CN116981678A - 包括用于与载体材料缀合的抗原前体的反应性碳水化合物的合成方法 - Google Patents

包括用于与载体材料缀合的抗原前体的反应性碳水化合物的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(A)的碳水化合物其中R1是H并且n是1至5的整数，该式(A)的碳水化合物通过在加热下使化合物(A0)与HO‑(CH2)n‑CH＝CH2在能够释放质子的酸的存在下反应，并冷却反应混合物以获得包含化合物(A)的冷却混合物来合成。式(AAPG)的碳水化合物其中R2是一价保护基团，PG是二价保护基团，并且n是1至5的整数，通过在含金属沸石的存在下使式(APG)的化合物与式(A1)的化合物反应来合成，其中X是‑I、‑Br、‑Cl、‑CN、‑OTf(三氟甲磺酸根)、‑OMs(甲磺酸根)、‑OTs(甲苯磺酸根)、甲基硫酸根或三氯乙酰亚胺酯基。化合物(AAPG)的脱保护形成化合物(AA)碳水化合物(A)和(AA)能够与硫醇化接头偶联以形成糖缀合物前体，该糖缀合物前体继而能够与载体材料如蛋白质、肽或多肽缀合。

Description

包括用于与载体材料缀合的抗原前体的反应性碳水化合物的 合成方法
技术领域
本发明涉及用于与载体材料(例如蛋白质)缀合的反应性碳水化合物(诸如抗原前体)的合成方法，并且涉及用于由反应性碳水化合物制备用作免疫原和用作治疗/诊断工具的糖缀合物的方法。
本说明书涉及多个文献，这些文献的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
免疫治疗的最终目的是通过调节免疫系统的先天和适应性反应来治疗疾病(诸如感染或癌症)以提高其对抗外来物质(诸如细菌、病毒和癌细胞)的能力。先天免疫被认为是在暴露于病原体的早期阶段触发的第一线免疫防御。细胞参与者包括天然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞、γδT细胞和天然杀伤T(NKT)细胞。与先天免疫系统不同，适应性免疫在最初暴露于外来抗原时发展较慢，但发展高度特异性反应并产生用于长期保护的免疫记忆。其涉及T细胞和B细胞及其体液和细胞介质、细胞因子和抗体的克隆扩增。先天和适应性免疫反应之间的主要界面是专职抗原呈递细胞(pAPC)；巨噬细胞、B细胞，特别是树突细胞(DC)。pAPC能够加工并向T细胞呈递来自内源性和外源性来源的抗原。它们通过模式识别受体(PRR)(如Toll样受体(TLR))识别微生物。在识别微生物表面决定簇或异常和非天然抗原时，微生物或肿瘤及其相关的抗原标志物可通过胞吞途径被pAPC吞噬，在胞吞途径中，其通常被降解成肽片段，并且释放的抗原结合到细胞内MHC I类或II类分子(pMHC)上。pAPC经历成熟和活化，导致pMHC复合物从细胞内区室到细胞表面的再分布，细胞因子和趋化因子的分泌。除pAPC外，所有有核细胞类型在细胞膜上仅显示内源性肽。与pAPC相反，这些源自细胞本身的肽(包括病毒和细胞内病原体)通过与b2-微球蛋白偶联的MHC I类分子显示。APC通常不表达MHC II类。
在MHC II类分子上显示的肽通常被CD4+T辅助细胞上的T细胞抗原受体(TCR)识别，CD4+T辅助细胞在接收到来自pAPC的共刺激信号后又经历功能成熟为不同的亚组，如Th1或Th2细胞。Th1细胞通过分泌IFN-γ和TNF-α导致主要的促炎反应，而Th2细胞分泌典型的细胞因子。尽管Th1细胞主要与细胞介导的反应相关，但两种类型的Th细胞都支持B细胞产生抗体，这反过来影响抗体同种型和功能。例如，IL-12和TNF-α与Th1细胞的分化和1型IgG亚类的产生相关，而IL-6和其他Th2细胞因子有助于2型IgG亚类(IgG1)的产生。
在MHC I类分子上显示肽的APC被CD8+细胞毒性T细胞的TCR识别。由两种细胞类型表达的共刺激分子之间的几种另外的相互作用触发细胞毒性T细胞活化为效应细胞，而当树突细胞与活化的T辅助细胞和T细胞毒性细胞两者相互作用时，产生强且持久的记忆T细胞。一旦被活化，T细胞在细胞因子的帮助下经历克隆选择和扩增。这增加了对功能失调的靶抗原具有特异性的细胞的数目，然后可以在整个身体中行进以寻找功能失调的抗原阳性体细胞。当停靠在靶细胞上时，活化的细胞毒性T细胞释放细胞毒素(如穿孔素和颗粒酶)的有效负载。通过穿孔素的作用，颗粒酶穿透靶细胞并且其蛋白酶触发细胞死亡。细胞毒性T细胞也可以通过FAS信号传导途径触发靶细胞死亡。
因此，希望能够使疫苗诱导的免疫性适应适当的反应，以处理感兴趣的病原体或肿瘤抗原。
与蛋白质和肽相反，碳水化合物是T细胞非依赖性抗原，其没有适当地装备以触发Th细胞的参与，因此不能诱导免疫细胞增殖、抗体类别转换和亲和力/特异性成熟。基于碳水化合物的疫苗最初遇到的主要早期进展已得到以下发现的支持：当正确缀合至载体蛋白(充当T细胞依赖性表位)时，细菌荚膜多糖变得能够获得产生调理吞噬性抗体所必需的免疫化学能力。
传统上，将糖抗原与载体蛋白缀合的策略依赖于醛衍生的糖在赖氨酸残基的ε-氨基上的还原性胺化，或简单地依赖于酰胺偶联反应。在这两种情况下，通常发生部分和随机的糖抗原缀合。此外，如果所有的酰胺配偶体(来自赖氨酸的胺或来自谷氨酸/天冬氨酸的酸)用于糖缀合，则太多的糖抗原变得附着于载体蛋白，因此导致掩蔽潜在必需的T细胞肽表位，同时固有地减少/消除免疫原性。因此，目前用于制备糖缀合物疫苗的策略是不充分的，并且面临显著的监管和/或商业障碍，因为制剂在其碳水化合物分布和再现性方面缺乏必要的均一性(即糖在蛋白质上的附着点是随机分布的，并且在批次与批次之间具有不同的密度)。因此，具有更高的糖抗原均一性、更精确地可表征结构和批次与批次之间的再现性的糖缀合物疫苗将是高度期望的。
此外，可用作与蛋白质缀合的抗原前体的反应性碳水化合物的合成可能存在各种挑战。目前的合成途径在立体选择性控制方面可能是挑战性的，导致获得可能难以分离的中间体立体异构体和/或以低收率获得期望的立体异构体。
SARS-CoV-2(始于2019年底的COVID-19疫情的病原体)代表了对全球人类健康的持续威胁，其也已经破坏全球经济。最初的疫苗开发努力主要集中于存在于刺突(spike)(S)糖蛋白上的蛋白质抗原和表位，刺突糖蛋白介导SARS-CoV-2进入宿主细胞的细胞进入和膜融合。然而，全球健康专家强烈推荐科学家并行探索不同的策略以开发针对SARS-CoV-2的治疗干预，以减轻单一策略可能出现的潜在失败或并发症，包括病毒中可能逃避针对蛋白质表位的当前疫苗策略的新突变。因此，仍然需要开发针对SARS-CoV-2的疫苗和其他治疗工具，其与集中于存在于SARS-CoV-2的S蛋白上的蛋白抗原的疫苗和其他治疗工具并行。
发明内容
在第一方面，本文描述了一种用于合成式(A)的反应性碳水化合物的方法，其中R1是H并且n是1至5的整数，所述方法包括在加热下使式(A0)的化合物与HO-(CH2)n-CH＝CH2在能够释放质子的酸的存在下反应，生成包含式(A)的化合物的反应混合物，并且冷却所述反应混合物以获得包含所述式(A)的化合物的冷却混合物。
在一些实施方案中，使(A0)的化合物反应包括在约0℃至约25℃的混合温度处将所述式(A0)的化合物添加到包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液中，在较低温度处生成包含所述式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和HCl的中间反应混合物。
在另外的方面，本文描述了一种用于合成式(AAPG)的反应性碳水化合物的方法，其中R2是一价保护基团，PG是二价保护团，并且n是1至5的整数，所述方法包括在含金属沸石的存在下使式(APG)的化合物与式(A1)的化合物反应，其中X是-I、-Br、-Cl、-CN、-OTf(三氟甲磺酸根)、-OMs(甲磺酸根)、-OTs(甲苯磺酸根)、甲基硫酸根或三氯乙酰亚胺酯基。
在一些实施方案中，式(APG)和(A1)的化合物之间的反应在分子筛的存在下进行。
在一些实施方案中，式(APG)的化合物是通过用保护基团PG保护式(A)的化合物来形成的，其中R1是H。
在一些实施方案中，式(A)的化合物通过如本文所定义的方法获得。
在另外的方面，本文描述了一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法，其中n是1至5的整数，该方法包括将通过如本文所定义的方法获得的式(AAPG)的化合物脱保护。
在一些实施方案中，脱保护包括使式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间产物，并然后用酸性溶液处理该中间产物。
在另外的方面，本文描述了一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法，所述方法包括将式(AAPG)的化合物脱保护，其中n是1至5的整数，R2是一价保护基团，并且PG是二价保护基团，所述脱保护包括使所述式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间粗产物，并然后用酸性溶液处理所述中间粗产物。
在另外的方面，本文描述了一种用于合成式(B)或式(BB)的反应性碳水化合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，并且LG是当式(B)或(BB)的化合物与氨基基团反应时能够形成酰胺键的离去基团，所述方法包括使式(C)的化合物与式(A)的化合物反应，其中R1是H，以形成式(B)的化合物，或者与式(AA)的化合物反应以形成式(BB)的化合物。
在一些实施方案中，式(A)的化合物通过本文所定义的方法获得。
在一些实施方案中，式(AA)的化合物通过本文所定义的方法获得。
在一些实施方案中，使式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物反应在光引发剂的存在下进行。
在一些实施方案中，使式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物反应在紫外光照射下进行。
在一些实施方案中，使式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物反应在紫外光照射下在光引发剂的存在下进行。
在一些实施方案中，使式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物反应在可见光下、在吸收可见光的过渡金属光催化剂的存在下进行。
在一些实施方案中，式(B)、(BB)和/或(C)中的m是1至3的整数。在一些实施方案中，m是2。
在另外的方面，本文描述了一种用于制备式(I)或(I I)的糖缀合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，p是1至50的整数，并且是含有能够用于缀合的至少一个氨基基团的载体材料，所述方法包括将所述载体材料的至少一个游离氨基基团与式(B)的化合物缀合以形成式(I)的糖缀合物，或与式(BB)的化合物缀合以形成式(I)的糖缀合物，其中式(B)和(BB)的化合物通过本文所定义的方法获得。
在一些实施方案中，载体材料包括蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，在本文所定义的方法中，n是1至3的整数。在一些实施方案中，n是1或2。在一些实施方案中，n是1。
在另外的方面，本文描述了式(AAPG)的化合物其中n是1至5的整数，R2是Ac，并且PG是选自由PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B组成的组的二价保护基团。
在一些实施方案中，化合物(AAPG)中的PG是PhCH。
在一些实施方案中，化合物(AAPG)中的n是1至3的整数。在一些实施方案中，n是1或2。在一些实施方案中，n是1。
在一些实施方案中，化合物(AAPG)具有下式：
在另外的方面，本文描述了下式的化合物：
一般定义
标题和其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求而呈现的。说明书或权利要求中标题或其他标识符的使用不一定要求步骤或要素按字母或数字顺序或按它们所呈现的顺序来进行。
当在权利要求和/或说明书中连同术语“包含”使用时，词语“一”或“一种”的使用可以意指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
术语“约”用于指示值包括为了确定该值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。一般而言，术语“约”意在表示高达10％的可能变化。因此，在术语“约”中包括值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。
如本说明书和权利要求中所用，词语“包含”(以及任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(以及任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
如本文所用，表述“离去基团”或“LG”是指与用离去基团置换之前的相应官能团相比提供改善的反应效率和/或特异性(即，改善的与多肽或蛋白质的游离胺基团的缀合)的离去基团。在一些实施方案中，离去基团可以是O-氟苯基基团，诸如OPhF5或OPhF4(对SO3Na)，或O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
如本文所用，术语“载体材料”是指能够与糖抗原(例如，抗原性单糖、二糖、寡糖或多糖，例如天然或合成抗原)缀合的材料。在一些实施方案中，载体材料可通过用能够形成与存在于载体材料上的至少一个氨基基团键合的酰氨基的基团封端的硫醇-接头与糖抗原缀合。在一些实施方案中，载体材料可以是载体蛋白。在其他实施方案中，载体材料可包括例如带有氨基基团的传感芯片、微量测定或珠。
如本文所用，术语“蛋白质”(例如，在表述“载体蛋白”中)意指任何肽连接的氨基酸链，其可包含或可不包含任何类型的修饰(例如，化学或翻译后修饰，诸如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、苏素化、异戊二烯化、泛素化等)，只要所述修饰不破坏本文所述的糖缀合物免疫原和糖缀合物疫苗的免疫原性。为了进一步清楚，如本文所用，术语“蛋白质”和“载体蛋白”包括肽和多肽两者，即使两个实施方案可以一起叙述，诸如在表述“载体蛋白或肽”中。
如本文所用，术语“糖缀合物”是指与载体材料偶联的糖抗原(例如，抗原性单糖、二糖、寡糖或多糖，例如天然或合成抗原)。当载体材料是载体蛋白或肽时，偶联可以增强糖抗原在感兴趣的受试者中的免疫原性。表述“糖抗原(carbohydrate antigen)”和“糖抗原(sugar antigen)”具有与本文所用相同的含义。术语“免疫原”是指能够与免疫系统的组分(例如，与抗体和/或淋巴细胞)特异性结合并且在感兴趣的受试者中产生体液和/或细胞介导的免疫应答的试剂。如本文所用，术语“免疫原”在诸如“糖缀合物免疫原”的表述中是指糖缀合物的能力(即，物理特征或性质)，而不将糖缀合物本身限于特定用途(例如，作为用于在受试者中产生免疫应答的免疫原)。例如，在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可用于诊断测定或方法(例如，体外方法)以检测生物样品(例如，来自受试者)中是否存在与糖缀合物免疫原结合的抗体的。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可用于筛选、鉴定或评估特异性结合糖缀合物免疫原的抗体(例如，可用于诊断或治疗的单克隆抗体)。
如本文所用，术语“合成的”是指不是天然产物的化合物，其通过人工干预生成。
