KR102304761B1

KR102304761B1 - StSR4 유전자 교정에 의해 병 저항성이 증가된 감자 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체

Info

Publication number: KR102304761B1
Application number: KR1020200087764A
Authority: KR
Inventors: 김현순; 문기범; 전재흥; 박지선; 이효준; 김용삼
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2021-09-28

Abstract

본 발명은 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자 교정에 의해 병 저항성이 증가된 감자 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체에 관한 것으로, 본 발명의 유전체 교정 감자 식물체는 유전체를 교정하지 않은 감자 식물체에 비해 역병 저항성이 50% 증가되어, 감자 생산성 증대 효과를 기대할 수 있다.

Description

StSR4 유전자 교정에 의해 병 저항성이 증가된 감자 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체{Method for producing genome-edited potato plant with enhanced disease resistance by StSR4 gene editing and genome-edited potato plant with enhanced disease resistance produced by the same method}

본 발명은 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자 교정에 의해 병 저항성이 증가된 감자 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체에 관한 것이다.

세계 3대 작물의 하나인 감자(Solanum tuberosum)는 병 저항성 향상이 무엇보다 중요한 농업적 형질로서, 특히, 역병(late blight) 저항력이 증가된 신품종 개발은 감자 육종에서 최우선 과제이다. Phytophthora infestans (Montagne) de Bary의 감염에 의해 일어나는 감자역병의 경우, 잎에 생긴 갈색병반이 다습한 조건에서 급속히 포기 전체로 확대, 암갈색의 수침상이 되며 썩어 말라죽게 된다.

식물체의 열성 저항성은 침입한 병원균이 생존을 위해 필요로 하는 숙주의 유전자가 결여되거나 상호작용이 억제되었을 때 나타난다. 우성 저항성을 매개하는 R 유전자들을 이용한 전통적인 교배 육종을 통한 병 저항성 품종 개발은 특이적 반응을 통해 대상 병원균에 대해 강한 저항성을 유발하지만, R-Avr(avirulence) 유전자의 상호작용 특이성에 따라 병원균 인식의 스펙트럼이 좁고, 돌연변이가 빠르게 발생하는 병원균의 경우에 쉽게 저항성이 무너질 수 있다는 단점이 있다.

본 발명은 병원균이 병을 일으키는데 도움을 주는 식물체 내부의 감수성 유전자(susceptibility gene)를 녹-아웃(knock-out)시킴으로서 식물체의 병 저항성을 향상시키는 방법을 적용하였다.

한편, 한국공개특허 제2010-0082143호에는 파이토프소라속 균의 성장을 저해하는 유전자 군인 EnAP95를 이용한 '파이토프소라속 특이 항균유전자 및 이를 이용한 작물역병 방제 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0001299호에는 '역병 저항성을 증가시키는 NMMP1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'StSR4 유전자 교정에 의해 병 저항성이 증가된 감자 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 감수성 유전자인 signal response 4를 표적으로 외부 유전자의 삽입이 없는 DNA-free RNP(ribonucleoprotein) 방법에 의한 CRISPR/Cas9 시스템을 감자 원형질체에 도입하여 유전체 교정 감자 식물체를 제조하였고, 상기 유전체 교정 감자 식물체가 유전체를 교정하지 않은 감자 식물체에 비해 감자역병균(Phytophthora infestans)에 의한 역병 발생이 50% 이상 감소한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 감자 유래 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 병 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명의 제조방법을 통해 제조된 유전체 교정 감자 식물체는 유전체를 교정하지 않은 감자 식물체에 비해 역병 저항성이 50% 증가되어, 감자 생산성 증대 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 StSR4 유전자의 구조, 엑손 1의 서열 및 gRNA 표적 서열 선정 위치를 보여준다.
도 2는 StSR4 유전자의 엑손 1 서열 내 SNP(single nucleotide polymorphism)를 보여준다.
도 3은 추출 효소 및 추출 방법에 의한 감자 원형질체 추출 효율을 보여준다.
도 4는 캘러스 크기 및 배지 조성에 따른 감자 원형질체 유래 캘러스의 재분화 영향을 보여주는 사진이다. PR medium은 medium H에 비타민이 추가된 것이다.
도 5는 캘러스 greening 유도기간에 따른 감자 식물체 재분화 효율을 비교한 결과이다.
도 6은 Cas9과 gRNA의 복합체인 RNP(ribonucleoprotein)를 도입한 감자 원형질체 유래 micro-callus의 T7 엔도뉴클레아제1(T7E1) 분석법을 통한 InDel 확인 결과이다. F1: 돌연변이 없는 StSR4 유전자의 엑손 1 단편이 포함되어 있는 PCR 단편, SR4_1F1 및 SR4_1F2: SR4_1(1^st target gRNA site) gRNA에 의해 StSR4 유전자의 엑손 1 내 돌연변이 발생 시 유도될 수 있는 단편, SR4_3F1 및 SR4_3F2: SR4_3(3^rd target gRNA site) gRNA에 의해 StSR4 유전자의 엑손 1 내 돌연변이 발생 시 유도될 수 있는 단편.
도 7은 StSR4 유전자의 RNP 매개 InDel 효율을 분석한 것으로, A는 micro-callus에서의 InDel 효율을 나타낸 것이고, B는 재분화된 식물체의 전체 수와 InDel 변이를 가진 식물체의 수를 나타낸 것이고, C는 재분화 식물체에서의 InDel 효율을 나타낸다.
도 8은 StSR4 유전자를 표적으로 하는 RNP를 도입한 원형질체로부터 재분화된 감자 식물체 중 InDel이 유도된 식물체의 T7E1 분석 결과이다.
도 9는 SR4_1과 SR4_3 RNP에 의한 Indel 유도 감자 재분화 식물체의 mutation type 및 효율을 분석한 결과이다.
도 10은 SR4_3-55 식물체의 역병균(Phytophthora infestans)에 대한 병 저항성 검증 및 관련 유전자의 발현을 확인한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감자 유래 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 병 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

