JP5237259B2 - 過剰産生黄色ブドウ球菌株の5型および8型莢膜多糖 - Google Patents
過剰産生黄色ブドウ球菌株の5型および8型莢膜多糖 Download PDFInfo
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Description
a)過剰産生黄色ブドウ球菌株を培養することからなる工程、
b)このようにして製造された培養物を不活化することからなる工程、および
c)上清からT5莢膜多糖を回収することからなる工程
を含む、T5莢膜多糖の製造方法に関する。
a)過剰産生黄色ブドウ球菌株、特に、CYL1892株またはCYL770株を培養することからなる工程、
b)このようにして製造された培養物を不活化することからなる工程、および
c)培養上清からT5またはT8莢膜多糖を回収することからなる工程
を含む製造方法によって製造され得る。
CYL1892株の凍結材料がChia Y. Lee博士(アメリカ合衆国、Arkansas University Medical Center)から提供された。それは、原凍結材料である。
2種類の凍結材料を調製した。凍結材料(A)は、Columbia培地での増幅により原凍結材料から直接得られ、該培地と同様に動物起源の材料を含有する。第二の凍結材料(B)は、動物起源の材料を含まない培地でのクローニングおよび反復継代により原凍結材料から得られた。
予備凍結材料の調製
非誘導培地M0上にてクローニング工程が行われる。原CYL1892株のアリコート100μlを使用して非誘導培地M0上にて単離が行われる。この単離により2つのコロニーを収穫し、ヌクレアーゼ不含H2Oの50μlに溶解し、次いで、単離コロニーとして再度接種する。三継代後、ペトリ皿あたりコロニー1つを溶解し、次いで、層として接種する(PCRによる対照を行うために、並行して1つのコロニー溶解容量を採取する)。次いで、このようにして得られた層を、液体誘導培地M0(50ml)の5時間培養物を接種するために使用する。培養の終わりに、680nmでの光学密度を測定し、次いで、体系化され0.22μmで濾過したグリセロール10mlに培養物40mlを加える。45×1mlに分配が行われ、−80℃で貯蔵が行われる。
原凍結材料中に存在する可能性のある動物起源の全ての成分を除去するために段階希釈液を調製する。非誘導培地M0を継代に使用する。
生存率
以下のプロトコルに従って、冷凍前に、凍結材料Bの分配時に各分配フラスコについて計数を行う:
・10-9希釈まで、凍結材料のPBS中段階10倍希釈、
・Columbia 寒天 2%NaClを含有する24×24Nuncペトリ皿上に10-3〜10-9の希釈液25μlの6滴を置くこと、
・37℃で18時間のインキュベーション、
・最も可読な希釈範囲におけるコロニーの計数および分配フラスコについての平均値の算出。
ApiStaph(登録商標)システムの生化学試験およびリゾスタフィン耐性試験によって凍結材料を使用して同一性を立証する。これらの試験は、製造者によって提供される使用説明書に従って、Columbia 寒天 2%NaCl上37℃での18時間培養物を使用して行われた。
生産性試験
液体誘導培地M0における前培養物を、試験しようとする凍結材料を使用して接種する。次いで、誘導培地M1中400mlの培養物を接種し、振盪しながら37℃で72時間置く。培養の終わりに、培養物50mlを取り出し、+4℃にて3500rpmで30分間遠心分離する。その後、莢膜多糖を抽出し、次いで、ELISAによってアッセイする。
培地M1中での連続培養を行って、1000リットルの発酵槽中で得ることができるものと同様に多くの世代を得る。これについて、M1の10mlに凍結材料Bのアンプルを接種し、次いで、37℃で16時間培養した後、OD=0.2で培地M1の10mlに接種し、37℃でそれぞれ4時間、4時間、16時間、4時間、4時間、16時間、4時間および4時間培養することにより8回連続培養を行う。最後の培養物を使用して、150μlを寒天誘導培地M0に接種して、37℃で16時間、前培養を行い、次いで、M1の400mlにOD=0.2で接種し、37℃で72時間培養する。培地M1での最後の継代の終わりに、生産性測定を上記のように行い、同一培養条件下で参照凍結材料について得られた生産性と比較する。
