변환시키는 단계;

여기에서, B1^*-5 또는 B2^*-2가 반복 단위로서 사용되는 때에, T2^*, C1^*-1, C1^*-2 또는 C1^*-3가 켄칭 빌딩 블록으로서 사용되고;

B1^*-6 또는 B2^*-2'가 반복 단위로서 사용되는 때에, T2^*, A1^*-6, A1^*-7 또는 A1^*-8가 켄칭 빌딩 블록으로서 사용된다.

대안적으로, 적어도 하나의 반복 단위 및 켄칭 빌딩 블록이 동시에 제공될 수 있으며, 적어도 하나의 반복 단위의 중축합 반응 및 중축합 반응의 켄칭이 원-포트 시스템(one-pot system)에서 자동으로 수행된다.

적어도 하나의 반복 단위의 합과 켄칭 빌딩 블록 사이의 몰 비율은 올리고사카라이드(들)의 길이 및 다양성에 중요한 역할을 한다.

적어도 하나의 반복 단위와 켄칭 빌딩은 20:1 내지 1:1, 바람직하게는 20:1 내지 3:1, 더욱 바람직하게는 15:1 내지 4:1, 가장 바람직하게는 10:1 내지 5:1의 반복 단위 및 켄칭 빌딩 블록 사이의 몰 비율의 범위로 제공된다.

따라서, 본 발명의 일 구체예에서는 화학식(I)의 사카라이드의 합성을 위한 중간체 화합물이 A1^*-2, A1^*-3, A1^*-4, A1^*-5, A1^*-5', A1^*-5'', A1^*-6, A1^*-7, A1^*-8, B1^*-1, B1^*-2, B1^*-3, B1^*-4, B1^*-5, B1^*-6, C1^*-2, C1^*-3, C1^*-3', C1^*-3'', A2^*-1, A2^*-2, A2^*-3, A2^*-4, B2^*-1, B2^*-2, B2^*-3, B2^*-4, C2^*-1, C2^*-2, C2^*-3, C2^*-4, A2^*-1', A2^*-2', A2^*-3', A2^*-4', A2^*-2'', A2^*-3'', A2^*-4'', B2^*-1', B2^*-1'', B2^*-1''', B2^*-2', B2^*-3', B2^*-3'', B2^*-3''', B2^*-4', C2^*-1',C2^*-2', C2^*-3' 및 C2^*-4'로 이루어진 군으로부터 선택된다:

상기 식에서, P¹, P², P³, P⁴, 및 P⁵는, -O-에 결합되는 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내고;

X_i와 X_j는 서로 독립적으로 -H, -OH, -F, -CH₃, -C₂H₅, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH(CH₃)₂, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂, -O-C₂H₄-O-CH₃, -O-CH₂-CF₃를 나타내고, 여기에서,

단지 하나의 기 X_i 또는 X_j가 존재하는 경우에, X_i 또는 X_j는 -OH일 수 없고,

기 X_i 및 X_j의 둘 모두가 존재하는 경우에, X_i 및 X_j는 동시에 -OH일 수 없고,

L은 상기 정의된 의미를 가지며;

M⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ^+,또는 HNEt₃ ⁺를 나타낸다.

대안적으로, 본 발명의 일 구체예에서, 화학식(I)의 사카라이드의 합성을 위한 중간체 화합물은 A1^*-4, A1^*-5, A1^*-6, A1^*-7, A1^*-8, B1^*-1, B1^*-2, B1^*-3, B1^*-4, B1^*-5, B1^*-6, C1^*-2, C1^*-3, A2^*-1, A2^*-2, A2^*-3, A2^*-4, B2^*-1, B2^*-2, B2^*-3, B2^*-4, C2^*-1, C2^*-2, C2^*-3, C2^*-4, A2^*-1', A2^*-2', A2^*-3', A2^*-4', B2^*-1', B2^*-2', B2^*-3', B2^*-4', B2^*-1''', B2^*-3''', C2^*-1',C2^*-2', C2^*-3' 및 C2^*-4'로 이루어진 군으로부터 선택된다:

상기 식에서, P¹, P², P³, P⁴, 및 P⁵는 보호기를 나타내고;

L은 상기 정의된 의미를 가지며;

M⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, 또는 HNEt₃ ⁺를 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "보호기"는 유기 합성에서, 바람직하게는 하이드록실 기를 위해서 일반적으로 사용되는 보호기를 나타낸다.

더욱 특히, P¹, P², P³, P⁴, P⁵ 및 P⁶은 바람직하게는 하이드록실 기에 적합한 보호기이며, 더욱 바람직하게는 적합한 탈보호 반응 시퀀스에 의해서 하나 하나씩 순착적으로 제거될 수 있는 하이드록실 기를 위한 상이한 적합한 보호기이다. 따라서, 하이드록실 기를 위한 보호기 P¹, P², P³, P⁴, P⁵ 및 P⁶은 아세틸, 벤질, 벤조일, p-메톡시벤질, p-메톡시페닐, 파라-브로모벤질, o-니트로페닐, p-니트로페닐, 알릴, 메틸, 이소프로필, 레불리닐, 디메톡시트리틸(DMTr), 트리틸, 2-나프틸메틸 (Nap), 피발로일, 트리이소프로필실릴, 3차-부틸디메틸실릴, 3차-부틸디페닐실릴, 3차-부틸메톡시페닐실릴, 트리에틸실릴, 트리메틸실릴, 2-트리메틸실릴에톡시메틸로 이루어진 또는 이들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

더욱 특히, 본 발명의 바람직한 구체예에서, P¹, P⁵ 및 P⁶은 벤질 또는 p-메톡시벤질일 수 있고, P²는 알릴, 디메톡시트리틸(DMTr), 2-나프틸메틸(Nap) 또는 트리틸일 수 있고, P³은 레불리닐(Lev) 또는 2-나프틸메틸(Nap)일 수 있고, P⁴는 메틸 또는 아세틸일 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, P¹은 벤질일 수 있고, P²는 2-나프틸-메틸일 수 있고, P³은 레불리닐일 수 있다.

트리클로로아세트산에 의한 처리에 의해서 P² 보호기로서의 DMTr 기를 제거하는 것은 리비톨의 C-5 위치에 일차 알코올을 유도하고, 이는 파트너 빌딩 블록의 리보오스의 C-3 위치에 하이드로겐 포스포네이트 또는 포스포르아미다이트와 커플링된다. 하이드라진 아세테이트에 의한 처리에 의한 P³보호기로서의 레불리닐 기의 절단은 리보오스의 C-3 위치에 이차 알코올을 유도하고, 이는 또한 파트너 빌딩 블록의 리비톨의 C-5 위치에 하이드로겐 포스포네이트 또는 포스포르아미다이트와 반응한다.

P¹ 보호기로서의 벤질기의 탈보호는 바람직하게는 Pd-촉매작용 수소첨가 반응에 의해서 수행된다. 동일한 반응 조건이 아지도기의 아민기로의 변환에 적용될 수 있다.

빌딩 블록 또는 P³ 또는 P² 보호기의 탈보호 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치 또는 리비톨의 C-5 위치에 하이드로겐 포스포네이트 기를 도입하기 위해서, 리보오스의 C-3 위치 또는 리비톨의 C-5 위치에서의 하이드록실 기는 바람직하게는 이미다졸의 존재하에 트리클로로포스핀 및 트리에틸아민과 반응된다.

빌딩 블록 또는 P³ 또는 P² 보호기의 탈보호 후에 생성되는 화합물의 리보오스의 C-3 위치 또는 리비톨의 C-5 위치에 포스포르아미다이트 기를 도입하기 위해서, 리보오스의 C-3 위치 또는 리비톨의 C-5 위치에서의 하이드록실 기는 바람직하게는 디이소프로필암모늄 테트라졸리드의 존재하에 비스(디이소프로필아미노)-벤질옥시포스핀과 반응된다.

피발로일 클로라이드가 한 쌍의 빌딩 블록을 커플링시키기 위한 커플링 또는 축합 시약으로서 사용된다. 상기 기재된 바와 같이, 커플링 반응의 경우에, 하나의 커플링 파트너는 하이드록실 기를 가지고 있으며, 다른 커플링 파트너는 하이드로겐 포스포네이트 기를 가지고 있다.

중축합 반응의 경우에, 빌딩 블록은 두 개의 작용기, 즉, 하이드록실 기와 하이드로겐 포스포네이트 기를 가지고 있다.

링커(linker)

따라서, 본 발명은 -O-L-NH₂ 기의 질소 원자를 통해서 면역원성 담체와의 컨주게이션(컨주게이션)에 적합한 -O-L-NH₂ 기를 함유하는 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 -O-L-COOH 기의 카르복실산을 통해서 면역원성 담체와의 컨주게이션에 적합한 -O-L-COOH 기를 함유하는 화학식 중 어느 화학식의 사카라이드에 관한 것이다. 링커 L은 상기 정의된 바와 같은 어떠한 비-면역원성 부분일 수 있다. 따라서, 링커 L은, 비록, 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드뿐만 아니라 화학식(I), (II-1), (II-2), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드의 면역원성 담체와의 어떠한 컨주게이트의 일부이지만, 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드뿐만 아니라 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드의 면역원성 담체와의 어떠한 컨주게이트의 면역원성 특성에 영향을 주지 않는다.

화학식 HO-L-NH₂ 또는 HO-L-COOH의 이작용성 링커가 본 발명의 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1) 및 (III-2) 중 어느 화학식의 사카라이드 뿐만 아니라 면역원성 담체와의 이들의 컨주게이트에 사용될 수 있다. 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), 및 (III-2) 중 어느 화학식의 사카라이드인 본 발명의 일 구체예에서, 링커 -L-는 -L^a-, -L^a-L^e-, -L^a-L^b-L^e-, -L^a-L^d-L^e-로부터 선택될 수 있고; 여기에서,

-L^a-는 -(CH₂)_o-, -(CH₂-CH₂-O)_o-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-로부터 선택되고;

-L^b-는 -O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-를 나타내고;

-L^d-는 -(CH₂)_q-, -(CF₂)_q-, -(CH₂-CH₂-O)_q-C₂H₄-, 및 -(CH₂-CH₂-O)_q-CH₂-로부터 선택되고;

-L^e-는 -(CH₂)_p1-, -(CF₂)_p1-, -C₂H₄-(O-CH₂-CH₂)_p1-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)_p1- 및 -(CH₂)_p1-O-(CH₂)_p2-로부터 선택되고;

o, q, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이다.

따라서, 본 발명은 또한 화학식(I)의 사카라이드 및 상기 언급된 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체의 혼합물, 아노머, 수화물, 용매화물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:

(I)

상기 식에서,

A는

,

, 또는

이고,

B는

이고, C는

이고,

D는

이고, E는

이고,

F는

,

,

또는

이고,

T¹ 및 T²는 -H, -L-NH₂를 나타내고; 여기에서, T¹이 -L-NH₂이면, T²는 -H이고, T¹이 -H이면, T²는 -L-NH₂ 또는 -L-COOH이고;

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆은 서로 독립적으로 -H, -OH, -F, -CH₃, -C₂H₅, -CN, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH(CH₃)₂, -OCH₂F, -OCF₃, -OCO-N(CH₃)₂, -O-C₂H₄-O-CH₃, -O-CH₂-CF₃이고, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆ 중 적어도 두 개는 -OH가 아니고;

n은 1, 2, 3, 또는 4로부터 선택된 정수이고;

n1, n2, n3 및 n4는 서로 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;

n1+n2+n3+n4 ≥1이고;

단, n1+n2+n3+n4 = 1이고, n=1이고, A가

이면,

F는

또는

이고;

단, n1+n2+n3+n4 = 1이고, n=1이고, F는

또는

이면,

A는

또는

이고;

L은 링커이고, L은 -L^a-, -L^a-L^e-, -L^a-L^b-L^e-, -L^a-L^d-L^e-로부터 선택되고,

여기에서, -L^a-는 -(CH₂)_o-, -(CH₂-CH₂-O)_o-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-로부터 선택되고;

-L^b-는 -O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-를 나타내고;

본 발명의 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), 및 (III-2) 중 어느 화학식의 사카라이드가 -L^a-L^e-인 링커 -L-을 갖고; 여기에서, -L^a-는 -(CH₂)_o-, -(CH₂-CH₂-O)_o-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-로부터 선택되고; -L^e-는 -C₂H₄-(O-CH₂-CH₂)_p1-, -CH₂-(O-CH₂-CH₂)_p1-, -(CH₂)_p1- 및 -(CH₂)_p1-O-(CH₂)_p2-로부터 선택되고; o, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수인 것이 또한 바람직하다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), 및 (III-2) 중 어느 화학식의 사카라이드인 일 구체예에서, 링커 -L-은 -L^a-이고, 여기에서, -L^a-가 -(CH₂)_o1-, -(CH₂-CH₂-O)_o2-C₂H₄-, -(CH₂-CH₂-O)_o2-CH₂-를 나타내고; o1는 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수이고; o2는 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수이다.

글리코컨주게이트

본 발명의 또 다른 양태는 -O-L-NH₂ 기의 질소 원자를 통해서 면역원성 담체와 컨주게이션된 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드를 나타낸다. 또한, 상기 사카라이드는 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시킴으로써 얻어지는 글리코컨주게이트로서 정의된다. 따라서, -O-L-NH₂ 기의 질소 원자를 통해서 면역원성 담체와 컨주게이션된 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 상기 사카라이드와 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 화학식의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시킴으로써 얻어지는 상기 글리코컨주게이트는 동일한 의미를 갖는다.

상기 글리코컨주게이트는 박테리아와 연관된 질환에 대항하는 면역을 위한 백신으로서 효능적인 것으로 입증되었다.

사카라이드는 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 TI-2 (T 세포 독립성-2) 항원 및 불량한 면역원(poor immunogen)으로서 알려져 있다. TI-2 항원은 표면 노출된 면역글로불린 수용체(surface exposed immunoglobulin receptor)의 가교를 통해서 성숙한 B 세포에 의해서만 인식되는 항원이다. T 세포의 도움 없이는, 면역 기억이 생성되지 않으며, IgM로부터 다른 IgG 서브클래스로 전환하는 이소타입뿐만 아니라 B 세포 친화성 성숙화가 발생하지 않는다. 더욱이, 사카라이드는 인간 글리코지질 및 글리코단백딜에 대한 구조적 상동성으로 인해서 인간에서의 공지된 불량한 면역원이다. 이들의 불량한 면역원성 특성으로 인해서, 사카라이드는 효능적인 백신의 생산에 필수적인 특징인 B 세포에 의한 항체 생산뿐만 아니라 기억 세포의 형성 둘 모두를 유도하는데 불량한 특성을 나타낸다.

따라서, 효능적인 사카라이드-기반 백신을 생산하기 위해서, 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드는 면역원성 담체와 컨주게이트되어 사카라이드에에 비해서 증가된 면역원성을 나타내는 글리코컨주게이트를 제공한다.

사카라이드-단백질 컨주게이트는 화학식(I)의 하나 이상의 합성 사카라이드 및 하나 이상의 사카라이드(I)가 공유결합되는 면역원성 담체로 이루어진다.

이러한 문맥에서, 용어 "면역원성 담체"는 사카라이드에 컨주게이트되어 사카라이드 자체에 비해서 증가된 면역원성을 나타내는 글리코컨주게이트를 형성시키는 구조체로서 정의된다. 따라서, 면역원성 담체에의 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드의 컨주게이션은 상기 면역원성 담체에 대항하는 면역 반응을 유도하지 않으면서 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드에 대항하는 면역 반응의 자극에 영향을 준다.

바람직한 면역원성 담체는 담체 단백질이다. 통상의 기술자를 위해서, 담체 단백질은 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 돌연변이 디프테리아 톡소이드, 개질된 디프테리아 톡소이드, 돌연변이 및 개질된 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 개질된 파상풍 톡소이드, 돌연변이 파상풍 톡소이드, 외막 단백질(outer membrane protein: OMP), 소 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine: KLH) 또는 콜레라 톡소이드(cholera toxoid: CT)를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다. 본원에서 용어 "톡소이드"는 독성이 화학적(포르말린) 또는 열 처리에 의해서 불활성화되거나 억제된 반면에 다른 특성, 전형적으로는 면역원성은 유지되는 박테리아 독소(일반적으로는 외독소(exotoxin))를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 톡소이드"는 야생형 아미노산 서열을 변경시킴으로써 독성이 덜하거나 심지어 비-독성이도록 변경된 재조합 박테리아 독소이다. 그러한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산에서의 치환일 수 있다. 그러한 돌연변이 톡소이드는 그의 표면상에서 상호 연결 분자의 작용기 Y와 반응하여 개질된 톡소이드를 제공할 수 있는 작용성을 제시한다.

본 발명의 구체예는 -O-L-NH₂-기의 질소 원자를 통해서 면역원성 담체에 공유적으로 연결된 사카라이드(I)이다. -O-L-NH₂-기의 -L-은 공유결합의 형태(면역원성 담체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 O-L-NH₂-기의 산소 원자) 또는 질소 원자가 담체 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어 있는 -L-NH-의 형태의 면역원성 담체에 대한 연결이다.

직접적으로 연결된이라는 표현은 면역원성 담체의 작용기 또는 측쇄를 의미하고, 간적적으로 연결된이라는 표현은 면역원성 담체 및/또는 -O-L-NH₂-기의 질소와 연결되는 추가의 작용기를 통한 연결을 나타낸다.

담체 단백질이 담체 단백질에의 사카라이드의 커플링을 위한 면역원성 담체로서 사용되면, 사카라이드 및 때로는 단백질의 화학적 활성화가 필요하다. 사카라이드 대 단백질에 대한 컨주게이션 방법의 선택은 단백질의 pH 및 온도 민감성, 및 대부분의 유기 용매 중의 이들의 제한된 용해도로 인해서 제한된다. 절차는 단백질의 변성 및 사카라이드의 분해를 방지하기 위해서 온화한 조건하에 수행되어야 한다. 그와 같이, 컨주게이션 반응은 중성 pH 또는 그 근처의 완충액에서 수행된다. 현재까지, 단백질에 대한 탄수화물의 공유 결합을 위한 많은 원안이 보고되었다. 하기 연결 방법이 합성 사카라이드(I)를 담체 단백질에 연결시키기 위해서 사용될 수 있다:

환원성 아미노화가 단백질 내의 라이신 잔기의 ε-아미노 기에 대한 환원-말단을 통한 유리 올리고사카라이드의 결합을 위한 가장 일반적인 글리코컨쥬게이션 방법 중 하나이다. 본 발명에서, 합성 사카라이드(I)의 아미노 기는, 예를 들어, 글루타르알데하이드를 사용하여, 알데하이드 작용에 의해서 추가로 작용성화될 수 있으며, 알데하이드에 의해서 작용성화된 합성 사카라이드와 라이신 잔기를 갖는 담체 단백질 사이의 글리코컨주게이션이 환원성 아미노화에 의해서 형성될 수 있다.

