KR20230148332A - 운반체 물질과의 접합을 위한 항원 전구체를 포함하는 반응성 탄수화물의 합성을 위한 방법 - Google Patents

운반체 물질과의 접합을 위한 항원 전구체를 포함하는 반응성 탄수화물의 합성을 위한 방법 Download PDF

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Abstract

화학식 (A) - 상기 식에서 R1은 H이고 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 탄수화물이, 양성자를 유리시킬 수 있는 산의 존재 하에서 가열 하에 화합물 (A0) 를 HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응시키는 단계, 및 반응 혼합물을 냉각시켜 화합물 (A)을 포함하는 냉각된 혼합물을 얻는 단계에 의해 합성된다.
화학식 (AAPG) - 상기 식에서 R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기이고, n은 1 내지 5의 정수임 - 의 탄수화물이, 금속-함유 제올라이트의 존재 하에서, 화학식 (APG) 의 화합물을 화학식 (A1) - 상기 식에서 X는 -I, -Br, -Cl, -CN, -OTf(트리플레이트), -OMs(메실레이트), -OTs(토실레이트), 메틸설페이트 또는 트리클로로아세트이미데이트임 - 의 화합물과 반응시킴으로써 합성된다. 화합물 (AAPG)의 탈보호는 화합물 (AA) 를 형성한다.
탄수화물 (A) 및 (AA)는 티올화된 링커와 결합하여 당접합체 전구체를 형성할 수 있으며, 이는 차례로 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 운반체 물질과 접합될 수 있다.

Description

운반체 물질과의 접합을 위한 항원 전구체를 포함하는 반응성 탄수화물의 합성을 위한 방법
본 발명은 운반체(carrier) 물질(예를 들어, 단백질)과의 접합(conjugation)에 유용한 항원 전구체와 같은 반응성 탄수화물의 합성 방법, 및 반응성 탄수화물로부터 면역원 및 치료/진단 도구로서 유용한 당접합체(glycoconjugate)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 복수의 문헌을 참조하며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
면역 요법의 궁극적인 목표는 면역 체계의 선천적 및 적응적 반응들을 조절하여 박테리아, 바이러스 및 암세포와 같은 외부 물질과 싸우는 능력을 향상시킴으로써 감염이나 암과 같은 질병을 치료하는 것이다. 선천적 면역은 병원체에 대한 노출의 초기 단계에서 유발되는 면역 방어의 제1 라인으로 간주된다. 세포 플레이어는 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC), 대식세포, 단핵구, γδ T-세포 및 자연 살해 T(NKT)-세포를 포함한다. 선천적 면역 체계와 달리, 적응적 면역은 외부 항원에 대한 초기 노출 시 발현이 더 느리지만, 고도의 특이적 반응을 발현하고, 장기지속성 방어를 위한 면역 기억을 생성한다. 그것은 T 세포와 B 세포 및 그들의 체액성 및 세포성 매개체, 사이토카인 및 항체의 클론 확장을 포함한다. 선천적 면역 반응과 적응적 면역 반응 사이의 주요 인터페이스는 전문 항원-제시 세포(pAPC); 대식세포, B 세포 및 특히 수지상 세포(DC)이다. pAPC는 내인성 및 외인성 소스에서 T 세포로 항원을 처리하고 제시할 수 있다. 그들은 톨-유사 수용체(TLR: Toll-like receptor)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR: pattern recognition receptor)를 통해 미생물을 인식한다. 미생물 표면 결정인자 또는 비정상적인(aberrant) 비천연 항원의 인식 시, 미생물 또는 종양 및 관련 항원 마커는 전형적으로 펩티드 단편으로 분해되고 방출된 항원이 세포내 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자(pMHC)에 결합되는 세포내이입 경로(endocytic pathway)를 통해 pAPC에 의해 삼켜질 수 있다. pAPC는 성숙 및 활성화를 거쳐 세포내 구획에서 세포 표면으로의 pMHC 복합체의 재분배, 사이토카인 및 케모카인의 분비로 이어진다. pAPC 외에도 모든 유핵 세포 유형은 세포막에 내인성 펩티드만을 표시한다. pAPC와는 대조적으로, 바이러스 및 세포내 병원체를 포함하여 세포 자체 내에서 기원하는 이러한 펩티드는 b2-마이크로글로불린에 결합된 MHC 클래스 I 분자에 의해 표시된다. APC는 전형적으로 MHC 클래스 II를 발현하지 않는다.
MHC 클래스 II 분자에 표시되는 펩티드는 전형적으로 CD4+ T 보조 세포의 T 세포 항원 수용체(TCR)에 의해 인식되며, 이는 pAPC로부터 받은 공동 자극 신호에 따라 Th1 또는 Th2 세포와 같은 다른 하위집합으로 기능적 성숙을 겪는다. Th1 세포는 IFN-γ 및 TNF-α의 분비와 함께 우세한 전염증성 반응을 일으키는 반면, Th2 세포는 전형적인 사이토카인을 분비한다. Th1 세포는 주로 세포 매개 반응과 관련이 있지만, 두 유형의 Th 세포는 모두 B 세포에 의한 항체 생성을 지원하며, 이는 다시 항체 동형 및 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, IL-12 및 TNF-α는 Th1 세포의 분화 및 1형 IgG 서브클래스의 생성과 관련되는 반면, IL-6 및 기타 Th2 사이토카인은 2형 IgG 서브클래스(IgG1) 생성에 기여한다.
MHC 클래스 I 분자에 펩티드를 표시하는 APC는 CD8+ 세포독성 T 세포의 TCR에 의해 인식된다. 두 세포 유형에 의해 발현되는 공동 자극 분자들 사이의 몇 가지 추가적인 상호작용은 세포독성 T 세포의 작동 세포(effector cell)로의 활성화를 유발하는 반면, 강력하고 오래 지속되는 기억 T 세포는 수지상 세포가 활성화된 T-보조 세포와 T-세포독성 세포 둘 모두와 상호작용할 때 생성된다. 일단 활성화되면, T 세포는 사이토카인의 도움으로 클론 선택 및 확장을 겪는다. 이것은 기능장애 표적 항원에 특이적인 세포의 수를 증가시켜 기능 장애 항원-양성 체세포를 찾아 몸 전체를 이동할 수 있다. 표적 세포에 도킹될 때, 활성화된 세포독성 T 세포는 퍼포린(perforin) 및 간자임(ganzyme)과 같은 세포독소의 페이로드(payload)를 방출한다. 퍼포린의 작용을 통해 그랜자임(granzyme)은 표적 세포에 침투하고 그 프로테아제는 세포 사멸을 유발한다. 세포독성 T 세포는 또한 FAS 신호전달 경로에 의해 표적 세포 사멸을 촉발할 수 있다.
따라서 관심 있는 병원체 또는 종양 항원을 처리하기 위해 적절한 반응에 대한 백신 유도 면역을 맞춤화할 수 있는 것이 바람직하다.
탄수화물은 단백질 및 펩티드와 달리 Th 세포의 참여를 촉발하도록 적절하게 장비되지 않은 T 세포 독립적 항원이므로 면역 세포 증식, 항체 클래스 전환 및 친화성/특이성 성숙을 유도할 수 없다. 탄수화물 기반 백신에서 처음 접한 주요 초기 진보는, T 세포 의존적 에피토프 역할을 하는 운반체 단백질에 적절하게 접합되었을 때 박테리아 캡슐 다당류가 옵소닌식세포(opsonophagocytic) 항체를 생성하는 데 필요한 면역화학적 능력을 획득할 수 있게 되었다는 발견에 의해 뒷받침되었다.
전통적으로, 탄수화물 항원을 운반체 단백질에 접합시키는 전략은 라이신 잔기의 ε-아미노기에 대한 알데하이드 유래 당의 환원적 아민화 또는 단순히 아미드 결합 반응에 의존했다. 두 경우 모두 부분적 및 무작위 탄수화물 항원 접합이 일반적으로 발생한다. 또한, 모든 아미드 파트너(라이신으로부터의 아민 또는 글루탐산/아스파르트산으로부터의 산)가 탄수화물 접합에 사용되면, 너무 많은 탄수화물 항원이 운반체 단백질에 부착하게 되고, 따라서 면역원성의 고유한 감소/제거와 함께 잠재적으로 필수적인 T 세포 펩티드 에피토프를 마스킹하게 된다. 따라서, 당접합체 백신을 제조하기 위한 현재의 전략은 부적절하고 상당한 규제 및/또는 상업적 장애에 직면해 있는데, 그 이유는 조제물(preparation)이 탄수화물 분포 및 재현성 측면에서 필요한 균질성이 부족하기 때문이다(즉, 단백질에 대한 당의 부착 지점은 무작위로 분포되고 배치(batch)마다 다양한 밀도이다). 따라서, 더 큰 탄수화물 항원 균질성, 보다 정확하게는 특성화 가능한 구조 및 배치 간 재현성을 갖는 당접합체 백신이 매우 바람직할 것이다.
또한, 단백질과 접합하기 위한 항원 전구체로서 유용한 반응성 탄수화물의 합성은 다양한 난제를 제시할 수 있다. 현재의 합성 경로는 입체선택성 제어 측면에서 어려울 수 있어, 분리하기 어려울 수 있는 중간체 입체이성질체의 수득 및/또는 낮은 수율의 원하는 입체이성질체로 이어진다.
2019년 후반에 시작된 COVID-19 대유행의 원인 물질인 SARS-CoV-2는 세계 경제를 마비시킨 세계적 인류 건강에 대한 지속적인 위협을 나타낸다. 초기 백신 개발 노력은 숙주 세포로 SARS-CoV-2의 세포 진입 및 막 융합을 매개하는 스파이크(S) 당단백질에 존재하는 단백질 항원 및 에피토프에 주로 초점을 맞추었다. 그러나, 세계 보건 전문가들은 과학자들이 단백질 에피토프에 대한 현재 백신 전략을 회피할 수 있는 바이러스의 새로운 돌연변이를 포함하여, 단일 전략에 대해 발생할 수 있는 잠재적인 실패나 합병증을 경감하기 위해, SARS-CoV-2에 대한 치료 개입을 개발하기 위한해 상이한 전략들을 병행적으로 탐색할 것을 강력히 권장했다. 따라서 SARS-CoV-2의 S 단백질에 존재하는 단백질 항원에 초점을 맞춘 것과 병행하여 SARS-CoV-2에 대한 백신 및 기타 치료 도구를 개발할 필요성이 남아 있다.
제1 양태에서, 화학식 (A) - 상기 식에서 R1은 H이고 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서, 양성자를 유리시킬 수 있는 산의 존재 하에서 화학식 (A0) 의 화합물을 HO-(CH2)n-CH=CH2와 가열 하에 반응시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 생성하는 단계, 및 상기 반응 혼합물을 냉각시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 냉각된 혼합물을 얻는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A0)의 화합물을 반응시키는 단계는 약 0℃ 내지 약 25℃의 혼합 온도에서 HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 용액에 화학식 (A0)의 화합물을 첨가하여, 저온에서 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 HCl을 포함하는 중간 반응 혼합물을 생성하는 것을 포함한다.
추가의 양태에서, 화학식 (AAPG) - 상기 식에서 R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기이고, n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서, 금속-함유 제올라이트의 존재 하에서, 화학식 (APG) 의 화합물을 화학식 (A1) - 상기 식에서 X는 -I, -Br, -Cl, -CN, -OTf(트리플레이트), -OMs(메실레이트), -OTs(토실레이트), 메틸설페이트 또는 트리클로로아세트이미데이트임 - 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (APG) 및 (A1)의 화합물들 사이의 반응은 분자체의 존재 하에 수행된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (APG)의 화합물은 화학식 (A) - 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물을 보호기 PG로 보호함으로써 형성된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻어진다.
추가의 양태에서, 화학식 (AA) - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서, 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻어진 화학식 (AAPG)의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음 상기 중간 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 화학식 (AA) 의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서, 화학식 (AAPG) - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기임 - 의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하고, 상기 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 미정제(crude) 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음, 중간 상기 미정제 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
추가의 양태에서, 화학식 (B) 또는 화학식 (BB)
- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이며, LG는 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물이 아미노기와 반응할 때 아미도 결합 형성을 가능하게 하는 이탈기임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서, 화학식 (C) 의 화합물을, 화학식 (A) - 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물과 반응시켜 화학식 (B)의 화합물을 형성하거나, 화학식 (AA) 의 화합물과 반응시켜 화학식 (BB)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻어진다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AA)의 화합물은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻어진다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에 수행된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 자외선 조사 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에서 자외선 조사 하에 수행된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 가시광선 흡수 전이 금속 광촉매의 존재 하에서 가시광선 하에 수행된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B), (BB) 및/또는 (C)에서 m은 1 내지 3의 정수이다. 일부 실시형태에서, m은 2이다.
추가의 양태에서, 화학식 (I) 또는 (II)
- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이고, p는 1 내지 50의 정수이며, 은 접합에 이용 가능한 적어도 하나의 아미노기를 함유하는 운반체 물질임 - 의 당접합체를 제조하는 방법으로서, 상기 운반체 물질의 적어도 하나의 유리 아미노기를 화학식 (B)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하거나, 화학식 (BB)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하는 단계를 포함하며, 상기 화학식 (B) 및 (BB)의 화합물은 본원에 정의된 방법에 의해 얻어지는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 운반체 물질은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 정의된 방법에서 n은 1 내지 3의 정수이다. 일부 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다.
추가의 양태에서, 화학식 (AAPG) - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 Ac이고, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로부터 선택된 2가 보호기임 - 의 화합물이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 화합물 (AAPG)에서 PG는 PhCH이다.
일부 실시형태에서, 화합물 (AAPG)에서 n은 1 내지 3의 정수이다. 일부 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다.
일부 실시형태에서, 화합물 (AAPG)는 다음 화학식을 갖는다:
.
추가의 양태에서, 본원에는 하기 화학식의 화합물이 기술된다:
.
일반 정의
표제 및 다른 식별자, 예를 들어, (a), (b), (i), (ii), 등은 단지 명세서 및 청구항의 용이한 파악을 위해 제시된다. 명세서 또는 청구항에서 표제 또는 다른 식별자의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳순 또는 숫자순 또는 이들이 제시되는 순서로 수행되는 것을 반드시 필요로 하지는 않는다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 단수 형태의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
용어 "약"은 값이 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다. 일반적으로, 용어 "약"은 10% 이하의 가능한 변동을 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 값의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10%의 변동이 용어 "약"에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 범위 앞의 용어 "약"은 범위의 양쪽 끝에 적용된다.
이러한 명세서 및 청구항(들)에서 사용된 바와 같은 단어 "포함하는"(및 "포함하는"의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다"), "갖는"(및 "갖는"의 임의의 형태, 예컨대 "갖다"), "포괄하는"(및 "포괄하는"의 임의의 형태, 예컨대 "포괄하다") 또는 "함유하는"(및 "함유하는"의 임의의 형태, 예컨대 "함유하다")은 포괄적이거나 개방적이고, 추가적, 비언급 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 표현 "이탈기" 또는 "LG"는 이탈기로 대체되기 전의 상응하는 작용기와 비교하여 개선된 반응 효율 및/또는 특이성(즉, 폴리펩티드 또는 단백질의 유리 아민기에 대한 개선된 접합)을 제공하는 이탈기를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이탈기는 OPhF5 또는 OPhF4(파라 SO3Na)와 같은 O-플루오로페닐기, 또는 O-(N-석신이미딜)기일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "운반체 물질"은 탄수화물 항원(예를 들어, 항원성 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류, 예를 들어 천연 또는 합성 항원)에 접합될 수 있는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 운반체 물질은 운반체 물질 상에 존재하는 적어도 하나의 아미노와 결합된 아미도를 형성할 수 있는 기로 종결되는 티올-링커를 통해 탄수화물 항원에 접합 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반체 물질은 운반체 단백질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 운반체 물질은 센서 칩, 마이크로어세이 또는 비드를 포함할 수 있으며, 몇 가지 예를 들자면 이는 아미노기를 보유한다.
본원에 사용되는 용어 "단백질"(예를 들어, "운반체 단백질"이라는 표현에서)은 개질이 본원에 기술된 당접합체 면역원 및 당접합체 백신의 면역원성을 파괴하지 않는 한. 임의의 유형의 개질(예를 들어, 화학적 또는 번역후 개질, 예컨대 아세틸화, 인산화, 글리코실화, 설페이트화, 수모일화, 프레닐화, 유비퀴틴화 등)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산의 임의의 펩티드-연결 사슬을 의미한다. 더 명확하게 하기 위해, 본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "운반체 단백질"은 펩티드와 폴리펩티드 둘 모두를 포함하지만, 두 실시형태는 표현 "운반체 단백질(들) 또는 펩티드(들)"에서와 같이 함께 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "당접합체"는 운반체 물질에 결합된 탄수화물 항원(예를 들어, 항원성 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류, 예를 들어 천연 또는 합성 항원)을 지칭한다. 운반체 물질이 운반체 단백질 또는 펩티드인 경우, 결합은 관심 대상체에서 탄수화물 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있다. "탄수화물 항원" 및 "당 항원"이라는 표현은 본원에서 사용된 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "면역원"은 면역계의 구성요소(예를 들어, 항체 및/또는 림프구)에 의해 특이적으로 결합될 수 있고 관심 대상체에서 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 생성할 수 있는 작용제를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "당접합체 면역원"과 같은 표현에서 "면역원"이라는 용어는 당접합체 자체를 특정 용도(예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 생성하기 위한 면역원으로서)로 제한하지 않고 당접합체의 능력(즉, 물리적 특성 또는 성질)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 당접합체 면역원은 생물학적 샘플(예를 들어, 대상체로부터)에서 당접합체 면역원에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단 검정 또는 방법(예를 들어, 시험관내 방법)에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 당접합체 면역원은 당접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 진단적으로 또는 치료적으로 적용 가능한 단일클론 항체)를 스크리닝, 식별 또는 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "합성"은 자연의 산물이 아니고 인간의 개입에 의해 생성되는 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "접합 가능한"이라는 용어는 분자가 실제로 서로 공유 결합되어 있는지 여부에 관계없이 적어도 2개의 분자(예를 들어, 탄수화물 항원 및 티오-링커; 또는 탄수화물 항원 및 단백질 또는 펩티드와 같은 운반체 물질)가 화학 반응을 통해 서로 공유 결합되는 능력 또는 성능을 지칭한다. 대조적으로, 용어 "접합된"은 서로 공유 결합된 적어도 2개의 분자(예를 들어, 탄수화물 항원 및 티오-링커, 또는 탄수화물 항원 및 단백질 또는 펩티드와 같은 운반체 물질)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여"는 투여 경로가 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 한 비경구(예를 들어, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내), 경구, 경피, 비강내 등과 같은 투여 경로를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 당접합체에 대한 면역 반응을 일으켜, 바람직하게는 당접합체 및/또는 당접합체를 제공하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 림프구의 생성을 야기할 수 있는 생물(예를 들어, 동물 또는 인간)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 대상체는 치료적으로(예를 들어, 본원에 기술된 당접합체 면역원으로의 백신접종을 통해) 치료될 환자일 수 있거나, 연구, 진단 및/또는 치료 목적을 위한 도구(예를 들어, 항체)를 생성하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 다양한 약어의 의미는 하기 표 1에 제공된다.
[표 1]
본 상세한 설명의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부된 도면을 참조하여 오로지 예로서 주어진, 이의 특정 실시형태의 하기 비제한적 설명을 파악할 시에 더욱 명백해질 것이다.
첨부된 도면에서:
도 1은 NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율(0.2, 0.6, 3)에서 0.01 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))에 대한 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(PNA) 및 항-TF 단일클론 항체 JAA-F11의 반응성을 보여주는 ELISA 결과를 나타낸다.
도 2는 NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 1 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 3은 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(PNA) 및 항-TF 단일클론 항체 JAA-F11을 사용하여 검출된 NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 1 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 4는 NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 MALDI-TOF 스펙트럼의 오버레이를 보여준다.
서열 목록
본 출원은 2022년 1월 11일에 생성된 약 15 Kb 크기의 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 형태는 본원에 참조로 포함된다.
상세한 설명
본 발명은 항원 전구체를 포함하는 반응성 탄수화물, 뿐만 아니라 예컨대 면역원, 백신, 진단에, 또는 분석 또는 치료 도구 생성(예: 신규한 항-당접합체 항체 생성)을 위해 사용하기에 적합한 당접합체를 합성하는 방법에 관한 것이다.
운반체 단백질의 아민기에 말단 산 작용기로 끝나는 탄수화물 항원을 접합시키는 것은 전통적으로 석신이미드 또는 카르보디이미드 시약을 사용한 무작위 활성화를 통해 수행된다. 이러한 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법의 주요 단점 중 하나는 운반체 단백질 자체 내에서 발생하는 제어되지 않은/바람직하지 않은 자체 가교결합이며, 여기서 운반체 단백질 자체의 아스파르트산/글루탐산 잔기의 측쇄는 운반체 단백질 자체의 라이신 잔기의 ε-아민기에 결합하게 된다. 이러한 접근법은 운반체 단백질의 고유 구조의 교란 또는 파괴로 이어지며, 종종 그렇지 않으면 고도의 면역원성이 될 핵심 펩티드 서열의 실질적인 손실, 뿐만 아니라 운반체 단백질의 잠재적인 바람직하지 않은 가교-결합을 초래한다. 또한, 당업계에 기술된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법은 종종 링커가 결합되는 탄수화물 항원만이 아니라 링커 자체에 대한 면역 반응을 촉발할 수 있는 스쿠아르산 등과 같은 링커를 사용한다. 또한, 당업계에 기술된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법은 운반체 단백질이 글리코실화되는 정도에 대한 적절한 제어를 허용하지 않으며, 종종 이종 당접합체 종을 초래하며, 이는 인간 치료제의 제조에 상당한 장벽이다. 또한, 단백질과 접합하기 위한 항원 전구체로서 유용한 반응성 탄수화물 중간체의 합성은 다양한 난제를 제시할 수 있다. 현재의 합성 경로는 입체선택성 제어 측면에서 어려울 수 있어, 분리하기 어려울 수 있는 중간체 입체이성질체의 수득 및/또는 낮은 수율의 원하는 입체이성질체로 이어진다.
대조적으로, 본 발명은 더 나은 입체선택성 제어로 중간 반응성 탄수화물의 합성을 가능하게 하고 현재 공지된 방법보다 더 적은 단계로 운반체 단백질과 같은 운반체 물질과의 접합에 적합한 합성 항원을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 운반체 물질이 글리코실화되는 정도에 대한 적절한 제어를 허용하면서 간단하고 제한된 합성 단계를 사용하여 당접합체를 합성하는 방법을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 유리 아민기를 갖는 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)과 접합되어 당접합체를 생성할 수 있는 반응성 탄수화물을 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 반응성 탄수화물은 정제되고, 이어서 하나 이상의 유리 아민기를 갖는 운반체 물질과의 결합 반응에 사용될 수 있다. 결합 반응은 아미드 결합을 통해 하나 이상의 유리 아민기에서 정제된 반응성 탄수화물 중 하나 이상을 운반체 물질에 접합시켜 당접합체를 생성한다.
추가의 양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 합성 반응성 탄수화물로부터 당접합체를 제조하는 방법이 본원에 기술된다.
다른 양태에서, 접합 가능한 반응성 탄수화물을 얻기 위해 반응할 수 있는 중간 반응성 탄수화물을 제조하는 방법이 본원에 기술된다.
다음 반응식 1은 이러한 다양한 방법에 포함될 수 있는 합성 단계를 나타낸다.
반응식 1

