CN105025701A

CN105025701A - 去除植物中遗传连锁的方法

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Publication number: CN105025701A
Application number: CN201380073822.6A
Authority: CN
Inventors: P·本多克; J·斯图尔曼
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: EP2938184B1; ES2705033T3; ES2953523T3; WO2014104878A1; FI3491915T3; EP3491915A1; JP6583918B2; DK3491915T3; US10995338B2; US20150351340A1; CN105025701B; TR201900252T4; DK2938184T3; EP2938184A1; US20210123068A1; JP2016503653A; EP3491915B1

Abstract

本公开涉及植物领域，尤其是植物育种和植物遗传学领域。更具体地，本公开涉及可用于改善植物属性的发明方法。尤其是，本发明可用于去除连锁累赘。还提供了采用此处公开的方法所获得的植物和植物部分。

Description

去除植物中遗传连锁的方法

技术领域

本公开涉及植物领域，尤其是植物育种和植物遗传学领域。更具体地，本公开涉及可用于改善植物属性的发明方法。

背景技术

重组通过各种机制，比如分类(assortment)和隔离、杂交、基因转换和转化，产生新的基因排列。植物中的重组可出现在植物发育的众多阶段。在植物细胞中有两个主要的不同重组类别，同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。HR重组途径涉及在享有相同DNA序列的DNA分子之间的重排，而无论是否在相同或不同的染色体上。这与NHEJ途径不同，NHEJ途径能在任何DNA分子之间产生重排，而不论它们之间的任何DNA同源性。HR途径被认为在所有不同类型的植物细胞中有活性，例如HR通过促进姐妹染色单体之间的交叉，在配子形成中起着重要作用，以便于正确的染色体分离和不同亲本等位基因的重组(减数分裂HR)。HR途径在有丝分裂的细胞中也有活性，在其中使用同源未损伤基因座上存在的序列信息主要参与基因座上DNA损伤的修复(有丝分裂HR)。这可以存在于和损伤的基因座相同或不同的染色体上。NHEJ途径在减数分裂和有丝分裂细胞中也有活性，并且在将非同源DNA末端连接在一起当中是非常有效的。HR和NHEJ途径之间的主要差别之一是方法的保真度。然而，相关的DNA序列之间的HR导致这样的重组，即在其中两个分子/基因座的DNA序列被保留，NHEJ途径往往在发生重组的位置上产生小的突变，其本身可以是致突变的。

植物育种包括选择最佳亲本植物，然后将亲本植物杂交，选择具有改善的生长特性的从这种杂交所得子代。在过去的100年，在培养广泛的植物品种和显著改善植物产品的产量和质量当中，植物育种一直非常成功。

这通过选择提供了植物培养和消费性性状改善的等位基因变异，而得以实现。典型地，两个亲本植物之间进行杂交以产生杂种F1子代，然后杂种F1子代自交以产生纯合等位基因，筛选所得F2子代的兴趣表型。当植物杂交形成杂种(F1)时，减数分裂过程中不同的同源亲本植物染色体之间发生重组(交叉(crossover))，每个亲本所贡献的遗传信息被重排(shuffle)。

减数分裂期间的重组(减数分裂HR)是一个(半)随机同源性依赖性的过程，产生雄性和雌性配子，其各自携带来自亲本植物不同套的等位基因。如果期望子代中亲本基因座的的特定组合，那么必须筛选很多个体，以选择继承了所需亲本等位基因的那些。可仅基于表型进行筛选，或者更通常的情况是通过使用和兴趣等位基因紧密连锁的分子标记物。辅助育种(MAB)过程的这种标记物具有这样的优点，即可以在早期生长阶段筛选F2群体的植物，从而不需要保留大量成熟植物，并且还可以筛选它们是否存在和多等位基因连锁的很多标记物。因此很显然，减数分裂重组的过程是植物育种中的主要驱动力，而且影响此过程的过程可导致育种过程中的瓶颈。

预计在未来几十年世界总人口显著增加，并且有一个共识，即许多作物的产量还必须增加并且同时利用同一可耕种土地区域且使用更少的资源，如水和肥料。植物育种通过引入种质中存在的新等位基因，在改善作物产量中发挥很大作用。然而，通过有意不选择被认为是有害的性状，或由于缺乏对(当时被认为是中性的)变异的选择胁迫而无意识的损失等位基因，传统植物育种导致存在于栽培作物中的等位基因变异总量的减少。由于栽培物种中减少的等位基因变异，可以赋予这样性状(如生物和非生物抗性)的新等位基因不太可能存在于栽培种质中。这种等位基因可能的一个来源是未曾改变过的(unadapted)野生种质。当生长条件或消费者的喜好改变时，野生种质已被广泛用来改善栽培物种的种质，并且现有基因库不具备必要的遗传变异以满足不断变化的需求。使用野生种质取得成功取决于几个因素，例如可以通过杂交而获得的变异的广度(例如植物不相容性、物种屏障))、可转移新遗传变异以解决快速变化需求的速度、以及最后可以从野生物种转移多少变异而没有转移严重的负面影响(连锁累赘)。连锁累赘可被描述为两个基因座之间存在遗传连锁，例如在相同染色体上一个是期望的而另一个是不期望的。这种遗传连锁的结果是正常减数分裂期间两个基因座被一起遗传。不幸的是，采用本领域中可用的方法，去除植物中期望和不期望基因之间的遗传连锁，并且获得仅具有期望基因和相关性状的植物，已被证明是困难、耗时的、并且在多种情况下是不可能的。