如本文所用，术语“可缀合的”是指至少两个分子(例如，糖抗原和硫代接头；或者糖抗原和载体材料如蛋白质或肽)通过化学反应彼此共价键合的能力或性能，而不管分子实际上是否彼此共价键合。相比之下，术语“缀合的”是指彼此共价键合的至少两个分子(例如，糖抗原和硫代接头，或糖抗原和载体材料如蛋白质或肽)。
如本文所用，术语“施用”可包括施用途径，诸如肠胃外(例如，皮下、皮内、肌内或静脉内)、口服、经皮、鼻内等，只要施用途径导致在受试者中产生免疫应答即可。
如本文所用，术语“受试者”通常是指能够对如本文所述的糖缀合物产生免疫应答，优选地导致特异性结合糖缀合物和/或呈递糖缀合物的细胞的抗体和/或淋巴细胞的产生的生物(例如，动物或人)。在一些实施方案中，本文所述的受试者可以是待治疗性治疗的患者(例如，通过用本文所述的糖缀合物免疫原接种疫苗)或可用作产生用于研究、诊断和/或治疗目的的工具(例如，抗体)的手段。
在下表1中提供了在本公开中使用的各种缩写的含义。
表1
本说明书的其他目的、优点和特征将在阅读以下对其具体实施方案的非限制性描述后变得更加明显，这些具体实施方案仅参考附图以举例的方式给出。
附图说明
在附图中：
图1显示了ELISA的结果，该结果显示TF特异性凝集素花生凝集素(PNA)和抗TF单克隆抗体JAA-F11对0.01μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率(0.2、0.6、3)缀合的CRM197的反应性。
图2显示了1μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的考马斯染色(Coomassiestained)的SDS-PAGE凝胶。
图3显示了使用TF特异性凝集素花生凝集素(PNA)和抗TF单克隆抗体JAA-F11检测的1μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的蛋白质印迹。
图4显示了未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的MALDI-TOF谱的重叠。
序列表
本申请含有2022年1月11日创建的大小为约15Kb的计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式以引用方式并入本文。
具体实施方式
本说明书涉及用于合成反应性碳水化合物(包括抗原前体)以及糖缀合物的方法，该糖缀合物适用于诸如免疫原、疫苗、诊断或用于产生分析或治疗工具(例如，产生新的抗糖缀合物抗体)。
以末端酸官能团为末端的糖抗原与载体蛋白的胺基团的缀合传统上通过用琥珀酰亚胺或碳二亚胺试剂随机活化来进行。这种糖抗原-载体蛋白缀合方法的主要缺点之一是在载体蛋白本身内发生的不受控制的/不期望的自交联，其中载体蛋白自身的天冬氨酸/谷氨酸残基的侧链与载体蛋白自身的赖氨酸残基的ε-胺基团偶联。这种方法导致载体蛋白的天然结构的扰乱或破坏，经常导致原本具有高免疫原性的关键肽序列的大量损失，以及载体蛋白的潜在不期望的交联。此外，本领域中所述的糖抗原-载体蛋白缀合方法通常使用接头如方形酸等，该接头可触发针对接头自身的免疫应答，而不是仅针对它们所偶联的糖抗原的免疫应答。此外，本领域中所述的糖抗原-载体蛋白缀合方法不允许充分控制载体蛋白被糖基化的程度，经常产生异源糖缀合物质，这对人类治疗剂的生产是显著障碍。此外，可用作与蛋白质缀合的抗原前体的反应性碳水化合物中间体的合成可能存在各种挑战。目前的合成途径在立体选择性控制方面可能是挑战性的，导致获得可能难以分离的中间体立体异构体和/或以低收率获得期望的立体异构体。
相比之下，本说明书提供了允许以比目前已知方法更少的步骤合成具有更好立体选择性控制的中间体反应性碳水化合物并生成适于与载体材料如载体蛋白缀合的合成抗原的方法。本说明书还提供了使用简单且有限的合成步骤合成糖缀合物同时仍允许对载体材料被糖基化的程度进行充分控制的方法。
在第一方面，本说明书涉及一种用于生产反应性碳水化合物的改进方法，该反应性碳水化合物可与具有一个或多个游离胺基团的载体材料(例如，载体蛋白或肽)缀合以生成糖缀合物。反应性碳水化合物可以被纯化并随后用于与具有一个或多个游离胺基团的载体材料的偶联反应中。偶联反应通过酰胺键将一种或多种纯化的反应性碳水化合物与载体材料在一个或多个游离胺基团处缀合，从而生成糖缀合物。
在另外的方面，本文描述了用于由根据本文所述的方法制备的合成反应性碳水化合物生产糖缀合物的方法。
在另一方面，本文描述了用于生产中间体反应性碳水化合物的方法，该中间体反应性碳水化合物可以反应以获得可缀合的反应性碳水化合物。
以下方案1给出了这些不同方法中可能涉及的合成步骤。
方案1
过程反应1
在一些实施方案中，首先提供式(A)的反应性碳水化合物的合成
其中R1是H，并且n是1至5的整数，例如1至3，优选地1或2，最优选地1。该方法可包括式(A0)的化合物
与式HO-(CH2)n-CH＝CH2的醇在酸的存在下的反应。该反应在加热下进行，生成包含式(A)的化合物的反应混合物，然后可将该反应混合物冷却。因此，式(A)的化合物的合成涉及在酸性条件下用醇HO-(CH2)n-CH＝CH2在碳水化合物(A0)的C1碳上进行醚化。可使用几种酸来进行反应，只要该酸能够在反应混合物中释放质子H+以催化可导致形成式(A)的化合物的反应。在一些实施方案中，该酸可以是强酸或路易斯酸。在一些实施方案中，路易斯酸可不同于BF3.Et2O。
在一些实施方案中，在由化合物(A0)和醇HO-(CH2)n-CH＝CH2形成式(A)的化合物的反应中使用的酸可以是乙酰氯、乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物。
在一些实施方案中，式(A0)的化合物与醇HO-(CH2)n-CH＝CH2在乙酰氯作为酸的存在下反应。可首先在低温如约0℃至约25℃的温度处制备包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液。在一些具体实施中，可在约0℃的温度处制备包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液。在其他实施方案中，制备HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液的温度可以是约0℃至约10℃、或约0℃至约20℃、或约10℃至约20℃、或约10℃至约25℃，或包括在这些范围内的任何温度。当制备HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液时，可使用过量的醇。因此，醇可用作反应物，同时用作溶剂。当混合醇和乙酰氯时，一些HCl与一些AcO-(CH2)n-CH＝CH2一起形成。该溶液可优选地在低温处制备以在醇中保持一些HCl溶液。在一些实施方案中，HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液可在惰性气氛下，诸如在氩气或N2下制备。在完成HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液的制备之后，将式(A0)的化合物添加到该溶液中，该溶液仍然可以在低温处，例如在约0℃至约25℃之间，以在低温处形成至少包含式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2、HCl以及一些AcO-(CH2)n-CH＝CH2的中间体反应混合物。然后，加热该中间体反应混合物以促进式(A)的化合物的形成。在加热时，式(A0)的化合物与HO-(CH2)n-CH＝CH2之间的反应可在质子H+的存在下快速发生，由此形成式(A)的醚。除了活化化合物(A0)的C1位中的氧原子之外，质子还可活化糖的2位中的碳上的乙酰胺基团，从而增加有利于α构象的端基异构效应。因此，在酸如乙酰氯的存在下的反应可促进使用单一反应形成具有α构象的式(A)的化合物，这与需要保护-脱保护步骤以得到相同化合物的现有合成方法相反。在一些实施方案中，中间体混合物的加热可在约40℃至约80℃的温度处进行。在一些实施方案中，反应温度可以是约60℃至约80℃，例如它可以是约70℃。包含在这些温度范围内的任何温度均可用作加热温度。反应时间可以是约30分钟至5小时。在一些实施方案中，反应时间可以是约30分钟至约1小时。使用乙酰氯作为酸，短反应时间可以是足够的，诸如约30分钟至约45分钟。甚至仅约30分钟可足够。在一些实施方案中，可监测反应的进展，并因此调节反应时间。在另外的实施方案中，使在低温处的至少包含式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和HCl的中间体混合物在足够高的温度处与热源接触以快速且立即加热混合物。换句话讲，在一些实施方案中，与从低温逐渐加热至加热温度相反，可使在低温处的中间体混合物与热源直接接触。在实验室规模下，这可通过将在低温处的包含中间体混合物的圆底烧瓶放入已经处于加热温度处的油浴中来进行，这与将圆底烧瓶放入在低温处的油浴中并然后加热浴油以升高温度并达到所需的加热温度相反。在工业规模上，可使用允许中间体混合物与热源“接触”的任何常规加热方式。例如，这些可包括热交换器。在一些实施方案中，热源可以在约40℃至约80℃的温度处。
在另外的实施方案中，能够释放质子以催化用于获得式(A)的化合物的反应的酸源可包括选自乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物的酸。在一些实施方案中，与这些其他类型的酸的反应可通过制备包含式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和酸的溶液，并然后加热该溶液来进行。该溶液还可包含有机溶剂。在一些实施方案中，该溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、1,3-二氧戊环、二乙氧基甲烷、二甲氧基甲烷、2,5,7,10-四氧杂十一烷、二丙氧基甲烷(仅举几个示例)以及它们的任何组合。在一些实施方案中，包含式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和酸的反应混合物可在约30℃至约70℃的温度处加热。可使用该范围内的任何温度。反应时间可变化并且监测反应的进展可允许调节反应时间。在一些实施方案中，反应可进行约0.5小时至约15小时、或约0.5小时至约10小时、或约0.5小时至约5小时、或约0.5小时至约2小时的反应时间。
在一些实施方案中，用于由化合物(A0)制备式(A)的化合物的反应温度和反应时间可通过监测式(A)的化合物的等价β构象异构体的形成来进一步调节。即使上述反应条件(即酸、温度、反应时间和/或中间体混合物制备的选择)应促进α构象异构体化合物(A)的形成，但在反应期间也可形成一些β构象异构体。通过在加热期间分析反应混合物，可评估β构象异构体的形成，并且如果观察到一些β构象异构体，则立即停止加热并冷却混合物。
一旦加热步骤完成并且反应混合物冷却，就可通过任何常规方法中和冷却的混合物(例如，添加碱并检查pH直至达到约7的pH)。然后可通过任何常规方法分离并纯化式(A)的化合物。例如，可将分离的粗产物冻干、再沉淀或通过色谱法纯化。在一些实施方案中，纯化步骤可允许将式(A)的化合物与等价β构象异构体分离，一些在反应期间形成。
过程反应2
在一些实施方案中，还提供了式(APG)的化合物的合成
其中PG是保护基团，并且n是1至5的整数。该反应包括用二价保护基团PG来保护式(A)的化合物
其中R1是H。
在一些实施方案中，n是1至3的整数，优选地1或2，最优选地1。
在一些实施方案中，式(A)的化合物可通过上述的过程反应1制备。在另外的实施方案中，式(A)的化合物的保护可通过与选自PhCH(OMe)2、三光气、Me2SiCl2、Me2C(OMe)2、2-甲氧基丙烯和2,6-双(三氟甲基)苯基硼酸酯组成的组的化合物反应来进行。因此，在一些实施方案中，该反应允许制备式(APG)的受保护的化合物，其中PG选自由PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B组成的组。在一个优选的实施方案中，保护基团是PhCH。
在一些实施方案中，保护反应可在选自由以下组成的组的有机溶剂中进行：DMF、二甲基乙酰胺(DMAC)、DMSO、THF、二噁烷、1-3二氧戊环、乙腈、2,5-二甲基四氢呋喃(DMTHF)、γ-戊内酯(GVL)、二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)、乙酰丙酸甲酯(ML)、乙酰丙酸乙酯(EL)、乙酰丙酸乙酯丙二醇缩酮(ELPK)、戊二酸二甲酯(DMG)、二甲基丙烯脲(DMPU)、聚(丙二醇)(PPG)、四氢糠醇聚乙二醇醚(Glycofurol)(THFP)、1-乙基-3-甲基咪唑鎓乙酸盐([emim][OAc])以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，式(APG)的化合物可通过使式(A)的化合物与PhCH(OMe)2在DMF中在催化量的对甲苯磺酸一水合物的存在下反应来制备。
在一些实施方案中，反应可在室温处进行，并且可监测式(APG)的化合物的形成，并且当反应基本上完成时停止反应。在一些实施方案中，反应时间可以是约5小时。然后可通过常规方法分离该化合物。
过程反应3
在一些实施方案中，还提供了式(AAPG)的反应性碳水化合物的合成
其中R2是一价保护基团，PG是二价保护基团，并且n是1至5的整数。
在一些实施方案中，该合成包括在含金属沸石的存在下式(APG)的化合物
与式(A1)的化合物之间的糖基化
其中X是-I、-Br、-Cl、-CN、-OTf(三氟甲磺酸根)、-OMs(甲磺酸根)、-OTs(甲苯磺酸根)、甲基硫酸根或三氯乙酰亚胺酯基。
在一些实施方案中，式(APG)的化合物可通过上述的过程反应2制备。
在一些实施方案中，制备式(AAPG)的化合物的反应可在有机溶剂中进行。例如，有机溶剂可选自由以下组成的组：甲苯、二氯甲烷-甲苯混合物、DMSO-甲苯混合物和N-甲基吡咯烷酮-甲苯混合物。在一些实施方案中，溶剂可以是甲苯。该反应可优选地在惰性气氛下(例如在氩气或N2下)进行。
在一些实施方案中，一价保护基团R2可选自由以下组成的组：Ac、Bz、烯丙基、苯甲酸酯基、甲氧基甲基(MOM)、四氢吡喃基(THP)、叔丁基、新戊酸酯基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)。也可使用任何其他可能的羟基保护基团。在优选的实施方案中，R2可以是Ac或Bz。
如先前所提及的，在一些实施方案中，二价保护基团PG可选自PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B，优选地PhCH。式(A1)的化合物中的离去基团X可优选为选自I、Br或Cl的卤素，最优选地Br。
在一些实施方案中，n是1至3的整数，优选地1或2，最优选地1。
在一些实施方案中，含金属沸石可以是具有作为沸石骨架本身的一部分的至少一种金属或具有至少一种存在于沸石孔中和/或沸石表面处的金属的沸石。在一些实施方案中，沸石因此可以是金属浸渍的沸石。在另外的实施方案中，含金属沸石中的金属可包括Ag、Al、Cd、Co、Cu、Fe、Ga、In、Mo、Pd、Pt、Sn、Sb、V、Zr或它们的任何混合物。在一些实施方案中，含金属沸石可以是例如选自由以下组成的组的沸石：Sn-β、Zr-β、Al-β(OH)、Al-β(F)、Pt@MCM-22、K-PtSn/MFI、0.3Pt/0.5Sn-Si-β、Pt/Sn 2.0-β、0.5CoSi-β、V-β、H-[Fe]ZSM-5、Fe-BEA、Ga-β、Ga-β-200、Mo/HZSM-5或它们的任何混合物。然而，能够催化式(APG)的化合物和式(A1)的化合物之间的醚键反应的任何类型的含金属沸石均可用于制备式(AAPG)的化合物。在优选的实施方案中，含金属沸石可包括含银沸石，例如银交换沸石。此类沸石通常是可商购获得的。
