CN112226456B

CN112226456B - 一种实现染色体定点遗传重组的方法

Info

Publication number: CN112226456B
Application number: CN201910572754.7A
Authority: CN
Inventors: 王克剑; 王俊杰; 王春; 刘庆
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN112226456A

Abstract

本发明公开了一种在染色体上定点产生遗传重组的方法。该方法通过敲除/RNAi等方法使得生物体减数分裂过程中DSB产生相关蛋白的功能受到阻碍，同时以减数分裂时期特异表达基因的启动子驱动产生DSB的外源蛋白表达，在染色体上特异位点产生DSB，通过生物体自身修复机制发展成CO，实现定点遗传重组。本发明尤其能够在重组冷点、盲点等引入遗传重组，打破基因之间的强连锁，加速优良性状聚合，剔除不利性状，使得育种过程更加高效，对于生物新品种培育有重大的应用价值。

Description

一种实现染色体定点遗传重组的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域和分子遗传育种领域，具体涉及在减数分裂实现定点重组的方法，更具体地说，涉及减数分裂时在染色体上特异位点产生精确重组的方法。

背景技术

遗传育种主要通过品种间或亚种间的广泛杂交、实现基因间的重组，再对重组的后代群体进行人工筛选，最终将不同的优良性状基因聚合到一起，剔除不利性状，产生新品种的过程。在多数真核生物中，每条染色体上一般只发生1到2次重组交换，而且这些有限的重组倾向于发生在某些位点处(重组热点)，在很多区域发生重组频率较低(重组冷点)，甚至从未发生重组(重组盲点，如着丝粒区域)。以水稻等作物为例，至少30-50％的区域从未发生过重组。大量研究表明，天然DSB位点分布不均匀，切割频率从一个位点到另一个位点变化10-100倍(Baudat,F.,and Nicolas,A.(1997).Clustering of meiotic double-strand breaks on yeast chromosome III.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,5213-5218.；Gerton,J.L.,DeRisi,J.,Shroff,R.,Lichten,M.,Brown,P.O.,and Petes,T.D.(2000).Global mapping of meiotic recombination hotspots and coldspots in the yeastSaccharomyces cerevisiae.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,11383-11390.)。因此，真核生物中有限的遗传重组数目、重组发生位置的偏好性导致了较强的遗传累赘，限制了不同基因间交流的效率，严重制约了遗传育种的速度。因此，探寻精准激发遗传重组以及打破不良遗传连锁的方法，将创造全新的重组事件、增加育种群体的遗传多样性、提高育种效率并缩短育种周期。

从真菌到人类的真核生物中，减数分裂DSB的形成由保守蛋白SPO11等引发(Bergerat，A.et al，Nature，1997,386(6623)，pp.414-417；Romanienko，PJ&Camerini-Otero，RD，1999，Genomics，61(2)，pp.156-169；Keeney，S.et al.，1999，Genomics，61(2)，pp.170-182；Hartung，F.&Puchta，H.，2000，Nucleic Acids Research，28(7)，pp.1548-1554)。DSB由多蛋白复合物形成，SPO11蛋白是其催化活性亚基。减数分裂重组的启动已在酵母中得到最好的研究，但在高等真核生物中还不是特别清楚其原理。

减数分裂过程中的重组起始于染色体DSB(DNA双链断裂)的产生，生物体染色体上产生DSB的数量远大于产生遗传重组的数量。但是DSB产生的位点不是随机分布的，更倾向于分布在核小体缺失的区段，而着丝粒以及异染色质等区域几乎不产生DSB。在酿酒酵母和其他生物体中，减数分裂重组由程序化的DNA双链断裂(DSB)引发，该过程需要至少15种蛋白质，包括SPO11—其是一种可催化切割的蛋白质。在正常情况下，减数分裂时期DSB的产生依赖于以SPO11为主的一系列互作蛋白的共同作用，这些蛋白的缺失会影响生物体减数分裂DSB的产生。在酵母中的研究表明，将SPO11与具有DNA定点结合活性的GAL4BD、ZFN、TALEN、dCas9等蛋白融合表达，可以在基因组上特异引入DSB，从而起始定点重组的发生(

A.et al.(2002)Targeted stimulation of meiotic recombination.Cell,111,173–184；Sarno,R.et al.(2017)Programming sites of meiotic crossovers usingSPO11fusion proteins.Nucleic Acids Res.,45,e164)。

目前对于遗传重组的研究主要针对遗传重组频率的增加或降低。已经发现了多个促进或抑制重组的基因，对于遗传育种有一定的帮助。如US200403349A1公开的产生生物变体的方法，包括使用在减数分裂细胞中表达的DBD-SPO11融合蛋白诱导减数分裂重组的步骤，并且使减数分裂重组以更高的速率和/或在不同的位点发生，由此增加了分裂细胞中同源染色体之间的重组。然而，单独的Gal4BD-SPO11结合不足以在着丝粒区域中诱导DSB形成(Robine，N.et al.，2007，Molecular and Cellular Biology，27(5)，pp.1868-1880)。EP3150626A1中公开了锌指结构域通过其N-末端与SPO11多肽的C-末端可操作地连接，并且锌指结构域包含六个或更多个锌指模块，其SPO11可以靶向某个基因组基因座，并指出通过使用SPO11多肽的C末端(而不是N末端)的融合，可以增加该位点的减数分裂重组。