减数分裂负责形成含有一半亲本植物遗传互补的减数配子(卵细胞或花粉)。减数分裂过程中，亲本染色体之间发生减数分裂重组，产生亲本等位基因的混合从而使配子携带亲本基因座的不同组合，在子代植物中产生不同图式的遗传变异。减数分裂重组通常发生在亲本染色体常染色质区域之间，在此处在结构和DNA水平上都有高程度的共线性(synteny)。已知在文献中，在结构上不同的(如大的缺失、插入或倒位)或缺乏DNA序列同一性的区域中，亲本染色体之间的重组(交叉)被抑制。当亲本源自共同的谱系时，因此遗传上是相似的，这不成问题，但是当考虑和野生种质杂交时却成为更大的问题，因为野生种质很可能比栽培品系(line)在遗传上更加多样化。在这种情况下，在野生种质和栽培种质染色体之间可以发生交叉的区域，被前述DNA中的结构差异所抑制。当栽培和野生种质植物品系之间进行杂交时，选择携带期望等位基因的F2植物，然后这些F2植物和栽培植物品系回交多次，同时继续选择携带期望野生种质等位基因的植物，来增加栽培亲本所贡献的基因组的百分比，同时降低来自野生亲本的基因组的百分比。在理想的情况下，这将产生具有栽培亲本基因组的但携带来自野生种质的小基因座(基因渗入)植物，。如前所述，这种回交过程完全依赖于来自两个亲本的基因座之间发生的正常减数分裂重组。然而，由于存在亲本之间的结构和序列差异，减数分裂重组可得以抑制，这导致存在来自野生种质的大基因渗入，它不能变的更小(Canady等人(2006)Genetics174,1775-1788)。

在这样的区域由于减数分裂重组被抑制，随后的回交不能成功降低基因渗入的大小。当期望的正(positive)性状和负(negative)性状位于基因渗入上，这可成为一个特殊的问题，因为使用减数分裂重组不能轻易将这些分离开。这就解释了为什么在源自野生种质的基因渗入上经常不能轻易地打破连锁累赘。通常用来打破这种连锁累赘的方法是筛选比两个基因座之间的重组事件通常所需的更多的植物。有时这是可行的，但可能非常昂贵并且不保证成功，因为重组抑制的程度是未知的。有许多基因渗入的实例，这基因渗入的地方没有发生进一步的重组，尽管很努力地筛选非常大的植物群体。一些出版物(如WO03/104451和WO00/54574)描述了在植物中增强MHR的方法，这可能会增加在抑制的减数分裂重组区域(如，带有连锁累赘的区域)中获得罕见重组事件的机会。然而，在这些出版物中描述的方法建议这样的处理，即增强细胞中所有同源基因座之间的HR途径，这在育种材料中是不期望的。此外，这些处理也常常本质上是致突变的，在基因组范围上改变DNA序列，导致不可预测的表型。例如，出版物EP0270120教导，可以通过使植物细胞生在在介质上组织培养物中来打破连锁累赘，其中介质含有高水平的诱变植物生长的调节剂。和其它出版物一样，基因组范围的重组率将受到影响，因此用这种方法产生的植物将不适合用于进一步的育种。

因此，本领域明显需要可再现的且更容易的方法，以允许操作植物的基因组，特别是在育种过程中，以及特别允许打破/去除同一染色体上两个基因座之间的遗传连锁，特别是其中这样的基因座都位于重组被抑制的染色体部分。

本发明解决的问题

我们惊奇地发现，可以通过使用NHEJ途径诱导仅特异性地位于带有连锁累赘的基因渗入处的重组事件，以及避免改变基因组剩余部分的重组或突变率，来解决现有技术中的上述明确需求。实际上，在本发明中，我们公开了一种新颖的NHEJ途径在植物育种中的用途，尤其是用于打破连锁累赘。此处我们公开了可应用于植物体细胞的方法，并允许例如在F1杂种中通过NHEJ在同源或部分同源(homeologous)染色体之间的任何特定位置产生易位。该方法可用于广泛的育种应用中，例如用于消除连锁累赘的目的、用于靶向操作多倍体基因组的目的、用于定制基因渗入生产的目的、用于简化精细图位(mapping)的目的和用于产生基因融合的目的。

更详细地说，本发明涉及，例如使用位点特异性核酸酶(包括核酸酶系统)向植物细胞包括植物原生质体中引入双链断裂。位点特异性核酸酶可以在两个同源染色体的相应位置靶向特定的相同序列。然后，这些诱导每个染色体上的DNA双链断裂，双链断裂以出乎意料的高频率(在大约0.8％的细胞中)被重新连接起来，导致染色体臂的交换，从而导致诱导的靶向易位。这种方法的另一重要优点在于，它只需要组织培养设施以鉴定期望的重组事件，而不是筛选大量的植物群体以鉴定随机减数分裂HR事件，所有这些都需要温室。因此，将该方法用于上面给定的目的，也可能导致育种过程本身成本大大降低。

根据本发明的方法可能例如用于目的：

a.打破连锁累赘：从野生番茄物种中引入对严重病毒(如TMV和TYCLV)的抗性，赋予抗性的基因存在于重组沉默的大基因渗入片段中。在这些基因渗入上还有对产量产生不利影响的基因(连锁累赘)，但所述基因不能被重组使其远离抗性的来源。然而，接受了这种产量损失，因为病毒抗性太有价值。此处所描述的技术可被用来打破限定位置上的基因渗入片段，从而生成具有病毒抗性但缺少连锁累赘的品系。各种形式的连锁累赘是育种中的大问题，在未来将继续减缓植物育种以及使植物育种变得复杂。

b.定制的基因渗入：任何已知序列的染色体区域可以被连锁至同源染色体上的任何其它序列。这允许人们限定希望出现在最终产品中的基因渗入的大小。事实上，基因渗入可以包括单个基因。

c.精细图位：基因图位使用减数分裂重组将基因和标记物连锁起来，但当减数分裂重组被抑制或当许多基因紧密连锁时不太有效。此处所公开的导致易位的方法，可以用来将基因渗入片段划分为更小的区域，其然后可以使用标记物进行基因分型或表型分型。以这种方式，可以快速鉴定有因果关系的基因。

d.基因内部重组：因为新的病原体的新生物型进化，所以需要新的抗性来源。抗性基因通常存在于簇中，这些之间的重组生成赋予新抗性的新基因。然而，这些是低频事件难以发现。易位可用于组合存在于不同染色体上簇中的抗性基因的部分(结构域)，以产生赋予新抗性的结构域的新组合。

e.多倍体物种中的纯合性：若干多倍体植物物种是异源多倍体，这意味着减数分裂过程中分离的基因组不重新组合。当基因组中的一个在染色体位置带有负表型时，因为这不能被消除所以这可能会产生问题。可以在基因组之间诱导易位，通过自交可以产生一种情况从而使整个染色体臂变得完全纯合。这也可以用于将一个基因组染色体中诱导的突变转移到其它基因组的染色体，如果这样的突变是隐性的(几乎总是如此)将是特别有用的。