용어 '유전체/유전자 교정(genome/gene editing)'은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.

용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA는 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 3의 염기서열(20 bp)은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 StSR4 유전자(5,564 bp)에서 541~562번째에 위치한 첫 번째 엑손 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA 서열로, 첫 번째 엑손 부위를 표적으로 한 다른 가이드 RNA 서열에 비해 돌연변이 유도 효율이 높으며, 유전체 교정 후 재분화시킨 감자 식물체에서 우수한 역병 저항성을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.

또한, 상기 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 병은 역병, 검은무늬썩음병, 겹둥근무늬병, 균핵병, 홍색부패병, 무름병, 잿빛곰팡이병, 더뎅이병 및 풋마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 역병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

(a) 감자 유래 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및

(b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질은 전술한 것과 같다.

본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하는 것은, 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 식물세포는 원형질체이다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 원형질체는 감자 잎 시료 1.0~1.5 g에 10,000 unit/g의 셀룰라아제(Cellulase) 0.8~1.2 %(w/v), 3,000 unit/g의 마세로자임(Macerozyme) 0.3~0.7 %(w/v), 0.3~0.7 M 만니톨, 18~22 mM 염화칼륨, 8~12 mM 염화칼슘, 0.08~0.12 %(w/v) BSA(bovine serum albumin) 및 18~22 mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)로 이루어진 pH 5.5~6.0의 추출 버퍼를 25~35 ㎖ 첨가하여 5.5~6.5 시간 반응시킨 후, 상기 추출 버퍼의 3배 부피의 세척 버퍼를 첨가한 후 분리한 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는, 감자 잎 시료 1.2 g에 10,000 unit/g의 셀룰라아제 1.0 %(w/v), 3,000 unit/g의 마세로자임 0.5 %(w/v), 0.5 M 만니톨, 20 mM 염화칼륨, 8~12 mM 염화칼슘, 0.1 %(w/v) BSA 및 20 mM MES로 이루어진 pH 5.7의 추출 버퍼를 30 ㎖ 첨가하여 6.0 시간 반응시킨 후, 상기 추출 버퍼의 3배 부피의 세척 버퍼를 첨가한 후 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같은 본 발명의 감자 원형질체 추출 방법은 종래 방법에 비해 원형질체 추출 수율을 3.7배 높인 것이다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 병은 역병, 검은무늬썩음병, 겹둥근무늬병, 균핵병, 홍색부패병, 무름병, 잿빛곰팡이병, 더뎅이병 및 풋마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 역병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체는 식물 병원균이 병을 일으키는데 도움을 주는 식물체 내부의 감수성 유전자인 StSR4 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 감자 유래 StSR4 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 감자 식물체에 비해 병 저항성이 증진되는 형질을 가지는 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체이다.

