CN114480387B

CN114480387B - 一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用

Info

Publication number: CN114480387B
Application number: CN202210006664.3A
Authority: CN
Inventors: 刘强
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114480387A

Abstract

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用，涉及微生物分子生物学技术领域。所述组成型启动子包含如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的任一核苷酸序列。本发明能够提供19个金黄色葡萄球菌组成型启动子，且具有不同的表达活性，能够供基因不同水平的持续性表达。另一方面，本发明还提供了一种包含上述组成型启动子的表达载体，以实现目的基因在金葡菌中不同强度地持续性表达，进而为实现金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘提供工具，并为新型抗菌药物的研发及临床抗感染治疗方案的制定提供新思路。

Description

一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学技术领域，尤其是涉及一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是目前造成临床感染最常见的病原菌之一。随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA)的出现和流行，世卫组织已将MRSA列入“重要等级”病原菌行列。MRSA之所以对人类的健康和生病造成严重威胁，主要是因为其严重的耐药性及复杂多变的免疫逃逸机制，使其在体内很难被彻底清楚，非常容易造成复发。因此，对金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘，将为新型抗菌药物的研发及临床抗感染治疗方案的制订提供新的思路。

对金葡菌毒力基因及功能未知基因的研究采用的常规方法包括基因敲除、回补及过表达等。目前，金葡菌基因敲除、回补的基因工具及方法已被成功建立和广泛应用。但是，金葡菌基因过表达的基因工具却非常缺乏，这主要是因为缺乏可用的启动子。用于基因表达的启动子可分为两大类：诱导性启动子和组成型启动子。金葡菌中应用的诱导性启动子主要包括木糖诱导性启动子、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性启动子及四环素诱导性启动子等。虽然这些启动子都能在金葡菌中有效的过表达基因，但是在应用的过程中具备一定的局限性，比如木糖型诱导启动子的活性通常会受葡萄糖的抑制，而葡萄糖是真核细胞中常见的物质，因此木糖型诱导启动子在金葡菌的动物及细胞感染模型中的应用受到限制。此外，所有诱导性启动子都需要诱导剂的诱导，而诱导剂的加入通常会影响金葡菌的正常生理代谢，甚至造成一些无法预期的表型出现。而组成型启动子不需要诱导剂的诱导便能让目标基因成功表达，是实现基因过表达的理想途径。

然而目前在金葡菌中用于基因持续性表达的组成型启动子非常少，主要有金葡菌转录调控因子SarA基因的启动子PsarA及编码荚膜基因启动子Pcap。组成型启动子的活性是固定的，因此用于基因表达时，基因的表达水平是固定的，如果想要不同水平地持续型表达基因，则需要不同强度的组成型启动子，以供基因不同水平的持续性表达。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌组成型启动子，本申请提供的金黄色葡萄球菌组成型启动子具有不同的表达活性，可以供基因不同水平的持续性表达。

本发明的第二目的在于提供一种包含金黄色葡萄球菌组成型启动子的表达载体，以实现目的基因在金葡菌中不同强度地持续性表达，进而为实现金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘提供工具。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种金黄色葡萄球菌组成型启动子，所述组成型启动子包含如SEQID NO.1至SEQ ID NO.19所示的任一核苷酸序列。

根据一种优选实施方式，具有如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的所有组成型启动子具有不同的表达活性，且在金黄色葡萄球菌接种后的适应期、对数期和稳定期均能够高水平表达。

本发明还提供了一种包含上述金黄色葡萄球菌组成型启动子的表达载体。

根据一种优选实施方式，所述表达载体是在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体质粒插入上述组成型启动子构建而成。

本发明还提供了一种所述的表达载体的构建方法，包括：

在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体质粒pBUS1-Pcap-HC的Bgl II位点插入氯霉素抗性基因，得到携带氯霉素抗性基因的pBUS1_Pcap_HC_cat质粒；

利用限制性内切酶Kpn I和Nde I去除pBUS1_Pcap_HC_cat质粒中的Pcap启动子，并替换为权利要求1所述的组成型启动子，得到携带不同组成型启动子的基因表达载体。