实施本发明的思想，将此处公开的方法应用于上面公开的各种目的，技术人员确实能够将这些方法应用于上面给定的目的。

发明内容

一方面，提供了一种用于去除植物或植物细胞中第一植物染色体上所存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的方法，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的。本方法包括步骤：提供至少一个植物细胞，所述植物细胞包含所述第一染色体和至少第二染色体，其中所述第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述染色体是同源的或者是各自的部分同源染色体；在所述第一染色体中引入双链断裂，其中所述第一染色体中的双链断裂引入至所述第一基因座A和所述第二基因座B之间，从而提供包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分、以及包含所述第二基因座B的第一染色体的第二部分；以及在所述第二染色体中引入双链断裂，从而提供第二染色体的第一部分和第二染色体的第二部分。通过至少一种位点特异性核酸酶引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

任选地，但是在具体的优选实施方式中，本方法还包括：采用获得的至少一个植物细胞鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分。

通过至少一种位点特异性核酸酶引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶(TALEN)和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

在特别优选的实施方式中进行本方法，其中第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述第一基因座A和第一特征的期望性状连锁，以及所述第二基因座B和第一特征或第二特征的不期望性状连锁；并且其中所述第二染色体不包含和所述第二基因座B相同的基因座，所述第二基因座B和第一特征或第二特征的不期望性状连锁，以及；在第一染色体的所述第一基因座A和所述第二基因座B之间以及在第二染色体对应的基因座或位置上引入一个双链断裂。本实施方式允许去除(杂交)植物中常见的期望和不期望性状之间的连锁累赘。

因此，还提供了一种用于提供获自植物P2的植物P1的方法，其中所述植物P2特征在于在第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间存在遗传连锁，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的，以及其中所述植物P1特征在于缺失所述遗传连锁，所述方法包括：提供至少一个植物细胞，其包含所述第一染色体和至少第二染色体，其中所述第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述染色体是同源的或者是各自的部分同源染色体；在所述第一染色体中引入双链断裂，其中所述第一染色体中的双链断裂引入至所述第一基因座A和所述第二基因座B之间，从而提供包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分、以及包含所述第二基因座B的第一染色体的第二部分；以及在所述第二染色体中引入双链断裂，从而提供第二染色体的第一部分和第二染色体的第二部分，以及；任选地，从获得的至少一个植物细胞鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分。从而，可以再生植物P1。

根据本发明的另一方面，提供位点特异性核酸酶用于去除第一染色体上存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的用途，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNACRISPR系统，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的。

根据本发明的最后一个方面，提供根据本发明的方法或根据本发明的用途可获得的或者获得的植物、植物的部分、果实或种子。

附图说明

图1：左图：在单个原生质体内显示两个同源染色体，其中一个染色体上的浅灰色部分代表来自未曾改变过的野生物种的基因渗入(浅灰色)，在此处不会发生减数分裂重组(重组抑制)。基因渗入中的框表示提供正(positive)表型(黑色)的基因座和提供负(negative)表型的基因座。表达双链断裂诱导酶的质粒被显示为圆形。箭头代表位点特异性核酸酶诱导DNA DSB的染色体中的位置。中间图：在两个同源染色体中诱导DNA DSB。右图：DSB修复导致相互易位。正和负基因座不再连锁。

图2提供了潘那利番茄(Solanum pennellii)ALS2基因座的序列。下划线为ALS2的开放阅读框。ZFN靶序列以粗斜体显示。

图2a显示特异性扩增潘那利番茄ALS2基因座(左图)或WT ALS2基因座(右图)的引物的测试结果。L，梯度条带；BC，源自IL7-3×M82杂交的F1品系；M82，WT番茄品系；IL7-3，在染色体VII上含潘那利番茄基因渗入的品系；B，水对照。

图3显示IL7-3和M82品系原生质体中诱导的小的缺失。上方的线，靶位点的序列。下划线为ZFN结合位点。显示M82和IL7-3原生质体中发现的小的缺失。破折号表示缺失的核苷酸。

图4：显示M82ALS2和潘那利番茄ALS2序列(顶部)，其中下划线为ZFN结合位点，基因座之间的单核苷酸多态性(SNP)以粗体小写显示。下划线为ZFN结合位点。ZFN结合位点后基因座之间的第一SNP是如所示的下游449bp。用于所有PCR扩增的引物为11_13680(潘那利番茄ALS2正向引物)和12_07231(M82ALS2反向引物)。M82&IL7-3，源自用pKG7402转染来自亲本品系的原生质体的克隆的PCR产物的序列。F1，源自用pKG7381(35S::GFP)转染来自F1品系的原生质体的克隆的PCR产物的序列。F1x ZFN，源自用pKG7402转染来自F1品系的原生质体的克隆的PCR产物的序列。在ZFN结合位点存在小的INDEL表示缺失的核苷酸。在非选择性PCR反应中使用引物12_11216+12_11217分离克隆#1和#2。

图5示意性显示在欧洲油菜(Brassica napus)中的靶向易位。1，表示A(深灰色)和C(浅灰色)的基因组。圆形表示待纯合的基因座。在细胞中表达位点特异性核酸酶，并在虚线的位置在所有4条染色体中诱导DSB。2，A和C基因组之间发生靶向易位。3，自交之后易位区域和兴趣基因座是纯合的。4，来自C基因组的部分染色体臂变为纯合的。