在一些实施方案中，在含金属沸石的存在下进行的糖基化反应可在室温处或在加热下进行。在一些实施方案中，糖基化温度可以是约20℃至约80℃。在其他实施方案中，反应在约20℃至约70℃、约20℃至约60℃、约20℃至约50℃、约20℃至约40℃、或约20℃至约30℃的温度处进行。因此，糖基化反应可在这些范围内包括的任何温度处进行。在另外的实施方案中，糖基化可进行约5小时至约50小时的时间。在其他实施方案中，糖基化时间可持续约5小时至约30小时、或约5小时至约25小时、约5小时至约20小时、或约10小时至约30小时、或约10小时至约25小时、或约10小时至约20小时、或约15小时至约30小时、或约15小时至约25小时、或约15小时至约20小时、或约20小时至约25小时、或约20小时至约30小时。在一些实施方案中，糖基化反应可在约60至约80℃处进行约15小时至约20小时。在其他实施方案中，糖基化可在约20℃至约25℃处进行约20小时至约30小时。
使用含金属沸石作为式(APG)和(A1)的两种碳水化合物之间的反应的催化剂令人惊讶地允许基本上获得在两种糖之间具有β构象的糖基化产物(AAPG)。与产生α和β构象异构体的混合物的常规糖基化反应(例如，使用三氯乙酰亚胺酯和BF3.Et2O或TMSOTf)相比，这是一个重要优点。在目前描述的方法中，所得产物(AAPG)的纯化可通过过滤容易地进行以在反应结束时去除沸石。此外，在沸石存在下的糖基化可比常规反应更容易控制。例如，在三氯乙酰亚胺酯和BF3.Et2O或TMSOTf的存在下的糖基化可能需要将反应温度保持在非常低的温度，诸如在约-30℃处，这继而可减慢反应。此外，使用含金属沸石优于使用其他催化剂如Hg(CN)2，也已知该催化剂催化糖基化，但包括有毒的重金属并因此是有毒的。总之，使用含金属沸石允许更平稳地进行糖基化，同时高度控制立体选择性。
在一些实施方案中，式(AAPG)的化合物的制备，即式(APG)和(A1)的化合物之间的偶联可在分子筛的存在下进一步进行。可使用的分子筛的示例包括型、型、型、13X型的分子筛。也可使用它们的任何混合物。在分子筛的存在下进行反应可允许捕集水分/痕量水，这继而可促进反应。
如上所述，可通过过滤反应混合物吧然后去除溶剂来容易地分离最终粗产物(AAPG)。在一些实施方案中，然后可通过任何常规方法纯化粗产物。
过程反应4
在一些实施方案中，还提供了式(AA)的反应性碳水化合物的合成
其中n是1至5的整数。
该反应可包括如本文所述使式(AAPG)的化合物脱保护。
在一些实施方案中，式(AAPG)的化合物可通过如本文所述的方法获得。
在一些实施方案中，n是1至3的整数，优选地1或2，最优选地1。
在一些实施方案中，式(AAPG)的化合物的脱保护可包括使式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间产物(AAi)，并然后用酸性溶液处理中间产物(AAi)。
在一些实施方案中，获得中间产物(AAi)所需的碱性溶液可包含选自由甲醇盐、乙醇盐和2-甲基丙-2-醇盐组成的组的碱。在一个优选的实施方案中，碱可以是甲醇钠。在一些实施方案中，碱性溶液可包含选自由甲醇、乙醇和异丙醇组成的组的溶剂。在一些实施方案中，溶剂可优选为甲醇。在一些实施方案中，(AAPG)与碱性溶液形成中间产物(AAi)的反应可在约0℃至约50℃的温度处，优选地在室温处进行。与碱性溶液形成中间产物(AAi)的反应可进行约0.5小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
在一些实施方案中，粗制形式的中间产物(AAi)可直接用酸性溶液处理，而不需要任何纯化步骤。这是有利的，因为它可减少保护过程的步骤数目。因此，在一些实施方案中，碱性处理和随后的酸性处理均可在同一反应容器中进行。在一些实施方案中，一旦碱性处理完成，就可中和溶液，并且可蒸发液体，得到粗制形式的中间产物(AAi)。然后，可将粗制形式的中间产物(AAi)直接用酸性溶液处理，而不需要如上所述的任何纯化步骤。
在一些实施方案中，随后的酸性处理可通过使中间产物(AAi)与包含乙酸-水混合物或乙醇酸-水混合物的酸性溶液反应来进行。在一个优选的实施方案中，酸性溶液可以是乙酸水溶液。在另外的实施方案中，中间产物(AAi)可在约50℃至约70℃的温度处，优选地在约60℃处用酸性溶液处理。用酸性溶液处理可进行约1小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间，以生成包含式(AA)的化合物的溶液。
在一些实施方案中，然后可通过常规方法分离式(AA)的化合物，该常规方法包括例如萃取、沉淀、结晶、冷冻干燥、C-18正相或反相硅胶色谱法、模拟移动床(SMB)色谱法和/或通过膜技术如膜纳米过滤的纯化。
过程反应5a和5b
在一些实施方案中，还提供了一种用于合成式(B)或式(BB)的反应性碳水化合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，并且LG是当式(B)或(BB)的化合物与氨基基团反应时能够形成酰胺键的离去基团。式(B)或(BB)的化合物在本说明书中也称为糖抗原前体。式(B)或(BB)的化合物包含与糖抗原连接的硫醇-接头。
在一些实施方案中，用于获得式(B)的化合物的方法可包括使式(C)的化合物
其中m和LG如上文所定义，
与式(A)的化合物反应
其中R1是H并且n如上文所定义。
在一些实施方案中，式(A)的化合物可通过如上文所定义的方法获得。
在一些实施方案中，用于获得式(BB)的化合物的方法可包括使式(C)的化合物与式(AA)的化合物反应
其中n如上文所定义。
在一些实施方案中，式(AA)的化合物可通过如上文所定义的方法获得。
在一些实施方案中，在式(A)、(AA)、(B)和(BB)的化合物中，n是1至3的整数，优选地1或2，最优选地1。
在一些实施方案中，在式(C)的化合物中，m是1至3的整数。在一个优选的实施方案中，m是2。
在一些实施方案中，在式(C)的化合物中，LG可以是O-氟苯基基团，诸如OPhF-5或OPhF4(对SO3Na)，或O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。在一个优选的实施方案中，式(C)的化合物中的LG是O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)的化合物获得式(B)的化合物的反应或与式(AA)的化合物获得式(BB)的化合物的反应在光引发剂的存在下进行。在一些实施方案中，光引发剂可选自由以下组成的组：产生自由基的偶氮化合物、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)、基于金属或金属离子的光引发剂、过氧化物、过硫酸铵、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，当光引发剂是产生自由基的偶氮化合物时，其可以是偶氮二异丁腈(AIBN)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)；1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)；二氮烯二甲酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二甲酸二哌啶(ADD)；2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(4-氰基戊酸)；2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)；或它们的任何组合。
在一些实施方案中，当光引发剂是过氧化物时，过氧化物可包括过氧异丁酸叔丁酯、叔丁基过氧化氢、过氧化苯甲酰或它们的任何组合。
在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物的反应可在水或有机溶剂中进行。在一些实施方案中，可根据光引发剂在该溶剂中的溶解度来选择溶剂。在一些实施方案中，如果需要增强光引发剂溶解度，则可使用不同溶剂的混合物。在一些实施方案中，用于进行式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物的反应的溶剂可选自水、二噁烷、乙腈、四氢呋喃(THF)、二异丙醚、异丙醇、氯苯、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醇、叔丁醇、氯仿以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)的化合物获得式(B)的化合物的反应或与式(AA)的化合物获得式(BB)的化合物的反应可在约40℃至约110℃的温度范围内进行。在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物的反应可进行约1小时至约10小时的时间。
在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)的化合物获得式(B)的化合物的反应或与式(AA)的化合物获得式(BB)的化合物的反应可在紫外光照射下进行。在一些实施方案中，紫外光照射可以是短波、中波或长波紫外光照射。在一些实施方案中，反应甚至可在光引发剂的存在下在紫外光照射下进行。在此类实施方案中，光引发剂可优选地选自2,2'-叠氮双[2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)；以及它们的组合。在一些实施方案中，当获得式(B)或(BB)的化合物的反应在紫外光照射下，任选地在光引发剂的存在下进行时，可在醇溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇或它们的任何组合中进行反应。在一些实施方案中，式(B)或(BB)的化合物在紫外光照射下的合成可在约20℃至约30℃范围内的温度处进行。在一些实施方案中，照射可进行约1小时至约24小时的时间。
在一些实施方案中，式(C)的化合物与式(A)的化合物获得式(B)的化合物的反应或与式(AA)的化合物获得式(BB)的化合物的反应可在可见光下在吸收可见光的过渡金属光催化剂的存在下进行。在一些实施方案中，吸收可见光的过渡金属光催化剂可以是钌多吡啶络合物，诸如Ru(bpz)3(PF6)2，并且光源可包括蓝光LED灯。在一些实施方案中，在吸收可见光的过渡金属光催化剂的存在下进行的反应可在溶剂如乙腈中在约20℃至约30℃的温度处进行。
在一些实施方案中，可使用常规方法分离式(B)或(BB)的化合物。在一些实施方案中，可处理包含式(B)或(BB)的化合物的反应混合物以去除溶剂和任何未反应的式(C)的化合物以回收式(B)或(BB)的化合物。然后，式(B)或(BB)的化合物可以粗制形式直接用于与带有至少一个氨基基团的载体材料缀合，即无需进一步纯化，如下文将进一步详述。
过程反应6a和6b
在一些实施方案中，还提供了一种用于制备式(I)或(II)的糖缀合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，p是1至50的整数(例如，表示载体材料上可用于缀合的游离氨基基团的总数)，并且是带有至少一个游离氨基基团的载体材料。该方法包括将载体材料与通过如本文所定义的方法制备的式(B)的化合物缀合以形成式(I)的糖缀合物，或与通过如本文所定义的方法制备的式(BB)的化合物缀合以形成式(I)的糖缀合物。
在一些实施方案中，载体材料含有可用于缀合的至少一个氨基基团，即能够与式(B)或(BB)的化合物的活化酯基团(CO)LG反应以形成式(I)或(II)的糖缀合物中的键的至少一个氨基基团。在一些实施方案中，载体材料可包括1至50个氨基基团，从而允许形成1至50个式(I)或(II)的糖缀合物中的键。
在一些实施方案中，在式(I)和(II)的化合物中，n是1至3的整数，优选地1或2，最优选地1。
在一些实施方案中，在式(I)和(II)的化合物中，m是1至3的整数。在一个优选的实施方案中，m是2。
在一些实施方案中，式(B)或(BB)的化合物与载体材料之间的缀合可涉及任何常规缀合方法。
在一些实施方案中，载体材料可包括蛋白质、多肽或肽。在其他实施方案中，载体材料可包括例如带有能够与式(B)或(BB)的化合物缀合的游离氨基基团的传感芯片、微量测定或珠。
在一些实施方案中，蛋白质、肽或多肽与式(B)或(BB)的化合物之间的缀合反应可有利地最小化或避免载体蛋白或肽自身中存在的天冬氨酸/谷氨酸残基的侧链与ε-赖氨酸胺之间的载体蛋白或肽自交联。
在一些实施方案中，本文所述的缀合反应使得与载体蛋白或肽缀合的糖抗原的数量能够通过反应物的功效和/或化学计量(例如，载体蛋白或肽与式(B)或(BB)的化合物的摩尔比)来控制。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应可包括使1摩尔当量至500摩尔当量、1摩尔当量至400摩尔当量、1摩尔当量至300摩尔当量、1摩尔当量至200摩尔当量、5摩尔当量至500摩尔当量、5摩尔当量至400摩尔当量、5摩尔当量至300摩尔当量、或5摩尔当量至200摩尔当量的式(B)或(BB)的化合物/载体蛋白或肽反应。
在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白或肽包含一个或多个游离胺基团。如本文所用，“游离胺”或“游离胺基团”是指具有一个或多个氨基团的载体蛋白或肽，该氨基团可用于化学修饰和/或缀合(例如，与如本文所述的糖抗原，诸如倾向于暴露在载体蛋白外周上的溶剂可及的赖氨酸残基缀合)。在一些实施方案中，避免太多的多重糖抗原与载体蛋白上的相邻位置缀合可能是有利的。在一些实施方案中，载体蛋白或肽可优选缺乏富含赖氨酸的结构域(例如，包含至少50％赖氨酸残基的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的链段)。
在一些实施方案中，载体蛋白可总共包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个赖氨酸残基。在一些实施方案中，载体蛋白可包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个游离胺残基。
在一些实施方案中，载体蛋白或肽包含具有一个或多个游离胺基团的一个或多个赖氨酸残基，或者任选地被工程化以添加一个或多个另外的赖氨酸残基，例如在载体蛋白或肽的氨基末端、羧基末端或溶剂可及的位置。在一些实施方案中，载体蛋白包含T细胞表位，并且/或者在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，载体蛋白或肽包含B细胞表位，并且/或者在受试者中诱导体液免疫应答。在一些实施方案中，载体蛋白包含B细胞表位和T细胞表位两者，并且/或者在受试者中诱导体液和细胞介导的免疫应答两者。
优选地，本文所述的载体蛋白可以是已经获得监管机构(例如，FDA)批准向人受试者施用(例如，在批准的疫苗中)的蛋白质。在一些实施方案中，载体蛋白是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应物质197(CRM197)、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌(H.Influenzae)蛋白D(HiD)、病毒样颗粒(VLP)、细胞因子、免疫原性肽如破伤风毒素831-844(SEQ ID NO:1或2)、破伤风毒素830-843(SEQ ID NO:5)、白蛋白(诸如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或其免疫原性片段。
