JP2763960B2 - 大腸菌 ｏ−多糖−タンパク質結合ワクチン - Google Patents

大腸菌 ｏ−多糖−タンパク質結合ワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一つのあるいは複数の大腸菌［Escherichi
a coli（E.coli）］株に対するワクチンの製造方法に関
する。本発明はさらに非発熱性、非毒性、かつ免疫原性
がある血清型特異的LPSに基づく結合体から構成される
多価ワクチン及び該ワクチン中の結合体に関する。
技術背景 Escherichia coli（E.coli）は生命を脅かす原因とな
る主なグラム陰性菌種である。莢膜（Ｋ）抗原及びリポ
多糖（LPS）（Ｏ）抗原はCross,A.S.,Kim,K.S.,Wright,
D.C.,Sadoff,J.C.,Gemski,P."Escherichia coli菌血症
菌株の血清耐性におけるリポ多糖及び莢膜の役割”J.In
fect.Dis．154:497−503（1986）及びPluschke,G.,Mayd
en,J.,Achtman,M.,Levine,R.P.,"018:K1 Escherichia c
oliの、補体媒介殺菌耐性における莢膜及びＯ抗原の役
割”Infect.Immun．42:907−913（1983）に記載されて
いるように、重要な病毒性因子である。Cross,A.S.,ki
m,K.S.,Wright,D.C.,Sadoff,J.C.,Gemski,P.,"Escheric
hia coli菌血症菌株の血清耐性におけるリポ多糖及び莢
膜の役割”J.Infect.Dis．154:497−503（1986）及び、
Pluschke,G.,Mayden,J.,Achtman,M.,Levine,R.P.,"018:
K1 Escherichia coliの、補体媒介殺菌耐性における莢
膜及びＯ抗原の役割”Infect.Immun．42:907−913（198
3）に記載されているように、莢膜抗原及びLPS抗原は共
に正常なヒト血清の殺菌性に対して防御を行うことがで
き、大腸菌（E.coli）を血液中へ侵入させ、残存させる
性質をもつ。
Cross,A.S.,Zollinger,W.,Mandrell,R.,Gemski,P.,Sa
doff,J.C.,"K1陽性Escherichia coliによる感染の治療
への免疫治療的アプローチの評価”J.Infect.Dis．197:
68−76（1983）及びKaijser,B.,Ahlstedt,S.,"Escheric
hia coliのＯ抗原及びＫ抗原に対する抗体の防御能力”
Infect.Immun．17:286−289（1977）に記載されている
ように、莢膜抗原及びLPS抗原に対する血清特異的抗体
は動物に対する大腸菌（E.coli）の感染実験において感
染を防御できる。Orskov,F,Orskov,I.,"Escherichia co
liの腸管外感染”J.Hyg．95:551−575（1985）、Cross,
A.S.,Gemski,P.,Sadoff,J.C.,Orskov,F,Orskov,I.,"Esc
herichia coliの侵略的感染におけるK1莢膜の重要性”
J.Infect.Dis．149:184−193（1984）、及びMcCabe,W.
R.,Kaijser,B.,Olling,S.,Uwaydah,M.,Hanson,L.A.,"菌
血症のEscherichia coli:成人及び新生児からの菌株の
Ｋ抗原、Ｏ抗原及び血清感受性”J.Infect.Dis．138:33
−41（1978）に記載されているように、敗血症などの深
刻な感染を引き起こす大腸菌（E.coli）が発現するＯ抗
原及びＫ抗原の数は限られているため、これらの抗原を
用いたワクチンの製造が可能となる。
しかし、大腸菌（E.coli）の莢膜抗原をヒトへのワク
チンとしての用いるには主に２つの障害がある。第一
に、およそ40％の大腸菌（E.coli）菌血症単離集団に莢
膜抗原に関する血清型分類をすることができない。加え
て、20％以上のＫ型分類可能血液単離集団が発現してい
るK1及びK5莢膜抗原は哺乳類のグリコサミノグリカンと
抗原としての交差反応性を持つため、ヒトにおいて免疫
原性に乏しい。従って、Ｋ抗原に基づく大腸菌（E.col
i）ワクチンは適用範囲が得られており、従って有用性
が低い。
