KR20210092224A - 다가 당접합체 면역원성 조성물 - Google Patents

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Abstract

살모넬라 질환에 대한 다가 접합체 조성물이 개시된다. 4가, 3가 및 2가 조합물 형태의 당-접합체들로 이루어진 조합된 백신 조성물이 본 발명에서 개시된다.

Description

다가 당접합체 면역원성 조성물
관련 특허 출원
본 출원은 2018년 11월 10일자 인도 특허 출원번호 201841017672에 대해 우선권 혜택을 주장하며, 이 특허의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 백신과 같은 다당류 접합체 면역원성 조성물 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 다당류 접합체 조성물 분야에 관한 것이다. 본 발명의 조합된 접합체 백신 조성물은 살모넬라에 의해 유발되는 감염 및 장티푸스 열을 유발하는 비-장티푸스성 살모넬라 감염을 예방하기 위한 것이다.
인간에서 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)에 의해 유발된 감염은 주로 감염성 혈청형으로 인한 것이다. 장티푸스 열을 유발하는 침습성 감염의 대부분이 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 (S. typhi); 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라티피 A, B 및 C로 알려진 혈청형으로부터 기인한다.
살모넬라 엔테리카는 임상 감염을 유발하는 것으로 알려진 운동성, 호기성 또는 통성 혐기성 그람 음성 바실러스, 무아포성 박테리아이다. 살모넬라 엔테리카는 인간 임상 감염을 유발하는 것으로 알려진 2500종 이상의 혈청-변종들을 포함한다. 혈청형 살모넬라 피티는 인간에 국한된 병원체로서, 열, 복부 불편함 및 전두 두통을 특징으로 하는 장티푸스 열을 유발한다. 이들 혈청-변종은 장티푸스성 혈청형과 비-장티푸스성 혈청형 둘다 포함한다. 예를 들어, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 (S. Typhimurium)과 같은 혈청형은 자기-한정 위장염 (self-limiting gastroenteritis)을 유발하는데 반해, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 (S. typhi)는 장티푸스 열을 발생시킨다.
이러한 장티푸스 혈청 변종들은 인간에서 임상 감염을 유발하는 것으로 알려져 있지만, 비-장티푸스성 혈청형 (NTS)은 유아, 면역노화된 노인 및 면역-약화된 개체에서 침습성 임상 질환을 유발할 수 있다. 그래서, 이들 혈청 변종이 전세계적으로 주목할만한 이환율 및 사망률 추이의 원인일 수 있다.
사하라 사막 이남에 거주하는 집단, 특히 어린이는 장티푸스 및 침습성 NTS (iNTS) 질환에 더 많은 영향을 받는 것으로 보이는데, 취학 연령 어린이는 장티푸스에 더 취약한데 반해, 영유아는 iNTS 공격으로 병에 걸린다. 비-장티푸스성 살모넬라는 침습성일 수 있으며, 파라티푸스 열을 유발할 수 있어, 즉각적으로 항생제 치료를 실시하여야 한다. 사하라 사막 아프리카에서, iNTS 감염은 주로 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움과 같은 혈청형에 의해 발생되고, 치사률은 12-28%이다.
일부 지역에서는 장티푸스 질환만, 다른 지역에서는 iNTS만 발병하고, 또 다른 지역에서는 이들 2가지 유형의 감염이 모두 발병하는데, 이는 지리적 유행 가변성을 의미한다. 사하라 사막 이남 아프리카에서 확인되는 iNTS는 미국 및 유럽에서 확인되는 통상적인 위장염 NTS 균주와 근본적으로 구별된다.
살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 분석에서, 장티푸스 및 파라티푸스 혈청형에 존재하는 것과 유사한 새로운 다중-유전자 좌 서열 타입 및 유전자 분해 패턴이 확인되었다. 사하라 사막 이남 아프리카 원형의 살모넬라 티피무리움 혈액 분리주에 대한 병원형 분석에서, 염증 감소 및 배양 세포에서 세포내 생존성 강화가 확인되었으며, 인간을 제외한 영장류 모델에서 살모넬라 티피와 일반적으로 관련있는 표현형인 설사가 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
계속적인 연구 노력에도 불구하고, iNTS 감염의 소스 (reservoir)는 아직까지 밝혀지지 않아, 전파를 막기 위해 전통적인 환경적 개입을 구현하고자 하는 노력을 저지한다. Crump et al., "A Perspective on Invasive Salmonella Disease in Africa" Clin. Infect. Dis. 61(Suppl. 4), S235-S240 (2015년 10월 7일 온라인 입수가능). 여러가지 유형의 장티푸스 백신들이 이용가능하지만, 인간 NTS 백신은 현재까지 사용가능하지 않다.
미국 특허 번호 5,738,855 (Shousun Chen Szu et al.,)는 변형된 사카라이드 및 면역원성 접합체를 제조하는 방법을 교시하고 있다. 이것은, 살모넬라 티피의 Vi와 유사하게 항원 측면에서 변형된 사카라이드를 제공하기 위한, 구조적으로 변형된, 변형된 식물, 과실류 또는 합성 올리고당 또는 다당류일 수 있다. 변형된 사카라이드는 담체와 접합되어, 살모넬라 티피에 대해 면역원성을 가진 접합체를 형성할 수 있다. 면역원성 접합체에 반응하여 형성된 항체는 장티푸스 열을 방지한다.
미국 특허 번호 3,856,935 (R Germanier)는 자외선 조사 처리된 살모넬라 티피 균주 ty2를 이용한 백신 제조 방법 및 경구 장티푸스 백신을 교시하고 있다. 여기서 생성된 돌연변이를 스크리닝하여, 효소 우리딘 다이포스포갈락토스-4-에피머라제에 결함이 있는 균주를 선별한다. 일반적인 방식으로 선별되고 조심스럽게 단리한 균주로부터 생 백신을 제조한다. 균주는 또한 모 균주와 비교해 갈락토키나제 및 갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴 트랜스퍼라제 활성의 현저한 감소에 의해 식별된다.
중국 특허 번호 1404873A는 장티푸스 Vi 다당류를 담체 단백질에 공유 접합하여, 인간 및 기타 포유류에서 능동 면역을 구현하고 장티푸스 감염을 예방하는데 이용가능한 접합 백신을 제조하는 것을 교시하고 있다. 장티푸스 Vi 다당류는 단백질과의 접합 후, 장티푸스 Vi 항원에 대한 유기체의 인지 방식을, 모든 인간 면역에 이용가능하고 면역 부스팅에 명백한 효과를 가진 T 세포 의존적인 항원으로, 대체한다.
미국 특허 번호 9,011,871 (Myron M. et al.)는, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 콜레라수이스, 살모넬라 티피, 살모넬라 파라티피 A 및 살모넬라 파라티피 B의 접합체를 포함하되, 접합체가 합텐 항원 또는 담체 항원을 포함하고, 합텐 항원 또는 담체 항원 중 하나 이상이 살모넬라 엔테리카 혈청형의 특징인, 다가 살모넬라 엔테리카 혈청형 접합 백신에 대해 교시하고 있다. 이 문헌에는 또한 다가 접합체 백신 및 백신으로서 사용하기 위한 약독화된 살모넬라 엔테리카 혈청형을 생산하기 위한 살모넬라 엔테리카 혈청형 시약 균주가 제공된다.
미국 특허 번호 9,050,283 (Myron M. et al.)은 약독화된 살모넬라 혈청형 균주 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 엔테리티디스; 플라젤린 단백질에 공유 결합된 O 다당류를 포함하는 상기한 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 균주로부터 유래된 접합체 백신, 및 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 기술하고 있다.