在一些实施方案中，载体蛋白或肽对于待施用的受试者而言是外源性的，其优选在受试者中不具有(接近的)直向同源物。在人疫苗生产的背景下，本文所述的载体蛋白是指“适用于人使用的载体蛋白”或简称“合适的载体蛋白”，这意指载体蛋白在抗原上不同于人蛋白，使得该载体蛋白不会被认为是人的“自身抗原”。与相应的人蛋白质在抗原上过于类似的载体蛋白的使用可能导致载体蛋白被认为是“自身抗原”，这在人疫苗中可能并不理想。例如，由与牛血清白蛋白(BSA)的赖氨酸残基的ε-氨基基团随机缀合的TF抗原组成的糖缀合物免疫原先前已被描述并表征(例如，Demian等人，2014；Rittenhouse-Diakun等人，1998；Heimburg等人，2006；Tati等人，2017)。然而，不仅BSA的59个赖氨酸残基上的碳水化合物水平是随机且低效的(每个BSA分子缀合不超过4至6个TF抗原)，BSA也不适合作为人疫苗中的载体蛋白，因为它在抗原性上与人白蛋白过于相似。在一些实施方案中，载体蛋白不是白蛋白(例如，牛血清白蛋白)。
在一些实施方案中，本文所述的式(I)或(I I)的糖缀合物可以是糖缀合物免疫原，其中载体蛋白或肽在施用于受试者时是免疫原性的，并且与相应施用未缀合的糖抗原相比，糖抗原经由硫代接头与载体蛋白或肽的缀合在施用于受试者后增加了糖抗原的免疫原性。
在一些实施方案中，糖抗原或糖抗原在与载体蛋白或肽偶联后不能被受试者的内源酶从载体蛋白或肽裂解。
在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白或肽可包含T细胞表位，并且/或者在施用时在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的式(I)或(I I)的合成糖缀合物在施用于受试者时可诱导针对糖抗原的细胞介导的免疫应答。
在另一方面，本文描述了一种用于生产糖缀合物疫苗或免疫应答触发组合物的方法。该方法可包括将通过如本文所述的方法制备的式(I)或(II)的糖缀合物与药学上可接受的赋形剂和/或助剂一起配制。在一些实施方案中，助剂是或者包括：无机化合物、矿物油、微生物衍生物、植物衍生物、细胞因子、角鲨烯、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢钙(calcium phosphate hydroxide)、toll样受体激动剂、免疫刺激性多核苷酸(例如，CPG)、免疫刺激性脂质、弗氏助剂(Freund's adjuvant)、RIBI助剂、QS-21、胞壁酰二肽、TiterMaxTM、SteviuneTM、StimuneTM或它们的任何组合。
考虑到受体动物的年龄、性别、体重、物种和状况以及施用途径等因素，疫苗组合物可以医学或兽医学领域技术人员熟知的剂量和技术进行施用。施用途径可以是经皮、经粘膜施用(例如，口服、鼻、眼)或经胃肠外途径(例如，皮内、肌内、皮下)。疫苗组合物可单独施用，或者可与其他治疗或疗法共同施用或相继施用。施用形式可包括用于肠胃外、皮下、皮内或肌内施用(例如，可注射施用)的混悬剂和制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。疫苗可作为喷雾剂施用，或者混合在食物和/或水中，或者与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合递送。组合物可含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、助剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和所需的制剂。可参考标准药学教科书，诸如“Remington's Pharmaceutical Sciences,”1990来制备合适的制剂，而无需过多的实验。
在另外的方面，本文描述了包含通过本文所述的方法制备的式(I)或(II)的糖缀合物和如本文所述的药学上可接受的赋形剂和/或助剂的糖缀合物疫苗或适应性免疫应答触发组合物。在实施方案中，糖缀合物疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。在实施方案中，本文所述的疫苗组合物可包含一种或多种TACA，并且疫苗组合物可以是针对表达TACA的癌症的抗癌疫苗。在实施方案中，癌症可以是B细胞淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌或胃癌。
在一些方面，本文描述了一种使受试者免疫、对该受试者进行疫苗接种或治疗该受试者的方法，该方法包括向受试者施用通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物、如本文所述的式(I)或(II)的合成糖缀合物、通过如本文所述的方法生成的糖缀合物疫苗或适应性免疫应答触发组合物、或如本文所述的糖缀合物疫苗。
在一些实施方案中，本文描述了通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物、如本文所述的式(I)或(II)的合成糖缀合物、通过如本文所述的方法生成的糖缀合物疫苗或适应性免疫应答触发组合物、或如本文所述的糖缀合物疫苗，上述物质用于使患有疾病的受试者免疫、对该受试者进行疫苗接种或治疗该受试者，或用于检测特异性结合式(I)或(II)的糖缀合物的抗体的存在或用于检测所述免疫、疫苗接种或治疗(例如，在来自受试者的生物样品中)。
在一些实施方案中，本文描述了通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物、如本文所述的合成糖缀合物、或通过如本文所述的方法生成的适应性免疫应答触发组合物，上述物质用于制造用于使患有疾病的受试者免疫或治疗患有疾病的受试者的疫苗，或用于检测特异性结合式(I)或(II)的糖缀合物的抗体的存在，或用于检测所述免疫或治疗(例如，在来自受试者的生物样品中)。
在一些实施方案中，本文描述了通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物、如本文所述的式(I)或(II)的合成糖缀合物、通过如本文所述的方法生成的糖缀合物疫苗或适应性免疫应答触发组合物、或如本文所述的糖缀合物疫苗，上述物质用于治疗患有与所述糖抗原的表达增加相关的疾病的受试者。
在一些实施方案中，本文描述了通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物、如本文所述的式(I)或(II)的合成糖缀合物、通过如本文所述的方法生成的糖缀合物疫苗或适应性免疫应答触发组合物、或如本文所述的糖缀合物疫苗，上述物质用于检测或筛选特异性结合糖抗原或包含糖抗原的肿瘤循环细胞的抗体的存在，或用于检测由用糖抗原进行免疫或疫苗接种产生的抗体的存在。在一些实施方案中，检测或筛选可通过任何合适的检测方法进行，诸如免疫吸附测定、ELISA、微阵列或免疫印迹分析。
在另外的方面，本文描述了一种治疗受试者的方法，该方法包括施用通过如本文所述的方法生成的式(I)或(II)的糖缀合物，以在所述受试者中产生针对糖抗原的免疫应答，并且任选地筛选来自所述受试者的生物样品中是否存在特异性结合糖抗原的抗体。
在另外的方面，本文描述了用作与SARS-CoV-2相关的治疗和/或诊断工具的式(I)或(II)的糖缀合物。更具体地，本文描述了式(I)或(II)的糖缀合物，该糖缀合物用于针对SARS-CoV-2使受试者免疫，用于在受试者中触发抗SARS-CoV-2抗体的产生，用于在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的细胞介导的免疫应答，或它们的任何组合。本文还描述了用于与SARS-CoV-2相关的检测/诊断工具的式(I)或(II)的糖缀合物。例如，本文描述了用于检测来自受试者的样品中抗SARS-CoV-2抗体的存在的式(I)或(II)的糖缀合物。就这一点而言，PCT/CA2020/051253中显示了证明SARS-CoV-2的S蛋白上存在糖抗原(例如，TF、Tn以及它们的唾液酸化的变体)以及它们与抗糖配体结合的可及性的结果。
如本文所用，表述“抗SARS-CoV-2抗体”是指能够以抗原的天然构象结合抗原(例如，糖抗原)的抗体，诸如在天然重组蛋白上表达和/或存在于组装的病毒颗粒上。相比之下，仅结合变性抗原(例如，在变性条件下，如按照SDS-PAGE)而不结合抗体的天然构象中的相同抗原的抗体被排除在表述“抗SARS-CoV-2抗体”之外。在一些实施方案中，本文所述的式(I)或(II)的糖缀合物或疫苗可诱导产生具有中和活性的抗体。如本文所用，表述“中和活性”是指与SARS-CoV-2病毒体颗粒结合并抑制其感染易感宿主细胞的能力的配体(例如抗体)。
在一些实施方案中，本文所述的式(I)或(II)的糖缀合物可包含与合适的载体材料(例如，载体蛋白或肽，或非蛋白质聚合物材料)缀合的糖抗原，其中该糖抗原包含TF抗原、Tn抗原或它们的任何组合或者由其组成。
在一些实施方案中，本文所述的糖抗原可与包含B细胞表位或T细胞表位的载体材料缀合，例如取决于是否需要触发体液和细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，糖抗原可与SEQ ID NO:3或4的SARS-CoV-2S蛋白片段共价缀合，诸如在SEQ ID NO:3的位置4和/或6处或SEQ ID NO:4的位置323、325和/或678处。具体地，已报道SEQ ID NO:4的位置678(其接近于刺突蛋白在R682处的弗林蛋白酶切割位点)被核心-1和核心-2结构O-糖基化。
在一些实施方案中，载体蛋白或肽可包含SEQ ID NO:4的SARS-CoV-2S蛋白序列的免疫原性片段，该片段包含与SEQ ID NO:4的位置323、325和/或678缀合的一种或多种糖抗原。在一些实施方案中，糖抗原可与SEQ ID NO:3的SARS-CoV-2S蛋白片段的变体共价缀合，例如其中位置4和/或6处的残基可被赖氨酸和/或半胱氨酸残基替代的变体，这可促进与糖抗原的化学缀合。在一些实施方案中，载体蛋白或肽可包含在位置323、325和/或678处具有赖氨酸或半胱氨酸的SEQ ID NO:4的SARS-CoV-2S蛋白序列的变体的免疫原性片段，该片段包含与SEQ ID NO:4的位置323、325和/或678处的赖氨酸或半胱氨酸残基缀合的一种或多种糖抗原。在赖氨酸残基的情况下，糖抗原可通过本文所述的缀合方法与载体蛋白缀合。在半胱氨酸残基的情况下，糖抗原可通过所述的缀合方法与载体蛋白缀合。因此，在一些实施方案中，本文所述的载体材料可包含SEQ ID NO:3的肽或由其组成，或者包含在位置4和/或6处包含半胱氨酸或赖氨酸的SEQ ID NO:3的肽的变体或由其组成。在一些实施方案中，SEQID NO:3的肽或肽变体可被包含在载体材料中(例如，重组工程化到氨基酸序列中)或可与载体材料融合(例如，作为融合蛋白)。
在一些实施方案中，载体材料是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应物质197(CRM197)、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌(H.Influenzae)蛋白D(HiD)、病毒样颗粒(VLP)、细胞因子、免疫原性肽如破伤风毒素831-844(SEQ ID NO:1或2)、破伤风毒素830-843(SEQ ID NO:5)、白蛋白(诸如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或其免疫原性片段。
在一些方面，本文描述了SARS-CoV-2或COVID-19疫苗或适应性免疫应答诱导组合物，其包含一种或多种如本文所定义的式(I)或(II)的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂和/或助剂。糖缀合物通常包含在SARS-CoV-2病毒体上表达的一种或多种糖抗原，例如在SARS-CoV-2的S(或S1)蛋白上表达的糖抗原。适用于如本文所述的SARS-CoV-2疫苗的糖抗原是异常糖基化模式的糖抗原，即在受试者的正常或健康细胞和组织上不表达的糖抗原，以便降低在施用疫苗的受试者中触发自身免疫应答的风险。
在一些实施方案中，本文所述的式(I)或(II)的糖缀合物或本文所述的SARS-CoV-2疫苗诱导产生与SARS-CoV-2病毒体颗粒结合的抗体，并且优选具有中和活性(例如，抑制SARS-CoV-2病毒体颗粒感染易感宿主细胞的能力)。
在另一方面，本发明还涉及一种式(AAPG)的化合物
其中n是1至5的整数，R2是Ac，并且PG是选自由PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B组成的组的二价保护基团。
在一些实施方案中，二价PG保护基团是PhCH。
在一些实施方案中，在式(AAPG)中，n是1至3的整数。在一个优选的实施方案中，n是1或2。在另一个实施方案中，n是1。
在一些实施方案中，式(AAPG)的化合物可用作生产本文所述的式(I)或(II)的糖缀合物的中间体。在一些实施方案中，式(AAPG)的化合物本身可通过本文所述的方法制备。
在一些实施方案中，化合物(AAPG)具有下式：
在另外的方面，本发明还涉及下式的化合物：
条项
本文描述了以下条项中的一者或多者。
1.一种用于合成式(A)的反应性碳水化合物的方法
其中R1是H，并且n是1至5的整数，
所述方法包括在加热下使式(A0)的化合物
与HO-(CH22)n-CH＝CH2在能够释放质子的酸的存在下反应，生成包含式(A)的化合物的反应混合物，以及
冷却所述反应混合物以获得包含所述式(A)的化合物的冷却混合物。
2.根据条项1所述的方法，其中所述酸包括乙酰氯、乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物。
3.根据条项1或2所述的方法，其中所述酸包括乙酰氯。
4.根据条项1至3中任一项所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物反应包括在约0℃至约25℃的混合温度处将所述式(A0)的化合物添加到包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液中，在较低温度处生成包含所述式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和HCl的中间体反应混合物。
5.根据条项4所述的方法，其中所述混合温度是约0℃、或约0℃至约10℃、或约0℃至约20℃、或约10℃至约20℃、约10℃至约25℃。
6.根据条项4或5所述的方法，其中包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的所述溶液是在惰性气氛下在约0℃的温度处制备的。
7.根据条项4至6中任一项所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物反应包括使所述中间体反应混合物与热源在约40℃至约80℃的温度处接触。
8.根据条项1至7中任一项所述的方法，其中所述加热在约40℃至约80℃的反应温度处进行约30分钟至5小时的反应时间。
9.根据条项8所述的方法，其中所述反应温度是约60℃至约80℃。
10.根据条项8或9所述的方法，其中所述反应温度是约70℃。
11.根据条项8至10中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟至约1小时。
12.根据条项8至11中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟至约45分钟。
13.根据条项8至12中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟。
14.根据条项1或2所述的方法，其中所述酸包括乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物。