但是现有的研究中增加的重组主要集中在重组热点范围内，而对于重组冷点，特别是着丝粒以及强连锁等区域遗传重组尚无有效的方法。植物遗传重组产生的CO位点在基因组上呈非随机分布，由于染色体结构、遗传干涉等因素，CO间隔分布在染色体上。在核小体缺失区域的启动子以及终止子区域富集，在结构复杂的异染色质区域很少。在靠近着丝粒的区域内聚集大量的重复序列，几乎不发生重组。因此，对于着丝粒区域基因的分离非常困难。能否使用其它方法如基因组编辑技术特异引入DSB并起始重组尚未见报道。另外，在真核生物着丝粒等经典冷点处能否发生重组，尚不得而知。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中难以实现的强连锁区域以及着丝粒区域重组等技术问题，而在重组冷点或重组盲点特异引入遗传重组，或者打破基因之间的强连锁，加速优良性状聚合，剔除不利性状，进一步地为获得精确的遗传重组，使得育种过程更加高效，对于生物新品种培育意义重大。

为了实现上述目的，本发明利用下述基本原理，如图1所示，其中不同颜色表示分别来自两亲本的同源染色体。减数分裂过程中两亲本同源染色体之间产生重组，实现染色体片段交换，产生重组的位点倾向于发生在热点区域；在不产生DSB的突变体中，亲本同源染色体之间不产生交换，则分裂异常，子代致死；定点重组体系中，阻碍DSB产生相关蛋白的功能，使得生物体本身不产生DSB，在减数分裂时期特异表达DSB产生相关蛋白(例如，基因编辑蛋白等)，在靶位点处产生DSB，随后在该位点处产生重组。

基于此，本发明的一个方面是提供在染色体特定位点产生遗传重组的方法，通过敲除/RNAi等方法使得生物体减数分裂过程中DSB产生相关蛋白(SPO11或PAIR1等)的功能受到阻碍，生物体自身遗传重组消失；同时在转化的生物体中以减数分裂时期特异表达基因的启动子驱动产生DSB的外源蛋白(例如基因编辑类蛋白等)表达，在染色体上特异位点产生DSB，优选针对重组冷点，例如异染色质、着丝粒区域产生DSB，通过生物体自身修复机制发展成CO，实现定点遗传重组。

为了对生物体减数分裂过程中DSB产生相关蛋白基因进行敲除/RNAi等，可以根据其已公开的序列信息来设计干扰技术，例如，针对SPO11基因，可以根据Hengxiu Yu,et al(OsSPO11-1is essential for both homologous chromosome pairing and crossoverformation in rice Chromosoma,2010,119(6):625-636)等相关信息来进行设计。

优选地，外源产生DSB蛋白为ZFN、TALEN、Cas或Cpf1等基因编辑蛋白。优选地是Cas9。

其中，减数分裂特异表达基因启动子仅在减数分裂时期启动表达基因编辑蛋白基因，具体实例启动子例如OsDMC1、OsBvF1、OsZEP1、OsCRC1等基因启动子。

一种用于在染色体特定位点产生遗传重组的载体，其特征在于，所述载体包含干扰或敲除生物体自身DSB产生相关基因的元件，以及减数分裂时期特异表达基因的启动子驱动产生DSB的外源蛋白基因表达的元件，和靶向染色体特异位点的sgRNA，优选所述载体为双元表达载体。

其中两方面的元件也可以构建成两个不同的载体，同时转化导入生物体中，但更优选的是将两方面的元件构建在同一条载体上，操作更为方便。

优选所述载体为进一步地，优选为双元表达载体，其只要能够在原核和真核细胞内生长的都可以采用，例如pCAMBIA 1300、pCAMBIA2300、pEarleyGate100、pEarleyGate101、pEarleyGate102、pEarleyGate103，等等。

其中，减数分裂特异表达基因启动子仅在减数分裂时期启动表达基因，具体实例的启动子例如OsDMC1、OsBvF1、OsZEP1、OsCRC1等基因启动子。

其中优选地，所述生物体自身DSB产生相关基因是MEI4、REEC24、PRD2、MER2、REC15、MRE11、RAD50、REC102、REC104、REC114、REC7、SKI8、REC14、SPO11、REC12、SPO11-1、SPO11-2、XRS2、NBS1、MDE2、REC6、MEI1、PRD1、DSB-1、DSB-1、MEI-P22、TREM、PRD3、SWI1、DFO、REC10、MTOPVIB、PAIR1、PCH2、PHS1，在本发明的具体实施方式中，可以阻碍其中一个或多个基因的功能，优选阻碍SPO11基因的功能。

在具体实施方式中，所述产生DSB的外源蛋白基因是基因编辑蛋白的基因。优选地，所述基因编辑蛋白选自ZFN、TALEN、Cas、Cpf1基因，最优选为Cas基因，如Cas9基因。相应的在所述载体中还包括针对特定靶序列的引导RNA(sgRNA)，其中对于sgRNA可以置于常规的启动子，如U3启动子控制之下，也可以但不是必需要置于减数分裂特异表达基因启动子之下。