WO 2015/029056 A1 (Ella et al.)은, 살모넬라 티피를 예방하기 위한 안정적인 접합체 백신 제형, 및 살모넬라 티피에 의해 유발되는 장티푸스 열에 대해 개선된 T-의존적인 면역 반응 구현에 기여하는 담체 단백질로서 파상풍 톡소이드를 살모넬라 티피의 Vi 다당류와 접합하는 방법을 교시하고 있다. 이 발명에 기술된 방법 및 수득되는 제형은 완전한 백신 접종 스케줄을 포함하기 위해 단 1회 주사를 통해 2살 미만의 어린이 등에게 장티푸스 열에 대한 면역을 유발할 수 있다.
장티푸스 Vi에 대한 접합체 백신 (Typbar-TCV®)은 2013년에 출시되었다. 이 백신은 인도 및 다른 국가들에서 매우 많은 수의 영아, 유아, 어린이 및 성인에게 접종되었다. 그래서, 이미 Typbar-TCV®의 안전성과 면역원성에 대해서는 상당한 추적 기록들이 누적되어 있다.
여러가지 형태의 장티푸스 백신들이 사용되고 있지만, 이용가능한 인간 NTS 백신은 없는 실정이다. 이에, 장티푸스를 유발하는 살모넬라 감염과 파라티푸스 열을 유발하는 비-장티푸스성 살모넬라 감염 (NTS)을 예방하는 면역원성 조성물이 당해 기술 분야에서 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 살모넬라의 장티푸스 혈청형 및/또는 비-장티푸스 혈청형의 2종 이상의 항원을 포함하고, 각각의 항원이 하나 이상의 담체 분자에 접합된, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 살모넬라의 장티푸스 혈청형 및/또는 비-장티푸스 혈청형의 2종 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 살모넬라 감염의 예방 및 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 살모넬라의 장티푸스 혈청형 및/또는 비-장티푸스 혈청형의 2종 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 다당류 접합체 면역원성 조성물, 및 다당류 접합체 면역원성 조성물들로 이루어진 조합된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 바람직하게는, 살모넬라에 의해 유발되는 감염 및 장티푸스 열을 유발하는 비-장티푸스성 살모넬라 감염에 대한 예방을 제공한다. 치료 또는 예방할 수 있는 살모넬라 및 비-장티푸스성 살모넬라 감염 유형으로는, 비-제한적으로, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피, 살모넬라 파라티피 A, B 및/또는 C, 및 이들의 조합 감염을 포함한다. 면역원성 조성물은 또한 수막구균성 (Meningococcal) 감염을 예방 또는 치료하기 위해 구축될 수 있다.
본 발명의 주요 측면은 하기 항원들 중 2 이상을 포함하고, 각각의 항원이 하나 이상의 담체 분자에 접합된, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다:
살모넬라 엔테리티디스의 항원;
살모넬라 티피무리움의 항원;
살모넬라 티피의 항원; 및/또는
살모넬라 파라티피의 항원.
일부 구현예에서, 하나 이상의 담체 분자가 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A (Pseudomonas exoprotein A), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertusis) 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens) 톡소이드, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 외막 복합체, rEPA, 호모필러스 인플루엔자 (Hemophilus influenzae 단백질 D, 플라젤린 Fli C (Flagellin Fli C), 호르세슈 크랩 (Horseshoe crab) 헤모시아닌, 및 이들의 단편, 유도체 및 변형체 중 하나 이상을 포함하는, 전술한 면역원성 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 PBS 및 Tween 80과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 2-페녹시 에탄올과 같은 안정화제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 보강제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물에는 각각의 항원 접합체는 용량 범위 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여로 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 하기로부터 선택되는 2종의 항원 성분을 포함한다:
a. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피무리움의 항원;
b. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피의 항원;
c. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원;
d. 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원; 또는
e. 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 하기로부터 선택되는 3종의 항원 성분을 포함한다:
a. 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원;
b. 3종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원; 또는
c. 살모넬라 티피무리움의 항원, 살모넬라 티피의 항원, 및 살모넬라 파라티피의 항원.
다른 측면에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 살모넬라 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 비경구 투여하는 것을 포함하는 살모넬라 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 일부 다른 구현예에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하고, 투여시 항체 역가가 8배 증가하는, 살모넬라 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 하기를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다:
2종 이상의 항원을 제공하는 단계;
2종 이상의 항원에 담체 분자를 접합하는 단계; 및
각각의 접합체를 용량 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여로 준비하는 단계.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물을 제조하기 위한 접합 방법은 하기에 의해 수행된다:
항원을 아디프산 다이하이드라지드 (ADH)를 이용해 카르보디이미드 매개 변형하여 반응성 하이드라지드 기를 도입한 다음, 이 기를 이용해 제2 카르보디이미드 단계에서 담체 분자와 연결하는 방식,
항원을 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)를 이용해 유도체화하여 말레이미드 모이어티를 도입한 다음, 이 모이어티를 티오 에테르 결합 형성을 통해 유도체화된 분자의 반응성 설프하이드릴와 연결하는 방식, 또는
CDAP 화학 반응.
본 발명의 일 구현예는 살모넬라 엔테리티디스의 항원; 살모넬라 티피무리움의 항원; 살모넬라 티피의 항원; 살모넬라 파라티피의 항원 A; 및 비-장티푸스성 살모넬라 미생물의 항원 중 하나 이상을 포함하고; 각각의 항원이 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된, 조합된 접합체 면역원성 조성물에 관한 것이다. 각각에 대한 항원은 미생물의 단리된 면역원성 분획, 예를 들어 다당류, 및/또는 협막다당 (capsular polysaccharide), 및/또는 약독화된 미생물 전체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물의 담체 단백질 또는 펩타이드는 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린겐스 톡소이드, 에셰리키아 콜라이 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, rEPA, 호모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 호르세슈 크랩 헤모시아닌, 및 이들의 단편, 유도체 및 변형체, 또는 다른 통상적인 단백질 접합체 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물의 각각의 접합체는 용량 범위 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여로 제형화된다. 바람직하게는, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 안정화제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 완충제를 포함유한다. 바람직한 안정화제로는, 예를 들어, 2-페녹시 에탄올 등이 있으며, 바람직한 완충제로는, 비-제한적으로, 예를 들어 Tween 80과 같은 비-이온성 디터전트가 첨가 또는 비첨가된, PBS 완충제 등이 있으며, 바람직하게는 pH 약 6.5 내지 약 7.5의 PBS 완충제 등이 있다.
바람직하게는, 면역원성 조성물은, 제1 담체 단백질에 접합된 살모넬라 엔테리티디스의 항원; 제2 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 티피무리움의 항원; 제3 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 티피의 항원; 제4 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 파라티피 A의 항원; 및 제5 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 비-장티푸스성 살모넬라 미생물의 항원 중 2종 이상을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 면역원성 조성물은, 제1 담체 단백질에 접합된 살모넬라 엔테리티디스의 항원; 제2 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 티피무리움의 항원; 제3 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 티피의 항원; 제4 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 살모넬라 파라티피 A의 항원; 및 제5 담체 단백질 또는 펩타이드에 접합된 비-장티푸스성 살모넬라 미생물의 항원 중 3종 이상을 포함한다. 각각의 담체 분자는 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있다. 특히 바람직한 조합은 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 티피 각각으로부터 유래된 항원, 또는 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 각각으로부터 유래된 항원, 또는 살모넬라 티피 Vi 및 살모넬라 파라티피 A 각각으로부터 유래된 항원을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, 본원의 임의의 다른 면역원성 조성물과 조합될 수 있는 다당류 또는 당접합체와 같이, 수막구균성 미생물의 하나 이상의 항원을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예 및 이점은 후술한 본원에 일부 기술되며, 부분적으로는 이러한 설명으로부터 자명해질 수 있거나 또는 본 발명을 실시함으로써 학습할 수 있다.
도 1은 살모넬라 엔테리티디스 COPS: FliC 접합체의 화학 합성 공정을 개괄적으로 도시한 것이다.
도 2는 살모넬라 티피무리움 COPS:FliC 접합체의 화학 합성 공정을 개괄적으로 도시한 것이다.