안정한 연결을 부여하기 위한 티올과의 말레이미드의 비가역적 반응으로서의 말레이미드-티올 컨주게이션이 또한 글리코컨주게이트의 제조에 자주 사용되었다. 예를 들어, 말레이미드는 환원-말단에 아민 링커를 지니고 있는 합성 사카라이드 (I)로부터 제조될 수 있다. 사카라이드-말레이미드 구성물은 이어서 담체 단백질의 시스테인내의 티올 측쇄와 반응하여 안정한 글리코컨주게이트를 생성시킬 수 있다. 반대로, 담체 단백질은 말레이미드에 의해서 활성화될 수 있고, 합성 사카라이드 (I)는 티올 작용에 의해서 추가로 작용성화될 수 있다.

스쿠아레이트(squarate) 에스테르를 사용하는 글리코컨주게이션 방법이 적용될 수 있다. 먼저, 합성 사카라이드(I)의 스쿠아르산(squaric acid) 아미드 에스테르가 스쿠아레이트 에스테르와의 아민기의 커플링에 의해서 제조될 수 있다. 합성 사카라이드(I)의 스쿠아르산 아미드 에스테르가 담체 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 기와 추가로 커플링될 수 있으며, 스쿠아르산 디아미드가 형성된다.

디(N-석신이미딜) 아디페이트, 디(N-석신이미딜) 글루타레이트(DSG), N-(γ-말레이미도부티릴옥시) 설포석신이미드 에스테르 (설포-GMBS), 석신이미딜(4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트(설포-SIAB), 석신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시석신이미드(PEG-4-SPDP)를 포함한 활성화된 에스테르가 적용될 수 있다(참조, 도 1). 바람직하게는 디(N-석신이미딜) 아디페이트가 글리코컨주게이트의 제조에 사용될 수 있다.

카르보디이미드, 무엇보다도 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)에 의한 제로-길이(Zero-length) 가교 방법이 사용될 수 있다. N-치환된 카르보디이미드가 담체 단백질의 카르복실산과 반응하여 고도의 반응성 O-아실이소우레아 유도체를 형성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 활성 종은 합성 사카라이드 (I)의 일차 아민과 반응하여 아미드 결합을 형성시킬 수 있다.

추가의 컨주게이션 방법으로서, 클릭 화학(click chemistry)이 사용될 수 있다. 클릭 화학은 알킨과 아지드의 [3+2] 고리첨가반응(cycloaddition)이다. 바람직하게는, 스트레인-프로모티드 아지드-알킨 고리첨가반응(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition: SPAAC)이 글리코컨주게이션에 적용될 수 있다. 사이클로옥틴과 같은 스트레인된 알킨이 비-독성 반응 조건으로 인한 바이오컨주게이션에 유리하다. 담체 단백질는 아지드-함유 아미노산으로 간단히 표지될 수 있으며 알킨으로 작용성화된 합성 사카라이드(I)와 컨주게이션될 수 있다. 반대로, 아지드로 작용성화된 합성 사카라이드(I)는 알킨으로 표지된 담체 단백질과 컨주게이션될 수 있다.

고유한 화학적 결찰(native chemical ligation: NCL)이 글리코컨주게이션에 사용될 수 있다. 이러한 방법을 글리코컨주게이션에 적용시키기 위해서, 합성 사카라이드(I)가 티오에스테르, 예를 들어, 벤질티오에스테르, 에틸티오에스테르, 또는 페닐티오에스테르로 추가로 작용성화되어야 한다. 고유한 화학적 결찰에서, 담체 단백질의 N-말단 시스테인 잔기의 티올레이트 기가 작용성화된 합성 사카라이드(I)의 티오에스테르를 공격한다. 이러한 비가역적 트랜스티오에스테르화 단계는 화학선택적(chemoselective) 및 위치선택적(regioselective)이고, 티오에스테르 중간체를 형성시키는 것을 유도하며, 이러한 중간체는 결찰 부위에서의 고유한 아미드 결합의 형성을 초래하는 분자내 S,N-아실 이동(S,N-acyl shift)에 의해서 재배열된다. 결과적으로, 합성 사카라이드(I) 및 담체 단백질은 아미드 결합에 의해서 컨주게이션된다.

흔적없는 스타우딩거 결찰(traceless Staudinger ligation)이 또한 글리코컨주게이션에 사용될 수 있다. 이러한 반응에서, 포스핀은 티오에스테르 친전자체를 지니고 있으며; 아지드와의 반응 후에, 생성물들은 아미드 및 이탈 포스핀 옥사이드이다. 스타우딩거 결찰은, 관련 농도에서의 아지드 및 포스핀 둘 모두의 입증된 비-독성으로 인해서, 시험관내, 즉, 살아있는 세포 그리고 살아있는 동물 둘 모두에서 아지드-함유 단백질을 표지시키기에 이상적인 것으로 입증되었다. 글리코컨주게이션 적용을 위해서, 합성 사카라이드(I)는 티오에스테르 함유 포스핀으로 작용성화되고, 아지드 기는 후속 포스핀 프로브 도입을 위한 여러 방법으로 관심 담체 단백질내로 도입된다. 일반적으로, 아지도호모알라닌이 단백질의 메티오닌 대신에 혼입될 수 있다. 아지도호모알라닌으로 개질된 담체 단백질은 스타우딩거 결찰에 의해서 합성 사카라이드(I)와 효과적으로 및 특이적으로 컨주게이션될 수 있다.

광-가교는 분자 생물학의 분야에서 중요한 화학적 방법이다. 최근에, 리간드-결합 영역의 확인에 대한 이러한 방법의 적용이 많은 주목을 받고 있다. 광-가교 방법이 글리코컨주게이션을 위해서 적용될 수 있다. 광친화성 표지화는 광화학적으로 활성화되어 고도의 반응성 중간체, 일반적으로는 니트렌 또는 카르벤을 생성시킬 수 있는 작용기를 필요로 한다. 작용기로서, 벤조페논, 아릴아지드, 아릴-, 또는 알킬디아지린이 적용된다. 최근에, 알킬- 또는 아릴디아지린이 바람직하게는 광친화성 표지화를 위해서 사용된다(M. R. Bond et al. Nature Protocols 2009, 4(7), 1044-1063; M. R. Bond et al. Bioconjugate Chemistry 2011, 22 (9), 1811-1823). 담체 단백질과의 합성 사카라이드(I)의 컨주게이션을 위해서, 합성 사카라이드(I)가 알킬- 또는 아릴디아지린, 예를 들어, 3-트리플루오로메틸-3-페닐디아지린으로 작용성화될 수 있다. UV-조사 후에, 반응성 카르벤은 아릴디아지리딘으로 작용성화된 합성 사카라이드(I)로부터 생성되며, 이러한 카르벤은 C-C 공유결합에 의해서 담체 단백질과 커플링된다.

특히, 화학식(I)의 사카라이드 및/또는 바람직하게는 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c가 비-독성 돌연변이 디프테리아 독소 CRM₁₉₇와 컨주게이션되어 라이신 잔기의 일차 아민 작용기로 작용하는 것이 바람직하다.

CRM₁₉₇유사 야생형 디프테리아 독소는 글리신에 대한 글루탐산의 단일 아미노산 치환을 갖는 디설파이드 브릿지에 의해서 연결된 두 개의 서브유닛(subunit)으로 이루어진 535 아미노산(58 kD)의 단일 폴리펩티드 사슬이다. 그것은 폐렴구균 박테리아 감염증과 같은 질환을 위한 많은 승인된 컨주게이트 백신(예, Prevnar)에서 담체 단백질로서 이용된다.

바람직하게는, 디(N-석신이미딜)아디페이트가 먼저 일차 아미노기를 갖는 합성 사카라이드(I)에 결합된다. 활성화된 사카라이드(I)는 후속하여 CRM₁₉₇과 같은 담체 단백질과 축합되어 글리코컨주게이트를 제공한다. 또한, 관련된 디석신이미딜 글루타레이트의 사용이 적용될 수 있다(도 2의 (A)).

담체 단백질와 컨주게이션된 상기 사카라이드는 바람직하게는 ≥ 95%, 바람직하게는 ≥ 96%, 더욱 바람직하게는 ≥ 97%, 더욱더 바람직하게는 ≥ 98%, 및 가장 바람직하게는 ≥ 99%의 순도를 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태는, 약물로서, 즉, 의약에 적용가능한 약제학적 활성제로서 본 발명의 사카라이드 및 이들의 글리코컨주게이트의 용도에 관한 것이다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드 및 화학식 (I), (II-1), (II-2), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드를 면역원성 담체와 반응시킴으로써 얻은 상기 글리코컨주게이트는 의약에서 약제학적 활성제에 적합한 것으로 밝혀졌다. 상기 사카라이드 및 상기 글리코컨주게이트가 동물에서의 면역 반응을 유발시키기에 적합하고, 그에 따라서, 인간 및/또는 동물 숙주에서의 방어 면역 반응을 상승시키기에 유용하다.

바람직하게는 상기 사카라이드 및 상기 글리코컨주게이트는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환, 바람직하게는 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

놀랍게도, 본 발명의 신규한 컨주게이트는 또한 인간 및/또는 동물 숙주에서의 면역 반응을 상승시키기에 적합하고, 그에 따라서, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환에 대한 방어에 적합하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본원에서 개시된 본 발명의 컨주게이트는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 그러한 질환은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 수막염, 폐렴, 후두덮개염 및 호흡 기관의 다른 질환을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 신규한 컨주게이트에 의한 동물의 치료는, 살아있는 유기체에서의 기억 B-세포(memory B-cell)의 발달을 나타내는, 면역글로불린 IgG-이소타입의 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 기억 B-세포의 존재는 면역학적 기억을 입증한다. 따라서, 본 발명의 컨주게이트는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항하는 동물에서의 장기간 방어를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명에 따른 컨주게이트는 의약에서, 특히, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발되거나 그와 연관된 질환에 대항하는 백신화에서의 사용을 위한 약제학적 활성제로서의 사용에 적합하다.

백신 조성물

본 발명의 일 양태는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 애주번트, 담체, 동결보호제(cryoprotectant), 동결건조보호제(lyoprotectant), 부형제 및/또는 희석제와 함께 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이의 글리코컨주게이트를 함유하는 약제학적 조성물, 특히, 백신 조성물에 관한 것이다.

따라서, 화학식(I)의 합성 사카라이드를 위한 본 발명의 합성은 추가로 단계 B)를 포함할 수 있다:

B) 화학식(I)의 사카라이드의 염을 제조하거나, 화학식(I)의 사카라이드 또는 화학식(I)의 합성 사카라이드의 염의 동결건조물(lyophilisate)을 제조하는 단계.

바람직한 구체예에서, 화학식(I)의 사카라이드를 위한 본 발명의 합성은 단계 B)를 추가로 포함할 수 있다:

B) 화학식(I)의 사카라이드의 염을 제조하거나, 화학식(I)의 사카라이드 또는 화학식(I)의 사카라이드의 염의 동결건조물을 제조하는 단계.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 특히, 본원에 개시된 전체 화학적 합성법에 따라 얻은 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c가 이들 백신에 사용된다. 본원에 개시된 전체 화학적 합성에 의해서 얻은 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드 뿐만 아니라, 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는, 적어도 96%, 더욱더 바람직하게는, 적어도 97%, 더욱더 바람직하게는, 적어도 98%, 및 가장 바람직하게는, 적어도 99%의 순도를 갖는다.

본 발명의 사카라이드 뿐만 아니라, 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드를 함유하는 약제학적 조성물, 및 특히, 적어도 하나의 본 발명의 사카라이드, 특히, 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c를 함유하는 백신은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발되거나 그와 연관된 질환, 바람직하게는 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염에 대항한 면역화에서 백신으로서의 사용에 매우 유용하다.

본 발명에 따르면, 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c 뿐만 아니라 본원에 개시된 어떠한 다른 본 발명의 사카라이드는 상기 언급된 질환에 대항한 면역화를 위한 백신으로서의 사용을 위한 상기 약제학적 조성물의 제조에 유용하다.

백신은 현탁액의 형태로 제조될 수 있거나, 동결건조될 수 있다. 현탁액 형태는 동결되어 저장될 수 있다. 동결건조된 형태에서, 하나 이상의 안정화제를 첨가하는 것이 바람직하다. 백신접종은 어떠한 연령에서 수행될 수 있다. 백신은 피하, 스프레이에 의해서, 주사에 의해서, 경구, 안내, 기관내 또는 비내로 투여될 수 있다. 인간 또는 동물에 투여되는 본 발명의 백신의 양 및 투여 섭생은 약제학 및 수의학 분야에서 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 따라서 특히 항원, 애주번트(존재하는 경우), 특정의 동물 또는 환자의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 결정될 수 있다.

대상체에서의 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항한 면역 반응을 유도하는 방법은 본 발명의 사카라이드, 이의 혼합물, 이의 컨주게이션 또는 이의 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 대상체에서의 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발되거나 그와 연관된 질환, 바람직하게는 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 적어도 하나의 합성 사카라이드 또는 이의 혼합물, 이의 컨주게이션 또는 이의 조성물 또는 백신을 투여함을 포함한다.

본 발명에서, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항하는 백신화를 위한 유용한 투여량을 제공하기 위한 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드의 양은 체중 kg 당 0.02 μg 내지 약 10 μg일 수 있다. 임의로 면역원성 담체, 바람직하게는 담체 단백질, 예컨대, CRM₁₉₇에 컨주게이션된 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드는 단일 투여로서 또는 연속으로(즉, "부스터(booster)" 또는 "부스터들"과 함께) 투여될 수 있다. 예를 들어, 어린이에게는, 어린 시절 질환을 예방하기 위해서 다른 백신에 대해서 현재 권장되는 바와 같이, 어릴때에 단일 투여로 투여된 다음에 최대 10년 후에 부스터 용량이 투여될 수 있다.

정맥내 및 비경구 투여가 바람직하다. 그러한 조성물은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대, 무균수, 생리 식염수, 또는 글루코오스 등과 혼합된 상태일 수 있다. 면역원성 담체에 임의로 컨주게이션된 본 발명에 따른 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 조성물 또는 사카라이드는 또한 동결건조될 수 있다.

본 발명의 동결건조된 사카라이드는 최종적으로는 액체 성분과 재구성되어 환자에게 투여하기에 적합한 물질을 생성시킨다. 재구성은 전형적으로는 사용 시점에 수행될 것이다. 따라서, 본 발명의 사카라이드 및 수중유 에멀션 애주번트 또는 애주번드의 완충 용액은, 사용시의 최종 제형을 위해서 준비된, 포장된 또는 분배된 백신 키트에 별도로 유지될 수 있다. 두 개의 컨테이너를 함유하는 키트에서, 하나의 컨테이너는 재구성을 위한 액체를 포함할 것이고, 두 번째 컨테이너는 동결건조된 물질을 포함한다. 안정성 이유 때문에, 본 발명의 동결건조된 성분은 안정화제, 예컨대, 락토오스, 수크로오스 및/또는 만니톨 뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 수크로오스/만니톨 혼합물의 사용은 건조 과정을 가속시킬 수 있다. 동결건조된 성분은 또한 염화나트륨을 포함할 수 있다. 동결건조된 물질 중의 가용성 성분은 재구성 후에 조성물에 보유될 것이고, 그래서 최종 액체 백신은 락토오스 및/또는 스크로오스를 함유할 수 있다.

본 발명의 백신의 제형은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 명백하게는, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정의 투여형의 본질에 좌우될 것이다.

본 발명의 백식 조성물은 하나 이상의 애주번트를 함유할 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, "애주번트"는 면역원성 담체에 임의로 컨주게이션된 본 발명에 따른 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드의 면역원성을 향상시키는 역할을 하는 물질이다. 면역 애주번트는, 예를 들어, 항체 역가 또는 세포-매개된 면역 반응이 없거나 약한 것을 포함한, 단독 투여 시에 면역원성이 약한 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 추가로, 애주번트는 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있고/거나, 개체에서의 면역 반응을 달성시키기에 효과적인 항원의 투여량을 저하시킬 수 있다. 따라서, 애주번트는 흔히 면역 반응을 증강시키기 위해서 주어지며 통상의 기술자에게는 잘 공지되어 있다. 효과를 향상시키기에 적합한 애주번트는, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, 알루미늄 애주번트(예, 알루미늄 염, 예컨대, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 또는 이들의 조합물), 프로인트 애주번트(Freund's Adjuvant)(완전 또는 불완전), BAY R1005 (N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-β-D-글리코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 하이드로아세테이트), DC-chol (디메틸아미노에탄)-카르바모일 콜레스테롤, PCPP (폴리[디(카르복실레이토페녹시) 포스파젠]), 모노포스포릴 리피드 A, CpG 올리고뉴클레오티드, QS-21 (Quillaja saponaria saponin immunologic adjuvant), 콜레라 독소 및 포르밀 메티오닐 펩티드를 포함한다.

대안적인 애주번트는 PCT Publ. No. WO 90/14837호에 기재된 바와 같은 수중유 에멀션 제형, 예를 들어, MF59, 에멀션 비히클[5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic® L121, 0.2% Polysorbate 80 및 포스페이트 완충 식염수 (pH 7.4)] 중의 SAF-1 (Syntex Adjuvant Formulation 트레오닐-MDP)(0.05-1%), 및 모노포스포릴 지질 A (MPL), 트레할로오스 디마이콜레이트(trehalose dimycolate: TDM), 및 세포벽 골격(CWS)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 포함하고, 사포닌 애주번트, 예컨대, StimulonTM (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.) 또는 이의 생성된 입자가 사용될 수 있다. 다양한 수중유 에멀션 애주번트가 공지되어 있으며, 이들은 전형적으로는 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하고, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생분해성(대사성) 및 생체적합성이다. 스쿠알렌의 포화된 유사체인 스쿠알란이 바람직한 오일이다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다. 오일들의 혼합물이 사용될 수 있다. 계면활성제는 이들의 HLB(hydrophile/lipophile balance: 친수성/친유성 균형)에 의해서 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 더욱 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(일반적으로는 Tweens으로 일컬어짐); 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 코폴리머; 반복 에톡시(옥시-1,2-에탄디일) 기의 수에 따라서 달라질 수 있는 옥톡시놀(octoxynol), 예컨대, 옥톡시놀-9(Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); 인지질, 예컨대, 포스파티딜콜린(레시틴); 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로 공지됨)를 포함한 계면활성제와 함께 사용될 수 있다. 에멀션에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85(sorbitan trioleate: 소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.

추가의 애주번트는 시토킨, 예컨대, 인터류킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, 등), 인터페론(예, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor: M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF)일 수 있다.