15.根据条项14所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物与HO-(CH2)n-CH＝CH2反应包括加热包含所述式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和所述酸的溶液。
16.根据条项15所述的方法，其中所述溶液还包含选自由以下组成的组的溶剂：二氯甲烷、氯仿、1,3-二氧戊环、二乙氧基甲烷、二甲氧基甲烷、2,5,7,10-四氧杂十一烷、二丙氧基甲烷以及它们的任何组合。
17.根据条项15或16所述的方法，其中所述反应在约30℃至约70℃的温度处进行。
18.根据条项15至17中任一项所述的方法，其中所述反应进行约0.5小时至约15小时、或约0.5小时至约10小时、或约0.5小时至约5小时、或约0.5小时至约2小时的反应时间。
19.根据条项1至18中任一项所述的方法，所述方法还包括中和所述冷却混合物。
20.根据条项1至19中任一项所述的方法，所述方法还包括分离所述式(A)的化合物。
21.一种用于合成式(AAPG)的反应性碳水化合物的方法
其中R2是一价保护基团，PG是二价保护基团，并且n是1至5的整数，所述方法包括在含金属沸石的存在下使式(APG)的化合物
与式(A1)的化合物反应
其中X是-I、-Br、-Cl、-CN、-OTf(三氟甲磺酸根)、-OMs(甲磺酸根)、-OTs(甲苯磺酸根)、甲基硫酸根或三氯乙酰亚胺酯基。
22.根据条项21所述的方法，其中所述含金属沸石中的金属包括Ag、Al、Cd、Co、Cu、Fe、Ga、In、Mo、Pd、Pt、Sn、Sb、V、Zr或它们的任何混合物。
23.根据条项21所述的方法，其中所述含金属沸石包括选自由以下组成的组的沸石：Sn-β、Zr-β、Al-β(OH)、Al-β(F)、Pt@MCM-22、K-PtSn/MFI、0.3Pt/0.5Sn-Si-β、Pt/Sn2.0-β、0.5CoSi-β、V-β、H-[Fe]ZSM-5、Fe-BEA、Ga-β、Ga-β-200、Mo/HZSM-5或它们的任何混合物。
24.根据条项21所述的方法，其中所述含金属沸石包括含银沸石。
25.根据条项21至24中任一项所述的方法，其中所述反应在选自由甲苯、二氯甲烷-甲苯混合物、DMSO-甲苯混合物和N-甲基吡咯烷酮-甲苯混合物组成的组的有机溶剂中进行。
26.根据条项21至25中任一项所述的方法，其中所述反应在甲苯中进行。
27.根据条项21至26中任一项所述的方法，其中所述反应在分子筛的存在下进行。
28.根据条项21至27中任一项所述的方法，其中所述反应在型、型、型、13X型或它们的任何混合物的分子筛的存在下进行。
29.根据条项21至28中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约80℃的温度处进行。
30.根据条项21至29中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约50℃的温度处进行。
31.根据条项21至30中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约30℃的温度处进行。
32.根据条项21至31中任一项所述的方法，其中所述反应进行约5小时至约50小时。
33.根据条项21至32中任一项所述的方法，其中所述反应进行约5小时至约30小时。
34.根据条项21至31中任一项所述的方法，其中所述反应在约60℃至约80℃处进行约15小时至约20小时。
35.根据条项21至31中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约25℃处进行约20小时至约30小时。
36.根据条项21至35中任一项所述的方法，其中R2选自由以下组成的组：Ac、Bz、烯丙基、苯甲酸酯基、甲氧基甲基(MOM)、四氢吡喃基(THP)、叔丁基、新戊酸酯基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)。
37.根据条项21至36中任一项所述的方法，其中R2是Ac或Bz。
38.根据条项21至37中任一项所述的方法，其中PG选自由以下组成的组：PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B。
39.根据条项21至38中任一项所述的方法，其中PG是PhCH。
40.根据条项21至39中任一项所述的方法，其中X是Br。
41.根据条项21至40中任一项所述的方法，其中所述反应在惰性气氛下进行。
42.根据条项21至41中任一项所述的方法，所述方法还包括分离所述式(AAPG)的化合物。
43.根据条项21至42中任一项所述的方法，其中所述式(APG)的化合物是通过用所述保护基团PG保护式(A)的化合物形成的
其中R1是H。
44.根据条项43所述的方法，其中保护所述式(A)的化合物是通过与选自由PhCH(OMe)2、三光气、Me2SiCl2、Me2C(OMe)2、2-甲氧基丙烯和2,6-双(三氟甲基)苯基硼酸酯组成的组的化合物反应来进行的。
45.根据条项43或44所述的方法，其中保护所述式(A)的化合物是在选自由以下组成的组的有机溶剂中进行的：DMF、二甲基乙酰胺(DMAC)、DMSO、THF、二噁烷、1-3二氧戊环、乙腈、2,5-二甲基四氢呋喃(DMTHF)、γ-戊内酯(GVL)、二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)、乙酰丙酸甲酯(ML)、乙酰丙酸乙酯(EL)、乙酰丙酸乙酯丙二醇缩酮(ELPK)、戊二酸二甲酯(DMG)、二甲基丙烯脲(DMPU)、聚(丙二醇)(PPG)、四氢糠醇聚乙二醇醚(THFP)、1-乙基-3-甲基咪唑鎓乙酸盐([emim][OAc])以及它们的任何组合。
46.根据条项43至45中任一项所述的方法，其中所述式(A)的化合物是通过根据条项1至20中任一项所述的方法获得的。
47.一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法
其中n是1至5的整数，
所述方法包括将通过根据条项21至46中任一项所述的方法获得的式(AAPG)的化合物脱保护。
48.根据条项47所述的方法，其中脱保护包括使所述式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间产物，并然后用酸性溶液处理所述中间产物。
49.根据条项48所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的碱：甲醇盐、乙醇盐和2-甲基丙-2-醇盐，优选地所述碱是甲醇钠。
50.根据条项48或49所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的溶剂：甲醇、乙醇和异丙醇，优选地所述溶剂是甲醇。
51.根据条项48至50中任一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括乙酸-水混合物或乙醇酸-水混合物，优选地所述酸性溶液是乙酸水溶液。
52.根据条项48至51中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应在约0℃至约50℃的温度处，优选地在室温处进行。
53.根据条项48至52中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应进行约0.5小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
54.根据条项48至53中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理在约50℃至约70℃的温度处，优选地在约60℃处进行。
55.根据条项48至54中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理进行约1小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
56.根据条项48至55中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述式(AAPG)的化合物反应之后中和所述碱性溶液并且蒸发任何液体，得到呈粗制形式的中间产物。
57.根据条项48至56中任一项所述的方法，其中当用所述酸性溶液处理时，所述中间产物是粗制的。
58.一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法
所述方法包括将式(AAPG)的化合物脱保护
其中n是1至5的整数，R2是一价保护基团，并且PG是二价保护基团，
所述脱保护包括使所述式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间粗产物，并然后用酸性溶液处理所述中间粗产物。
59.根据条项58所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的碱：甲醇盐、乙醇盐和2-甲基丙-2-醇盐，优选地所述碱是甲醇钠。
60.根据条项58或59所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的溶剂：甲醇、乙醇和异丙醇，优选地所述溶剂是甲醇。
61.根据条项58至60中任一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括乙酸-水混合物或乙醇酸-水混合物，优选地所述酸性溶液是乙酸水溶液。
62.根据条项58至61中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应在约0℃至约50℃的温度处，优选地在室温处进行。
63.根据条项58至62中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应进行约0.5小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
64.根据条项58至63中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理在约50℃至约70℃的温度处，优选地在约60℃处进行。
65.根据条项58至64中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理进行约1小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
66.根据条项58至65中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述式(AAPG)的化合物反应之后中和所述碱性溶液并且蒸发任何液体，得到所述中间粗产物。
67.根据条项58至66中任一项所述的方法，其中R2是Ac或Bz，优选地Bz。
68.根据条项58至67中任一项所述的方法，其中PG选自由以下组成的组：PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B。
69.根据条项58至68中任一项所述的方法，其中PG是PhCH。
70.一种用于合成式(B)或式(BB)的反应性碳水化合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，并且LG是当式(B)或(BB)的化合物与氨基基团反应时能够形成酰胺键的离去基团，
所述方法包括使式(C)的化合物
与式(A)的化合物反应
其中R1是H，以形成所述式(B)的化合物
或者
与式(AA)的化合物反应
以形成所述式(BB)的化合物。
71.根据条项70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在光引发剂的存在下进行。
72.根据条项71所述的方法，其中所述光引发剂选自由以下组成的组：产生自由基的偶氮化合物、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)、基于金属或金属离子的光引发剂、过氧化物、过硫酸铵、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)以及它们的任何组合。
73.根据条项72所述的方法，其中所述产生自由基的偶氮化合物选自由以下组成的组：偶氮二异丁腈(AIBN)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)；1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)；二氮烯二甲酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二甲酸二哌啶(ADD)；2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(4-氰基戊酸)；2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)；以及它们的任何组合。
74.根据条项72或73所述的方法，其中所述过氧化物选自由以下组成的组：过氧异丁酸叔丁酯、叔丁基过氧化氢、过氧化苯甲酰以及它们的任何组合。
75.根据条项70至74中任一项所述的方法，其中使式(C)的化合物与式(A)或(AA)的化合物反应在水或有机溶剂中进行。
76.根据条项70至75中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在选自由以下组成的组的溶剂中进行：水、二噁烷、乙腈、四氢呋喃(THF)、二异丙醚、异丙醇、氯苯、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醇、叔丁醇、氯仿以及它们的任何组合。
77.根据条项70至76中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在约40℃至约110℃范围内的温度处进行。
78.根据条项70至77中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应进行约1小时至约10小时的时间。
79.根据条项70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在可见光下、在吸收可见光的过渡金属光催化剂的存在下进行。
80.根据条项70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在紫外光照射下进行。
81.根据条项70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在光引发剂的存在下在紫外光照射下进行。
82.根据条项81所述的方法，其中所述光引发剂选自由以下组成的组：2,2'-叠氮双[2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)；以及它们的组合。
83.根据条项80至82中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在醇溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇或它们的任何组合中进行。
84.根据条项80至83中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在约20℃至约30℃范围内的温度处进行。
85.根据条项80至84中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应进行约1小时至约24小时的时间。
86.根据条项80至85中任一项所述的方法，其中所述紫外光照射是短波、中波或长波紫外光照射。