上記の結果に基づき、血清特異的なLPSに基づくワク
チンは大腸菌（E.coli）の腸外感染の防御に関し、最も
高い可能性をもつと思われる。しかし、天然のLPSはヒ
トへのワクチンとして用いるには毒性及び発熱性が高
い。他のグラム陰性細菌と同様に、大腸菌（E.coli）Ｏ
血清型特異性はLPS分子のＯ−多糖（Ｏ−PS）部位に含
まれる。希釈酢酸による切断とそれに続く遠心操作によ
り不溶性のリピドＡを沈澱させることで、Ｏ−PS領域を
LPS分子の有毒性リピドＡ部位と分けることができる。
この方法により単離したＯ−PSは血清学的に反応性、非
毒性、非発熱性であるが、Pier,G.B.,Sidberry,H.F.,Sa
doff,J.C.,"Pseudomonas aeruginosaの高分子多糖によ
る免疫によってマウスに誘導される免疫性防御”Infec
t.Immun．22:919−925（1978）及びChester,I.R.,Meado
w,P.M.,Pitt,T.L.,"異なるＯ−血清型Pseudomonas aeru
ginosa菌種におけるＯ−抗原性リポ多糖と血清学的特異
性との関係”J.General Microbiol．78:305−318（197
3）に記載されているように、低分子量であるため免疫
原性がない。
単離したＯ−PSに対して防御的な免疫反応をもたせる
方法の一つはＯ−PSを担体タンパク質と共有結合し、結
合ワクチンを生産することである。Cryz,S.J.,Jr.,Cros
s,A.S.,Sadoff,J.C.,Frer,E.,"Escherichia coli 018
O−多糖結合体ワクチンの合成と特徴づけ”Infect.Imm
un．58:373−377（1990）及びCryz,S.J.,Jr.,Cross,A.
S.,Sadoff,J.C.,Wegmann,A.,Que,J.U.,Frer,E.,"Esch
erichia coli 018 O−特異的ポリ多糖（Ｏ−PS）−毒素
Ａ及びＯ−PS−コレラ毒素結合ワクチンのヒトにおける
安全性と免疫原性”J.Infect.Dis．163:1040−1045（19
91）に記載されているように、大腸菌（E.coli）018 O
−PSはコレラ毒素及びPseudomonas aeruginosa毒素Ａと
共有結合され、安全な、免疫原性をもつ防御的単価結合
ワクチンとなった。
しかし、菌血症感染の大多数（〜70％）は大腸菌（E.
coli）の、10−12の異なる血清型に起因するという観察
結果に基づき、血清特異的Ｏ−PS決定基に基づく大腸菌
（E.coli）に対するワクチンは総て、多価でなくてはな
らないと考えられる。Orskov,F.,Orskov,I.,、Escheric
hia coliの血清型分類”Methodsin Microbiology 14:4
3−112（1984）に記載されているように、血清特異性は
Ｏ−PS単糖組成及び単糖間の化学結合様式により与えら
れる。従って、上記の018単価結合体合成に使用された
条件は大腸菌（E.coli）の他の血清型に対しては適切で
はないかもしれない。
本発明により、大腸菌（E.coli）の12の血清型から単
離されたＯ−PSを”担体タンパク質”としてのP.aerugi
nosa毒素Ａと共有結合させた。毒素Ａと大腸菌（E.col
i）Ｏ−PSとの共有結合の合成に用いた条件は効果的に
毒素Ａ分子を無毒化し、かつ、Ｏ−PS部位の免疫原性を
保持させた。得られた多価結合体は非経口接種した場
合、人体内において、安全で免疫原性をもっていた。
発明の概要 本発明の目的は、異なる大腸菌（E.coli）血清型に対
して有効である、多価非毒性抗大腸菌（E.coli）ワクチ
ンの製造方法を提供することである。
本発明の別の目的は、多価ワクチンに使用される、多
様な大腸菌（E.coli）血清型に特異的である、単価Ｏ−
PS−毒素Ａ結合体を提供することである。
一つの態様として、本発明は多価、非毒性かつ免疫原
性をもつ大腸菌（E.coli）Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチン
の製造方法を提供する。その方法は、良い水準で完全な
Ｏ−PS領域をもつ滑らかなLPSを生産することが示され
た。特異的大腸菌（E.coli）株からのＯ−PSの単離；反
応性アルデヒド基を作成するための厳密に制御された条
件下でのＯ−PSの酸化；水溶性カルボジイミドを結合剤