基于上述技术方案，本发明的一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用至少具有如下技术效果：

本发明提供的金黄色葡萄球菌组成型启动子包含如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的任一核苷酸序列。因此本发明能够提供19个金黄色葡萄球菌组成型启动子，且具有不同的表达活性，能够供基因不同水平的持续性表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中鉴定金葡菌在3个生长时期高表达基因的示意图。

图2是本发明实施例1中将扩增出来的启动子序列克隆至包含β-半乳糖苷酶的报告基因质粒中的过程图；

图3是本发明实施例1中30个启动子的活性显色情况；

图4是本发明实施例2中基于活性启动子序列表达载体的构建过程；

图5是本发明实施例2中基因表达载体的基因转录水平及目的基因表达情况；

图6是本发明实施例2中所构建的表达载体表达内源性基因过氧化氢酶基因及转录抑制子purR基因的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例1提供了金黄色葡萄球菌组成型启动子的筛选过程，具体如下：

1.1、鉴定金黄色葡萄球菌在适应期、对数期及稳定期同时高表达的基因。

将金葡菌接种于TSB肉汤培养基，每小时测定OD₆₀₀吸光值，绘制出金葡菌生长曲线，如图1A所示。在金葡菌接种后的适应期LP(2h)、对数期EP(6h)及稳定期SP(10h)收集细菌样本，送至南京派森诺基因公司进行转录组测序及数据分析。利用转录中的FPKM(FragmentsPer Kilobase per Million)值，将FPKM≥1500的基因判定为高表达基因，如图1B所示，对LP，EP，SP时期的高表达基因进行交叉分析，筛选出30条同时在3个生长时期高表达的基因，如图1C所示。

1.2、高表达基因启动子序列的扩增及克隆。

以S.αureusUSA300_FPR3757基因组DNA为模板，利用高保真PCR酶GXL Premix(Takara)，PCR扩增出30条高表达基因的30个启动子序列(P₁-P₃₀)及阳性对照sarA基因启动子(P₃₁)，引物见下表1。扩增出的启动子PCR产物经纯化后，利用无缝克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)，将扩增、纯化的启动子片段，克隆至EcoR I和Pst I线性化的β-半乳糖苷酶报告基因质粒中，如图2所示。启动子序列以其对应的Gene locus为命名，如基因SAUSA300_RS10930对应的启动子命名为P₁₀₉₃₀。高表达基因信息及启动子序列大小见下表2。将扩增出来的启动子序列，克隆至包含β-半乳糖苷酶的报告基因质粒中，如图2所示。

表1扩增高表达基因引物序列

表2高表达基因信息及启动子信息

1.3、高表达基因启动子序列的活性鉴定。

将构建好的所有质粒分别转化至S.αureusUSA300_FPR3757菌株中。挑取目的菌单菌落接种于10mL TSB培养基中。次日，取100μL接种于10mL TSB培养基中培养2h，取5μL菌液滴至含有25μg/mL氯霉素和200μg/mL X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)的TSA固体培养基上。随后于30℃培养2天，观察菌落颜色。若启动子有活性，将驱动lacZ基因表达，产生β-半乳糖苷酶。产生的β-半乳糖苷酶将与X-Gal反应生成蓝色物质。结果如图3所示，克隆的30个启动子中有19个启动子有活性，显示出蓝色菌落。其中P31代表sarA基因启动子，作为阳性对照，NG代表无启动子，作为阴性对照。因此，具备活性的19个启动子序列被鉴定出，19个组成型启动子的核苷酸序列具体如下：

P1 P10930，

SEQ ID NO.1：

TTTTACACCACTCTCCTCACTGTCATTATACGATTTAGTACAATCTTTTATCATTATATTGCCTAACTGTAGGAAATAAATACTTAACTGTTAAATGTAATTTGTATTTAATATTTTAACATAAAAAAAATTACAGTTAAGAATAAAAAACGACTAGTTAAGAAAAATTGGAAAATAAATGCTTTTAGCATGTTTTAATATAACTAGATCACAGAGATGTGATGGAAAATAGTTG。