도 3은 살모넬라 티피Vi-TT (Typbar-TCV™) 접합체의 화학 합성 공정을 개괄적으로 도시한 것이다.
장티푸스 열은 간단히 장티푸스라고도 하며, 살모넬라에 기인한 박테리아 감염이다. 이들 박테리아는 감염된 개체의 장 및 혈액에서 군락을 형성하여, 현저한 수준의 이환률 및 사망률을 유발한다. 2000년도에, 장티푸스 열로 인해 약 2,170만건의 질병 건수와 약 217,000건의 사망이 발생하였으며, 대부분 5-19세 어린이와 청소년들에서 흔히 발생하였다. 일반적으로 원인이 되는 살모넬라 종 및 아종으로는 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피, 살모넬라 파라티피 및 이들 각각의 복수의 혈청형 (serotype 또는 serovar)을 포함한다. 아종 엔테리카의 2가지 주요 유형은 MLST 서브타입핑 방식을 토대로 ST1 및 ST2이다. 살모넬라의 비-장티푸스 혈청형 (NTS)은 특히 유아, 노년층 및 면역약화 개체들에서 침습적인 임상 질환을 유발한다. 장티푸스 열에 대한 백신은 존재하지만, 현재 iNTS 및 다수의 다른 혈청형에 대한 백신은 없는 실정이다. 전세계적으로 이용가능한 장티푸스 백신은 일반적으로 유아 및 노인과 같은 대부분의 취약 개체들에 투여하기에는 비현실적이다.
살모넬라의 장티푸스 혈청형 및/또는 비-장티푸스 혈청형으로 구성되는 면역원성 조성물, 이들 면역원성 조성물의 제조 방법 및 용도가, 놀랍게도, 살모넬라 감염을 예방 및/또는 치료하는데, 특히 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피, 살모넬라 파라피티 A, B 및 C, NTS 및 iNTS에 의해 유발되는 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 면역원성 조성물은 살모넬라 엔테리티디스의 항원; 살모넬라 티피무리움의 항원; 살모넬라 티피의 항원; 살모넬라 파라티피 A의 항원; 및 비-장티푸스성 살모넬라 미생물의 항원 중 하나 이상을 포함하고, 이들 각각의 항원에는 담체 단백질 또는 펩타이드가 접합된다. 각각에 대한 항원은 미생물의 단리된 면역원성 분획, 예를 들어 면역원성 다당류, 및/또는 협막다당, 및/또는 약독화된 미생물 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물의 담체 단백질 또는 펩타이드는 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 백일해 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린겐스 톡소이드, 에셰리키아 콜라이 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, rEPA, 호모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 호르세슈 크랩 헤모시아닌, 및 이들의 단편, 유도체 및 변형체, 또는 다른 통상적인 단백질 접합체 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 복수의 항원 성분들이 동일한 또는 복수의 담체 분자와 접합될 수 있지만, 각각의 항원이 담체 단백질 또는 펩타이드와 접합된다. 단백질 담체에 다당류의 접합은 전형적으로 면역원성을 개선한다. 바람직하게는, 접합은 통상적인 접합 공정을 통한 커플링, 예를 들어 시아닐화제, 예컨대 1-시아노-4-(다이메틸아미노)-피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP), 1-시아노벤조트리아졸 (1-CBT), 2-시아노피리다진-3(2H)-온 (2-CPO), 1-시아노이미다졸 (1-CI), 1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오르보레이트 (CPPT), 담체의 아디프산 다이하이드라지드 (ADH) 처리를 이용한 다당류의 카르보디이미드 매개 변형, 아미노옥시 티올 링커로 다당류 말단 2-케토-3-데옥시옥토네이트 (KDO) 카르보닐을 변형하여 KDO 케톤과 옥심 결합을 형성한 후 이를 소듐 시아노보로하이드라이드를 이용해 환원시키는 방식, 항원을 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)로 변형하여 말레이미드 모이어티를 도입한 다음 이를 티오 에테르 결합 형성을 통해 유도체화된 COPS 분자의 반응성 설프하이드릴과 연결시키는 방식, 또는 이들의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 하기로부터 선택되는 2종의 항원 성분을 포함한다:
a. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피무리움의 항원;
b. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피의 항원;
c. 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원;
d. 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원; 또는
e. 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 하기로부터 선택되는 3종의 항원 성분을 포함한다:
a. 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원;
b. 3종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원; 또는
c. 살모넬라 티피무리움의 항원, 살모넬라 티피의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원.
또한, 바람직하게는, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 안정화제 (예를 들어, 2-페녹시 에탄올), 완충제, 보존제 (예를 들어, Thiomersal)와 같은 보호제, 아미노산, 염, 벌킹제, 항산화제 및/또는 분산제를 포함한다. 안정화제 및 보호제를 사용해, 제조 및/또는 보관 중에, 특히 수송 조건이 문제일 수 있는 경우에 조성물의 효능 유지를 돕는다. 불안정성은 항원성 감소 및 효능 저하를 초래할 수 있다. 안정성에 영향을 미치는 인자는 온도, pH, 가수분해 및 단백질 또는 다당류 응집을 예를 들어 포함한다. 안정화제는, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 당, 젤라틴, 아미노산, 알코올, 오일 및 염을 포함한다. 바람직한 안정화제는, 예를 들어, 2-페녹시 에탄올이고, 바람직한 완충제는, 비-제한적으로, 폴리옥시에틸렌 또는 글리코시드를 기본 성분으로 하는, 비-이온성 디터전트가 첨가 또는 비-첨가된 PBS (포스페이트 완충화된 염수) 완충제이다. 바람직한 비-이온성 디터전트는, 예를 들어, Tween (예를 들어, Tween 20; Tween 80), Triton (예를 들어, TX-100), 및 Brij 시리즈 디터전트이다. 바람직하게는, 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.5, 더 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0, 보다 더 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 바람직하게는, 개별 환자 및 상황에 따라 투여되는 용량은 더 많거나 또는 적을 순 있지만, 면역조성물의 각각의 접합체는 용량 범위 약 1 ㎍/투여 내지 약 100 ㎍/투여, 더 바람직하게는 약 2.5 ㎍/투여 내지 약 50 ㎍/투여, 보다 더 바람직하게는 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여 범위로 제형화된다.
또한, 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 보강제를 포함할 수 있다. 보강제는 다른 물질의 효과를 변형하는 약리학적 또는 면역학적 물질이다. 보강제는 면역 반응을 부스팅하여 더 많은 항체를 생성시키고 보다 장기간 지속되는 면역을 구현하기 위해, 따라서 항원의 필요 용량을 최소화하기 위해, 백신에 첨가될 수 있다. 보강제는 또한 면역계 세포의 특정 유형에 대해 면역 반응 변형을 보조함으로써, 예를 들어 백신의 목적에 따라 항체-분비성 B 세포 대신 T 세포를 활성화함으로써, 백신의 효능을 강화하기 위해 이용할 수 있다. 바람직한 보강제는, 비-제한적으로, 진통성 보강제, 무기 화합물, 예를 들어 알럼 (alum), 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트 하이드록사이드, 미네랄 오일, 파라핀 오일, 박테리아 산물, 예를 들어 박테리아 사균 (예를 들어, 보르데텔라 백일해, 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 박테리아 톡소이드), 사이토카인 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-12), 프로인드 완전 보강제, 프로인드 불완전 보강제 및 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다:
2종 이상의 항원을 제공하는 단계;
상기 2종 이상의 항원 각각에 담체 분자를 접합하는 단계; 및
각각의 접합체를 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여의 용량으로 준비하는 단계.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물을 제조하기 위한 접합 방법은 하기에 의해 수행된다:
아디프산 다이하이드라지드 (ADH)를 이용하여 항원을 카르보디이미드 매개 변형하여 반응성 하이드라지드 기를 도입한 다음 이를 제2 카르보디이미드 단계에서 담체 분자와 연결하는 방식;
아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)를 이용해 항원을 유도체화하여 말레이미드 모이어티를 도입한 다음 이를 티오 에테르 결합 형성을 통해 유도체화된 분자의 반응성 설프하이드릴와 연결하는 방식; 또는
CDAP 화학 반응.