培養の終わりに、懸濁液を+4℃にて3500rpmで30分間遠心分離し、培養上清を分取し、+4℃で貯蔵する。2回連続オートクレーブサイクルによりペレットを抽出する。各サイクルは、PBS 5mlにペレットを溶解すること、次いで、121℃で60分間のオートクレーブサイクルからなる。オートクレーブしたペレットについて、Columbia 寒天 2%NaClへの接種により死亡率試験を行う。その後、このオートクレーブしたペレットを+4℃にて25000×gで30分間遠心分離し、抽出物(上清)を回収し、次いで、+4℃で貯蔵する。次いで、該ペレットをPBS 5mlに再溶解し、2回目のオートクレーブサイクルを開始する。2回目のサイクルの終わりに、2つの抽出物を合わせる。抽出物および培養上清を37℃で1時間プロテイナーゼK(50μg/ml)で処理し、次いで、80℃で30分間インキュベートすることによりプロテイナーゼKを不活化する。次いで、処理した培養上清について死亡率試験を行う。
プロテイナーゼKで処理した試料(オートクレーブ処理後に得られた抽出物および/または処理した培養上清)をサンドイッチELISAによりアッセイする。二重滴定により、データの信頼性を確実にすることができる。原理は、2つの抗体間で抗原(PS5)を捕獲して、それを定量化することからなる。いずれもの干渉を回避するため、そしてできる限り正確な測定値を得るために、2つの抗体のうち1つは、完全に特異的でなければならない(吸着で使用される抗PS5モノクローナル抗体)。次いで、吸着したウサギポリクローナル血清を検出抗体として使用する。ペルオキシダーゼと結合した二次抗体は可視化を可能にするであろう。ELISAの間、精製PS5を様々な濃度で使用して標準曲線を作成して抗原を定量化する。対照も導入する;それは、濃度が既知であり、物理化学的測定により78μg/mlであることが確立されている精製PS5である。最終工程において、発色基質、テトラメチルベンジジン(TMB)を加える。後者をペルオキシダーゼにより分解して青色の生成物を得る。暗所にて20℃で15分間インキュベートした後、酸を加え、反応を停止させ、青色の生成物を黄色に変える。450nmで光学密度を測定する。それは、結合した抗体の量に比例する。
CYL1892凍結材料A
11日間冷凍した後、CYL1892計数結果は安定である。4回連続継代を行った。合計16個の異なるコロニーを抽出し、PCRにより分析した。継代ごとに試験したコロニーは全て明らかに5型cap遺伝子座を有しており、cap1プロモーターの存在もまた全てのコロニーについて示された。
11日間冷凍した後、CYL1892計数結果は安定である(平均2.3×109CFU/ml)。
製造者の使用説明書に従って生化学的特性の分析に従って黄色ブドウ球菌の正確な同定が得られる。
様々なクローニング工程の間、予備凍結材料の遺伝的安定性をモニターした。約500bpのcap5および200bpのcap1プロモーターの特異的増幅の存在に注目する。試験した10個のコロニーは、凍結材料Bを生産するための培養物の接種のために使用した予備凍結材料Bから得られる。cap5遺伝子座およびcap1プロモーターの遺伝的安定性が観察される。
抗PS5モノクローナル抗体による凝集のみが観察される。
参考凍結材料および野生型株凍結材料を並行して用いて生産性測定を数回行った。組換え株に関して、野生型株について2種類の凍結材料を調製した。Columbia ブロス 2%NaCl中にて研究室にてわずかな回数の継代によって、原株からReynolds凍結材料Aを得た。この凍結材料Aは、動物起源の材料を含有する。培地M0上での原株の連続継代によって、動物起源の材料を含まない第2の凍結材料(Reynolds凍結材料B)得た。非誘導培地M0において継代を受けた後、液体誘導培地M0においてReynolds凍結材料Bを調製した。
培地M1上での安定性試験後(約40世代が実現)、生産性測定を行った。培地M1中での数回の継代後にペレットおよび上清中で観察された生産性は、凍結材料Aに関してはCYL1892凍結材料Bについて継代なしで観察されるものと同等である。野生型Reynolds株の凍結材料Bについては20〜50%の生産性減少が観察される。
下記分析によって、それぞれCYL770株およびCYL1892株から単離および精製されたrPS T8およびT5を特徴付けた。
誘導培地M1において組換え8型株CYL770の培養物を調製した。この培養物由来の微生物をホルマリン処理して、文献(Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447)に記載される原理に従ってウサギにおける免疫化プロトコルに使用した。得られた過免疫血清は、8型莢膜多糖に対して特異的な抗体を含有するが、種々の株間で共通し得る他のエピトープに対する抗体も含有する。したがって、この血清を、化学的に脱莢膜させられた自家株の1011CFUを含有するペレット上に数回吸着させて、8型莢膜多糖に対して特異的ではない抗体を除去した。このようにして得られた試薬を、誘導培地M1における組換えCYL770株の培養物由来の微生物についてプロテインAを介する抗体の非特異的結合を回避するためにトリプシン処理された全微生物上での凝集技術によって評価した。次いで、様々なレベルの莢膜多糖誘導を有する固体および液体培養物由来の8型野生株(BeckerおよびWright)のトリプシン処理した全微生物について同条件下で抗CYL770血清を試験した。