P2 P13425，

SEQ ID NO.2：

GGAGATTGGGTTAAAAAGGCGAAGAATGAACTGGATGATATTAGTAAGAAATTAAAAAATATTCAAAGAACGGAAGTTTAATAGCTTATATGATTCTTGGAGCTAAGACAGCATGCGTTCATTCATGCCATTATTAATATAAGCACCGCAACAAAAAAGCTTCTAATGTGATACAGGAACCTCATATTCCGTATCATGTTAGAAGCTTTTAATGTCTAAAGAACATCTACATTTTATCATATTTTCTGACTTATTAAACTTTTATATAATTAAATATTTCTTAATTTTCCAAAATAGTGATAAATTTGTGAAATACATCACAAATCCCTTTATTTATTTGGAAATTCATGTAATATTAGACTTGTAAGAAGTTAATAAATAGAGAGAGACGAGAGAGTTTATATAAATACTATATAAACATTGGAGTGATGATT。

P3 P01490，

SEQ ID NO.3：

AATAACCATTTAATCCTTTATGTATTTAATTTAATTTTAGTATACACATTTATATTACAAAAATGAATGGTTAATTAAAAATATATGGGTATATTCAATATATTTATTTAAAAAAAGCTAAAAATACTTAAAAAACTATATACATATACTAATAATTTATATATTATTTGAGTAAGGAGCACTTTTTCAAAAAATAGTGTCCCTAAAAAGTTTTGATAAACTTAAAATATTCAGGAGGTTTCTAGTT。

P4 P05790，

SEQ ID NO.4：

ACGTTTAACAACACAAGAATTATTATATCTAAATGAACTTAAATTAGCAATACCTTGTAAATAAAAAATGTTTATATTTTTCACTATTATAGAGCTATTTATCTAAAAAGGTTCAATAAGACTTAAATACGAATTCAGGCAACTTAATTGTGTTAAATACAGTTTTGAATGCCTAACTGTATTTCTTTTCTCTTTAAAATACAGTTAAGTACATTATAAGATGTTGTGCGGATAAACAAACTAATTGTATCAAATTTATTTTAAAATAACAACAACAAAACGATAAGCGAATAACATTTCGGTGATTTAAAAGCTACGCACGTTTTTGTTATCTTCAAATTTAAATTTTAAGGAGTGTTTTCA。

P5 P12390，

SEQ ID NO.5：

TTAATATAAAAAATATCAAATCAAACACGTTGATATAGATTAAAATTTTAAAAGTTTACATATCAGTTAAGATACAAAATATTCAGACTAATAATTTTCAATTTGGCAAAATATCTTAAACATCAAATTATTATAAGAAATAAATGTATTTAACCATATTCTAGTAATAAAAATATTGAATTTTTATACTTATTTGTTTAGAATGAACTTTATAACATAGTTGGATAGAGTTTCGATTTAATAAATTACATGTGAACCTTGCTACAACAAGATGTGCATCAGAGGAGTGGTTTAATA。

P7 P04400，

SEQ ID NO.6：

ATATTAATGGCTCAGTAACGTGATGTTGCTGGGCTTTTTAATTTAAACAGGTATTTATATGATATTTAGGAATGAGATGCTATTACGGATAAAGTAAAATCCTATATGCATGCGTGCTACTCATTTATTCTTATTTTTAATTTCACATGGCTAGTGACTAATACATCATAAATCATTAGTGATTCTTTATTATTTCAGTCCCACTCCCTCAAGTTAATGATGAATCTATTTCGCTAGTTATAAAATGACGTCAAATCAATATCAAAAATTATTTAAGTAAAATGTTTAGATAATTTTTCAGTGGGTAAGTATTATATATAACATTTAATTATTCCGAGGAGGCATTTATT。

P8 P10935，

SEQ ID NO.7：

CAACTATTTTCCATCACATCTCTGTGATCTAGTTATATTAAAACATGCTAAAAGCATTTATTTTCCAATTTTTCTTAACTAGTCGTTTTTTATTCTTAACTGTAATTTTTTTTATGTTAAAATATTAAATACAAATTACATTTAACAGTTAAGTATTTATTTCCTACAGTTAGGCAATATAATGATAAAAGATTGTACTAAATCGTATAATGACAGTGAGGAGAGTGGTGTAAAA。

P10 P00165，

SEQ ID NO.8：

ACATATCGTGAGCAATGAACTGATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACCTTCTACACCTCCATATCACAAAAATTATAACATTATTTTGACATAAATACTACATTTGTAATATACTACAAATGTAGTCTTATATAAGGAGTATA。