在具体实施方式中驱动产生DSB的位点可以染色体上任何位点，但更加优选的是针对生物体减数分裂时自身DSB的冷点，例如异染色质、着丝粒等区域，这可以根据需求来确定和设计相应的如sgRNA等来实现。

本发明中，所述生物体是有性生殖的真核生物，可以植物或动物，优选的具体实例是植物如水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯等；动物如猪、牛、羊、马、鸡、鸭、小鼠等，在符合伦理道德的前提下也包括人类。

对于植物而言，利用本发明的方法过程为：本发明构建的载体为双元表达载体，通过农杆菌或者基因枪等方法转化植物的愈伤组织，获得转化的再生苗，培养获得转化植株，检测筛选定点重组的转化植株。

对于动物而言，可以采取转基因手段获得稳定的转基因个体。也可以对减数分裂起始前的细胞进行显微注射DNA、RNA和蛋白组分，在减数分裂之后再将细胞回移至代孕母体，检测筛选定点重组子代。

进一步地，本发明提供一种培育改变或改良植物性状的方法，其利用上所述在染色体特定位点产生遗传重组的方法，其所述特定位点的重组能够影响植物性状。因而能够用于培育特定性状的植物品种，更加精确的重组有益于发掘新的性状组合，可以用于将优良的品种是许多有益性状进行组合，加速育种进程。

例如可以针对水稻中位于着丝粒两侧强连锁区域的QTL通过定点重组(着丝粒重组)来打破紧密连锁来改良相关的性状。水稻3号染色体着丝粒RM15139-RM16(位置：15898974-23127621)区域跨着丝粒，存在控制千粒重、每穗实粒数每穗、总粒数和结实率4个产量相关性状以及稻米品质包括碾磨品质、外观品质和粒型3个方面的QTL。千粒重与每穗实粒数和每穗总粒数的增效等位基因分别来自于IRBB和特青，即，该区域在增加千粒重同时降低每穗粒数，位于该区域控制糙米率、粒长、长宽比、垩白米率、垩白度和透明度QTL增效等位基因均来自于IRBB，而整精米率和粒宽QTL增效等位基因来自于特青(梅德勇.应用QTL分析研究籼稻稻米品质和产量性状的关系[博士学位论文].北京：中国农业科学院，2012.)。利用定点重组能够实现着丝粒两侧连锁区域QTLs的分离，增加千粒重的同时不影响穗粒数，并且稳定稻米品质。

同时，本发明的在染色体特定位点产生遗传重组的方法也可用于培育特定性状的动物品种，其针对特定性状的相关基因位点产生定点重组。

进而，本发明还提供利用上述方法获得的遗传重组植物或动物，其也可以作为进一步育种或其他相关的用途。

本发明定点重组系统能够在特定的靶位点处产生重组，对于异染色质、着丝粒等SPO11蛋白不能结合的区域，本发明采用的基因编辑蛋白同样能够产生DSB，尤其对于着丝粒区域的定点遗传重组是一个极大的突破，之前未发现可靠的技术手段实现着丝粒重组。并且，基于真核生物间遗传重组过程的保守性，该方法能够推广到有性生殖的真核生物中。同时，本发明通过设计靶向染色体上特异位置的sgRNA，能够实现不同的需求，在目标位点处产生重组；载体设计简单，操作方便，只需要更换sgRNA而不需要改变其它的元件。相对于酵母中的方法，本发明方法中DSB的产生完全依赖于基因编辑蛋白，而不是SPO11蛋白，使得重组发生的位点更加精确和可控。总之，本发明的载体构建方便快捷，能够在染色体上特异位点产生精确重组，对于真核生物染色体操作具有广泛的适用性。而优良的品种是许多有益性状的组合，在不影响已有性状组合基础上，更加精确的重组有益于发掘新的性状组合，加速育种进程。本发明能够在特定位点产生重组，实现精确的遗传重组，有较大的推广应用价值。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1示出了本发明的定点重组原理示意图。

其中：不同颜色表示分别来自两亲本的同源染色体。

图2示出了本发明一种典型的实施方式中的定点重组载体基本元件。

其中：Promoter:水稻减数分裂特异启动子；Actin-P:Actin基因启动子；T：终止子；U3：U3启动子；SPO11^RNAi：SPO11 RNAi元件。

图3实施例一中非着丝粒重组表型分析。

其中：WT:野生型水稻CY84；OsSPO11 RNAi:SPO11 RNAi植株；NCR:非着丝粒重组植株。

图4实施例一中非着丝粒重组的重组频率分析。

其中：WT:野生型水稻CY84；NCR：非着丝粒重组植株。

图5实施例二中着丝粒重组表型分析。

其中，WT：野生型水稻CY84；OsSPO11 RNAi：SPO11 RNAi植株；CR：:着丝粒重组植株。

图6实施例二中着丝粒重组的遗传重组频率分析。

其中，CY84：野生型水稻植株，147-1-2，147-2-6，147-3-5，147-2-5：着丝粒重组株系。

具体实施方式

下面详细描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例一

1.载体构建

以pC1300-Cas9为载体，BamHI/NcoI进行双酶切，得到线性化载体pC1300-Cas9。以水稻DNA为模板，利用下述引物：

DMC1-F(SEQ ID NO：2):

