KR20160098161A

KR20160098161A - 피. 에루기노사 백신용 합성 올리고당류

Info

Publication number: KR20160098161A
Application number: KR1020167001973A
Authority: KR
Inventors: 에이. 스튜워트 캠벨; 오바디야 제이. 플란테
Original assignee: 비스테라, 인크.
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2016-08-18
Also published as: CN105517573A; JP2016525507A; WO2015002954A1; US20160144016A1; EP3016685A1; EP3016685A4; AU2014284457A1; IL243432A0; CL2015003792A1; SG11201510792XA; MX2016000195A; EP3016685B1; CA2917192A1; HK1217642A1

Abstract

본 발명은 합성 슈도모나스 에루기노사 지질올리고당류(LOS)계 올리고당류, 및 각종 피. 에루기노사 혈청형 특이적 올리고당류 항원 또는 다양한 코어 피. 에루기노사 올리고당류 구조 또는 모티브를 함유하는 접합체를 제공한다. 본 발명은 추가로 피. 에루기노사에 의해 야기된 감염을 진단, 치료 및 예방하기 위한 피. 에루기노사 LOS계 면역원성 및 면역보호 조성물, 및 이로부터 유도된 항체를 제공한다.

Description

피. 에루기노사 백신용 합성 올리고당류{SYNTHETIC OLIGOSACCHARIDES FOR P. AERUGINOSA VACCINE}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 가특허 출원 번호 61/842,474(2013년 7월 3일 출원)를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 내용은 이에 따라 본원에 참고 인용된다.

본 발명의 분야

본 발명은 면역원성 및 면역보호 조성물, 및 균질한 합성 피. 에루기노사 지질올리고당류(P. aeruginosa lipooligosaccharide(LOS))계 올리고당류, 접합체, 및 이로부터 유도된 항체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 합성 올리고당류 1a 또는 1b를 제공한다:

상기 식에서, 각각의 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 단당류 또는 올리고당류이고, X는 H, 링커 기, 또는 보호 기이고; L은 링커이고 Y는 담체이다. 일부 구체예에서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, α-Rha-, α-Glc(1-2)-α-Rha-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha-, β-FucNAc(1-3)-α-Rha-, α-Rha[2,3,4-OAc]-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha[2,4-OAc]-, 또는 β-FucNAc(1-3)-α-Rha[2,4,-OAc]-이다. 일부 구체예에서, R₁ 및 R₂는 하기 표의 조합에서 선택된다:

본 발명은 또한 항원 1a 및/또는 1b 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 단일 항원 또는 공지되어 있는 규정된 항원 혼합물을 함유한다.

본 발명은 면역원성 및 면역보호 조성물을 포함하고, 항원 1a 및/또는 1b 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 백신 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 백신 조성물은 경우에 따라 약학적으로 허용가능한 보강제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 백신 조성물은 내독소를 포함하지 않는다. 백신 조성물은 1가, 2가, 3가 또는 4가일 수 있다.

본 발명은 올리고당류 1a 및 항원 1b를 합성 형성하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 피. 에루기노사에 의해 야기된 감염을 진단, 치료 및 예방하는 방법을 추가로 제공한다.

상세한 설명

정의

본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 다음과 같은 정의를 제공한다.

단위, 접두사, 및 부호는 SI 허용 형태로 나타낼 수 있다. 본원에 인용되는 수치 범위는 범위를 규정하는 수치를 포함하며 규정된 범위 내에서 각 정수를 포함하고 지지한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 단수형("a" 또는 "an")은 "∼중 하나 이상"을 의미하는 것으로서 이해된다. 본원에 사용된 섹션 표제는 단지 구조적인 목적을 위한 것이며 기술된 청구 대상을 제한하는 것으로 이해되서는 안된다. 비제한적으로 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 전문서를 비롯한 본 출원에 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부는 사실상 그 전문이 명확하게 본원에 참고 인용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "올리고당류"는 둘 이상의 단당류 단위를 함유하는 화합물에 관한 것이다. 올리고당류는 환원성 말단에서 단당류 단위가 사실상 환원당인 것과 무관하게 환원성 말단 및 비환원성 말단을 갖는 것으로 간주된다. 용인된 명명법에 따라, 본원에서 올리고당류는 좌측에 비환원성 말단을 그리고 우측에 환원성 말단을 나타낸다. 본원에 기술된 모든 올리고당류는 비환원성 단당류(예, Gal)의 명칭 또는 약자, 이후에 글리코시드 결합(α 또는 β), 고리 결합, 결합에 수반된 환원성 단당류의 고리 위치의 배열, 그리고나서 환원성 단당류(DP, GlcNAc)의 명칭 또는 약자로 기술된다. 2개의 당류 사이의 연결은, 예를 들면 2,3, 2→3, 또는 2-3으로 나타낼 수 있다. 각 단당류는 피라노스 또는 푸라노스이다.

본원에 사용된 바와 같이, "단당류" 또는 "단당류 단위"는 올리고당류의 단일당 잔기, 및 이로부터의 유도체를 나타낸다. 올리고당류의 맥락에서, 개별 단량체 단위는 히드록실 기를 통해 또다른 단당류에 결합되는 (또는 결합될 수 있는) 단당류이다.

본원에 사용된 바와 같이, "내독소 불포함"은 단리된 박테리아 탄수화물 및 다당류에 통상 존재하는 내독소 또는 내독소 성분을 함유하지 않는 올리고당류를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "합성"은 단리되었을 때 화합물을 통상 동반하는 성분들, 예컨대 내독소, 당지질, 관련없는 올리고당류 등을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 재료를 나타낸다. 통상, 합성 화합물은 약 90% 이상의 순도, 통상 약 95% 이상, 바람직하게는 약 99% 이상의 순도이다. 순도는 당업계에 잘 공지된 여러 가지 수단에 의해 제시될 수 있다. 바람직하게는, 순도는 HPLC에 의해 측정된다. 합성 재료의 실체는 질량 분광기 및/또는 NMR 분광기에 의해 측정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "링커"는 한쪽 말단에서 담체의 반응성 작용기, 예컨대 아미노, 티올, 또는 카르복실 기와 공유 결합을 시작할 수 있는 그룹화, 및 다른쪽 말단에서 비슷하게 본 발명에 따른 올리고당류의 히드록실 기 또는 아미노 기와 공유 결합을 시작할 수 있는 그룹화를 제시하는 결합 또는 모이어티를 나타낸다. 링커 분자의 두개의 작용기 사이에는 적당한 길이의 생적합성 가교 분자, 예컨대 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 아릴알킬렌, 알킬렌, 알케닐렌, 또는 (올리고)알킬렌 글리콜 기가 있다. 링커는 바람직하게는 치환 또는 비치환된 (C₁-C₁₀) 알킬렌 기 또는 치환 또는 비치환된 (C₂-C₁₀) 알케닐렌 기를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "담체"는 올리고당류에 연결되어 올리고당류 단독보다 더 높은 정도로 생성된 올리고당류-담체 접합체의 면역원성을 향상시키는 단백질, 펩티드, 지질, 중합체, 덴드리머, 바이로좀(virosome), 바이러스 유사 입자(VLP), 또는 이의 조합을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "단백질 담체"는 올리고당류에 연결 또는 접합되어 올리고당류 단독보다 더 높은 정도로 생성된 올리고당류-단백질 담체 접합체의 면역원성을 향상시키는 단백질, 펩티드 또는 이의 단편을 나타낸다. 예를 들면, 담체로 사용되었을 때, 단백질 담체는 T 세포를 활성화하고 동원시켜 T 세포 의존 항체 생성을 증가시킬 수 있는 T 의존 항원으로서 작용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "접합된"은 올리고당류와 담체가 근위 관련되어 올리고당류 접합체가 비접합된 올리고당류에 비해 증가된 면역원성을 갖는 공유 또는 비공유 화학적 연결을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "접합체"는 링커 및/또는 가교결합제를 통해 담체에 화학적으로 연결되는 올리고당류를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "수동 면역"은 항체가 피험체에 투여됨으로써, 항체가 박테리아의 표면에 결합하고 박테리아가 식균되거나 사균되도록 항체가 상이한 피험체(동일하고 상이한 종의 피험체 포함)에서 생성되는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "방어 면역"은 동물에 투여되는 백신 또는 면역 스케줄이 병원체에 의해 야기되는 질병의 중증도를 감소시키거나 이의 발달을 예방, 지연하거나 또는 질병의 증상을 감소시키거나 완전히 없애는 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다. 방어 면역은, 보체 매개성 박테리아 활성을 활성화시키는 혈청 항체의 능력을 기초로 예측되거나 또는 적당한 동물 실험 모델에서 박테리아 감염에 대한 수동 보호를 부여할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "면역보호 조성물"은 호스트에서 방어 면역을 제공하기 위해 조제되는 조성물을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, (예컨대, 제제에 존재하는 에피토프에 대한) "면역 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로" 또는 "면역 반응을 자극하는 유효량으로"는 특정 항원 제제의 투여 전후에 측정되는 면역 반응 인디케이터 간에 검출가능한 차이가 있다는 것을 의미한다. 면역 반응 인디케이터는 비제한적으로 어세이, 예컨대 효소면역측정법(ELISA), 살균 어세이(예, 혈청 살균 항체 검출), 유동세포계수법, 면역침강법, Ouchter-Lowry 면역확산법; 예컨대, 스폿, 웨스턴 블롯 또는 항원 어레이의 결합 검출 어세이; 세포독성 어세이 등에 의해 검출되는 바와 같은 항체 역가 또는 특이성을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제제, 및 하이브리드 항체, 변형(altered) 항체, F(ab')² 단편, F(ab) 분자, Fv 단편, 파지 상 표시된 단일 쇄 단편 가변부(scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 이의 기능 단편을 비롯한 제제를 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같이, "단일클론 항체"는 균질한 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 나타낸다. 이 용어는 제조되는 방식으로 제한되지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린 분자, 및 Fab 분자, F(ab')² 단편, Fv 단편, 파지 상 표시된 단일 쇄 단편 가변부(scFv), 및 모 단일클론 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 기타 분자를 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같이, 올리고당류, 단백질 또는 펩티드를 지칭하였을 때 "항체에 특이적으로 결합하다" 또는 "∼와 특이적으로 면역반응성이 있는"은, 다른 분자의 불균질한 집단을 또한 포함할 수 있는 샘플에서 항원의 존재를 기초로 하고/하거나 증명하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 면역어세이 조건 하에, 명시된 항체 또는 항체(들)는 샘플에 존재하는 다른 분자에 유의적인 양으로 결합하지 않는 샘플에서 특정 항원 또는 항원(들)에 결합한다. 이러한 조건 하에서의 항체에의 특이적 결합은 특정 항원 또는 항원(들)에 대한 특이성으로 선택되는 항체 또는 항혈청을 필요로 할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 항체 분자에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 물질을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "면역원" 및 "면역원성 조성물"은 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 림프구 활성을 개시할 수 있는 항원 조성물을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 이 용어는 또한 "항원 결정기" 또는 "항원 결정 부위"와 혼용된다. 단백질, 올리고당류, 또는 다른 생물중합체 상의 B 세포 에피토프 부위는 폴딩에 의해 함께 묶이게 된 거대분자의 상이한 부분으로부터의 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 에피토프는 배좌 또는 불연속 에피토프로서 지칭되는데, 그 이유는 상기 부위가 선형 순서에서는 불연속이지만 폴딩된 배좌(들)에서는 연속인 중합체의 세그먼트를 포함하기 때문이다. 생물중합체 또는 다른 분자의 단일 세그먼트를 포함하는 에피토프는 연속 또는 선형 에피토프로 지칭된다. T 세포 에피토프는 일반적으로 선형 펩티드로 제한된다. 동일 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 또다른 항체의 결합을 방해하는 한 항체의 능력을 나타내는 단순 면역어세이에서 확인될 수 있다.