P11 P02850，

SEQ ID NO.9：

TATAACTTGTTTTGACTAGCTAGCCTAGGTTAAAATACAAGGTGAGCTTAAATGTAAGCTATCATCTTTATAGTTTGATTTTTTGGGGTGAATGCATTATAAAAGAATTGTAAAATTCTTTTTGCATCGCTATAAATAATTTCTCATGATGGTGAGAAACTATCATGAGAGATAAATTTAAATATTATTTTTAATTAGAATAGGAGAGATTTTATA。

P12 P03960，

SEQ ID NO.10：

GGGTGTAAATTATATGCTAAAAATATCAGAAAATTCAAAGTGTTTGCGTTTGCACGATAGCGTAAAAATGTTAAAATATAATAAAGAGTTACCAATAAAGAGGTTTAAGGAGAGATTACT。

P13 P05175，

SEQ ID NO.11：

CTAGCCATCATTTTCAATTTATTAGACAATTTCAAACTTTTTTTATTTTCATTCAATTAACCTTTAATTGAAAGCTATTCTCAACTTTCCTTTTAAATATGAAGCAATTTTTTCAAAAACGCTATTAGTCACAAAATGTACACATAATTTTAACAAATGTGTGAACCCACGTCACACCTTGATTTATCAACATTTTTGATACAATTTTATTAATTTTTTTCCCATAAGCCCTTGTAAATATTGTGTAATAACTTAAAATTAATGTTAAGCCCTACATTTGTAGTATTAGGAGGTCAAAAAA。

P14 P11445，

SEQ ID NO.12：

CTTTATCCTCCAATCTACTTATAAAATATTGTAATTAATGACTACATATTATGCAACGGCTTAAATTGTATAAAAATGTATACGTTTGCATTTAGTATAACTATCGCATTTTTCAAAAAATACACATTTAATCTGCAGTATTTCAATGCATTGACGCTATTTTTTTGATATAATTACTTTGAAAAATACGTGCGTAAGCACTCAAGGAGGAACTTTC。

P15 P12155，

SEQ ID NO.13：

ATTCATTCACCACCGTTCTTATGACTAATTATATAGAATAATTTTCAATGATAATAATAAAATGATTCAAGGTACGAATTTACAATAAAGAAGGAAATAAAAAATATCTCGAAAATAGTTGAACTGACTAAGTATATAAAGTAAAATATAAAAGTATGTGTTAGACAGATAGAAAAATTATGTGAAAAGCCTTGATTTATCGATGTTTTTCGTGTAATATAACTAACGTTGGACTTTAAGAAAAGCGATGAAGCGAAAGGTTACTGACACACCCGGCCGCTTTGCCATGGCGCTGTGTAAGATAGTTTTCGTGGAGAAGTCTATCACTAAATGTAGACGAATAAGGAGGGAAAATT。

P17 P11990，

SEQ ID NO.14：

TTGCCATTGACAAAAAGCTTGTGAAATTATAAGATTATTAACGGTATTGTTTTATATCCACCCCACGATAAGCCCCGGAAACTTATTGTGTTACAAGATATATAAGCAGAAACGAACAACAGTTAACAAAATAAATGAAATTAAACGTTTTAAAAATGAAACAAATGAAATCATCTATTAGGTTATGAAACTGTTTATAGCTTGAATAGAAGCATTTATTTTTTAGGAGGACAATTATT。

P19 P11815，

SEQ ID NO.15：

TTAATAATGAGGTTTTATTTACAAAAACTAGGGAATATATTACTAAATGGTACTTCATCTTATATATTAAAAATAAATTTAAAGTTATTAATTTATTATGTTTAAGAAAAAAACTGATGGGTACATATTTAATATGTTTTTAAATTAACTTTAACTAAGGAGGTGTCGTTAGGG。

P20 P08825，

SEQ ID NO.16：

TTTTTGTACGTCAAAACTTATACAAAAATTTTAAAAATAATGTAAGCACGAAACTTTTAATTAGTACACAATTGATAACATTTTTCAACGTTCATCATTTTGTCAAAAACTCAAAAGTAAATTAGAAAGATTATAATTTATTTAAGCATCGTACTTAATTGGATTTTAAATTATGTTATAATATTTGTATTGTTAGTATATATGGGGGCGTTTCAA。

