CN101947323B - 一种革兰氏阴性细菌疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种革兰氏阴性细菌疫苗及其制备方法，该疫苗的成分为一种多糖蛋白质结合物，该多糖蛋白质结合物是由水解后的革兰氏阴性细菌外膜外侧的脂多糖，直接或通过间隔剂与载体蛋白质缩合得到。本发明的疫苗，用于预防、治疗相应病原菌的感染，也可以做为抗原，用于疾病诊断。
Description
技术领域：
本发明涉及一种革兰氏阴性细菌疫苗及其制备方法。本发明特别涉及疫苗可以作为原材料或终产品用于疾病诊断、预防、治疗等，尤其用于预防相应细菌引起的感染。
背景技术：
革兰氏阴性细菌外膜外侧的脂多糖是细菌的毒力因子，也是最主要的保护性抗原，由3部分组成，分别是特异性多糖、核心多糖和脂类A。其中特异性多糖是位于细菌最外侧的结构，是细菌逃避宿主免疫攻击的保护层，也是宿主免疫细胞俘获细菌的靶点，它决定了细菌的抗原特性，反映了细菌的血清型别；核心多糖是连接特异性多糖和脂类A的部分；脂类A是脂多糖的致热源部分。由于特异性多糖部分决定着细菌的血清型别，在结构上具有型特异性，因此，是细菌诊断、病原菌预防和传染病治疗的重要目标。
Robbins JB等(Hypothesis for vaccine development：protective immunity to entericdiseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgGantibodies to the O-specific polysaccharide oftheir lipopolysaccharides.Clin Infect Dis.1992，Vol.15，No.2：346-61)提出“针对脂多糖内O-特异性多糖的血清IgG抗体可能预防该疾病的发生”，并在此理论的基础上，研发了针对细菌性痢疾(Preparation，characterization，andimmunogenicity of conjugates composed of the O-specific polysaccharide of Shigelladysenteriae type 1(Shiga′s bacillus)bound to tetanus toxoid.Infect Immun.1991，Vol.59，No.12：4450-8.)、大肠杆菌(Preparation，characterization，and immunological properties in mice ofEscherichia coli O157 O-specific polysaccharide-protein conjugate vaccines.Infect Immun.1994，Vol.62，No.11：5048-54)、鼠伤寒(Protection of mice against Salmonella typhimuriumwith an O-specific polysaccharide-protein conjugate vaccine.Infect Immun.1992，Vol.60，No.11：4679-86)等病原菌的多糖-蛋白质结合疫苗。这些以脂多糖为基础的革兰氏阴性细菌多糖蛋白质结合疫苗都采用氰基活化方式，通过氰根活化O-特异性多糖上的邻羟基，再与六碳间隔剂己二酰二肼(ADH)相连(图1)，制备出衍生的多糖。衍生多糖和载体蛋白质在缩合剂碳二亚胺的作用下，反应形成多糖蛋白质结合物。
国内谢贵林(福氏2a痢疾杆菌O-特异性多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫学特性，《微生物学免疫学进展》，2001年第29卷第1期)、王燕(大肠杆菌O157：H7多糖-重组铜绿假单胞菌外毒素A结合疫苗的研制，《中华微生物学和免疫学杂志》，2004年第24卷第11期)等也同样利用氰基活化方式衍生多糖，制备了脂多糖为基础的多糖蛋白质结合疫苗。这种氰基活化方式采用的氰化物试剂通常为溴化氰(CNBr)、1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)等。王燕(宋内氏痢疾杆菌O-SP-TT结合疫苗的制备及其免疫学特性的研究，《微生物学免疫学进展》，2002年第30卷第2期)在制备细菌性痢疾宋内血清型的多糖蛋白质结合疫苗时，虽未采用氰基活化，但利用了宋内氏痢疾特异性多糖重复单位中的阿卓糖酸，利用阿卓糖酸的羧基直接与ADH反应形成衍生多糖，再结合形成多糖蛋白质结合物。
以上所述制备方法均利用了脂多糖O-特异性多糖链上的活性基团进行反应，与蛋白质以多点连接方式结合形成多糖蛋白结合物。这种结合物是一种网络状交联状态，形成的结合物分子量相对较大。