용어 Ac는 아세틸 (-C(O)CH₃)을 의미한다.

용어 TBS는 tert-부틸디메틸실릴을 의미한다.

용어 Troc는 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐을 의미한다.

용어 TCI는 트리클로로아세트이미데이트를 의미한다.

용어 Phth는 프탈로일을 의미한다.

용어 TFA는 트리플루오로아세테이트를 의미한다.

용어 TCA는 트리클로로아세테이트를 의미한다.

용어 Cbz는 벤질옥시카르보닐을 의미한다.

용어 Bz는 벤조일을 의미한다.

용어 Bn은 벤질을 의미한다.

용어 TES는 트리에틸실릴을 의미한다.

용어 TBDPS는 tert-부틸디페닐실릴을 의미한다.

용어 MCA는 모노클로로아세테이트를 의미한다.

용어 Lev는 레불리노일을 의미한다.

용어 ADMB는 4-O-아세틸 2,2디메틸부타노에이트를 의미한다.

용어 Tr은 트리페닐메틸을 의미한다.

용어 DMT는 디메톡시트리틸을 의미한다.

용어 FMOC는 9-플루오레닐메틸 카르보네이트를 의미한다.

용어 Alloc는 알릴옥시카르보닐을 의미한다.

용어 Nap는 나프틸을 의미한다.

용어 SEt는 티오에틸을 의미한다.

용어 SPh는 티오페닐을 의미한다.

용어 STol은 티오톨릴을 의미한다.

용어 SAdm은 티오아다만틸을 의미한다.

합성 올리고당류

본 발명은 피. 에루기노사 지질올리고당류(LOS) 부분, 외막의 주요 표면 성분에 상응하는 항원 구조를 화학적으로 합성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

올리고당류(1a 및 1b)에 있어서, 올리고당류는 하나 이상의 α- 및/또는 β-글리코시드 결합을 통해 서로에게 연결되는 하나 이상의 단당류 단위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 올리고당류는 통상 1-2 또는 1-4 연결성에 있어서 피. 에루기노사 LOS 구조에서 자연적으로 발견되는 글리코시드 결합 및 단당류를 포함한다. 본 발명은 추가로 특히 올리고당류 디자인이 자연적으로 피. 에루기노사 LOS 구조를 넘어서 연장되는 다른 연결성, 예컨대 1-3 및 1-6을 고려한다.

R₁ 또는 R₂가 올리고당류인 경우, 1개∼약 6개, 바람직하게는 약 4개 이하의 단당류 단위를 함유할 수 있다. 본 발명은 특히 올리고당류 디자인이 자연적으로 피. 에루기노사 LOS 구조를 넘어서 연장되는 천연 및 변성 단당류 단위, 예컨대 글루코스, 푸코사민 및 람노스의 포함을 고려한다.

화합물(1a 및 1b)에 있어서, 바람직한 당류 치환기는 α-Rha-(람노실), α-Glc(1-2)-α-Rha-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha-, β-FucNAc(1-3)-α-Rha-, α-Rha[2,3,4-OAc]-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha[2,4-OAc]-, 및 β-FucNAc(1-3)-α-Rha[2,4,-OAc]-를 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 올리고당류 1a를 제공한다:

상기 식에서, 각각의 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 단당류 또는 올리고당류이고, X는 H, 링커 기 또는 보호 기이다. 바람직하게는, R₁ 및 R₂는 H, α-Rha-(람노실), α-Glc(1-2)-α-Rha-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha-, β-FucNAc(1-3)-α-Rha-, α-Rha[2,3,4-OAc]-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha[2,4-OAc]-, 및 β-FucNAc(1-3)-α-Rha[2,4,-OAc]-에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, R₁ 및 R₂는 하기 표의 조합에서 선택된다:

또다른 측면에서, 본 발명은 올리고당류 1b를 제공한다:

상기 식에서, 각각의 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 단당류 또는 올리고당류이고, L은 링커 기이고, Y는 담체이다. 바람직하게는, R₁ 및 R₂는 H, α-Rha-(람노실), α-Glc(1-2)-α-Rha-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha-, β-FucNAc(1-3)-α-Rha-, α-Rha[2,3,4-OAc]-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha[2,4-OAc]-, 및 β-FucNAc(1-3)-α-Rha[2,4,-OAc]-에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, R₁ 및 R₂는 하기 표의 조합에서 선택된다:

일 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (2a)를 갖는다:

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또다른 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (2b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (3a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (3b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (4a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (4b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (5a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (5b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (6a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (6b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (7a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (7b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (8a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (8b)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1a)는 하기 화학식 (9a)를 갖는다:

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추가 구체예에서, 올리고당류 (1b)는 하기 화학식 (9b)를 갖는다:

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하기 표 1에는 순열에 의해 커버되도록 제안된 바람직한 R₁ 및 R₂ 조합 및 슈도모나스 혈청형이 나열된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 20개의 주요 혈청형, 제시된 혈청형 내 구성원, 및 상기 표 1에 표시된 개별 혈청형 서브유형 중 하나 이상에 상응하는 코어 올리고당류 구조 또는 모티브를 포함하는 LOS 항원을 제공한다. 하기 구체예에서, 링커는 1∼20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1∼8개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌티올 기로서 예시된다. 이러한 임의의 구체예에서, 제시된 링커(즉, 알킬렌티올 기)는 본원에 기술된 임의의 다른 적당한 링커로 치환될 수 있다.

당업자라면 본 발명이 상기 기술된 임의의 티올 생성물을 상이한 링커 및/또는 스페이서로 변형시키기에 충분하고, LOS 구조가, 상기 기술된 임의의 올리고당류, 및 이로부터 유도된 임의의 결과 조합, 또는 이에 대해서는 확실히 임의의 피. 에루기노사 LOS 구조로 유도되도록 하는 지침을 하기에 고려하고 제공한다는 것을 인식하여야 한다.

추가 측면에서, 본 발명은 다수의 상기 표 1에 기술된 임의의 상이한 올리고당류 등을 나타내는 다가 LOS 항원 조합 (및 이의 접합체), 또는 합성 올리고당류 1a 또는 1b 중 하나 이상과, 하나 이상의 다른 단백질 항원, 탄수화물 O-항원, 및/또는 알지네이트의 다가 조합을 제공한다.