공정 반응 1
일부 실시형태에서, 먼저 화학식 (A)의 반응성 탄수화물의 합성이 제공되며,

상기 식에서 R1은 H이고 n은 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다. 공정은 산의 존재 하에서 화학식 (A0)의 화합물과

화학식 HO-(CH2)n-CH=CH2의 알코올 사이의 반응을 포함할 수 있다. 반응은 가열 하에 수행되어 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 생성하고, 이는 이후 냉각될 수 있다. 따라서 화학식 (A)의 화합물의 합성은 알코올 HO-(CH2)n-CH=CH2를 사용하여 산성 조건에서 탄수화물 (A0)의 C1 탄소에 대한 에테르화를 포함한다. 화학식 (A)의 화합물을 형성할 수 있는 반응을 촉매하기 위해 반응 혼합물에서 양성자 H+를 유리시킬 수 있는 한, 몇 가지 산이 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 산은 강산 또는 루이스산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 루이스산은 BF3.Et2O와 상이할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화합물 (A0) 및 알코올 HO-(CH2)n-CH=CH2로부터 화학식 (A)의 화합물을 형성하기 위한 반응에 사용되는 산은 아세틸 클로라이드, 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (A0)의 화합물은 산으로서 아세틸 클로라이드의 존재 하에 알코올 HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응한다. HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 용액은 먼저 약 0℃ 내지 약 25℃의 온도와 같은 저온에서 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 용액은 약 0℃인 온도에서 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드의 용액이 제조되는 온도는 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 20℃, 또는 약 10℃ 내지 약 20℃, 또는 약 10℃ 내지 약 25℃, 또는 이들 범위에 포함된 임의의 온도일 수 있다. HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드의 용액을 제조할 때 과량의 알코올이 사용될 수 있다. 따라서, 알코올은 반응물로서 사용되면서 용매로도 역할을 할 수 있다. 알코올과 아세틸 클로라이드를 혼합하면, 약간의 AcO-(CH2)n-CH=CH2와 함께 약간의 HCl이 형성된다. 용액은 바람직하게는 저온에서 제조되어 알코올의 용액에 약간의 HCl을 유지할 수 있다. 일부 실시형태에서, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드의 용액은 아르곤 또는 N2와 같은 불활성 분위기 하에서 제조될 수 있다. HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드의 용액 제조를 완료한 후, 화학식 (A0)의 화합물을 용액에 첨가하고, 이는 여전히 저온, 예를 들어 약 0℃ 내지 약 25℃일 수 있어, 저온에서 적어도 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2, HCl 및 약간의 AcO-(CH2)n-CH=CH2를 포함하는 중간 반응 혼합물을 형성할 수 있다. 이어서, 이 중간 반응 혼합물을 가열하여 화학식 (A)의 화합물의 형성을 촉진한다. 가열 시, 화학식 (A0)의 화합물과 HO-(CH2)n-CH=CH2 사이의 반응은 양성자 H+의 존재 하에 신속하게 일어나서 화학식 (A)의 에테르를 형성할 수 있다. 화합물 (A0)의 C1 위치에 있는 산소 원자를 활성화하는 것 외에도, 양성자는 당의 위치 2에 있는 탄소 상의 아세트아미도기를 활성화하여 알파 형태에 유리한 아노머 효과(anomeric effect)를 증가시킬 수 있다. 따라서 아세틸 클로라이드와 같은 산의 존재 하에서의 반응은, 동일한 화합물에 도달하기 위해 보호-탈보호 단계를 필요로 하는 이전의 합성 공정과는 대조적으로, 단일 반응을 사용하여 알파 형태를 갖는 화학식 (A)의 화합물의 형성을 촉진할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중간 혼합물의 가열은 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 온도는 약 60℃ 내지 약 80℃일 수 있고, 예를 들어 약 70℃일 수 있다. 이러한 온도 범위에 포함되는 임의의 온도가 가열 온도로서 사용될 수 있다. 반응 시간은 약 30분 내지 5시간으로 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 시간은 약 30분 내지 약 1시간일 수 있다. 산으로서 아세틸 클로라이드를 사용하면 약 30분 내지 약 45분과 같이 짧은 반응 시간이 충분할 수 있다. 단지 약 30분 정도로도 충분할 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응의 진행을 모니터링하고 결과적으로 반응 시간을 조정할 수 있다. 추가 실시형태에서, 적어도 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 HCl을 저온에서 포함하는 중간 혼합물은 혼합물을 신속하고 즉각적으로 가열하기에 충분히 높은 온도에서 열원과 접촉된다. 다시 말해, 일부 실시형태에서, 저온으로부터 가열 온도로의 점진적인 가열과는 반대로, 저온에서의 중간 혼합물은 즉시 열원과 접촉되도록 투입될 수 있다. 실험실 규모에서, 이것은 저온에서 중간 혼합물을 포함하는 둥근 바닥 플라스크를 이미 가열 온도에 있는 오일 욕조에 넣음으로써 수행될 수 있으며, 이는 둥근 바닥 플라스크를 저온에서 오일 욕조에 넣은 다음 욕조 오일을 가열하여 온도를 높이고 원하는 가열 온도에 도달시키는 것과는 대조적이다. 산업적 규모에서, 중간 혼합물을 열원과 "접촉"시키는 임의의 통상적인 가열 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어 여기에는 열교환기가 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 열원은 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도일 수 있다.
추가 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물을 얻기 위한 반응을 촉매화하기 위해 양성자를 유리시킬 수 있는 산 공급원은 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택되는 산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 다른 유형의 산과의 반응은 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 산을 포함하는 용액을 제조한 다음, 그 용액을 가열함으로써 수행될 수 있다. 용액은 또한 유기 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 몇 가지 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,3-디옥솔란, 디에톡시메탄, 디메톡시메탄, 2,5,7,10-테트라옥사운데칸, 디프로폭시메탄, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 산을 포함하는 반응 혼합물은 약 30℃ 내지 약 70℃의 온도에서 가열될 수 있다. 이 범위 내의 임의의 온도가 사용될 수 있다. 반응 시간은 다양할 수 있으며 반응 진행을 모니터링하여 반응 시간을 조정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응은 약 0.5시간 내지 약 15시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 10시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 5시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 2시간의 반응 시간 동안 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화합물 (A0)로부터 화학식 (A)의 화합물을 제조하기 위한 반응 온도 및 반응 시간은 화학식 (A)의 화합물의 동등한 베타 이형태체(conformer)의 형성을 모니터링함으로써 추가로 조정될 수 있다. 상기 언급된 반응 조건(즉, 산, 온도, 반응 시간 및/또는 중간 혼합물 제조의 선택)이 알파 이형태체 화합물 (A)의 형성을 촉진해야 하는 경우에도, 약간의 베타 이형태체가 반응 중에 형성될 수 있다. 가열하는 동안 반응 혼합물을 분석함으로써 베타 이형태체의 형성을 평가하고, 약간의 베타 이형태체가 관찰되는 경우 가열을 즉시 중단하고 혼합물을 냉각시킬 수 있다.
가열 단계가 완료되고 반응 혼합물이 냉각되면, 냉각된 혼합물은 임의의 통상적인 방법(예를 들어, pH가 약 7에 도달할 때까지 염기를 첨가하고 pH를 확인)에 의해 중화될 수 있다. 이어서 화학식 (A)의 화합물을 임의의 통상적인 방법에 의해 단리하고 정제할 수 있다. 예를 들어, 단리된 미정제 생성물은 동결건조되거나, 재침전되거나 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제 단계는 화학식 (A)의 화합물을 등가 베타 이형태체로부터 분리하는 것을 허용할 수 있으며, 약간이 반응 동안 형성되었다.
공정 반응 2
일부 실시형태에서, 또한 화학식 (APG)의 화합물의 합성이 제공되며,

상기 식에서 PG는 보호기이고 n은 1 내지 5의 정수이다. 반응은 화학식 (A)

- 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물을 2가 보호기 PG로 보호하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물은 전술한 공정 반응 1에 의해 제조될 수 있다. 추가 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물의 보호는 PhCH(OMe)2, 트리포스겐, Me2SiCl2, Me2C(OMe)2, 2-메톡시프로펜 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐보론산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물과의 반응에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 반응은 화학식 (APG)의 보호된 화합물을 제조할 수 있게 하며, 상기 식에서 PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보호기는 PhCH이다.
일부 실시형태에서, 보호 반응은 DMF, 디메틸 아세트아미드(DMAC), DMSO, THF, 디옥산, 1-3 디옥솔란, 아세토니트릴, 2,5-디메틸 테트라하이드로푸란(DMTHF), 감마-바테로락톤(GVL), 디하이드로레보글루코세론(Cyrene), 메틸 레불리네이트(ML), 에틸 레불리네이트(EL), 에틸 레불리네이트 프로필렌글리콜 케탈(ELPK), 디메틸 글루타레이트(DMG), 디메틸프로필렌 우레아(DMPU), 폴리(프로필렌글리콜)(PPG), 글리코푸롤(THFP), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트([emim][OAc]) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (APG)의 화합물은 촉매량의 p-톨루엔설폰산 일수화물의 존재 하에 DMF에서 화학식 (A)의 화합물을 PhCH(OMe)2와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 반응은 실온에서 수행될 수 있고, 화학식 (APG)의 화합물의 형성은 모니터링될 수 있으며 반응이 실질적으로 완료될 때 반응은 중단된다. 일부 실시형태에서, 반응 시간은 약 5시간일 수 있다. 그 다음 화합물은 통상적인 방법으로 단리될 수 있다.
공정 반응 3
일부 실시형태에서, 또한 화학식 (AAPG)의 반응성 탄수화물 화합물의 합성이 제공되며,

상기 식에서 R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기이고, n은 1 내지 5의 정수이다.
일부 실시형태에서, 합성은 금속-함유 제올라이트의 존재 하에 화학식 (APG)의 화합물과

화학식 (A1)의 화합물 사이의 글리코실화를 포함하며,

상기 식에서 X는 -I, -Br, -Cl, -CN, -OTf(트리플레이트), -OMs(메실레이트), -OTs(토실레이트), 메틸설페이트 또는 트리클로로아세트이미데이트이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (APG)의 화합물은 전술한 공정 반응 2에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물을 제조하기 위한 반응은 유기 용매에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는 톨루엔, 디클로로메탄-톨루엔 혼합물, DMSO-톨루엔 혼합물 및 N-메틸피롤리돈-톨루엔 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 톨루엔일 수 있다. 반응은 바람직하게는 불활성 분위기 하에서(예를 들어, 아르곤 또는 N2 하에서) 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 1가 보호기 R2는 Ac, Bz, 알릴, 벤조에이트, 메톡시메틸(MOM), 테트라하이드로프로피라닐(THP), t-부틸, 피발레이트, t-부틸디메틸실릴(TBDMS) 및 t-부틸디페닐실릴(TBDPS)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 임의의 다른 가능한 하이드록실 보호기가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, R2는 Ac 또는 Bz일 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 2가 보호기 PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B, 바람직하게는 PhCH로부터 선택될 수 있다. 화학식 (A1)의 화합물에서 이탈기 X는 바람직하게는 I, Br 또는 Cl로부터 선택되는 할로겐, 가장 바람직하게는 Br일 수 있다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, 금속-함유 제올라이트는 제올라이트 골격 자체의 일부인 적어도 하나의 금속을 갖거나 제올라이트 기공 및/또는 제올라이트 표면에 존재하는 적어도 하나의 금속을 갖는 제올라이트일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제올라이트는 금속-함침된 제올라이트일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 금속-함유 제올라이트에서의 금속은 Ag, Al, Cd, Co, Cu, Fe, Ga, In, Mo, Pd, Pt, Sn, Sb, V, Zr 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 금속-함유 제올라이트는 몇 가지 예를 들면 Sn-베타, Zr-베타, Al-베타(OH), Al-베타(F), Pt@MCM-22, K-PtSn/MFI, 0.3Pt/0.5Sn-Si-베타, Pt/Sn 2.0-베타, 0.5CoSi-베타, V-베타, H-[Fe]ZSM-5, Fe-BEA, Ga-베타, Ga-베타-200, Mo/HZSM-5, 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제올라이트일 수 있다. 그러나, 화학식 (APG)의 화합물과 화학식 (A1)의 화합물 사이의 에테르 결합 반응을 촉매할 수 있는 임의의 유형의 금속-함유 제올라이트를 사용하여 화학식 (AAPG)의 화합물을 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 금속-함유 제올라이트는 예를 들어 은-교환된 제올라이트와 같은 은-함유 제올라이트를 포함할 수 있다. 그러한 제올라이트는 일반적으로 상업적으로 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 금속-함유 제올라이트의 존재 하에 수행되는 글리코실화 반응은 실온에서 또는 가열 하에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 글리코실화 온도는 약 20℃ 내지 약 80℃일 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응은 약 20℃ 내지 약 70℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 50℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 따라서 글리코실화 반응은 이들 범위 내에 포함되는 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 추가 실시형태에서, 글리코실화는 약 5시간 내지 약 50시간의 기간 동안 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 글리코실화 시간은 약 5시간 내지 약 30시간, 또는 약 5시간 내지 약 25시간, 약 5시간 내지 약 20시간, 또는 약 10시간 내지 약 30시간, 또는 약 10시간 내지 약 25시간, 또는 약 10시간 내지 약 20시간, 또는 약 15시간 내지 약 30시간, 또는 약 15시간 내지 약 25시간, 또는 약 15시간 내지 약 20시간, 또는 약 20시간 내지 약 25시간, 또는 약 20시간 내지 약 30시간 지속될 수 있다. 일부 실시형태에서, 글리코실화 반응은 약 60 내지 약 80℃에서 약 15시간 내지 약 20시간 동안 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 글리코실화는 약 20℃ 내지 약 25℃에서 약 20시간 내지 약 30시간 동안 수행될 수 있다.
화학식 (APG) 및 (A1)의 두 탄수화물들 사이의 반응을 위한 촉매로서 금속-함유 제올라이트의 사용은 놀랍게도 본질적으로 두 당 사이의 베타 형태를 갖는 글리코실화 생성물 (AAPG)를 얻을 수 있게 하였다. 이는 알파 및 베타 이형태체의 혼합물을 생성하는 통상적인 글리코실화 반응(예: 트리클로로아세트이미데이트 및 BF3.Et2O 또는 TMSOTf 사용)과 비교하여 중요한 이점이다. 본원에 기술된 방법에서, 생성된 생성물 (AAPG)의 정제는 여과에 의해 용이하게 수행되어 반응 종료 시 제올라이트를 제거할 수 있다. 또한, 제올라이트 존재 하의 글리코실화는 통상적인 반응보다 제어하기 더 쉬울 수 있다. 예를 들어, 트리클로로아세트이미데이트 및 BF3.Et2O 또는 TMSOTf의 존재 하에서의 글리코실화는 반응 온도를 약 -30℃와 같이 매우 낮게 유지해야 할 수 있으며, 이는 반응을 늦출 수 있다. 또한, 금속-함유 제올라이트를 사용하는 것이 Hg(CN)2와 같은 다른 촉매를 사용하는 것보다 바람직하며, Hg(CN)2는 글리코실화를 촉매하는 것으로도 알려져 있지만, 독성 중금속을 포함하므로 독성이 있다. 전반적으로, 금속-함유 제올라이트를 사용하면 입체 선택성의 높은 제어로 보다 원활하게 글리코실화를 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물의 제조, 즉 화학식 (APG) 및 (A1)의 화합물들 사이의 결합은 분자체의 존재 하에 추가로 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 분자체의 예는 유형 3 Å, 유형 4 Å, 유형 5 Å, 유형 13X의 분자체를 포함한다. 이들의 임의의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 분자체의 존재 하에 반응을 수행하면 수분/미량의 물을 가두어 반응을 촉진할 수 있다.
위에서 설명한 바와 같이, 최종 미정제 생성물 (AAPG)는 반응 혼합물을 여과한 다음 용매를 제거함으로써 쉽게 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미정제 생성물은 그 다음 임의의 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다.
공정 반응 4
일부 실시형태에서, 또한 화학식 (AA)의 반응성 탄수화물 화합물의 합성이 제공되며,