본 발명은 또한, (a) 감자 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein)를 감자 원형질체에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 감자 원형질체로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법에 있어서, 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 감자 원형질체에 도입하여 유전체를 교정하는 방법, 감자 원형질체의 추출 방법 및 재분화 단계는 전술한 것과 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감수성 유전자 StSR4 의 가이드 RNA 서열 동정

CAMTA3 (Calmodulin-binding transcription activator 3)의 일종인 감자의 SR4 유전자 (Solanum tuberosum signal response 4, 이하 StSR4)는 애기장대 SR1 유전자 서열을 감자표준유전체정보 (https://solgenomics.net/organism/Solanum_ tuberosum/genome)에 정렬(alignment)하여 유전자 정보를 확보하였다. StSR4 유전자는 총 5개의 엑손으로 구성되어 있으며 엑손 1을 표적 부위으로 하는 총 3개의 sgRNA 표적 부위를 선정였다: 1^st target gRNA site; SR4_1, 2^nd target gRNA site; SR4_2 및 3^rd target gRNA site; SR4_3 (도 1). StSR4 엑손 1 서열을 PCR로 증폭한 후, 유전체 정보(genome sequence)가 밝혀진 2배체 감자 데이터베이스(S. tuberosum group Phureja DM1-3 Pseudomolecules (v4.03))를 참조서열(reference)로 하여 해당 부분이 포함되어 있는 염색체 1번의 33,294,896 - 33,299,175 nt에 위치하는 서열과 비교분석한 결과, +49 bp에서 C/T의 SNP(single nucleotide polymorphism)가 확인되었다(도 2). 상기 위치는 두 번째 sgRNA 표적 후보 위치 뒤에 바로 인접한 것으로, 상기 결과를 바탕으로 SNP-free genomic region에서 CRISPR/Cas9 적용을 위한 sgRNA는 최종 2개를 선택하였다(SR4_1 및 SR4_3).

실시예 2. 원형질체 추출 효율 증가 및 원형질체로부터 완전한 식물체로의 재분화 효율 증가를 위한 조건 최적화

현재까지 보고된 감자 잎으로부터 원형질체 추출 효율은 7.6 x 10⁵~ 1.9 x 10⁶protoplasts/g FW(fresh weight) 수준으로 알려져 있다. 본 발명에서는 Desiree 품종(Solanum tuberosum L. cv. Desiree)의 잎 시료 1.2 g을 대상으로 Nicolia 등 (J. Biotechnol. (2015) 204:17-24)의 방법(M1)에서 추출 용액을 변경 (20 mM MES, 1% Cellulase, 0.5% Macerozyme, 0.5 M Mannitol, 20 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 0.1% BSA, pH 5.7)한 방법(M2) 및, 상기 변경한 추출 용액 반응 후 추출 용액에 포함된 Cellulase와 Macerozyme의 반응이 끝나는 시점(enzymolysis time)에 추출 용액 부피(30 ㎖)의 3배 부피의 세척 용액(Nicolia 등의 문헌에서 Wash solution과 동일 조성)을 첨가하여 추출 용액의 희석을 최대화하는 방법(Modified M2)을 확립하였고, 각각의 방법을 적용하여 감자 원형질체 추출 효율을 분석한 결과, enzymolysis time 6시간의 Modified M2 방법에서 최대 6.95 x 10⁶ protoplasts/g FW의 원형질체 추출 효율을 확인할 수 있었다(도 3). 이는 종래 보고된 감자 식물체로부터 원형질체 추출 효율에 비해 약 3.7배 높은 수준이며, 추출 용액의 3배 부피의 세척 용액을 적용한 감자 원형질체 추출 방법은 본 발명에서 처음 제안되는 바이다.