적당한 링커는 한쪽 말단에서 담체의 반응성 작용기, 예컨대 아미노, 티올, 또는 카르복실 기와 공유 결합을 시작할 수 있는 그룹화, 및 다른쪽 말단에서 비슷하게 본 발명에 따른 올리고당류의 히드록실 기와 공유 결합을 시작할 수 있는 그룹화를 포함한다. 링커 분자의 두개의 작용기 사이에는 적당한 길이의 생적합성 가교 분자, 예컨대 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 아릴알킬렌, 알킬렌, 알케닐렌, 또는 (올리고)알킬렌 글리콜 기가 있다. 링커는 바람직하게는 1∼10개의 탄소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 알케닐렌 기를 포함한다.

담체 상에서 티올 기와 반응할 수 있는 링커는, 예컨대 말레이미드 및 카르복실 기이고; 알데히드 또는 카르복실 기와 반응할 수 있는 바람직한 그룹화는, 예컨대 아미노 또는 티올 기이다. 링커와 담체 사이의 바람직한 공유 결합은, 티올과 α-할로 카르보닐 또는 α-할로 니트릴의 반응, 및 티올과 말레이미드의 반응으로부터의 티오에테르; 히드라지드 또는 히드라진과 활성화된 카르보닐 기의 반응으로부터의 히드라지드(들)(예, 활성화된 NHS-에스테르 또는 산 할라이드); 아지드와 알킨의 반응으로부터의 트리아졸(예, "클릭 화학"을 통함); 및 예를 들어 문헌[Lees et al., Vaccine, 24:716, 2006]에 개시된 히드록실아민 및 알데히드 또는 케톤의 반응으로부터의 옥심을 포함한다. 추가의 적당한 링커 분자는 당업자에게 공지되어 있고 구입 가능하거나 또는 필요에 따라 그리고 제시된 작용기에 따라 고안될 수 있고 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

적당한 담체는 당업자에게 공지되어 있고(예, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Easton, PA (1990) 참조), 예를 들어 그 자체로는 특정 항원 특성을 나타낼 수 없지만, 담체(들)의 표면에 표시되는 본 발명의 올리고당류(항원)에 호스트의 면역원성 반응을 지원할 수 있는 단백질, 펩티드, 지질, 중합체, 덴드리머, 바이로좀, 바이러스 유사 입자(VLP), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 담체는, 비제한적으로 박테리아 톡소이드, 독소, 외독소, 및 이의 비독성 유도체를 포함한 단백질 담체, 예컨대 파상풍 톡소이드, 파상풍 독소 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM(비독성 디프테리아 독소 돌연변이), 예컨대 CRM 197, 콜레라 톡소이드, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 외독소 또는 톡소이드, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 엔테로톡신(heat labile enterotoxin), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A, 및 이의 재조합으로 생성된 유전적으로 독소제거된 변이체; 박테리아 외막 단백질, 예컨대 수막염균 혈청형 B 외막 단백질 복합체(OMPC), 외막 부류 3 포린(rPorB) 및 다른 포린; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH; keyhole limpet hemocyanine), B형 간염 바이러스 코어 단백질, 티로글로불린, 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 및 오브알부민; 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 부착소 단백질(PsaA); 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD); 트랜스페린 결합 단백질, 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산); TLR-5의 펩티딜 작용제(예, 운동성 박테리아, 예컨대 리스테리아(Listeria)의 플라젤린); 및 상기 담체의 유도체 및/또는 조합이다. 인간에게 사용하기에 바람직한 담체는 파상풍 톡소이드, CRM 197, 및 OMPC를 포함한다.

링커와 담체 사이의 결합 유형, 및 담체 및 올리고당류의 구조 성질에 따라, 담체는, 예를 들어 평균 1∼500개, 1∼100개, 1∼20개, 또는 3∼9개의 올리고당류 단위를 이의 표면 상에 표시할 수 있다.

담체, 예컨대 담체 단백질에 올리고당류를 결합시키는 방법은 통상적이며, 숙련된 당업자는 통상의 방법을 이용하여 본 발명에 따라 접합체를 생성할 수 있다. 지침은 또한 각종 공개물에서, 그리고 예컨대 미국 특허 번호 4,356,170; 4,619,828; 5,153,312; 5,422,427; 및 5,445,817; 및 각종 인쇄물 및 온라인 피어스(Pierce) 단백질 가교결합 가이드 및 카달로그(Thermo Fisher, Rockford, IL)에서 이용가능하다.

일 구체예에서, 본 발명의 탄수화물 항원은, 수많은 FDA 승인 백신에 사용되는 구입 가능한 단백질 담체인 CRM197에 접합된다. CRM-접합체는 다른 FDA 승인 담체, 예컨대 OMPC보다 합성, 정제 및 특성화에 용이하다는 장점을 갖는다. 탄수화물 항원은 티올-브로모아세틸 접합 화학을 통해 CRM에 접합될 수 있다. CRM 활성은, 개시 내용이 본원에 참고 인용되는 미국 특허 출원 공개 2007-0134762에 앞서 기술된 표준 조건을 사용하여 브로모아세트산의 NHS 에스테르와 리신 측쇄를 반응시킴으로써 실현될 수 있다. CRM은 접합 전에 단백질 당 10∼20개의 브로모아세틸 기(n=10∼20)로 작용기화될 수 있다. 접합은 CRM의 응집을 피하기 위해 pH=9에서 수행될 수 있다. CRM의 배경 가수분해를 최소화하면서 NHS-브로모아세테이트와의 완전한 CRM 반응을 보장하기 위해 pH의 신중한 모니터링이 이용되어야 한다. 활성화된 CRM은 접합 전 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 항원-CRM 접합체는 티올-말단 탄수화물 항원과 브로모아세트아미드-활성화된 CRM의 반응에 의해 합성될 수 있다.

CRM 접합체는 크기별 배제 크로마토그래피를 통해 정제되어 임의의 미반응된 탄수화물을 제거 및 회수할 수 있다. MBTH(GlcNAc 잔기에 특이적임) 및 Bradford 어세이는 앞서 기술된 바와 같이 탄수화물:단백질 비율 및 단백질 함량을 각각 측정하는 데 사용될 수 있다(Manzi et al., Curr. Prot. Mol. Biol., section 17.9.1 (Suppl. 32), 1995). 바람직한 구체예에서, 각 접합체에 대해 약 10 중량%의 최소의 탄수화물 함량이 생성될 수 있다. 통상, 접합체는 단백질 담체 당 약 3∼20개의 항원을 포함할 수 있다.

또다른 구체예에서, 탄수화물 항원은 ELISA 및 마이크로어레이를 비롯한 진단 어세이의 개발에 적당한 하나 이상의 담체에 접합될 수 있다. 그러한 어세이에 사용하는 예시적 담체는 소 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 비오틴, 라벨, 유리 슬라이드 또는 금 표면을 포함한다. 예로서, 합성 탄수화물 항원은 티올-말레이미드 연결 절차에 의해 BSA에 접합될 수 있다(도 5b). 말레이미드-BSA는 단백질 당 15∼20개의 말레이미드 기를 함유한다(n=15∼20). 따라서, 올리고당류 항원은 말레이미드 작용기화된 BSA에 접합될 수 있고, 이에 의해 20배 몰의 과량의 항원이 구입 가능한 말레이미드 접합 버퍼(Pierce) 중 Imjectmaleimide BSA(Pierce)와 반응한다. 접합은 접합 동안 말레이미드 기의 가수분해를 피하기 위해 pH=7.2에서 수행될 수 있다.

BSA 접합체는 크기별 배제 크로마토그래피를 통해 정제되어 임의의 미반응된 탄수화물을 제거 및 회수할 수 있다. 페놀-황산 및 Bradford 어세이를 통한 특성화는 MALDI-MS와 함께 수행되어 탄수화물 함량 및 접합체의 원자가에 대한 정보를 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 접합체는 BSA 접합체 당 약 10 중량%의 최소 탄수화물 함량 및 접합체 당 8개 초과의 항원 카피를 함유한다.

LOS-올리고당류 구조의 합성 방법

추가 측면에서, 본 발명은 단당류 및 이당류 구성 요소로부터 상기 기술된 것을 포함하여 피. 에루기노사로부터 균질한 합성 LOS-올리고당류 구조를 조립하는 방법을 제공한다.

반응식 I에는 피. 에루기노사백신 외부 코어 레트로합성이 제시된다.

반응식 I:

외부 코어는 반응식 I에서 레트로합성 후 WO2012/082635에 기술된 절차에 따라 제조될 수 있다.

α-글루코실 공여체는 하기 반응식을 사용하여 제조될 수 있다:

피. 에루기노사 백신 외부 코어 합성을 제조하기에 적당한 갈락토사민 링커 단위는 다음과 같이 제조될 수 있다:

헥실(벤질)카르바메이트 화합물은 Whitfield D. M. 등(Collet. Czech. Chem. Commun. 58:159-17291993)에 의해 기술된 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 6-O 및 4-O 위치는 문헌[Bedini E. et al. Carbohydrate Res. 349:24-32 (2012)]에 따라 벤질리딘으로 보호될 수 있다.