として用いた、毒素Ａへのスペーサー分子の共有結合に
よる導入；そして、単価、非毒性、かつ免疫原性をもつ
Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチンを製造するために毒素Ａ−
スペーサー分子と酸化ポリ多糖とを結合させること、を
含む。
別の態様として、本発明は多価ワクチンをつくるため
に、多様な血清型の単価Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチンを
結合させることにより生産された非毒性、かつ免疫原性
をもつ大腸菌（E.coli）ワクチンに関する。
更に別の態様として、本発明は担体タンパク質と共有
結合した大腸菌（E.coli）リポ多糖分子の、Ｏ−多糖領
域から成る結合体に関する。
本発明の他の多様な目的及び利点は下記の発明の記載
により明らかとなる。
発明の詳細な説明 本発明は大腸菌（E.coli）に対するワクチンに使用す
る大腸菌（E.coli）タンパク質結合体に関する。本発明
は更にこのようなワクチンの製造方法に関する。
本発明の新しい方法は大腸菌（E.coli）に対する多
価、非毒性、かつ免疫原性をもつワクチンを製造する。
本発明の方法の利用により、単価、血清型特異的結合体
が製造され、結合されて多価のワクチンとなる。免疫原
性をもつワクチンは、液性免疫反応を誘導するのに十分
な本発明の結合体、および薬学的に受容できる担体から
構成される。
本発明の方法においては、ワクチン結合体は良い水準
で、完全なＯ−PS領域をもつ滑らかなLPSを生産するこ
とが示された特異的な大腸菌（E.coli）株からＯ−PSを
単離することによって得られる。血清疫学的調査に基づ
いた適切な大腸菌（E.coli）株は血清型01,02,04,06,0
7,08,012,015,016,018,025及び075を含むが、これらに
限定されるものではない。Ｏ−PSはリピドＡが実質的に
存在しないように単離され、反応性アルデヒド基をもつ
ように酸化される。酸化され得るＯ−PSの還元糖のうち
40〜80％はこの処理の過程で酸化される。例えば、Ｏ−
PSは、好ましくは５分以下の、より好ましくは２〜５分
のNaIO4処理により酸化され得る。
つづいて、リピドＡ非存在Ｏ−ポリ多糖が、少なくと
も一つのヒドロキシル基あるいはカルボキシル基により
担体タンパク質と共有結合され、結合体が作成される。
本発明における利用に適した担体タンパク質は例えば、
毒素Ａ、破傷風トキソイド、コレラ毒素、ジフテリアト
キソイド、Corynebacterium diphtheriaeが生産するタ
ンパク質CRM 197、グラム陰性細菌、特にグループB Nei
sseria meningitidisの外膜タンパク質、Escherichia c
oliの熱不安定性毒素、コレラ毒素若しくは大腸菌（E.c
oli）の熱不安定性毒素のＢサブユニット、または細菌
性熱ショックタンパク質、を含む。担体タンパク質はＯ
−PS分子と直接、あるいはスペーサー分子を介して結合
され得る。
好ましい担体タンパク質は、アジピン酸ジヒドラジド
のようなスペーサー分子を介して精製Ｏ−PSと結合する
毒素Ａである。このスペーサー分子は非可逆的に毒素Ａ
を無毒化し、かつ、Ｏ−PSと結合可能であるという二重
機能スペーサー分子としての機能をもつ。
多価ワクチンは、上記の様々な血清型のＯ−PSから作
成された２つ以上の単価結合体の結合によって製造され
る。例えば、本発明の多価ワクチンは血清型02、04、06
及び、018、あるいは02、04、06、07及び、018、あるい
は01、02、04、06、07、08、及び018、あるいは01、0
2、04、06、07、08、012、及び018、あるいは01、02、0
4、06、07、08、012、015、及び018、あるいは01、02、
04、06、08、012、015、016、及び018、あるいは01、0
2、04、06、07、08、012、015、016、018、及び025、あ
るいは01、02、04、06、07、08、012、015、016、018、
025、及び075、由来のＯ−PSから構成される結合体を含
み得る。
上記のように作成された本発明の結合体は600,000よ
り大きい分子量を有する。天然のLPSや毒素Ａとは異な
り、本発明の結合体は非毒性である。また、天然のLPS
とは異なり、この結合体は非発熱性である。本発明の結