P21 P02795，

SEQ ID NO.17：

TTAACAATTAAAGTTATTAAACTAACCAAAAGATAAAAAAGAGTATTGATTTTTTAATTAGAAAAGTGTTAAAATTATGTGGTCGCGCTTTTAGAGCGCCCATTTCGTCACGAAATGTTAAGAGTGGGAGGGCAAAACTGAGCCCTGTGACCACATCACGATATCAAGGAGGTGCACATC。

P24 P02805，

SEQ ID NO.18：

TAAATGATATAAACAATTACAGGCTGAAAGAAATATCTTTCAGTCTGTAAAAATATATTGACAATAAGTAATTTCCAAGTTATATTACTTATTGTGATTATTTTACCTAAGACAGTAGGAGTTATTTATAACTTAAAATTTATCCTGCCGAGGCTAAAATTGACTTGAACGTGATGATCTATGATCTTTCAAGCACTTTTTGCCGTGGGTAGAAAGTGCTTTTTTTATTAATTTTAAAAAAAGCACCAAAAATTTAAATGGAGGTGTCTGA。

P25 P08620，

SEQ ID NO.19：

GAATATGTAGATACAAGTGAAGATTTAGACGGATACATGTTTTATATTTAATCGTATAAATACTATACTATAACATAAAAACTTCATATTATAATGTTTAGCGAACCTCCTTAGTGGTATATAAATATATACATCCAAGGAGGTTTCACT。

P31 PsarA：

SEQ ID NO.20：

CTGATATTTTTGACTAAACCAAATGCTAACCCAGAAATACAATCACTGTGTCTAATGAATAATTTGTTTTATAAACACTTTTTTGTTTACTTCTCATTTTTAATTAGTTATAATTAACTAAATAATAGAGCATTAAATATATTTAATAAAACTTATTTAATGCAAAATTATGACTAACATATCTATAATAAATAAAGATTAGATATCAATATATTATCGGGCAAATGTATCGAGCAAGATGCATCAAATAGGGAGGTTTTAAAC。

实施例2

本实施例提供了包含实施例1所述的活性组成型启动子的表达载体的构建，具体如下：

2.1、基于活性启动子序列表达载体的构建及评价。

本发明中基因表达载体的构建是基于大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体质粒pBUS1-Pcap-HC得来，如图4A所示。由于原始质粒只携带四环素抗性基因，而许多金葡菌对四环素具有天然抗性，因此我们首先在原始质粒的Bgl II位点插入了氯霉素抗性基因：以质粒pBT2(Addgene购买)为DNA模板，引物F(5’-ATCTTTTACTCAGCAATCGCCGTTAGAAAACCGACTGTAAAAAGT-3’)及R(5’-GAGAGAGTTCAAAATTGATCCTCGGCAATAGTTACCCTTATTATCAAG-3’)，利用高保真PCR酶GXL Premix(Takara)扩增出完整氯霉素抗性基因片段。PCR产物经纯化后，利用无缝克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)，将氯霉素抗性基因片段克隆至Bgl II线性化的pBUS1-Pcap-HC质粒中，得到质粒pBUS1_Pcap_HC_cat，如图4B所示。随后利用限制性内切酶Kpn I和Nde I将pBUS1_Pcap_HC_cat质粒中的Pcap启动子序列切掉，采用同样的克隆方法，将Pcap启动子序列替换成本发明鉴定的有活性的19个启动子序列，如图4C所示。生成19个携带不同组成型启动子活性的基因表达载体，见下表3。

表3携带不同组成型启动子活性的基因表达载体

2.2、基因表达载体评估。

为了评估所构建的表达载体是否能成功表达目的基因，将绿色荧光蛋白基因(gfp)在Nde I andXho I位点插入本发明所构建的表达载体中，生成一系列由不同启动子驱动gfp基因表达的载体。随后将这些质粒分别转入S.aureusUSA300_FPR3757中，利用氯霉素抗性筛选阳性目的菌落。

将得到的目的菌接种于TSB液体培养基中培养过夜。次日，取100μL接种于10mLTSB培养基中，培养6h至对数期期时，取200μL菌液，收集细菌并提取RNA，利用RT-qPCR检测每个菌株中gfp基因转录水平，如图5A结果所示，所有构建的表达载体都能在S.aureusUSA300_FPR3757中成功过表达gfp基因。