피. 에루기노사 백신 외부 코어를 제조하기에 적당한 분지화된 글루코스 이당류 단위는 다음과 같이 제조될 수 있다:

피. 에루기노사 백신 외부 코어를 제조하기에 적당한 코어 사당류 조립체는 다음과 같이 제조될 수 있다:

이당류에 의한 GaIN₃-3,4-디올의 선택적 연결은 Osswald 등(Z. Naturforsch. 58b:764-774 (2003)) 및 Komarova B. S. 등(Tetrahed. Lett. 47:3583-78 (2006))에 의해 개시된 하기 절차에 의해 실현될 수 있다. 두 문헌에는 4-위치에 대한 3-위치에 따른 반응의 선택성이 제시된다. Komarova는 또한 생성된 삼량체의 4-위치와 OTFI 활성화된 단당류를 연결하여 사량체를 제공하는 방법을 기술한다.

상기 기술된 LOS-올리고당류 및 이의 접합체, 및 표 1에 기술된 나머지의 합성을 위한 조성물 및 방법은 하기 실시예 1 내지 9에 기술된다. LOS-올리고당류의 합성에 사용되는 보호 기는 당류 화학, 예컨대 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts (Ed.), John Wiley and Sons, New York, 1999]에 언급된 것에서 통상적으로 고려되는 것을 포함할 수 있다.

면역원성 및 면역보호 조성물, 및 이의 사용 방법

또다른 측면에서, 본 발명은 LOS 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 LOS 올리고당류 또는 LOS 올리고당류-단백질 담체 접합체를 함유하는 면역원성 및 면역보호 조성물을 제공한다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 보강제, 및 동물 또는 개체에게 투여하기에 적당한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함할 수 있다. 면역원성 또는 면역보호 조성물은 "충분한 양" 또는 "면역학적 유효량"의 본 발명에 따른 올리고당류-단백질 담체 접합체, 및 추가로 본원에 정의된 바와 같이 면역 반응을 생성하거나 방어 면역을 제공하기 위해 상기 언급된 임의의 성분을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명은 피. 에루기노사에 대하여 면역 반응을 유도하기에 적당한 하나 이상의 LOS 올리고당류(들) 1a 또는 LOS 올리고당류-단백질 담체 접합체(들) 1b를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 피. 에루기노사 감염에 대한 보호용 백신으로서 조제된 LOS 올리고당류(들) 1a 또는 LOS 올리고당류-단백질 담체 접합체 1b를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 피. 에루기노사 혈청형에 대한 보호용 백신으로서 조제된 올리고당류-단백질 담체 접합체 1b를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

추가 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 피. 에루기노사 혈청형에 대한 수동 면역 또는 치료를 제공하는 방법에 사용하기 위한 항체 및 생리학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 LOS-올리고당류 접합체 1b 조성물에 대한 항체 제제를 제공한다. 항체 제제는 다클론 항체, 단일클론 항체, 마우스 단일클론 IgG 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이의 단편, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터의 임의의 구성원을 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 본원에 기술된 임의의 LOS-올리고당류에 대해 유도되는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 고려한다.

올리고당류 또는 올리고당류-단백질 담체 접합체 또는 이에 대한 항체의 투여는 비경구 투여(예, 정맥내, 피하, 피내, 또는 근육내); 예컨대 기도 표면에의 항체의 국소 투여; 경구 투여; 예를 들어 조류에서 오보(ovo) 내 주입 등을 비롯한 임의의 적당한 수단에 의해 수행될 수 있다.

특정 구체예에서, 각 면역원성 또는 면역보호 조성물은 실질적으로 수성 혼합물을 형성하는 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제 중의 화학식 1a 또는 1b에 따른 1종 이상의 올리고당류(들) 또는 이의 접합체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 면역원성 또는 면역보호 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제(들), 동물 또는 개체에 투여하기에 적당한 비히클 및/또는 단백질 담체와 함께 1종 이상의 올리고당류-단백질 담체 접합체(들)를 포함한다.

보강제

올리고당류-단백질 담체 접합체 조성물은 하나 이상의 면역 보강제(들)를 추가로 포함할 수 있다. 면역 보강제는, 항원과 조합되었을 때, 항원 단독에 의해 유도되는 반응과 비교하여 항원에 대한 면역 반응이 증가하여 유사 반응을 실현하는 데 더 적은 항원을 사용할 수 있는 화합물이다. 예를 들면, 보강제는 체액성 면역 반응, 세포 유도 면역 반응, 또는 둘다를 증대시킬 수 있다.

당업자라면 용어 "보강제" 및 "담체"가 유의적 범위로 중첩될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, "보강제"로서 작용하는 물질이 또한 "담체"일 수 있고, 예를 들어 "담체"로서 통상 여겨지는 특정한 다른 물질이 또한 "보강제"로서 작용할 수 있다. 따라서, 합성 올리고당류 또는 이와 연관된 담체의 면역원성을 증가시킬 수 있는 물질은 잠재적 보강제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 담체는 일반적으로 본 발명의 올리고당류에 대한 더 많은 지정된 부위 특이적 접합의 맥락에서 사용되며 이에 비해 보강제는 일반적으로 덜 특이적이거나 또는 더 많이 일반화된 구조 관련하여 사용된다.

예시적 보강제 및/또는 보강제 조합은, 알루미늄 염을 비롯한 무기염, 예컨대 인산알루미늄 및 수산화알루미늄(백반)(예, Alhydrogel™, Superfos, Denmark) 및 인산칼슘; 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀션 중 박테리아로부터 추출된 3개의 성분, 즉 모노포스포릴 지질 A, 트레할로세디미콜레이트, 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI(이에 의해, 임의의 3개의 성분 MPL, TDM 또는 CWS가 또한 단독으로 또는 2 x 2의 조합으로 사용될 수 있음); 예컨대 TLR-1의 작용제(예, 트리-아실 리포펩티드); TLR-2의 작용제[예, 그람 양성 박테리아, 예컨대 스트렙토코쿠스(streptococcus) 및 스타필로코쿠스(staphylococcus)의 펩티도글리칸; 리포테이코산]; TLR-3의 작용제(예, 이중 가닥 RNA 및 이의 유사체, 예컨대 폴리 1:C); TLR-4의 작용제(예, 그람 음성 박테리아, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 및 이. 콜라이의 지질다당류(내독소)); TLR-5의 작용제(예, 운동성 박테리아, 예컨대 리스테리아의 플라젤린); TLR-6의 작용제(예, TLR-2 펩티도글리칸 및 특정 지질(디아실리포펩티드)과 함께); TLR-7의 작용제(예, 인플루엔자, 홍역, 및 볼거리로서의 바이러스의 단일 가닥 RNA(ssRNA) 게놈; 및 소형 합성 구아노신계 항바이러스 분자 유사 록소리빈 및 ssRNA 및 이의 유사체); TLR-8의 작용제(예, ssRNA와 결합됨); TLR-9의 작용제(예, 병원체 및 이의 유사체의 DNA의 비메틸화된 CpG); TLR-10의 작용제(기능이 규정되지 않음) 및 TLR-11의 작용제(예, 여러가지 감염성 원생동물(Apicomplexa)에 의해 발현되는 단백질과 결합됨)를 포함하는 톨 유사 수용체(TLR; toll-like receptor) 작용제(특이적 톨 유사 수용체 작용제는 모노포스포릴 지질 A(MPL^®), 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3 D-MPL), OM-174(이. 콜라이 지질 A 유도체); OM 트리아실 지질 A 유도체, 및 MPL^®-SE, RC-529(Dynavax Technologies)를 비롯한 다른 MPL- 또는 지질 A계 조제물 및 이의 조합을 포함함), AS01(리포솜+MPL+QS21), AS02(수중유 PL + QS-21), 및 AS04(Alum + MPL)(GlaxoSmith Kline, Pa.), 면역 자극성 CpG 모티브, 이중 가닥 RNA, 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리 I:C), 및 경우에 따라 리포솜에 캡슐화된 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CpG-올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); AS03을 포함한 수중유 에멀션(GlaxoSmith Kline, Pa.), MF-59(미세유동화된 세정제 안정화된 스쿠알렌 수중유 에멀션; Novartis), 및 몬타나이드(Montanide) ISA-51 VG(안정화된 유중수 에멀션) 및 몬타나이드 ISA-720(안정화된 물/스쿠알렌; Seppic Pharmaceuticals, Fairfield, NJ); 콜레라 독소 B 서브단위; 사포닌, 예컨대 Quil A 또는 QS21, QuillajaSaponaria Molina의 껍질로부터 유도된 HPLC 정제된 비독성 단편(STIMULON™)(Antigenics, Inc., Lexington, Mass.) 및 면역 자극 복합체(ISCOM; 사포닌 및 지질의 구조화된 복합체)를 비롯한 사포닌계 보강제 및 다른 ISCOM계 보강제, 예컨대 ISCOMATRIX™ 및 AbISCO^®-100 및 -300 시리즈 보강제(Isconova AB, Uppsala, Sweden); 미국 특허 출원 번호 2006/0073171에 개시된 수중유 에멀션과의 QS21 및 3 D-MPL; 스테아릴 티로신(ST) 및 이의 아미드 유사체; 바이러스 유사 입자(VLP) 및 재구성된 인플루엔자 바이로좀(IRIV); 완전 Freund 보강제(CFA); 불완전 Freund 보강제(IFA); 이. 콜라이 이열성 엔테로톡신(LT); 사이토카인을 포함한 면역-보강제, 예컨대 IL-2, IL-12, GM-CSF, Flt3, 액세사리 분자, 예컨대 B7.1, 및 비만 세포(MC) 활성인자, 예컨대 비만 세포 활성인자 화합물 48/80 (C48/80); 수불용성 무기 염; DNPC/Chol 및 DC Chol로부터 만들어진 것을 포함하는 리포솜; 미셀; 스쿠알렌; 스쿠알란; 무라밀 디펩티드, 예컨대 미국 특허 번호 4,606,918에서 찾아볼 수 있는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'2'-디팔미토일-n-글리세로-3-히드록시포스포릴; SAF-1(Syntex); AS05(GlaxoSmith Kline, Pa.); 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 보강제 효능은, 생체내 항원 특이적 면역 반응을 향상시키도록 상승적으로 작용하는 잠재성을 갖는 다성분 보강제를 형성하기 위해 각종 전달 시스템과 면역증식 물질(immunopotentiating substance)을 배합하는 것을 포함하여 상기 기술된 복수의 보강제를 배합함으로써 향상될 수 있다. 예시적 면역증식 물질은, 예컨대 MPL 및 합성 유도체, MDP 및 유도체, 올리고뉴클레오티드(CpGetc), ds RNA, 대체 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)(이. 콜라이 이열성 엔테로톡신; 플라젤린, 사포닌(QS-21 등), 소분자 면역 증식인자(SMIP, 예컨대 레시퀴모드[R848]), 사이토카인, 및 케모카인을 포함하는 상기 기술된 보강제를 포함한다.