조성물은 투여 경로 및 요망되는 제제에 따라서 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제, 및 착색제 등을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 특히, 다중 투여 형태로 포장되는 때에, 항균제를 포함할 수 있다. 항균제, 예컨대, 티메로살 및 2-페녹시에탄올이 일반적으로 백신에서 사용되지만, 무-수은 보존제를 사용하거나 보존제를 전혀 사용하지 않은 것이 바람직하다.

조성물은 온도 보호제(temperature protective agent)를 포함할 수 있다. 그러한 예를 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 추가로 디프테리아 항원, 파상풍(tetanus) 항원, 백일해(pertussis) 항원, 간염(hepatitis) B 항원, 불활성화된 소아마비 백신 및 불활성화된 로타바이러스 백신 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "디프테리아 항원"은 바람직하게는 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)이다. 디프테리아 톡소이드는, 디프테리아에 대항하는 활성 면역화제로서 사용되는, 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 포름알데하이드-불활성화된 독소이다. 디프테리아 톡소이드의 제조는 잘 문서화되어 있다(예, Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 12). 어떠한 적합한 디프테리아 톡소이드가 사용될 수 있다. 디프테리아 톡소이드의 농도는 일반적으로는 5 내지 100 Lf(Limit of Floculation: 응집 한계)/mL이다. 바람직한 농도는 10 내지 50 Lf/mL이다. 더욱 바람직한 농도는 20 내지 40 Lf/mL이다. 가장 바람직하게는, 농도는 약 30 Lf/mL이다.

본원에서 사용되는 용어 "파상풍 항원"은 바람직하게는 파상풍 톡소이드이다. 파상풍 톡소이드는 통상의 기술자에게는 공지되어 있다(예, Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 33). 어떠한 적합한 파상풍 톡소이드가 사용될 수 있다. 파상풍 톡소이드의 농도는 일반적으로는 1 내지 50 Lf/mL이다. 바람직한 농도는 2 내지 9 Lf/mL이다. 더욱 바람직하게는 농도는 5 내지 8 Lf/mL이다. 가장 바람직하게는, 농도는 약 6.5 Lf/mL이다.

본원에서 사용되는 용어 "백일해 항원"은 세포성(예, 전세포) 또는 무세포성(acellular)일 수 있다. 두 유형 모두의 항원의 제조는 잘 문서화되어 있다(Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 23). 세포성 백일해 항원의 경우에, 백일해 항원의 농도는 일반적으로는 5 내지 50 OU/mL이다. 바람직한 농도는 10 내지 40 OU/mL이다. 더욱 바람직한 농도는 25 내지 35 OU/mL이다. 가장 바람직하게는, 농도는 약 30 OU/mL이다. 무세포성 항원이 사용되는 경우에, 백일해 완전독소(pertussis holotoxin: PT) 및 섬유질 헤마글루티닌(filamentous haemagglutinin: FHA)을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 이들을 퍼탁틴(pertactin)(또한, PRN 또는 69kDa 항원로 공지됨) 및 임의로 응집원(agglutinogen)(또한, fimbriae으로 공지됨) 2 및 3과 조합하여 사용한다. PT는 독성 단백질이며, 백일해 항원에 존재하는 때에, 바람직하게는 그것은 탈독소화된다. 탈독소화는 화학적 및/또는 유전적 수단에 의할 수 있다. 바람직한 탈독소화된 돌연변이체는 9K/129G doulb 돌연변이체이다.

본원에서 사용되는 용어 "간염 B 항원"은 간염 B 표면 항원일 수 있다. 간염 B 표면 항원의 제조는 잘 문서화되어 있다(예, Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 15).

본원에서 사용되는 용어 "불활성화된 소아마비 백신(IPV)"은 바람직하게는 모든 세 가지의 폴리오바이러스 타입 I-3의 불활성화된(치사된) 폴리오바이러스 스트레인으로 이루어진다. 본 발명에서, 바이러스 불활성화는 바이러스의 감염 능력의 제거를 나타낸다. 불활성화의 두 가지 방법(화학적 및 물리적)에서, 가장 일반적으로 사용되는 화학물질은 포름알데하이드 및 베타프로피올락톤이다. 디프테리아 톡소이드의 제조는 잘 문서화되어 있다(예, Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 27).

본원에서 사용된 용어 "불활성화된 로타바이러스 백신"은 바람직하게는 소 (UK 혈통)/인간 재조합 백신, 인간 신생아 RV3 스트레인 또는 소/인간 신생아 116E 스트레인일 수 있다. 본 발명에서, 바이러스 불활성화는 바이러스의 감염 능력의 제거를 나타낸다. 불활성화의 두 가지 방법(화학적 및 물리적)에서, 가장 일반적으로 사용되는 화학물질은 포름알데하이드 및 베타프로피올락톤이다. 불활성화된 로타바이러스 백신의 제조는 잘 문서화되어 있다(예, Plotkin et al, Vaccines, 6^th edition, 2012, Chapter 30).

본 발명의 조성물은 통상적으로는 선택된 pH로 완충될 수 있는 액체 제제, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제형을 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀션 또는 오일일 수 있다. 수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충된 매질을 포함한, 물, 알코올성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다.

재구성 후의 조성물의 pH는 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5 (예, 약 7)이다. 본 발명의 조성물은 완충제, 예를 들어, 트리스 완충제, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, 히스티딘, 글리신, 석시네이트 및 트리에탄올아민 완충제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 완충제를 포함할 것이다. 등장화제는 이온성 등장화제, 예컨대, 염 또는 비-온성성 등장화제, 예컨대, 탄수화물일 수 있다. 이온성 등장화제의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, NaCl, CaCl₂, KCl 및 MgCl₂을 포함한다. 비-이온성 등장화제의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 백신 조성물은, 보존제와 함께 또는 보존제 없이, 무균 액체, 무-발열원 포스페이트-완충된 생리학적 식염수로서 제형화된다.

약제학적으로 허용되는 보존제는 조성물의 저장 수명을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 비록, 예를 들어, 파라벤, 티메로살, 클로로부탄올, 또는 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하는 다양한 보존제가 또한 사용될 수 있지만, 벤질 알코올이 적합할 수 있다. 비록, 선택된 제제에 따라서 상당한 차이가 존재할 수 있지만, 보존제의 적합한 농도는 전체 중량을 기준으로 하여 0.02% 내지 2%일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단일 투여 바이알, 다중투여 바이알 또는 사전-충전 주사기로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 애주번트, 담체, 부형제, 용매 및/또는 희석제와 함께, 활성 성분으로서 면역원성 담체와 임의로 컨주게이션된 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중의 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드를 함유하는 약제학적 제형 및 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다.

추가로 바람직하게는, 약제학적 조성물은 동결건조물 또는 액체 완충 용액의 형태로 제형화된다.

백신 또는 약제학적 조성물은 또한 실질적으로 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 또는 희석제를 임의로 사용하는 이의 약제학적 활성 염의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물은 공지된 방법으로 적합한 투여 수준으로 통상의 고체 또는 액체 담체 또는 희석제 및 통상적인 약제학적으로-제조된 애주번트에 제조된다. 바람직한 제제 및 제형은 경구 적용에 적합한 투여 가능한 형태이다. 이들 투여 가능한 형태는 예를 들어, 환제, 정제, 필름 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 분말 및 침착물(deposit)을 포함한다. 경구 투여 가능한 형태가 아닌 다른 것이 또한 가능하다. 본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 상피 또는 점막피부의 내막(구강 점막, 직장 및 질 상피 내막, 비인두 점막, 장내 점막)을 통한 흡수에 의한 흡입, 주사(정맥내, 복강내, 근육내, 피하); 경구, 직장내, 경피, 국소, 피부내(intradermally), 위내, 피내(intracutaneously), 질내, 혈관내, 비내(intranasally), 구강내, 경피, 설하 또는 약제 기술분야에서 이용 가능한 다른 수단을 포함한 어떠한 적절한 수단에 의해서 투여될 수 있다.

활성 성분으로서 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 6a, 6b, 6c, 8a, 8b 및 8c 또는 이의 약제학적으로 하용되는 염을 함유하는 본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물은 전형적으로는, 의도된 투여 형태, 즉, 경구 정제, 캡슐(고체-충전된, 반-고체 충전된 또는 액체 충전된), 재구성용 분말, 경구 겔, 엘릭시르(elixir), 분산 가능한 과립, 시럽, 및 현탁액 등과 관련하여 적합하게 선택되고 통상의 약제 관행에 부합하는 적합한 담체 물질과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐의 형태의 경구 투여의 경우에, 활성 성분은 어떠한 경구 비독성의 약제학적으로 허용되는 불활성 담체, 예컨대, 락토오스, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘, 황산칼슘, 탈크(talc), 만니톨, 및 에틸 알코올(액체 형태) 등와 조합될 수 있다. 더욱이, 요망되거나 요구되는 경우에, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 분말 및 정제는 약 5 내지 약 95%의 테트라사카라이드로 구성될 수 있다.

적합한 결합제는 전분, 젤라틴, 천연 당, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대, 아카시아, 소듐 알기네이트, 카르복시메틸-셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스를 포함한다. 윤활제 중에, 붕산, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 및 염화나트륨 등이 이들 투여형에 사용되는 것으로 언급될 수 있다. 붕해제는 전분, 메틸셀룰로오스, 및 구아 검 등을 포함한다. 감미제 및 향미제 및 보존제가 또한 적절한 경우에 포함될 수 있다. 상기 언급된 용어 중 일부, 즉, 붕해제, 희석제, 윤활제, 및 결합제 등이 이하 더욱 상세히 논의된다.

추가적으로는, 본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물은 지연된 방출 형태(sustained release form)로 제형화되어서 치료 효과를 최적화시키기 위해서 성분 또는 활성 성분 중 어느 하나 이상의 속도 조절된 방출을 제공할 수 있다. 지연된 방출에 적합한 투여형은 활성 성분으로 함침되고 그러한 함침되거나 캡슐화된 다공성 폴리머 매트릭스를 함유하는 정제 형태 또는 캡슐로 성형된 다양한 붕해 속도의 층 또는 제어된 방출 폴리머 매트릭스를 함유하는 층상 정제를 포함한다.

액체 형태 제제는 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 예로서 비경구 주사를 위한 물 또는 물-프로필렌 글리콜 용액이 언급될 수 있거나, 감미제 및 불투명화제(opacifier)가 첨가된 경구 용액, 현탁액 및 에멀션이 언급될 수 있다. 액체 형태 제제는 또한 비내 투여를 위한 용액을 포함할 수 있다.

흡입에 적합한 에어로졸 제제는 용액 및 분말 형태의 고형물을 포함할 수 있고, 분말 형태의 고형물은 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 불활성 압축 가스, 예를 들어, 질소와 조합될 수 있다.

좌제를 제조하기 위해서, 저융점 왁스, 예컨대, 지방산 글리세라이드, 예컨대, 코코아 버터의 혼합물이 먼저 용융되고, 활성 성분이 교반 또는 유사한 혼합에 의해서 그 내부에서 균일하게 분산된다. 이어서, 용융된 균일 혼합물을 통상의 크기의 모울드에 붓고 냉각시키고 그에 의해서 고형화시킨다.

또한, 경구 또는 비경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 사용 직전에 전환되도록 의도된 고체 형태 제제가 포함된다. 그러한 액체 형태는 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 바람직하게는, 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f을 함유하는 본 발명의 백신 또는 약제학적 조성물이 또한 경피 전달 가능할 수 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀션의 형태를 가질 수 있고, 본 목적으로 본 기술분야에서 통상적인 매트릭스 또는 저장소 타입의 경피 패치에 포함될 수 있다.

용어 캡슐은 활성 성분을 포함하는 조성물을 보유하거나 함유시키기 위한 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올 또는 변성 젤라틴으로 제조된 특수 컨테이너 또는 엔클로저(enclosure)를 나타낸다. 경질 쉘 캡슐(hard shell capsule)은 전형적으로는 비교적 높은 농도 뼈 및 돼지껍질 젤라틴의 배합물로 제조된다. 캡슐 자체는 소량의 염료, 불투명화제(opaquing agent), 가소제 및 보존제를 함유할 수 있다.

정제는 적합한 희석제와 함께 활성 성분을 함유하는 압축된 또는 성형된 고체 투여형을 의미한다. 정제는 통상의 기술자에게는 공지된 습식 과립화 또는 건식 과립화에 의해서 얻은 혼합물 또는 과립의 타정 또는 압축에 의해서 제조될 수 있다.

경구 겔은 친수성 반-고체 매트릭스에 분산된 또는 용해된 활성 성분을 나타낸다.

구성을 위한 분말은 물 또는 주스에 현탁될 수 있는 활성 성분 및 적합한 희석제를 함유하는 분말 배합물을 나타낸다.

적합한 희석제는 일반적으로 조성물 또는 투여형의 주요 부분을 이루는 물질이다. 적합한 희석제는 당, 예컨대, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 및 소르비톨, 밀, 옥수수 쌀 및 감자로부터 유래된 전분, 및 셀룰로오스, 예컨대, 미세결정상 셀룰로오스를 포함한다. 조성물 중의 희석제의 양은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95 중량%, 바람직하게는 약 25 내지 약 75 중량%, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 60 중량%, 가장 바람직하게는 약 40 내지 50 중량%의 범위일 수 있다.

용어 붕해제는 조성물이 파괴(붕해)되고 약제를 방출하는 것을 돕도록 조성물에 첨가되는 물질을 나타낸다. 적합한 붕해제는 전분, "냉수 가용성" 개질된 전분, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 전분, 천연 및 합성 검, 예컨대, 로커스트 빈(locust bean), 카라야(karaya), 구아(guar), 트라가칸트 및 한천, 셀룰로오스 유도체, 예컨대, 메틸셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 미세결정상 셀룰로오스 및 가교된 미세결정상 셀룰오로스, 예컨대, 소듐 크로스카르멜로스(croscarmellose), 알기네이트, 예컨대, 알긴산 및 소듐 알기네이트, 점토, 예컨대, 벤토나이트 및 발포 혼합물을 포함한다. 조성물 중의 붕해제의 양은 조성물의 약 1 내지 약 40 중량%, 바람직하게는 조성물의 2 내지 약 30 중량%, 더욱 바람직하게는 조성물의 약 3 내지 20 중량%, 가장 바람직하게는, 약 5 내지 약 10 중량%의 범위일 수 있다.

결합제는 분말을 함께 결합시키거나 "접착(glue)"시키고 과립을 형성시킴으로써 분말을 점착성이 되게 하여 제형 내에서 "접착제"로서 작용하는 물질을 특징으로 한다. 결합제는 이미 희석제 또는 벌크화제(bulking agent)에 이용가능한 응집력을 부가한다. 적합한 결합제는 당, 예컨대, 수크로오스, 밀, 옥수수 쌀 및 감자로부터 유래된 전분; 천연 검, 예컨대, 아카시아, 젤라틴 및 트라가칸트; 해초(seaweed)의 유도체, 예컨대, 알긴산, 소듐 알기네이트 및 암모늄 칼슘 알기네이트; 셀룰로오스 물질, 예컨대, 메틸셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스; 폴리비닐피롤리돈; 및 무기물, 예컨대, 마그네슘 알루미늄 실리케이트를 포함한다. 조성물 중의 결합제의 양은 조성물의 약 1 내지 30 중량%, 바람직하게는 조성물의 약 2 내지 약 20 중량%, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 10 중량%, 더욱더 바람직하게는 약 3 내지 약 6 중량%의 범위일 수 있다.

윤활제는 투여형에 첨가되어 정제, 또는 과립 등이 압축된 후에 마찰 또는 마모를 감소시킴으로써 이들이 모울드 또는 다이로부터 방출되게 할 수 있는 물질을 나타낸다. 적합한 윤활제는 금속성 스테아레이트, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 또는 포타슘 스테아레이트; 스테아르산; 고융점 왁스; 및 물 가용성 윤활제, 예컨대, 염화나트륨, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 올레이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 d'l-류신을 포함한다. 윤활제는 일반적으로는 타정되기 매우 직전 단계에서 첨가되는데, 그 이유는 이들이 과립의 표면 및 이들과 정제 프레스의 일부 사이에 존재되어야 하기 때문이다. 조성물 중의 윤활제의 양은 조성물의 약 0.05 내지 약 15 중량%, 바람직하게는 조성물의 0.2 내지 약 5 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 3 중량%, 가장 바람직하게는 조성물의 약 0.3 내지 약 1.5 중량%의 범위일 수 있다.

활택제는 과립의 케이킹을 방지하고 유동 특성을 개선시켜서 흐름이 원활하고 균일하게 하는 물질이다. 적합한 활택제는 이산화실리콘 및 탈크를 포함한다. 조성물 중의 활택제의 양은 조성물의 약 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 조성물의 0.1 중량% 내지 약 7 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 5 중량%, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2 중량%의 범위일 수 있다.

착색제는 조성물 또는 투여형에 색상을 제공하는 부형제이다. 그러한 부형제는 식품 등급 염료 및 적합한 흡착제, 예컨대, 점토 또는 산화알루미늄상에 흡착된 식품 등급 염료를 포함할 수 있다. 착색제의 양은 조성물의 약 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 6 중량%, 더욱 바람직하게는 조성물의 약 0.1 내지 약 4 중량%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 중량%로 다양할 수 있다.

본 발명의 백신의 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA에서 찾아볼 수 있다. 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f, 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 적합한 백신 조성물은 적합한 액체의 약제학적 담체 중의 그러한 사카라이드(들)의 용액 또는 어떠한 다른 제형, 예컨대, 정제, 환제, 필름 정제, 코팅된 정제, 드라제(dragee), 캡슐, 분말 및 침착물, 겔, 시험, 슬러리, 현탁액, 및 에멀션 등일 수 있다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f의 치료 유효 투여량은 질환에 대항해서 적어도 부분적인 면역화를 생성시키는 화합물의 양을 나타낸다. 그러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물 중의 표준 약제학적, 약리학적 및 독성학적 절차에 의해서 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여 비율은 치료 지수이다. 투여되는 조성물의 실질적인 양은 치료되는 대상체, 대상체의 체중, 병의 중증도, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.

언급된 백신 제형은 본 발명의 화합물의 모듈식 구성으로 인해서 실온에서 놀라운 안정성을 나타내며, 여기에서, 상기 백신 제형은 재구성 전에 적어도 25℃의 온도에서 적어도 3 개월의 기간 동안 유지될 수 있다. 본원에서 기재된 백신 제형의 온도-안정성은 현재까지 기재된 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 대항하도록 유도된 백신에 비해서 본 발명의 특이적 이점을 구성한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 기간은 6 개월 또는 적어도 12개월이다.