具体实施方式

定义

除非另有指明，此处所用技术和科学术语和本发明所属领域普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。分子生物学、生物化学、计算生物化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中常规技术的操作是本领域技术人员公知的，例如在下面的参考文献中讨论：Sambrook等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New York,1987和定期的更新；以及系列丛书Methods inEnzymology,Academic Press,San Diego。出于本发明的目的，下列术语定义如下。

如此处所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的形式。例如，提及“一个”DNA分子时可包括多个相同的DNA分子(如数十、数百、数千、数万、数十万、数百万或更多个分子)。

术语“和/或”表示一个或更多所陈述的情况可能发生。换言之，所陈述的情况可单独发生或与至少一个所陈述的情况、直至所有所陈述的情况组合发生。术语和/或公开了单独的每个所陈述的情况，以及所陈述的情况和至少一个其它所陈述的情况、直至所有所陈述的情况的特定组合。

在本公开中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等具有专利法赋予它们的含义，并且可以指“包括”、“包含”等；“基本上由......组成”或“基本上组成”同样具有专利法赋予的含义，并且该术语是开放式的，只要所引用的内容以外的内容存在时，没有改变所引用的内容的基本或新颖特征，则允许存在所引用的内容以外的内容，但不包括现有技术的实施方式。

如此处所用，术语“等位基因”是指在特定的基因座上基因的任何一个或更多替代形式。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于一个特定的位置，或位于染色体上的基因座(基因座复数)。一个等位基因存在于同源染色体对的每条染色体上。二倍体或植物物种可以包括位于特定基因座的大量不同的等位基因。

“特征”涉及生物的表型质量。特征可以表现为不同的性状。例如，植物可以是一种以花色作为特征的植物，红色或白色的花作为特征的性状A和B。本发明内，只要具有特征的第一性状的生物成员可以从表型上区分于具有特征第二性状的生物成员，特征(或性状)可以是任何特征(或性状)。这并不仅限定于通过检查生物可以直接观察到的差异还包括通过进一步分析生物而可以显明的特征/性状，例如分析对某些环境的抗性，或分析这种生物中是否存在特定的代谢物。

同一染色体上基因座之间的“遗传连锁”，本领域技术人员理解为同一染色体上彼此相关联而定位的那些基因座，使得它们在减数分裂过程中通常一起遗传。例如，基因座彼此更靠近的基因不太可能在染色体交叉时被分到不同的染色单体上，因此说这些基因是遗传连锁的。另一个实例是，当基因座都位于特征在于“(减数分裂)重组抑制”的同一染色体区段中(见下文)。另外，在这种情况下，基因座在减数分裂期间有可能被一起遗传。

如此处所使用的，术语“杂合”是指当两个不同的等位基因位于一个特定的基因座时出现的遗传状况。相反，如此处所用，术语“纯合”当两个相同的等位基因位于一个特定的基因座但分别位于细胞中对应的同源染色体对上时出现的遗传状况。

术语“部分同源”或“部分同源的”染色体，用于描述种间杂交和异源多倍体化(allopolyploidization)之后被带到一起的相似染色体之间的关系，并且其关系是祖先物种中完全同源的。当两个染色体源自两个不同的基因组但共享这样的特征，如相似的核苷酸序列、相似的基因顺序同线性，并且位于两个基因组染色体组型中对应的位置上，则认为两个染色体是部分同源的。

术语“同源”染色体是用来描述减数分裂时进行配对的相似染色体之间的关系。当两个染色体能够在减数分裂时通过联会复合体形成染色体对，则认为两个染色体彼此是同源的。

由连接酶催化的酶促反应，其中两个双链DNA分子共价结合在一起称为连接(ligation)。DNA分子被认为是由该反应“连接的”。

如此处所用，术语“基因座”(基因座复数)是指染色体上基因或遗传标记物定位的特定位置或多个位置或位点。

“基因型”是细胞、生物、或个体(即个体的特定等位基因组成)的遗传组成(makeup)，通常参照所考虑的特定特征或性状。

“表型”是生物可观察到的特征或性状，如器形态、发育、生化或生理属性、物候(phenology)、行为和行为的产物。表型是基因表达和环境因素影响，以及两者之间相互作用的结果。

本公开适用于广泛范围的植物，包括单子叶植物和双子叶植物。非限制性的实例包括葫芦科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)和禾本科(Gramineae)、玉米/玉米(玉蜀黍属(Zea)物种)、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(如大麦(Hordeum vulgare))、燕麦(如燕麦(Avena sativa))、高粱(Sorghum bicolor)、黑麦(Secale cereale)、大豆(大豆(Glycine)物种，如G.max)、棉花(棉属(Gossypium)物种，如陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))、芸苔属(Brassica)物种(如甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、芜菁(B.rapa)等)、向日葵(Helianthus annus)、红花、山药、木薯、紫花苜蓿(Medicago sativa)、稻(稻属(Oryza)物种，如O.sativa indica品种群或山茶品种群)、牧草、珍珠粟(狼尾草属(Pennisetum)物种，如珍珠狼尾草(P.glaucum))、树的物种(马尾松、杨树、杉、车前草等)、茶、咖啡树、油棕、椰、蔬菜物种如豌豆、西葫芦、豆类(如菜豆属(Phaseolus)物种)、黄瓜、菊芋、芦笋、花椰菜、大蒜、韭菜、生菜、洋葱、萝卜、生菜、芜菁、甘蓝、胡萝卜、菜花、菊苣、芹菜、菠菜、苦苣、茴香、甜菜、产肉质果的植物(葡萄、桃子、李子，草莓、芒果、苹果、李子、樱桃、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、柑橘、猕猴桃、无花果、柠檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙、柚等)、观赏物种(如玫瑰、矮牵牛、菊花、百合、非洲菊物种)、药草(薄荷、香菜、罗勒、百里香等)、木质树(如物种胡杨、沙柳、栓皮栎、桉树)、纤维物种例如亚麻(Linum usitatissimum)和大麻(Cannabis sativa)、或模式生物如拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