약학적으로 허용가능한 전달 비히클

상기 기술된 것을 포함한 약학적으로 허용가능한 전달 비히클은 전달을 향상시키고/시키거나 작용 기간을 제어하는 데 사용될 수 있다. 제어 방출 제제는 올리고당류, 올리고당류 접합체, 및/또는 보강제를 복합체화하거나 또는 흡수하는 중합체의 사용을 통해 실현될 수 있다. 제어된 전달은 적절한 거대분자(예, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 또는 프로타민 설페이트) 및 거대분자의 농도, 및 방출을 제어하기 위한 혼입 방법을 선택함으로써 실시될 수 있다. 제어된 방출 제제에 의한 작용 기간을 제어하는 또다른 가능한 방법은 본 발명의 화합물을, 중합체 재료, 예컨대 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체의 입자 내에 혼입시키는 것이다. 대안적으로, 상기 물질들을 중합체 입자 내에 혼입시키는 대신에, 상기 재료를, 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 계면 중합, 예컨대, 각각 히드로시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트)-마이크로캡슐에, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템, 예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐에 또는 마크로에멀션에 포획시킬 수 있다. 이러한 기법은 상기 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어 있다.

올리고당류-단백질 담체 접합체 조성물을 포함한 본 발명의 올리고당류 조성물은, 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 조제될 수 있고, 이에 의해 상기 재료, 또는 이의 작용성 유도체가 약학적으로 허용가능한 비히클 (또는 희석제)과 혼합하여 배합된다. 다른 인간 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민을 포함한 적당한 비히클 및 이의 조제물은, 예를 들어 상기 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술된다. 효과적인 투여에 적당한 약학적으로 허용가능한 조성물을 형성하기 위해, 이러한 조성물은 적당한 양의 단백질 담체 및/또는 비히클과 함께 유효량의 상기 기술된 화합물을 함유한다.

통상, 면역원성 또는 면역보호 조성물은 액체 용액 또는 현탁액; 주사 전, 액체 비히클 중 용액 또는 액체 비히클 중 현탁액에 적당한 고체 형태로서 주사가능하게 제조될 수 있다. 비경구 투여용 수성 조성물은, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제, 바람직하게는 주로 수성 비히클 중에 용해 또는 현탁된 면역원성 성분(들)의 용액을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제는 물, 인산염으로 완충된 중성 식염수 용액, 트리스, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한 식염수를 포함할 수 있다. 수성 조성물은 방부제를 포함할 수 있거나 방부제 불포함일 수 있는, 멸균 병원체 불포함 완충 식염수 또는 인산염 함유 용액으로서 조제될 수 있다. 적당한 방부제는 벤질 알콜, 파라벤, 티메로잘, 클로로부탄올, 및 벤잘코늄 클로라이드 등을 포함한다. 수용액은 바람직하게는 대략 등장성이고, 이의 장력은 제제, 예컨대 타르타르산나트륨, 염화나트륨, 프로필렌 글리콜, 및 인산나트륨에 의해 조절될 수 있다. 추가적으로, pH 조절 및 완충 물질, 장력 조절 물질, 습윤 또는 유화 물질, pH 완충 물질 등을 비롯한 생리학적 조건을 맞추는 데 필요한 보조제 물질, 예컨대 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄모노라우레이트, 트리에탄올아민올레에이트 등은 본원에 기술된 비히클에 포함될 수 있다.

이러한 조성물은 통상의 멸관 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 포장되거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전 멸균 용액과 배합되게 된다. 그러한 약학 조성물의 제조는 당업계의 일반적인 기술에 속하며, 예컨대 본원에 참고 인용되는 상기 표준 기준 서적 [Remington's Pharmaceutical Science]에 의해 안내될 수 있다.

조성물은 경구 전달을 위한 고체 또는 액체 형태로 조제될 수 있다. 고체 조성물의 경우, 비독성 및/또는 약학적으로 허용가능한 고체 단백질 담체는, 예를 들면 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 약학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 앞서 나열된 단백질 담체를 비롯한 임의의 통상 사용되는 부형제, 및 단백질 담체에 접합되는지 여부에 상관없이 유효 성분의 단위 용량, 즉 하나 이상의 본 발명의 화합물을 혼입시킴으로써 형성될 수 있다.

기도 표면에 대한 항체의 국소 적용은, 예를 들면, 비내 투여에 의해 (예, 비내에 약학 조제물을 침착시키는, 드로퍼, 스왑, 또는 흡입기의 사용에 의해) 수행될 수 있다. 기도 표면에 대한 항체의 국소 적용은 또한 흡입 투여에 의해, 예컨대 에어로졸 현탁액으로서 항체를 함유하는 약학 조제물(고체 입자 및 액체 입자를 모두 포함함)의 호흡가능한 입자를 생성하고, 이후 피험자가 호흡가능한 입자를 흡입하도록 함으로써 수행될 수 있다. 약학 조제물의 호흡가능한 입자를 투여하는 방법 및 장치는 잘 공지되어 있으며, 임의의 통상적인 기법이 사용될 수 있다. 경구 투여는 섭취가능한 액체 또는 고체 조제물의 형태일 수 있다.

추가로, 조성물은 비측 투여용 에어로졸로 조제될 수 있다. 에어로졸 투여의 경우, 면역원성 화합물은 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제(들) 및/또는 추진제(들)와 함께 미분된 형태로 공급된다. 계면활성제는 비독성이며, 바람직하게는 추진제에 가용성이다. 대표적인 상기 제제는 6∼22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산, 예컨대 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과, 지방족 다가 알콜 또는 이의 활형 무수물의 에스테르 또는 부분 에스테르이다. 혼합 에스테르, 예컨대 혼합 또는 천연 글리세리드가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1 중량%∼20 중량%, 바람직하게는 0.25∼5 중량%로 구성될 수 있다. 조성물의 나머지는 보통 추진제가 된다. 단백질 담체는 또한 필요에 따라 예를 들어 비내 전달을 위해 레시틴과 포함될 수 있다.

약학 조제물 내 본 발명의 면역원성 올리고당류의 농도는, 즉 약 0.1 중량% 미만, 통상 약 0.1 중량% 또는 그 이상 내지 20 중량%∼50 중량% 이상 정도로 광범위하게 다양할 수 있고, 유체 부피, 점도 등에 의해, 그리고 선택되는 특정한 투여 방식에 따라 주로 선택된다. 화합물 및 조성물의 인간 단위 용량 형태는 통상 허용가능한 단백질 담체, 바람직하게는 수성 단백질 담체의 인간 단위 용량을 포함하는 약학 조성물에 포함되고, 당업자에 의해 공지된 액체 부피로 투여되어 상기 조성물을 인간에게 투여하는 데 사용되고, 치료하고자 하는 특정 피험자에 대해 공통적으로 이해되는 원리에 따라 조절된다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 수용액의 적당한 양, 예컨대 0.1∼3 ㎖, 바람직하게는 0.2∼2 ㎖로 본 발명의 백신 성분의 단위 용량을 제공한다.

치료 방법

본 발명의 면역원성 및 면역보호 조성물은 피. 에루기노사에 의한 감염을 발병시키는 위험에 있는 임의의 동물 종에게 투여될 수 있다.