5’-tgattacgaattcgagctcggtacccctcatagcaatcagctgcgtactccacg-3’

DMC1-R(SEQ ID NO：3):

5’-ccgacctttctcttcttcttaggggccatggcgccatctgctcacacag-3’

扩增OsDMC1基因启动子区域3384bp序列(SEQ ID NO:1)，通过Gibson连接将所述启动子区域连接到线性化载体pC1300-Cas9中，因而构建得到pC1300-DMC1-Cas9。

PmeI酶切pC1300-DMC1-Cas9载体，利用下述引物：

ACT-F(SEQ ID NO：4)：tcgtttcccgccttcagtttcctcgaggtcattcatatg

OCS-R(SEQ ID NO：5)：tgtcaaacactgatagttttcaatcagtaaattgaacgg

扩增SPO11 RNAi元件序列，经PmeI线性化的pC1300-DMC1-Cas9与SPO11RNAi通过Gibson连接，构成pC1300-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi载体。

按照CRISPR-Cas9系统对靶序列的要求(PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG，序列长度为22bp)，在水稻染色体序列上选择下述2个特异靶序列：

其在12条染色体上的位置见下表。

表1靶位点位置信息

并根据sgRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为NCR1-F/R，NCR2-F/R。序列如下：

NCR1-F(SEQ ID NO：6)：GGCATTGAGGTGGAGGATTTTGA

NCR1-R(SEQ ID NO：7)：AAACTCAAAATCCTCCACCTCAA

NCR2-F(SEQ ID NO：8)：GGCAGAATACTTTATGAAATGGG

NCR2-R(SEQ ID NO：9)：AAACCCCATTTCATAAAGTATTC

将设计好的NCR1-F/R，NCR2-F/R引物分别在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经过AarI酶切的中间载体sk-sgRNA连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到2个中间载体分别命名为sk-NCR1，sk-NCR2。

以KpnI/XbaI酶切sk-NCR1作为载体，以KpnI/NheI酶切sk-NCR2，用T4酶将其连接得到sk-NCR1-NCR2-sgRNA载体。用KpnI和NheI双酶切sk-NCR1-NCR2-sgRNA，回收含sgRNA的片段，与经过KpnI和SpeI双酶切的载体pC1300-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi连接，得到最终载体pC1300-NCR1-NCR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi。

其中SPO11 RNAi序列如SEQ ID NO:12所示，而sk-NCR1-NCR2-sgRNA序列如SEQ IDNO:13所示。

2、植株转化：转基因植株的获得

将上述获得的pC1300-NCR1-NCR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi以及对照组pC1300-SPO11-RNAi双元载体分别转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌1和2，分别命名为EHA105/pC1300-NCR1-NCR2DMC1-Cas9-SPO11 RNAi和EHA105/pC1300-SPO11-RNAi。

将上述重组菌EHA105/pC1300-NCR1-NCR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi和EHA105/pC1300-SPO11-RNAi，转入到受体植株：籼(春江16A)粳(C84)杂交稻春优84的愈伤组织中，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤组织转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。转基因植株大田种植(即T₀代植株)，成熟后收获种子，发苗得到T₁代水稻植株。

3.表型鉴定

取T₀代成熟期水稻植株观察，结果发现pC1300-SPO11-RNAi株型正常，花粉不育，植株不育；pC1300-NCR1-NCR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNA植株株型正常，花粉半不育，能够得到种子(图3)，表明在非着丝粒区域人为引入DSB能够恢复育性。

4.重组频率检测

提取T1代植株DNA作为模板，分别以引物C10-NCR2-F1/R1、C10-NCR2-F2/R2、C12-NCR2-F1/R1、C12-NCR2-F2/R2进行PCR扩增，检测10号、12号染色体靶位点附近SNP，计算靶位点附近重组频率。重组频率计算方法：根据SNP标记区分基因型，子代基因型包括C84/16A/C84×16A3种重组事件计算规则如下：

位点A	位点B	重组次数
			C84	C84	0
C84	C84×16A	1
			C84	16A	2
16A	C84×16A	1

每个样品计算发生重组次数，所有样品重组总次数/2×样品数＝重组频率。

如图4所示在野生型靶位点附近不产生重组，转基因株系在靶位点处发生重组，其中10号染色体2号靶位点处重组频率2％，12号染色体2号靶位点重组频率6.3％(数据见表2)。

表2靶位点区域重组频率

表3 Chr10-NCR2和Chr12-NCR2位点的重组频率检测所用的引物

实施例二

1.载体构建

按照实施例一中的方法构建pC1300-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi载体。

按照CRISPR-Cas9系统对靶序列的要求(PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG，序列长度为22bp)，在水稻染色体着丝粒区域重复序列上选择下述2个特异靶序列：

并根据sgRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为CR1-F/R，CR2-F/R。序列如下：