液体誘導培地M0(9ml)にCYL770凍結材料Aのアンプル(1ml)を接種することによりエルレンマイヤーフラスコ中にて前培養物を調製する。前培養物を×100振盪しながら37℃で18時間〜20時間置く。次いで、CYL770株を、液体誘導M0中にて調製した前培養物を使用してOD680nm=0.2で接種することにより、エルレンマイヤーフラスコ中のM1(100ml)中にて培養する。次いで、エルレンマイヤーフラスコを×100振盪しながら37℃で48時間置く。次いで、培養物を遠心分離し、ペレットをPBS 20mlに溶解し(貯蔵溶液)、OD680nmを測定する。
6×107CFU/mlで2×4ml(注射d2+d4)
1.2×108CFU/mlで4×4ml(注射d0+d7+d9+d11)
1.8×108CFU/mlで3×4ml(注射d14+d16+d18)
2.4×108CFU/mlで3×4ml(注射d21+d23+d25)
CYL770株の凍結材料A(1ml)のアンプルを使用して、Columbia培地50mlの前培養物を接種し、振盪しながら37℃で18時間インキュベートする。前培養物を使用して、Columbia培地の400mlの培養物を初期OD680nm 0.2で接種し、振盪しながら37℃で24時間インキュベートする。次いで、培養物を+4℃にて3500rpmで30分間遠心分離し、上清を除去する。次いで、ペレットをPBS 8mlに溶解し、OD測定を行う:OD680nm=178。
吸着プロトコルために抗CYL770ポリクローナル血清2mlを使用した。1011CFUの細菌ペレットにより、血清2mlについて1回の吸着サイクルを行うことができる。合計5回の吸着サイクルを行った;各サイクルは、以下のように構成されていた:化学的に脱莢膜した微生物のペレット上に脱補体抗CYL770血清2mlを置き、ゆっくりと再懸濁させ、1日中または一夜+4℃で試験管用回転装置上に置き、+4℃にて3500rpmで30分間遠心分離し、吸着血清を回収し、化学的に脱莢膜した微生物のさらなるペレット上に血清を置き、該プロトコルを繰り返す。5回目のサイクルの後、吸着血清を回収し、0.22μmのMillipore膜で濾過し、次いで、スライドグラス上での凝集アッセイによって評価するまで+4℃で貯蔵する。
種々の固体および液体培地上での黄色ブドウ球菌8型株(Becker、WrightおよびCYL770)の培養物由来のトリプシン処理微生物について、化学的に脱莢膜した微生物上に吸着した抗CYL770ポリクローナル血清についてのスライドグラス上での凝集アッセイを行った。黄色ブドウ球菌5型Reynolds株のPSを誘導しない固体培地中の培養物を対照として試験した。
培地M1中にてCYL770株を48時間培養し、次いで、ホルマリンで固定する。直接死亡率および増幅後の死亡率を立証する。次いで、懸濁液を所望の濃度(表2)に調整し、滅菌フラスコ中に分配する。次いで、該フラスコに栓をし、文献(Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447)に記載されているプロトコルに従って免疫化に使用する。
++++ 0〜30秒で完全な凝集が観察された
+++ 30秒〜1分で完全な凝集が観察された
++ 1〜3分で完全な凝集が観察された
+ 3〜5分で完全な凝集が観察された
+/− 非常に遅く、10分で完全な凝集が観察された
− 凝集は観察されなかった
CYL770株によって生産されるPS8の性質を特徴付けるために、基礎としてKarakawaおよび研究仲間によって以前に記載されたプロトコル(Karakawa et al., 1985; J. Clin. Microbiol., 22: 445-447)を使用して、培地M1中で培養されたCYL770株の不活化全微生物でウサギを免疫化することによって抗PS8ポリクローナル抗体を生じさせた。
注射: 体重2.5kgの雌性ニュージーランド白ウサギ(ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle)3羽に、培地M1中にて培養したCYL770株の不活化全微生物を様々な濃度で4週間、週3回注射し、PBSに対して透析する。最初の注射(D0)は、敗血症性ショックを回避するように上肢帯にて皮下に施す。その後の注射は全て、耳の辺縁静脈において静脈内に施す。各注射に使用される濃度および容量を以下に記載する。
使用するまで全ての血清を−20℃で保存する。