항체

본 발명은 또한 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2)의 적어도 하나의 합성 사카라이드에 대항하는 항체에 관한 것이다. 항체는 모노클로날 하이브리도마(monoclonal hybridoma)에 의해서 생성된다. 항체는 폐렴, 수막염, 중이염(otitis media), 균혈증(bacteremia) 및 만성 기관지염(chronic bronchitis)의 급성 악화, 부비동염(sinusitis), 관절염(arthritis) 및 결막염(conjunctivitis)의 진단, 예방 및 치료를 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단, 예방, 및 치료를 위한 약제 또는 장치의 제조를 위한 항체의 용도이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제제 뿐만 아니라 하이브리드 항체, F(ab')₂ 단편, F(ab) 분자, 단일 도메인 항체 및 모체 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 이의 기능성 단편을 포함하는 제제를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f 또는 이의 항체가 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 질환의 치료 또는 방지를 위한 약제학적 조성물, 특히, 백신을 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 사카라이드 또는 이의 항체는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 질환의 치료 또는 방지를 위해서 사용될 수 있다.

추가로, 본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위한 면역학적 분석에서 본 발명에 따른 화학식 (I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2) 중의 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f 또는 본 발명의 적어도 하나의 사카라이드에 대항하는 적어도 하나의 항체의 용도를 나타낸다.

그러한 분석은, 예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 질환의 진단에 유용한 마이크로어레이(microarray) 및 ELISA를 포함한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 질환의 진단을 위한 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2)의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f 중 어느 하나의 용도를 나타낸다.

화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2)의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f 또는 그러한 사카라이드의 혼합물 중 어느 하나가 마이크로어레이 표면 또는 어떠한 다른 표면에 고정화될 수 있고 헤모필루스 인플루엔자 타입 b를 검출하기 위한 시험관내 방법에 사용될 수 있다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b를 확인하기 위한 방법은 본 발명의 적어도 하나의 사카라이드의 용도를 포함한다. 추가로, 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2)의 합성 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f 또는 그러한 사카라이트의 혼합물이 면역분석을 위한 분석 표준으로서 사용될 수 있다.

진단 장치

본 발명의 또 다른 양태는 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드, 바람직하게는 화학식(II-1), (II-2), (II-3), (II-4)의 사카라이드, 더욱 바람직하게는 화학식(III-1), (III-2), (IV-1), 및 (IV-2)의 사카라이드, 바람직하게는 사카라이드 1f, 2a, 2b, 2b', 2c, 2f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 6a, 6b, 6c, 6f, 8a, 8b, 8c 및 8f를 포함하는 고체 지지체에 관한 것이다.

이러한 고체 지지체는 바람직하게는 진단 장치의 일부이다. 고체 지지체 및 진단 장치는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위해서 사용되며, 여기에서, 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드는 바람직하게는 공유결합에 의해서 상기 고체 지지체에 고정화된다.

본 발명의 다른 구체예는 고체 지지체가 유리 슬라이드, 유리 플레이트, 미세역가 플레이트, 미소구체, 또는 비드(bead)를 포함하는 군으로부터 선택되는 진단 장치이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드가 연결 분자를 사용하여 공유결합되는 진단 장치이다.

더욱이, 본 발명은 화학식(I)에 따른 사카라이드가 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염에 대한 면역학적 분석에 사용될 수 있다.

그러한 분석은, 예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단에 유용한 마이크로어레이 및 ELISA를 포함한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위한 화학식(I)의 사카라이드의 용도를 나타낸다.

본 발명에 따른 사카라이드(I)는 공유결합에 의해서 고체 지지체에 고정화된다. 고체 지지체 상에 비결합된 또는 고정화된 적어도 하나의 합성 사카라이드 (I)가 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위해서 사용된다.

헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위한 사카라이드(I)의 용도는 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드에 특이적인 항체의 존재의 검출을 기반으로 한다. 따라서, 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 진단 장치는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위해서 사용된다.

추가로, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염을 위해서 사용되는 화학식(I)의 사카라이드는 실질적으로 순수하고, ≥ 95%, 바람직하게는 ≥ 96%, 더욱 바람직하게는 ≥ 97%, 더욱더 바람직하게는 ≥ 98%, 가장 바람직하게는 ≥ 99%의 순도를 갖는 것이 바람직하다.

화학식(I)의 사카라이드가 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단에 사용되는 분석 시스템의 선택에 대한 여러 가능성이 있다. 본 발명에 따른 진단 목적으로 수행되는 분석은 고체-상 효소 면역분석(solid-phase enzyme immunoassay: EIA), 효소 연결된 면역흡착 검사(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 특히, "간접" ELISA 또는 방사면역분석(radioimmune assay: RIA)과 같은 면역 분석일 수 있다. 그러한 분석에서의 화학식(I)의 사카라이드의 사용의 경우에, 고체 지지체 상에 화학식(I)의 사카라이드를 고정화시키는 것을 필요로 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예는 적어도 하나의 사카라이드(I)가 링커 또는 스페이서를 통해서 공유결합에 의해서 고정되는 고체 지지체이다. 본 발명의 다른 구체예는 -O-L-NH₂ 기의 질소 원자를 통해서 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 공유 결합시킴으로써 고정되는 사카라이드이다(도 2의 (B))

따라서, 화학식(I)의 사카라이드는, 특히, 진단 적용을 위해서, 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 본 발명의 한 가지 바람직한 구체예는 공유결합에 의해서 고체 지지체 상에 고정화된 화학식(I)의 사카라이드이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 직접적인 또는 간접적인 공유결합에 의해서 고체 지지체 상에 고정화된 화학식(I)의 사카라이드이다. 그에 따라서, 직접적인 공유결합이 특히 바람직하다.

추가로 바람직하게는 고체 지지체는 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트, 시험 튜브, 미소구체, 나노입자 또는 비드를 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된다.

고체 지지체는 유리 슬라이드 또는 미세역가 플레이트인 것이 특히 바람직하다. 미세역가 플레이트 또는 마이크로플레이트 또는 마이크로웰 플레이트는 작은 시험 튜브로서 사용되는 복수의 "웰(well)"을 갖는 평탄 플레이트이다. 전형적으로는, 6, 24, 96, 384 또는 심지어 1536개의 샘플 웰을 갖는 미세역가 플레이트가 사용될 수 있다. 마이크로플레이트는 PCR을 위해서 사용되는 미세역가 플레이트용 폴리카르보네이트와 같은 많은 다양한 물질로부터 생산된다. 가장 일반적인 것은 대부분의 광학 검출 마이크로플레이트용으로 사용되는 폴리스티렌이다. 그것은 광학 흡수 또는 발광 검출을 위한 이산화티탄의 첨가에 의해서 백색으로 착색되거나 형광 생물학적 분석을 위한 탄소의 첨가에 의해서 검은색으로 착색될 수 있다.

본원에서 사용되는 "직접적인 공유결합"은 화학식(I)의 사카라이드의 작용기를 고체 지지체가 제조되는 재료의 작용기와 반응시킴으로써 화학식(I)의 화합물을 고정화시킴을 나타낸다. 화학식(I)의 사카라이드의 작용기는 -O-L-NH₂ 내의 상기 정의된 아민인 것이 바람직하다. 고체 지지체의 가능한 반응성 작용기는 페닐, 아미노 기, 하이드록실 기, 티올, 카르보닐, 카르복실, 비닐, 할라이드, 예컨대, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드, 말레이미드; 석신이미드 에스테르일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "간접적인 공유결합"은 화학식(I)의 사카라이드가 고체 지지체에 대한 고정화를 매개하는 두 번째 화합물에 공유 결합되는 고체 지지체 상의 화학식(I)의 사카라이드의 고정화를 나타낸다. 이러한 두 번째 화합물은 면역 반응을 유발하지 않은 단백질인 것이 바람직하다. 두 번째 화합물 자체는 거짓 양성 결과를 피하기 위해서 환자의 혈액 또는 혈청에 존재하는 어떠한 항체에 의해서 아마 결합되지 않는 것이 중요하다. 추가로, 두 번째 화합물은 공유결합 또는 비공유 결합에 의해서 고체 담체 상에 고정화되는 것이 가능해야 한다. 이러한 두 번째 화합물은 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HAS), 젤라틴 또는 카제인을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 따라서, 간접적인 공유결합을 이용한 고정은 바람직하게는 두 번째 화합물로서 단백질에 대한 화학식(I)의 사카라이드의 공유결합(예, 단백질의 자유 아미노 기를 사용함) 및 후속적으로 고체 지지체와 단백질 사이의 공유결합 또는 비공유 상호작용에 의한 고체 지지체에 대한 단백질의 결합을 나타낸다. 가능한 비공유 상호작용은 수소결합, 이온결합, 판데르 발스 힘(van der Waals force), 및 소수성 상호작용이다. 많은 폴리머, 예컨대, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌은 본래 소수성이다. 그럼에도 불구하고, 또한, 상이한 부착 조건에 최적화된 특수 표면을 갖는 고체 지지체를 제공하는 제조자들이 있다.

그러나, 특히, 간접적인 공유결합을 사용하는 고정화가 또한 강한 유착에 의해서 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 효과적인 고정화는 화학적 결합에 의해서 실현될 수 있을 뿐만 아니라, 물리흡착과 관련된 고정화에 의해서 비결합될 수 있다. 물리흡착의 중요한 특징은 접착을 위한 힘이 반 데르 발스 힘에 의해서 유발된다는 현상이다. 용어 "비결합"은 공유결합이 아닌 다른 결합을 나타낸다.

본 발명에 따른 고정화 형태로서의 화학흡착은 고체 지지체와 화학식(I)의 사카라이드 사이의 화학적 결합을 이용한다. 그러한 결합은 공유결합일 수 있지만 또한 이온 결합일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 고체 지지체 상의 화학식(I)의 사카라이드의 고정화는 직접적인 공유결합, 즉, 이들 두 반응물 사이의 화학적 반응에 의해서, 바람직하게는, 치환 반응에 의해서 실현된다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 고체 지지체는 본 발명의 화합물과의 반응시에 고체 지지체를 이탈할 수 있는 작용기로 개질된다. 그러한 작용기는 고체 지지체의 구성 분자에 직접적으로 결합될 수 있거나, 고체 지지체의 구성 분자에 직접적으로 결합되는 링커에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 고체 지지체는 적합한 이탈기를 갖도록 개질된다. 적합한 이탈기는 할라이드, 예컨대, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 하이드록사이드, 옥심, 말레이미드, 석신이미드, 알코올 및 에스테르일 수 있다. 그러한 이탈기는 말레이미드; α-요오도아세틸; α-브로모아세틸; N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS) 및 2-피리딜디티올에 있거나 그에 통합될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 고체 지지체 상의 이탈기는, 바람직하게는 프로톤 교환 시에, 아민, 알코올 및 티올과 반응할 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 고체 지지체는, N-하이드록시석신이미드로서 본 발명의 화합물과 반응 시에 고체 지지체를 이탈하게 되는, 석신이미딜 하이드록사이드 작용기, 더욱 바람직하게는 N-석신이미딜 하이드록사이드로 작용성화된다.

적합한 이탈기의 도입에 의한 고체 지지체의 개질은 바람직하게는 반응성 이작용성 분자와의 비개질된 담체의 반응, 바람직하게는 두 작용기 사이의 분자 브릿지 또는 스페이서 아암과의 이작용성 분자의 반응에 의해서 수행된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 고체 지지체와 잘 반응하는 작용기는 설포석신이미드 에스테르 및 석신이미드를 포함한다.

이작용성 연결 분자의 한 가지 추가의 바람직한 양태에서, 화학식(I)의 사카라이드와 결합하는 것을 의미하는 작용기를 제공하는 능력은 고체 담체에 대한 적절한 거리이다. 그러한 적절한 거리는 적합한 길이의 분자 브릿지 또는 스페이서 아암에 의해서 제공된다. 그러한 분자 브릿지 또는 스페이서 아암은 바람직하게는 3 Å (10^-10 m) 내지 10 nm, 더욱 바람직하게는 5 Å 내지 50 Å, 가장 바람직하게는 6 Å 내지 30 Å의 길이를 가질 수 있다.

고체 지지체의 개질을 위한 적합한 반응성 이작용성 분자는 N-(γ-말레이미도부티릴옥시) 설포석신이미드 에스테르(설포-GMBO), 석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAN), 석신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시석신이미드(PEG-4-SPDP)를 포함한다.

또한, 공유결합을 위해서 도입되는 반응성 작용기를 갖는 폴리머로부터 제조된 상업적으로 이용 가능한 고체 지지체가 존재한다. 한 가지 예는 이차 아민기를 통한 공유결합이 가능한 Thermo scientific에 의한 명칭 CovaLink™ NH의 마이크로플레이트이다.

본 발명의 또 다른 양태는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 수막염, 폐렴, 및 후두덮개염의 진단을 위한 공유결합에 의해서 고체 지지체 상에 고정화된 적어도 하나의 합성 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 진단 장치의 용도이다.

키트

본 발명의 일 구체예는 공유 결합에 의한 고체 지지체 상에 고정화된 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드 또는 고체 지지체 상의 고정화를 위한 화학식(I)의 사카라이드를 포함하는 키트에 관한 것이다. 적어도 하나의 화학식(I)의 사카라이드는 상기 분석에서 마커(marker)로서 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중 어느 한 화학식의 사카라이드에 대항하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.

분자 생물학에서 또는 의학적 진단에서의 키트는 특정의 방법 또는 단일 단계를 수행하기 위한 모든 필요한 성분을 포함하는 패키지(package)이다. 어떠한 표준 분자 생물학 또는 의학적 실험실에서 존재하는 표준 화학물질은 일반적으로 포함되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이들 표준 화학물질 중 일부가 진단 또는 고정화를 적절히 수행시키기 위해서 불가피할 수 있다. 모든 성분은 과학적, 진단적 및 산업적 적용의 대부분을 위한 요망되는 반응의 적절한 수행을 가능하게 하는 양으로 제공되는 것으로 이해될 것이다.

흔하지만 항상 그러하지는 않은, 이들 성분은 미리 제조된 사용 준비된 용액이거나 사용 준비된 용액에 가까운 용액으로 제공된다. 이미 함께 첨가된 다른 성분의 조합이 또한 있을 수 있다. 추가의 이점은 그러한 키트가 검증된 것을 사용하는 것이다. 따라서, 작업자는 진단방법의 실행 가능성을 다시 입증할 필요가 없고 적어도 일부 대조 실험을 절약할 수 있다. 따라서, 키트는 연구, 진단 및 산업에서의 실험실에서 매우 인기있는 도구이다.

본 발명에 따른 그러한 키트는 적어도 하기 성분, 즉,

A) 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 적어도 하나의 사카라이드가 고정화되는 고체 지지체

B) 검출 항체와 같은 적어도 하나의 항체

C) 표준 용액을 포함하거나,

본 발명에 따른 키트는 적어도 하기 성분, 즉,

A') 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드에 대항하는 적어도 하나의 항체가 고정화되는 고체 지지체

B) 검출 항체와 같은 적어도 하나의 추가의 항체

C) 표준 용액을 포함할 것이다.

하기 성분이 또한 그러한 키트에 포함될 수 있다:

D) 블로킹 용액(blocking solution)

E) 세척 용액

F) 샘플 완충제

키트 내의 항체는 포획 항체로서 사용될 수 있는 특이적 항체일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 그것은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 검출 항체로서 사용되는 적어도 효소-연결된 이차 항체이다. 정량적인 측정을 위해서, 샘플의 광학 밀도(OD) 또는 형광이 표적 분자의 공지된 농도 용액의 일련의 희석액(표준 용액)인 표준 곡선과 비교된다. 블로킹 용액은, 항원에 의해서 비코팅된 상태로 유지되는 웰내의 어떠한 플라스틱 표면을 블로킹하기 위해서 첨가되는, 비-반응 단백질, 예컨대, 소 혈정 알부민 또는 카제인의 용액일 수 있다. 세척 용액은 비결합된 성분들을 제거하기 위해서 사용된다. 샘플 완충제는 환자의 샘플(혈액, 혈청, 요(urine))를 희석시켜서, 표적 분자의 농도가 사용되는 시험 시스템에 의해서 일반적으로 검출될 수 있는 범위에 있게 하기 위해서 사용될 수 있다.

키트가 고체 지지체 상의 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 사카라이드의 고정화를 가능하게 해야 한다면, 키트는 적어도,

A) 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2) 중의 어느 한 화학식의 적어도 하나의 사카라이드, 또는 화학식(I), (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-1), (III-2), (IV-1) 및 (IV-2)의 적어도 하나의 합성 사카라이드에 대항하는 항체,

B) 미세역가 플레이트 또는 마이크로어레이 슬라이드와 같은 고체 지지체를 포함해야 한다.

그렇게 함으로써, 고체 지지체는 개질될 수 있고, 예를 들어, 고체 지지체는 상기 기재된 바와 같이 링커 분자로 작용성화될 수 있다.