对于本发明的目的，术语“重组”用来表示两个基因座之间交换遗传物质的过程。

“(减数分裂)重组抑制”：杂种植物自交或回交后，当在2000子代个体中发生少于一个交叉或重组事件时，杂种个体中同一染色体上两个基因座之间的减数分裂重组被抑制。

在生物学中，“性状”涉及相较于(任何)其它相同生物的个体成员而言生物个体成员任何表型上的独特特征。本发明上下文内，性状是可以被继承的，即通过生物中的遗传信息，可以传给生物的下一代。“相同特征的性状”或“所述特征的性状”：特征中所存在(或变得明显)的至少两个性状的组中的任意一个。例如，在“花的颜色”特征情况下，表型表现可以包括蓝、红、白等等。在上面的实例中，蓝、红和白是相同特征的所有不同性状。

整个本申请中，括号中引用的各种参考文献用于更充分地描述本发明所属领域的状态。对于每个引用而言完整的书目信息见于本说明书的末尾，权利要求书之前。这些参考文献的公开在此通过引用其全部并入本公开。

详细描述

本发明提供了用于去除染色体上存在的基因座之间遗传连锁的新且创造性的方法，从而有可能不再依赖于经典的育种方法或经典的标记物辅助育种。尤其是此处公开的方法允许在体细胞中染色体的部分实现重组，染色体的部分特征在于具有被抑制了的(减数分裂)重组，即在减数分裂情况下该部分通常是被一起遗传的。在一个方面中，该方法允许在体细胞的染色体区域或部分中的同源和/或部分同源染色体之间进行相互染色体易位(交叉；交换)，所述染色体区域或部分的特征是具有被抑制了的(减数分裂)重组。例如，这首次允许高效地去除同一染色体上两个基因座之间的遗传连锁，两个基因座都位于染色体的这种“被抑制了的(减数分裂)重组”部分中。此外，允许在体细胞中进行如此的方法是DNA序列非依赖性的，且不依赖于减数分裂或有丝分裂。

更特别地，提供了用于去除植物或植物细胞中第一植物染色体上所存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的方法，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的，所述方法包括步骤：

(a)提供至少一个植物细胞，其包含所述第一染色体和至少第二染色体，其中所述第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述染色体是同源的或者是各自的部分同源染色体；

(b)在所述第一染色体中引入双链断裂，其中所述第一染色体中的双链断裂引入至所述第一基因座A和所述第二基因座B之间，从而提供包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分、以及包含所述第二基因座B的第一染色体的第二部分，

和

在所述第二染色体中引入双链断裂，从而提供第二染色体的第一部分和第二染色体的第二部分，以及；

(c)任选地，采用步骤(b)获得的至少一个植物细胞，鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分，

并且，其中通过至少一种位点特异性核酸酶引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

采用该方法，相同染色体上的基因座A和B之间的遗传连锁被去除。换句话说，根据本发明的方法后，两个原始基因座A和B在随后的减数分裂中不太可能被一起遗传，实际上不能在同一染色体一起存在。在优选的实施方式中，基因座A和基因座B存在于同一染色体臂。

第一染色体上的基因座A和基因座B可以是基因、启动子、遗传标记物、或存在于第一个染色体上的任何序列。基因座可以或可以不被图位(mapped)为特定生物性状的基因座。在一些实施方式中，基因座A和/或基因座B是基因和/或基因的部分。

优选在存在于植物细胞(优选植物原生质体)中的染色体上进行本方法，并且优选存在这种植物细胞的其它天然存在的成分，包括这种植物细胞的一套完整的染色体。

在优选的实施方式中，植物细胞是原生质体。本领域技术人员容易获得用于获得和维持植物原生质体的方法。发现在植物细胞中诱导(序列特异性的)DNADSB的最有效方法是使用植物原生质体。原生质体是缺乏初级和次级细胞壁个体植物细胞，其通过用真菌来源的酶混合物孵育植物部分而生成。然后任何DNA如质粒通过化学处理可引入到原生质体中，由于数以千计的质粒拷贝进入每个细胞，能够以高的水平表达质粒上存在的任何兴趣基因，其表达由合适的植物启动子所驱动。优选，基因表达是瞬时的，持续如24-36小时，这是因为质粒无法复制并且随着时间的推移逐渐降解。此外，质粒整合在植物基因组中是罕见的。/pct

可以诱导个体植物的原生质体分化形成未分化的细胞团，称为愈伤组织，这些继而又可被诱导以再生叶和芽，然后可以生根以产生植物。对于使用此处所述的任何方法之一来生产DNA DSB而言，以原生质体为基础的系统是理想的。位点特异性核酸酶可以置于质粒上，以高的水平表达，并产生能诱导所需DNA DSB的大量位点特异性蛋白。可大量分离(每天数百万)原生质体，用质粒DNA进行批量(en masse)转染，源自这些经转染的原生质体的愈伤组织来自单个原生质体细胞，所以不受嵌合现象(chimaerism)困扰。

然而，基因座A和基因座B特征在于它们位于所述第一染色体这样的部分、区域或区段中，其特征在于在所述部分、区域或区段中(减数分裂)重组被抑制。如此处所述，“抑制的减数分裂重组”是指，杂种植物自交或回交后，在2000个子代个体中，杂种个体中相同染色体上两个基因座之间的减数分裂重组发生少于一个交叉或重组事件。在优选的实施方式中，这在2500、5000或8000个子代个体中，发生少于一个交叉或重组事件。本领域的技术人员知道如何确定这一点。