ELISAアッセイによってポリクローナルウサギ血清をPS8に対する特異性について評価する。96ウェルELISAプレート(平底マイクロプレート;Immunosorp Microwell;Nunc;デンマーク国Roskilde)を、1×PBS、pH7.2(100μl/ウェル)中の1μg/mlの精製PS8の存在下、周囲温度(20〜22℃)で一夜インキュベートする。該プレートを、Titertek M96V自動プレート洗浄器を使用してウェルあたり300μlのPBS/0.05%Tween 20(PBS−Tween)で4回洗浄し、次いで、250μl/ウェルのPBS−Tween/1%BSAを用いて37℃で1時間飽和させる。次いで、該プレートを上記方法に従って4回洗浄する。プレート上に種々の濃度の被験血清の各々をウェルあたり100μl置く;マルチチャネルピペットを用いて、プレート内にてPBS−Tween/1%BSAで連続3倍希釈液を調製する(カラム希釈)。プレートを37℃で1時間30分インキュベートし、次いで、PBS−Tweenで4回洗浄する。
5.1 − 8型結合体の製造(STAPH8−rEPA)
CYL770株から精製した8型多糖の脱重合
結合前に、米国特許第6,045,805号に記載された原理に従って、CYL770株から精製したrPS8抗原を脱重合する。rPS8抗原を2mg/mlで調製する。周囲温度で、この溶液20mlに200mMアスコルビン酸110μl、20mM CuSO4 11μlおよび20mM FeSO4 11μlを加える。周囲温度で80分間撹拌しながら該反応を続ける。pH7.0の2M TRIS溶液2mlを加えることによって脱重合反応を停止させる。水に対して透析することにより脱重合反応物を取り出し、次いで、該脱重合rPS8を凍結乾燥させる。HPSEC/LS/RI/Visc分析により、脱重合rPS8の平均分子量は、50kDa付近であると見積もられた。
抗原(CYL770株から精製した多糖について脱重合された)40mgを8mlの200mM NaClおよび125mMアジピン酸ジヒドラジド(ADH)に溶解した。pHを4.9に調整し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDAC)を最終濃度25mMで加える。周囲温度で90分間続いた活性化の進行の間、希HCl溶液を加えることによってpHを常に4.9に調整する。pHの中和により反応を停止させる。次いで、活性抗原を500mM NaClに対して透析し、次いで、水に対して透析する。次いで、活性化および透析した抗原を凍結乾燥させる。機能化パーセンテージは、Becker株から精製した多糖およびCYL770株から精製および脱重合した多糖についてそれぞれ3.7および4.3(w/w)であると見積もられた。
100mM NaClおよび50mM EDAC中に活性抗原(CYL770株から精製された抗原について脱重合された)20mgおよびキャリアータンパク質(組換えエキソプロテインAΔ553、すなわち、rEPA)10または20mgを含有する10mlの溶液を調製した。4℃で90分間続いた結合の進行の間、希HCl溶液を加えることによってpHを常に5.6に調整する。反応の終わりに、pHを中和する。次いで、結合抗原を200mM NaClに対して透析し、次いで、10mMリン酸緩衝液pH7.2中の200mM NaClで平衡させたSepharose Cl−4Bカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。結合体を含有しており(210nmおよび280nmでの光吸収によって検出される)、主にカラムのデッドボリュームで溶離されるフラクションを合わせた。
精製後、結合した多糖およびタンパク質の量は、多糖(Hestrinの方法(Hestrin S. 1949. J. Biol. Chem. 180: 249-261)に従ってO−アセチルの定量化により測定された)対タンパク質(Bradford法(Anal. Biochem. 1976 72, 248-254)に従ってタンパク質の定量化により測定された)の重量比として見積もられた。非結合抗原および遊離キャリアータンパク質のレベルは、キャピラリー電気泳動法により測定された。結合体のサイズは、HPSEC/LS/RI/Viscにより見積もられた。
CYL1892株から精製した5型多糖の脱重合
結合前に、米国特許第6,045,805号に記載された原理に従って、CYL1892株から精製したrPS5抗原を脱重合する。rPS5抗原を2mg/mlで調製する。周囲温度で、この溶液20mlに200mMアスコルビン酸55μl、20mM CuSO4 5.5μlおよび20mM FeSO4 5.5μlを加える。周囲温度で80分間撹拌しながら該反応を続ける。pH7.0の2M TRIS溶液2mlを加えることによって脱重合反応を停止させる。水に対して透析することにより脱重合反応物を取り出し、次いで、該脱重合rPS5を凍結乾燥させる。HPSEC/LS/RI/Visc分析により、脱重合rPS5の平均分子量は、50kDa付近であると見積もられた。