合体はＯ−PS部位及び毒素Ａ部位に対して抗体反応を誘
導する免疫原性をもつ。
下記の非制限的な実施例は本発明についてさらに記述
するために示される。本明細書中に含まれるデータ作成
の際、表３に示されている大腸菌（E.coli）株をLPSの
抽出源として用いた。しかし、同じ血清型を発現する他
の大腸菌（E.coli）株も、完全なＯ−PSを含む滑らかな
LPS構造を合成する場合には、必ずしも同じ結果にはな
らないかも知れないが、用いることができよう。
Ｏ−PS−毒素Ａ結合体の調製 本発明の非毒性、かつ免疫原性をもつ結合体は、加水
分解された大腸菌（E.coli）LPS由来の血清特異的決定
基を含むＯ−PSと毒素Ａとの共有結合により合成され
た。アジピン酸ジヒドラジド（ADH）はスペーサー分子
として用いられた。ADHと毒素Ａとの共有結合によりア
デノシン二リン酸リボース転移酵素を完全に非活性化す
る。このことにより、Cryz,S.J.,Jr.,Frer,E.,Sadof
f,J.C.,Germanier,R.,"Pseudomonas aeruginosa免疫型
５多糖−毒素Ａ結合ワクチン”Infect.Immun．52:161−
165（1986）に記載されているように、毒素Ａは無毒化
される。敗血症と関連付けられる大腸菌（E.coli）の、
最も一般的な12の血清型のLPS由来のＯ−PSからこの方
法によって合成された結合体は分子量が600,000より大
きく、非毒性、非発熱性、かつ免疫原性を有するもので
あった。このワクチンによってウサギ及びヒトで誘導さ
れる抗体をマウスへ受け身的に注入した場合、大腸菌
（E.coli）感染実験において、感染を防御した。ワクチ
ン接種は抗大腸菌（E.coli）LPS IgG抗体反応及び、抗
毒素A IgG抗体反応の両方を引き起こす。
本発明の方法では、Cryz,S.J.,Jr.,Cross,A.S.,Sadof
f,J.C.,Frer,E.,"Escherichia coli 018 O−多糖結合
ワクチンの合成と特性づけ”Infect.Immun．58:373−37
7（1990）に記載されているようにして、LPSを単離、精
製した。このようにして生成されたLPSは２％（wt/wt）
以下のタンパク質及び核酸を含んだ。血清特異的抗原決
定基を含むＯ−PSは、精製されたLPSから穏やかな酸加
水分解により調製された。精製されたLPS（lg）を200ml
の１％（vol/vol）酢酸水溶液に懸濁した。溶液を還流
冷却器つき丸底フラスコに入れ、半球フラスコヒーター
中で90分間煮沸した。冷却後、不溶性であるリピドＡは
遠心操作により沈澱させ、廃棄した。上清を0.2N NaOH
で中和し、45μｍフィルターを用いて濾過滅菌し、リピ
ドＡを完全に取り除いた。溶液を減圧下、ロータリーエ
バポレーションを用いて濃縮し、濃縮液を蒸留水で平衡
化した５×40cm G−25カラム（Pharmacia Fine Chemica
ls,Uppsala,Sweden）に通した。フラクションを集め、
各フラクションの炭水化物含量をWestphal,O.,Luderit
z,O.,Bister,F.,"フェノール−水によるバクテリアの抽
出について”Z.Naturforsch[B]7:148−155（1952）に記
載されているフェノール硫酸法により測定した。炭水化
物含有フラクション（Mr≦70,000）を集め、ロータリー
エバポレーションによって濃縮し0.22μｍフィルターを
用いて濾過滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥した物質を
体重1kg当たり10μｇの静注量でウサギに接種し、発熱
性を分析した。発熱性をもたない物質のみを結合体の作
成に使用した。
毒素ＡはCryz,S.J.,Jr.,Frer,E.,Germanier,R.,"抗
毒素Ａ、抗エラスターゼ、及び抗リポ多糖の受け身的注
入による、やけど敗血症モデルネズミへのP.aeruginosa
の感染に対する防御”Infect.Immun．39:1072−1079（1
983）に記載されている方法で精製された。ただし、生
産株はP.aeruginosa PA103株から自然に単離された毒素
Ａ高生産株、PA103−FeRである。最終精製産物は高圧液
相クロマトグラフィーで解析したところ、95％以上毒素
Ａ蛋白質で構成されていた。
次に、Ｏ−PSを反応性アルデヒド基をつくりだすため