세포벽이 제거된 단일세포인 원형질체로부터 식물체를 만들어 내기 위한 가장 유의미한 단계는 RNP가 도입된 후 원형질체가 세포벽이 완벽히 재생되어 2세포, 4세포 나아가 다세포로 무사히 분열하는 것이다. 가장 최적의 조건으로는 초반의 암상태(medium E에서 2~3주간 24℃, 암상태) 유지가 매우 중요하며 micro-callus (육안 식별 가능하며 1 mm 미만)가 형성되고 난 이후 명상태로 유지하는 것이 필요하다. 또한 micro-callus의 원활한 유도를 위하여 알지네이드(alginate) 코팅 과정이 필요하며, mini callus (1 mm 이상) 유도 후 적절한 재분화 배지 (Medium H)와 0.5 cm 이상되는 캘러스의 크기가 식물체 재분화에 중요함을 확인하였다(도 4). 또한 캘러스의 greening 유도기간에 따른 재분화 효율의 차이를 확인하였고, 6주 동안 greening을 유도한 캘러스 (Condition C)에서 가장 높은 83.65%의 재분화 효율을 보여, 원형질체 유래 높은 재분화 식물체 유도 조건을 확립하였다(도 5). 본 발명에서 사용된 Medium E, Medium F, Medium G 및 Medium H는 Nicolia 등(2015)의 supplementary data (http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.03.021.)에 개시되어 있다.

실시예 3. StSR4 유전자 녹-아웃을 위한 감자 원형질체에 RNP(ribonucleoprotein) 매개 CRISPR/Cas9 적용

감자 원형질체를 대상으로 SR4_1(5'-GCTACAGAGAAAGTTCTACT'3', 서열번호 2)과 SR4_3(5'-ACAGATTGACAATTACTTCT-3', 서열번호 3)을 각각 포함하는 20 ㎍의 RNP를 PEG 방법으로 감자 원형질체에 적용하였다. 구체적으로, 10 ㎍의 SpCas9 단백질과 10 ㎍의 gRNA를 상온에서 15분간 반응시켜 RNP 복합체를 유도한 후, 감자 원형질체(1 x 10⁵)와 PEG 용액(40% PEG 4000, 0.2M Mannitol 및 0.1M CaCl₂)을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. RNP가 도입된 원형질체는 24℃에서 7일간 암조건으로 medium-E (Nicolia et al. 2015) 액체배양을 통해 micro-callus를 유도하여 InDel 분석을 진행하였고, 더불어 알지네이드(alginate) 코팅한 원형질체는 3주간 암조건에서 micro-callus를 유도한 후 24℃에서 명배양(광주기-16시간 명/8시간 암)으로 재분화 식물체를 유도하였다. SR4_2는 InDel 분석에서 그 효율이 상대적으로 낮아 제외하였다. Micro-callus 유도 7일 후 각각의 시료로부터 genomic DNA를 추출하였고 표적 부위의 InDel 유무를 확인하기 위하여, 0.5 ㎕ (5 U) T7E1 효소(New England Bio Labs, USA)를 사용하여 T7E1 분석법을 수행하였다.

그 결과, SR4_1과 SR4_3 두 표적 자리에서 InDel 변이가 확인되었고(도 6), SR4_1는 약 25%, SR4_3은 약 35%의 효율로 InDel이 유도되었음을 알 수 있었다(도 7A). SR4_1과 SR4_3을 표적으로 하는 RNP를 도입한 원형질체로부터 각각 700여개의 재분화 식물체를 확보하였고, Sanger sequencing 방법을 이용하여 InDel 유도 식물체를 선별하였다. 그 결과, SR4_1과 SR4_3 두 표적 자리에서 Micro-callus와 유사한 수준으로 InDel이 유도된 식물체가 확인되었다(도 7B 및 7C). 이렇게 확보된 InDel 유도 식물체를 T7E1 분석을 통하여 2차 검증을 실시하였다(도 8). 상기와 같은 InDel 효율은 지금까지 보고된 감자의 RNP 매개 유전자교정 효율에 비해 매우 높은 수준으로, 본 발명에서는 3차례 이상의 반복 실험과 많은 재분화 개체수에 의해 확보된 안정적인 수준의 결과이다.

실시예 4. 유전자교정된 감자 식물체의 분석

확보한 SR4_1과 SR4_3 각각의 유전자교정 식물체들의 Targeted deep sequencing을 통하여 4배체 염색체에서 1개, 2개, 3개 및 4개 염색체가 모두 InDel 유도되어 돌연변이된 식물체를 확보하였다(도 9A). SR4_1의 경우 1개의 염색체가 돌연변이된 경우가 가장 많았으며, SR4_3의 경우 2개의 염색체가 돌연변이된 경우가 가장 많았다. 이 중에서 Frame-shift가 유도되어 각 염색체에서 녹-아웃(KO)이 유도된 식물체를 확보하였다(도 9B).