抗原(CYL1892株から精製された多糖について脱重合された)40mgを8mlの200mM NaClおよび50mMアジピン酸ジヒドラジト(ADH)に溶解した。pHを4.9に調整し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDAC)を最終濃度10mMで加える。周囲温度で45分間続いた活性化の進行の間、希HCl溶液を加えることによってpHを常に4.9に調整する。pHの中和により反応を停止させる。次いで、活性抗原を500mM NaClに対して透析し、次いで、水に対して透析する。次いで、活性化および透析した抗原を凍結乾燥させる。機能化パーセンテージは、Reynolds株から精製した多糖およびCYL1892株から精製および脱重合した多糖についてそれぞれ1.25および0.9(w/w)であると見積もられた。
100mM NaClおよび50mM EDAC中に活性抗原(CYL1892株から精製された抗原について脱重合された)20mgおよびキャリアータンパク質(組換えエキソプロテインA、rEPA)40mgを含有する10mlの溶液を調製した。4℃で90分間続いた結合の進行の間、希HCl溶液を加えることによってpHを常に5.6に調整する。反応の終わりにpHを中和する。次いで、結合抗原を200mM NaClに対して透析し、次いで、10mMリン酸緩衝液pH7.2中の200mM NaClで平衡させたSepharose Cl−4Bカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。結合体を含有しており(210nmおよび280nmで光吸収により検出される)、主にカラムのデッドボリュームで溶離されるフラクションを合わせた。
精製後、結合した多糖およびタンパク質の量は、多糖(Hestrinの方法(Hestrin S. 1949. J. Biol. Chem. 180: 249-261)に従ってO−アセチルの定量化により測定された)対タンパク質(Bradford法(Anal. Biochem. 1976 72, 248-254)に従ってタンパク質の定量化により測定された)の重量比として見積もられた。非結合抗原および遊離キャリアータンパク質のレベルは、キャピラリー電気泳動法により測定された。結合体のサイズは、HPSEC/LS/RI/Viscにより見積もられた。
Becker8型株から精製したPS8を使用するPS T8−rEPA結合体の種々のバッチが本発明者らによって得られた。これらの8型結合体の免疫原性は、抗PS8体液性応答(IgM、IgG、およびIgGのサブクラス)のELISA分析により、種々の近交系または非近交系マウス系において立証することができた。用量−効果実験もまたこの種の動物モデルについて行われた。
注射: 体重20〜22gの雌性OF1マウス(非近交系)(ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle)に、培地M1中にて培養したCYL770株に由来するPS8を用いて得られた種々の濃度のPS T8−rEPA結合体を、D0(感作)、次いで、1回目の注射の3週間後(D21)に、上肢帯にて皮下注射する。各注射に使用される濃度および容量を以下に記載する。
吸着(「コーティング」)のために抗原としてBecker T8株から精製した特徴付けられたPS8を1.5μg/mlの濃度で使用してELISAアッセイによって抗PS8体液性応答(アッセイ内で決定された免疫化用量についての、D0、D21およびD35での抗PS8 IgGおよびIgM力価、ならびにD0およびD35での抗PS8 IgG1、IgG2aおよびIgG3力価)を評価する。
抗PS8 IgM力価
図2に示される結果は、免疫前動物の全てにおいて有意であるが非特異的な抗PS8応答が観察されることを示している(2Logよりも大きい力価)。感作後(D21)、4つの結合体グループについて特異的な抗PS8 IgM応答の著しい増大が見られ(約+2Log)、これら4つのグループの間で差異はない。非結合PS8を投与されたグループについては、グループA(Becker PS8+rEPA、非結合)について約1Log、グループG(CYL770からの天然PS8+rEPA、非結合)について約1.5Logの抗PS8 IgM力価の著しい増加が見られる。グループB(CYL770からの分画されたPS8+rEPA、非結合)については、抗PS8 IgM力価の増大は見られない。D35には、考慮されるグループに関わらずIgM応答の有意な増幅効果はない。