に下記のように酸化した。凍結乾燥したＯ−PS（60mg）
を12mlの蒸留水に溶かした。固体NaIO4（258mg;E.Merck
and Co.,Darmstadt,Germany）を加え、２分間反応させ
た。酸化反応をエチレングリコール（0.12ml）を加えて
停止した。酸化過程において、Ｏ−PSのNaIO4処理時間
は、毒素Ａと結合させたときの酸化Ｏ−PSの免疫原性に
関して重要であることがわかった。５分以上酸化したＯ
−PSで構成された結合体は下記の表１に示されるよう
に、免疫原性が低下していた。この傾向は研究された３
つの血清型のＯ−PS総てに一致しており、Ｏ−PSの酸化
時間に関連しているようであった。この結果は大腸菌
（E.coli）Ｏ−PSが発現している決定エピトープは過度
の酸化によって容易に破壊されることを意味している。
これはCryz,S.J.,Frer,E.P.,"非毒性Pseudomonas aer
uginosa多糖−破傷風トキソイド及び多糖−毒素Ａ結合
ワクチン”米国特許第4.771.127号.10/88の、P.aerugin
osa由来のＯ−PSはNaIO4存在下、２時間酸化後もなお、
適切な担体タンパク質と結合させた場合、高い免疫原性
をもつ結合体となり得る、という記載からは意外な結果
であった。表１はＯ−PS結合ワクチンの免疫原性に対す
る、様々な酸化時間の影響を示している。
混合物を減圧下ロータリーエバポレーションを用いて
濃縮し、Sephadex G−25（Pharmacia Fine Chemicals,U
ppsala,Sweden）を用いて濾過することにより、酸化Ｏ
−PSの他の反応物と分けた。カラムフラクションを集
め、各フラクションの炭水化物含量をDubois,M.,Gille
s,K.A.,Hamilton,J.K.,Rebers,P.A.,Smith,F.,"糖及び
関連物質の決定のための比色定量法”Anal.Chem．28:35
0−356（1956）に記載されているフェノール硫酸法によ
り測定した。酸化Ｏ−PS含有フラクションを集め、凍結
乾燥した。
アジピン酸ジヒドラジド（ADH）は２つの目的で利用
された。（ｉ）毒素Ａ分子との共有結合後、毒素Ａを不
可逆的に無毒化する；（ii）毒素Ａと結合する基、及び
Ｏ−PSと結合し得る基、２つの反応基によってスペーサ
ー分子といて機能する。ADHは下記のように毒素Ａと共
有結合させた。固体ADH（300mg;Fluka AG,Buchs,Switze
rland）及び１−エチル−３（−３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド（30mg;Sigma Chemical Co.,
St.Louis,MO）を150mg（5mg/ml 0.05M Na2HPO4−NaH2PO
4,pH7.2）の毒素Ａに加えた。溶液を22℃において２時
間撹拌した。撹拌中、溶液のpHはpH−stat（Methrom,He
risan,Switzerland）を用い、0.3N塩酸を加えることに
より4.8に保った。次に毒素Ａ−ADH溶液を0.05Mリン酸
塩緩衝液pH7.2（PBS）に対して十分に透析した後、5,00
0×ｇ、10分間の遠心操作により総ての不溶性物質を取
り除いた。
毒素Ａ−ADHを下記のように酸化Ｏ−PSと結合した。
毒素Ａ−ADH溶液を最終濃度2mg/mlとなるように50mMリ
ン酸バッファーpH7.0で希釈した。同量の酸化Ｏ−PSを
加え、混合溶液を22℃において１時間インキュベートし
た。NaCNBH3を最終濃度20mMとなるように加え、22℃に
おいて72−96時間インキュベートした。この混合溶液を
メルチオレイトを0.02％含むPBS（PBS−Ｍ）に対し、十
分に透析し、PBS−Ｍで平衡化したSephadex G−100カラ
ムにのせた。カラムをPBS−Ｍで流出し、結合体を含有
するボイドフラクションを集め、４℃で保存した。
最終的に、多価ワクチンは下記のように生産された。
12の単価結合体を、無菌条件下、各血清型のポリ多糖の
最終濃度が50μg/mlとなるように混合した（600μg/ml
に等しい）。この混合液を５％（wt/vol）ラクトース及
び0.01％メルチオレイトを含む、10倍量の半濃度PBSに
対して透析した。混合液を透析バッグから無菌的に吸い
取り、1mlを滅菌した３−mlガラスバイアルに入れた。
バイアルの蓋を閉め、無菌条件で凍結乾燥した。蓋を閉