87.根据条项70至86中任一项所述的方法，其中m是1至3的整数。
88.根据条项70至87中任一项所述的方法，其中m是2。
89.根据条项70至88中任一项所述的方法，其中LG是O-氟苯基基团，诸如OPhF-5或OPhF4(对SO3Na)，或O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
90.根据条项70至89中任一项所述的方法，其中LG是O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
91.根据条项70至90中任一项所述的方法，其中所述式(A)的化合物是通过根据条项1至20中任一项所述的方法获得的。
92.根据条项70至90中任一项所述的方法，其中所述式(AA)的化合物是通过根据条项47至69中任一项所述的方法获得的。
93.一种用于制备式(I)或(II)的糖缀合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，p是1至50的整数，并且是含有能够用于缀合的至少一个氨基基团的载体材料，所述方法包括将所述载体材料的至少一个游离氨基基团与式(B)的化合物缀合以形成所述式(I)的糖缀合物或与式(BB)的化合物缀合以形成所述式(I)的糖缀合物，其中所述式(B)和(BB)的化合物通过根据条项70至92中任一项所述的方法获得。
94.根据条项93所述的方法，其中所述载体材料包括蛋白质、多肽或肽。
95.根据条项1至94中任一项所述的方法，其中n是1至3的整数。
96.根据条项1至95中任一项所述的方法，其中n是1或2。
97.根据条项1至96中任一项所述的方法，其中n是1。
98.一种式(AAPG)的化合物
其中n是1至5的整数，R2是Ac，并且PG是选自由PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B组成的组的二价保护基团。
99.根据条项98所述的化合物，其中PG是PhCH。
100.根据条项98或99所述的化合物，其中n是1至3的整数。
101.根据条项98至100中任一项所述的化合物，其中n是1或2。
102.根据条项98至101中任一项所述的化合物，其中n是1。
103.根据条项98所述的化合物，所述化合物具有下式：
104.一种下式的化合物：
实施例
根据反应方案2并如下进一步详述来合成各种反应性碳水化合物。此外，进行蛋白质缀合以形成糖缀合物(I)和(II)，并且通过ELISA、蛋白质印迹、MALDI-TOF和Bradford测定评估缀合。
方案2
使用可商购获得的HPLC级在氩气气氛下进行反应。使用可商购获得的试剂(SigmaAldrich and Fisher Scientific,Canada)而无需进一步纯化。N-乙酰基-D-半乳糖胺由Rose Scientific Ltd.Alberta,Canada提供。使用硅胶60F254涂覆的板(E.Merck)，通过薄层色谱法监测反应进程。使用来自Canadian Life Science的ZEOprepTM硅胶60(40μm-63μm)或来自Buchi的FlasuPureTM系统进行快速色谱法。在UV光下或通过用20％乙醇硫酸或钼酸盐或KMnO4溶液喷雾，随后加热来进行检测。在Bruker ULTRASHIELDTM300MHz和BrukerAvanceTMIII HD 400MHz和600MHz光谱仪上记录NMR谱。质子和碳的化学位移(δ)以相对于残余CHCl3的化学位移的ppm报告，其化学位移设定为7.27ppm(1H)和77.00ppm(13C)。偶合常数(J)以赫兹(Hz)报告，并且以下缩写用于峰多重性：单峰(s)、双峰(d)、双二重峰(dd)、具有相等偶合常数的双二重峰(tap)、三重峰(t)、多重峰(m)。使用COSY(相关光谱学)和HSQC(异核单量子相干)实验进行分析和分配。使用来自Thermo Scientific的LC-MS-TOF(液相色谱质谱飞行时间)仪器以正电喷雾和/或负电喷雾模式测量高分辨率质谱(HRMS)。质子化离子(M+H)+或钠加合物(M+Na)+用于经验式确认。LC方法：使用Dionex UltimateTM3000系统(Thermo Scientific)，在室温处以800μL/min的流速将样品注射(2μL)到具有5μm颗粒的PrePureTMC18 150×4,6mm柱(BUCHI)上，该系统具有水(A)和乙腈(B)，均含有0.1％乙酸。梯度从5％B开始，保持0,5分钟。在1分钟内增加至15％B，然后在14,5分钟内增加至27％B，并然后在4分钟内增加至95％B。梯度在95％B处保持2分钟，并然后在1分钟内降低到5％B。最后，梯度在5％B处保持1分钟。总时间为24分钟。MS方法：在TSQ Quantum Access MaxTM(Thermo Scientific)上收集MS谱，该仪器配备有正离子模式的HESI离子源，设定为4,5kV源电压、320℃源温度。以SCAN模式从m/z 200-1000进行MS采集。使用Thermo XCaliburQual BrowserTM分析数据。
实施例1：烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(2)的合成
在N2下在0℃处，将乙酰氯(4.85mL，68.0mmol，3.4当量)添加到烯丙醇(80mL)中。将溶液在该温度处搅拌一小时，并然后在室温处将N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc，(1)，4.42g，20.0mmol，1.0当量)添加到该溶液中。将混合物在70℃处搅拌一小时。将溶液冷却至室温，并然后保持在0℃处。将溶液用MeOH(40mL)稀释，并用固体NaHCO3(8.0g)中和直至达到pH7.0。将混合物在celiteTM垫下过滤并用MeOH洗涤。然后在减压下去除溶剂。将干燥的粗产物1)溶解在水(50mL)中，并用DCM(4×200mL)洗涤，随后用EtOAc(200mL)洗涤，将水层分离并然后保持在-80℃处，随后冻干；2)在MeOH/己烷或EtOH/二异丙醚中沉淀；或3)通过硅胶快速色谱法使用梯度(EtOAc 100％至EtOAc/MeOH 4:1)纯化，得到呈白色固体的所需产物烯丙基GalNAc(2)(4.18mg，1.60mmol，80％)。Rf＝0.30；ACN/H2O 95:5；1H NMR(CD3OD,600MHz):δ5.99-5.88(m,1H,OCH2CH＝CH2),5.31(dd,1H,Jtrans＝17.3,Jgem＝1.3Hz,OCH2CH＝CH2),5.17(dd,1H,Jcis＝10.5Hz,OCH2CH＝CH2),4.86(d,1H,J1,2＝3.8Hz,H-1),4.27(dd,1H,J2,3＝11.0Hz,H-2),4.20(m,1H,OCH2),4.00(m,1H,OCH2),3.89(dd,J3,4＝J4,5＝2.6Hz,H-4),3.85-3.77(m,2H,H-3和H-5),3.72(m,2H,H-6a和H-6b)和1.99ppm(s,3H,CH3)；13C NMR(CD3OD,150MHz):δ172.5(NHCO),134.2(OCH2CH＝CH2),116.1(OCH2CH＝CH2),96.6(C-1),71.2(C-3),69.0(C-4),68.3(C-5)。67.8(OCH2),61.4(C-6),50.2(C-2)和21.2ppm(CH3)。ESI+-HRMS：C11H20O6N的[M+H]+计算值，262.1285；实验值，262.1294。LC-MS：rt＝4.94分钟。
实施例2：烯丙基2-乙酰氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(3)的合 成
向烯丙基GalNAc(2)(2.35g，9.0mmol，1.0当量)和苯甲醛二甲基缩醛(6.75mL，45.0mmol，5.0当量)在无水DMF(20mL)的溶液中添加催化量的对甲苯磺酸一水合物。将混合物在室温处搅拌。5小时后，将混合物用CHCl3稀释并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机层分离并用水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到白色固体。通过在EtOAc/己烷中沉淀来分离亚苄基缩醛(化合物(3))，为白色固体(2.64g，7.56％，84％)。Rf＝0.21；DCM/MeOH 9.0:0.5；1HNMR(CDCl3,300MHz):δ7.59-7.46(m,2H,H-ar),7.43-7.31(m,3H,H-ar),5.91(m,1H,OCH2CH＝CH2),5.75(d,1H,JNH,H2＝9.0Hz,NH),5.58(s,1H,PhCH),5.34-5.17(m,2H,OCH2CH＝CH2),5.01(d,1H,J1,2＝3.5Hz,H-1),4.56-4.42(ddd,1H,J2,3＝10.9Hz,J2,OH＝9.1Hz,H-2),4.34(dd,1H,J5,6a＝1.5Hz,J6a,6b＝12.5Hz,H-6a),4.19(m,2H,H-4和OCH2),4.04(m,1H,dd,1H,J5,6b＝1.6Hz,J6a,6b＝12.5Hz,H-6b),4.01(m,OCH2),3.86(dd,1H,J3,4＝10.9Hz,H-3),3.71(sb,1H,H-5),2.80(d,1H,J3,OH＝10.7Hz,OH-3)和2.05ppm(s,3H,CH3)。ESI+-HRMS：C18H24O6N的[M+H]+计算值，350.1598；实验值，350.1608。LC-MS：rt＝19.78分钟。
实施例3：烯丙基(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨 基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷)(5a)的合成
将化合物(3)(657mg，1.88mmol，1.0当量)和2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(化合物(4b)，3.48g，8.46mmol，4.5当量)与银交换沸石(2.56g)在含有4个分子筛(800mg)的无水甲苯(60mL)中在氩气气氛下在70℃处搅拌18小时。然后在celiteTM垫下滤出混合物。在减压下去除溶剂。将粗产物通过硅胶色谱法使用100％己烷至己烷/EtOAc1:4的梯度来纯化，得到呈白色固体的所需二糖化合物(5a)(817mg，1.20mmol，64％)。Rf＝0.24；乙烷/EtOAc 1:4；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.57-7.50(m,2H,H-ar),7.42-7.30(m,3H,H-ar),5.97-5.80(m,1H,OCH2CH＝CH2),5.63-5.545(m,3H),5.38(dd,1H,J3,4’＝3.3Hz,J4,5’＝1.0Hz,H-4II),5.33-5.14(m,4H),5.05(d,1H,J＝3.5Hz,H-1),5.11-5.00(m,1H,H-2),4.76(d,1H,J＝7.9Hz,H-1’),4.68(m,1H),4.30-3.80(m,7H),3.65(m,1H),2.15(s,3H),2.04(s,6H),1.99(s,3H)和1.97ppm(s,3H)。ESI+-HRMS：C32H42O15N的[M+H]+计算值，680.2549；实验值，680.2549(0.0ppm)。LC-MS：rt＝13.11分钟。
实施例4：烯丙基(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰 氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(5b)的合成
将化合物(3)(101mg，0.29mmol，1.0当量)和2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(化合物(4b)，239mg，0.58mmol，2.0当量)与银交换沸石(430mg)在含有4个分子筛的无水甲苯(10mL)中在氩气气氛下在70℃处搅拌18小时。然后在celiteTM垫下滤出混合物。在减压下去除溶剂。将粗产物通过硅胶色谱法使用100％己烷至己烷/EtOAc 1:2的梯度来纯化，得到呈白色固体的所需二糖化合物(5b)(250mg，0.27mmol，94％)。mp:110℃-111℃；Rf＝0.20；乙烷/EtOAc 1:2；1H NMR(CDCl3,600MHz):δ8.06-7.19(m,25H,H-ar),5.98(dd,1H,J3,4’＝3.3Hz,J4,5’＝1.0Hz,H-4II),5.85-5.78(m,2H,OCH2CH＝CH2和H-2II),5.60(dd,1H,J2,3’＝10.2Hz,J3,4’＝3.4Hz,H-3II),5.48(sb,1H,NH),5.23(m,3H,OCH2CH＝CH2和H-1),4.68(dd,1H,J5’,6a’＝6.9Hz,J6a’,6b’＝11.4Hz,H-6aI),4.63-4.58(m,1H,H-2),4.46-4.36(m,3H,H-4。H-5和H-6bII),4.14-4.07(m,3H,H-6a,OCH2和H-3),3.96(m,1H,OCH2),3.75(m,1H,H-6b),3.51(m,1H,H-5)和1.40ppm(s,3H,CH3)；13C NMR(CDC13,150MHz):δ170.0(NHCO),166.0,165.5,165.4,165.2(CO),137.6-126.2(多重峰，30C-芳族),133.2(OCH2CH＝CH2),117.8(OCH2CH＝CH2),102.0(C-1II),100.9(CPhCH),97,3(C-1I),76.1(C-3),75.4(C-4),71.7(C-3II和C-5II),70.2(C-2II),69.1(C-6),68.6(OCH2),68.1(C-4II),62.9(C-5),62.6(C-6I),48.2(C-2)和22.5ppm(CH3)。ESI+-HRMS：C52H50O15N的[M+H]+计算值，928.3175；实验值，928.3133。
实施例5：烯丙基(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半 乳糖苷(6)的合成
将化合物(5b)(1.12g，1.20mmol，1.0当量)在1M甲醇钠的甲醇溶液(12mL，pH 8-9)中的溶液在室温处搅拌直至起始材料消耗。1.5小时后，通过添加离子交换树脂(AmberliteTMIR 120,H+)将溶液中和，过滤，用MeOH洗涤，并在减压下去除溶剂，得到呈白色固体的中间体。然后将白色固体中间体溶解在10mL 60％乙酸水溶液中，并将所得溶液在60℃处搅拌1.5小时。在减压下去除溶剂，并将残余物溶解在水中，并且用二氯甲烷洗涤数次并用EtOAc洗涤两次。然后将水层冻干，得到呈白色固体的脱保护的烯丙基化合物(6)(400mg，0.94mmol，79％)。mp＝230℃-232℃；Rf＝0.53；CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1；1H NMR(D2O,600MHz):δ5.80(m,1H,OCH2CH＝CH2),5.19(dd,1H,Jtrans＝17.3Hz,OCH2CH＝CH2),5.09(dd,1H,Jcis＝10.4Hz,OCH2CH＝CH2),4.77(d,1H,J1,2＝3.7Hz,H-1),4.29(d,1H,J1,2＝3.7Hz,H-1),4.29(d,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1II),4.16(dd,1H,J2,3＝11.2Hz,J1,2＝3.7Hz,H-2),4.08-4.01(m,2H,H-4和OCH2),3.92-3.82(m,3H,H-3,H-5和OCH2),3.73(dd,1H,H-4II),3.63-3.52(m,4H,H-6a,b和H-6’a,b),3.47(m,2H,H-3II和H-5II),3.39(dd,1H,J2’,3’＝10.0Hz,J1’,2’＝7.7Hz,H-2II)和1.85ppm(s,3H,CH3)；13C NMR(D2O,150MHz):δ174.6(NHCO),133.7(OCH2CH＝CH2),117.9(OCH2CH＝CH2),104.7(C-1II),96.4(C-1),77.2(C-3),75.0(C-5II),72.5(C-3II),70.7(C-5),70.6(C-2II),68.8(C-4),68.6(C-4II),68.4(OCH2),61.2(C-6II),61.0(C-6),48.6(C-2)和22.0ppm(CH3)。ESI+-HRMS：C17H29O11NNa的[M+Na]+计算值，446.1633；实验值，446.1613。LC-MS：rt＝4.77分钟。