在该方法中，在第一染色体中引入双链断裂，第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B。引入这种双链断裂的位置或基因座在所述第一基因座A和B之间。通过在基因座A和B之间引入一个双链断裂，染色体被分成至少两个部分，优选不超过两个部分；一个部分包含所述基因座A以及一个部分包括所述基因座B。在本发明的上下文中，当提及到所述染色体的第一部分或第二部分，这表明现在包含着丝粒的部分(即，在朝向(并包括)着丝粒的原始染色体中)或者通过引入双链断裂现在从着丝粒中分离的部分(即该部分远离染色体的中心，即相对于由于引入双链断裂而形成的其它部分更接近染色体(臂)的末端)。在本发明的上下文中，如果第一个染色体的第一部分被连接到第二染色体的第二部分，这表明相对于由于在所述染色体中引入双链断裂而形成的其它部分而言，接近第一染色体着丝粒的第一染色体的部分被连接到远离第二染色体着丝粒的第二染色体的部分，反之亦然。换句话说，在重新连接的染色体中包含第一染色体的第一部分和第二染色体的第二部分，在一个实施方式中，相对于由于引入双链断裂而形成的同一染色体的其它部分而言，第一部分靠近第一染色体的着丝粒，并且第二部分远离第二染色体的着丝粒。

令人惊讶地发现，进行上述步骤时，可应用分子技术或仅仅通过从这样的细胞再生植物鉴定植物细胞，其中所述第一基因座A和所述第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中至少两个同源或部分同源染色体之间已经发生了交叉(交换)，从而基因座A存在于第一染色体，基因座B存在于所述第二同源或部分同源染色体。否则，其中同源或部分同源染色体已被重新组织，在其中至少两个染色体之间发生交换或交叉，以及其中，虽然位于(减数分裂)重组被抑制的染色体区域中，基因座A和基因座B已被分离。

因此，任选地，进行上述步骤(a)和(b)后可鉴定至少一个细胞，其中第一染色体上第一基因座A与第二基因座B之间的遗传连锁已去除，并且其中包含第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接到第二染色体的第二部分。或者，在一些实施方式中，步骤(b)后获得的细胞可被再生为植物，任选地随后进行自交，由此获得的植物可以用于表型筛选是否去除基因座A和B之间的遗传连锁，例如在基因座A和基因座B与特定性状连锁的情况下，则可以观察到。

优选，进行上述方法的步骤(c)，即是根据本发明方法的一部分。基于本公开，技术人员知道如何鉴定这样的至少一个细胞。例如，首先个体原生质体可以单独繁殖，然后分析一些繁殖(克隆)的原生质体，例如使用标准的DNA测序、或扩增或杂交技术用于重新连接两个染色体的两个部分，和/或对子代进行表型分型，和/或荧光原位杂交(FISH)。

在优选的实施方式中，当进行上述步骤(c)时，方法进一步包括鉴定这样的那些细胞，即此外其中第一染色体的第二部分也被连接到第二染色体的第一部分。再次，如上所述，技术人员清楚如何进行这样的鉴定。

在此处公开的方法特别优选的实施方式中，所选择的植物细胞是这样的，即第二染色体不包含和所述第一基因座A相同的基因座和/或不包含和所述第二基因座B相同的基因座。换句话说，尽管第二染色体可具有相同基因座A和/或B的等位基因，它必须至少具有区别于存在于第一染色体上的基因座/等位基因的一些序列差异。例如，第一染色体包含基因座A或B，其可以是特定基因的第一等位基因，第二染色体可以包含相同基因的另一等位基因。优选地，在这样的实施方式中，第一染色体和第二染色体上的等位基因都涉及不同的表型。

在此处公开的方法的另一个实施方式中，存在于所述第一植物染色体上所述第一基因座A和所述第二基因座B之间的距离在一个碱基对和整个染色体长度之间。如上面已公开的，第一染色体上的基因座A和基因座B都在染色体(相同的)区域/部分/区段中，特征是被抑制的(减数分裂)重组。本发明另一具体优点是，现在可以容易地分离这种基因座，即使这种基因座彼此非常接近或远离，仍然同时提供生存的且正常的植物。

在此处公开的方法中，通过至少一种位点特异性核酸酶引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂，所述位点特异性核酸酶优选选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶(TALEN)和Cas9/crRNA/tracrRNACRISPR系统。

然而，基因组范围内引入DNA断裂和随机修饰的基因毒性试剂，本发明中使用的(内切)核酸酶，目前可以进行合理的设计使其识别并结合特定DNA序列，在其中随后诱导DNA DSB。

对于本发明，引入DSB的四项技术/核酸酶系统优选是：(1)大范围核酸酶，(2)锌指核酸酶(ZFN)，和(3)TAL效应物核酸酶(TALEN)和(4)Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

大范围核酸酶，包括归巢内切核酸酶如I-SceI，可以经突变以赋予改变的DNA序列亲和性(Belfort和Roberts,1997,Nucleic Axids Res.25:3379-3388；Chevalier和Stoddard,2001,Nucleic Acids Res.29:3757-3774)，并且已经在植物中报道了它们的活性(Kirik,2000,EMBO J.19,5562-566)。大范围核酸酶有时也被称为LAGLIDADG归巢内切核酸酶(LHE’s；Stoddard等人(2011)Structure 19:7–15)。大范围核酸酶不同于锌指核酸酶和TALEN(见下文)，之处在于因为它们是天然存在的基因靶向蛋白，其形成包含两个相同亚基的同二聚体，各亚基大小约160至200个氨基酸残基。已经提出，它们还可以作为通过接头序列连接在一起的两个串联重复单体的单肽而发挥作用(Stoddard,2011)。大范围核酸酶一般识别约20至30个碱基对的靶位点。对于大范围核酸酶以及用来评价突变的大范围核酸酶活性和改变的靶向特异性的方法的综述，参考Stoddards等人(2011)。此外，例如，大范围核酸酶的使用已在WO2011154159和EP2522723中得以描述。在本发明中使用的大范围核酸酶或大范围核酸酶对、以及所有其它核酸酶，可使用本领域技术人员了解的方法引入植物细胞中并随后(瞬时)在其中表达。例如，嵌合基因或嵌合基因对，其各包含连接到编码区的植物可表达的启动子，并且启动子还可操作地连接到在植物细胞中参与转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区，其中所述编码区编码大范围核酸酶或大范围核酸酶对中的一个。