상기 식물체에 역병균 (Phytopthora infestans)을 접종하여 병 저항성을 분석하였다. 구체적으로, 유주자(zoospore) 현탁액을 3 x 10⁴ sporangia/㎖로 조정한 후 3주령의 감자 식물체의 잎에 엽면분사하고, 95~100%의 높은 습도를 유지시키며 20℃ 조건에서 5일간 배양시켰다. 감자 식물체는 역병균에 감염되면 대부분의 조직이 완전히 괴사되기 때문에 대조군인 Desiree 품종 식물체의 거의 대부분의 조직이 완전히 괴사가 진행된 시기를 기준으로 분석을 진행하였다. 병원균 접종 5일 후 발병 정도를 파악하여 저항성을 비교하였으며, 발병 정도의 판단은 식물체 잎의 괴사된 비율을 이용하여 판단하였다. 그 결과, SR4_3 표적 자리의 서열이 2개의 염색체에서 교정이 이루어진 식물체 55번(3-55)은 대조구에 비해 역병 발병이 51.7% 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 10A).

상기 SR4_3-55 식물체의 역병에 대한 향상된 저항성이 StSR4 유전자의 기능 손실로 인한 살리실산(salicylic acid, SA) 증가의 영향인지 확인하기 위하여 유리(Free) 살리실산 수준을 분석하였다. 100 ㎎의 frozen grinded SR4_3-55 식물체의 잎을 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 1 ㎍/㎖ SA를 내부 표준(internal standard)로서 첨가한 뒤, 1시간 동안 진공농축기(vacuum concentrator)를 이용하여 건조시켰다. 70% 메탄올을 상기 건조된 시료에 첨가하여 녹인 후 SA 측정을 위하여 LC/MS 분석을 진행하였다. 분석은 10개의 식물체를 이용하여 총 5 biological replicate로 진행되었다. 그 결과, SR4_3-55 식물체는 대조구 식물체 대비 약 4배 정도 향상된 유리 살리실산 수준을 확인할 수 있었다(도 10B). 또한, SYBR Green Master Mix (Enzynomics Co., Korea)와 유전자 특이적 프라이머 세트를 이용하여 살리실산 합성에 관련된 유전자(EDS1, PR1)의 전사체 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과, EDS1 및 PR1 유전자 모두 SR4_3-55 식물체에서 증가된 전사체 발현 수준을 보여주었다(도 10C 및 10D).

qRT-PCR에 사용된 프라이머 정보

프라이머명	서열정보 (5'→3')	서열번호
StEDS1_F	GACACAGTTTCGCAGGCAAG	4
StEDS1_R	CCAGCCATTTGCAGCTGTTT	5
StPR1_F	CAGCTGTGCAATTGTGGGTG	6
StPR1_R	GTTGTCCGACCCAGTTTCCA	7