实施例6：N-琥珀酰亚胺基-3-{[3-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨基-2- 脱氧-α-D-吡喃半乳糖基)氧基丙基]硫代}丙酸酯(11b)并与蛋白质CRM197缀合以形成糖缀 合物(II)
将化合物(6)(138mg，0.53mmol，1.0当量)、化合物(7)(538mg，2.65mmol，5当量–可从Sigma-Aldrich商购获得)和4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA，1.5mg，0.05mmol，0.1当量)在脱气的乙腈(5mL)中回流(70℃)搅拌2小时。恢复至室温后，在减压下去除溶剂。化合物(6)和化合物(7)也可用DMPA(0.1当量)在THF/水(1:1；v/v)在UV照射(280nm-320nm)下在25℃处再活化20分钟。将粗产物悬浮在水中并通过用二氯甲烷洗涤数次并用EtOAc洗涤两次以去除琥珀酰亚胺试剂来萃取。含有粗化合物(11b；NHS-TF)的最终水层冷却至-80℃以冻干。然后，将无需任何进一步纯化的粗化合物(11b)直接用于与蛋白质CRM197的缀合步骤中，得到糖缀合物(II；CRM-TF)。另外，将粗白色固体也通过C-18反相制备型HPLC纯化，得到白色固体11b。纯化合物(11b)用于与蛋白质CRM197的缀合步骤中，得到糖缀合物(II；CRM-TF)。1H NMR(D2O,400MHz):δ4.83(d,1H,J＝3.7Hz,H-1),4.40(d,1H,J＝7.7Hz,H-1II),4.25(dd,1H,J＝17.0,6.9Hz),4.18(d,1H,J＝2.6Hz),4.02-3.90(m,2H),3.84(d,1H,J＝3.1Hz),3.80-3.62(m,5H),3.62-3.40(m,4H),3.02(t,2H,J＝6.7Hz),2.96-2.83(m,5H),2.79-2.55(m,3H),1.96(s,3H)和1.87(dd,2H,J＝12.9,6.4Hz)；13C NMR(D2O,100MHz,):δ176.6,174.6,173.3,169.2,104.8,97.2,77.3,75.0,72.6,70.6,68.8,68.6,66.4,66.3,61.2,61.0,48.7,34.3,31.4,28.4,28.2,26.3,25.7,25.6,25.2和22.0ppm(CH3)。ESI+-HRMS：C24H38O15N2SNa的[M+Na]+计算值，649.18851；实验值，649.18838,0.2ppm。HPLC:Tr＝10.747。
对于缀合步骤，通过离心过滤(AmiconTMMWCO；10K或30K)将载体蛋白缓冲液更换为pH 8的PBS，并将其浓度调节至2mg/ml。使用以BSA作为标准的Bradford测定来测量蛋白质浓度。通过向蛋白质中添加新鲜的20mM化合物(11b)水溶液来引发与蛋白质的缀合，以达到1mg/ml的最终蛋白质浓度。添加到蛋白质中的化合物(11b)的量可根据蛋白质的表面可及的赖氨酸的数量和预期的最终缀合比率进行调整。然后，将溶液涡旋90分钟，然后使用pH7.4的PBS(AmiconTMMWCO；10K或30K)通过离心过滤，或凝胶过滤进行洗涤。
通过ELISA、蛋白质印迹、MALDI-TOF和Bradford测定证明了蛋白质与化合物(11b)的缀合，即获得了糖缀合物(II)。
通过ELISA测定TF特异性凝集素花生凝集素(PNA)和抗TF单克隆抗体JAAF11与0.01μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率(0.2、0.6、3)缀合的CRM197的反应性。如图1所示，ELISA表明缀合条件与所得糖缀合物的反应性之间的相关性。
图2显示了1μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。相对于未缀合的CRM，在缀合条件的作用下观察到的糖缀合物带的迁移率的降低表明CRM是缀合的。
使用TF特异性凝集素花生凝集素(PNA)和抗TF单克隆抗体JAAF11记录1μg未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与检测到的蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的蛋白质印迹。如图3所示，蛋白质印迹揭示了与缀合条件相关的分子量增加的PNA和JAAF11的反应性带，表明CRM是缀合的并且对未缀合的CRM不存在反应性。
记录未缀合的CRM197和与TF(CRM-TF：糖缀合物(II))以NHS-TF(化合物(11b))与蛋白质的赖氨酸总数的3种不同比率缀合的CRM197的MALDI-TOF谱。如图4所示，该谱表明质量随缀合条件的变化而增加。插图中的表格显示了质量的增益和与TF缀合的平均摩尔比。
实施例7：N-琥珀酰亚胺基-3-[3-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基丙 基)硫代]-丙酸酯(11a)并与蛋白质CRM197缀合以形成糖缀合物(I)
将化合物(2)(200mg，0.765mmol，1.0当量)、化合物(7)(933mg，4.59mmol，6.0当量)和4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA，2mg，0.08mmol，0.01当量)在脱气的乙腈和异丙醇(4.0mL，1:1)中回流(70℃)搅拌2小时。恢复至室温后，在减压下去除溶剂。将粗产物悬浮在水中并通过A)C18硅胶色谱法或C18 HPLC或B)通过用二氯甲烷洗涤数次并用EtOAc洗涤两次以去除琥珀酰亚胺试剂进行萃取来纯化。将含有粗化合物(11a；NHS-TN)的最终水层冷却至-80℃以冻干。然后，将无需任何进一步纯化的粗化合物(11a)直接用于与蛋白质CRM197的缀合步骤中，得到糖缀合物(I；CRM-TN)。
对于缀合步骤，通过离心过滤(AmiconTMMWCO；10K或30K)将载体蛋白缓冲液更换为pH 8的PBS，并将其浓度调节至2mg/ml。使用以BSA作为标准的Bradford测定来测量蛋白质浓度。通过向蛋白质中添加新鲜的20mM化合物(11a)水溶液来引发与蛋白质的缀合，以达到1mg/ml的最终蛋白质浓度。添加到蛋白质中的化合物(11a)的量可根据蛋白质的表面可及的赖氨酸的数量和预期的最终缀合比率进行调整。然后，将溶液涡旋90分钟，然后使用pH7.4的PBS(AmiconTMMWCO；10K或30K)通过离心过滤，或凝胶过滤进行洗涤。
序列表
<110> 科兰克斯资本(KORANEX CAPITAL)
<120> 包括用于与载体材料缀合的抗原前体的反应性碳水化合物的合成方法
<130> 20187-50
<150> IN 202121001963
<151> 2021-01-15
<160> 5
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌(Clostridium tetani)
<400> 1
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<223> dTT831-844-Cys-β-Ala
<220>
<221> 修饰的_残基
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 2
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<223> 来自SARS-CoV-2的S1蛋白的O-糖基化肽
<400> 3
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
1 5
<210> 4
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<223> dTT830-843
<400> 5
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10

Claims (104)

1.一种用于合成式(A)的反应性碳水化合物的方法
其中R1是H，并且n是1至5的整数，
所述方法包括在加热下使式(A0)的化合物
与HO-(CH2)n-CH＝CH2在能够释放质子的酸的存在下反应，生成包含所述式(A)的化合物的反应混合物，以及
冷却所述反应混合物以获得包含所述式(A)的化合物的冷却混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸包括乙酰氯、乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酸包括乙酰氯。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物反应包括在约0℃至约25℃的混合温度处将所述式(A0)的化合物添加到包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的溶液中，在较低温度处生成包含所述式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和HCl的中间体反应混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述混合温度是约0℃、或约0℃至约10℃、或约0℃至约20℃、或约10℃至约20℃、约10℃至约25℃。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中包含HO-(CH2)n-CH＝CH2和乙酰氯的所述溶液是在惰性气氛下在约0℃的温度处制备的。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物反应包括使所述中间体反应混合物与热源在约40℃至约80℃的温度处接触。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述加热在约40℃至约80℃的反应温度处进行约30分钟至5小时的反应时间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述反应温度是约60℃至约80℃。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述反应温度是约70℃。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟至约1小时。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟至约45分钟。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述反应时间是约30分钟。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酸包括乙酸、酸性阳离子交换树脂、樟脑磺酸、对甲苯磺酸一水合物、HCl或它们的任何混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使所述式(A0)的化合物与HO-(CH2)n-CH＝CH2反应包括加热包含所述式(A0)的化合物、HO-(CH2)n-CH＝CH2和所述酸的溶液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶液还包含选自由以下组成的组的溶剂：二氯甲烷、氯仿、1,3-二氧戊环、二乙氧基甲烷、二甲氧基甲烷、2,5,7,10-四氧杂十一烷、二丙氧基甲烷以及它们的任何组合。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述反应在约30℃至约70℃的温度处进行。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述反应进行约0.5小时至约15小时、或约0.5小时至约10小时、或约0.5小时至约5小时、或约0.5小时至约2小时的反应时间。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述方法还包括中和所述冷却混合物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，所述方法还包括分离所述式(A)的化合物。
21.一种用于合成式(AAPG)的反应性碳水化合物的方法
其中R2是一价保护基团，PG是二价保护基团，并且n是1至5的整数，
所述方法包括在含金属沸石的存在下使式(APG)的化合物
与式(A1)的化合物反应
其中X是-I、-Br、-Cl、-CN、-OTf(三氟甲磺酸根)、-OMs(甲磺酸根)、-OTs(甲苯磺酸根)、甲基硫酸根或三氯乙酰亚胺酯基。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述含金属沸石中的金属包括Ag、Al、Cd、Co、Cu、Fe、Ga、In、Mo、Pd、Pt、Sn、Sb、V、Zr或它们的任何混合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述含金属沸石包括选自由以下组成的组的沸石：Sn-β、Zr-β、Al-β(OH)、Al-β(F)、Pt@MCM-22、K-PtSn/MFI、0.3Pt/0.5Sn-Si-β、Pt/Sn2.0-β、0.5CoSi-β、V-β、H-[Fe]ZSM-5、Fe-BEA、Ga-β、Ga-β-200、Mo/HZSM-5或它们的任何混合物。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述含金属沸石包括含银沸石。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述反应在选自由甲苯、二氯甲烷-甲苯混合物、DMSO-甲苯混合物和N-甲基吡咯烷酮-甲苯混合物组成的组的有机溶剂中进行。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述反应在甲苯中进行。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述反应在分子筛的存在下进行。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述反应在型、型、型、13X型或它们的任何混合物的分子筛的存在下进行。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约80℃的温度处进行。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约50℃的温度处进行。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约30℃的温度处进行。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述反应进行约5小时至约50小时。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述反应进行约5小时至约30小时。