하기 성분이 또한 그러한 키트에 포함될 수 있다:

C) 블로킹 용액

D) 세척 용액

E) 반응 완충제

도 1: 본 발명에 따른 상업적으로 이용 가능한 상호연결 분자.
도 2: (A) 담체 단백질와 컨주게이션된 사카라이드; (B) 고체 지지체 상에 컨주게이션된 사카라이드.
도 3: CRM₁₉₇ 및 시스테인에 컨주게이션된 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 테트라머 29의 합성 도식.
도 4: (A) 20 시간 동안의 0.1 M 수산화나트륨 용액에 의한 처리 후의 단편화된 Hib CPS 및 (B) 참조로서 비처리된 Hib CPS의 ¹H NMR 스펙트럼. 비교는 Hib CPS가 염기성 조건하에 20 시간 이내에 완전히 가수분해됨을 나타내고 있다.
도 5: 20 시간 동안의 0.1 M 수산화나트륨 용액에 의한 처리 후의 단편화된 Hib CPS의 (도 5a) HPLC 크로마토그램 및 (도 5b) ESI 질량 스펙트럼.
도 6: 37 ℃에서 (A) 7일 동안 및 (B) 2일 동안 뿐만 아니라, 실온에서 (D) 7일 동안 및 (E) 2일 동안 Alhydrogel®로 처리된 후의 Hib CPS의 HPLC 크로마토그램. 비처리된 Hib CPS의 HPLC 크로마토그램은 (C)에 도시된다.
도 7: 37 ℃에서 7일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 알루미늄 포스페이트, (C) 물로 처리된 후의 화합물 16의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D) 및 (E)에 도시되어 있다.
도 8: 2-8 ℃에서 7일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 알루미늄 포스페이트, (C) 물로 처리된 후의 화합물 16의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D) 및 (E)에 도시되어 있다.
도 9: 실온에서 7일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 알루미늄 포스페이트, (C) 물로 처리된 후의 화합물 16의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D) 및 (E)에 도시되어 있다.
도 10: 70℃에서 7일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 알루미늄 포스페이트, (C) 물로 처리된 후의 화합물 16의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D) 및 (E)에 도시되어 있다.
도 11: 실온에서 14일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 포스페이트 완충액, (C) 물로 처리된 후의 화합물 30의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 30, 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D), (E) 및 (F)에 도시되어 있다.
도 12: 2-8 ℃에서 14일 동안 (A) Alhydrogel®, (B) 포스페이트 완충액, (C) 물로 처리된 후의 화합물 30의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 30, 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (D), (E) 및 (F)에 도시되어 있다.
도 13: (A) 3일 동안 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 처리한 후의 화합물 30; (C) 3일 동안 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 처리한 후의 화합물 16의 HPLC 크로마토그램. 미처리 화합물 30, 16 및 8의 HPLC 크로마토그램이 (B), (D) 및 (E)에 도시되어 있다.
도 14: (도 14a) CRM₁₉₇에 컨주게이션된 화합물 30의 MALDI 질량 스펙트럼 및 (도 14b) 화합물 94의 MALDI 질량 스펙트럼.
도 15: 포스페이트 완충액의 존재하에 화합물 94의 HPLC-SEC 크로마토그램.
도 16: 컨주게이트 94의 구조를 도시함.
도 17: 글리칸(Glycan) 어레이 분석: (도 17a) 21일 후의 Hib PRP 억제제의 존재(회색 막대) 하의 또는 억제제 없는(검은색 막대) 상태에서 항체 (Hib 인간 기준 혈청)에 대한 화합물 19, 24, 29, 53 및 62의 결합; (도 17b) 21일 후의 Hib PRP 억제제의 존재(회색 막대) 하에 또는 억제제 없는(검은색 막대) 상태에서 항체 (토끼 유형화 혈청)에 대한 화합물 19, 24, 29, 53 및 62의 결합; 35일 후의 화합물 94 (도 17c) 및 Alhydrogel과의 화합물 94 (도 17d)에 의한 면역화에 의해서 상승된 항체에 대한 화합물 19, 24, 29, 53, 62 및 참조로서의 천연 Hib PRP의 결합. 오차 막대는 4 중의 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
도 18: ELISA 연구: 0 일 (도 18a - 음성 대조군), 14 일 (도 18b), 21 일 (도 18c) 및 35 일(도 18d) 후의 본래의 Hib PRP 항원으로 코팅된 플레이트에 대한 보조되지 않은 (unadjuvanted) 컨주게이트 94(■), Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94(▲), PBS/Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94(●) 및 HiberiX®로 보조된 컨주게이트 94(▼)로 면역화된 토끼(n = 4)로부터의 IgG 항체의 결합. 혈청은 1% BSA-PBS로 5-배 희석되었다. 희석된 혈청(100 μL)을 1 μg의 Hib-PRP 폴리사카라이드로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰마다 첨가하고, 1 : 10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-토끼 이차 항체로 검출하고, TMB를 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어(graphpad prism software)를 사용하여 블롯팅시켰다.
도 19: ELISA 연구: 0 일 (도 19a - 음성 대조군), 14 일 (도 19b), 21 일 (도 19c) 및 35 일(도 19ㅇ) 후의 자연 Hib PRP 항원으로 사전 코팅된 상업적 ADi 플레이트에 대한 보조되지 않은 (unadjuvanted) 컨주게이트 94(■), Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94(▲), PBS/Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94(●) 및 HiberiX®로 보조된 컨주게이트 94(▼)로 면역화된 토끼(n = 4)로부터의 IgG 항체의 결합. 혈청은 1% BSA-PBS로 5-배 희석되었다. 희석된 혈청(100 μL)을 1 μg의 Hib-PRP 폴리사카라이드로 코팅된 미세역가 플레이트의 웰마다 첨가하고, 1 : 10000으로 희석된 HRP 컨주게이션된 염소 항-토끼 이차 항체로 검출하고, TMB를 사용하여 전개시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어(graphpad prism software)를 사용하여 블롯팅시켰다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 입증하기 위해서 포함된다. 이하의 실시예에서 개시되는 기술은 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 본 발명의 발명자에 의해서 발견된 기술을 나타내고 있으며, 그에 따라서 그 실행에 바람직한 모드를 구성하는 것으로 여겨질 수 있다는 것이 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 그러나, 통상의 기술자는, 본 발명의 개시내용 면에서, 많은 변화가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 개시되고 유사한 결과를 여전히 얻고 있는 특정의 구체예 내에서 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
추가로, 본 발명의 다양한 양태의 변형 및 대안적인 구체예는 본 발명의 설명의 면에서 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 따라서, 이러한 설명은 단지 예시하는 것으로 해석되어야 하며 본 발명을 수행하는 일반적인 방법을 통상의 기술자에게 교시하기 위한 것이다. 본원에서 도시되고 기재된 본 발명의 형태는 구체예의 예로서 취해지는 것으로 이해되어야 한다. 요소 및 재료가 본원에서 예시되고 기재된 것에 대해서 대체될 수 있으며, 부분 및 공정은 역전될 수 있고, 본 발명의 특정의 특징이 독립적으로 이용될 수 있으며, 모두가 본 발명의 이러한 설명의 이익을 얻은 후의 통상의 기술자에제는 자명할 것이다. 하기 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 기재된 요소에서 변화가 이루어질 수 있다.

실시예

화학적 합성

약어:

TLC: 박층 크로마토그래피, EtOAc: 에틸 아세테이트, DCM:디클로로메탄, RBF: 둥근 바닥 플라스크, ACN: 아세토니트릴, AcOH: 아세트산, TBAF: 테트라부틸암모늄 플루오라이드, BnBr: 벤질 브로마이드, DMAP: 디메틸아미노피리딘, PTFE: 폴리테트라플루오로에틸렌, AIBN: 아조비스이소부티로니트릴, THF: 테트라하이드로푸란, NAP: 2-나프틸메틸, Lev: 레불리닐.

화학적 합성을 위한 일반적인 정보

상업적 시약은 주석이 붙은 경우를 제외하고는 추가의 정제 없이 사용하였다. 용매는 통상적인 방식으로 사용 전에 건조되고 재증류되었다. 모든 반응은 달리 주지되지 않는 한 불활성 대기 하에 오븐-건조된 유리제품에서 수행되었다. 분석용 박층 크로마토그래피(TLC)는 0.25 mm 두께의 실리카겔로 사전 코팅된 Kieselgel 60 F254 알루미늄 플레이트 상에서 수행되었다. TLC 플레이트는 UV 광에 의해서 및 Hanessian 용액(수성 황산 중의 세릭 설페이트(ceric sulfate) 및 암모늄 몰리브데이트) 또는 황산-에탄올 용액으로 염색시킴으로써 가시화되었다. 컬럼 크로마토그래피는 Fluka Kieselgel 60(230-400 mesh) 상에서 수행되었다. 광학 회전(Optical rotation: OR)은 g/100 mL로 표현되는 농도에서 Schmidt & Haensch UniPol L1000 편광계로 측정되었다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 내부 표준으로서 Me₄Si와 함께 Varian 400-MR 또는 Varian 600 분광계로 측정되었다. NMR 화학 이동 (δ)은 ppm으로 기록되었으며, 결합상수(J)는 Hz로 기록되었다. 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS)은 Agilent 6210 ESI-TOF 질량 분광계에 의해서 기록되었다.

일반적인 절차 A) 디실릴옥시 탈보호

TBAF(0.21 mL, 0.21 mmol) 및 AcOH(7 μL, 0.11 mmol)를 아르곤 대기하에 10 mL RBF(오븐 건조됨) 중의 실온에서 THF(1.5 mL) 중의 출발물질(0.073 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4 시간(h) 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 출발 물질의 완전한 소모 후에, 반응 혼합물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고,진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(20-60%)를 사용하는 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일을 생성시켰다.

일반적인 절차 B) Bu ₂ SnO을 사용한 벤질화

Ag₂O(0.116 g, 0.5 mmol) 및 BnBr(8 μL, 0.07 mmol)을 아르곤 대기하에 10 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 실온에서 DCM(1 mL) 중의 출발물질(0.063 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 출발 물질의 완전한 소모 후에, 반응 혼합물을 DCM(30 mL)으로 희석시키고, 셀라이트 패드를 통해서 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-50%)를 사용하는 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일을 생성시켰다.

Bu₂SnO(2.42 g, 9.73 mmol)를 교반 막대가 구비된 아르곤 대기 하에 실온에서 1400 rpm의 교반과 함께 톨루엔(50 mL) 중의 디올 출발물질(4.6 g, 6.48 mmol)의 투명한 용액에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 130℃에서 6 시간 동안 환류하에 유지시켰다. 6 시간 후에, 용매를 진공 하에 제거하고, 반응물을 톨루엔 (5 X 10 mL 무수 톨루엔)과 함께 공비 건조시켰다. 용매의 완전한 제거 후에, 아세탈을 진공 하에 20분 동안 건조시켰다. 아세탈을 아르곤의 존재하에 진공으로부터 제거하고, DMF(50 mL)에 용해시켰다. 이러한 용액에 BnBr(1.16 mL, 9.73 mmol) 및 TBAI(4.78 g, 12.96 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 100℃에서 교반하면서 20 시간 동안 유지시켰다. 반응을 TLC(n-헥산 중의 40% EtOAc)에 의해서 모니터링하였다. 20 시간 후에, 반응 혼합물을 EtOAc(50 mL) 및 물(20 mL)로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, EtOAc(2 x 30 mL)로 세척하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄(~2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(구배, 0 내지 30%)를 사용하여 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 시험 튜브로부터의 용매의 농축은 무색 오일(3.8 g, 73%)을 생성시켰다.

일반적인 절차 C) Lev에 의한 보호

아르곤 대기하에 25 mL RBF 내의 DCM (3 mL) 중의 하이드록실 화합물(0.195 mmol)의 용액에, 레불린산(0.3 mmol, 30 μL), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.3 mmol, 58 mg) 및 DMAP(0.2 mmol, 24 mg)를 첨가하였다. 생성되는 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 출발물질의 완전한 소모 후에, 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석시키고, 염수(5 mL)로 세척하였다. 수성층을 DCM(2 x 5 mL)에 의해서 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-50%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 용매의 진공 중의 농축은 백색 오일을 생성시켰다.

일반적인 절차 D) NAP 탈보호

아르곤 대기하의 10 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 디클로로메탄:H₂O(1.8 : 0.2 mL) 중의 NAP 보호된 화합물(0.048 mmol)의 용액에 0℃에서 2.3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(14 mg, 0.058 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(5 mL) 및 염수(5 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 15분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-80%)을 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 백색 오일을 생성시켰다.

일반적인 절차 E) 포스페이트 커플링: 포스포르아미다이트 방법

아르곤 대기 하의 25 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 DCM(1.2 mL) 중의 3-OH 화합물(0.054 mmol)의 용액에 비스(디이소프로필아미노)-벤질옥시포스핀(0.108 mmol) 및 디이소프로필암모늄 테트라졸리드(0.081 mmol)를 첨가하고, 용액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 DCM(10 mL)로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시켰다. 수성층을 DCM(2 x 5 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(5 mL)로 세척하고, Na₂SO₄(0.5 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-30%) 및 2% 트리에틸아민을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼 2 X 10 cm) 상에서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 황색 오일을 생성시켰다. 생성물을 톨루엔(5 mL)을 사용하는 더 작은 RBF(10 mL)에 옮겼고, 20분 동안의 진공 하의 용매의 증발은 백색 오일을 생성시켰다. 생성물을 10분 동안 높은 진공 중에 방치하고, 아르곤으로 세정하고, 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다. 아르곤 대기 하의 10 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 DCM(1.2 mL) 중의 포스포르아미다이트(0.054 mmol)의 용액에 5-OH 화합물 (0.036 mmol) 및 ACN (0.24 mL, 0.108 mmol) 중의 테트라졸 0.45 M 용액을 첨가하였고, 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 데칸 중의 t-부틸 퍼옥사이드 5.0 - 6.0 M 용액(0.015 mL, 0.072 mmol)을 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM(10 mL)으로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(5 mL)으로 켄칭시켰다. 수성층을 DCM(2 x 5 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(5 mL)로 세척하고, Na₂SO₄(0.3 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 회전 증발기의 35℃ 배쓰(bath) 온도에서 15분 동안 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 n-헥산 중의 EtOAc(0-80%)을 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일을 생성시켰다.

일반적인 절차 F) 링커와의 포스페이트 커플링: 포스포르아미다이트 방법(원 폿(one pot) 과정)

아르곤 대기 하의 10 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 DCM(1.0 mL) 중의 하이드록실 화합물(0.016 mmol)의 용액에 비스(디이소프로필아미노)-벤질옥시포스핀(0.032 mmol) 및 디이소프로필암모늄 테트라졸리드(0.024 mmol)를 첨가하고, 용액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 링커(0.097 mmol) 및 ACN 중의 테트라졸 0.45 M 용액(0.11 mL, 0.049 mmol)을 첨가하였고, 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 이어서, 데칸 중의 t-부틸 퍼옥사이드 5.0 - 6.0 M 용액(0.006 mL, 0.032 mmol)을 실온에서 첨가하였고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 DCM(5 mL)으로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(3 mL)으로 켄칭시켰다. 수성층을 DCM(2 x 3 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(3 mL)로 세척하고, Na₂SO₄(0.2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 n-헥산 중의 EtOAc(0-80%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일을 생성시켰다.

하기 링커가 합성에서 사용되었다:

일반적인 절차 G) Lev 탈보호

DCM(2 mL) 중의 Lev 보호된 화합물(0.060 mmol)의 용액에, 아세트산(0.08 mL) 및 피리딘(0.12 mL)에 용해된 하이드라진 하이드레이트(0.267 mmol, 13 μL)의 용액을 첨가하였다. 생성되는 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세톤(0.5 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 용매를 진공하에 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-80%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 백색 오일을 생성시켰다.

일반적인 절차 H) 수소첨가

교반 막대가 구비된 10 mL 둥근 바닥 플라스크에서의 EtOAc:MeOH:H₂O:AcOH (1.0:0.5:0.25:0.125, 1.825 mL) 중의 보호된 화합물(20 mg)의 용액에 탄소상 팔라듐(20 mg)을 첨가하였다. 벌룬을 사용하여, 용액을 수소로 2 분 동안 세정하고 수소압하에 실온에서 40시간 동안 교반시켰다. 반응물을 PTFE 필터(0.45 μM)를 통해서 여과하고, 플라스크를 H₂O:MeOH 용액(1:1, 5 mL)을 사용하여 세척하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 100% H₂O, H₂O:MeOH (1:1) 및 100% MeOH를 사용하여 SepPak C18 ec (small) 상에서 정제하였다. 동결건조기 내의 주요 생성물을 함유한 바이알로부터의 용매의 밤샌 농축은 백색 고형물을 생성시켰다.

실시예 A. 글리코실화

실시예 A-1. 화합물 4

2,3,4-트리-O-벤질-5-O-(2-나프탈레닐메틸)-1-O-D-리비톨 2(40 g, 71.08 mmol)를 무수 톨루엔과 함께 동시 증발시키고, 진공 중에서 건조시켰다. 아르곤 대기 및 교반 하의 무수 DCM(320 mL) 중의 2 의 용액을 0℃로 냉각시키고, BF₃·Et₂O(19.3 mL, 156.38 mmol)를 적가하였다. 5 분 후에, 톨루엔(480 mL) 중의 1,2,3,5-테트라-O-아세틸-β-D-리보푸라노스 1(15.08 g, 47.38 mmol)의 용액을 45 분에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 2 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 트리에틸아민(50 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM (200 mL)로 희석시켰다. 반응 혼합물을 NaHCO₃ 포화 수용액(200 mL)으로 세척하고, 수성층을 DCM(2 x 150 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 NaCl 포화 수용액(100 mL)으로 세척하고, Na₂SO₄(~20 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물 4를 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(20-30%)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제하였다. 생성물을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 황색 오일을 생성시켰다. 이어서, 생성물(31.05 g, 37.82 mmol)을 아르곤 대기 하에 250 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 메탄올(70 mL)에 재용해시키고, 매탄올 (4.09 mL, 18.91 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 25 중량% 용액을 첨가하였다. 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 Amberlite IR-120H(500 mg)의 첨가에 의해서 중화(pH 7)시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(50-100%)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제하였다. 생성물 4를 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 황색 오일(11.46 g, 2 단계에 걸쳐 35%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₂H₄₆O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 717.3040, 실측치 717.3057.

실시예 A-2. 화합물 5

1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산(8.2 g, 11.79 mmol)을 아르곤 대기 하에 100 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 아세토니트릴(70 mL) 중의 트리올 4 (3.53 g, 11.2 mmol) 및 이미다졸(3.05 mg, 44.8 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 실온에서 10분 동안 교반시킨 후에, 반응 혼합물을 물(10 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시키고, DCM(50 mL) 및 물(20 mL)로 희석시켰다. 수성층을 분리하고, DCM(2 x 30 mL)로 세척하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄(~2 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-30%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 5를 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축이 무색 오일(8.4 g, 76%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₄H₇₂N₂O₁₀Si₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 959.4562, 실측치 959.4590.

실시예 B. 2'-메톡시폴리리보실리비톨포스페이트

실시예 B-1. 화합물 6

Ag₂O(6 g, 26.0 mmol)를 아르곤 대기 하의 25 mL RBF (오븐 건조됨) 내의 MeI (6 mL) 중의 알코올 5 (3.5 g, 3.73 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5일 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 출발 물질의 완전한 소모 후에, 반응 혼합물을 DCM (50 mL)로 희석시키고, Celite® 패드를 통해서 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-20%)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일 6(3.0 g, 85%)를 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₅H₇₄N₂O₁₀Si₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 973.4718, 실측치 973.4738.

실시예 B-2. 화합물 7

일반적인 절차 A)에 따라서, 실릴화된 화합물 6을 디올 생성물 7(4.6 g, 96%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₃H₄₈O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 731.3196, 실측치 731.3217.

실시예 B-3. 화합물 8

일반적인 절차 H)에 따라서, 모노머 7을 탈보호된 모노머 8(5 mg, 67%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₁H₂₂O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 321.1162, 실측치 321.1187.

실시예 B-4. 화합물 9

벤질 브로마이드(77 mg, 0.45 mmol) 및 소듐 하이드라이드(16 mg, 0.672 mmol)를 0℃의 아르곤 대기 하의 THF:DMF(1.5:0.2, 1.7 mL) 용액 중의 디올 7(80 mg, 0.112 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 빙냉수(1 mL)로 켄칭시키고, EtOAc(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄(~0.5 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-50%)를 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 9를 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일(75 mg, 75%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₇H₆₀O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 911.4135, 실측치 911.4162.

실시예 B-5. 화합물 10

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 9를 5-하이드록실 화합물 10 (189 mg, 89%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₆H₅₂O₉Na⁺ [M+Na]⁺ 에 대한 계산치 771.3509, 실측치 771.3521.

실시예 B-6. 화합물 11

일반적인 절차 B)에 따라서, 디올 7을 벤질화된 생성물 11(3.8 g, 73%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₀H₅₄O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 821.3666, 실측치 821.3672.

실시예 B-7. 화합물 12

일반적인 절차 C)에 따라서, 3-하이드록실 중간체 11을 Lev 보호된 화합물 12(1.75 g, 97%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₅H₆₀O₁₁Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 919.4033, 실측치 919.4062.