2007年，Robbins JB等(Effect of the nonreducing end of Shigella dysenteriae type 1O-specific oligosaccharides on their immunogenicity as conjugates in mice.PNAS.2007，Vol.104，No.36：14478-82)发现利用多糖的末端，以单点连接方式制备出的多糖蛋白质结合物免疫原性更佳，这种结合物是以蛋白质为中心形成的一种“太阳”状结构。随后，以志贺氏菌福氏2a血清型、福氏6型血清型、痢疾志贺氏1型血清型(Immunochemical studies ofShigella flexneri 2a and 6，and Shigella dysenteriae type 1 O-specific polysaccharide-corefragments and their protein conjugates as vaccine candidates.Carbohydrate Research.2010，Vol.345，No.11：1600-08)以及志贺氏菌宋内氏血清型(Synthesis，characterization，andimmunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates.PNAS.2009，Vol.108，No.19：7974-8)制备了这种“太阳”状结构的结合物。Robbins JB等制备“太阳”状结构结合物是原理是：脂多糖水解后还原端为2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)，利用KDO上的羰基与蛋白质载体上的氨氧基反应，形成稳定的肟结构，完成多糖与蛋白质间的单点连接，从而制备出“太阳”状结构的多糖蛋白质结合物。
本发明利用脂多糖水解后的末端KDO上的羧基，通过缩合反应以间隔剂或直接与载体蛋白质相连，形成多糖蛋白质结合物。KDO的汉语名称为2-酮基-3-脱氧辛酸，为八碳的有机酸，含羧基。图2为脂多糖(LPS)的模式图，箭头所指的位置就是KDO的羧基部分。由于革兰氏阴性细菌均含有脂多糖(或脂寡糖)成分，而脂多糖又是细菌的保护性抗原，因此，该方法可广泛用于革兰氏阴性细菌，制备针对该类细菌感染的多糖蛋白质结合物疫苗。这种制备结合物的方法具有简单、时间短、结合率高、不使用含氰化合物类有毒试剂等众多优势。制备的结合物以单点式连接为主，形成以“太阳”状结构为主体的多糖蛋白质结合疫苗。
发明内容：
本发明提供一种多糖蛋白质结合物，该多糖蛋白质结合物是由水解后的革兰氏阴性细菌外膜外侧的脂多糖，直接或通过间隔剂与载体蛋白质缩合得到。本发明的多糖蛋白质结合物，可进一步加工制备成革兰氏阴性细菌的疫苗，用于预防、治疗相应病原菌的感染，也可以做为抗原，用于疾病诊断。
为此，本发明提供一种革兰氏阴性细菌疫苗及其制备方法，其特征在于利用革兰氏阴性细菌脂多糖水解后核心多糖部分的2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)分子，通过其羧基直接或以间隔剂的形式与载体蛋白质相连，制备出多糖蛋白质的结合物，进一步加工制备成革兰氏阴性细菌的疫苗。
本发明的多糖蛋白质的结合物制备方法主要包括以下三种：
1.直接结合法
将水解的脂多糖与载体蛋白质直接缩合，形成多糖蛋白质结合物。
2.衍生蛋白结合法
用含双官能团的间隔剂衍生载体蛋白质，然后与水解的脂多糖缩合，形成多糖蛋白质结合物。常用间隔剂包括丁二酸二酰肼(Butanedihydrazide)、己二酰二肼(ADH)等二肼类化合物，还包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷类化合物。间隔的-C-原子以4～8个为最佳。
3.衍生多糖结合法
用含双官能团的间隔剂衍生水解的脂多糖，然后与载体蛋白质缩合，形成多糖蛋白质结合物。常用间隔剂包括丁二酸二酰肼(Butanedihydrazide)、己二酰二肼(ADH)等二肼类化合物，还包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷类化合物。
缩合反应主要采用碳二亚胺(EDAC或EDC)介导，也可以采用HATU介导。反应体系可以在缓冲系统中，也可以在非缓冲系统中，甚至在水溶液中，还可以采用有机反应体系。缩合反应时，多糖(或衍生物)和蛋白质(或衍生物)的比例从100∶1～1∶100，较优比例从10∶1～1∶10，最佳比例从5∶1～1∶5。多糖(或衍生物)及蛋白质(或衍生物)的终反应浓度为1000mg/ml～0.1mg/ml，较佳浓度100mg/ml～1mg/ml，最佳浓度20mg/ml～5mg/ml。反应所用的碳二亚胺浓度(终反应浓度)为1M～0.0001M，较佳浓度为0.1M～0.001M，最佳浓度为0.05M～0.01M。反应时间15分钟～24小时，更长时间的反应因体系已达到平衡将没有意义。较佳反应时间1小时～8小时，最佳反应时间2小时～4小时。反应温度为-4℃～100℃，较佳反应温度为10℃～50℃，最佳反应温度为15℃～25℃。反应pH值在2.5～11.5之间，较佳pH值为3.0～8.0之间，最佳pH值为4.5～6.5之间。