상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이다.
반응은 본원에 기술된 바와 같은 화학식 (AAPG)의 화합물을 탈보호하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물은 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물의 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 생성물 (AAi)를 형성하는 단계, 및 그 다음 중간 생성물 (AAi)를 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 중간 생성물 (AAi)를 얻기 위해 필요한 염기성 용액은 메톡시드, 에톡시드 및 2-메틸프로판-2-올레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 염기는 나트륨 메톡시드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기성 용액은 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 일부 실시형태에서, (AAPG)와 염기성 용액의 반응을 통해 중간 생성물 (AAi)를 형성하는 것은 약 0℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 실온에서 수행될 수 있다. 중간 생성물 (AAi)를 형성하기 위한 염기성 용액과의 반응은 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미정제 형태의 중간 생성물 (AAi)는 어떠한 정제 단계도 필요로 하지않고 산성 용액으로 직접 처리될 수 있다. 이는 보호 공정 단계들 수를 줄일 수 있기 때문에 유리하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 염기성 처리와 후속적인 산성 처리 둘 모두가 동일한 반응 용기에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 일단 염기성 처리가 완료되면, 용액을 중화시킬 수 있고, 액체를 증발시켜 미정제 형태로 중간 생성물 (AAi)를 제공할 수 있다. 그 다음, 미정제 형태의 중간 생성물 (AAi)는 전술한 바와 같이 어떠한 정제 단계도 필요로 하지않고 산성 용액으로 직접 처리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 후속 산성 처리는 중간 생성물 (AAi)를 아세트산-물 혼합물 또는 에탄올산-물 혼합물을 포함하는 산성 용액과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 산성 용액은 아세트산 수용액일 수 있다. 추가 실시형태에서, 중간 생성물 (AAi)는 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도에서 산성 용액으로 처리될 수 있다. 산성 용액으로의 처리는 약 1시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간 동안 수행되어 화학식 (AA)의 화합물을 포함하는 용액을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AA)의 화합물은 이어서 예를 들어 추출, 침전, 결정화, 동결건조, C-18에서의 순상 또는 역상 하의 실리카 겔 상의 크로마토그래피, 모사 이동층(SMB: simulated moving bed) 크로마토그래피, 및/또는 막 나노여과와 같은 막 기술에 의한 정제를 포함하는 통상적인 방법에 의해 단리될 수 있다.
공정 반응 5a 및 5b
일부 실시형태에서, 화학식 (B) 또는 화학식 (BB)의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법이 또한 제공되며,

상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이고, LG는 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물이 아미노기와 반응할 때 아미도 결합 형성을 가능하게 하는 이탈기이다. 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물은 또한 본 발명에서 탄수화물 항원 전구체로 지칭된다. 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물은 탄수화물 항원이 연결되는 티올-링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B)의 화합물을 얻는 방법은 화학식 (C)

- 상기 식에서 m 및 LG는 전술한 바와 같음 - 의 화합물을
화학식 (A)

- 상기 식에서 R1은 H이고 n은 전술한 바와 같음 - 의 화합물과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물은 상기 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (BB)의 화합물을 얻는 방법은 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (AA)의 화합물과 반응시키는 것을 포함할 수 있으며,

상기 식에서 n은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AA)의 화합물은 상기 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A), (AA), (B) 및 (BB)의 화합물에서, n은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물에서 m은 1 내지 3의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, m은 2이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물에서, LG는 OPhF5 또는 OPhF4(파라 SO3Na)와 같은 O-플루오로페닐기, 또는 O-(N-석신이미딜)기일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물에서 LG는 O-(N-석신이미딜) 기이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (A)의 화합물 또는 화학식 (BB)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (AA)의 화합물과 화학식 (C)의 화합물을 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에 수행된다. 일부 실시형태에서, 광개시제는 유리 라디칼-생성 아조 화합물, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), 금속 또는 금속 이온 기반 광개시제, 과산화물, 과황산암모늄, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 광개시제가 유리 라디칼-생성 아조 화합물일 때, 그것은 아조비스이소부티로니트릴(AIBN); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA); 1,1'-아조비스(시아노사이클로헥산)(ACHN); 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD); 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-(디아젠-1,2-디일)비스(4-시아노펜탄산); 2,2'-아조디(2-메틸부티로니트릴); 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 광개시제가 퍼옥사이드인 경우, 퍼옥사이드는 tert-부틸 퍼옥시이소부티레이트, tert-부틸 하이드로퍼옥사이드, 벤조일 퍼옥사이드 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물과 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물의 반응은 물 또는 유기 용매에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 이 용매에서 광개시제의 용해도에 따라 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 광개시제 용해도를 향상시키기 위해 필요한 경우 상이한 용매의 혼합물을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물과 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물의 반응을 수행하기 위해 사용되는 용매는 물, 디옥산, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란(THF), 디이소프로필 에테르, 이소프로판올, 클로로벤젠, 메틸-tert-부틸 에테르, 메탄올, 에탄올, tert-부탄올, 클로로포름 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (A)의 화합물 또는 화학식 (BB)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (AA)의 화합물과 화학식 (C)의 화합물을 반응시키는 것은 약 40℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (C)의 화합물과 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물의 반응은 약 1시간 내지 약 10시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (A)의 화합물 또는 화학식 (BB)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (AA)의 화합물과 화학식 (C)의 화합물을 반응시키는 것은 자외선 조사 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 자외선 조사는 단파, 중파 또는 장파 자외선 조사일 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응은 광개시제의 존재 하에서 자외선 조사 하에 수행될 수도 있다. 이러한 실시형태에서, 광개시제는 바람직하게는 2,2'-아지도비스[2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA); 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물을 얻기 위한 반응이 자외선 조사 하에, 선택적으로 광개시제의 존재 하에 수행되는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 조합과 같은 알코올 용매에서 반응을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 자외선 조사 하의 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물의 합성은 약 20℃ 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조사는 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (A)의 화합물 또는 화학식 (BB)의 화합물을 얻기 위해 화학식 (AA)의 화합물과 화학식 (C)의 화합물을 반응시키는 것은 가시광선 흡수 전이 금속 광촉매의 존재 하에서 가시광선 하에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가시광 흡수 전이 금속 광촉매는 Ru(bpz)3(PF6)2와 같은 루테늄 폴리피리딜 착물일 수 있고 광원은 청색 LED 광을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가시광 흡수 전이 금속 광촉매의 존재 하에 수행되는 반응은 약 20℃ 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 아세토니트릴과 같은 용매에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물은 통상적인 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물을 포함하는 반응 혼합물이 처리되어 용매 및 임의의 미반응 화학식 (C)의 화합물을 제거하여 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물을 회수할 수 있다. 그 다음, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물은 미정제 형태로, 즉 추가 정제 없이 직접, 하기에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이 적어도 하나의 아미노기를 함유하는 운반체 물질과의 접합을 위해 사용될 수 있다.
공정 반응 6a 및 6b
일부 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체를 제조하는 방법이 또한 제공되며,

상기 식에서, n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이고, p는 1 내지 50의 정수(예를 들어, 접합에 이용 가능한 운반체 물질 상의 유리 아미노기의 총 수를 나타냄)이며, 는 적어도 하나의 유리 아미노기를 함유하는 운반체 물질이다. 방법은 운반체 물질을 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (B)의 화합물과 접합시켜 화학식 (I)의 당접합체를 형성하거나 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (BB)의 화합물을 접합시켜 화학식 (I)의 당접합체를 형성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 운반체 물질은 접합에 이용 가능한 적어도 하나의 아미노기, 즉 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체에서 결합을 형성하기 위한 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물의 활성화된 에스테르기 (CO)LG와 반응할 수 있는 적어도 하나의 아미노기를 함유한다. 일부 실시형태에서, 운반체 물질은 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체에서 1 내지 50개의 결합의 형성을 허용하는 1 내지 50개의 아미노기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I) 및 (II)의 화합물에서, n은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I) 및 (II)의 화합물에서 m은 1 내지 3의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, m은 2이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물과 운반체 물질 사이의 접합은 임의의 통상적인 접합 방법을 수반할 수 있다.
일부 실시형태에서, 운반체 물질은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 운반체 물질은 몇 가지 예를 들자면 센서 칩, 마이크로어세이 또는 비드를 포함할 수 있으며, 이들은 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물과 접합할 수 있는 유리 아미노기를 보유한다.
일부 실시형태에서, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드와 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물 사이의 접합 반응은 유리하게는 아스파르테이트/글루타메이트 잔기의 측쇄와 운반체 단백질 또는 펩티드 자체에 존재하는 ε-라이신 아민 사이의 운반체 단백질 또는 펩티드 자체-가교결합을 최소화하거나 피할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 접합 반응은 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 탄수화물 항원의 수가 반응물의 효능 및/또는 화학양론(예를 들어, 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물에 대한 운반체 단백질 또는 펩티드의 몰비)에 의해 제어될 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 접합 반응은 운반체 단백질 또는 펩티드당 1 내지 500, 1 내지 400, 1 내지 300, 1 내지 200, 5 내지 500, 5 내지 400, 5 내지 300, 또는 5 내지 200 몰 당량의 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 운반체 단백질 또는 펩티드는 하나 이상의 유리 아민기를 포함한다. 본원에 사용되는 "유리 아민" 또는 "유리 아민기"는 화학적 개질 및/또는 접합(예를 들어, 운반체 단백질의 주변에 노출되는 경향이 있는 용매 접근 가능한 라이신 잔기와 같은 본원에 기술된 바와 같은 탄수화물 항원에 대한)에 이용 가능한 하나 이상의 아미노기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질 상의 인접한 위치에 접합된 너무 많은 다중 탄수화물 항원을 갖는 것을 피하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 바람직하게는 라이신-풍부 도메인(예를 들어, 적어도 50%의 라이신 잔기를 포함하는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 분절)이 결여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 총 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 총 유리 아민 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 하나 이상의 유리 아민기를 갖는 하나 이상의 라이신 잔기를 포함하거나, 선택적으로 예를 들어 운반체 단백질 또는 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 용매-접근 가능한 위치에 하나 이상의 추가 라이신 잔기를 첨가하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 T 세포 에피토프를 포함하고/하거나 대상체에서 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 B 세포 에피토프를 포함하고/하거나 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 B 세포 에피토프와 T 세포 에피토프 둘 모두를 포함하고/하거나 대상체에서 체액성 면역 반응과 세포-매개 면역 반응 둘 모두를 유도한다.
바람직하게는, 본원에 기술된 운반체 단백질은 (예를 들어, 승인된 백신에서) 인간 대상체에 대한 투여에 대해 이미 규제(예를 들어, FDA) 승인을 받은 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차-반응 물질 197(CRM197), 뇌수막염균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자(H. Influenzae) 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대 파상풍 독소 831-844(서열 번호 1 또는 2), 파상풍 독소 830-843(서열 번호 5), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 이들의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 투여될 대상체에 대해 외인성이며, 바람직하게는 대상체에서 (가까운) 오르토로그(ortholog)를 갖지 않는다. 인간 백신 생성과 관련하여, 본원에 기술된 운반체 단백질은 "인간 사용에 적합한 운반체 단백질" 또는 간단히 "적합한 운반체 단백질"을 지칭하며, 이는 운반체 단백질이 인간에서 "자가-항원"으로 간주되지 않도록 인간 단백질과 항원적으로 구별되는 운반체 단백질을 의미한다. 상응하는 인간 단백질과 항원적으로 너무 유사한 운반체 단백질을 사용하는 것은, 인간 백신에 이상적이지 않을 수 있는 "자가-항원"으로 간주되는 운반체 단백질을 초래할 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)의 라이신 잔기의 ε-아미노기에 무작위로 접합된 TF 항원으로 이루어진 당접합체 면역원은 이미 기술되고 특성화되어 있다(예를 들어, 문헌[Demian et al., 2014]; 문헌[Rittenhouse-Diakun et al., 1998]; 문헌[Heimburg et al., 2006]; 문헌[Tati et al., 2017]). 그러나, BSA의 59개 라이신 잔기 상의 탄수화물 수준이 무작위적이고 비효율적일 뿐만 아니라(BSA 분자당 4 내지 6개 이하의 TF 항원이 접합됨), BSA는 인간 알부민과 너무 항원적으로 유사하기 때문에 인간 백신에서 운반체 단백질로서 적합하지 않을 것이다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질은 알부민(예를 들어, 소 혈청 알부민)이 아니다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체는 당접합체 면역원일 수 있으며, 여기서 운반체 단백질 또는 펩티드는 대상체에게 투여될 때 면역원성이며, 티오-링커를 통한 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 미접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 대상체에 투여시 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 항원 또는 운반체 단백질 또는 펩티드에 결합된 후 탄수화물 항원은 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질 또는 펩티드로부터 절단가능하지 않다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 운반체 단백질 또는 펩티드는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나 투여시 대상체에서 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 합성 당접합체는 대상체에게 투여시 탄수화물 항원에 대한 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
추가의 양태에서, 당접합체 백신 또는 면역 반응-촉발 조성물을 제조하는 방법이 본원에 기술된다. 방법은 제약상 허용되는 부형제 및/또는 보조제와 함께 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체를 제제화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 보조제는 무기 화합물, 광유, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘 수산화칼슘, 톨-유사 수용체 작용제, 면역자극성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트(Freund) 보조제, RIBI 보조제, QS-21, 무라밀 디펩티드, TiterMaxTM, SteviuneTM, StimuneTM 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
백신 조성물은 수용하는 동물의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 또는 수의학 분야의 숙련가에게 잘 알려진 투여량 및 기술로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피, 점막 투여(예: 경구, 비강, 안구) 또는 비경구 경로(예: 피내, 근육내, 피하)일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 함께 공동 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태는 비경구, 피하, 피내 또는 근육내 투여(예를 들어, 주사가능한 투여)를 위한 현탁액 및 제제, 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀젼을 포함할 수 있다. 백신은 스프레이로 투여되거나 식품 및/또는 물에 혼합되거나 멸균수, 생리 식염수, 포도당 등과 같은 적절한 운반체, 희석제 또는 부형제와 혼합되어 전달될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보조제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990]과 같은 표준 제약 교과서를 참조하여 과도한 실험 없이 적절한 제제를 제조할 수 있다.
추가의 양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체 및 본원에 기술된 바와 같은 제약상 허용되는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 당접합체 백신 또는 적응성 면역 반응-촉발 조성물이 본원에 기술된다. 실시형태에서, 당접합체 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다. 실시형태에서, 본원에 기술된 백신 조성물은 하나 이상의 TACA를 포함할 수 있고 백신 조성물은 TACA를 발현하는 암에 대한 항암 백신일 수 있다. 실시형태에서, 암은 B-세포 림프종, 유방암, 결장암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소, 전립선, 육종, 소세포 폐암 또는 위암일 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 합성 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당접합체 백신 또는 적응성 면역 반응-촉발 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 당접합체 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 질병이 있는 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 데 사용하기 위한, 또는 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화, 백신접종 또는 치료를 검출하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 합성 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당접합체 백신 또는 적응성 면역 반응-촉발 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 당접합체 백신이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 질병이 있는 대상체를 면역화 또는 치료하기 위한 백신의 제조를 위한, 또는 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화 또는 치료를 검출하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 합성 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 적응성 면역 반응-촉발 조성물이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 항원의 증가된 발현과 관련된 질병을 가진 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 합성 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당접합체 백신 또는 적응성 면역 반응-촉발 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 당접합체 백신이 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양-순환 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출 또는 스크리닝하기 위한, 또는 탄수화물 항원으로 면역화 또는 백신화로부터 생성되는 항체의 존재를 검출하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 합성 당접합체, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당접합체 백신 또는 적응성 면역 반응-촉발 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 당접합체 백신이 본원에 기술된다. 일부 실시형태에서, 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행될 수 있다.
추가의 양태에서, 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체를 투여하여 상기 대상체에서 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 단계, 및 선택적으로 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
추가의 양태에서, SARS-CoV-2와 관련된 치료 및/또는 진단 도구로 사용하기 위한 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체가 본원에 기술된다. 보다 구체적으로, SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화하는 데 사용하기 위한, 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생성을 촉발하는 데 사용하기 위한, SARS-CoV-2에 대해 대상체에서 세포-매개 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 또는 이들의 조합을 위한 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체가 본원에 기술된다. 또한, SARS-CoV-2와 관련된 검출 및/또는 진단 도구로 사용하기 위한 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체가 본원에 기술된다. 예를 들어, 대상체의 샘플에서 항-SARS-CoV-2 항체의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체가 본원에 기술된다. 이와 관련하여, SARS-CoV-2의 S 단백질 상의 탄수화물 항원(예: TF, Tn 및 이의 시알화된 변형체)의 존재와 항-탄수화물 리간드에 의한 결합에 대한 접근성을 입증하는 결과가 PCT/CA2020/051253호에 나와 있다.
본원에 사용되는 "항-SARS-CoV-2 항체"라는 표현은 천연 재조합 단백질 상에서 발현되고/되거나 조립된 비리온 입자 상에 존재하는 것과 같은 천연 형태의 항원(예를 들어, 탄수화물 항원)에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 반대로, 변성 항원에만 결합하고(예를 들어, SDS-PAGE를 따르는 것과 같은 변성 조건 하에서) 고유 형태의 동일한 항원에는 결합하지 않는 항체는 "항-SARS-CoV-2 항체"라는 표현에서 제외된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체 또는 백신은 중화 활성을 갖는 항체의 생성을 유도할 수 있다. 본원에 사용되는 "중화 활성"이라는 표현은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하여 감수성 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제하는 리간드(예: 항체)를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체는 적합한 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드, 또는 비-단백질성 중합체 물질)에 접합된 탄수화물 항원을 포함할 수 있으며, 여기서 탄수화물 항원은 TF 항원, Tn 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 탄수화물 항원은 예를 들어 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 촉발시키는 것이 요구되는지 여부에 따라 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 운반체 물질에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 서열번호 3 또는 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 단편, 예를 들어, 서열번호 3의 위치 4 및/또는 6에 또는 서열번호 4의 위치 323, 325 및/또는 678에 공유 접합될 수 있다. 특히, 서열번호 4의 위치 678(R682에서 스파이크 단백질의 푸린 절단 부위에 근접함)은 코어-1 및 코어-2 구조에 의해 O-글리코실화된 것으로 보고되었다.
일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 서열번호 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 서열의 면역원성 단편을 포함할 수 있으며, 이 단편은 서열번호 4의 위치 323, 325 및/또는 678에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 서열번호 3의 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 변형체, 예를 들어 위치 4 및/또는 6의 잔기가 탄수화물 항원에 대한 화학적 접합을 용이하게 할 수 있는 라이신 및/또는 시스테인 잔기로 대체될 수 있는 변형체에 공유 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 위치 323, 325 및/또는 678에 라이신 또는 시스테인을 갖는 서열번호 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 서열의 변형체의 면역원성 단편을 포함할 수 있으며, 상기 단편은 서열번호 4의 위치 323, 325 및/또는 678에서 라이신 또는 시스테인 잔기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원을 포함한다. 라이신 잔기의 경우, 탄수화물 항원은 본원에 기술된 접합 방법을 통해 운반체 단백질에 접합될 수 있다. 시스테인 잔기의 경우, 탄수화물 항원은 기술된 접합 방법을 통해 운반체 단백질에 접합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 운반체 물질은 서열번호 3의 펩티드, 또는 위치 4 및/또는 6에 시스테인 또는 라이신을 포함하는 서열번호 3의 펩티드의 변형체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 3의 펩티드 또는 펩티드 변형체는 운반체 물질에 포함되거나(예를 들어, 아미노산 서열로 재조합적으로 조작됨) 융합될 수 있다(예를 들어, 융합 단백질로서).
일부 실시형태에서, 운반체 물질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차-반응 물질 197(CRM197), 뇌수막염균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대 파상풍 독소 831-844(서열 번호 1 또는 2), 파상풍 독소 830-843(서열 번호 5), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 이들의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 하나 이상의 당접합체, 및 제약상 허용되는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 SARS-CoV-2 또는 COVID-19 백신 또는 적응성 면역 반응-유도 조성물이 본원에 기술된다. 당접합체는 일반적으로 SARS-CoV-2 비리온에서 발현되는 하나 이상의 탄수화물 항원, 예를 들어 SARS-CoV-2의 S(또는 S1) 단백질에서 발현되는 탄수화물 항원을 포함한다. 본원에 기술된 SARS-CoV-2 백신에 적합한 탄수화물 항원은 백신을 투여받는 대상체에서 자가 면역 반응을 촉발할 위험을 감소시키기 위해 비정상적인 글리코실화 패턴 - 즉, 대상체의 정상 또는 건강한 세포 및 조직 상에 발현되지 않는 것 - 인 탄수화물 항원이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체 또는 본원에 기술된 SARS-CoV-2 백신은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하는 항체의 생성을 유도하고, 바람직하게는 중화 활성을 갖는다(예를 들어 SARS-CoV-2 비리온 입자가 감수성 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제한다).
다른 양태에서, 본 발명은 또한 화학식 (AAPG)의 화합물에 관한 것이며,