1회 용량 스케줄, 또는 바람직하게는 다회 용량 스케줄로 치료가 실시될 수 있고, 이때 주요 치료 과정은, 1∼10회 별도 용량 후, 반응을 유지하고/하거나 보강하는 데 필요한 후속 시간 간격으로, 예컨대 2회 용량 동안 1∼4개월로 제시되는 다른 용량, 그리고 필요에 따라, 몇 개월 후 후속 용량(들)에 의한 것일 수 있다. 적당한 치료 스케줄의 예는 (i) 0개월, 1개월 및 6개월, (ii) 0일, 7일 및 1개월, (iii) 0개월 및 1개월, (iv) 0개월 및 6개월, 또는 병증을 감소시키거나, 또는 질병의 중증도를 감소시키는 것으로 기대되는 원하는 반응을 이끌어내기에 충분한 다른 스케줄을 포함한다.

면역 반응을 유도하거나 방어 면역을 제공하기에 효과적인 양은 올리고당류 조성물, 단백질 담체에의 접합, 보강제(들)의 포함 및 성질, 투여 방식, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태, 및 처방 의사의 판단을 비롯한 각종 요인들에 따라 달라진다. 예로서, 그 양은 일반적으로 70 kg 환자의 경우 (예방적 투여를 위한) 초기 면역에 대해 탄수화물 항원 약 1.0 ㎍∼약 5,000 ㎍의 범위일 수 있다(예, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 2.5 ㎍, 3.0 ㎍, 3.5 ㎍, 4.0 ㎍, 4.5 ㎍, 5.0 ㎍, 7.5 ㎍, 10 ㎍, 12.5 ㎍, 15 ㎍, 17.5 ㎍, 20 ㎍, 25 ㎍, 30 ㎍, 35 ㎍, 40 ㎍, 45 ㎍, 50 ㎍, 75 ㎍, 100 ㎍, 250 ㎍, 500 ㎍, 750 ㎍, 1,000 ㎍, 1,500 ㎍, 2,000 ㎍, 2,500 ㎍, 3,000 ㎍, 3,500 ㎍, 4,000 ㎍, 4,500 ㎍ 또는 5,000 ㎍). 피험자에게 투여되는 실제 용량은 종종 피험자의 체중 1 kg 당 적당량에 따라 측정된다. 예를 들면, 유효량은 체중 1 kg 당 약 0.1 ㎍∼5 ㎍일 수 있다.

1차 용량은 경우에 따라 환자 혈액 내 특이적 T 세포 활성을 측정함으로써 환자의 반응 및 병태에 따라 몇주에서 몇개월에 걸친 증가 처방에 따라 탄수화물 항원 약 1.0∼약 1,000의 투여량을 증대시키는 것으로 이어질 수 있다(예, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 2.5 ㎍, 3.0 ㎍, 3.5 ㎍, 4.0 ㎍, 4.5 ㎍, 5.0 ㎍, 7.5 ㎍, 10 ㎍, 12.5 ㎍, 15 ㎍, 17.5 ㎍, 20 ㎍, 25 ㎍, 30 ㎍, 35 ㎍, 40 ㎍, 45 ㎍, 50 ㎍, 75 ㎍, 100 ㎍, 250 ㎍, 500 ㎍, 750 ㎍, 1,000 ㎍, 1,500 ㎍, 2,000 ㎍, 2,500 ㎍, 3,000 ㎍, 3,500 ㎍, 4,000 ㎍, 4,500 ㎍ 또는 5,000 ㎍).

본 발명은 본원에 기술된 임의의 합성 올리고당류를 포함하는 1가 및 다가 당접합체 백신의 용도를 고려한다. 교차 반응 면역 반응을 이끌어내는 단일 올리고당류 항원의 확인은 든 일반 피. 에루기노사 박테리아 혈청형 및/또는 균주에 대해 활성인 단일-항원 백신 후보자의 발달을 용이하게 할 수 있다.

본 발명은 피. 에루기노사의 단일 혈청형 또는 혈청형 서브유형에 대해 또는 피. 에루기노사의 복수의 혈청형 또는 혈청형 서브유형에 대해 보호를 제공하도록 본원에 기술된 복수의 임의의 합성 올리고당류를 포함하는 다중-항원 당접합체 백신을 추가로 고려한다. 따라서, 일 구체예에서, 예를 들면, 본 발명은 화학식 1b에 따른 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 올리고당류 항원을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 면역원성 조성물은 LOS 발현 박테리아 종에 의해 야기되는 감염을 축소시키기 위해 위험에 있는 유아 또는 나머지를 포함한 성인 인간 또는 어린이에서 사용하기에 적당할 수 있다. 경우에 따라, 그러한 조성물은 다른 약학 활성 물질과 함께 투여될 수 있고, 빈번하게 유아기 예방접종 프로그램의 일부로서 다른 백신과 함께 투여된다.

투여를 위한 조성물은 피. 에루기노사의 단일 균주 또는 혈청형에 대해 또는 피. 에루기노사의 복수의 균주 또는 혈청형에 대해 증가된 보호를 제공하도록 복수의 상이한 에피토프에 대해 면역 반응을 이끌어내는 다중 올리고당류- 또는 올리고당류 접합체를 유리하게 포함할 수 있다. 더하여, 조성물을 투여함으로써 1개 또는 복수개의 항원 접합체에 의해 주요 면역 후 본 발명에 따른 하나 이상의 교차 반응성 코어 접합체에 의한 이벤트를 촉진시킬 수 있다.

항체 조성물

또다른 구체예에서, 본 발명은 진단 항체, 및 하나 이상의 항-LOS 항체(들) 또는 이의 작용성 단편(들), 및 생리학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 항체의 제조 방법은 하기 추가로 기술된다.

약학적 항체 조성물은 피. 에루기노사 감염에 대한 수동 면역을 제공하는 방법에 사용될 수 있다. 약학적 항체 조성물은 동물 피험자, 바람직하게는 인간에게, 피. 에루기노사의 하나 이상의 균주 또는 혈청형에 의한 감염의 중증도, 기간 정도를 예방하거나 약화시키기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.

하나 이상의 항체의 투여는 예방적 (박테리아 감염에의 예상된 노출 이전) 또는 치료적(감염 개시 후, 증상 시작시 또는 시작 직후)일 수 있다. 하나 이상의 항체의 투여량은 피험자의 연령, 체중 및 종으로서의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 항체 투여량은 체중 1 kg 당 약 1∼10 mg의 범위 내에 있을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 IgG 또는 IgA 부류의 인간화된 항체이다. 하나 이상의 항체의 투여 경로는 경구적 또는 전신적, 예컨대 피하, 근육내 또는 정맥내일 수 있다.

진단 제제로서의 항체의 사용은 하기에 그리고 미국 특허 번호 7,595,307 및 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0155299에 추가로 기술되고, 이의 개시 내용은 본원에 참고 인용된다.

본 발명은 또한 피. 에루기노사 감염을 진단, 치료 및/또는 예방하기에 유용한 하나 이상의 키트를 제공한다. 예를 들면, 키트는 본 발명의 진단 또는 약학 조성물을 수용하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 특정 진단 또는 약학적 사용에 필요하거나 편리한, 예를 들어 하나 이상의 용액을 함유하는 다른 용기(들)를 포함할 수 있다. 용기 수단은 유리, 플라스틱 또는 호일로 제조될 수 있고 바이알, 병, 파우치, 튜브, 백(bag) 등일 수 있다. 키트는 또한 기재 정보, 예컨대 본 발명을 수행하기 위한 절차 또는 분석 정보, 예컨대 용기(들)에 함유된 시약의 양을 함유할 수 있다.

어세이 개발에서의 항체 생성 및 이의 용도

추가 측면에서, 본 발명은, 검출 물질 및 혈청 스크리닝 도구로서의 이의 사용을 포함한, 어세이 개발에서 사용하기 위한 항체의 생성을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

뉴질랜드 화이트 토끼에서 13주에 걸쳐 3∼4회의 피하 주사에 의해 LOS-접합체에 대한 항혈청을 생성할 수 있다. 면역전 출혈이 각 토끼로부터 약 5 ㎖의 기선 혈청을 생성할 수 있다. 완전 Freund 보강제(CFA) 중 에멀션으로서 주요 주사(10 ㎍ 항원 등가물)를 투여할 수 있다. 3주 간격으로 불완전 Freund 보강제(IFA) 중 후속 주사(5 ㎍ 항원 등가물)를 실시할 수 있다. 제3 면역 후 1주를 개시하는 매 2주마다 토끼를 출혈시킬 수 있다. 각 출혈 사건으로 토끼 당 대략 25∼30 ㎖의 혈청을 발생시키고 -80℃에서 동결시킬 수 있다. 하기 기술되는 바와 같이 상응한 LOS-접합체에 대해 ELISA로 혈청을 분석할 수 있다. 추가적으로, 출혈후 항혈청은 하기 추가로 기술되는 바와 같이 친화성 정제될 수 있다.