실시예 B-8. 화합물 13

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 12를 5-하이드록실 화합물 13(1.23 g, 80%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₄H₅₂O₁₁Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 779.3407, 실측치 779.3431.

실시예 B-9. 화합물 15

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 화합물 11 및 5-하이드록실 화합물 10을 디머 15(60 mg, 95%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₀₃H₁₁₁O₂₀PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1721.7304, 실측치 1721.7393.

실시예 B-10. 화합물 16

일반적인 절차 H)에 따라서, 디머 15를 탈보호된 디머 16(5.6 mg, 77%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₁H₂₂O₉Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 681.1983, 실측치 681.2000.

실시예 B-11. 화합물 17

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 디머 15를 5-하이드록실 화합물 17 (30 mg, 60%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₂H₁₀₃O₂₀Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1581.6678, 실측치 1581.6734.

실시예 B-12. 화합물 18

일반적인 절차 E)에 따라서, 디머 17을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링키셔 디머 18(6 mg, 42%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₀₄H₁₁₉N₃O₂₃P₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1863.7641, 실측치 1863.7709.

실시예 B-13. 화합물 19

일반적인 절차 H)에 따라서, 디머 18을 탈보호된 디머 19(1.2 mg, 55%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₂₇H₅O₂₃P₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 846.2538, 실측치 846.2540.

실시예 B-14. 화합물 20

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 화합물 11 및 5-하이드록실 화합물 13을 디머 20(1.5 g, 76%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₀₁H₁₁₁O₂₂PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1729.7202, 실측치 1729.7240.

실시예 B-15. 화합물 21

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 20을 5-하이드록실 화합물 21(386 mg, 63%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₀H₁₀₃O₂₂PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1589.6576, 실측치 1589.6613.

실시예 B-16. 화합물 22

일반적인 절차 G)에 따라서, 디머 20을 3-하이드록실 디머 22(473 mg, 74%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₆H₁₀₅O₂₀PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1631.6835, 실측치 1631.6873.

실시예 B-17. 화합물 23

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22를 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 디머 23(3 mg, 30%)를 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₀₈H₁₂₁N₃O₂₃P₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1912.7764, 실측치 1912.7781.

실시예 B-18. 화합물 24

일반적인 절차 H)에 따라서, 디머 23를 탈보호된 디머 24(1.1 mg, 76%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₂₇H₅O₂₃P₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 846.2538, 실측치 846.2540.

실시예 B-19. 화합물 25

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22 및 5-하이드록실 디머 21를 테트라머 25(367 mg, 86%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₉₃H₂₁₃O₄₄P₃Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3350.3540, 실측치 3350.3531.

실시예 B-20. 화합물 26

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 테트라머 25를 5-하이드록실 테트라머 26(125 mg, 75%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₈₂H₂₀₅O44P₃Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3210.2914, 실측치 3210.2911.

실시예 B-21. 화합물 27

일반적인 절차 E)에 따라서, 테트라머 26을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 테트라머 27(35 mg, 77%)를 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₉₄H₂₂₁N₃O₄₇P₄Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3491.3844, 실측치 3492.3787.

실시예 B-22. 화합물 28

일반적인 절차 G)에 따라서, 테트라머 27을 3-하이드록실 테트라머 28(30 mg, 90%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₈₉H₂₁₅N₃O₄₅P₄Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3393.3476, 실측치 3393.3543.

실시예 B-23. 화합물 29

일반적인 절차 H)에 따라서, 테트라머 28을 탈보호된 테트라머 29(10 mg, 73%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₉H₉₇NO₄₅P₄Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1566.4181, 실측치 1566.4174.

실시예 B-24. 화합물 30

테트라머 30은 일반적인 절차 G) 및 일반적인 절차 H)에 따라서 테트라머 26로부터 2 단계로 제조된다.

실시예 B-25. 화합물 31

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22 및 5-하이드록실 테트라머 26을 헥사머 31(85 mg, 85%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₂₈₅H₃₁₅O₆₆P₅Na⁺ [M/2+Na]⁺에 대한 계산치 2496.9888, 실측치 2496.0271.

실시예 B-26. 화합물 32

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 헥사머 31을 5-하이드록실 헥사머 32(50 mg, 65%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₂₇₄H₃₀₇O₆₆P₅Na⁺ [M/2+Na]⁺에 대한 계산치 2426.9677, 실측치 2426.9977.

실시예 B-27. 화합물 33

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22 및 5-하이드록실 헥사머 32를 옥타머 33(50 mg, 77%)로 전환시켰다. ¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.86 - 7.62 (m, 4H), 7.51 - 7.35 (m, 3H), 7.37 - 7.06 (m, 195H), 5.10 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.03 (dt, J = 7.6, 4.2 Hz, 7H), 4.97 - 4.77 (m, 22H), 4.69 - 4.37 (m, 60H), 4.36 - 4.14 (m, 23H), 3.98 - 3.55 (m, 47H), 3.53 - 3.36 (m, 13H), 3.34 - 3.21 (m, 24H), 2.72 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.65 - 2.54 (m, 2H), 2.16 (s, 3H).

실시예 B-28. 화합물 34

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 옥타머 33을 5-하이드록실 옥타머 34 (35 mg, 73%)로 전환시켰다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.43 - 7.07 (m, 195H), 5.10 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.08 - 4.78 (m, 29H), 4.70 - 4.45 (m, 51H), 4.45 - 4.15 (m, 38H), 3.95 - 3.54 (m, 50H), 3.54 - 3.36 (m, 16H), 3.36 - 3.25 (m, 24H), 2.72 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.65 - 2.56 (m, 2H), 2.16 (s, 3H).

실시예 B-29. 화합물 35 - 포스포네이트 화학

아르곤 대기 하의 10 mL RBF(오븐 건조됨) 내의 DCM(2 mL) 중의 3-하이드록실 화합물 11(10 mg) 및 이미다졸(5.96 mg, 0.087 mmol)의 용액에, 0℃의 PCl₃(4.37 μL, 0.050 mmol) 및 트리에틸아민(12.28 μL, 0.087 mmol)을 첨가하였다. 5 분 후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응물을 DCM(5 mL)으로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(5 mL) 및 트리에틸암모늄 완충 용액(5 mL)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 수성층을 DCM(2 x 10 mL)으로 추출하고, 합한 유기층을 염수(5 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄(0.25 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 DCM 중의 10% MeOH를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피상에서 정제하였다. 생성물 35(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 황색 오일(10 mg, 83%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₆H₇₁NO₁₁SP⁺ [M+H]⁺에 대한 계산치 964.4765, 실측치 964.4759.

실시예 B-30. 화합물 36

H-포스포네이트 35(10 mg, 0.010 mmol) 및 화합물 13(7.85 mg, 0.010 mmol)을 피리딘(1 mL)에 용해시켰다. 이어서, 트리메틸아세틸 클로라이드(3.83 μL, 0.031 mmol)를 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 피리딘-물 (96:4, v/v; 67 μL) 중의 요오드(2.6 mg, 0.010 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 추가로 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(5 mL)로 희석시키고, Na₂S₂O₃ 포화 수용액(5 mL) 및 1.0 M TEAB 용액(5 mL)으로 세척하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(DCM/MeOH, 10:1, v/v)에 의해서 정제하여 36(5.5 g, 29%)을 무색 오일로서 수득하였다. HRMS (ESI⁺): C₉₄H₁₀₄O₂₂P⁺ [M]^-에 대한 계산치 1615.6762, 실측치 1615.7056.

실시예 C. 2'-데옥시폴리리보실리비톨포스페이트

실시예 C-1. 화합물 37

아르곤 대기 하의 25 mL RBF (오븐 건조됨) 내의 1,2-디클로로에탄(5 mL) 중의 알코올 4(860 mg, 0.92 mmol)의 용액에 티오카르보닐디이미다졸(327 mg, 1.83 mmol)을 첨가하였다. 용액을 60℃에서 64 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-30%)를 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 37(TLC를 기반으로 함)을 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 백색 오일(950 mg, 98%)을 생성시켰다. HRMS (ESI+): C₅₈H₇₄N₂O₁₀SSi₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1069.4500, 실측치 1069.4525.

실시예 C-2. 화합물 38

60℃의 아르곤 대기 하의 100 mL RBF(오븐 건조됨) 내 톨루엔(20 mL) 중의 Bu₃SnH (0.49 mL, 1.814 mmol) 및 AIBN(톨루엔 중 0.2 M, 0.46 mL, 0.091 mmol)의 용액에 톨루엔(20 mL) 중의 티오카르바메이트 37(950 mg, 0.907 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해서 모니터링하였다. 반응 혼합물을 희석시키고, NaHCO₃ 포화 수용액(10 mL)으로 켄칭시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(10 mL)로 세척하고, Na₂SO₄(0.5 g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공 하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 n-헥산 중의 EtOAc(0-50%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 38(TLC를 기반으로 함)을 포함하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일(510 mg, 61%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₈H₇₂O₉Si₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 943.4613, 실측치 943.4640.

실시예 C-2. 화합물 39

일반적인 절차 A)에 따라서, 실릴화된 화합물 38을 디올 생성물 39(330 mg, 90%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₂H₄₆O₈Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 701.3090, 실측치 701.3117.

실시예 C-3. 화합물 40

일반적인 절차 B)에 따라서, 디올 39를 벤질화된 생성물 40(260 mg, 69%)으로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₉H₅₂O₈Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 791.3560, 실측치 791.3565.

실시예 C-4. 화합물 41

일반적인 절차 C)에 따라서, 3-하이드록실 중간체 40을 Lev 보호된 화합물 41(135 mg, 82%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₄H₅₈O₁₀Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 889.3928, 실측치 889.3928.

실시예 C-5. 화합물 42

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 41을 5-하이드록실 화합물 42(95 mg, 85%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₃H₅₀O₁₀Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 749.3302, 실측치 749.3325.

실시예 C-6. 화합물 44

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 화합물 40 및 5-하이드록실 화합물 42를 디머 44(160 mg, 78%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₉H₁₀₇O₂₀PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1669.6991, 실측치 1669.6981.

실시예 C-7. 화합물 45

일반적인 절차 D)에 따라서, 디머 44를 5-하이드록실 디머 45(53 mg, 73%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₉H₁₀₇O₂₀PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1529.6365, 실측치 1529.6397.

실시예 C-8. 화합물 46

일반적인 절차 G)에 따라서, 디머 44를 3-하이드록실 디머 46(85 mg, 91%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₉₄H₁₀₁O₁₈PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1571.6623, 실측치 1571.6656.

실시예 C-9. 화합물 49

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 46 및 5-하이드록실 디머 45를 테트라머 49(96 mg, 83%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₈₉H₂₀₅O₄₀P₃Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3230.3118, 실측치 3230.3111.

실시예 C-10. 화합물 50

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 테트라머 49를 5-하이드록실 테트라머 50(50 mg, 56%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₇₈H₁₉₇O₄₀P₃Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3090.2492, 실측치 3090.2405.

실시예 C-11. 화합물 51

일반적인 절차 E)에 따라서, 테트라머 50을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 테트라머 51(41 mg, 76%)을 수득하였다. HRMS (ESI⁺): C₁₉₀H₂₁₃N₃O₄₃P₄Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3371.3421, 실측치 3371.3321.

실시예 C-12. 화합물 52

일반적인 절차 G)에 따라서, 테트라머 51을 3-하이드록실 테트라머 52(36 mg, 92%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₈₅H₂₀₇N₃O₄₁P₄Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 3273.3053, 실측치 3273.3079.

실시예 C-13. 화합물 53

일반적인 절차 H)에 따라서, 테트라머 52를 탈보호된 테트라머 53(6 mg, 70%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₅H₈₉NO₄₁P₄Na⁺ [M+Na/2]⁺에 대한 계산치 723.1879, 실측치 723.1996.

실시예 D. 2'-N,N,-디메틸아미노카르보닐폴리리보실리비톨포스페이트

실시예 D-1. 화합물 54

아르곤 대기 하에 실온의 DCM(10 mL) 중의 알코올 4(2.153 g, 2.299 mmol)의 용액에 1,1'-카르보닐디이미다졸(145 mg, 4.598 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반시켰고(이때, CDI가 완전히 용해된다), 출발물질이 완전히 소모될 때까지 TLC에서 의해서 모니터링하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 용리액으로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-100%)를 사용하는 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 54(TLC를 기반으로 함)를 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일(2.35 g, 99%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₈H₇₅N₂O₁₁Si₂ ⁺ [M+H]⁺에 대한 계산치 1031.4909, 실측치 1031.4936.

실시예 D-2. 화합물 55

모노머 54(2.396 g, 2.32 mmol)를 아르곤 대기 하의 실온에서 ACN(20 mL)에 용해시켰고, Me₂NH를 첨가하였다(1.89 g, 23.2 mmol). 반응 혼합물을 실온에서 65 시간 동안 교반시키고, TLC에 의해서 모니터링하였다. 용액을 셀라이트의 패드를 통해서 여과하고, DCM(50 mL)으로 세척하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성되는 고형물을 DCM(100 mL)에 가용화시키고, 유기 용액을 염수(100 mL)로 세척하고, Na₂SO₄(~2 g)로 건조시켰다. 유기 용매를 진공 중에서 증발시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 용리액로서 n-헥산 중의 EtOAc(0-100%)를 사용하여 자동화된 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 55(TLC를 기반으로 함)를 함유하는 시험 튜브로부터의 용매의 진공 중의 농축은 무색 오일(2 g, 85%)을 생성시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₇H₇₇NO₁₁Si₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1030.4933, 실측치 1030.4958.

실시예 D-3. 화합물 56

일반적인 절차 A)에 따라서, 실릴화된 화합물 55를 디올 생성물 56(1.1 g, 73%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₅H₅₁NO₁₀Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 788.3411, 실측치 788.3431.

실시예 D-4. 화합물 57

일반적인 절차 B)에 따라서, 디올 56을 벤질화된 생성물 57(91 mg, 16%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₂H₅₇NO₁₀Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 878.3880, 실측치 878.3930.

실시예 D-5. 화합물 58

일반적인 절차 C)에 따라서, 3-하이드록실 중간체 57을 Lev 보호된 화합물 58(46 mg, 92%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₇H₆₃NO₁₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 976.4248, 실측치 976.4318.

실시예 D-6. 화합물 59

일반적인 절차 D)에 따라서, 모노머 58을 5-하이드록실 모노머 59(23 mg, 60%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₄₆H₅₅NO₁₂Na⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 836.3622, 실측치 836.3682.

실시예 D-7. 화합물 60

일반적인 절차 E)에 따라서, 모노머 59를 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 모노머 60(19 mg, 70%)을 수득하였다. HRMS (ESI⁺): C₅₈H₇₁N₄O₁₅PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1117.4551, 실측치 1117.4628.

실시예 D-8. 화합물 61

일반적인 절차 G)에 따라서, 모노머 60을 3-하이드록실 모노머 61(12 mg, 71%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₅₃H₆₅N₄O₁₃PNa⁺ [M+Na]⁺에 대한 계산치 1019.4183, 실측치 1019.4246.

실시예 D-9. 화합물 62

일반적인 절차 H)에 따라서, 모노머 61을 탈보호된 모노머 62(3 mg, 60%)로 전환시켰다. HRMS (ESI⁺): C₁₈H₃₈N₂O₁₃PNa⁺ [M+H]⁺에 대한 계산치 521.2112, 실측치 521.2125.

실시예 E. 2'-플루오로폴리리보실리비톨포스페이트

실시예 E-1. 화합물 63

아세톤 중의 화합물 4에 2,2-디메톡시프로판(1.2 당량)을 첨가한 다음, 캄포르설폰산(0.5 당량)을 첨가하였다. 6시간 동안 교반시킨 후에, 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고, 이를 컬럼 크로마토그래피 정제하여 순수한 화합물 63을 수득하였다.

실시예 E-2. 화합물 64

화합물 63을 0℃에서 DCM 중의 트리플산 무수물 및 피리딘으로 처리하였다. 2 시간 후에, 테트라부틸암모늄 니트라이트 및 소듐 니트라이트를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 5 시간 동안 교반하였다. 생성물을 헥산(200 mL)내로 추출하였다. 추출물을 수성 수산화나트륨(2N), 염수로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)시키고, 감압하에 농축시켜 갈색 오일을 수득하였다. 플래시 크로마토그래피(헥산:에테르로 용리시킴)에 의해서 정제하여 64를 수득하였다.

실시예 E-3. 화합물 65

DAST(디에틸아미노 설퍼 트리플루오라이드)(1.2 당량)를 -78℃의 디클로로메탄 중의 64의 교반 용액에 적가하였다. 혼합물을 제 위치에서 냉각조(cooling bath)로 실온으로 밤새 가온하였다. 20 시간 후에, 용액을 얼음과 과량의 중탄산나트륨 포화용액의 격렬하게 교반된 혼합물내로 서서히 부었다. 발포가 중지된 때에, 생성물을 헥산 (200 mL)으로 추출하였다. 추출물을 수성 수산화나트륨 (2N), 염수로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)시키고, 감압하에 농축시켜 갈색 오일을 수득하였다. 플래시 크로마토그래피(헥산:에테르로 용리됨)에 의해서 정제하여 65를 수득하였다.

실시예 E-4. 화합물 66

화합물 65를 80% 아세트산에 취하고, 80℃에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료(TLC) 후에, 산성 용액을 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 화합물 66을 수득하였다.

실시예 E-5. 화합물 67

일반적인 절차 B)에 따라서, 디올 66을 벤질화된 생성물 67로 전환시켰다.

실시예 E-6. 화합물 68

일반적인 절차 C)에 따라서, 3-하이드록실 중간체 67을 Lev 보호된 화합물 68로 전환시켰다.

실시예 E-7. 화합물 69

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 68을 5-하이드록실 화합물 69로 전환시켰다.

실시예 E-8. 화합물 71

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 화합물 67 및 5-하이드록실 화합물 69를 디머 71로 전환시켰다.

실시예 E-9. 화합물 72

일반적인 절차 H)에 따라서, 디머 71을 탈보호된 디머 72로 전환시켰다.

실시예 E-10. 화합물 73

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 디머 71을 5-하이드록실 화합물 73으로 전환시켰다.

실시예 E-11. 화합물 74

일반적인 절차 E)에 따라서, 디머 73을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 디머 74를 수득하였다.

실시예 E-12. 화합물 75

일반적인 절차 H)에 따라서, 디머 74를 탈보호된 디머 75로 전환시켰다.

실시예 F. 2'-치환된 폴리리보실리비톨포스페이트

실시예 F-1. 화합물 76

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 화합물 67 및 5-하이드록실 화합물 69를 디머 76로 전환시켰다.

실시예 F-2. 화합물 77

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 중간체 76을 5-하이드록실 화합물 77로 전환시켰다.