본 발명의 일 구현예는, 살모넬라 티피 Vi 다당류를 아디프산 다이하이드라지드 (ADH)를 이용해 카르보디이미드 매개 변형하여 반응성 하이드라지드 기를 도입한 다음 이를 제2 카르보디이미드 단계를 통해 파상풍 톡소이드 (TT)와 연결함으로써 접합된 살모넬라 티피 Vi를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, 카르보디이미드를 이용해 ADH로 유도체화된 상동적인 혈청형 FliC 플라젤린 단백질 서브유닛을 살모넬라 엔테리티디스 코어-O 다당류 (COPS)에 연결하기 위한 1-시아노-4-다이메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP) 화학반응에 의해, 또는 다당류 말단 2-케토-3-데옥시옥토네이트 (KDO) 카르보닐에서 아미노옥시티올 링커로 변형함으로써, 접합된 살모넬라 피라티피를 포함한다. 아미노옥시는 KDO 케톤과 옥심 결합을 형성하고, 이는 소듐 시아노보로하이드라이드를 이용해 추가적으로 환원된다.
본 발명의 다른 구현예는, 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)를 이용해 유도체화하여 말레이미드 모이어티를 도입한 다음 이를 티오 에테르 결합 형성을 통해 유도체화된 COPS 분자의 반응성 설프하이드릴과 연결시킨, 살모넬라 티피무리움 FliC 단백질 접합체를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, 2-케토-3-데옥시옥토네이트 (KDO) 카르보닐에서 아미노옥시 티올 링커를 이용한 변형에 의해 제조된, 살모넬라 티피무리움 접합체 구성성분을 포함한다. 아미노옥시는 KDO 케톤과 옥심 결합을 형성하고, 이는 추가적으로 소듐 시아노보로하이드라이드를 이용해 환원된다. 살모넬라 티피무리움 FliC 단백질은 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)를 이용해 유도체화하여 말레이미드 모이어티가 도입되고, 이후 티오에테르 결합 형성을 통해 유도체화된 COPS 분자의 반응성 설프하이드릴과 연결된다. 본원에 기술된 바와 같이 살모넬라 티피무리움 당접합체에 적용되는 특수한 접합 방법이 활용된 인간 용도의 접합체 백신은 없다.
본 발명의 다른 구현예는 카르보디이미드를 이용해 ADH로 유도체화된 상동적인 혈청형 FliC 플라젤린 단백질 서브유닛을 살모넬라 엔테리티디스 코어-O 다당류 (COPS)에 연결하기 위한 1-시아노-4-다이메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP) 화학반응에 의해 구축된 살모넬라 엔테리티디스 접합체를 포함한다.
다른 측면에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 살모넬라 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 비경구 투여하는 것을 포함하는, 살모넬라 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 다른 구현예에서, 환자에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하며, 투여시 항체 역가의 8배 증가가 달성되는, 살모넬라 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원의 접합체를 환자에게 투여하는 것이다. 투여는 예방 또는 치료 목적일 수 있으며, 경구 투여, 코 투여, 정맥내, 근육내 또는 복막내를 통한 투여와 같은 주입, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 투여는 1회 투여를 포함하지만, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상과 같은 복수 투여를 포함할 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 구현예를 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 백신 제조
본 발명의 조합된 글리콜-접합체 백신은 표 1에 제시된다.
표 1: 본 발명에 따른 백신
백신 범주 설명
1가 살모넬라 파라티피 A 접합 백신 (1회 투여) 5-30 ㎍/투여, PBS 완충제 pH: 6.5-7.5
살모넬라 파라티피 A 접합 백신 (다회 투여) 5-30 ㎍/투여, 2-페녹시 에탄올, PBS 완충제 pH: 6.5-7.5
2가 2가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체 및 살모넬라 파라티피 A 접합체를 포함함, (1회 투여), 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 + tween 80, pH: 6.5-7.5
2가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체 및 살모넬라 파라티피 A 접합체를 포함함 (다회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 + tween 80, 2-페녹시 에탄올, pH: 6.5-7.5
2가 2가 접합 백신은 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (1회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 pH: 6.5-7.5
2가 접합 백신은 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (다회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 + tween 80, 2-페녹시 에탄올, pH: 6.5-7.5
3가 3가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체, 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (1회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 pH: 6.5-7.5
3가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체, 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (다회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 + tween 80, 2-페녹시 에탄올, pH: 6.5-7.5
4가 4가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체, 살모넬라 파라티피 A 접합체, 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (1회 투여) 5-30 ㎍ 씩/투여, PBS 완충제 pH: 6.5-7.5
4가 접합 백신은 살모넬라 티피 Vi 접합체, 살모넬라 파라티피 A 접합체, 살모넬라 엔테리티디스 접합체 및 살모넬라 티피무리움 접합체를 포함함 (다회 투여) 5-30 ㎍/투여, PBS 완충제 + tween 80, 2-페녹시 에탄올, pH: 6.5-7.5
조합 수막구균성 1 접합 백신 보존제로서 페녹시 에탄올과 조합된 상기한 1가 (장티푸스), 2가, 3가 또는 4가 조합 중 임의의 것과 혼합된 수막구균성 다당류 또는 당접합체.
실시예 2: 백신의 제조 방법
A. 살모넬라 엔테리티디스 COPS:FliC 접합체의 제조:
살모넬라 엔테리티디스 COPS와 살모넬라 엔테리티디스 FliC의 접합은 시아닐화 화학반응으로 달성하여, 복수의 랜덤 COPS 하이드록시에서 단백질의 복수의 랜덤 일차 아민 및 하이드라지드와 가교된 격자 (lattice) 접합체를 제조한다. 이를 위해, 단백질을 먼저 단백질 카르복실에서 카르보디이미드를 이용하여 아디프산 다이하이드라지드로 유도체화한다. 별도로, COPS를 CDAP로 유도체화하여, 다당류 하이드록실에 반응성 시아네이트 기를 도입한다. 유도체화된 단백질과 활성화된 다당류는, 단백질과 다당류가 복수의 지점에서 서로 연결되게, 서로 혼합하고; 이로써 연결 지점의 분포 및 분자량 측면에서 다양한 이종적인 격자들이 형성된다. 도 1은 살모넬라 엔테리티디스 COPS: FliC 접합체를 화학 합성하는 공정의 개괄도 보여준다.
단백질 활성화: 살모넬라 엔테리티디스 FliC (0.9% 식염수에 보관)를 > 6.0 mg/ml로 농축한 다음 0.1% Tween 20에 첨가하였으며, 이때 HPLC-SEC에 의해 모노머 형태를 검증하였다. 폴리머인 것으로 확인되면, 5±3℃에서 30분간 pH 2로 낮추어 모노머화한 다음 NaOH를 첨가하여 pH 7로 높인다. 그런 다음, 5±3℃에서 17±1 시간 동안 용액 5 mg/mL EDC를 제조함으로써, FliC를 100mM MES 중의 0.5M ADH를 이용해 0.5M 아디프산 다이하이드라지드 (ADH)로 유도체화한다. 이후, FliC-ADH를 40 부피배의 보레이트-완충제 pH 9.2에 대해 10 kDa TFF를 사용해 정용여과한다. 접합 공정을 수행하기 전에 TNBS 분석으로 단백질 ADH 표지 및 유리 ADH의 제거를 검증한다.
다당류 활성화: 살모넬라 엔테리티디스 COPS를 5±3℃에서 WFI 중의 10 mg/ml로 준비한다. 그런 후, CDAP (아세토니트릴 중의 100 mg/ml)를 0.5 mg:mg 비율로 용해된 COPS에 첨가하여, 5±3℃에서 30초간 인큐베이션하고, 이때 2.5 M DMAP를 첨가하여 pH 9.5로 조정한다. 5±3℃에서 6분간 인큐베이션한 후, 활성화된 COPS는, FliC-ADH 첨가를 통한 접합에 즉시 사용한다.