めた上からアルミニウム製キャップで封をし、バイアル
にラベルを貼った。
Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチンの特性 Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチンの、様々な物理化学的特
性及び安全性、免疫原性に関する特性が表１−８に示さ
れている。特に表１に関しては、結合体の免疫原性は、
次に続く結合体の形成に不可欠である反応性アルデヒド
基をつくりだす酸化過程において、Ｏ−PSをNaIO4処理
する時間に依存していることが分かった。NaIO4処理時
間はＯ−PSの酸化度に影響を与える。３つの異なる血清
型のＯ−PSについて、５分以上の室温でのNaIO4処理は8
0％以上の糖残基を酸化し、それらを担体タンパク質と
結合した際、結合体の免疫原性は低かった。２−５分間
酸化したＯ−PSで構成された結合体はより高い免疫原性
を示した。
LPS、Ｏ−PS、毒素Ａ、及びＯ−PS−毒素Ａ結合体の
様々な特性（分子量、毒性、発熱性、及び免疫原性）が
表２に示されている。結合体は、各材料構成成分の分子
量、即ち、Ｏ−PS（70.000）及び毒素Ａ（〜66,000）
よりも高い、600,000以上の分子量を有した。LPS及び毒
素Ａは天然の形ではマウスに対し毒性をもった。例え
ば、天然の毒素Ａを腹腔内注射した場合の平均致死量は
マウス１匹当たり0.2μｇであった。しかし、毒素Ａを
Ｏ−PSと共有結合すると毒性は劇的に減少し、これは毒
素Ａタンパク質200μｇに相当する結合体をマウスに注
入しても毒性を示さなかったことで証明されている。従
って、結合ワクチンを作成する方法により、毒素Ａの毒
性は少なくとも1000分の１に減少し、毒素Ａトキソイド
となった。
天然のLPSは体重1kg当たり0.1μｇ、ウサギに静脈投
与すると発熱性を示す。これに対し、精製Ｏ−PS及びＯ
−PS−毒素Ａ結合体は10μg/Kg投与しても発熱性を示
さない。高い毒性のため、天然の毒素Ａについては発熱
性を解析することはしなかった。非結合Ｏ−PSはウサギ
に筋肉注射した場合非免疫原性であった。これに対し、
12の単価Ｏ−PS−毒素Ａ結合体は総て、12価結合ワクチ
ンと同様、各Ｏ−PS血清型及び毒素Ａに対する免疫反応
を引き起こすことができた。
１ Dupont Zorbax GF−250カラムを用いた高圧液相ク
ロマトグラフィーにより決定した。
２ 18−20gのマウスに腹腔接種した時の平均致死量を
示す。LPSに関してはあらかじめガラクトサミン感受性
にしたマウスを用いた。
非毒性は最低500μｇの抗原を腹腔接種しても死に至
らなかったことを意味する。
３ ウサギに静脈投与した際、体温を0.3℃上昇させ
る抗原量（体重1Kg当たりのμｇ） ４ ND＝not done ５ 各抗原10−50μｇで免疫したウサギにより決定し
た。血清はELISAを用い、特異的IgG抗原の存在を解析し
た。
まとめると、表１に示されたデータはＯ−PS−毒素Ａ
結合ワクチンが高分子量、非毒性、非発熱性でありＯ−
PS及び毒素Ａ結合体構成要素の双方に対して特異的抗体
反応を引き起こすことができることを示している。
Ｏ−PSを単離したLPSを提供した菌株が表３に示され
る。これらの12の血清型は、これらの血清型を発現する
大腸菌（E.coli）がしばしば菌血症と関連していること
を示した血清疫学研究に基づき選択された。これらの特
定の菌株は、完全なＯ−PS側鎖をもつ滑らかなLPSを多
量につくりだすことを指標に選択された。その際、LPS
はドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の後、銀染色して得られるバンドにより解析し
た。これらの特性を示す他の菌株も必ずしも同じ結果に
はならないかもしれないが、使用できる可能性がある。
異なる血清型のＯ−PSからつくられた12の単価Ｏ−PS
−毒素Ａ結合ワクチンの組成（Ｏ−PSと毒素Ａとの比）
が表４に示された。これらの単価結合体は多価ワクチン
作成のために結合された。結合体は33.4％から54.7％の
Ｏ−PSと46.3％から66.6％の毒素Ａから構成された。従
って、毒素Ａに対するＯ−PSの比は血清型によって異な
るが、各結合体は最低30重量％のＯ−PSを含むことが好
ましい。
多価結合ワクチンの、12のLPS血清型各々及び毒素Ａ