실시예 F-3. 화합물 79

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22 및 5-하이드록실 디머 77을 테트라머 79로 전환시켰다.

실시예 F-4. 화합물 80

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 테트라머 79를 5-하이드록실 테트라머 80로 전환시켰다.

실시예 F-5. 화합물 81

일반적인 절차 E)에 따라서, 테트라머 80을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 테트라머 81을 수득하였다.

실시예 F-6. 화합물 82

일반적인 절차 G)에 따라서, 테트라머 81을 3-하이드록실 테트라머 82로 전환시켰다.

실시예 F-7. 화합물 83

일반적인 절차 H)에 따라서, 테트라머 82를 탈보호된 테트라머 83으로 전환시켰다.

실시예 F-8. 화합물 85

일반적인 절차 E)에 따라서, 3-하이드록실 디머 22 및 5-하이드록실 디머 45를 테트라머 85로 전환시켰다.

실시예 F-9. 화합물 86

일반적인 절차 D)에 따라서, NAP 보호된 테트라머 85를 5-하이드록실 테트라머 86으로 전환시켰다.

실시예 F-10. 화합물 87

일반적인 절차 E)에 따라서, 테트라머 86을 링커 5-아지도-펜탄올에 커플링시켜 테트라머 87을 수득하였다.

실시예 F-11. 화합물 88

일반적인 절차 G)에 따라서, 테트라머 87을 3-하이드록실 테트라머 88로 전환시켰다.

실시예 F-12. 화합물 89

일반적인 절차 H)에 따라서, 테트라머 88을 탈보호된 테트라머 89으로 전환시켰다.

실시예 G. 안정화된 사카라이드-CRM197-시스테인 컨주게이트의 합성

실시예 G-1. 화합물 90

컨주게이션을 위한 CRM ₁₉₇ 의 준비: 원액으로부터의 CRM₁₉₇(3.0 mg, 0.0517 μmol)을 아미콘 필터 (0.5 mL, MWCO 30KDa)에 옮기고, 10000 RPM에서 3 분 동안 원심분리하였다. 300 μL의 1X PBS를 아미콘(Amicon) 필터에 보유되는 단백질에 첨가하고 10000 RPM에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 이어서, 400 μL의 1 x PBS 완충(pH 7.4)을 아미콘 필터에 가하고 10000 RPM에서 3 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 단배질을 함유하는 필터를 새로운 아미콘 마이크로 원심분리 튜브((1.5 mL)의 내부에서 역전시키고 1000 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 마이크로 원심분리 튜브(부피~=100-120 μL) 내에 단백질을 수거하였다.

컨주게이션 절차: 1 x PBS 완충액 (~100 μL) 중의 CRM₁₉₇를 교반 막대가 구비된 실온의 반응 바이알에서 1.3 mL의 1 x PBS 완충액으로 희석시켰다. 3-(말레이미도)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(0.688 mg, 2.58 μmol)를 타입 I 유리-2 mL 반응 바이알에 옮기고, 20 μL의 DMSO로 용해시키고, 이를 1 x PBS 완충물 중의 CRM₁₉₇을 함유하는 반응 바이알에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 14 시간 동안 교반시켰다. RM은 투명한 무색 용액이었다.

세척 단계: 반응 혼합물을 아미콘 필터(0.5 mL, MWCO 30KDa)에 옮기고, 10000 RPM에서 3 분 동안 원심분리하고, 전체 반응 혼합물이 전달되고 원심분리될 때까지 과정을 반복하였다. 이어서, 400 μL의 1 x PBS 완충액을 반응 바이알에 처가하고, 세정하고, 용액을 아미콘 필터에 옮겼다. 이러한 세척은 400 μL의 PBS 완충 용액으로 4번 더 반복하였다. 마지막으로, CRM₁₉₇-말레이미드를 함유하는 아미콘 필터를 새로운 아미콘 원심분리 튜브(1.5 mL)의 내부에서 역전시키고, 1000 RPM에서 1 분 동안 원심분리하여 마이크로 원심분리 튜브 내에 ~130 μL CRM₁₉₇-말레이미드를 수거하였다. 950 μL의 PBS 용액(pH 7.4)을 그것에 첨가하고, 2-8 ℃의 바이알을 저장하였다(전체 부피 =~1.08 mL). CRM₁₉₇-말레이미드 컨주게이트를 MALDI, SDS-page, 웨스턴 블롯, SEC-HPLC 및 BCA에 의한 단백질 평가에 의해서 분석하였다. CRM₁₉₇-말레이미드 컨주게이트를 MALDI에 의해서 분석하였고, 21-24 사이인 것으로 밝혀졌다. BCA 평가는 또한 단백질의 우수한 회수를 나타냈다. SDS page는 CRM-말레이미드 컨주게이트 90는 CRM₁₉₇보다 분자량이 더 컸으며 안정하였음을 나타냈다. 웨스턴 블롯은 CRM 항-염소 항체가 CRM-컨주게이트 90를 인식하는 반면에 Hib 항-토끼 항체는 당이 없는 CRM-말레이미드 컨주게이트 90를 인식하지 않았음을 나타낸다. 샘플을 추가의 사용까지 2-8℃에서 저장하였다.

실시예 G-2. 화합물 94 사카라이드-CRM ₁₉₇ -시스테인 컨주게이트

화합물 94을 위한 합성 경로가 도 3에 개괄되어 있다.

DTT 방법: 화합물 29(5 mg, 0.003 mmol)를 pH 7.4 PBS 완충액(5 mL)에 용해시키고, DMSO(2.5 mL) 중의 DSP(디티오비스(석신이미딜 프로피오네이트))(20 mg, 0.049 mmol)를 실온에서 밤새 첨가하였다. 그 후에, 디티오트레이톨(DTT)(4 mg, 0.025 mmol)를 첨가하고, 용액을 40℃에서 추가로 2 시간 동안 교반시켰다. 화합물 91을 Sephadex G-25 컬럼 크로마토그래피(4.5 mg, 88%)를 통해서 정제하였다. HRMS (ESI⁺): C₅₁H₉₉NO₄₆P₄S [M+2Na+2K-4H]^-에 대한 계산치 1736.2793, 실측치 1736.279.

컨주게이션을 위한 사카라이드-티올 준비: TCEP 방법: 100 μL의 TCEP 현탁액을 1.5 ml 바이알에 취하였고, 300 μL의 1 x PBS 용액 (pH 7.4)을 첨가하였다. 원심분리하고, 상청 용액을 제거하였다. 이어서, PBS에 의한 세척을 한 번 더 반복하였다. 이어서, 마지막으로 잔류물을 100 μL의 PBS 용액에 취하고, 2 mL 타입 I 유리 바이알 내의 PBS 완충액(0.15 mL) 중의 당-디설파이드 91(1.38 mg, 0.292 μmol)에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 궤도 혼합기(orbital shaker)를 사용하여 가볍게 혼합하였다. RM을 바이알에 옮기고, 유리 반응 바이알을 200 μL의 PBS 용액으로 세정하고, 바이알에 옮겼다. 원심분리하고, 2 mL 타입 I 유리 바이알 내의 PBS 용액의 상청액(~325 μL)을 수거하였다. 200 μL의 PBS 용액을 잔류물에 첨가하고, 잘 혼합하고, 원심분리하고, 상청액을 수거하고, 2 mL 타입 I 유리 바이알에 다시 옮겼다. 그래서, 환원된 티올 78 용액의 전체 부피는 ~525 μL였다. ~25 μL는 분석을 위해서 유지시켰다.

컨주게이션 절차: 1X PBS 완충액 (~850 μL) 중의 CRM₁₉₇-말레이미드 90을 교반 막대가 구비된 실온의 반응 바이알에 취하였다. 1 x PBS 완충액 중의 PBS 용액 (~500 μL) 중의 사카라이드-티올 92를 CRM₁₉₇-말레이미드 90 용액에 적가하였다. 바이알을 50 μL PBS 용액으로 세정하고, 용액을 실온의 반응 혼합물에 옮겼다. RM을 투명한 용액이었고, 실온에서 20 시간 동안 교반시켰다. [~40 μL의 반응 혼합물의 분취량을 분석 목적을 위해서 취하였다]. 이어서, 포스페이트 완충액(pH 7.4, 30 μL) 중의 시스테인(0.14 mg)을 93을 함유하는 RM에 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다.

세척 단계: 94를 함유하는 반응 혼합물을 아미콘 필터(0.5 mL, MWCO 30KDa)에 옮기고, 10000 RPM에서 3 분 동안 원심분리하고, 전체 반응 혼합물이 전달되고 원심분리될 때까지 과정을 반복하였다. 이어서, 400 μL의 1 x PBS 완충액을 반응 바이알에 첨가하고, 세정하고, 용액을 아미콘 필터에 옮겼다. 이러한 세척은 400 μL의 PBS 완충 용액으로 4번 더 반복하였다. 마지막으로, CRM₁₉₇-말레이미드-사카라이드-시스테인 94를 함유하는 필터를 새로운 아미콘 원심분리 튜브(1.5 mL)의 내부에서 역전시키고, 1000 RPM에서 1 분 동안 원심분리하여 마이크로 원심분리 튜브 내에 ~150 μL CRM₁₉₇-말레이미드-당-시스테인를 수거하였다. 200 μL의 PBS 용액(pH 7.4)을 아미콘 필터에 첨가하고, 잘 세정하고, 용액을 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 용액을 750 μL의 PBS 용액 (pH 7.4)으로 희석시키고, 2-8 ℃의 바이알을 저장하였다(전체 부피 =~1100 μL). 40 μL의 컨주게이트 94의 분취량을 아미콘 필터를 사용하여 milliQ 물로 세척하고, MALDI(시나피닉 산 매트릭스(sinapinic acid matrix))을 사용하여 분석하고, 3.4 - 4.2의 부하(loading)를 얻었다. 컨주게이트 94를 추가로 SDS-Page, 웨스턴 블롯 및 SEC-HPLC를 사용하여 연속적으로 분석하였다. BCA 방법을 사용한 단백질 평가는 컨주게이트 내의 단백질의 우수한 회수를 나타냈다.

실시예 H. 안정성 시험

실시예 H-1. 염기성 매질 중의 Hib 피막 폴리사카라이드의 안정성

본 발명의 사카라이드의 안정성 연구는 안정한 액체 Hib 글리코컨주게이트 백신의 개발에 중요하다. 대조군으로서, 먼저, Hib 폴리리보실리비톨포스페이트 피막 폴리사카라이드(CPS)의 안정성 및 절단을 시험하였다. 따라서, Hib CPS는 문헌[Vaccine, 2000, 18, 1982-1993: 1 mg Hib CPS in 0.43 mL of 0.1 M NaOH, 20 h]에 기재된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 단편화시켰다. 정제(30 kDa 아미콘 필터를 통해서 여과한 다음에 탈염) 후에 얻은 단편을 ¹H NMR, HPLC 및 HRMS에 의해서 분석하였다.

도 4의 A는 단편화된 Hib CPS의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타내고, 도 4의 B는 비처리 Hib CPS의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 5a는 단편화된 Hib CPS의 HPLC 크로마토그램을 나타내고, 도 5b는 처리된 Hib CPS의 ESI 질량 스펙트럼을 나타낸다. 이러한 초기 실험 세트는 Hib CPS가 염기성 매질에서 이의 가장 작은 2 및 3-O 포스페이트 단편으로 절단되었음을 입증하였다.

실시예 H-2. 알루미늄 하이드록사이드 현탁액 중의 Hib 피막 폴리사카라이드의 안정성

대조군 Hib CPS의 안정성 데이터를 확립하고, 이어서, 알루미늄 하이드록사이드 내의 Hib CPS의 안정성을 조사하였다. 여기에서, 그것은 다양한 온도{37℃ (A1) 및 실온 (A3)}의 백신 제형{0.5 mg Hib CPS, 3 mL Alhydrogel® (Brentag) 및 22 mL milli-Q 물}에서 불안정한 것으로 공지되어 있다. 37℃에서, 가장 작은 단편으로의 절단이 2일 후에 관찰되었고, 실온에서는 이러한 패턴이 7일 후에 관찰되었다(도 6). 이러한 실험으로부터, Hib CPS는 상업적 백신에 사용되는 가장 일반적인 애주번트인 알루미늄 하이드록사이드에서 온도에 따라서 2 내지 7일에서 2 및 3-O 포스페이트 단편으로 분해됨이 확인되었다.

실시예 H-3. 화합물 16의 안정성

합성된 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 디머 16의 안정성 연구를 다양한 애주번트의 존재하에 수행하였다. 첫 번째 단계로서, 16의 안정성을 다양한 온도{37 ℃(A1), 2-8 ℃(A2), 실온(A3) 및 70 ℃(A4)}에서 Al(OH)₃, AlPO₄ 및 물을 사용하여 연구하였다.

본 연구에 사용된 Al(OH)₃ 및 AlPO₄의 양은 상업적 Hib 백신에 존재하는 양과 유사하였다. 1 주일 후의 HPLC를 사용한 상이한 온도에서의 샘플의 분석은 도 7 내지 10에 도시되어 있다. 화합물 16 및 8이 참조로서 사용되었는데, 그 이유는 디머 16의 분해가 모노머 8을 유도하기 때문이다. 24 시간 마다, 40 μL의 용액을 각각의 바이알로부터 분취하고 5000 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액(25 μL)을 HPLC 분석을 위해서 취하였다. 7일 후에도 분해가 관찰되지 않았다. 이러한 연구로부터 2'-메톡시-리보실리비톨 디머 16은 37℃(A1), 2-8℃(A2), 실온(A3) 및 70 ℃에서 안정하였음이 명확하였다.

디머 16의 안정성을 실시예 H-1에서 적용된 바와 같이 수성 염기성 조건하에 추가로 조사하였다. 도 13의 D에서의 HPLC 크로마토그램으로부터, 디머 16가 4일 후에 완전히 절단되는 반면에, 천연 Hib CPS는 20 시간 이내에 이미 완전히 절단되었다고 결론내렸다. 이는 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 올리고머가 천연 Hib CPS에 비해서 극심한 염기성 조건하에도 매우 안정함을 입증하고 있다.

실시예 H-4. 화합물 29의 안정성

링커 29를 함유하는 합성된 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 테트라머의 안정성 연구를 다양한 애주번트의 존재하에 수행되었다. 첫 번째 단계로서, 29의 안정성은 다양한 온도{2-8 ℃(A2), 및 실온(A3)}의 Al(OH)₃, 포스페이트 완충 (PBS) 및 물을 사용하여 연구하였다.

본 연구를 위해서 사용된 Al(OH)₃의 양은 상업적 Hib 백신에 존재하는 양과 유사하였다. 1 주일 후의 HPLC를 사용한 상이한 온도에서의 샘플의 분석은 도 11 및 도 12에 도시되어 있다. 화합물 29, 16 및 8이 참조로서 사용되었는데, 그 이유는 테트라머 29의 분해가 디머 16 및 모노머 8을 유도하기 때문이다. 24 시간 마다, 40 μL의 용액을 각각의 바이알로부터 분취하고 5000 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액(25 μL)을 HPLC 분석을 위해서 채취하였다. 7일 후에도, 분해가 관찰되지 않았다. 이러한 연구로부터, 2'-메톡시-리보실리비톨포스페이트 테트라머 29는 2-8 ℃(A2) 및 실온(A3)에서 포스페이트 완충액(PBS)중에서 및 물 중에서 Al(OH)₃의 존재하에 안정하다는 것이 명확하였다.

테트라머 29의 안정성을 실시예 H-1에서 적용된 바와 같이 수성 염기성 조건하에 추가로 조사하였다. 도 13의 A에서의 HPLC 크로마토그램으로부터, 테트라머 29가 4일 후에 완전히 절단되는 반면에, 천연 Hib CPS는 20 시간 이내에 이미 완전히 절단되었다고 결론내렸다. 이는 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 올리고머가 천연 Hib CPS에 비해서 극심한 염기성 조건하에도 매우 안정함을 입증하고 있다.

실시예 H-5. 포스페이트 완충액의 존재하의 컨주게이트 94의 안정성

두 바이알 내의 ~5 μg의 화합물 94를 각각 500 μL의 PBS pH 7.4에 희석시키고; 하나의 바이알은 25℃에서 저장하였고 다른 하나는 2-8℃에서 저장하였다. 샘플을 일일 후에 및 15일 후에 바이신코니닉 산 분석(bicinchoninic acid assay: BCA) 및 HPLC-SEC (컬럼: TSKgel G2000SWxl, 완충액: 50 mM Tris, 20 mM NaCl, pH 7.2)에 의해서 분석하였다. 데이터는 15일 후에도 여전히 컨주게이트 94가 두 온도 조건 25 ℃ 및 2 - 8 ℃ 모두에서 존재하였고 안정하였음을 나타냈다.

실시예 H-6. 알루미늄 하이드록사이드의 존재하의 화합물 94의 안정성

~5 μg의 화합물 94 및 Alhydrogel®(0.125 mg/투여)을 함유하는 두 바이알을 각각 500 μL까지의 PBS pH 7.4를 충전시키고; 하나의 바이알을 25℃에서 저장하였고, 다른 하나를 2-8℃에서 저장하였다. 샘플을 일일 후에 및 1 주일 후에 바이신코니닉 산 분석(BCA), HPLC-SEC(컬럼: TSKgel G2000SWxl, 완충액: 50 mM Tris, 20 mM NaCl, pH 7.2), SDS-page 및 웨스턴 블롯에 의해서 분석하였다. 데이터는 컨주게이트 94의 ~75%가 Alhydrogel® 상에 흡착되었고, 흡착된 컨주게이트는 두 온도 조건 모두에서 안정하였음을 나타냈다. 분해 생성물이 이러한 시간 과정 동안에 관찰되지 않았다.

표 1: 포스페이트 완충 및 알루미늄 하이드록사이드의 존재하의 컨주게이트 94의 BCA 분석

실시예 I. Glycan 어레이 분석

실시예 I-1. 토끼에서의 면역화

면역화 실험을 토끼에 대해서 수행하였다(Chong et al. Infect. Immun., 1997, p. 4918-4925; Fernandez-Santana et al. Science, 2004, 305 (5683), p. 522-525.). 토끼를 국제 동물 규정(EU Directive 2010/63/EU)에 따라서 하우징하고 취급하였고, 정부 기관에 의해서 제재를 받았다(Landesamt fur Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern).

각 그룹당 4 마리의 토끼로 이루어진 4 그룹을 5 μg 사카라이드 29를 함유하는 보조되지 않은 컨주게이트 94 또는 Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94(5 μg Hib 사카라이드 29를 함유함)로 프라임-부스터 요법으로 면역화시켰다. 음성 대조군에게는 PBS/Alhydrogel 만을 투여하였다. 양성 대조군에게는 승인된 백신 ActHIB® (5 μg PRP, 인간 투여량의 절반에 상응함), 파상풍 톡소이드(TT)에 대한 천연 PRP의 컨주게이트를 투여하였다. 출혈 21일(2회 면역화 후)의 면역전 혈청 및 항혈청을 채취하고 글리칸 어레이 상에서 분석하였다. ActHIB-특이적 혈청은 본 발명의 HIB의 2회 면역화와는 대조적으로 3회 투여 후에 얻어졌다.

