CN117568319B - 水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用，属于基因工程和植物遗传育种技术领域。本发明通过实验证明，将OsPOP8基因在水稻品种ZH11中过表达，可获得粒型增大的转基因水稻；在ZH11中通过干扰技术降低该基因表达水平可以获得粒型减小的水稻材料。与ZH11相比，OsPOP8的过表达转基因水稻株系中，粒宽显著增加、粒长显著变长及粒重显著增加。因此，OsPOP8基因与水稻粒型相关，为培育粒型改变的转基因作物奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和植物遗传育种技术领域，具体而言，涉及水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用。
背景技术
水稻是全世界最主要的粮食作物之一，以之为主食的人口数量占据着世界人口的一半以上。虽然经过了矮杆和杂种优势的广泛应用，水稻产量得到了极大程度的提升，但随着人口数量的增长、全球气候变暖加剧以及耕地面积持续的减少，粮食安全依然面临着更为严峻的挑战。因此，水稻高产育种仍然是当今水稻育种的主要目标之一。水稻的产量由3个关键因素决定：粒重、有效穗数和每穗粒数。其中，粒重与粒型、籽粒灌浆程度密切相关，而粒型由籽粒粒长、粒宽和粒厚决定。
目前，已经鉴定了许多水稻粒型相关数量性状位点，其编码蛋白质种类繁多，功能也不尽相同。水稻粒型调控主要涉及泛素-蛋白酶体途径、G蛋白信号通路、MAPK级联、miRNA相关通路及植物激素信号通路等。本发明中的OsPOP8基因编码脯氨酰寡肽酶，该基因家族成员在水稻中的功能研究暂未报道。因此OsPOP8为一个调控水稻粒型及粒重的新基因，深入探究其调控粒型的分子机制，将有助于为分子设计育种改良水稻粒型提供理论依据，最终实现高产育种。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用，通过调控OsPOP8基因的表达水平，为水稻籽粒改良提供新的思路和方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了OsPOP8蛋白的应用，为如下(1)-(4)中的至少一种：
(1)调控水稻粒长；
(2)调控水稻粒宽；
(3)调控水稻粒厚；
(4)调控水稻粒重；
其中，OsPOP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
尽管目前已克隆到了一些调控水稻粒型的基因，但脯氨酰寡肽酶基因家族是如何影响植物生长发育的分子机制暂未报道。而本发明获得了一种突变体材料，其与R225品种相比，粒长、粒宽、粒厚与千粒重均显著增加。经T-DNA插入位点的鉴定，成功克隆了一个新的调控籽粒粒型和粒重的基因OsPOP8，该基因编码脯氨酰寡肽酶。
进一步通过遗传转化实验，发现该基因在中花11(ZH11)中过表达可使籽粒的粒长变长、粒宽变宽、粒厚变厚且粒重增加，在ZH11中降低OsPOP8的表达水平则使籽粒的粒长变短、粒宽变窄、粒厚变薄且粒重减少。表明OsPOP8具有重要的粒型改良应用潜力，同时可用于深入研究OsPOP8调控水稻粒型的分子机制，进而对阐明植物籽粒发育分子机理并通过基因工程手段培育优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
第二方面，本发明提供了编码OsPOP8蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
第三方面，本发明提供了上述核酸分子的应用，为如下(1)-(4)中的至少一种：
(1)调控水稻粒长；
(2)调控水稻粒宽；
(3)调控水稻粒厚；
(4)调控水稻粒重。
第四方面，本发明提供了含有上述核酸分子的生物材料，该生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。
第五方面，本发明提供了上述生物材料的应用，为如下(1)-(4)中的至少一种：
(1)调控水稻粒长；
(2)调控水稻粒宽；
(3)调控水稻粒厚；
(4)调控水稻粒重。
第六方面，本发明还提供了一种改良水稻粒型和粒重的方法，其包括通过转基因或改变OsPOP8基因的启动子序列提高OsPOP8基因的表达。
在可选的实施方式中，上述粒型包括水稻籽粒的粒长、粒宽和粒厚。
在可选的实施方式中，转基因水稻是通过向野生型水稻中导入编码OsPOP8蛋白的核酸分子获得的。
在可选的实施方式中，OsPOP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述OsPOP8蛋白的氨基酸序列如(1)或(2)所示：(1)SEQ ID NO.1；(2)有SEQ IDNO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸得到的且与SEQ ID NO.1具有相同生物活性的衍生序列。
应该理解为，在不影响OsPOP8蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsPOP8蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