본 발명의 올리고당류 및 항체는 생물학적 샘플에 존재하는 피. 에루기노사 LOS 항원 또는 이에 대한 항체를 검출하는 진단 시약으로서 사용될 수 있다. 검출 시약은 ELISA- 및 마이크로어레이-관련 기술을 비롯한 당업자에게 공지된 각종 면역진단 기법에 사용될 수 있다. 추가적으로, 이러한 시약은 면역원성 올리고당류 접합체에 대한 혈청 항체 수준을 포함한 항체 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 어세이 방법은 통상 생물학적 샘플 내 항원 또는 항체와 고체 지지체에 결합된 상응한 항체 또는 항원 사이의 복합체의 직접 또는 간접 검출을 위한 표지, 예컨대 형광성, 화학발광성, 방사성, 효소 표지 또는 염료 분자, 및/또는 2차 면역 시약의 사용을 포함한다.

그러한 어세이는 통상 항체-항원 복합체가 결합된 고체 상 지지체로부터 액체 상의 비결합된 항체를 분리시키는 것을 포함한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 고체 지지체는 기재, 예컨대 니트로셀룰로스(예, 막 또는 마이크로역가 웰 형태); 폴리비닐클로라이드(예, 시트 또는 마이크로역가 웰); 폴리스티렌 라텍스(예, 비드 또는 마이크로역가판); 폴리비닐리딘 플루오라이드; 디아조화된 종이; 나일론 막; 활성화된 비드, 자기 반응성 비드 등을 포함한다.

통상, 우선 제1 결합 성분이 지지체에 충분히 고정되도록 적당한 결합 조건 하에서 고체 지지체를 제1 결합 성분(예, 본 발명에 따른 항원 또는 항체)과 반응시킨다. 일부 경우에, 지지체에 대한 운동성은, 항체 또는 올리고당류를 결합 특성이 더 우수한 단백질에 우선 연결시킴으로써 향상시킬 수 있거나, 또는 항체 결합 활성 또는 특이성의 유의적 손실 없이 지지체 상에 항체 또는 항원의 부동화를 제공한다. 적당한 연결 단백질은, 비제한적으로, 거대분자, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA)을 비롯한 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 및 당업자에게 잘 공지된 다른 단백질을 포함한다. 항체를 지지체에 결합시키는 데 사용될 수 있는 다른 분자는 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 등을 포함한다. 이러한 분자 및 상기 분자를 연결하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 번호 7,595,307 및 미국 특허 출원 번호 US 2009/0155299에 기술된다.

당업자라면 본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시 목적이며 이러한 관점에서 각종 변형 또는 변화를 당업자에게 제안하며 본 출원의 취지 및 이해범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함시킨다는 것을 이해할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개, 특허, 및 특허 출원은 이에 의해 모든 경우에 그 전문이 참고 인용 된다.

실험 상세:

하기 반응식은 상기 기술된 피. 에루기노사 LOS 항원의 조립체에 유용한 주요 구성 요소의 제조를 위한 실험적 프로토콜을 상세히 기술한다. 각각의 반응식 1∼5에서, 실선 화살표는 수행된 화학을 나타내고 점선 화살표는 예측되는 화학을 나타낸다.

반응식 1. 글루코사민 구성 요소 F의 합성

중간체 E의 합성:

문헌[Emmadi, M., Kulkarni, S.S. J. Org. Chem. 2011, 76, 4703]에 따라 제조된, 무수물 DMF(100 ㎖) 중 공지된 트리올 D(40 mmol)의 용액에 벤즈알데히드 디메틸아세탈(7.22 ㎖, 48 mmol) 및 캄포르 설폰산(2 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 진공 하에 50℃로 가온하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 트리에틸아민(6 ㎖)으로 켄칭하고 진공 농축시켰다. 미정제 생성물 E를 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

중간체 F의 합성:

미정제 중간체 E(약 40 mmol)를 피리딘(80 ㎖) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 아세트산 무수물(40 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 진한 슬러리로 농축시켰다. EtOAc(200 ㎖)를 첨가하고 현탁액을 물(200 ㎖)로 분배하였다. 유기물을 수집하고, NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 미정제 생성물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc, 헵탄 용출액)를 통한 정제로 중간체 F(11 g)를 얻었다.

반응식 2. 글루코스 이당류 구성 요소 J의 합성

중간체 N의 합성:

공지된 화합물 M(Peri, F. et al J. Carbohydr. Chem. 2003, 22, 57)(275 mmol)을 DMF(3 x 100 ㎖)으로 동시 증발시키고 CH₂Cl₂(100 ㎖) 중에 용해시켰다. 2-메톡시프로펜(52 ㎖, 550 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 0℃로 냉각시켰다. p-톨루엔설폰산(120 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 12시간에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하였다. 생성된 혼합물을 Na₂CO₃(20 g)으로 중성화하고 추가 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 셀라이트에 여과시키고, EtOAc로 씻어내고 물 및 염수로 세척하였다. 미정제 생성물을 피리딘(200 ㎖) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각하고 벤조일 클로라이드(80 ㎖)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각 후, 메탄올(40 ㎖)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 점성 백색 고체로 농축시켰다. 현탁액을 EtOAc(500 ㎖) 중에 용해시키고 물 및 염수로 세척하였다. 미정제 생성물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 생성물 N을 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

중간체 O의 합성:

중간체 N(약 275 mmol)을 HOAc:H₂O(500 ㎖, 4:1 v:v) 중에 현탁시키고 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진한 시럽으로 진공 농축시켰다. 현탁액을 톨루엔(3x100 ㎖)으로 동시 증발시키고 실리카겔 상에서 정제하였다. 중간체 O(49.8 g)를 단리시켰다.

중간체 P의 합성:

중간체 O(116 mmol)를 피리딘(3 x 100 ㎖)으로 동시 증발시키고 피리딘(300 ㎖) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 30분 동안 0℃로 냉각시켰다. TBSCl(139 mmol, 100 ㎖ CH₂Cl₂ 중 용해됨)을 적가하고 반응 혼합물을 12시간에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 0℃로 냉각시켰다. 벤조일 클로라이드(162 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 18시간에 걸쳐 실온으로 가온하였다. 메탄올(40 ㎖)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 점성 백색 고체로 농축시켰다. 현탁액을 EtOAc(500 ㎖) 중에 용해시키고 1 M HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 혼합물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 생성물 P를 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

중간체 Q의 합성:

중간체 P(약 116 mmol)를 CH₂Cl₂(200 ㎖) 중에 현탁시키고 TFA:H₂O(22 ㎖, 10:1 v:v)를 처리하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진한 시럽으로 진공 농축시켰다. 현탁액을 톨루엔(3x100 ㎖)으로 동시 증발시키고 실리카겔 상에서 정제하였다. 중간체 Q(82 mmol)를 α- 및 β-이성질체의 혼합물로서 단리시켰다.

이당류 S의 합성:

공지된 글리코실 트리클로로아세트이미데이트 R(21.7 mmol) 및 글리코실 수용체 Q(26.3 mmol)를 배합하고, 톨루엔(3 x 20 ㎖)으로 동시 증발시키고 1시간 동안 진공 건조하였다. 생성된 혼합물을 건조 CH₂Cl₂(150 ㎖) 및 건조 디에틸 에테르(100 ㎖) 중에 용해시키고, 질소 하에 퍼징하고 -20℃로 냉각시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, CH₂Cl₂ 중 1.0 M, 2.19 ㎖, 2.19 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하고 반응물을 -10℃에서 추가 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 트리에틸아민(2 ㎖)으로 켄칭하고, CH₂Cl₂(50 ㎖)로 희석하고 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 정제 via 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헵탄)를 통해 정제하여 원하는 연결 생성물 S(16.4 g)를 얻었다.

중간체 T의 합성:

이당류 S(11 g)를 THF:MeOH(200 ㎖, 총, 10:1 v:v) 중에 현탁시키고 0℃로 냉각시켰다. 암모니아를 15분 동안 반응 혼합물에 버블링하였다. 반응 혼합물을 캡핑하고 12시간에 걸쳐 교반 하에 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고 진한 시럽으로 진공 농축시켰다. 중간체 T를 α- 및 β-이성질체의 혼합물로서 단리하고 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

중간체 J의 합성:

CH₂Cl₂(20 ㎖) 중 출발 당류 T(7 mmol)의 용액을 트리클로로아세토니트릴(5 ㎖)로 처리하였다. 반응 혼합물에 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU, 0.1 ㎖, 0.6 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 점성 오일로 농축시켰다. 0.1% TEA 함유 EtOAc로 선처리된 실리카겔 플러그를 통한 여과를 통해 정제하여 원하는 트리클로로아세트이미데이트 생성물 J(6.2 mmol)를 얻었다.

반응식 3. 주요 삼당류 코어 단위 K의 합성

중간체 H의 합성:

티오글리코시드 F(14.0 mmol) 및 글리코실 수용체 G(20.4 mmol)를 배합하고, 톨루엔(3 x 20 ㎖)으로 동시 증발시키고 1시간 동안 진공 건조하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 건조 CH₂Cl₂(130 ㎖) 중에 용해시키고 반응 혼합물을 -20℃로 냉각시켰다. N-요오도숙신이미드(28 mmol)를 첨가한 후 트리플루오로메탄설폰산(1.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분에 걸쳐 0℃로 가온하고 반응물을 추가 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 트리에틸아민(2 ㎖)으로 켄칭하고, CH₂Cl₂(50 ㎖)로 희석시키고 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헵탄; 50∼100% EtOAc 구배)를 통해 정제하여 원하는 연결 생성물 H(9.2 g)를 얻었다.