접합 공정: 신선하게 활성화된 COPS-CN을 FliC-ADH에 1:1 mg:mg 비율로 첨가하고, 5±3℃에서 17±1 시간 동안 계속 교반하면서 인큐베이션한다. 0.2M 글리신-HCl을 첨가하여 실온에서 24시간 교반함으로써 접합 반응을 퀀칭한다.
미반응 성분으로부터 DS 정제: 접합 조산물을 15분간 4℃에서 4000±200 rpm으로 원심분리하고, 불용성 물질 펠렛은 버린다. 맑은 상층액을 K-Prime 크로마토그래피 시스템에 부착된 Superdex 200 PG 컬럼을 사용해 10 mM PBS 중에 분획화한다. 고 분자량 접합체가 함유된 분획에서 단백질 및 탄수화물을 분석한다. 적절한 선택 분획을 모아 농축하고, 15 부피배의 10mM PBS pH 7.1에서 10 kDa TFF에 대해 정용 여과한다. 최종 농축된 COPS: FliC 접합체 벌크를 무균 조건 하에 0.22 μm로 무균 여과하여, 2-8℃에 보관한다.
미반응 활성 기들의 캡핑: CDAP를 이용한 COPS의 활성화 및 ADH를 이용한 FliC의 활성화는, 각각 시아네이트 에스테르 기 및 하이드라지드 기를, 접합 중에 서로 반응하여 아미드 기를 형성하는 분자에, 도입한다. 이 반응이 효율적이고 왕성해 화학적 연결이 계속 형성됨에도 불구하고, 이들 활성화된 기들 중 일부는 접합 중에 미반응된 채 남아있다. 잔류 COPS 시아네이트 에스테르를 퀀칭하기 위해, 과량의 글리신을 혼합물에 첨가하여, 남아있는 미반응 시아네이트 기와 반응시키고, 글리신에 공유 결합을 형성함으로써 이를 캡핑한다. 이러한 캡핑 공정은 시아네이트 에스테르에 특이적이므로, 글리신 첨가시 다른 변화는 발생되지 않을 것으로 예상된다. 비등한 접근 방식은, 반응성 기가 일차 아민이고 퀀칭 시약이 물론 단백질 아미노산 측쇄 (예, 라이신)에 존재하는 일차 아민과 광의적으로 반응하여 신생-에피토프를 형성할 것이므로, 미반응 하이드라지드를 퀀칭하기 위해 쉽게 실행할 수 없다. 본 발명자들은, 접합 중에, 다수의 하이드라지드가 반응에 의해 소모되어 일부만 비-캡핑된 채 남겨진다는 것을, 알게 되었다 (부록 VII-9의 리포트 참조). 그러나, 계산된 ADH 잔류 수준 < 2 ㎍/투여 (dose)은 120 ㎍ 1회 투여시 허용되는 계산된 일일 노출값보다 낮아 (Gadd 독성학 평가 참조, 부록 VII-10), 미반응 하이드라지드를 확실히 캡핑하지 못한다. 이 백신은 WHO로부터 허가 및 사전 검증되었으며, 안전하고 효과적인 것으로 확인된 성인 및 어린이 수십만명에게 투여된 바 있다.
B. 살모넬라 티피무리움 COPS:FliC 접합체의 제조:
살모넬라 티피무리움 COPS는 OPS 반복 유닛의 아비퀴스 및 람노스 단당류 둘다에서 가변적으로 O-아세틸화된다. OPS O-아세틸을 보존하기 위해, 살모넬라 티피무리움 COPS:FliC 접합체는 중성 내지 약산성 pH에서 수행되는 방법으로 합성한다. 이는, 서로 반응해 접합체를 형성하는 링커로 COPS 및 FliC를 유도체화함으로써, 달성된다. KDO 카르보닐은 아미노옥시-티올 링커로 변형되고, 소듐 시아노보로하이드라이드와의 반응시 옥심 결합을 가진 OPS 환원성-말단 종결기에 연결되는 설프하이드릴 기가 형성된다. 단백질은, 일차 아민 함유 측쇄를 가진 단백질 아미노산 (예, 라이신)에 티올-반응성 말레이미드를 배치하는, GMBS로 유도체화된다. 접합체는 활성화된 COPS와 FliC의 혼합시 쉽게 형성되어, 복수의 FliC 부위에서 서로 다른 COPS 분자들의 환원-말단을 연결하는 "선-타입 (sun-type)" 접합체가 형성된다. 도 2는 살모넬라 티피무리움 COPS:FliC 접합체를 화학 합성하기 위한 공정의 개괄을 제공해준다.
다당류 활성화: 살모넬라 티피무리움 COPS를 WFI 중의 10 mg/ml로 준비하고, 다당류 환원성 말단 2-케토-3-데옥시옥토네이트 (KDO) 카르보닐에서 1:5 mg:mg 비율의 아미노옥시 티올 링커 (O-3-머캅토-프로필-하이드록실-아민)으로 유도체화한다. 이 반응에서, 링커 아미노옥시 기는 KDO 카르보닐과 옥심 결합을 형성한다. 이 반응은 실온에서 18±1시간 동안 부드럽게 교반하면서 pH 5.3에서 인큐베이션하고, 이때 혼합물을 10 mM 소듐 시아노보로하이드라이드에 첨가하여 실온에서 다시 2.5시간 동안 인큐베이션하여 옥심 결합을 환원시킨다. 이 혼합물을 4℃에서 4000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 수집한 다음 10kDa TFF 막을 이용해 20 부피배의 10mM PBS 5mM EDTA 0.1% Tween 20 (pH 6.8)에 대해 정용 여과하여, 접합 반응에 사용하기 전에 미반응 링커를 제거한다. 접합에 사용하기 전에, 총 COPS를 측정하기 위한 레조르시놀 다당류 분석 및 유리 티올 기를 측정하기 위한 DTNB 분석으로 티올:다당류 비율을 조사함으로써 아미노옥시 티올 링커를 이용한 COPS 표지를 검증한다.
단백질 활성화: 살모넬라 티피무리움 FliC (0.9% 식염수에 보관)를 > 6.0 mg/ml로 농축하여, HPLC-SEC에 의해 모노머 형태를 검증한 다음, 0.1% Tween 20에 첨가한다. 폴리머인 것으로 확인되면, 5±3℃에서 30분간 pH 2로 낮추어 모노머화한 다음 NaOH를 첨가하여 pH 7로 높인다. FliC 모노머를 100mM PBS pH 7.4에 첨가한 다음 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)로 표지하여 단백질 라이신에서 말레이미드 모이어티를 도입한다. 이를 위해, GMBS를 DMSO 중에 제조한 다음 서서히 교반하면서 FliC를 30:1 몰 비율로 1시간 동안 실온에서 첨가한다. 그런 후, 표지된 단백질을 미반응 링커 및 용매로부터 10 kDa TFF 및 10 부피배의 10mM PBS + 5mM EDTA pH 6.8을 이용해 즉시 정제하고, 수용액 중에 느리게 가수분해되는 말레이미드 기의 반응성을 최대화하기 위해 접합에 이용한다.
접합 공정: 정제된 COPS-SH를 FliC-GMBS에 2.8:1 mg:mg 비율로 첨가하고, 실온에서 pH 7.4 하에 12±01시간 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션한다. 50mM 2-머캅토에타놀을 첨가하여 반응을 퀀칭하고, 1시간 동안 RT에서 교반 하에 인큐베이션한다. 티올-표지된 COPS 및 말레이미드-표지된 FliC를 2.8:1 COPS-티올:FliC-말레이미드 비율로 혼합하고, 부드럽게 혼합하면서 2-8℃에서 12-18시간 동안 인큐베이션한다.