在可选的实施方式中，OsPOP8蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
需要说明的是，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为OsPOP8基因的cDNA序列。
本发明还包括与OsPOP8基因具有90％以上同源性，优选95％更优选99％以上同源性且编码脯氨酰寡肽酶的基因。
在可选的实施方式中，OsPOP8基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示。
本领域技术人员可以替换OsPOP8基因的启动子序列中部分顺式作用元件，或通过其它手段改变启动子活性，从而改变OsPOP8基因表达水平。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过实验证明，将OsPOP8基因在水稻品种ZH11中过表达，可获得粒型增大的转基因水稻；在ZH11中通过干扰技术降低该基因表达水平可以获得粒型减小的水稻材料。与ZH11相比，OsPOP8的过表达转基因水稻株系中，粒宽显著增加、粒长显著变长及粒重显著增加。因此，OsPOP8基因与水稻粒型相关，为培育粒型改变的转基因作物奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中R225和grain length 3(gl3)突变体的籽粒表型及统计图，图1A为籽粒表型，标尺为1cm；图1B、图1C、图1D、图1E分别指粒长、粒厚、粒宽与千粒重统计图，数据采用GraphPad软件进行显著性分析(t-test)，其中“**”与“***”分别代表p<0.01与p<0.001；
图2为实施例1中gl3突变体经三代测序后的序列比对图，图2A为测序产生的序列数据，图2B为序列数据经Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对后的结果。其中黄色标记序列为T-DNA插入序列，绿色标记序列为水稻日本睛第3号染色体LOC_Os03g24450基因部分序列；
图3为实施例1中对gl3突变体中T-DNA的插入位点的鉴定图，图3A为T-DNA插入位点模式图，倒三角形代表T-DNA插入；图3B与图3C为PCR对插入位点的鉴定图；
图4为实施例2中ZH11和OsPOP8基因过表达株系性状统计图，图4A为OsPOP8基因过表达株系的籽粒图，标尺为1cm；图4B为过表达株系中OsPOP8基因表达水平检测图；图4C、图4D、图4E、图4F分别为过表达转基因株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚与千粒重统计图，其中，OE-1、OE-2与OE-3指OsPOP8基因过表达的三个株系，“*”、“**”与“***”分别代表p<0.05、p<0.01与p<0.001；
图5为实施例3中ZH11和OsPOP8基因干扰株系性状统计图，图5A为OsPOP8基因干扰株系的籽粒图；图5B为干扰株系中OsPOP8基因表达水平检测图；图5C、图5D、图5E、图5F分别为干扰株系籽粒粒长、粒宽、粒厚与千粒重统计图，其中，Ri-1、Ri-2与Ri-3指OsPOP8基因干扰的三个株系，“*”、“**”与“***”分别代表p<0.05、p<0.01与p<0.001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例为GL3基因的克隆，具体如下：
本发明鉴定到一个水稻籽粒增大的突变体gl3(图1A)，相对于R225，该突变体籽粒的粒长、粒厚、粒宽及千粒重均显著增加(图1B-D)。
提取突变体叶片基因组DNA，并于北京百迈客生物科技有限公司进行重测序。利用T-DNA序列和重测序产生的DNA序列进行序列比对(图2A)，分析该突变体中T-DNA的插入位点，初步确定T-DNA插入到水稻基因组的第3号染色体的13935010bp位置(图2B)。
根据上述测序结果，于水稻3号染色体的13935010bp左右两侧及T-DNA分别设计引物(图3A)，进一步验证T-DNA的插入位点，引物序列如下：
GSP-F：5'-TCCAAGCAAGACAGCACCAA-3'；
GSP-R：5'-GATAAGCCCATGAACTACAACA-3'；
TSP-F：5'-GCGGATTTCGGCTCCAACAA-3'。
分别用GSP-F/R与TSP-F/GSP-R引物对扩增ZH11与突变体的DNA(图3B-C)，对扩增片段进行测序鉴定，确定T-DNA插入于OsPOP8基因起始密码子前的-105bp处，此插入位点正好处于OsPOP8基因5’UTL区域(图3A)。
实施例2
本实施例为GL3基因的过表达分析，具体如下：
提取水稻ZH11的RNA，并将其反转录成cDNA，采用KOD高保真DNA聚合酶以ZH11的cDNA为模板，利用引物对：
5'-AGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGACCAGCTCGTCAATTTCAT-3'，