図3に示される結果は、免疫前動物において非特異的抗PS8 IgG応答が全くまたはあまり観察されないことを示している(<1.3Log)。
図4は、免疫前動物においては非特異的抗PS8応答が観察されないことを示している(<1.2Log)。
Reynolds5型株から精製したPS5または組換え黄色ブドウ球菌株CYL1892から精製したrPS5を用いて、種々のPS T5−rEPA結合体バッチを得た。
注射: 体重20〜22gの雌性OF1(非近交系)マウス(ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle)に、培地M1にて培養したReynolds株に由来する精製PS5またはCYL1892株に由来する精製rPS5fから得られるPS T5−rEPA結合体の2.5μg/マウス/注射を、D0(感作)、次いで、この1回目の注射の3週間後(D21)に、上肢帯にて皮下注射した。
吸着(「コーティング」)のための抗原としてReynolds5型株から精製したsPS5を1μg/mlの濃度で使用して自動ELISAアッセイによって抗PS5体液性応答(D0、D21およびD35での抗PS5 IgMおよびIgG力価)を評価する。
図7(a)に示される結果は、免疫前動物の全てにおいて有意であるが非特異的な抗PS5応答が観察されることを示している(力価の平均値約1.8Log±0.2Log)。
図7(b)に示される結果は、免疫前動物において抗PS5 IgG応答が全く観察されないことを示している(平均力価<1.3Log;検出閾値)。
Claims (9)
- a)cap5オペロンまたはcap8オペロンの主要プロモーターが、別の黄色ブドウ球菌株の強力な主要プロモーターに置き換えられた黄色ブドウ球菌T5株またはT8株を培養培地中で培養すること、
b)このようにして製造された細胞培養物を不活化すること、および
c)不活化した細胞培養上清からT5またはT8莢膜多糖を回収すること、
を含む、T5またはT8莢膜多糖の製造方法。 - 強力な主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターである、請求項1に記載の製造方法。
- 莢膜多糖がT5莢膜多糖であり、および、黄色ブドウ球菌T5株が、そのcap5オペロンの主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターに置き換えられたReynolds株である、請求項2に記載の製造方法。
- 莢膜多糖がT8莢膜多糖であり、および、黄色ブドウ球菌T8株が、そのcap8オペロンの主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターに置き換えられたBecker株である、請求項2に記載の製造方法。
- a)T5またはT8莢膜多糖を、
i)cap5オペロンまたはcap8オペロンの主要プロモーターが、別の黄色ブドウ球菌株の強力な主要プロモーターに置き換えられた黄色ブドウ球菌T5またはT8細胞株を培養培地中で培養すること、
ii)このようにして製造された細胞培養物を不活化すること、
iii)不活化した細胞培養上清からT5またはT8莢膜多糖を回収すること、
により製造すること、
b)回収したT5またはT8多糖を精製すること、
c)精製したT5またはT8多糖を分画すること、および
d)分画したT5またはT8多糖をキャリアータンパク質に共有結合させること、
を含む、キャリアータンパク質に共有結合したT5またはT8莢膜多糖を含むコンジュゲートの製造方法。 - 強力な主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターである、請求項5に記載の製造方法。
- 莢膜多糖がT5莢膜多糖であり、および、黄色ブドウ球菌T5株が、そのcap5オペロンの主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターに置き換えられたReynolds株である、請求項5に記載の製造方法。
- 莢膜多糖がT8莢膜多糖であり、および、黄色ブドウ球菌T8株が、そのcap8オペロンの主要プロモーターがcap1オペロンのプロモーターに置き換えられたBecker株である、請求項5に記載の製造方法。
- キャリアータンパク質が、緑濃菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Aである、請求項5〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
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