미반응 구성성분으로부터 DS 정제: 조산물 접합체를 4℃에서 15분간 4000±200 rpm으로 원심분리하고, 불용성 물질 펠렛은 버린다. 맑은 상층액을 K-Prime 크로마토그래피 시스템에 부착된 Superdex 200 PG 컬럼을 사용해 10 mM PBS 중에 분획화한다. 고 분자량 접합체가 함유된 분획을 분석하고, 선별하여 모은다. 적절한 선택 분획을 모아 농축하고, 15 부피배의 10mM PBS pH 7.1에 대해 10 kDa TFF에 의해 정용 여과한다. 최종 농축된 COPS: FliC 접합체 벌크를 무균 조건 하에 0.22 μm로 무균 여과하여, 2-8℃에 보관한다.
미반응 활성 기들의 캡핑: COPS 유도체화에 사용되는 아미노옥시-티올 링커는 각 말단에 독특한 기 (아미노옥시 및 설프하이드릴)를 가진 헤테로-2 관능성 링커이다. 아미노옥시 기가 COPS (KDO 상의 카르보닐)와 반응하는 경우, 이는 아미노옥시 관능기를 캡핑해, 표지된 COPS로부터 미반응 링커를 제거한다. 따라서, 유리 링커의 부재시, 아미노옥시 기는 COPS에 의해 캡핑된 것으로 간주한다. 아미노옥시-티올 표지된 COPS의 말단에 존재하는 설프하이드릴의 연결은 활성 기를 캡핑시킨다. 따라서, 임의의 남아있는 비-캡핑된 티올은 비-연결된 유리 OPS와 본질적으로 관련되어 있다. FliC 단백질에는 GMBS를 이용한 변형 후 말레이미드 기가 부착된다. 남아있는 미반응 GMBS 링커는 TFF 여과로 제거한다. 말레이미드는 중성 pH에서 불안정하며, 빠르게 가수분해되며; 그래서 표지된/활성화된 다당류는 접합 효율을 최대화하기 위해 FliC 유도체화 후 빨리 첨가한다. 접합 중에 남아있을 수 있는 임의의 가능한 미반응 말레이미드를 캡핑하기 위해, β-머캅토에탄올 (βME)을 몰 과량으로 첨가하고, 이에 βME 설프하이드릴은 남아있는 활성 말레이미드 기와 반응하여 그 활성을 기능적으로 상실하게 된다.
C. S. Typhi ViPs - TT 접합체 ( Typbar - TCV ™)의 제조
Typbar-TCV™은 파상풍 톡소이드가 연결된 살모넬라 티피의 정제된 Vi 협막다당으로 구성된다. 접합체의 합성은 Vi를 먼저 ADH로 다당류 카르복실 기에서 카르보디이미드 화학 반응으로 유도체화한 다음, ADH 유도체화된 Vi를 파상풍 톡소이드 카르복실에 동일한 카르보디이미드 방식으로 연결함으로써, 이루어진다. 도 3은 살모넬라 티피Vi-TT (Typbar-TCV™) 접합체를 화학 합성하는 공정에 대한 개괄을 도시한다.
다당류 활성화: 살모넬라 티피 Vi PS 벌크 (-20℃에서 보관)를 실온에서 해동한다. 여기에 0.45 M 소듐 카보네이트 및 바이카보네이트 완충제를 15분간 2-8℃에서 부드럽게 교반함으로써, 벌크에서 부분적으로 탈-O-아세틸화 Vi로의 가수분해를 수행한 다음, 50% 빙초산을 사용해 pH 7로 적정한 후, RT에서 30 kDa TFF를 사용해 0.1M MES / 50 mM NaCl pH 6(MES 완충제)에 대해 완충제 교체를 수행한다. 부분적으로 탈-O-아세틸화 벌크에 ADH 및 EDC를 4시간 동안 2-8℃에서 처리해, 카르복시산 기를 ADH로 표지한다. 활성화된 다당류를 이후 완충제 교체하고, PBS에 대해 먼저 농축한 다음 300 kDa TFF를 사용해 MES 완충제에 대해 농축한다.
접합 공정: 파상풍 톡소이드 벌크를 완충제 교체하고, 30 kDa TFF를 사용해 MES 완충제 pH 5.8에 대해 농축한다. ADH-유도체화된 Vi 및 파상풍 톡소이드 벌크를 1:1 mg: mg 비율로, EDC의 존재 하에 2-8℃에서 혼합하고, 절합체 벌크의 점도가 특정 점도 한계 (cP)에 도달할 때까지 부드럽게 교반하면서 혼합한 다음 10-15분간 교반하면서 20mM EDTA pH 8.5를 첨가해 pH 7.4로 서서히 적정함으로써 반응을 퀀칭한다.
미반응 구성성분으로부터 DS 정제: 10 부피배의 10 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0과 이후 10 부피배의 10 mM PBS pH 7.1을 이용해 1,000 kDa TFF에 의해 퀀칭된 Vi:TT를 정제한다. 이 과정은 유리 Vi 및 단백질을 각각 20% 및 1% 미만으로 줄이는데 충분하다. 최종 정제된 접합체 벌크를 무균 조건 하에 0.22 μm 필터를 통해 무균 여과하고, QC 승인 대기 중에 2-8℃에서 보관한다.
미반응 활성 기의 캡핑: Vi는 ADH로 제한적인 방식으로 변형시키고, 과량의 TT 단백질을 첨가한 후 활성화된 Vi 상의 하이드라지드 기를 효율적으로 캡핑한다. Typbar-TCV™에서 캡핑되지 않은 하이드라지드의 잔류 수준이, 아마도 다음과 같은 요인으로 인해 실제 매우 낮게 확인되었다: i.) ADH를 이용한 유도체화가 준-포화 조건 (즉, 분자 당 수개의 하이드라지드)에서 이루어지고, ii.) 과량의 TT가 접합 반응에 첨가되어, 접합에 이용가능한 단백질 카르복실의 몰 비율이 다당류 하이드라지드에 대해 과잉으로 존재함.
뉴질랜드 화이트 토끼 암컷 및 수컷에 근육내 주사에 의해 투여하였을 경우, (1상 플라젤린 [FliC]에 대해 접합된 코어-O 다당류 [COPS]로 구성된 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 백신을 함유한) 2가 접합 백신, 및 (살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 COPS:FliC 접합 백신과 살모넬라 티피 Vi 접합 백신 [Typbar-TCV™]을 함유한) 3가 접합 백신의 14일 무처리 기간 동안 임의의 효과에 대한 지속성 또는 가역성과 잠재적인 국소 및 전신 독성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
동물들 모두 계획된 종료시까지 생존. 사망률, 임상 관찰, 신체 검사, 주사 부위 점수, 체중, 식품 섭취, 장기 무게, 장기 무게:체중 비율, 체온, 눈 검사 또는 뇨 분석에서 검체 (test article) 관련 부정적인 변화는 나타나지 않았다.
백신 부스트 투여 후, 검체 그룹에서는 급성 염증 반응을 의미하는 임상 병리 및 조직병리학적 특성에 변화가 나타났다.
검체 그룹에서 86/87일에 병리학적 변화는, 현미경 검경에서 이호성 (heterophilic) 및/또는 혼성 진피, 피하 및/또는 근육의 세포 염증 및 근세포 괴사 또는 변성으로 이루어진, 주사 부위에서 염증 병변을 포함하였다. 염증 세포는 주사 부위에서 관찰된 염증의 간접 효과로서 배액성 장골 림프절의 수질동 (medullary sinuse)에 존재하였다. 반응은 85일 투여 결과로서 좌측에서 더 만연된 상태이거나 및/또는 심각하였다. 전반적으로, 3가 다중 투여 백신 그룹 (그룹 4)은 2가 백신 투여 그룹에 비해 중증도가 약간 더 높았다. 2가 그룹과 다르게, 그룹 4 암컷들에서는 우측 (마지막 주사 57일) 및 좌측 (마지막 주사 85일)에서 주사 부위에 염증이 있는 것으로 관찰되었다.