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for producing genome-edited potato plant with enhanced disease resistance by StSR4 gene editing and genome-edited potato plant with enhanced disease resistance produced by the same method <130> PN20133 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5564 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 1 cggggatgaa gacagagagt tatcaagcta catgtagcaa actgacttat tatgagatgg 60 cgtgtgattc ttagtctcta tcatagtaga ttaacatata ttattgatat gtgccatgca 120 gggttacaga ataggtgcct cccgtctgca acctgtacat ccagggttat tgcttgaaaa 180 tcctgaaagt agttccaagc cttgctttgt atttggccca acatttcaga aatctcatac 240 atcaaatcca agcttagttg actggaaaga acaagcactc tcttctgaac ttcacagtgg 300 tgattccaaa ggtagttttc tctttgatgc ttcccttaat tcataatgtt tggataagga 360 aactggtaca gtattatagc acttcataag ttgttcttat ataatacaaa ctaaggacct 420 tgttttgtct tgtaaggact tatggagttc tcgaggtcgc aggagaggtt tcagctcaat 480 ccacaagtta gagcattcat gtcttctggc tttcgtagat cagacagaaa tttaaatgtt 540 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gctctcagac agttattact cctgatgctg cagttaaaac tagttccttg 1440 gatggtggac tcaacagtga tgaagttgga agcctaaaga aacttgatat ccttggaaga 1500 tggatggata gagagatcgg tggagactgc aacaagtctc tgatggcctc tgattctggc 1560 aactactgga atacccttga cactgataat ggggataaag aagtttccac tttatcacgt 1620 cacatgctgt tggaagctga ttccgtaggc acttctccat cccaaaagca gctgttcagg 1680 atctttgatt tttctccaca atgggccttc tcaggagtgg aaacaaaggt aaacttatct 1740 gatctgatag aatggtccat ttttctactc gtaactttga aatcacatga agagatattg 1800 tattagttgt aaatgttaaa gattcagata tacaacttta tttctcttca ggttttgatt 1860 gtaggtacct ttcttgtcca tgggaaacat cttacctgtc agaaatggag ctgcatgttt 1920 ggtgaagttg aggtgtctgc agaagttcag actcaaagta ttcgatgtca agttcctttt 1980 catgctcctg gacgtgttcc tttttatgta acctgcagca ataggttagc atgcagtgag 2040 gttcgggagt ttgaatatcg tgaaaaatca tcagaacttg ctcttgccct tcgaccaagt 2100 gatgaagtgc gtctgcaagt acaactagct aaattgctat attcaggact aaacaaaaaa 2160 ttcttggatt gctccagtgg agagtgtgaa aagtgtaaat tgaagactca gttatgttct 2220 ttgaaatgca agactggaaa tgctactgaa agattagagg acttacttgc cattattgaa 2280 tgcgatcaca tcaacttcaa agatgtgcag attcagaatt tcatgaagga taaactttat 2340 gaatggctag tctctagagc acacgaagaa gataaaggtc caaatatttt gaatgacaaa 2400 ggcaaagggg ttattcatct agtggctgcc ctaggttatg aatgggggtt gcttccatta 2460 attgctgccg gtattagtcc taatttccga gatgcatgtg gtaggacagc tcttcactgg 2520 gccgcacgtc atggaaggtg agtggcccca tcaattttgt acctggacta actaatttat 2580 cctcaacatc aaaacctttt agagtttatt agctcattgc ttttaagttt cttctttctc 2640 cattgggcat ctagtgagcc tacgttaaat agcagctctg taaggcaggt ccaacccaac 2700 cagcttcctc ctgtatgcat taagaacatc actcttccat taaaggcagt tgtttagaga 2760 catgtctctg ctttatgctt cctgtaccca tagttaattg aaatgtgcat gcatttataa 2820 taataatagt tgaataatga agaccataaa gttctctttg tttctatagt gtattccttg 2880 ccatttgatc atgcattttc cattgaaatt cacctcgggt aagtgtgaat ttcaatacta 2940 tatttgtgaa gagaaaaaac tgtctgagca cgtcccaaga attctgcaac agaagcttca 3000 taagtgagct atgtgttgca tttattgata cattacttca gcagttgaat tattgatagc 3060 aaaaaggaaa 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gaaaatatta tttacaattg ggtactaagc ctgtcaactt caccgttctt 3960 cttgttagtg atgtaacttt tcacatgaga agtagaagag tactgtccat agtttcgttc 4020 ttactaaaga ctgcacaaga agggtaataa attatatatt acatagtgca agttgttttt 4080 tctccctctg ttggtcccaa tgatttggct tttgcttaaa ctgactctgt gccggaagtg 4140 taagattgtc tgtccctaga tgctttaagc aagtgtgtag atgatgatgg ttagattgtg 4200 actgccatca aatcacttcc gaaccctgct aatcacatct cctcagccct cttagtttac 4260 tggcctttat gtacttgaaa ttttacacaa acttgtggtg tggacttctc ataaatcact 4320 ttcactctga agtttgttta gataatcttt ccctgatgta tttgatgagg taattgactt 4380 ttatttcact aacttaaatt ggactttgca aatatgtttg ctgaatcatt aataatctct 4440 caaccttcag agtgcagtca aaaagatttt acatcatgtt atgatttcag gctcatgtac 4500 gtggacatca agttcgcaag caatataaaa agtttgtatg gtcggtcggt atacttgaaa 4560 aaggcatttt gcgttggagg aggaaaaaaa caggattacg aggatttcgg ccagaaaaaa 4620 ctagtcagaa aggaatacta gagcctgaga agaaggatga gtatgattat ctaagtattg 4680 gtctaaaaca gaagtctgct ggagttgaga aggctttggc aagagttcag tccatggtac 4740 gtcatccaga ggcaagagat cagtatatga ggctggttgc caagtttaaa agttgtaagg 4800 tgagtctaat cttctggtag gtgaatttag aatctaacaa cattcaagcc gcctcttgta 4860 ataatgcaag ggccagcaac gcattgtacc tgtgtttatt ttactatcta ttctgttatg 4920 catgacatgg tagatctctt gcatgtaaac ccacttcgta cgaggagact gcacctctta 4980 tcttatgtat gctgaagtcc agtcctccgt gcttgtacat ctagtggtga aaaacaagaa 5040 tgagtgggtt tcttgcagta gataagcata aagctaatgt tgttgtagat cccttgtgct 5100 tatccacctt aaatgttact atttgctacg aatgccagtg accaatcaac taacagactt 5160 ttgtttgttt ctgcagctgg atgacggagg gagagaagta aataggtcat cttcaccagt 5220 ttaggttttc aatatatgag caaaggctct ccaattgttt gtagactaaa atgtacggat 5280 tgtagtctaa catgtctgaa atatagtcat ctgggaagag aaaggagggg tacatacatt 5340 gcgtttttct ggtgttgtaa tcatacccgg ttcccatgag gttagaatga tcaaaatgta 5400 cagagagatt gtatagtgca tttagggtgg aaccccaaca aatagattcc atctactggg 5460 agcataagta aatgagaagt ctgtgtgtca aatatattct tgcatcgaat gttaatactc 5520 ctgcaatgtt aatatttttt taaaatataa tgttgtagtt ttct 5564 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StSr4 target sequence for gRNA <400> 2 gctacagaga aagttctact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SR4_3 <400> 3 acagattgac aattacttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gacacagttt cgcaggcaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccagccattt gcagctgttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cagctgtgca attgtgggtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gttgtccgac ccagtttcca 20