同时，取200μL菌液，抽提总蛋白，利用anti-his标签抗体，对重组表达的携带6*His标签的绿色荧光蛋白进行SDS-PAGE及Western blot检测。如图5B结果所示，所有载体也不同水平成功表达绿色荧光蛋白。说明本发明提供的金黄色葡萄球菌组成型启动子所构建的基因表达载体能够成功表达目的基因。

2.3、内源性基因(过氧化氢酶基因及转录抑制子purR)表达以验证本发明构建的基因过表达载体。

为了进一步评估本申请所构建的基因过表达载体，申请人随机挑选分别包含P00165(P10)，P08620(P25)，和P04400(P7)启动子的3个表达载体表达S.aureusUSA300_FPR3757的内源性基因：编码嘌呤生物合成通路的转录抑制子purR基因及过氧化氢酶基因(catalase)。以S.aureus USA300_FPR3757基因组DNA为模板，PCR扩增出purR及catalase基因，利用重组克隆法，在表达载体的Nde I、Xho I位点插入扩增的purR及catalase基因。测序验证后，将所得质粒转入S.aureusUSA300_FPR3757宿主菌中，得到相应过表达菌株。扩大培养过表达菌株，抽提RNA，利用荧光定量PCR，分别检测过purR及catalase基因表达水平。如图6A和6D所示，purR及catalase基因的表达水平在过表达菌株中明显高于野生型菌株。purR及catalase蛋白的过表达同时在蛋白水平得到验证，如图6B和6E所示，purR及catalase蛋白均在免疫印记(WB)中被检测到。

此外，过表达的purR的生物学活性得到验证，如图6C荧光定量PCR结果所示，purR转录抑制子所抑制的靶标基因(FnbA和FnbB)，在过表达菌株中明显低于野生型菌株。另外，利用基于双氧水-钼酸铵的过氧化氢酶活性检测方法，过表达的catalase的生物学活性也得到验证，如图6F所示，过表达菌株细胞裂解液的过氧化氢酶活性明显高于野生型菌株。说明应用本申请的金黄色葡萄球菌组成型启动子构建的表达载体能够在金葡菌内成功表达两个内源蛋白过氧化氢酶(catalase)和嘌呤合成途径的转录抑制子(purR)，并具备相应的生物学活性。因此本申请的金黄色葡萄球菌组成型启动子构建的表达载体能够为研究金葡菌耐药及毒力相关基因功能提供有效的支持。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用