실시예 I-2. 글리칸 어레이 분석

PBS 중의 사카라이드는 S3 microarray spotter(Scienion)를 사용하여 N-하이드록시 석신이미드 활성화된 유리 슬라이드(CodeLink slides, Surmodics) 상에 인쇄되었다. 슬라이드를 흡기 포화된 챔버에서 밤새 인큐베이션하고, 100 mM 에탄올아민, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 7.5으로 2 시간 동안 켄칭시키고, 물로 세척하고 건조시켰다.

인큐베이션을 위해서, 슬라이드를 3% (w/v) BSA-PBS로 1 시간 동안 블로킹시키고, PBS 및 물로 세척하고, 원심분리에 의해서 건조시켰다. 64웰 인큐베이션 그리드를 부착시켰다. 혈청을 3% BSA-PBS, 0.1% (v/v) Tween-20에 희석시키고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 3220 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 혈청 희석액을 슬라이드에 적용하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS + 0.1% Tween-20 (PBS-T)로 3회 세척하였다. 이차 항체(항-토끼 IgG FITC, 항-토끼 IgM AlexaFluor 647, 항-인간 IgG-Fc AlexaFluor 488 및 IgM AlexaFluor 594)를 슬라이드 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS-T로 2회 세척하고, 인큐베이션 그리드를 제거하였고, 슬라이드를 PBS 및 물로 세척하였다. 원심분리에 의한 건조 후에, 슬라이드를 GenePix 4300A (Molecular Devices) 마이크로어레이 판독기를 사용하여 스캐닝하였다.

일차 면역 반응을 0일 21일 및 35일째에 검색된 혈청 샘플의 글리칸 어레이 스크리닝에 의해서 분석하였다. 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 디머 19, 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 디머 24, 2'-메톡시리보실리비톨포스페이트 테트라머 29, 2'-데옥시리보실리비톨포스페이트 테트라머 53 및 2'-디메틸아미노카르보닐리보실리비톨포스페이트 62 뿐만 아니라 천연 Hib PRP를 NHS 에스테르-활성화된 마이크로어레이 슬라이드 상에 인쇄하였다. Alhydrogel로 보조된 및 애주번트 없는 컨주게이트 94에 의한 면역화 후에, 모든 면역화된 토끼에서의 Hib PRP 유도체 19, 24, 29, 53 및 62 뿐만 아니라 천연 Hib PRP 폴리사카라이드에 대항하는 IgG 및 IgM 서브타입의 항체가 검출되었다.

글리칸 어레이 스크리닝은 또한 인간 기준 혈청(도 17a) 및 토끼 타이핑 혈청(도 17b)에 존재하는 항-Hib 항체가 Hib PRP 유도체 19, 24, 29, 53 및 62에 결합됨을 나타냈다. 천연 Hib PRP의 존재는 2'-데옥시리보실리비톨포스페이트 53가 아닌 Hib PRP 유도체 19, 24, 29 및 62의 결합을 억제한다.

혈청 IgG 항체는 Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94에 의한 첫 번째 면역화 후 21일에, 및 보조되지 않은 컨주게이트 94에 의한 첫 번째 면역화 후에 35일에 검출 가능하였다. 천연 Hib PRP 폴리사카라이드와의 항체 교차-반응은 헤모필루스 인플루엔자 박테리아에 결합하고 헤모필루스 인플루엔자 감염증에 대항하는 보호를 부여하기 위한 이들 항체의 효능을 나타낸다.

실시예 J. ELISA 연구

- ELISA 플레이트 (높은-결합, EIA/RIA 플레이트, 96 웰, 낮은 증발 뚜껑이 있는 평판 바닥, 회사: costar® 3361)

- 상업적 토끼 항-Hib-PRP IgG ELISA 어셈블리 키트 (Alpha Diagnostic Intl. Inc, # 980-130-PRG; Lot: 170531K5, Expiry: 06/2018)

- 항원: 헤모필루스 인플루엔자 b(NIBSC, Code:12/306)로부터의 포스포리보실포스페이트(PRP) 피막 폴리사카라이드

- 시험 혈청: BioGenes GmbH에 의해서 공급됨.

- 검출 항체: 염소 항 토끼 IgG 퍼옥시다제 컨주게이트 (Sigma, #A4914 ).

- 포스페이트 완충된 식염수(PBS): 원액으로부터 인-하우스 제조 (Biochrom GmbH, Cat: L182-10)

- 블로킹 용액: PBS 중의 1 % FCS (v/v).

- 항체 희석제: PBS+1% BSA (w/v).

- 세척 완충: PBS+0.1% Tween 20 (PBS-T)

- 전개 용액: 1 stepTM Ultra TMB-ELISA 현상액. (ThermoScientific, Cat #: 34028)

- 정지 용액- 2M 황산 (H₂SO₄)(인-하우스 제조)

- 플레이트 판독기: Anthos ht 2.

소프트웨어: 흡광도 측정을 위한 WinRead 2.36 및 데이터 플롯팅 및 분석을 위한 GraphPad Prism 7.

실시예 J-1. 면역화 스케줄 및 혈청 수거

모든 면역화 실험을 BioGenes GmbH Berlin에서 수행하였다. 실험군은 i) Alhydrogel을 함유한 PBS(음성 대조군), ii) Alhydrogel이 없는 화합물 94, iii) Alhydrogel과 함께 한 화합물 94, 및 iv) 상업적 백신 HiberiX® (양성 대조군)을 포함하였다. 요약하면, 토끼(n=4)를 표 1에 언급된 바와 같은 각각의 실험군에 대한 구성물로 프라임 부스트 요법으로 면역화시켰다. 마우스를 프라임-부스트 요법 후에 면역화시키고, 0 일(면역전), 14 일, 21 일 및 35 일째에 혈청을 수거하였다.

표 2. 토끼 (n=4)의 면역화 스케줄 및 항원 투여 정보

혈청 수거 및 취급:

상이한 실험군 및 각각의 시점으로부터의 혈청을 -20℃에서 저장하였다. 특이적 실험군의 개별적인 토끼로부터의 혈청(20 μl)을 풀링(pooling)하고 -20℃에서 저장하였다. 개별적인 토끼 혈청(20 μl)를 별도의 원액으로서 분액하고 추가의 사용까지 -20℃에서 저장하였다.

실시예 J-2. 인-하우스 항원 코팅된 플레이트를 사용한 효소 연결된 면역흡착 검사 (ELISA)

항원에 의한 플레이트의 코팅:

항원, Hib PRP 피막 폴리사카라이드(원액 농도 1 mg/mL)를 PBS pH 7.4 중에 10 μg/mL의 작업 항원 농도로 희석시켰다. 100 μL를 각각의 웰(1 μg 항원/웰)에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

세척:

항원의 밤샌 흡착 후에, 플레이트를 PBS-T(200 μL/웰)로 3회 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집고 역전시켜 깨끗한 건조 티슈 타월 상에서 톡톡 두드려서 제거하였다.

블로킹:

플레이트를 300 μL의 블로킹 용액(PBS + 1% FCS)을 사용하여 실온에서 2 시간 동안 블로킹시켰다.

세척:

블로킹 후에, 플레이트를 PBS-T (200 μL/웰)로 3회 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집고 역전시켜 깨끗한 건조 티슈 타월 상에서 톡톡 두드려서 제거하였다.

혈청의 희석 및 인큐베이션:

풀링된(n=4 토끼/그룹) 면역전 및 상이한 실험군의 시험 혈청 및 개별적인 토끼 시험 혈청(n=4)을 항체 희석제(PBS+1% BSA) 중에 이들의 각각의 희석액으로 희석시켰다. 상이한 실험군의 100 μL의 희석된 혈청 샘플을 상응하는 웰에 이중으로 첨가하고, 250 rpm의 혼합기 세트 상에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 항체 희석제(PBS+1 % BSA)가 실험 블랭크를 형성시켰다. 혈청과 함께 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS-T(200 μL/웰)로 5회 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집고 역전시켜 깨끗한 건조 티슈 타월 상에서 톡톡 두드려서 제거하였다.

인큐베이션 (검출 항체):

검출 항체, 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제를 항체 희석제(PBS+1 % BSA) 중에 1:10,000으로 희석시키고, 100 μL를 웰에 첨가하고, 250 rpm으로 혼합기 상에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체와 함께 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS-T(200 μL/웰)로 5회 세척하고, 웰 당 과량의 유체를 플레이트를 뒤집고 역전시켜 깨끗한 건조 티슈 타월 상에서 톡톡 두드려서 제거하였다.

전개:

각각의 웰에, 100 μL의 사용 준비된 TMB 기질(4℃로부터 실온으로 표준화됨)을 첨가하고, 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 효소 반응의 블루 컬러를 100 μL/웰의 2M H₂SO₄용액을 첨가하여 황색 착색 용액을 생성시킴으로써 중지시켰다. 황색 용액의 흡수를 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm의 보정 파장과 함께 450 nm에서 측정하였다. 흡수 값을 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프를 플롯팅함으로써 분석하였다.

결과:

도 18a에 도시된 바와 같이, 모든 희석액에 걸친 모든 실험군의 면역전 혈청은 어떠한 유의한 반응을 나타내지 않았고, 판독값들은 0과 동일하였다. 면역후/시험 혈청에서, 14 일 HiberiX 군(역전된 삼각형)은 21 일 및 35일 군에서 1:2500의 역가까지 증가된 PBS 대조군(충전된 원)보다 상당히 더 높은 면역 반응을 나타냈다(도 18b 내지 도 18d). 보조된 화합물 94(삼각형)으로 면역된 실험군에서, 항체 역가는 1:25000의 역가에서 HiberiX 군의 역가로 실질적으로 증가하지만 1-배 낮게 증가하는 14일째의 PBS 군의 역가보다 더 낮았다. 비록, 보조된 화합물 94(사각형)으로 면역된 실험군이 14 일에 HiberiX 군에 비견되는 면역 역가를 나타냈지만, 부스팅 반응은 보조된 군이 부스팅 반응을 나타낸 21일 시점에 관찰되지 않았다. 그러나, 두 번째 부스트 후에, 보조되지 않은 화합물 94는 보조된 군에 비견되는 면역 역가를 나타냈지만, Hiberix 군의 것보다 더 낮았다.

실시예 J-3. 상업적 ADi 플레이트를 사용한 혈청의 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISA)

토끼 항-Hib-PRP IgG ELISA 키트(ADi)는 백신 접종된 동물의 혈청에서의 Hib-PRP 특이적 IgG 항체를 검출한다. 키트는 ,세척 완충액 및 퍼옥사이드 컨주게이션된 검출 항체가 공급된, 항원 Hib-PRP 폴리사카라이드로 사전 코팅된 96 웰 미세역가 플레이트를 포함한다. 키트는 또한 캘리브레이터(calibrator)의 세트(0.5, 1.0, 2.5, 및 5.0 U/mL) 및 양성 대조군/참조 혈청을 포함한다. 캘리브레이터는 내부 분석 파라미터의 제어를 제공하고 1:50 초과의 혈청 희석액에서 거짓 양성을 차별화한다. 0.5 U/mL 값은 가장 낮은 검출 가능한 역가가 되며 그 미만의 시험 값은 거짓 양성일 수 있다. 분석은 제조자의 지시에 따라서 표준 ELISA 포멧으로 수행되었다. 간단하게는, 시험되는 혈청은 키트에 제공된 희석제에서 1:100 및 그 초과의 적절한 희석 범위로 희석되었다. 캘리브레이터, 양성 대조군 및 음성 대조군과 함께 100 μL의 희석된 혈청이 소정의 웰에 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션되었다. 이어서, 웰을 키트 세척 완충액으로 4회 세척하였고, 100 μL의 검출 항체가 첨가되고, 30분 동안 추가로 인큐베이션하였고 세척을 5회 수행하였다. 웰은 100 μL의 TMB 기질을 첨가하고 15분 동안 인큐베이션한 다음에, 100 μL 정지 용액을 사용하여 반응을 정지시켜 황색 용액을 생성시킴으로써 전개되었습니다. 황색 용액의 흡수는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 630 nm의 보정 파장과 함께 450 nm에서 측정하였다. 흡수 값을 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프를 플롯팅함으로써 분석하였다.

결과:

Hib-PRP 폴리사카라이드(항원)은 ELISA에서 항원의 더 낮은 검출을 유도할 수 있는 pH 차이 및 다른 물리화학적 인자로 인해서 가수분해에 매우 민감하다. 도 18b 내지 도 18d에서 관찰된 면역 역가를 확증하고 항원의 인-하우스 코팅으로 인해서 발생하는 이상을 제거하기 위해서, 토끼 혈청을 Hib-PRP 폴리사카라이드로 사전 코팅된 상업적 진단 플레이트(Advanced Diagnostics-adi) 상에서 스크리닝하였다. 실시예 J-2에 기재된 바와 같이, 상이한 실험군 및 시점으로부터의 토끼 면역화된 혈청을 5-배 희석시키고(1:100, 500, 2500, 및 12500), 폴리사카라이드 특이적 IgG 항체에 대해서 분석하였다. 도 19a에 도시된 바와 같이, 모든 희석액에 걸친 모든 실험군의 면역전 혈청은 어떠한 유의한 반응을 나타내지 않았고, 판독치는 임계치 미만이었다. 임계치는 동일한 플레이트 상에서 실행되는 0.5 U/mL 캘리브레이터에 대해서 얻은 흡수 값을 나타내며, 그러한 값 미만의 값은 음성 또는 거짓 양성으로서 할당될 수 있다.

면역후/시험 혈청에서, 14 일 HiberiX 군(역전된 삼각형), Alhydrogel과 함께한 화합물 94(삼각형) 및 그것 없는 화합물 94(사각형)는 1:100의 가장 높은 희석에서도 임계치 보다 낮은 면역 역가를 나타냈다(도 19b). 그러나, PBS 대조군(충전된 원)은 단지 14일 시점에서 1:100의 가장 높은 희석에서 임계치보다 더 큰 신호를 나타냈지만, 21일 및 35일의 모든 다른 시점에서는 임계치보다 낮았다. 이는 인-하우스 코팅된 항원 플레이트에서 관찰되는 경향과 유사한 경향이었다(도 18b 내지 도 18d). 21일 및 35일 시점에서의 보조된 화합물 94(삼각형) 및 HiberiX 군(역전된 삼각형)은 각각 1:500 및 1:2500의 희석까지 포화를 나타냈다. 애주번트 및 부스팅 반응의 효과는 Alhydrogel과 함께 한 화합물 94 군에서 명확하게 가시적이었는데, 그 이유는 역가가 21일 시점에서의 1:2500로부터 35일 시점에서의 1:12500으로 유의하게 증가하기 때문이다. 명확하게 35일에서, 보조된 화합물 94로 면역된 군은 HiberiX에 비견되는 반응을 나타냈지만 1-배 낮았다. 그러나, 보조된 화합물 94로 면역된 군에서는, 21일까지 검출 가능한 IgG 역가가 없었지만, 두 번째 부스트 후에 1:2500까지 유의하게 증가하였다. 이러한 경향은 인-하우스 항원 코팅된 플레이트를 사용하여 수행된 ELISA에서 관찰된 경향과 유사하였다(도 18c, 및 도 18d).

이들 데이터는 컨주게이트 94의 면역원성을 입증하고 있다. 이소타입 스위칭은 T 세포-의존성 항체 반응을 나타낸다. 혈청 IgG 항체는 Alhydrogel로 보조된 컨주게이트 94에 의한 첫 번째 면역화 후 21일에 및 보조되지 않은 컨주게이트 94에 의한 첫 번째 면역화 후 35일에 검출 가능하였다. 천연 Hib PRP 폴리사카라이드와의 항체 교차-반응은 헤모필루스 인플루엔자 박테리아에 결합하고 헤모필루스 인플루엔자 감염증에 대항하는 보호를 부여하는 이들 항체의 효능을 나타낸다.

Claims

화학식(IV-1)의 사카라이드 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염:

(IV-1)
상기 식에서,
m은 1 내지 9로부터 선택된 정수이고;
X_a는 -H, -F, -OCO-N(CH₃)₂ 또는 -OCH₃이다.
청구항 1에 있어서,
하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드:

여기서, M⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, 또는 HNEt₃ ⁺를 나타낸다.
청구항 1에 있어서,
질소 원자를 통해서 면역원성 담체와 컨주게이션되고, 상기 면역원성 담체는 CRM₁₉₇인 사카라이드.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
의약에서의 약제학적 활성제로서 사용하기 위한 사카라이드.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
인간 또는 동물 숙주에서의 방어 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 사카라이드.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Haemophilus influenzae type b)와 연관된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 사카라이드.
청구항 6에 있어서,
헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환이 수막염(meningitis), 폐렴(pneumonia), 및 후두덮개염(epiglottis)로부터 선택되는 사카라이드.
헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환에 대항하는 면역화에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 사카라이드를 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 애주번트, 담체, 동결보호제(cryoprotectant), 동결건조보호제(lyoprotectant), 부형제 또는 희석제와 함께 포함하고, 상기 헤모필루스 인플루엔자 타입 b와 연관된 질환은 수막염, 폐렴 또는 후두덮개염인 백신 조성물.
청구항 8에 있어서,
디프테리아 항원, 파상풍 항원, 백일해 항원, 간염 B 항원, 불활성화된 소아마비 백신 및 불활성화된 로타바이러스 백신 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 백신 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
헤모필루스 인플루엔자 타입 b에 의해서 유발된 질환의 진단을 위한 면역 분석에서의 마커(marker)로서 사용하기 위한 사카라이드.
하기 화학식 A1^*-3, A1^*-5, A1^*-5', A1^*-5'', A1^*-8, B1^*-1, B1^*-2, B1^*-3, B1^*-4, B1^*-5, B1^*-6, A2^*-1, A2^*-4, B2^*-1, B2^*-2, B2^*-3, B2^*-4, A2^*-1', A2^*-4', A2^*-2'', A2^*-4'', B2^*-1', B2^*-1'', B2^*-1''', B2^*-2', B2^*-3', B2^*-3'', B2^*-3''', 및 B2^*-4'로 이루어진 군으로부터 선택되는 중간체 화합물:

상기 식에서, P¹, P², P³, P⁴, 및 P⁵는, -O-에 결합되는 때에, X_i 및 X_j와 동일하지 않은 보호기를 나타내고;
X_i와 X_j는 서로 독립적으로 -H, -F, -OCH₃, 또는 -OCO-N(CH₃)₂를 나타내며, L은 -(CH₂)₅-를 나타내고;
M⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ^+,또는 HNEt₃ ⁺를 나타낸다.
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