本发明多糖来源于革兰氏阴性细菌，通过化学、物理或生物学方法获得，末端含有KDO结构。革兰氏阴性细菌包括但不限于脑膜炎奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、霍乱弧菌等。如：痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、类志贺邻单胞菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌。
载体蛋白质可选用破伤风类毒素、白喉类毒素(以及交叉反应物质，如CRM197、CRM9)、脱毒的百日咳毒素、霍乱毒素B亚单位、不耐热肠毒素亚单位、重组绿脓杆菌外毒素A等，也可选用脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌外膜蛋白、流感嗜血杆菌外膜蛋白等，还可选用白蛋白、匙孔蓝蛋白等。这些蛋白质可以从原始材料中提取，也可以通过基因工程手段制备重组蛋白获得，属于现有技术。
通过间隔剂结合时，载体蛋白质可先用琥珀酰酐处理。蛋白质是由α-氨基酸通过肽键组成的高分子化合物，含氨基和羧基，为两性物质。在反应前，将蛋白质进行琥珀酰化，使蛋白质上的氨基转化为羧基。通过蛋白预处理，减少蛋白质上氨基含量的同时，增加了羧基含量，可以有效避免了后续结合步骤中蛋白质的自体交联。蛋白质预处理的工艺步骤可采用：蛋白质用0.01M磷酸缓冲液调整为10mg/ml，按10∶1(Wt∶Wt)加入琥珀酰酐，维持pH7.2-7.4室温反应20分钟，超滤膜超滤洗涤，缓冲液为0.01M磷酸缓冲液，洗涤浓缩至蛋白质含量≥20mg/ml，除菌过滤后，4℃保存备用。
琥珀酰酐与蛋白质反应化学式
本发明得到的多糖蛋白质结合物，进一步加工可制备成疫苗制剂，制备制剂的技术属于制备疫苗制剂的常规技术。
其中每一单位给药剂量的制剂中含多糖的量在0.1μg-100μg之间，所述每一单位给药剂量是指每次用量的制剂量，或每一制剂单位如注射剂1支中内容物的量。而本发明的制剂优选的为注射用的制剂，如粉针剂或水针剂。可皮下或肌肉注射。
本发明的疫苗制剂，还可含有氢氧化铝或磷酸铝作为佐剂，铝含量为0.05mg-10mg/ml。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：
本发明的不同的多糖蛋白质结合物的免疫实验：
采用大肠杆菌酸水解多糖与破伤风类毒素以上述3种方法制备结合物，免疫NIH小鼠，共免疫3针，间隔2周。每次免疫后1周，采血测定抗体水平。计算特异性抗体水平。抗体水平测定采用间接ELISA，是抗体检测的常规方法。酶标板包被用抗原为大肠杆菌脂多糖。
1、直接结合法制备结合物的免疫学结果：
| 免疫次数 | 免前 | 1针 | 2针 | 3针 |
| 抗体滴度(1：) | 3.7 | 394 | 1344 | 3904 |
2、衍生蛋白结合法制备结合物的免疫学结果：
| 免疫次数 | 免前 | 1针 | 2针 | 3针 |
| 抗体滴度(1：) | 4.6 | 490 | 1280 | 4864 |
3、衍生多糖结合法制备结合物的免疫学结果：
| 免疫次数 | 免前 | 1针 | 2针 | 3针 |
| 抗体滴度(1：) | 5.6 | 364 | 1664 | 4740 |
附图说明：
图1、氰根活化衍生多糖
图2、脂多糖(LPS)的模式图
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。本实施例只是一种举例，是本发明的解决方案之一，并非将本发明局限于实施例。
实施例一直接结合法(1)
酸水解的大肠杆菌脂多糖溶解为20mg/ml，溶剂为0.01M的醋酸缓冲液，pH5.6，等量加入20mg/ml的破伤风类毒素，充分搅拌混匀。加入EDAC至终浓度0.02M，搅拌反应4小时，期间维持pH值至5.6。反应结束后，采用超滤或层析手段分离结合物，所用溶剂为PBS，pH值6.8-7.0。
实施例二直接结合法(2)
酸水解的大肠杆菌脂多糖溶解为20mg/ml，溶剂为0.01M的醋酸缓冲液，pH5.6。加入EDAC至终浓度0.02M，搅拌溶解后。滴加等体积破伤风类毒素，破伤风类毒素浓度为20mg/ml，边滴边搅拌反应，滴加完成后继续搅拌，共反应4小时，期间维持pH值至5.6。反应结束后，采用超滤或层析手段分离结合物，所用溶剂为PBS，pH值6.8-7.0。实施例三衍生蛋白结合法