CR1-F(SEQ ID NO：24)：ggcaagtgtattgggtgtgttcg

CR1-R(SEQ ID NO：25)：aaaccgaacacacccaatacact

CR2-F(SEQ ID NO：26)：ggcaggacatattggagtgtatt

CR2-R(SEQ ID NO：27)：aaacaatacactccaatatgtcc

将设计好的CR1-F/R，CR2-F/R引物分别在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经过AarI酶切的中间载体sk-sgRNA连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到2个中间载体分别命名为sk-CR1，sk-CR2。

以KpnI/XbaI酶切sk-CR1作为载体，以KpnI/NheI酶切sk-CR2，用T4酶将其连接得到sk-CR1-CR2-sgRNA载体。用KpnI和NheI双酶切sk-CR1-CR2-sgRNA，回收含sgRNA的片段，与经过KpnI和SpeI双酶切的载体pC1300-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi连接，得到最终载体pC1300-CR1-CR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi。

2、植株转化：转基因植株的获得

将上述获得的pC1300-CR1-CR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi以及对照组pC1300-SPO11-RNAi双元载体分别转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌1和2，分别命名为EHA105/pC1300-CR1-CR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi和EHA105/pC1300-SPO11-RNAi。

将上述重组菌EHA105/pC1300-CR1-CR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi和EHA105/pC1300-SPO11-RNAi，转入到受体植株：籼(春江16A)粳(C84)杂交稻春优84的愈伤组织中，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤组织转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。转基因植株大田种植(即T₀代植株)，成熟后收获种子，发苗得到T₁代水稻。

3.表型鉴定

取T₀代成熟期水稻植株观察，结果发现pC1300-SPO11-RNAi株型正常，花粉不育，植株不育；pC1300-CR1-CR2-DMC1-Cas9-SPO11 RNAi(CR：着丝粒重组)植株株型正常，花粉半不育，能够得到种子(图5)，表明在着丝粒区域人为引入DSB能够恢复育性。

4.重组频率检测

提取T1代植株DNA作为模板，分别以引物Ide1-F/Ide1-R、Ide1-F1/Ide1-R1进行PCR扩增，检测1号着丝粒两端SNP，计算着丝粒附近重组频率。重组频率计算方法：根据Idel标记区分基因型，子代基因型包括C84/16A/C84×16A 3种重组事件计算规则如下：

位点A	位点B	重组次数
			C84	C84	0
C84	C84×16A	1
			C84	16A	2
16A	C84×16A	1

表4 Chr01-CR位点的重组频率检测所用的引物

重组频率结果见图6，野生型植株着丝粒区域不发生重组，而转基因植株147-1-2、147-2-5、147-2-6、147-3-5后代检测到着丝粒区域发生遗传重组，重组频率分别为0.4％、1.4％、0.9％、2.2％(数据见表5)。