<130> 2022.01.04

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 235

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 1

ttttacacca ctctcctcac tgtcattata cgatttagta caatctttta tcattatatt 60

gcctaactgt aggaaataaa tacttaactg ttaaatgtaa tttgtattta atattttaac 120

ataaaaaaaa ttacagttaa gaataaaaaa cgactagtta agaaaaattg gaaaataaat 180

gcttttagca tgttttaata taactagatc acagagatgt gatggaaaat agttg 235

<210> 2

<211> 434

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 2

ggagattggg ttaaaaaggc gaagaatgaa ctggatgata ttagtaagaa attaaaaaat 60

attcaaagaa cggaagttta atagcttata tgattcttgg agctaagaca gcatgcgttc 120

attcatgcca ttattaatat aagcaccgca acaaaaaagc ttctaatgtg atacaggaac 180

ctcatattcc gtatcatgtt agaagctttt aatgtctaaa gaacatctac attttatcat 240

attttctgac ttattaaact tttatataat taaatatttc ttaattttcc aaaatagtga 300

taaatttgtg aaatacatca caaatccctt tatttatttg gaaattcatg taatattaga 360

cttgtaagaa gttaataaat agagagagac gagagagttt atataaatac tatataaaca 420

ttggagtgat gatt 434

<210> 3

<211> 247

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 3

aataaccatt taatccttta tgtatttaat ttaattttag tatacacatt tatattacaa 60

aaatgaatgg ttaattaaaa atatatgggt atattcaata tatttattta aaaaaagcta 120

aaaatactta aaaaactata tacatatact aataatttat atattatttg agtaaggagc 180

actttttcaa aaaatagtgt ccctaaaaag ttttgataaa cttaaaatat tcaggaggtt 240

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<210> 4

<211> 363

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 4

acgtttaaca acacaagaat tattatatct aaatgaactt aaattagcaa taccttgtaa 60

ataaaaaatg tttatatttt tcactattat agagctattt atctaaaaag gttcaataag 120

acttaaatac gaattcaggc aacttaattg tgttaaatac agttttgaat gcctaactgt 180

atttcttttc tctttaaaat acagttaagt acattataag atgttgtgcg gataaacaaa 240

ctaattgtat caaatttatt ttaaaataac aacaacaaaa cgataagcga ataacatttc 300

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<210> 5

<211> 297

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 5

ttaatataaa aaatatcaaa tcaaacacgt tgatatagat taaaatttta aaagtttaca 60

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catcaaatta ttataagaaa taaatgtatt taaccatatt ctagtaataa aaatattgaa 180

tttttatact tatttgttta gaatgaactt tataacatag ttggatagag tttcgattta 240

ataaattaca tgtgaacctt gctacaacaa gatgtgcatc agaggagtgg tttaata 297

<210> 6

<211> 350

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 6

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gatatttagg aatgagatgc tattacggat aaagtaaaat cctatatgca tgcgtgctac 120

tcatttattc ttatttttaa tttcacatgg ctagtgacta atacatcata aatcattagt 180

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taaaatgacg tcaaatcaat atcaaaaatt atttaagtaa aatgtttaga taatttttca 300