상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 Ac이고, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로부터 선택된 2가 보호기이다.
일부 실시형태에서, 2가 PG 보호기는 PhCH이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)에서, n은 1 내지 3의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 다른 실시형태에서, n은 1이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물은 본원에 기술된 화학식 (I) 또는 (II)의 당접합체의 제조에서 중간체로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (AAPG)의 화합물 자체는 본원에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화합물 (AAPG)는 다음 화학식을 갖는다:
.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
.
항목
다음 항목들 중 하나 이상이 본원에 기술된다.
1. 화학식 (A)

- 상기 식에서 R1은 H이고 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
양성자를 유리시킬 수 있는 산의 존재 하에서 가열 하에 화학식 (A0)의 화합물을

HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 생성하는 단계, 및
상기 반응 혼합물을 냉각시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 냉각된 혼합물을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
2. 항목 1에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드, 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드를 포함하는, 방법.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 반응시키는 단계는 약 0℃ 내지 약 25℃의 혼합 온도에서 HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 용액에 화학식 (A0)의 화합물을 첨가하여, 저온에서 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 HCl을 포함하는 중간 반응 혼합물을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
5. 항목 4에 있어서, 상기 혼합 온도는 약 0℃, 또는 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 20℃, 또는 약 10℃ 내지 약 20℃, 약 10℃ 내지 약 25℃인, 방법.
6. 항목 4 또는 5에 있어서, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 상기 용액은 불활성 분위기 하에 약 0℃의 온도에서 제조되는, 방법.
7. 항목 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 반응시키는 단계는 상기 중간 반응 혼합물을 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도에서 열원과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 가열은 약 40℃ 내지 약 80℃의 반응 온도에서 약 30분 내지 5시간의 반응 시간 동안 수행되는, 방법.
9. 항목 8에 있어서, 상기 반응 온도는 약 60℃ 내지 약 80℃인, 방법.
10. 항목 8 또는 9에 있어서, 상기 반응 온도는 약 70℃인, 방법.
11. 항목 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분 내지 약 1시간인, 방법.
12. 항목 8 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분 내지 약 45분인, 방법.
13. 항목 8 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분인, 방법.
14. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드, 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
15. 항목 14에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응시키는 단계는 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 산을 포함하는 용액을 가열하는 것을 포함하는, 방법.
16. 항목 15에 있어서, 상기 용액은 디클로로메탄, 클로로포름, 1,3-디옥솔란, 디에톡시메탄, 디메톡시메탄, 2,5,7,10-테트라옥사운데칸, 디프로폭시메탄 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 추가로 포함하는, 방법.
17. 항목 15 또는 16에 있어서, 상기 반응은 약 30℃ 내지 약 70℃의 온도에서 수행되는, 방법.
18. 항목 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 0.5시간 내지 약 15시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 10시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 5시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 2시간의 반응 시간 동안 수행되는, 방법.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 냉각된 혼합물을 중화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
21. 화학식 (AAPG)

- 상기 식에서 R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기이고, n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
금속-함유 제올라이트의 존재 하에서, 화학식 (APG)의 화합물을

화학식 (A1)

- 상기 식에서 X는 -I, -Br, -Cl, -CN, -OTf(트리플레이트), -OMs(메실레이트), -OTs(토실레이트), 메틸설페이트 또는 트리클로로아세트이미데이트임 - 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 방법.
22. 항목 21에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트에서의 금속은 Ag, Al, Cd, Co, Cu, Fe, Ga, In, Mo, Pd, Pt, Sn, Sb, V, Zr 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
23. 항목 21에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트는 Sn-베타, Zr-베타, Al-베타(OH), Al-베타(F), Pt@MCM-22, K-PtSn/MFI, 0.3Pt/0.5Sn-Si-베타, Pt/Sn 2.0-베타, 0.5CoSi-베타, V-베타, H-[Fe]ZSM-5, Fe-BEA, Ga-베타, Ga-베타-200, Mo/HZSM-5, 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제올라이트를 포함하는, 방법.
24. 항목 21에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트는 은-함유 제올라이트를 포함하는, 방법.
25. 항목 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 톨루엔, 디클로로메탄-톨루엔 혼합물, DMSO-톨루엔 혼합물 및 N-메틸피롤리돈-톨루엔 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
26. 항목 21 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 톨루엔에서 수행되는, 방법.
27. 항목 21 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 분자체의 존재 하에 수행되는, 방법.
28. 항목 21 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 유형 3 Å, 유형 4 Å, 유형 5 Å, 유형 13X 또는 이들의 임의의 혼합물의 분자체의 존재 하에 수행되는, 방법.
29. 항목 21 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
30. 항목 21 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
31. 항목 21 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
32. 항목 21 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 5시간 내지 약 50시간 동안 수행되는, 방법.
33. 항목 21 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 5시간 내지 약 30시간 동안 수행되는, 방법.
34. 항목 21 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 60 내지 약 80℃에서 약 15시간 내지 약 20시간 동안 수행되는, 방법.
35. 항목 21 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 약 20 내지 약 25℃에서 약 20시간 내지 약 30시간 동안 수행되는, 방법.
36. 항목 21 내지 35 중 어느 하나에 있어서, R2는 Ac, Bz, 알릴, 벤조에이트, 메톡시메틸(MOM), 테트라하이드로프로피라닐(THP), t-부틸, 피발레이트, t-부틸디메틸실릴(TBDMS) 및 t-부틸디페닐실릴(TBDPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
37. 항목 21 내지 36 중 어느 하나에 있어서, R2는 Ac 또는 Bz인, 방법.
38. 항목 21 내지 37 중 어느 하나에 있어서, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
39. 항목 21 내지 38 중 어느 하나에 있어서, PG는 PhCH인, 방법.
40. 항목 21 내지 39 중 어느 하나에 있어서, X는 Br인, 방법.
41. 항목 21 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은 불활성 분위기 하에서 수행되는, 방법.
42. 항목 21 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
43. 항목 21 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (APG)의 화합물은 화학식 (A)

- 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물을 보호기 PG로 보호함으로써 형성되는, 방법.
44. 항목 43에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물의 보호는 PhCH(OMe)2, 트리포스겐, Me2SiCl2, Me2C(OMe)2, 2-메톡시프로펜 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐보론산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물과의 반응에 의해 수행되는, 방법.
45. 항목 43 또는 44에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물을 보호하는 것은 DMF, 디메틸 아세트아미드(DMAC), DMSO, THF, 디옥산, 1-3 디옥솔란, 아세토니트릴, 2,5-디메틸 테트라하이드로푸란(DMTHF), 감마-바테로락톤(GVL), 디하이드로레보글루코세론(Cyrene), 메틸 레불리네이트(ML), 에틸 레불리네이트(EL), 에틸 레불리네이트 프로필렌글리콜 케탈(ELPK), 디메틸 글루타레이트(DMG), 디메틸프로필렌 우레아(DMPU), 폴리(프로필렌글리콜)(PPG), 글리코푸롤(THFP), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트([emim][OAc]) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
46. 항목 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물은 항목 1 내지 20 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
47. 화학식 (AA)

- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서,
항목 21 내지 46 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어진 화학식 (AAPG)의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하는, 방법.
48. 항목 47에 있어서, 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음 상기 중간 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 항목 48에 있어서, 상기 염기성 용액은 메톡시드, 에톡시드 및 2-메틸프로판-2-올레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함하고, 바람직하게는 상기 염기는 나트륨 메톡시드인, 방법.
50. 항목 48 또는 49에 있어서, 상기 염기성 용액은 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 포함하고, 바람직하게는 용매는 메탄올인, 방법.
51. 항목 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액은 아세트산-물 혼합물 또는 에탄올산-물 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 용액은 아세트산 수용액인, 방법.
52. 항목 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행되는, 방법.
53. 항목 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
54. 항목 48 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도에서 수행되는, 방법.
55. 항목 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 1시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
56. 항목 48 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물과 반응한 후 염기성 용액을 중화하고 임의의 액체를 증발시켜 미정제 형태의 중간 생성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
57. 항목 48 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 중간 생성물은 산성 용액으로 처리될 때 미정제인, 방법.
58. 화학식 (AA)의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서,

화학식 (AAPG)

- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기임 - 의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하고,
상기 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 미정제 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음, 상기 중간 미정제 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
59. 항목 58에 있어서, 상기 염기성 용액은 메톡시드, 에톡시드 및 2-메틸프로판-2-올레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함하고, 바람직하게는 상기 염기는 나트륨 메톡시드인, 방법.
60. 항목 58 또는 59에 있어서, 상기 염기성 용액은 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 포함하고, 바람직하게는 용매는 메탄올인, 방법.
61. 항목 58 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액은 아세트산-물 혼합물 또는 에탄올산-물 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 용액은 아세트산 수용액인, 방법.
62. 항목 58 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행되는, 방법.
63. 항목 58 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
64. 항목 58 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도에서 수행되는, 방법.
65. 항목 58 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 1시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
66. 항목 58 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물과 반응한 후 염기성 용액을 중화하고 임의의 액체를 증발시켜 중간 미정제 생성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
67. 항목 58 내지 66 중 어느 하나에 있어서, R2는 Ac 또는 Bz, 바람직하게는 Bz인, 방법.
68. 항목 58 내지 67 중 어느 하나에 있어서, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
69. 항목 58 내지 68 중 어느 하나에 있어서, PG는 PhCH인, 방법.
70. 화학식 (B) 또는 화학식 (BB)

- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이며, LG는 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물이 아미노기와 반응할 때 아미도 결합 형성을 가능하게 하는 이탈기임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
화학식 (C)의 화합물을,

화학식 (A)

- 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물과 반응시켜 화학식 (B)의 화합물을 형성하거나,
화학식 (AA)의 화합물과 반응시켜

화학식 (BB)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
71. 항목 70에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에 수행되는, 방법.
72. 항목 71에 있어서, 상기 광개시제는 유리 라디칼-생성 아조 화합물, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), 금속 또는 금속 이온 기반 광개시제, 과산화물, 과황산암모늄, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
73. 항목 72에 있어서, 상기 유리 라디칼-생성 아조 화합물은 아조비스이소부티로니트릴(AIBN); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA); 1,1'-아조비스(시아노사이클로헥산)(ACHN); 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD); 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-(디아젠-1,2-디일)비스(4-시아노펜탄산); 2,2'-아조디(2-메틸부티로니트릴); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
74. 항목 72 또는 73에 있어서, 상기 퍼옥사이드는 tert-부틸 퍼옥시이소부티레이트, tert-부틸 하이드로퍼옥사이드, 벤조일 퍼옥사이드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
75. 항목 70 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 물 또는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
76. 항목 70 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 물, 디옥산, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란(THF), 디이소프로필 에테르, 이소프로판올, 클로로벤젠, 메틸-tert-부틸 에테르, 메탄올, 에탄올, tert-부탄올, 클로로포름 및 이들의 임의의 조합으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 용매에서 수행되는, 방법.
77. 항목 70 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 40℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
78. 항목 70 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물과 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물을 반응시키는 것은 약 1시간 내지 약 10시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
79. 항목 70에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 가시광선 흡수 전이 금속 광촉매의 존재 하에서 가시광선 하에 수행되는, 방법.
80. 항목 70에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 자외선 조사 하에 수행되는, 방법.
81. 항목 70에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에서 자외선 조사 하에 수행되는, 방법.
82. 항목 81에 있어서, 상기 광개시제는 2,2'-아지도비스[2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
83. 항목 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 임의의 조합과 같은 알코올성 용매에서 수행되는, 방법.
84. 항목 80 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 20℃ 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
85. 항목 80 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물과 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물을 반응시키는 것은 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
86. 항목 80 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 자외선 조사는 단파, 중파 또는 장파 자외선 조사인, 방법.
87. 항목 70 내지 86 중 어느 하나에 있어서, m은 1 내지 3의 정수인, 방법.
88. 항목 70 내지 87 중 어느 하나에 있어서, m은 2인, 방법.
89. 항목 70 내지 88중 어느 하나에 있어서, LG는 OPhF5 또는 OPhF4(파라 SO3Na)와 같은 O-플루오로페닐기, 또는 O-(N-석신이미딜)기인, 방법.
90. 항목 70 내지 89 중 어느 하나에 있어서, LG는 O-(N-석신이미딜)기인, 방법.
91. 항목 70 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물은 항목 1 내지 20 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
92. 항목 70 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (AA)의 화합물은 항목 47 내지 69 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
93. 화학식 (I) 또는 (II)

- 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이고, p는 1 내지 50의 정수이며, 은 접합에 이용 가능한 적어도 하나의 아미노기를 함유하는 운반체 물질임 - 의 당접합체를 제조하는 방법으로서,
상기 운반체 물질의 적어도 하나의 유리 아미노기를 화학식 (B)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하거나, 화학식 (BB)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하는 단계를 포함하며, 상기 화학식 (B) 및 (BB)의 화합물은 항목 70 내지 92 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
94. 항목 93에 있어서, 상기 운반체 물질은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는, 방법.
95. 항목 1 내지 94 중 어느 하나에 있어서, n은 1 내지 3의 정수인, 방법.
96. 항목 1 내지 95 중 어느 하나에 있어서, n은 1 또는 2인, 방법.
97. 항목 1 내지 96 중 어느 하나에 있어서, n은 1인, 방법.
98. 화학식 (AAPG)의 화합물로서,

상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 Ac이고, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로부터 선택된 2가 보호기인, 화합물.
99. 항목 98에 있어서, PG는 PhCH인, 화합물.
100. 항목 98 또는 99에 있어서, n은 1 내지 3의 정수인, 화합물.
101. 항목 98 내지 100 중 어느 하나에 있어서, n은 1 또는 2인, 화합물.
102. 항목 98 내지 101 중 어느 하나에 있어서, n은 1인, 화합물.
103. 항목 98에 있어서, 하기 화학식을 갖는, 화합물:
.
104. 하기 화학식의 화합물:
.
실시예
다양한 반응성 탄수화물이 반응식 2에 따라 그리고 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 합성되었다. 또한, 당접합체 (I) 및 (II)를 형성하기 위한 단백질 접합이 수행되었고 접합은 ELISA, 웨스턴 블롯, MALDI-TOF 및 브래드포드 분석으로 평가되었다.
반응식 2