表5着丝粒区域重组频率

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种实现染色体定点遗传重组的方法

<160> 31

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 3384

<212> DNA

<213> 水稻

<220>

<223> OsDMC1基因启动子

<400> 1

ccctcatagc aatcagctgc gtactccacg ggaagctgca caatacatcc agccgttggc 60

attgtgctct cttctctgaa ttaatggcca gtggagctca gtttggcaga tgattttttt 120

taatacgtaa ggagcgtatc tttgtatttt ttttttataa tagaatataa tcccgatctt 180

tgctcaaaga gctacagtca attattacac caattcaaca aaaactcaca cctgaataaa 240

caaaagcaca cacaaactaa taaaaactca cacaacataa aaagatcacc aaaattattg 300

aattctgttt gtgaatctcc atccaaagtt agcgaacagc tgcataacca ttgactcaag 360

attacgacat gcagctttca ccgacttgat ttcttcatca cactttagta gttgagccca 420

agaccgaagc cagtatgttg ccctgaaaag aacctgcata taggatatag atggtaattt 480

atcaaaaacc atatcatttc tacacaacta tatagctcaa catatagcgg atgctccaac 540

aagaataaat ttggtagatt ttttatcaac tcccacgagc cacttctaaa aaatatgaga 600

tatattgtga ggagtatata aaccagtagt aaattgtaga gctctccaaa aaaattttgc 660

atagtgatac tccacaaaca aatattgaat atctgtatta aggggaagaa aagtttattt 720

tgcatagtga cactccacaa acaaatactg ttcctacgaa ctatagcgta tctttgtatt 780

aaggggaaga aaagtttatt tacaacaaaa aaaaatcaag aagtgaagga gacgggatac 840

aagaatgatc atggtctgct tactttacat tgtccccatc accatttcaa ttaagcagtg 900

acgacataat atcatcgacg gtctgatcag caacatgtgg gacgactgcc atggattgat 960

caacctcata atcaaagcct gacgcatcat cgctacctgc cgccatttcg tccagcatca 1020

ggaagttgtc agggaaagtt gcgctatcct ccggcccttg cattaataca ccaccattat 1080

cttgatcatt gtaaatctga cgctgagcat aatctgccat gttaccatcc acccaaacat 1140

tgtcagggta tacaccagta tttcccaatg ccctatcatg ttgttggtat agatcagcct 1200

ctccaaatgc aacactgcca tcctctgctt gctgttgctg gtaaaattgt agctgacgac 1260

aagaaataca gtttctatcg cagcagcatg gggtgaacat cgactgatca ccaatgtacg 1320

atggttccag ctggttactg tacagcattg cagggtttgg gttctgcaat tggagtggtt 1380

gaagttgcag catgccatca tcgttgttgc aaggagcaat taagcttggc atgaatggtg 1440

gtgcatcttg atctactcct ccaaacatca tatgcatgga atgggcaata tccatgaact 1500

ggtcaggatc cacaatggtt tcttctccag gtgttggtgc tgtttcctgc tgctcgtctt 1560

gtgcctggca agcagtaggc tgctgctgca tgttcttcct ccttgcggcc tttttattgc 1620

gtttgttgtc attcttctgc tcctcccggg ccttctcttc tctctcgtag gtctgcttca 1680

gctgtatcgc gcacaataca tactgaccca tctgcaagta cattgatcga tcatacacca 1740

acatgtagta ctcccttcat tcacttttat tttttatcag atactcactt tgattcatat 1800

tatatcaaat ttcttcaagt ttaactaaga tcatagtaaa atatagcaac atctgtacat 1860

caccaaatta gtctcactat atctaatata ctatgttgaa tatattttga tggtatattt 1920

gttttgtatt catataaatt tagtcaaact taaaaagtaa aacgacttgt catatgaaaa 1980

cttgtcatat gaaattgaga gggtactatt cacacacaaa ctttgaccca tcatcttttt 2040

tttaaaaaaa aatatataaa tgcttcaaaa gatgttggat tatcaaagta cctgggattt 2100

gcctgccaag acatactcat gcatgctcca catgtcgttc tcagcggaac gagcagattt 2160

ataagtgaga accctcttgc tgccaatgat agccttccgg ttcgtctcct tggtgctgtg 2220

aatctgcacc acgctccccg tcgcgctcca gcttccctct tccaccccat ccaccaccac 2280

cttcctgttc ggctcgtcct tcttcttcgt cttcgacggc tccctcacca tgaaaaagta 2340

ccacctgtct tccccatagc ccttgtattt ctctaatgca ttcatattgt gttatcacaa 2400

accaatttgg ttcatagaca tacataatta aacctttttt ttcatggata atcaagcgat 2460

caattagcta aaaagaagat taaattacca atcagctttt ggggatcata acgcatgata 2520

ttctcctcac tgatgaagtg gcgaggcggg tcgcgtccct cgatcttgcc gcggaggtag 2580

aagtccacga gctcctcgtc cgttggtacg aagtggtagc ccggaggtag ctgtagctgc 2640

ggcaccagct cactcttcca gatcgcactt ccctccgccg ctgccgccgc cgccgatcca 2700

tcgccgccgc tgccgccgtt ttctattgtc gggttcataa gtgaatcgaa ttggacagaa 2760

aaaggaaagt gggtattgct ataataaatt agtatttata tatgctaaaa ctaattgcag 2820

ttaattagag agagctgtaa actttctcgg gaagaaacag agagttgtaa tggaaataag 2880

gaataatagt gttgtttagt aatcctagtt tgcttcggtt ctgttcccat gagcgagttt 2940

tgagtccgga gggcctagtt gggcctggtt tggtctgaac cgcgtgggcc tcaagcctct 3000

ctatcctgct gggctgggtg aaacggccca gtagtaatta ttcctcccgg aggagaagcc 3060

caataacaag acgattccag aaggcccgag agcctcaagt agcccacctc gccgcacgca 3120

acgcaacgca acggcacaag cacaacacca cttcgagtgt gtttgtcgtc tcgcctctgc 3180

tgcttccttc tcctacaagc cgccgctccg acctcgccgt cgccggtcgc cggccgcctc 3240

cgcctacagg tgaggaaggt tctctccgcc gcagcggcct ccgctcgacg tctttgctag 3300

ggttttgggg tgatttttcg gttgggttgt ctcctgatcg cattttgacg caggtgcggg 3360

gggtctgtgt gagcagatgg cgcc 3384

<210> 2

<211>54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DMC1-F引物

<400> 2

tgattacgaa ttcgagctcg gtacccctca tagcaatcag ctgcgtactc cacg 54

<210> 3

<211>49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DMC1-R引物

<400> 3

ccgacctttc tcttcttctt aggggccatg gcgccatctg ctcacacag 49

<210> 4

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACT-F引物

<400> 4

tcgtttcccg ccttcagttt cctcgaggtc attcatatg 39

<210> 5

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCS-R引物