に対して免疫グロブリンＧ（IgG）抗体反応をウサギに
引き起こす能力が表５に示される。免疫により、13のワ
クチン抗原（12のLPS血清型及び毒素Ａ）総てに対しELI
SA平均IgG力価は４倍上昇する。
ウサギ（３羽）は第０日及び第14日に、12の血清型由来
のＯ−PS各々を25μｇに相当する量で含むワクチンで免
疫された。
多価Ｏ−PS−毒素Ａワクチンで免疫されたウサギの血
清から単離されたIgG抗体をマウスに受け身的に注入し
た際の、12の血清型の大腸菌（E.coli）の感染によって
おこる、致死的大腸菌（E.coli）敗血症実験に対する防
御能力が表６に示される。受け身的に投与されたIgG
は、実験した菌株が発現する８つの血清型総てに対し力
価が上昇した抗体を含んでおり、バッファーのみを接種
したコントロール群に比べ、死亡率を有意に減少させ
た。
12価大腸菌（E.coli）Ｏ−PS−毒素Ａ結合ワクチンで
免疫されたウサギ血清から精製されたおよそ3mgのIgGは
大腸菌（E.coli）の腹腔内（IP）投与より３−５時間前
にマウスにIP接種された。
ヒトにおける多価Ｏ−PS−毒素Ａワクチンの安全性及び
免疫原性 多価ワクチンは、表３に記載されている菌株から単離
された12の無菌単価結合体を毒素Ａに結合させることに
よって作成された。無菌性、発熱性、及び一般的安全性
テストはUnited States Code of Federal Regulations
21.610.に詳細が記載されている手順に従って行われ
た。この例に使用された多価結合ワクチンは43％のＯ−
PS及び57％の毒素Ａから構成されていた。このワクチン
は体重1Kg当たり12μｇの量をウサギに静脈投与したと
ころ非発熱性であった。再溶解したワクチンをマウス及
びモルモットにそれぞれ0.5ml及び5ml腹腔内投与したと
ころ致死性及び明らかな毒性は見られなかった。ワクチ
ンは毒性の復帰に関して安定であった。従って、再溶解
し37℃で28日間保存した後、結合体の形での毒素Ａタン
パク質をマウス１匹当たり100μｇ腹膜内投与しても明
白な毒性を示さなかった。
健康な成人志願者に合計698μｇの結合体（合計300μ
ｇのＯ−PS［25μg/各血清型］及び398μｇの毒素Ａ）
を三角筋の筋肉中に0.5ml接種した。ワクチン接種後の
総ての反応は志願者によって、コントロールシートに記
入された。静脈血はワクチン接種の直前及びワクチン接
種後28日後にサンプル採取された。血清はCryz,S.J.,J
r.,Cross,A.S.,Sadoff,J.C.,Wegmann,A.,Que,J.U.,Fr
er,E.,"Escherichia coli 018 O−特異的多糖（Ｏ−P
S）−毒素Ａ及びＯ−PS−コレラ毒素結合ワクチンのヒ
トにおける安全性及び免疫原性”J.Infect.Dis．163:10
40−1045（1991）に記載されている方法により集められ
た。
ワクチン接種に対する反応は下記の表７に詳細が記載
されている。多くの（85％）被ワクチン接種者が注入部
位の軽い痛みを報告し、腫れおよび赤みをそれぞれ30％
および20％の被験者が報告した。３人の被験者だけが頭
痛（１）と不快感（２）からなる全身的な反応を報告し
た。正常な活動を妨げる反応は無く、すべての反応は24
−72時間以内に自然解消された。
20名の健康な成人志願者にワクチン各血清型につき25μ
ｇのＯ−PSを含むワクチンを、１回、筋肉中に接種し
た。
下記の表８に示されるように、多価Ｏ−PS−毒素Ａ結
合ワクチンでの免疫は12血清型のうち、血清型016（1.4
倍の上昇）を除く11の血清型に対する抗LPS IgG価を実
質的に増加させた。平均増加倍率は2.8倍（012）から20
倍（06）であった。抗LPS IgGレベルが＜10μg/mlであ
った被験者ではさらに著しい増加を示したことは特筆す
べきことである。この種の高レベル（＞10μg/ml）の未
刺激特異的抗体による”エピトープ抑制”は文献に広く
記載されている。
被験者はワクチンの12の血清型Ｏ−PSを各25μｇ含む量
を１回、第０日目に接種された。
本発明の好ましい態様はこの文書中に記載されてきる
が、様々な、特に組み入れられるＯ−PSの血清型の数に
関するワクチンの系統的論述に関して、変更及び修飾が
下記の請求の中に定義されている発明の範囲から外れる
事なく、当事者によってなされることは明らかである。
この文書中の総ての文献はここに参考文献として引用