반응은 상업적으로 입수 가능한 HPLC 등급을 사용하여 아르곤 분위기에서 수행되었다. 상업적으로 이용 가능한 시약(Sigma Aldrich 및 Fisher Scientific, Canada)을 추가 정제 없이 사용했다. N-아세틸-D-갈락토사민은 Rose Scientific Ltd.(캐나다 앨버타)에서 제공받았다. 반응의 진행은 실리카 겔 60 F254 코팅 플레이트(E. Merck)를 사용하는 박층 크로마토그래피에 의해 모니터링되었다. 플래시 크로마토그래피는 Canadian Life Science의 ZEOprepTM 실리카 겔 60(40-63 μm) 또는 Buchi의 FlasuPureTM 시스템을 사용하여 수행되었다. 검출은 UV 광 하에서, 또는 20% 에탄올성 황산 또는 몰리브데이트 또는 KMnO4 용액을 분무한 후 가열함으로써 수행되었다. NMR 스펙트럼은 Bruker ULTRASHIELDTM 300 ㎒ 및 Bruker Avance™III HD 400 및 600 ㎒ 분광계에서 기록되었다. 양성자 및 탄소 화학적 이동(δ)은 7.27 ppm(1H) 및 77.00 ppm(13C)으로 설정된 잔류 CHCl3의 화학적 이동에 대해 ppm으로 보고된다. 결합 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 보고되며 다음 약어가 피크 다중도에 사용된다: 단일선(s), 이중선(d), 이중선의 이중선(dd), 결합 상수가 동일한 이중선의 이중선(tap), 삼중선(t), 다중선(m). 분석 및 할당은 COSY(Correlated SpectroscopY) 및 HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) 실험을 사용하여 이루어졌다. 고분해능 질량 스펙트럼(HRMS)은 Thermo Scientific의 LC-MS-TOF(Liquid Chromatography Mass Spectrometry Time Of Flight) 기기를 사용하여 양성 및/또는 음성 전기분무 모드에서 측정되었다. 양성자화 이온 (M+H)+ 또는 나트륨 부가물 (M+Na)+를 실험식 확인에 사용하였다. LC 방법: 실온에서 800 μL/분의 유량으로 물(A) 및 아세토니트릴(B) - 둘 모두 0.1% 아세트산을 함유 - 을 사용하는 Dionex UltimateTM 3000 시스템(Thermo Scientific)을 사용하여 5 μm 입자(BUCHI)를 갖는 PrePureTM C18 150x4,6 mm 컬럼에 샘플을 주입했다(2 μL). 구배는 5% B에서 시작하여 0,5 동안 유지되었다. 1분 만에 15% B, 그 다음 14,5분 만에 27% B, 그 다음 4분 만에 95% B로 증가했다. 구배는 2분 동안 95% B에서 유지되었고, 그 다음 1분 만에 5% B로 감소했다. 마지막으로, 구배는 5% B에서 1분 동안 유지되었다. 총 시간은 24분이다. MS 방법: MS 스펙트럼은 4,5 kV 소스 전압, 320℃ 소스 온도로 설정된 양이온 모드에서 HESI 이온 소스가 장착된 TSQ Quantum Access MaxTM(Thermo Scientific)에서 수집되었다. MS 획득은 SCAN 모드에서 m/z 200-1000으로부터 이루어졌다. 데이터는 Thermo XCalibur Qual BrowserTM를 사용하여 분석되었다.
실시예 1: 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (2)의 합성
아세틸 클로라이드(4.85 mL, 68.0 mmol, 3.4 당량)를 0℃에서 N2 하에 알릴 알코올(80 mL)에 첨가하였다. 용액을 이 온도에서 1시간 동안 교반한 다음 N-아세틸갈락토사민(GalNAc, (1), 4.42 g, 20.0 mmol, 1.0 당량)을 실온에서 용액에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반했다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후 0℃로 유지하였다. 용액을 MeOH(40 mL)로 희석하고 pH 7.0에 도달할 때까지 고체 NaHCO3(8.0 g)로 중화시켰다. 혼합물을 celiteTM 패드로 여과하고 MeOH로 세척하였다. 그 다음 용매를 감압 하에 제거하였다. 건조 미정제 생성물은, 1) 물(50 mL)에 용해되고 DCM(4 x 200 mL)에 이어 EtOAc(200 mL)로 세척되고, 수성 층이 분리된 다음 -80℃에서 유지된 후 동결건조되거나; 또는 2) MeOH/헥산 또는 EtOH/디이소프로필 에테르에 침전되거나; 또는 3) 구배(EtOAc 100% 내지 EtOAc/MeOH 4:1)를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되어 원하는 생성물인 알릴 GalNAc(2)를 흰색 고체(4.18 mg, 1.60 mmol, 80%)로 제공하였다. Rf = 0.30; ACN/H2O 95:5; 1H NMR (CD3OD, 600 ㎒): δ 5.99-5.88 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.31 (dd, 1H, J trans = 17.3, J gem = 1.3 ㎐, OCH2CH=CH 2), 5.17 (dd, 1H, J cis = 10.5 ㎐, OCH2CH=CH 2), 4.86 (d, 1H, J 1,2 = 3.8 ㎐, H-1), 4.27 (dd, 1H, J 2,3 = 11.0 ㎐, H-2), 4.20 (m, 1H, OCH 2), 4.00 (m, 1H, OCH 2), 3.89 (dd, J 3,4 = J 4,5 = 2.6 ㎐, H-4), 3.85-3.77 (m, 2H, H-3 및 H-5), 3.72 (m, 2H, H-6a 및 H-6b) 및 1.99 ppm (s, 3H, CH 3); 13C NMR (CD3OD, 150 ㎒): δ 172.5 (NHCO), 134.2 (OCH2 CH=CH2), 116.1 (OCH2CH=CH2), 96.6 (C-1), 71.2 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5). 67.8 (OCH2), 61.4 (C-6), 50.2 (C-2) 및 21.2 ppm (CH3). ESI+-HRMS: C11H20O6N에 대해 계산된 [M+H]+, 262.1285; 실측치, 262.1294. LC-MS: rt = 4.94 분.
실시예 2: 알릴 2-아세트아미도-4,6- O -벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (3)의 합성 건조 DMF(20 mL) 중 알릴 GalNAc(2)(2.35 g, 9.0 mmol, 1.0 당량) 및 벤즈알데히드 디메틸아세탈(6.75 mL, 45.0 mmol, 5.0 당량)의 용액에 촉매량의 p-톨루엔설폰산 일수화물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 혼합물을 CHCl3로 희석하고 NaHCO3 포화 수용액으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고 물로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 농축하여 흰색 고체를 얻었다. 벤질리덴 아세탈(화합물 (3))을 EtOAc/헥산에서 침전시킴으로써 흰색 고체(2.64 g, 7.56, 84%)로 단리했다. Rf = 0.21; DCM/MeOH 9.0:0.5; 1H NMR (CDCl3, 300 ㎒): δ 7.59-7.46 (m, 2H, H-ar), 7.43-7.31 (m, 3H, H-ar), 5.91 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.75 (d, 1H, J NH,H2 = 9.0 ㎐, NH), 5.58 (s, 1H, PhCH), 5.34-5.17 (m, 2H, OCH2CH=CH 2), 5.01 (d, 1H, J 1,2 = 3.5 ㎐, H-1), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J 2,3 = 10.9 ㎐, J 2,OH = 9.1 ㎐, H-2), 4.34 (dd, 1H, J 5,6a = 1.5 ㎐, J 6a,6b = 12.5 ㎐, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J 5,6b = 1.6 ㎐, J 6a,6b = 12.5 ㎐, H-6b), 4.01 (m, OCH 2), 3.86 (dd, 1H, J 3,4 = 10.9 ㎐, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J 3,OH = 10.7 ㎐, OH-3) 및 2.05 ppm (s, 3H, CH 3). ESI+-HRMS: C18H24O6N에 대해 계산된 [M+H]+, 350.1598; 실측치, 350.1608. LC-MS: rt = 19.78 분.
실시예 3: 알릴(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6- O -벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (5a)의 합성
화합물 (3) (657 mg, 1.88 mmol, 1.0 당량) 및 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-갈락토피라노실 브로마이드(화합물 (4b), 3.48 g, 8.46 mmol, 4.5 당량)를 아르곤 분위기 하에 70℃에서 18시간 동안 4 Å 분자체(800 mg)를 함유하는 무수 톨루엔(60 mL)에서 은-교환 제올라이트(2.56 g)와 함께 교반하였다. 그 다음 혼합물을 celiteTM 패드 아래에서 걸러내었다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 100% 헥산 내지 헥산/EtOAc 1:4의 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 원하는 이당류 화합물 (5a)를 백색 고체(817 mg, 1.20 mmol, 64%)로 얻었다. Rf = 0.24; 헥산/EtOAc 1:4; 1H NMR (CDCl3, 400 ㎒): δ 7.57-7.50 (m, 2H, H-ar), 7.42-7.30 (m, 3H, H-ar), 5.97-5.80 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.63-5.545 (m, 3H), 5.38 (dd, 1H, J 3,4' = 3.3 ㎐, J 4,5' = 1.0 ㎐, H-4II), 5.33-5.14 (m, 4H), 5.05 (d, 1H, J = 3.5 ㎐, H-1), 5.11-5.00 (m, 1H, H-2), 4.76 (d, 1H, J = 7.9 ㎐, H-1'), 4.68 (m, 1H), 4.30-3.80 (m, 7H), 3.65 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 1.99 (s, 3H) 및 1.97 ppm (s, 3H). ESI+-HRMS: C32H42O15N에 대해 계산된 [M+H]+, 680.2549; 실측치, 680.2549 (0.0 ppm). LC-MS: rt = 13.11 분.
실시예 4: 알릴(2,3,4,6-테트라- O -벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6- O -벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (5b)의 합성
화합물 (3) (101 mg, 0.29 mmol, 1.0 당량) 및 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-갈락토피라노실 브로마이드(화합물 (4b), 239 mg, 0.58 mmol, 2.0 당량)를 아르곤 분위기 하에 70℃에서 18시간 동안 4 Å 분자체를 함유하는 무수 톨루엔(10 mL)에서 은-교환 제올라이트(430 mg)와 함께 교반하였다. 그 다음 혼합물을 celiteTM 패드 아래에서 걸러내었다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 100% 헥산 내지 헥산/EtOAc 1:2의 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 원하는 이당류 화합물 (5b)를 백색 고체(250 mg, 0.27 mmol, 94%)로 얻었다. mp : 110-111℃; Rf = 0.20; 헥산/EtOAc 1:2; 1H NMR (CDCl3, 600 ㎒): δ 8.06-7.19 (m, 25H, H-ar), 5.98 (dd, 1H, J 3,4' = 3.3 ㎐, J 4,5' = 1.0 ㎐, H-4II), 5.85-5.78 (m, 2H, OCH2CH=CH2 및 H-2II), 5.60 (dd, 1H, J 2,3' = 10.2 ㎐, J 3,4' = 3.4 ㎐, H-3II), 5.48 (sb, 1H, NH), 5.23 (m, 3H, OCH2CH=CH 2 및 H-1), 4.68 (dd, 1H, J 5',6a' = 6.9 ㎐, J 6a',6b' = 11.4 ㎐, H-6aI), 4.63-4.58 (m, 1H, H-2), 4.46-4.36 (m, 3H, H-4. H-5 및 H-6bII), 4.14-4.07 (m, 3H, H-6a, OCH 2 및 H-3), 3.96 (m, 1H, OCH 2), 3.75 (m, 1H, H-6b), 3.51 (m, 1H, H-5) 및 1.40 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (CDC13, 150 ㎒): δ 170.0 (NHCO), 166.0, 165.5, 165.4, 165.2 (CO), 137.6-126.2 (멀티, 30 C-arom), 133.2 (OCH2 CH=CH2), 117.8 (OCH2CH=CH2), 102.0 (C-1II), 100.9 (CPhCH), 97,3 (C-1I), 76.1 (C-3), 75.4 (C-4), 71.7 (C-3II 및 C-5II), 70.2 (C-2II), 69.1 (C-6), 68.6 (OCH2), 68.1 (C-4II), 62.9 (C-5), 62.6 (C-6I), 48.2 (C-2) 및 22.5 ppm (CH3). ESI+-HRMS: C52H50O15N에 대해 계산된 [M+H]+, 928.3175; 실측치, 928.3133.
실시예 5: 알릴(β-D-갈락토프라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (6)의 합성
메탄올(12 mL, pH 8-9) 중 1 M 나트륨 메톡시드 중 화합물 (5b)(1.12 g, 1.20 mmol, 1.0 당량)의 용액을 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 용액은 이온 교환 수지(AmberliteTM IR 120, H+)를 첨가함으로써 중화되고, 여과되고, MeOH로 세척되고, 용매를 감압 하에 제거하여 중간체를 백색 고체로 얻었다. 그 다음 백색 고체 중간체를 60% 아세트산 수용액 10 mL에 용해시키고 생성된 용액을 60℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 물에 용해시키고 디클로로메탄으로 여러 번, EtOAc로 두 번 세척하였다. 그 다음 수 층을 동결건조하여 탈보호된 알릴 화합물 (6)을 백색 고체(400 mg, 0.94 mmol, 79%)로 얻었다. mp = 230-232℃; Rf = 0.53; CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1; 1H NMR (D2O, 600 ㎒): δ 5.80 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.19 (dd, 1H, J trans = 17.3 ㎐, OCH2CH=CH 2), 5.09 (dd, 1H, J cis = 10.4 ㎐, OCH2CH=CH 2), 4.77 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 ㎐, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 ㎐, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 7.8 ㎐, H-1II), 4.16 (dd, 1H, J 2,3 = 11.2 ㎐, J 1,2 = 3.7 ㎐, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5 및 OCH 2), 3.73 (dd, 1H, H-4II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,b 및 H-6'a,b), 3.47 (m, 2H, H-3II 및 H-5II), 3.39 (dd, 1H, J 2',3' = 10.0 ㎐, J 1',2' = 7.7 ㎐, H-2II) 및 1.85 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (D2O, 150 ㎒): δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH2 CH=CH2), 117.9 (OCH2CH=CH2), 104.7 (C-1II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.5 (C-3II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4II), 68.4 (OCH2), 61.2 (C-6II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2) 및 22.0 ppm (CH3). ESI+-HRMS: C17H29O11NNa에 대해 계산된 [M+Na]+, 446.1633; 실측치, 446.1613. LC-MS: rt = 4.77 분.
실시예 6: N -숙신이미딜-3-{[3-(β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토프라노실)옥시프로필]티오}프로파노에이트 (11b) 및 단백질 CRM197과의 접합으로 당접합체 (II)의 형성
화합물 (6)(138 mg, 0.53 mmol, 1.0 당량), 화합물 (7)(538 mg, 2.65 mmol, 5 당량 - Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수 가능) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(ACVA, 1.5 mg, 0.05 mmol, 0.1 당량)을 탈기된 아세토니트릴(5 mL)에서 환류(70℃)에서 2시간 동안 교반하였다. 실온으로 되돌린 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 화합물 (6) 및 화합물 (7)은 또한 25℃에서 20분 동안 UV 조사(280-320 nm) 하에 THF/물(1:1; v/v) 중의 DMPA(0.1 당량)로 재활성화될 수 있다. 미정제 생성물을 물에 현탁시키고 디클로로메탄으로 여러 번 세척하고 EtOAc로 두 번 세척함으로써 석신이미드 시약을 제거하여 추출했다. 미정제 화합물 (11b; NHS-TF)를 함유하는 최종 수성 층을 -80℃로 냉각시켜 동결건조시켰다. 그 다음, 미정제 화합물 (11b)를 추가 정제 없이 단백질 CRM197과의 접합 단계에서 직접 사용하여 당접합체 (II; CRM-TF)를 얻었다. 또한 미정제 백색 고체를 C-18 상에서 역 분취용 HPLC로 정제하여 흰색 고체 11b를 얻었다. 순수 화합물 (11b)를 단백질 CRM197과의 접합 단계에서 사용하여 당접합체 (II; CRM-TF)를 얻었다. 1H NMR (D2O, 400 ㎒): δ 4.83 (d, 1H, J = 3.7 ㎐, H-1), 4.40 (d, 1H, J = 7.7 ㎐, H-1II), 4.25 (dd, 1H, J = 17.0, 6.9 ㎐), 4.18 (d, 1H, J = 2.6 ㎐), 4.02-3.90 (m, 2H), 3.84 (d, 1H, J = 3.1 ㎐), 3.80-3.62 (m, 5H), 3.62-3.40 (m, 4H), 3.02 (t, 2H, J = 6.7 ㎐), 2.96-2.83 (m, 5H), 2.79-2.55 (m, 3H), 1.96 (s, 3H) 및 1.87 (dd, 2H, J = 12.9, 6.4 ㎐); 13C NMR (D2O, 100 ㎒,): δ 176.6, 174.6, 173.3, 169.2, 104.8, 97.2, 77.3, 75.0, 72.6, 70.6, 68.8, 68.6, 66.4, 66.3, 61.2, 61.0, 48.7, 34.3, 31.4, 28.4, 28.2, 26.3, 25.7, 25.6, 25.2, 및 22.0 ppm (CH3). ESI+-HRMS: C24H38O15N2SNa에 대해 계산된 [M+Na]+, 649.18851; 실측치, 649.18838, 0.2 ppm. HPLC: Tr = 10.747.
접합 단계를 위해, 운반체 단백질을 원심 여과(AmiconTM MWCO; 10 또는 30K)에 의해 pH 8에서 PBS로 완충액 교환하고 그 농도를 2 mg/ml로 조정하였다. BSA를 표준으로 하는 브래드포드 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 단백질에 대한 접합은 1 mg/ml의 최종 단백질 농도에 도달하도록 단백질에 물 중의 화합물 (11b)의 새로운 20 mM 용액을 첨가함으로써 개시되었다. 단백질에 첨가되는 화합물 (11b)의 양은 단백질의 표면 접근 가능한 라이신의 수 및 의도하는 접합의 최종 비에 따라 조정될 수 있다. 그 다음, 용액을 90분 동안 볼텍싱한 다음, pH 7.4에서 PBS를 사용하는 원심 여과(AmiconTM MWCO; 10 또는 30K)를, 또는 겔 여과에 의해 세척하였다.
화합물 (11b)에 대한 단백질의 접합, 즉 당접합체 (II)의 획득은 ELISA, 웨스턴 블롯, MALDI-TOF 및 브래드포드 분석에 의해 증명되었다.
NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율(0.2, 0.6, 3)에서 0.01 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))에 대한 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(PNA) 및 항-TF 단일클론 항체 JAAF11의 반응성은 ELISA에 의해 결정되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, ELISA는 접합 조건과 생성된 당접합체의 반응성 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 2는 NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 1 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 미접합 CRM에 대해 접합 조건의 함수에서 당접합체 밴드의 이동성에서 관찰된 감소는 CRM이 접합됨을 나타낸다.
NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 검출된 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 1 μg의 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 웨스턴 블롯은 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(PNA) 및 항-TF 단일클론 항체 JAAF11을 사용하여 기록되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯은 CRM이 접합됨을 나타내는 접합 조건 및 미접합 CRM에 대한 반응성의 부재와 관련하여 증가하는 분자량의 PNA와 JAAF11 둘 모두에 대한 반응성 밴드를 나타낸다.
NHS-TF(화합물 (11b)) 대 단백질의 총 라이신 수의 3가지 다른 비율에서 미접합 CRM197 및 TF에 접합된 CRM197(CRM-TF: 당접합체 (II))의 MALDI-TOF 스펙트럼이 기록되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 스펙트럼은 접합 조건의 함수에서 질량의 증가를 나타낸다. 삽입된 표는 질량 증가 및 TF에 대한 접합의 평균 몰비를 보여준다.
실시예 7: N -숙신이미딜-3-[3-(2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실옥시프로필)티오]-프로파노에이트 (11a) 및 단백질 CRM197과의 접합으로 당접합체 (I)의 형성
화합물 (2)(200 mg, 0.765 mmol, 1.0 당량), 화합물 (7)(933 mg, 4.59 mmol, 6.0 당량) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(ACVA, 2 mg, 0.08 mmol, 0.01 당량)을 탈기된 아세토니트릴 및 이소프로판올(4.0 mL, 1:1)에서 환류(70℃)에서 2시간 동안 교반하였다. 실온으로 되돌린 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 미정제 생성물을 물에 현탁시키고, A) C18 실리카 겔 상의 크로마토그래피 또는 C18 HPLC에 의해, 또는 B) 디클로로메탄으로 여러 번 그리고 EtOAc로 두 번 세척하여 석신이미드 시약을 제거하는 추출에 의해 정제하였다. 미정제 화합물 (11a; NHS-TN)을 함유하는 최종 수성 층을 -80℃로 냉각시켜 동결건조시켰다. 그 다음, 미정제 화합물 (11a)를 추가 정제 없이 단백질 CRM197과의 접합 단계에서 직접 사용하여 당접합체 (I; CRM-TN)을 얻었다.
접합 단계를 위해, 운반체 단백질을 원심 여과(AmiconTM MWCO; 10 또는 30K)에 의해 pH 8에서 PBS로 완충액 교환하고 그 농도를 2 mg/ml로 조정하였다. BSA를 표준으로 하는 브래드포드 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 단백질에 대한 접합은 1 mg/ml의 최종 단백질 농도에 도달하도록 단백질에 물 중의 화합물 (11a)의 새로운 20 mM 용액을 첨가함으로써 개시되었다. 단백질에 첨가되는 화합물 (11a)의 양은 단백질의 표면 접근 가능한 라이신의 수 및 의도하는 접합의 최종 비에 따라 조정될 수 있다. 그 다음, 용액을 90분 동안 볼텍싱한 다음, pH 7.4에서 PBS를 사용하는 원심 여과(AmiconTM MWCO; 10 또는 30K), 또는 겔 여과에 의해 세척하였다.
SEQUENCE LISTING <110> KORANEX CAPITAL <120> PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF REACTIVE CARBOHYDRATES INCLUDING ANTIGEN PRECURSORS FOR CONJUGATION WITH A CARRIER MATERIAL <130> 20187-50 <150> IN 202121001963 <151> 2021-01-15 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 1 Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dTT831-844-Cys-beta-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 2 Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-glycosylated peptide from S1 protein of SARS-CoV-2 <400> 3 Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg 1 5 <210> 4 <211> 1273 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 4 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1010 1015 1020 Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys 1025 1030 1035 Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 1040 1045 1050 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1055 1060 1065 Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His 1070 1075 1080 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn 1085 1090 1095 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln 1100 1105 1110 Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val 1115 1120 1125 Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro 1130 1135 1140 Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn 1145 1150 1155 His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu 1175 1180 1185 Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu 1190 1195 1200 Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu 1205 1210 1215 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met 1220 1225 1230 Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1250 1255 1260 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dTT830-843 <400> 5 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10