<400>5

tgtcaaacac tgatagtttt caatcagtaa attgaacgg 39

<210>6

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR1-F引物

<400>6

ggcattgagg tggaggattt tga 23

<210> 7

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR1-R引物

<400>7

aaactcaaaa tcctccacct caa 23

<210> 8

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR2-F引物

<400>8

ggcagaatac tttatgaaat ggg 23

<210>9

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR2-R引物

<400>9

aaaccccatt tcataaagta ttc 23

<210>10

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR1靶点

<400>10

ttgaggtgga ggattttgat gg 22

<210>11

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCR1靶点

<400>11

gaatacttta tgaaatgggc gg 22

<210>12

<211>2552

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SPO11 RNAi序列

<400>12

cctcgaggtc attcatatgc ttgagaagag agtcgggata gtccaaaata aaacaaaggt 60

aagattacct ggtcaaaagt gaaaacatca gttaaaaggt ggtataaagt aaaatatcgg 120

taataaaagg tggcccaaag tgaaatttac tcttttctac tattataaaa attgaggatg 180

tttttgtcgg tactttgata cgtcattttt gtatgaattg gtttttaagt ttattcgctt 240

ttggaaatgc atatctgtat ttgagtcggg ttttaagttc gtttgctttt gtaaatacag 300

agggatttgt ataagaaata tctttaaaaa aacccatatg ctaatttgac ataatttttg 360

agaaaaatat atattcaggc gaattctcac aatgaacaat aataagatta aaatagcttt 420

cccccgttgc agcgcatggg tattttttct agtaaaaata aaagataaac ttagactcaa 480

aacatttaca aaaacaaccc ctaaagttcc taaagcccaa agtgctatcc acgatccata 540

gcaagcccag cccaacccaa cccaacccaa cccaccccag tccagccaac tggacaatag 600

tctccacacc cccccactat caccgtgagt tgtccgcacg caccgcacgt ctcgcagcca 660

aaaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa agaaaaaaca gcaggtgggt ccgggtcgtg 720

ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc 780

caaagaaacg ccccccatcg ccactatata catacccccc cctctcctcc catcccccca 840

accctaccac caccaccacc accacctcca cctcctcccc cctcgctgcc ggacgacgag 900

ctcctccccc ctccccctcc gccgccgccg cgccggtaac caccccgccc ctctcctctt 960

tctttctccg tttttttttt ccgtctcggt ctcgatcttt ggccttggta gtttgggtgg 1020

gcgagaggcg gcttcgtgcg cgcccagatc ggtgcgcggg aggggcggga tctcgcggct 1080

ggggctctcg ccggcgtgga tccggcccgg atctcgcggg gaatggggct ctcggatgta 1140

gatctgcgat ccgccgttgt tgggggagat gatggggggt ttaaaatttc cgccatgcta 1200

aacaagatca ggaagagggg aaaagggcac tatggtttat atttttatat atttctgctg 1260

cttcgtcagg cttagatgtg ctagatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat 1320

ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttcatgatt tgtgacaaat gcagcctcgt 1380

gcggagcttt tttgtaggta gaagaggtac ccggggatcc ttcgaggaga aggagacagt 1440

gtttcaacgt ttggctaatg acaagttctg tgaaaggaat cgctgcattg tgattacagg 1500

aagaggctac ccagatattc caacaagaag attcttgcgc taccttgttg aacagctgca 1560

tttgccagtt tactgtttgg tggatgcaga cccttatggt ttcgacattc tggctaccta 1620

caaatttggt tcactgcaat tggcatacga tgcaaatttc ctgcgtgtgc ctgatattcg 1680

gtggcttggg gtcttcacat ctgattttga ggattatcgc cttccagact gctgcctact 1740

tcacttgtcg tctgaagaca gaaggaaagc tgaaggaatt ctctcaaggt gttacttgca 1800

cagggaagcc ccacaatgga ggttggagtt agaagccatg ttgcaaaagg gtgtcaaatt 1860

tgagattgag gcgttatctg caagatctgg tacggaccgt actactctat tcgtttcaat 1920

atatttattt gtttcagctg actgcaagat tcaaaaattt ctttattatt ttaaattttg 1980

tgtcactcaa aaccagataa acaatttgat atagaggcac tatatatata catattctcg 2040

attatatatg taaatgagtt aacctttttt tccacttaaa ttatataggg gatcttgcag 2100

ataacgcctc aatctcaaat ttgacaccct tttgcaacat ggcttctaac tccaacctcc 2160

attgtggggc ttccctgtgc aagtaacacc ttgagagaat tccttcagct ttccttctgt 2220

cttcagacga caagtgaagt aggcagcagt ctggaaggcg ataatcctca aaatcagatg 2280

tgaagacccc aagccaccga atatcaggca cacgcaggaa atttgcatcg tatgccaatt 2340

gcagtgaacc aaatttgtag gtagccagaa tgtcgaaacc ataagggtct gcatccacca 2400

aacagtaaac tggcaaatgc agctgttcaa caaggtagcg caagaatctt cttgttggaa 2460

tatctgggta gcctcttcct gtaatcacaa tgcagcgatt cctttcacag aacttgtcat 2520

tagccaaacg ttgaaacact gtctccttct cc 2552

<210>13

<211>1018

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sk-NCR1-NCR2-sgRNA序列

<400>13

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttatttcaa 60

cttgctatgc tgtttccagc atagctctga aaccccattt cataaagtat tctgccacgg 120

atcatctgca caactctttt aaatcagctt tgatctatgt ggatagccga ggtggtacta 180

atactagtct ttgttgtcgt ccaattgcgt aatgggccgg cccatactgc aatacatgtc 240

ctgaaaggct tcatggccca ctacgaaatg cttttctcct acagtttatc ttacttcttc 300

acatcacgtg gtttccgacg tacccagtgt tcccggcttc cagcatttgc tggtagcacc 360

agtagaagac gcctgtcttg tgctatggtc cctgactgca catctgattc ctccaagatc 420

catgcatgcc tgataacttt aagttgcttc agaagaactt taagtgatct gttcgtatgt 480

ttaaagattc cttaatcgtc gacgctagac tcgaggatta tgtggaaaaa aagcaccgac 540

tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat ttcaacttgc tatgctgttt 600