Claims

서열번호 3의 염기서열로 이루어진 감자 유래 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 병 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
삭제
(a) 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 감자 유래 StSR4 (Solanum tuberosum Signal Response 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하는 것은, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 감자 유래 StSR4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제3항에 있어서, 상기 식물세포는 원형질체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 원형질체는 감자 잎 시료 1.0~1.5 g에 10,000 unit/g의 셀룰라아제(Cellulase) 0.8~1.2 %(w/v), 3,000 unit/g의 마세로자임(Macerozyme) 0.3~0.7 %(w/v), 0.3~0.7 M 만니톨, 18~22 mM 염화칼륨, 8~12 mM 염화칼슘, 0.08~0.12 %(w/v) BSA(bovine serum albumin) 및 18~22 mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)로 이루어진 pH 5.5~6.0의 추출 버퍼를 25~35 ㎖ 첨가하여 5.5~6.5 시간 반응시킨 후, 상기 추출 버퍼의 3배 부피의 세척 버퍼를 첨가한 후 분리한 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 병은 역병, 검은무늬썩음병, 겹둥근무늬병, 균핵병, 홍색부패병, 무름병, 잿빛곰팡이병, 더뎅이병 및 풋마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 유전체 교정 감자 식물체.
제9항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.
(a) 감자 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein)를 감자 원형질체에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 감자 원형질체로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법으로서,
상기 (a) 단계의 원형질체는 감자 잎 시료 1.0~1.5 g에 10,000 unit/g의 셀룰라아제(Cellulase) 0.8~1.2 %(w/v), 3,000 unit/g의 마세로자임(Macerozyme) 0.3~0.7 %(w/v), 0.3~0.7 M 만니톨, 18~22 mM 염화칼륨, 8~12 mM 염화칼슘, 0.08~0.12 %(w/v) BSA(bovine serum albumin) 및 18~22 mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)로 이루어진 pH 5.5~6.0의 추출 버퍼를 25~35 ㎖ 첨가하여 5.5~6.5 시간 반응시킨 후, 상기 추출 버퍼의 3배 부피의 세척 버퍼를 첨가한 후 분리한 것을 특징으로 하는 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법.
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