중간체 I의 합성:

중간체 H(8.0 mmol)를 CH₂Cl₂(50 ㎖) 중에 용해시켰다. NaOMe(MeOH 중 4 M, 0.1 ㎖, 0.4 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 혼합물을 물 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헵탄; 50∼100% EtOAc 구배)를 통해 정제하여 원하는 생성물 I(4.5 g, 7.25 mmol)를 얻었다.

삼당류 K의 합성:

글리코실 트리클로로아세트이미데이트 J(6.0 mmol) 및 글리코실 수용체 I(7.3 mmol)를 배합하고, 톨루엔(3 x 20 ㎖)으로 동시 증발시키고 1시간 동안 진공 건조하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에서 건조 CH₂Cl₂(40 ㎖) 중에 용해시키고 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 활성된 분자체(AW-300, 5 g)를 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, CH₂Cl₂ 중 0.10 M, 3.0 ㎖, 0.3 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하고 반응물을 추가 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 트리에틸아민(2 ㎖)으로 켄칭하고, CH₂Cl₂(50 ㎖)로 희석시키고 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헵탄; 50∼100% EtOAc 구배)를 통해 정제하여 원하는 연결 생성물 K(8.2 g)를 얻었다.

반응식 4. QuiNAc 구성 요소 CC 합성

하기 프로토콜은 중간체 Y, 즉 표적 구성 요소 CC의 생성에 유용할 수 있는 화합물의 합성을 기술한다.

중간체 Y의 합성:

공지된 화합물 V(Christ, W. et al PCT/US96/09578))(73 mmol)를 THF(3 x 100 ㎖)로 동시 증발시키고 THF(200 ㎖) 중에 용해시켰다. 2,6-루티딘(25 ㎖, 109 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 -78℃로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄설폰산(18.4 ㎖, 109 mmol)을 적가하고 반응 혼합물을 30분 동안 -78℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 THF(200 ㎖)로 희석시키고 염수(500 ㎖)로 세척하였다. 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 중간체 W를 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다. 아세토니트릴(100 ㎖)을 미정제 중간체 W에 첨가하고 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. NaBH₄(9 g 합계, 240 mmol)를 1 g 부분에 첨가하여 각 부분 첨가 전에 느리게 버블링되도록 하였다. 반응 혼합물을 1시간에 걸쳐 실온으로 가온한 후 물(20 ㎖, 적가)로 켄칭하였다. 현탁액을 진공 농축시키고, EtOAc(200 ㎖) 중에 현탁시키고 셀라이트에 여과시켰다. 생성물 X를 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

중간체 Y의 합성:

중간체 X(8 mmol)를 톨루엔(3 x 100 ㎖)으로 동시 증발시키고 NMP:THF(20 ㎖ 합계, 4:1 v:v) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 30분 동안 -0℃로 냉각시키고 질소로 퍼징하였다. NaH(1.05 g, 광유 중 60%, 25 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 -0℃에서 교반하였다. 벤질 브로마이드(2.2 ㎖, 18.4 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 1시간에 걸쳐 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 메탄올(5 ㎖)로 켄칭하고, EtOAc(200 ㎖)로 희석하고 물(2 x 200 ㎖)로 세척하였다. 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헵탄)를 통해 정제하여 생성물 Y(2.3 g)를 얻었다.

반응식 5. FucNAc 구성 요소 LL의 합성

화합물 HH를 문헌[Paulsen, H. et al Liebigs Ann. Chem. 1992, 735]의 방버에 따라 제조할 수 있고 이는 구성 요소 LL의 합성에 사용될 수 있는 주요 중간체이다.

상기 상세한 설명은 한정하려는 것이 아니고 예시로서 간주되며, 하기 청구범위가 모든 등가물을 비롯하여 본 발명의 취지 및 범위를 규정하고 있음을 이해하도록 의도된다.

Claims

합성 올리고당류 1a 또는 1b:

상기 식에서, 각각의 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 단당류 또는 올리고당류이고, X는 H, 링커 기, 또는 보호 기이고; L은 링커이고 Y는 담체이다.
제1항에 있어서, 각각의 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, α-Rha-, α-Glc(1-2)-α-Rha-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha-, β-FucNAc(1-3)-α-Rha-, α-Rha[2,3,4-OAc]-, β-QuiNAc(1-3)-α-Rha[2,4-OAc]-, 및 β-FucNAc(1-3)-α-Rha[2,4,-OAc]-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 것인 합성 올리고당류.
제1항에 있어서, R₁ 및 R₂는 하기 표에 나열된 조합 중 하나에서 선택되는 것인 합성 올리고당류:
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, L은 알킬렌티올 링커인 합성 올리고당류.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, Y는 단백질, 펩티드, 지질, 중합체, 덴드리머, 바이로좀(virosome), 및 바이러스 유사 입자 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 담체인 합성 올리고당류.
제5항에 있어서, 담체는 담체 단백질인 합성 올리고당류.
제6항에 있어서, 담체 단백질은 박테리아 톡소이드, 독소, 외독소, 및 이의 비독성 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 합성 올리고당류.
제7항에 있어서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 파상풍 독소 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM, 콜레라 톡소이드, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 외독소 또는 톡소이드, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 엔테로톡신(heat labile enterotoxin), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A, 이의 유전적으로 독소제거된 변이체; 박테리아 외막 단백질, 혈청형 B 외막 단백질 복합체(OMPC), 외막 부류 3 포린(rPorB), 포린; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH; keyhole limpet hemocyanine), B형 간염 바이러스 코어 단백질, 티로글로불린, 알부민, 및 오브알부민; 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 부착소 단백질(PsaA); 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD); 트랜스페린 결합 단백질, TLR-5의 펩티딜 작용제; 및 상기 담체의 유도체 및/또는 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 합성 올리고당류.
제8항에 있어서, 담체 단백질은 CRM 197, 수막염균, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 폴리(리신:글루탐산), 운동성 박테리아의 플라젤린, 및 이의 유도체 및/또는 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 합성 올리고당류.
제8항에 있어서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, CRM 197, 및 OMPC로 이루어진 군에서 선택되는 것인 합성 올리고당류.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 1종 이상의 올리고당류를, 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 포함하고, 경우에 따라 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제11항에 있어서, 보강제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 면역 반응은 항원 특이적 면역 반응인 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 합성 올리고당류 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 복수의 상이한 올리고당류를 포함하고, 각 올리고당류는 화학식 1a 또는 1b의 올리고당류인 조성물.
제14항에 있어서, 보강제를 추가로 포함하는 조성물.
제16항에 있어서, 보강제는 알루미늄 염, RIBI, 톨 유사(toll-like) 수용체 작용제, AS01, AS02, AS03, AS04, AS05, CpG-올리고데옥시뉴클레오티드, MF-59, 몬타나이드(Montanide) ISA-51 VG, 몬타나이드 ISA-720, Quil A, QS21, 합성 사포닌, 면역자극 복합체, 스테아릴 티로신, 바이러스 유사 입자, 재구성된 인플루엔자 바이로좀, 사이토카인, 비만 세포 활성인자 화합물 48/80, 리포솜, 무라밀 디펩티드, SAF-1, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 슈도모나스에 대한 면역을 부여하기에 충분한 양의 1종 이상의 합성 올리고당류를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 올리고당류를 백신으로서 포함하는 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 올리고당류에 대한 항체 제제.
제46항에 있어서, 다클론 항체, 단일클론 항체, 마우스 단일클론 IgG 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 이의 단편, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 구성원을 포함하는 것인 항체 제제.
피. 에루기노사(P. aeruginosa) 감염과 관련된 질병의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 올리고당류 또는 이에 대한 항체의, 슈도모나스에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
피. 에루기노사 감염과 관련된 질병의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항의 올리고당류 또는 조성물을 피. 에루기노사 감염과 관련된 질병의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 환자는 인간인 방법.
항체의 생성 방법으로서,
(a) 슈도모나스에 특이적인 항체를 생성하기 위해 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 1종 이상의 올리고당류의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계; 경우에 따라 보강제를 추가로 포함하는 단계;
(b) 피험자로부터 항체를 단리시키는 단계
를 포함하는 방법.
단일클론 항체의 생성 방법으로서,
(a) 모락셀라(Moraxella)에 특이적인 항체를 생성하기 위해 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 1종 이상의 올리고당류의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계;
(b) 피험자로부터 항체를 단리시키는 단계;
(c) 피험자로부터의 항체 생성 세포를 골수종 세포에 융합시키는 단계, 및
(d) 융합 서브클론으로부터 생성된 항체를 수거하는 단계
를 포함하는 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 피험자는 토끼인 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 피험자는 인간인 방법.
제26항의 단계 (a) 내지 (c)를 수행함으로써 수득가능한 항체 생성 세포.
제26항의 단계 (a) 내지 (d)를 수행함으로써 수득가능한 항체.
샘플 내 슈도모나스의 존재를 진단하는 방법으로서, 제20항, 제21항, 제29항 및 제30항 중 어느 하나의 항의 항체와 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.