검체 투여 그룹에서 급성 염증 반응에 대한 추가적인 지표는 86/87일에 호중구 및 단핵구 수치 증가, 및 1일 및 85일에 투여한 후 3일 및 86/87일에 피브리노겐 및 C-반응성 단백질 농도 상승을 포함하였다.
이러한 변화는 99/100일에 회수 희생시 관찰되지 않았으며, 이는 염증이 투여 기간 후 14일에 해소되었음을 의미한다.
실시예 3: 백신의 혈청학적 분석
2가 제형 및 3가 제형 둘다 독성 실험을 수행하였으나, 면역원성 실험은 3가 백신만 진행하였다. 2가 및 3가 제형 둘다 동일한 완충제 조성 및 동일한 강도의 개별 항원으로 설계되었다. 면역원성 실험을 조사하기 위해, 3가 제형만 선택하였는데, 그 이유는 3가 제형이 2가 제형의 구성성분들을 포함하기 때문이었다. 그 결과, 3가 제형이 항체의 높은 배수 증가를 나타내었으며, 이로써 별도의 백신으로서 2가 역시 각 질환에 대해 동일한 수준의 면역원성을 발휘할 것으로 예상된다.
3가 살모넬라 접합체 백신 약물 제품의 면역원성 실험:
다회-용량 바이얼 내 3가 살모넬라 접합 백신 약물과 다회-용량 및 1회-용량 바이얼 내 2가 살모넬라 접합 백신 약물 제품을 2-8℃에서 통제된 조건 하에 보관하였으며, 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 성분 모니터링에는 21개월 동안 검증된 분석을 이용할 수 없어, Vi 접합체 구성성분에 대해서만 안정성을 모니터링하였다.
본 발명은 3가 및 2가 접합 백신의 구성성분을 모니터링하기 위한 방법을 기술한다. 이는 (Vi 협막다당에 의해 영향을 받지 않는) 레조르시놀에 의해 총 COPS를 측정함으로써 수행하였다. 이후, 그룹 B 살모넬라의 면역우세 항원 4에 특이적인 강력한 단일클론 항체를 이용한 저해 ELISA에 의해 살모넬라 티피무리움 COPS를 측정하고; 혈청형 살모넬라 티피무리움은 그룹 B 살모넬라에 속하므로, 단일클론 항체와 반응한다. 이후, 살모넬라 티피무리움 COPS 수치를 총 레조르시놀 COPS 수치로부터 제하여, 살모넬라 엔테리티디스 COPS 수치를 구하였다. 이러한 검사는 총 COPS 및 유리 (비-접합된) COPS 둘다를 측정하는데 효과적이었다.
레조르시놀을 제하는 방법은 신뢰할 수 있는 방법인 것으로 입증되었다. 동일한 3가 살모넬라 접합 백신을 이용한 토끼 독성 실험에서 토끼 20마리에 백신 접종한 후 7개월 및 8개월 경과시, 백신 구성성분의 면역원성을 평가하기 위해, 3가 살모넬라 접합 백신을 1회 투여하여 백신 접종한 동물에서 토끼 면역원성 실험 2가지를 수행하였다. 3가 접합 백신의 용량은 토끼 독성 실험을 수행한 CRO에서 GLP (우수 실험 관리기준) 조건 하에 2-8℃에서 보관한 백신의 나머지 바이얼에서 나온 것이다. 요컨대, 8개월에 걸친 3마리 개별 토끼 면역원성 실험의 결과로, 3가 살모넬라 접합 백신의 면역원성을 모니터링하기 위한 데이터가 수득되었다. 토끼 면역원성 실험의 설계 및 특징은 아래 표 2에 기술한다.
토끼 독성 실험 - 토끼 독성 실험의 그룹 4에서, 항체의 역가 분석은 3가 살모넬라 접합 백신이 투여된 토끼 20마리를 대상으로 수행하였으며, 개봉 시간 (time of release)으로부터 14개월 경과시, 3가 살모넬라 접합 백신의 면역원성을 확인하였다. 특히, 그 결과 (1일과 29일의 항체 역가를 비교함으로써 분석한 바), 3가 접합체의 1차 용량 투여 후 4주 경과시 면역원성이 확인되었으며, 즉 3가 살모넬라 접합 백신의 1회 투여 후 면역 반응의 증거가 제시되었다.
토끼 면역원성 실험 #1 - 토끼 10마리에 3가 접합 백신을 1회 용량으로 투여하고, 1일 (면역화 당일) 및 4주 후 (29일)에 채혈하는 면역원성 실험. 페어링된 혈청은 토끼 9마리로부터 입수가능하였다.
토끼 면역원성 실험 #2 - 토끼 면역원성 실험 #1에서 동물에 백신 접종한 후 6주 후 더 소규모의 2차 면역원성 실험을 수행하였다. 모두 암컷인 토끼 5마리에 나머지 3가 살모넬라 접합 백신 바이얼에서 1회 용량을 취해 투여하여 면역화하였다.
방법 - 토끼 면역원성 실험 #1에서 이용한 토끼 10마리 (9마리로부터 페어링된 혈청이 입수됨) 및 토끼 면역원성 실험 #2에서 이용한 토끼 5마리 (5마리 모두로부터 페어링된 혈청이 입수됨)는 모두 동일 품종 (뉴질랜드 화이트), 연령 (투여 시점에 10-16주령) 및 체중 (> 2.2 kg)의 특수 비 병원성 (Special Pathogen Free. SPF)의 어린 동물이었으며, 토끼 독성 실험에 사용한 토끼와 동일한 판매처 (Charles River Laboratories)에서 구입하였다. 모든 토끼는 투여하기 전 적어도 7일 동안 적응시켰다. 혈청 시료는 보다 대규모 (동물 20마리) 토끼 독성 실험에서와 같이 동일한 시점, 1일 및 29일에 수집하였다. 모두 3가지 시험에서 수득한 혈청은, 동일한 소스의 살모넬라 엔테리티디스 COPS, 살모넬라 티피무리움 COPS 및 살모넬라 티피 Vi 항원을 이용하여, 동일한 혈청 분석 (IgG ELISA)에 의해 검사하였다. 즉, 방법 및 동물은 3가지 면역원성 실험들 모두에서 표준화하여, 변동성 요인을 최소화하였다.
Figure pct00001
결과 - 표 2는 3가 살모넬라 접합 백신을 1회 투여하여 면역화한 토끼 3세트로부터 수득된 혈청학적 결과를 요약 개시한다 (독성 실험; N=토끼 20마리), 면역원성 실험 #1; (N=토끼 9마리)[페어링된 혈청 시료]) 및 (N=토끼 5마리). 이들 3가지 세트에서 수득한 혈청학적 데이터는, 3가 살모넬라 접합 백신 내 3종의 서로 다른 접합 백신이 수개월 동안 비슷한 면역원성을 유지하는지 또는 하나 또는 다른 성분 접합체에 대해 중대한 역가 감소 증거가 존재하는지를 확인할 수 있는 기회를 제공해준다.
각각의 개별 실험에서, 3가지 백신 항원 (살모넬라 엔테리티디스 COPS, 살모넬라 티피무리움 COPS 및 살모넬라 티피 Vi) 각각에 대한 각 토끼의 역가 배수 증가가 측정의 핵심이다.
실험들에서 비교할 매개변수 4가지는 하기이어야 한다:
i)　면역화된 전체 토끼들에서 역가　>4배 증가를 나타내는 토끼 %.
ii) 역가 배수 증가에 대한 기하 평균.
iii) 역가 배수 증가의 최소값.
iv) 역가 배수 증가의 최대값.