gtgggtaagt attatatata acatttaatt attccgagga ggcatttatt 350

<210> 7

<211> 235

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 7

caactatttt ccatcacatc tctgtgatct agttatatta aaacatgcta aaagcattta 60

ttttccaatt tttcttaact agtcgttttt tattcttaac tgtaattttt tttatgttaa 120

aatattaaat acaaattaca tttaacagtt aagtatttat ttcctacagt taggcaatat 180

aatgataaaa gattgtacta aatcgtataa tgacagtgag gagagtggtg taaaa 235

<210> 8

<211> 150

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 8

acatatcgtg agcaatgaac tgattatact taacattaaa aaagatgata acaccttcta 60

cacctccata tcacaaaaat tataacatta ttttgacata aatactacat ttgtaatata 120

ctacaaatgt agtcttatat aaggagtata 150

<210> 9

<211> 216

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 9

tataacttgt tttgactagc tagcctaggt taaaatacaa ggtgagctta aatgtaagct 60

atcatcttta tagtttgatt ttttggggtg aatgcattat aaaagaattg taaaattctt 120

tttgcatcgc tataaataat ttctcatgat ggtgagaaac tatcatgaga gataaattta 180

aatattattt ttaattagaa taggagagat tttata 216

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 10

gggtgtaaat tatatgctaa aaatatcaga aaattcaaag tgtttgcgtt tgcacgatag 60

cgtaaaaatg ttaaaatata ataaagagtt accaataaag aggtttaagg agagattact 120

<210> 11

<211> 301

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 11

ctagccatca ttttcaattt attagacaat ttcaaacttt ttttattttc attcaattaa 60

cctttaattg aaagctattc tcaactttcc ttttaaatat gaagcaattt tttcaaaaac 120

gctattagtc acaaaatgta cacataattt taacaaatgt gtgaacccac gtcacacctt 180

gatttatcaa catttttgat acaattttat taattttttt cccataagcc cttgtaaata 240

ttgtgtaata acttaaaatt aatgttaagc cctacatttg tagtattagg aggtcaaaaa 300

a 301

<210> 12

<211> 217

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 12

ctttatcctc caatctactt ataaaatatt gtaattaatg actacatatt atgcaacggc 60

ttaaattgta taaaaatgta tacgtttgca tttagtataa ctatcgcatt tttcaaaaaa 120

tacacattta atctgcagta tttcaatgca ttgacgctat ttttttgata taattacttt 180

gaaaaatacg tgcgtaagca ctcaaggagg aactttc 217

<210> 13

<211> 356

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 13

attcattcac caccgttctt atgactaatt atatagaata attttcaatg ataataataa 60

aatgattcaa ggtacgaatt tacaataaag aaggaaataa aaaatatctc gaaaatagtt 120

gaactgacta agtatataaa gtaaaatata aaagtatgtg ttagacagat agaaaaatta 180

tgtgaaaagc cttgatttat cgatgttttt cgtgtaatat aactaacgtt ggactttaag 240

aaaagcgatg aagcgaaagg ttactgacac acccggccgc tttgccatgg cgctgtgtaa 300

gatagttttc gtggagaagt ctatcactaa atgtagacga ataaggaggg aaaatt 356

<210> 14

<211> 239

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 14

ttgccattga caaaaagctt gtgaaattat aagattatta acggtattgt tttatatcca 60

ccccacgata agccccggaa acttattgtg ttacaagata tataagcaga aacgaacaac 120

agttaacaaa ataaatgaaa ttaaacgttt taaaaatgaa acaaatgaaa tcatctatta 180

ggttatgaaa ctgtttatag cttgaataga agcatttatt ttttaggagg acaattatt 239

<210> 15

<211> 174

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 15

ttaataatga ggttttattt acaaaaacta gggaatatat tactaaatgg tacttcatct 60

tatatattaa aaataaattt aaagttatta atttattatg tttaagaaaa aaactgatgg 120

gtacatattt aatatgtttt taaattaact ttaactaagg aggtgtcgtt aggg 174

<210> 16

<211> 216

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 16

tttttgtacg tcaaaactta tacaaaaatt ttaaaaataa tgtaagcacg aaacttttaa 60

ttagtacaca attgataaca tttttcaacg ttcatcattt tgtcaaaaac tcaaaagtaa 120

attagaaaga ttataattta tttaagcatc gtacttaatt ggattttaaa ttatgttata 180

atatttgtat tgttagtata tatgggggcg tttcaa 216

<210> 17

<211> 180

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 17

ttaacaatta aagttattaa actaaccaaa agataaaaaa gagtattgat tttttaatta 60

gaaaagtgtt aaaattatgt ggtcgcgctt ttagagcgcc catttcgtca cgaaatgtta 120

agagtgggag ggcaaaactg agccctgtga ccacatcacg atatcaagga ggtgcacatc 180

<210> 18

<211> 271

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 18

taaatgatat aaacaattac aggctgaaag aaatatcttt cagtctgtaa aaatatattg 60

acaataagta atttccaagt tatattactt attgtgatta ttttacctaa gacagtagga 120

gttatttata acttaaaatt tatcctgccg aggctaaaat tgacttgaac gtgatgatct 180

atgatctttc aagcactttt tgccgtgggt agaaagtgct ttttttatta attttaaaaa 240

aagcaccaaa aatttaaatg gaggtgtctg a 271

<210> 19

<211> 150

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 19

gaatatgtag atacaagtga agatttagac ggatacatgt tttatattta atcgtataaa 60

tactatacta taacataaaa acttcatatt ataatgttta gcgaacctcc ttagtggtat 120

ataaatatat acatccaagg aggtttcact 150

<210> 20

<211> 264

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 20

ctgatatttt tgactaaacc aaatgctaac ccagaaatac aatcactgtg tctaatgaat 60

aatttgtttt ataaacactt ttttgtttac ttctcatttt taattagtta taattaacta 120

aataatagag cattaaatat atttaataaa acttatttaa tgcaaaatta tgactaacat 180

atctataata aataaagatt agatatcaat atattatcgg gcaaatgtat cgagcaagat 240

gcatcaaata gggaggtttt aaac 264

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌组成型启动子，其特征在于，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的金黄色葡萄球菌组成型启动子的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒插入权利要求1所述的组成型启动子构建而成。

4.一种如权利要求2所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括：

在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体质粒pBUS1-Pcap-HC的BglII位点插入氯霉素抗性基因，得到携带氯霉素抗性基因的pBUS1_Pcap_HC_cat质粒；

利用限制性内切酶KpnI和NdeI切掉pBUS1_Pcap_HC_cat质粒中的Pcap启动子，并替换为权利要求1所述的组成型启动子，得到携带组成型启动子的基因表达载体。

5.一种包括权利要求2所述的表达载体的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在表达载体的NdeI和XhoI位点插入绿色荧光蛋白基因GFP，以形成由权利要求1所述的组成型启动子驱动GFP基因表达的载体质粒；并将所形成的载体质粒转入MRSA的S.aureusUSA300_FPR3757菌株中培养形成。

7.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌组成型启动子在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。