对于本发明的目的，术语“锌指核酸酶”或“ZFN”是指嵌合蛋白分子，其包含有效连接到能够切割DNA的至少一个核酸酶的至少一个锌指DNA结合结构域。在靶基因座之处被ZFN切割在该基因座产生双链断裂(DSB)。锌指核酸酶由两个结构域组成，锌指结构域的阵列和核酸酶结构域，通常源自IIS型限制性酶FokI。这些IIS型限制性酶如FokI，识别特异性的DNA序列并切割识别位点下游的几个碱基对。每个锌指结构域可经工程改造以识别特异性的3bp三联体，以及通过将这些中的一些连接在一起，更长的DNA序列可被特异性识别。切割DNA之前，FokI结构域必须进行二聚化，因此两个ZFN蛋白经设计以靶向被5-6bp的短间隔区所隔开的相反DNA链上的序列。两个ZFN蛋白和它们各自的靶序列相结合，使得两个FokI结构域在间隔区中的DNA螺旋上彼此相对，在此处然后产生DNADSB。许多研究显示，在许多不同植物物种中ZFN在内源靶序列上有效诱导小INDEL(Curtin(2012)The Plant Genome,5,42-50)。以CompoZr的名称，从Sigma-Aldrich可商购获得定制的锌指核酸酶(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology.html)。例如，在植物中锌指核酸酶的用途已经描述于WO03087341和WO2011052539。用于本发明的ZFN、以及在本发明中使用的所有其它核酸酶，可使用本领域技术人员了解的方法引入植物细胞并随后(瞬时)在其中表达。例如，嵌合基因或嵌合基因对，其各包含连接到编码区的植物可表达的启动子，并且启动子还可操作地连接到在植物细胞中参与转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区，其中所述编码区编码大范围核酸酶或大范围核酸酶对中的一个。出版物US2012/0196370教导ZFN可用于在真核基因组中产生特定的缺失。在这种方法中，ZFN的靶向位点被高达120Kbp所分开，和线性“供体”分子一起被引入细胞，所述线性“供体”分子在各端具有每个被分开的ZFN靶位点的序列同源性的区域。用这些试剂处理动物细胞系后，然后可以扩增产物从而ZFN靶位点之间的区域已被供体分子替换，产生介入(intervening)序列的有效删除。在这种情况下，由于序列同源性的区域存在于供体分子的末端，采用有丝分裂HR途径。出版物表明，供体分子对于第一驱动有丝分裂HR反应的精确性和第二增加有丝分裂HR反应的频率而言是必不可少的。这被认为是必要的，因为只使用ZFN时获得的易位频率对于实际应用而言太低了。和文献中所教导的相反，本发明人发现，当只有单一的ZFN对被用来产生DSB时，可以产生植物染色体之间的特异性易位。与出版物US2012/0196370相反，我们的实验利用NHEJ途径产生易位，因为我们在染色体融合点观察到了表征这种重组途径的小的缺失。当仅在植物染色体中的一个诱导DNA DSB时，通过导致小的缺失的NHEJ途径将DNA末端重新结合。这些小缺失的频率(存在于10％的细胞中)由两部分组成，ZFN对的切割效率以及通过NHEJ途径修复DSB时的效率。在这种情况下，在一个染色体上诱导单一的DSB以使得DNA末端紧相邻，产生10％的效率。然而，为了发生易位，必须在细胞核中空间上分离的两个染色体上产生DSB，并且这些DNA末端的相互作用不太可能导致非常低的易位形成频率。然而，我们已发现，在植物细胞中通过NHEJ途径的易位形成效率(0.8％)出乎意料的高，只比相邻DNA末端的修复低12倍，因此，允许容易的分离经历了这种重组过程的单个细胞。此外，我们的方法在植物细胞中不要求“供体”分子，因为根据我们的发明使用NHEJ途径的易位形成频率和精确性对于实际应用而言已经足够高。因此，根据本发明的方法并不需要使用US2012/0196370所描述的这种线性供体分子或供体多核苷酸。

TALEN是源自TAL效应物的位点特异性核酸酶，是由引起各种不同植物疾病的黄单胞菌属物种所产生的。植物感染黄单胞菌属物种期间，TAL效应物蛋白被引入植物细胞。TAL效应物由许多重复的蛋白结构域组成，其中的每一个都能够特异性识别并结合到4个DNA核苷酸(A、T、G、C)中的一个。这些结构域的不同组合存在于不同TAL效应物中，并且每一个都结合植物基因组中的，通常在植物基因启动子中的独特DNA序列。病原体一旦结合到植物DNA，TAL效应物便影响植物基因表达以增强细菌致病性。已经鉴定了特异于每个核苷酸的结构域，并且可生产对任何DNA序列具有高结合亲和性的这些结构域的阵列(Christian,2010,Genetics 186:757-761；Cermak等人,2011,Nucleic Acids Res 39:e82；Bogdanove和Voytas,2011,Science 333:1843-1846；Boch,2011,NatureBiotechnology 29:135-136)。可从Cellectis Bioresearch获得商业定制的TALEN(http://www.cellectis-bioresearch.com/genome-customization/genomic-scissors/talen)。然后这些阵列融合到FokI的核酸酶结构域以产生TALEN，并且和ZFN类似，两个TALEN蛋白用来在靶序列的间隔区中诱导DNA DSB。有几篇论文描述了使用TALEN来产生靶序列物种的突变(Curtin(2012)The Plant Genome,5,42-50)。用于本发明的TALEN、以及在本发明中使用的所有其它核酸酶，可使用本领域技术人员了解的方法引入植物细胞并随后(瞬时)在其中表达。例如，嵌合基因或一对嵌合基因，其各包含可操作地连接到编码区的植物可表达的启动子，并且启动子还可操作地连接到在植物细胞中参与转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区，其中所述编码区编码TALEN或一对TALEN中的一个。例如，在WO201107224中已经描述了TAL效应物(TALEN)的用途。