Claims (104)

  1. 화학식 (A)

    - 상기 식에서 R1은 H이고 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
    양성자를 유리시킬 수 있는 산의 존재 하에서 가열 하에 화학식 (A0)의 화합물을

    HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 생성하는 단계, 및
    상기 반응 혼합물을 냉각시켜 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 냉각된 혼합물을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드, 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 반응시키는 단계는 약 0℃ 내지 약 25℃의 혼합 온도에서 HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 용액에 화학식 (A0)의 화합물을 첨가하여, 저온에서 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 HCl을 포함하는 중간 반응 혼합물을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혼합 온도는 약 0℃, 또는 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 20℃, 또는 약 10℃ 내지 약 20℃, 약 10℃ 내지 약 25℃인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 아세틸 클로라이드를 포함하는 상기 용액은 불활성 분위기 하에 약 0℃의 온도에서 제조되는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 반응시키는 단계는 상기 중간 반응 혼합물을 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도에서 열원과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열은 약 40℃ 내지 약 80℃의 반응 온도에서 약 30분 내지 5시간의 반응 시간 동안 수행되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 반응 온도는 약 60℃ 내지 약 80℃인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 반응 온도는 약 70℃인, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분 내지 약 1시간인, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분 내지 약 45분인, 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 시간은 약 30분인, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산은 아세틸 클로라이드, 아세트산, 산성 양이온 교환 수지, 캄포설폰산, p-톨루엔설폰산 일수화물, HCl 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화학식 (A0)의 화합물을 HO-(CH2)n-CH=CH2와 반응시키는 단계는 화학식 (A0)의 화합물, HO-(CH2)n-CH=CH2 및 산을 포함하는 용액을 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 용액은 디클로로메탄, 클로로포름, 1,3-디옥솔란, 디에톡시메탄, 디메톡시메탄, 2,5,7,10-테트라옥사운데칸, 디프로폭시메탄 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 반응은 약 30℃ 내지 약 70℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 0.5시간 내지 약 15시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 10시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 5시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 2시간의 반응 시간 동안 수행되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉각된 혼합물을 중화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 화학식 (AAPG)

    - 상기 식에서 R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기이고, n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
    금속-함유 제올라이트의 존재 하에서, 화학식 (APG)의 화합물을

    화학식 (A1)

    - 상기 식에서 X는 -I, -Br, -Cl, -CN, -OTf(트리플레이트), -OMs(메실레이트), -OTs(토실레이트), 메틸설페이트 또는 트리클로로아세트이미데이트임 - 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트에서의 금속은 Ag, Al, Cd, Co, Cu, Fe, Ga, In, Mo, Pd, Pt, Sn, Sb, V, Zr 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트는 Sn-베타, Zr-베타, Al-베타(OH), Al-베타(F), Pt@MCM-22, K-PtSn/MFI, 0.3Pt/0.5Sn-Si-베타, Pt/Sn 2.0-베타, 0.5CoSi-베타, V-베타, H-[Fe]ZSM-5, Fe-BEA, Ga-베타, Ga-베타-200, Mo/HZSM-5, 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제올라이트를 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 금속-함유 제올라이트는 은-함유 제올라이트를 포함하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 톨루엔, 디클로로메탄-톨루엔 혼합물, DMSO-톨루엔 혼합물 및 N-메틸피롤리돈-톨루엔 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 톨루엔에서 수행되는, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 분자체의 존재 하에 수행되는, 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 유형 3 Å, 유형 4 Å, 유형 5 Å, 유형 13X 또는 이들의 임의의 혼합물의 분자체의 존재 하에 수행되는, 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 5시간 내지 약 50시간 동안 수행되는, 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 5시간 내지 약 30시간 동안 수행되는, 방법.
  34. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 60 내지 약 80℃에서 약 15시간 내지 약 20시간 동안 수행되는, 방법.
  35. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 20 내지 약 25℃에서 약 20시간 내지 약 30시간 동안 수행되는, 방법.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 Ac, Bz, 알릴, 벤조에이트, 메톡시메틸(MOM), 테트라하이드로프로피라닐(THP), t-부틸, 피발레이트, t-부틸디메틸실릴(TBDMS) 및 t-부틸디페닐실릴(TBDPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 Ac 또는 Bz인, 방법.
  38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, PG는 PhCH인, 방법.
  40. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, X는 Br인, 방법.
  41. 제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 불활성 분위기 하에서 수행되는, 방법.
  42. 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (APG)의 화합물은 화학식 (A)

    - 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물을 보호기 PG로 보호함으로써 형성되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물의 보호는 PhCH(OMe)2, 트리포스겐, Me2SiCl2, Me2C(OMe)2, 2-메톡시프로펜 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐보론산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물과의 반응에 의해 수행되는, 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물을 보호하는 것은 DMF, 디메틸 아세트아미드(DMAC), DMSO, THF, 디옥산, 1-3 디옥솔란, 아세토니트릴, 2,5-디메틸 테트라하이드로푸란(DMTHF), 감마-바테로락톤(GVL), 디하이드로레보글루코세론(Cyrene), 메틸 레불리네이트(ML), 에틸 레불리네이트(EL), 에틸 레불리네이트 프로필렌글리콜 케탈(ELPK), 디메틸 글루타레이트(DMG), 디메틸프로필렌 우레아(DMPU), 폴리(프로필렌글리콜)(PPG), 글리코푸롤(THFP), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트([emim][OAc]) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물은 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
  47. 화학식 (AA)

    - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수임 - 의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서,
    제21항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 화학식 (AAPG)의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음 상기 중간 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 염기성 용액은 메톡시드, 에톡시드 및 2-메틸프로판-2-올레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함하고, 바람직하게는 상기 염기는 나트륨 메톡시드인, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 염기성 용액은 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 포함하고, 바람직하게는 상기 용매는 메탄올인, 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액은 아세트산-물 혼합물 또는 에탄올산-물 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 용액은 아세트산 수용액인, 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행되는, 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 1시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물과 반응한 후 염기성 용액을 중화하고 임의의 액체를 증발시켜 미정제(crude) 형태의 중간 생성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간 생성물은 산성 용액으로 처리될 때 미정제인, 방법.
  58. 화학식 (AA)의 반응성 탄수화물의 합성 방법으로서,

    화학식 (AAPG)

    - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 1가 보호기이고, PG는 2가 보호기임 - 의 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하고,
    상기 탈보호는 화학식 (AAPG)의 화합물을 염기성 용액과 반응시켜 중간 미정제 생성물을 형성하는 단계, 및 그 다음, 상기 중간 미정제 생성물을 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 염기성 용액은 메톡시드, 에톡시드 및 2-메틸프로판-2-올레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 포함하고, 바람직하게는 상기 염기는 나트륨 메톡시드인, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 염기성 용액은 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 포함하고, 바람직하게는 용매는 메탄올인, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액은 아세트산-물 혼합물 또는 에탄올산-물 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 용액은 아세트산 수용액인, 방법.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행되는, 방법.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액과의 반응은 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 용액으로의 처리는 약 1시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 2시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AAPG)의 화합물과 반응한 후 염기성 용액을 중화하고 임의의 액체를 증발시켜 중간 미정제 생성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 Ac 또는 Bz, 바람직하게는 Bz인, 방법.
  68. 제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  69. 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, PG는 PhCH인, 방법.
  70. 화학식 (B) 또는 화학식 (BB)

    - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이며, LG는 화학식 (B) 또는 (BB)의 화합물이 아미노기와 반응할 때 아미도 결합 형성을 가능하게 하는 이탈기임 - 의 반응성 탄수화물을 합성하는 방법으로서,
    화학식 (C)의 화합물을,

    화학식 (A)

    - 상기 식에서 R1은 H임 - 의 화합물과 반응시켜 화학식 (B)의 화합물을 형성하거나,
    화학식 (AA)의 화합물과 반응시켜

    화학식 (BB)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 광개시제는 유리 라디칼-생성 아조 화합물, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), 금속 또는 금속 이온 기반 광개시제, 과산화물, 과황산암모늄, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 유리 라디칼-생성 아조 화합물은 아조비스이소부티로니트릴(AIBN); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA); 1,1'-아조비스(시아노사이클로헥산)(ACHN); 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD); 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 4,4'-(디아젠-1,2-디일)비스(4-시아노펜탄산); 2,2'-아조디(2-메틸부티로니트릴); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 퍼옥사이드는 tert-부틸 퍼옥시이소부티레이트, tert-부틸 하이드로퍼옥사이드, 벤조일 퍼옥사이드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 물 또는 유기 용매에서 수행되는, 방법.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 물, 디옥산, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란(THF), 디이소프로필 에테르, 이소프로판올, 클로로벤젠, 메틸-tert-부틸 에테르, 메탄올, 에탄올, tert-부탄올, 클로로포름 및 이들의 임의의 조합으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 용매에서 수행되는, 방법.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 40℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 1시간 내지 약 10시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  79. 제70항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 가시광선 흡수 전이 금속 광촉매의 존재 하에서 가시광선 하에 수행되는, 방법.
  80. 제70항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 자외선 조사 하에 수행되는, 방법.
  81. 제70항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 광개시제의 존재 하에서 자외선 조사 하에 수행되는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 광개시제는 2,2'-아지도비스[2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드; 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 임의의 조합과 같은 알코올성 용매에서 수행되는, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 20℃ 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 화합물을 화학식 (A) 또는 (AA)의 화합물과 반응시키는 것은 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자외선 조사는 단파, 중파 또는 장파 자외선 조사인, 방법.
  87. 제70항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1 내지 3의 정수인, 방법.
  88. 제70항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, m은 2인, 방법.
  89. 제70항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, LG는 OPhF5 또는 OPhF4(파라 SO3Na)와 같은 O-플루오로페닐기, 또는 O-(N-석신이미딜)기인, 방법.
  90. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, LG는 O-(N-석신이미딜)기인, 방법.
  91. 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 화합물은 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
  92. 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AA)의 화합물은 제47항 내지 제69항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
  93. 화학식 (I) 또는 (II)

    - 상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이고, p는 1 내지 50의 정수이며, 은 접합에 이용 가능한 적어도 하나의 아미노기를 함유하는 운반체 물질임 - 의 당접합체를 제조하는 방법으로서,
    상기 운반체 물질의 적어도 하나의 유리 아미노기를 화학식 (B)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하거나, 화학식 (BB)의 화합물과 접합하여 화학식 (I)의 당접합체를 형성하는 단계를 포함하며, 상기 화학식 (B) 및 (BB)의 화합물은 제70항 내지 제92항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 운반체 물질은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는, 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1 내지 3의 정수인, 방법.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1 또는 2인, 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1인, 방법.
  98. 화학식 (AAPG)의 화합물로서,

    상기 식에서 n은 1 내지 5의 정수이고, R2는 Ac이고, PG는 PhCH, Me2C, O=C, Me2Si 및 2,6-비스(트리플루오로메틸)페닐-B로부터 선택된 2가 보호기인, 화합물.
  99. 제98항에 있어서, PG는 PhCH인, 화합물.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, n은 1 내지 3의 정수인, 화합물.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1 또는 2인, 화합물.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1인, 화합물.
  103. 제98항에 있어서, 하기 화학식을 갖는, 화합물:
    .
  104. 하기 화학식의 화합물:
    .
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