5'-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAGTCATTGTTCTTGAACAAGGAA-3'；
扩增出OsPOP8基因的cDNA序列，通过同源重组技术将OsPOP8基因的cDNA插入pC1300S载体的多克隆位点5'KpnI/BamHI 3'之间，构建出OsPOP8基因的超表达载体pC1300S-OsPOP8。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种ZH11中。
得到的所有转基因幼苗经潮霉素溶液筛选后，移栽于温室中种植，阳性植株单株收种，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即OsPOP8基因的超表达株系。于水稻孕穗期取2-4cm幼穗，提取RNA，反转录为cDNA后检测超表达株系中OsPOP8基因的表达水平，并于水稻黄熟期对籽粒性状进行调查统计。
调查统计结果如图4所示，从图4A中可以看出超表达株系籽粒明显增大，从图4B中可以看出OsPOP8基因表达水平均显著高于ZH11，图4C-F的统计结果表明超表达植株籽粒的粒长、粒宽、粒厚和千粒重均显著高于ZH11。
实施例3
本实施例为GL3基因的干扰分析，具体如下：
根据OsPOP8基因的cDNA序列，利用引物对：
F1：5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATAATGTGCTAAACCCT-3(BamH I)，
R1：5’-TCTGTCGACCTCGAGGGTACCATTTCTGTCAGCCCTGTC-3’(Kpn I)；
F2：5’-GATTTTCAGATCGATACTAGTATTTCTGTCAGCCCTGTC-3’(SpeI)，
R2：5’-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCCCATAATGTGCTAAACCCT-3’(Sac I)；
分别扩增出OsPOP8基因的cDNA的正向和反向干扰片段，通过同源重组技术分别连入pTCK303干扰载体，构建出OsPOP8基因的干扰表达载体pTCK303-OsPOP8。
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入粳稻品种ZH11中。T2代纯合的OsPOP8转基因干扰株系鉴定方法同OsPOP8超表达株系的鉴定。
类似地，于水稻孕穗期取2-4cm幼穗，提取RNA，反转录为cDNA后检测OsPOP8干扰株系中OsPOP8基因的表达水平，并于水稻黄熟期对籽粒性状进行调查统计。
结果如图5所示，OsPOP8干扰株系籽粒明显减小(图5A)，OsPOP8基因表达水平均显著低于ZH11(图5B)。统计结果表明OsPOP8干扰株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚和千粒重相比于ZH11均显著下降(图5C-F)，进一步证明了OsPOP8基因对水稻籽粒粒型发育的影响。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.OsPOP8蛋白的应用，为如下（1）-（4）中的至少一种：
（1）调控水稻粒长；
（2）调控水稻粒宽；
（3）调控水稻粒厚；
（4）调控水稻粒重；
所述OsPOP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的OsPOP8蛋白的核酸分子的应用，其特征在于， 所述应用为如下（1）-（4）中的至少一种：
（1）调控水稻粒长；
（2）调控水稻粒宽；
（3）调控水稻粒厚；
（4）调控水稻粒重；
所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求2所述的核酸分子的生物材料的应用，其特征在于，为如下（1）-（4）中的至少一种：
（1）调控水稻粒长；
（2）调控水稻粒宽；
（3）调控水稻粒厚；
（4）调控水稻粒重；
所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。
4.一种改良水稻粒型和粒重的方法，其特征在于，包括通过转基因或改变OsPOP8基因的启动子序列提高OsPOP8基因的表达；
所述OsPOP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述OsPOP8蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述OsPOP8基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粒型包括水稻籽粒的粒长、粒宽和粒厚。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，转基因水稻是通过向野生型水稻中导入编码OsPOP8蛋白的核酸分子获得的。
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