혈청학적 데이터의 분석 결론
토끼 20마리 (암컷 10마리, 수컷 10마리)의 토끼 독성 실험 결과 및 토끼 9마리 (암컷 5마리, 수컷 4마리)에 대한 면역원성 실험 #1 결과는, 실험별 비교하기에 합리적인 동물 수 N (동물 개체 수)를 제공해주었다. 토끼 독성 실험 및 면역원성 실험 #1에서, 3종의 항체 (항-엔테리티디스 COPS, 항-티피무리움 COPS 및 항-Vi PS) 각각에 대해 역가 배수 증가의 기하 평균 및 역가 배수 증가의 최소값 및 최대값을 비교한 결과, 3가 접합 백신 내 각각의 개별 접합체는, 이들 2가지 실험에서 약물 제품의 사용 시점에 7개월 차이가 존재함에도 불구하고, 혈청 항체를 자극하는 능력을 유지하는 것으로, 확인되었다.
면역원성 실험 #2의 결과를 면역원성 실험 #1과, 그리고 토끼 독성 실험의 결과와 비교한 결과, 3종의 접합체 모두 각각의 토끼에서 각 백신 항원에 대해 적어도 4배 이상의 역가 상승을 유발하였다. 실제, 토끼 한마리를 제외하고 모두 각각의 백신 항원에 대해 >8배의 역가 상승이 관찰되었다. 즉, 살모넬라 3가 접합 백신은 면역원성을 가지고 있었다. 배수 증가에 대한 기하 평균은 소규모 토끼 면역원성 실험 #2에서 살모넬라 티피무리움 및 Vi 항체에서 다소 낮았다. 그러나, 역가 배수 증가의 최소값 및 최대값은 토끼 독성 실험 및 면역원성 실험#1에서 보고된 결과와 비슷하였다. 이는, 배수 증가에 대한 기하 평균 차이는 특히 토끼 면역원성 실험 #2에서 적은 개체 수가 원인임을, 시사해준다.
각 항체 분석에서 각 동물 그룹에서의 역가 배수 증가를 윌콕슨 순위 합계로 비교하여, 독성 실험에서 토끼 20마리에서의 배수 증가가 면역원성 실험 #1에서의 토끼 9마리의 배수 증가와 3종의 항원 중 어느 항체에 대해 유의한 차이가 있는지를 확인하였다 (p<0.05). 유의한 차이는 없었다. 동일한 통계학적 검정 (윌콕슨 순위 합계)을 수행하여, 면역원성 실험 #1의 토끼 9마리를 면역원설 실험 #2의 토끼 5마리와 비교함으로써, 각 항체에서 1일과 29일의 역가 증가를 비교하였다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 4:　실험 설명
통제된 실험은 표 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
Figure pct00002
실시예 5: 실험 설계
토끼 팔십(80)(성별 40마리) 마리를 이십마리 (20)씩 네개(4)의 그룹으로 나누었다 (10마리/성별/그룹). 그룹 설명, 검체/대조군 투여 및 괴사 일수는 표 2를 참조한다. 이후 공정은 표 4에 열거한다.
Figure pct00003
실시예 6: 결과　
평균 C 반응성 단백질 (CRP)의 농도는, 각각 1일 또는 85일에 투여하는 경우와 비교해, 3일 및 86/87일에 백신-투여 그룹들에서 현저하게, 그리고 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, 이는 급성 염증을 의미한다. 86/87일에 더 높은 값은 최종 괴사시 주사 부위에서 주로 전술한 현미경에 의한 염증 관찰과 관련 있다. 대조군 수컷 한마리를 제외하고는, CRP 값은 99/100일까지 모든 대조군 및 백신-투여 동물들에서 물론 32 ㎍/mL 미만이었으며, 이는 이러한 변화의 가역성을 의미한다. CRP 값은 대조군 동물과 비교해 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다 (표 5).
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 7: 안정성 실험
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 대해 다양한 안정성 실험을 수행하였다. 실시간 안정성 검사를 수행하여, 권고된 보관 조건 2-8℃에서 보관한 본 발명에 따른 백신 조성물의 안정성을 평가하였다.
A. 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 접합체로 된 2가 백신에 대한 실시간 안정성 실험
제품 명: 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 티피무리움 접합체 2가 백신
보관 조건: 5℃ ± 3℃
안정성 실험: 실시간 안정성 실험
포장: 3.0 mL 유리 바이얼
제공: 2.5 mL
투여 부피: 0.5 mL
분석 결과: 표 7에 나타냄
Figure pct00006
B. 살모넬라 엔테리티디스 , 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 티피 Vi 접합체로 된 3가 백신에 대한 실시간 안정성 실험
제품 명: 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 티피 Vi 접합체로 된 3가 백신
보관 조건: 5℃ ± 3℃
안정성 실험: 실시간 안정성 실험
포장: 3.0 mL 유리 바이얼
제공: 2.5 mL
투여 부피: 0.5 mL
분석 결과: 표 8에 나타냄
Figure pct00007
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 2-8℃의 권고된 보관 조건에서 안정적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 구현예 및 용도는 본원에 기술된 본 발명의 설명 및 실시를 감안하여 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 모든 간행물, 모든 미국 및 외국 특허와 특허 출원을 비롯한 본원에 언급된 모든 참조문헌들은 원용에 의해 전체가 구체적으로 본 발명에 포함된다. 용어 포함하는은, 사용되는 경우, 구성되는 및 필수적으로 구성되는의 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 포함하는, 비롯하여 및 함유하는은 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 설명 및 예들은 단순 예로서 간주되며, 본 발명의 진정한 범위와 사상은 후술한 청구항에 의해 교시되는 것으로 의도된다.

Claims (21)

  1. 면역원성 조성물로서,
    하기 항원들 중 2 이상을 포함하고,
    각각의 항원이 하나 이상의 담체 분자와 접합된, 면역원성 조성물:
    a. 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)의 항원;
    b. 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)의 항원;
    c. 살모넬라 티피 (Salmonella typhi)의 항원; 및/또는
    d. 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi)의 항원.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 담체 분자가 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A (Pseudomonas exoprotein A), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertusis) 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens) 톡소이드, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 외막 복합체, rEPA, 호모필러스 인플루엔자 (Hemophilus influenzae) 단백질 D, 플라젤린 플리 C, 호르세슈 크랩 (Horseshoe crab) 헤모시아닌, 및 이들의 단편, 유도체 및 변형체 중 하나 이상을 포함하는, 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    약제학적으로 허용가능한 완충제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용가능한 완충제가 PBS 및 Tween 80을 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    안정화제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 안정화제가 2-페녹시 에탄올을 포함하는, 면역원성 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    보강제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 항원이 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여 범위의 용량인, 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    2종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피무리움의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    2종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    2종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    2종의 항원 성분, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    2종의 항원 성분, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    3종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    3종의 항원 성분, 살모넬라 엔테리티디스의 항원, 살모넬라 티피무리움의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    3종의 항원 성분, 살모넬라 티피무리움의 항원, 살모넬라 티피의 항원 및 살모넬라 파라티피의 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  17. 제1항에 따른 면역원성 조성물을 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 살모넬라 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 투여가 주사에 의한 투여를 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 투여가 항체 역가를 8배 증가시키는, 방법.
  20. 제1항에 따른 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
    a. 2종 이상의 항원을 제공하는 단계;
    b. 상기 2종 이상의 항원 각각을 담체 분자와 접합하는 단계; 및
    c. 각각의 접합체를 약 5 ㎍/투여 내지 약 30 ㎍/투여의 용량으로 준비하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 접합이
    a. 아디프산 다이하이드라지드 (ADH)를 이용하여 항원을 카르보디이미드 매개 변형하여 반응성 하이드라지드 기를 도입한 후, 이를 제2 카르보디이미드 단계를 통해 담체 분자와 연결하거나;
    b. 아민 반응성 제제 숙신이미딜 4-말레이미딜부티레이트 (GMBS)를 이용해 항원을 유도체화하여 말레이미드 모이어티를 도입한 후, 이를 티오 에테르 결합의 형성을 통해 유도체화된 분자의 반응성 설프하이드릴과 연결하거나; 또는
    c. CDAP 화학 반응.
    에 의해 수행되는, 방법.
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