1.载体蛋白质衍生：破伤风类毒素调整浓度至20mg/ml，等体积加入0.5M ADH，搅拌均匀，调pH值至5.6。加入EDAC至终浓度0.02M，维持pH5.6反应4小时。透析或超滤去除未反应的ADH和EDAC，浓缩衍生破伤风类毒素浓度至20mg/ml以上。
2.酸水解的大肠杆菌脂多糖溶解为20mg/ml，溶剂为0.01M的醋酸缓冲液，pH5.6，等量加入20mg/ml的衍生破伤风类毒素，充分搅拌混匀。加入EDAC至终浓度0.02M，搅拌反应4小时，期间维持pH值至5.6。反应结束后，采用超滤或层析手段分离结合物，所用溶剂为PBS，pH值6.8-7.0。也可采用直接结合法(2)进行。
实施例四衍生多糖结合法
1.多糖衍生：酸水解的大肠杆菌脂多糖溶解为20mg/ml，溶剂为0.01M的醋酸缓冲液，pH4.9，等体积加入0.5M ADH，搅拌均匀。加入EDAC至终浓度0.02M，维持pH4.9反应4小时。透析或超滤去除未反应的ADH和EDAC，冻干或乙醇沉淀收获衍生的多糖。
2.衍生多糖溶解为20mg/ml，溶剂为0.01M的醋酸缓冲液，pH5.6，等量加入20mg/ml的破伤风类毒素，充分搅拌混匀。加入EDAC至终浓度0.02M，搅拌反应4小时，期间维持pH值至5.6。反应结束后，采用超滤或层析手段分离结合物，所用溶剂为PBS，pH值6.8-7.0。也可采用直接结合法(2)进行。
实施例五疫苗的制备
将多糖蛋白质结合物原液用PBS(pH6.8-7.0)稀释至20μg/ml(按多糖计算)，充分混合后，4～8℃保存。按0.5ml/支的量分装，即为疫苗。每支含多糖抗原10μg。
实施例六疫苗的制备
将多糖蛋白质结合物原液稀释至20μg/ml(按多糖计算)，加入铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为疫苗。每支含多糖抗原10μg。
Claims (10)
1.一种多糖蛋白质的结合物，其特征在于，制备方法如下：革兰氏阴性细菌脂多糖水解后，在其羧基位置直接或以间隔剂的形式与载体蛋白质进行缩合反应，得到。
2.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，其中所述革兰氏阴性细菌选自痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉菌、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、类志贺邻单胞菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌，其中所述载体蛋白质选自破伤风类毒素、白喉类毒素、交叉反应物质、脱毒的百日咳毒素、霍乱毒素B亚单位、不耐热肠毒素亚单位、重组绿脓杆菌外毒素A、脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌外膜蛋白、流感嗜血杆菌外膜蛋白、白蛋白、匙孔蓝蛋白。
3.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，其中的间隔剂选自二肼类化合物、二氨基烷类化合物。
4.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，其中的缩合反应，缩合剂为碳二亚胺。
5.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，缩合反应多糖和蛋白质的加量比例为1∶100～100∶1，多糖和蛋白质的反应浓度为1000mg/ml～0.1mg/ml。
6.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，缩合反应时间15分钟～24小时，反应温度为-4℃～100℃，反应pH值为2.5～11.5。
7.权利要求4的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，碳二亚胺使用终浓度为1M～0.0001M。
8.权利要求1的多糖蛋白质的结合物，其特征在于，缩合反应采用碳二亚胺介导，反应体系在缓冲系统或非缓冲系统中或有机反应体系中进行，缩合反应时，多糖和蛋白质的比例从5∶1～1∶5，多糖及蛋白质的终反应浓度为20mg/ml～5mg/ml，反应所用的碳二亚胺浓度为0.05M～0.01M，反应时间2小时～4小时，反应温度为15℃～25℃，反应pH值在4.5～6.5之间。
9.一种疫苗，其特征在于，含有权利要求1的多糖蛋白质的结合物。
10.权利要求9的疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：革兰氏阴性细菌脂多糖水解后，在其羧基位置直接或以间隔剂的形式与载体蛋白质进行缩合反应，得到权利要求1的多糖蛋白质的结合物，用制备疫苗制剂的常规技术进一步加工制备成疫苗制剂。
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