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ. 163 （Ｍａｙ 1991），ＰＰ．1040− 1045 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．58，Ｎｏ．２ （1990），ＰＰ．373−377 国際公開第90／13660号パンフレット

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）以下の工程： （ａ）完全なＯ−多糖側鎖を発現する大腸菌（E.coli）
    からリポ多糖を精製し； （ｂ）工程（ａ）で得られたリポ多糖分子のＯ−多糖領
    域を希酸中での加水分解によって単離して、当該Ｏ−多
    糖からリピドＡを取り除き； （ｃ）Ｏ−多糖の酸化され得る還元糖の40％ないし80％
    を酸化し、その際、免疫原性は保持されたまま活性なア
    ルデヒド基が産生される； （ｄ）工程（ｃ）で得られた酸化されたＯ−多糖を単離
    し； （ｅ）工程（ｄ）で得られた単離された酸化Ｏ−多糖
    を、該酸化多糖のヒドロキシル基あるいはカルボキシル
    基を介して担体タンパク質と共有結合させる： からなる工程によって、Ｏ−多糖血清型01、02、04、0
    6、07、08、012、015、016、018、025および075の各々
    から単価ワクチンを調製し；そして （ii）工程（ａ）−（ｅ）によって得られた異なる血清
    型の12の単価ワクチンを一緒にして多価ワクチンを産生
    する； ことから成る、多価大腸菌（E.Coli）ワクチンを製造す
    る方法。
  2. 【請求項２】前記担体タンパク質が毒素Ａである、請求
    項１の方法。
  3. 【請求項３】毒素Ａをスペーサー分子に結合させ、そし
    て、当該スペーサー分子は、段階（ｃ）で得られた酸化
    Ｏ−多糖に、当該Ｏ−多糖の少なくとも１つのヒドロキ
    シル基あるいはカルボキシル基を介して共有結合させる
    ことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】該スペーサー分子がアジピン酸ジヒドラジ
    ドである，請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】酸化剤がNaIO4である請求項１ないし４の
    いずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】（ｉ）以下の工程： （ａ）完全なＯ−多糖側鎖を発現する大腸菌（E.coli）
    からリポ多糖を精製し； （ｂ）工程（ａ）で得られたリポ多糖分子のＯ−多糖領
    域を希酸中での加水分解によって単離して、当該Ｏ−多
    糖からリピドＡを取り除き； （ｃ）Ｏ−多糖の酸化され得る還元糖の40％ないし80％
    を酸化し、その際、免疫原性は保持されたまま活性なア
    ルデヒド基が産生される； （ｄ）工程（ｃ）で得られた酸化されたＯ−多糖を単離
    し； （ｅ）アジピン酸ジヒドラジド（ADH）を毒素Ａに、当
    該毒素Ａが無毒化されるような条件下で共有結合して、
    毒素Ａ−ADHを形成し； （ｆ）前記毒素Ａ−ADHを工程（ｄ）で得られた酸化Ｏ
    −多糖に、該酸化多糖のヒドロキシル基あるいはカルボ
    キシル基を介して共有結合させて、Ｏ−多糖を少なくと
    も30重量％含む結合体を形成させる： からなる工程によって、Ｏ−多糖血清型01、02、04、0
    6、07、08、012、015、016、018、025および075の各々
    から単価ワクチンを調製し；そして （ii）工程（ａ）−（ｆ）によって得られた異なる血清
    型の12の単価ワクチンを一緒にして多価ワクチンを産生
    する； ことから成る、多価大腸菌（E.Coli）ワクチンを製造す
    る方法。
  7. 【請求項７】酸化剤がNaIO4である請求項６項に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】請求項１ないし７のいずれか１項に記載の
    方法によって製造された多価ワクチン。
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