ccagcatagc tctgaaactc aaaatcctcc acctcaatgc cacggatcat ctgcacaact 660

cttttaaatc agctttgatc tatgtggata gccgaggtgg tactaatact agtctttgtt 720

gtcgtccaat tgcgtaatgg gccggcccat actgcaatac atgtcctgaa aggcttcatg 780

gcccactacg aaatgctttt ctcctacagt ttatcttact tcttcacatc acgtggtttc 840

cgacgtaccc agtgttcccg gcttccagca tttgctggta gcaccagtag aagacgcctg 900

tcttgtgcta tggtccctga ctgcacatct gattcctcca agatccatgc atgcctgata 960

actttaagtt gcttcagaag aactttaagt gatctgttcg tatgtttaaa gattcctt 1018

<210>14

<211>38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C10-NCR2-F1引物

<400>14

ggagtgagta cggtgtgcgt ccttgagttt attcgaga 38

<210>15

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C10-NCR2-R1引物

<400>15

gagttggatg ctggatgggg atgctgtaat tgtcttcgc 39

<210>16

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C10-NCR2-F2引物

<400>16

ggagtgagta cggtgtgccg tgggcgctgc aaattctcc 39

<210>17

<211>38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C10-NCR2-R2引物

<400>17

gagttggatg ctggatggcc acataagtgc aacaatgg 38

<210>18

<211>38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C12-NCR2-F1引物

<400>18

ggagtgagta cggtgtgcga gattccatct tggcgctg 38

<210>19

<211>37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C12-NCR2-R1引物

<400>19

gagttggatg ctggatggga gatgcatatg gattggg 37

<210>20

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C12-NCR2-F2引物

<400>20

ggagtgagta cggtgtgccg aagttggtga acttgggat 39

<210>21

<211>38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C12-NCR2-R2引物

<400>21

gagttggatg ctggatggcc atggtgatca ctacagag 38

<210>22

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-1靶点

<400>22

agtgtattgg gtgtgttcgt gg 22

<210>23

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-2靶点

<400>23

ggacatattg gagtgtattg gg 22

<210>24

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-1-F引物

<400>24

ggcaagtgta ttgggtgtgt tcg 23

<210>25

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-1-R引物

<400>25

aaaccgaaca cacccaatac act 23

<210>26

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-2-F引物

<400>26

ggcaggacat attggagtgt att 23

<210>27

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CR-2-R引物

<400>27

aaacaataca ctccaatatg tcc 23

<210>28

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ide1-f引物

<400>28

tgctctaggc tgggtttagt 20

<210>29

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ide1-R引物

<400>29

ctaacacacc gaagcatcac 20

<210>30

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ide1-F1引物

<400>30

atccagttgc ctcacctcca 20

<210>31

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ide1-R1引物

<400>31

tgtcactgat cgatgtca 18

Claims

1.一种在染色体上特定位点产生遗传重组的方法，其特征在于，通过基因工程方法使得生物体减数分裂过程中自身DSB产生相关蛋白的功能受到阻碍，同时在转化的生物体中以减数分裂时期特异表达基因的启动子驱动产生DSB的外源蛋白表达，通过设计靶向染色体上特定位点的sgRNA而实现在染色体上特定位点产生DSB，实现定点遗传重组；所述生物体是有性生殖的植物；

所述DSB产生相关蛋白是SPO11。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程方法使得生物体减数分裂过程中自身DSB产生相关蛋白的功能受到阻碍是通过基因敲除、或RNAi方法实现。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产生DSB的外源蛋白是基因编辑蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因编辑蛋白选自Cas、Cpf1蛋白。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色体上特定位点是重组冷点区域。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组冷点区域是指异染色质、着丝粒区域。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯。

8.一种用于在染色体特定位点产生遗传重组的载体，其特征在于，所述载体包含干扰或敲除生物体自身DSB产生相关基因的元件，以及减数分裂时期特异表达基因的启动子驱动产生DSB的外源蛋白基因表达的元件，和靶向染色体上特异位点的sgRNA；

所述DSB产生相关基因是SPO11。

9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为双元表达载体。

10.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述产生DSB的外源蛋白基因是基因编辑蛋白的基因。

11.根据权利要求10所述的载体，其特征在于，所述基因编辑蛋白的基因选自Cas、Cpf1基因。

12.一种培育改变或改良有性生殖的植物性状的方法，其利用如权利要求1至7任一项所述的染色体上特定位点产生遗传重组的方法，以改变有性生殖的植物后代的性状。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，是将如权利要求8至11任一项所述的载体转化所述植物，筛选获得定点重组的转化的植物。

14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻，其改变或改良的相关性状涉及稻米品质。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述稻米品质指碾磨品质、外观品质或粒型。