34.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述反应在约60℃至约80℃处进行约15小时至约20小时。
35.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述反应在约20℃至约25℃处进行约20小时至约30小时。
36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中R2选自由以下组成的组：Ac、Bz、烯丙基、苯甲酸酯基、甲氧基甲基(MOM)、四氢吡喃基(THP)、叔丁基、新戊酸酯基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)。
37.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中R2是Ac或Bz。
38.根据权利要求21至37中任一项所述的方法，其中PG选自由以下组成的组：PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B。
39.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中PG是PhCH。
40.根据权利要求21至39中任一项所述的方法，其中X是Br。
41.根据权利要求21至40中任一项所述的方法，其中所述反应在惰性气氛下进行。
42.根据权利要求21至41中任一项所述的方法，所述方法还包括分离式(AAPG)的化合物。
43.根据权利要求21至42中任一项所述的方法，其中所述式(APG)的化合物是通过用所述保护基团PG保护式(A)的化合物形成的，
其中R1是H。
44.根据权利要求43所述的方法，其中保护所述式(A)的化合物是通过与选自由PhCH(OMe)2、三光气、Me2SiCl2、Me2C(OMe)2、2-甲氧基丙烯和2,6-双(三氟甲基)苯基硼酸酯组成的组的化合物反应来进行的。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中保护所述式(A)的化合物是在选自由以下组成的组的有机溶剂中进行的：DMF、二甲基乙酰胺(DMAC)、DMSO、THF、二噁烷、1-3二氧戊环、乙腈、2,5-二甲基四氢呋喃(DMTHF)、γ-戊内酯(GVL)、二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)、乙酰丙酸甲酯(ML)、乙酰丙酸乙酯(EL)、乙酰丙酸乙酯丙二醇缩酮(ELPK)、戊二酸二甲酯(DMG)、二甲基丙烯脲(DMPU)、聚(丙二醇)(PPG)、四氢糠醇聚乙二醇醚(THFP)、1-乙基-3-甲基咪唑鎓乙酸盐([emim][OAc])以及它们的任何组合。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述式(A)的化合物通过根据权利要求1至20中任一项所述的方法获得。
47.一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法
其中n是1至5的整数，
所述方法包括将通过根据权利要求21至46中任一项所述的方法获得的所述式(AAPG)的化合物脱保护。
48.根据权利要求47所述的方法，其中脱保护包括使所述式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间产物，并然后用酸性溶液处理所述中间产物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的碱：甲醇盐、乙醇盐和2-甲基丙-2-醇盐，优选地所述碱是甲醇钠。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的溶剂：甲醇、乙醇和异丙醇，优选地所述溶剂是甲醇。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括乙酸-水混合物或乙醇酸-水混合物，优选地所述酸性溶液是乙酸水溶液。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应在约0℃至约50℃的温度处，优选地在室温处进行。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应进行约0.5小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
54.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理在约50℃至约70℃的温度处，优选地在约60℃处进行。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理进行约1小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
56.根据权利要求48至55中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述式(AAPG)的化合物反应之后中和所述碱性溶液并且蒸发任何液体，得到呈粗制形式的中间产物。
57.根据权利要求48至56中任一项所述的方法，其中当用所述酸性溶液处理时，所述中间产物是粗制的。
58.一种用于合成式(AA)的反应性碳水化合物的方法
所述方法包括将式(AAPG)的化合物脱保护
其中n是1至5的整数，R2是一价保护基团，并且PG是二价保护基团，
所述脱保护包括使所述式(AAPG)的化合物与碱性溶液反应以形成中间粗产物，并然后用酸性溶液处理所述中间粗产物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的碱：甲醇盐、乙醇盐和2-甲基丙-2-醇盐，优选地所述碱是甲醇钠。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述碱性溶液包含选自由以下组成的组的溶剂：甲醇、乙醇和异丙醇，优选地所述溶剂是甲醇。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括乙酸-水混合物或乙醇酸-水混合物，优选地所述酸性溶液是乙酸水溶液。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应在约0℃至约50℃的温度处，优选地在室温处进行。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中与所述碱性溶液的所述反应进行约0.5小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
64.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理在约50℃至约70℃的温度处，优选地在约60℃处进行。
65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其中用所述酸性溶液处理进行约1小时至约5小时，优选地约1小时至约2小时的时间。
66.根据权利要求58至65中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述式(AAPG)的化合物反应之后中和所述碱性溶液并且蒸发任何液体，得到所述中间粗产物。
67.根据权利要求58至66中任一项所述的方法，其中R2是Ac或Bz，优选地Bz。
68.根据权利要求58至67中任一项所述的方法，其中PG选自由以下组成的组：PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B。
69.根据权利要求58至68中任一项所述的方法，其中PG是PhCH。
70.一种用于合成式(B)或式(BB)的反应性碳水化合物的方法
(B):R1是H
(BB):R1是
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，并且LG是当式(B)或(BB)的化合物与氨基基团反应时能够形成酰胺键的离去基团，
所述方法包括使式(C)的化合物
与式(A)的化合物反应
其中R1是H，以形成所述式(B)的化合物
或者
与式(AA)的化合物反应
以形成所述式(BB)的化合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在光引发剂的存在下进行。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述光引发剂选自由以下组成的组：产生自由基的偶氮化合物、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)、基于金属或金属离子的光引发剂、过氧化物、过硫酸铵、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)以及它们的任何组合。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述产生自由基的偶氮化合物选自由以下组成的组：偶氮二异丁腈(AIBN)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)；1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)；二氮烯二甲酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二甲酸二哌啶(ADD)；2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)；4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(4-氰基戊酸)；2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)；以及它们的任何组合。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述过氧化物选自由以下组成的组：过氧异丁酸叔丁酯、叔丁基过氧化氢、过氧化苯甲酰以及它们的任何组合。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物在水或有机溶剂中进行反应。
76.根据权利要求70至75中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在选自由以下组成的组的溶剂中进行：水、二噁烷、乙腈、四氢呋喃(THF)、二异丙醚、异丙醇、氯苯、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醇、叔丁醇、氯仿以及它们的任何组合。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在约40℃至约110℃范围内的温度处进行。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应进行约1小时至约10小时的时间。
79.根据权利要求70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在可见光下、在吸收可见光的过渡金属光催化剂的存在下进行。
80.根据权利要求70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在紫外线照射下进行。
81.根据权利要求70所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在光引发剂的存在下在紫外光照射下进行。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述光引发剂选自由以下组成的组：2,2'-叠氮双[2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)；以及它们的组合。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在醇溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇或它们的任何组合中进行。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应在约20℃至约30℃范围内的温度处进行。
85.根据权利要求80至84中任一项所述的方法，其中使所述式(C)的化合物与所述式(A)或(AA)的化合物反应进行约1小时至约24小时的时间。
86.根据权利要求80至85中任一项所述的方法，其中所述紫外光照射是短波、中波或长波紫外光照射。
87.根据权利要求70至86中任一项所述的方法，其中m是1至3的整数。
88.根据权利要求70至87中任一项所述的方法，其中m是2。
89.根据权利要求70至88中任一项所述的方法，其中LG是O-氟苯基基团，诸如OPhF5或OPhF4(对SO3Na)，或O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
90.根据权利要求70至89中任一项所述的方法，其中LG是O-(N-琥珀酰亚胺基)基团。
91.根据权利要求70至90中任一项所述的方法，其中所述式(A)的化合物通过根据权利要求1至20中任一项所述的方法获得。
92.根据权利要求70至90中任一项所述的方法，其中所述式(AA)的化合物通过根据权利要求47至69中任一项所述的方法获得。
93.一种用于制备式(I)或(II)的糖缀合物的方法
其中n是1至5的整数，m是1至5的整数，p是1至50的整数，并且是含有能够用于缀合的至少一个氨基基团的载体材料，
所述方法包括将所述载体材料的至少一个游离氨基基团与式(B)的化合物缀合以形成所述式(I)的糖缀合物，或与式(BB)的化合物缀合以形成所述式(I)的糖缀合物，其中所述式(B)和(BB)的化合物通过根据权利要求70至92中任一项所述的方法获得。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述载体材料包括蛋白质、多肽或肽。
95.根据权利要求1至94中任一项所述的方法，其中n是1至3的整数。
96.根据权利要求1至95中任一项所述的方法，其中n是1或2。
97.根据权利要求1至96中任一项所述的方法，其中n是1。
98.一种式(AAPG)的化合物
其中n是1至5的整数，R2是Ac，并且PG是选自由PhCH、Me2C、O＝C、Me2Si和2,6-双(三氟甲基)苯基-B组成的组的二价保护基团。
99.根据权利要求98所述的化合物，其中PG是PhCH。
100.根据权利要求98或99所述的化合物，其中n是1至3的整数。
101.根据权利要求98至100中任一项所述的化合物，其中n是1或2。
102.根据权利要求98至101中任一项所述的化合物，其中n是1。
103.根据权利要求98所述的化合物，所述化合物具有下式：
104.一种下式的化合物：
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