CRISPR技术(此处也称为Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统)源自细菌，在细菌中它用作防御分子病原体例如质粒和噬菌体入侵的系统。细菌基因组中的特异性基因座由源自分子病原体基因组的短序列的阵列组成，所述的分子病原体基因组是之前的感染所致。小RNA(crRNA)产生自这些和tracrRNA相互作用的基因座，这些RNA分子然后一起将Cas9蛋白靶向分子病原体基因组中的特异性互补序列。Cas9蛋白具有核酸酶活性并且能够在病原体基因组中的靶序列处产生特异性DNA双链断裂(DSB)，然后病原体基因组被降解。在植物和动物细胞中表达靶向基因组序列的Cas9蛋白(核酸酶)、tracrRNA和crRNA(CRISPR系统的成分)，在经常被细胞DNA机器(machinery)所错配的基因组靶序列的位置产生靶向的DSB，导致小的插入或缺失(INDEL)(Feng等人(2013)Cell Res.1:4；Li等人(2013)Nat.Biotech.31:689-691；Nekrasov等人(2013)Nat.Biotech.31:691-693；Shan等人(2013)Nat.Biotech.31:686-688)。基因的编码序列或甚至内含子中的INDEL通常导致基因功能的丢失。对于实践目的，tracrRNA和crRNA通常组合成一个嵌合引导RNA(sgRNA)；RNA的这种组合包含在Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统的定义中。

位点特异性核酸酶能够以高的效率诱导靶向DSB，因此能够轻易地鉴定出在靶序列中含有INDEL的植物。通过采用位点特异性核酸酶(如CRISPR系统)所进行的基因组工程改造具有很多的应用，尤其是在多倍性物种中，并且对于作物的改善变得越来越重要。

尽管原则上一个或更多的上述核酸酶可单独或者组合使用，优选通过相同的位点特异性核酸酶、相同的锌指核酸酶、相同的大范围核酸酶、相同的TAL效应物核酸酶或相同的Cas9/crRNA/tracrRNA核酸酶系统，引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂。换言之，优选靶向第一和第二染色体中可被相同核酸酶所靶向的序列，例如因为靶序列是相同的。对第一和第二染色体中这种靶的识别在技术人员能力范围之内，而且并不困难，因为第一和第二染色体是同源的，或者是享有染色体的具有高水平同一性(如100％)部分的部分同源染色体。

基于此处所公开的，在此处所公开的方法的优选实施方式中，技术人员清楚第一染色体中引入不超过一个双链断裂，并且第二染色体中引入不超过一个双链断裂。

在根据本发明方法的另一个优选实施方式中，

i.第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述第一基因座A和第一特征的期望性状连锁，以及所述第二基因座B和所述第一特征或第二特征的不期望性状连锁；以及

ii.其中所述第二染色体不包含和所述第二基因座B相同的基因座，其中所述第二基因座B和所述第一特征或第二特征的不期望性状连锁，以及；

iii.在第一染色体的所述第一基因座A和所述第二基因座B之间以及在第二染色体对应的基因座或位置上引入一个双链断裂。

根据本发明的方法的这种实施方式允许克服连锁累赘。方法允许将连锁至有利性状的基因座A和连锁至不利性状的基因座B分离。基因座A和B可以是连锁至所述期望(A)或不期望(B)性状的遗传标记物，或者可以是有因果关系地连锁至期望或不期望性状的基因(之中)。与基因座A和B相关的或连锁的性状可以是或者可以不是相同的特征。

如上述，在此处所公开的方法的尤其优选的实施方式中，所选的植物细胞是这样的，以使得第二染色体不包含和所述第一基因座A相同的基因座，和/或不包含和所述第二基因座B相同的基因座。换言之，尽管第二染色体可具有相同基因座A和/或B的等位基因，其必须具有至少一些和第一染色体中基因座/等位基因的序列差异。例如，第一染色体包含可以是特定基因的第一等位基因的基因座A或B，以及第二染色体可包含相同基因的另一等位基因。在本实施方式的上下文中，技术人员理解第二染色体优选不提供和第一染色体上所述不期望基因座B相同的基因座，或包含这种不期望基因座B的不期望等位基因变体的基因座B。换言之，通过根据本发明的这种方法，第一染色体得以修饰，从而原来存在于染色体上不期望的基因座B被去除，并替换为获自第二染色体的染色体对应部分，并且不含有连锁至不期望性状的所述基因座B。

不期望性状的非限制性实例可以是选自如下的性状：对第一特征的期望性状有负面影响的性状、降低产量的性状、降低疾病或害虫抗性的性状、降低生长的性状、降低尺寸的性状、降低种子的量的性状、降低胁迫抗性的性状，所述胁迫包括盐、热、冷、水和干旱的胁迫。然而，将会理解的是，取决于育种者或技术人员的目的，特征的任何性状单独地或相对于基因座A相关的期望性状而言，可以被视为是不期望的。

在根据本发明方法的另一实施方式中，方法还包括从步骤(b)或步骤(c)之后获得的植物细胞中再生植物，并且通过自交或者和另一植物进行杂交，从所述再生植物中产生种子，并且从获得的种子来培养植物，以及任选地，筛选获得的所述植物是否去除遗传连锁。如上所解释的，技术人员熟知如何进行这些步骤以及如何筛选遗传连锁的去除。

优选，所提供的植物细胞是植物体细胞，优选原生质体，和/或获自杂种的植物细胞。植物细胞可获自任何适合的植物，例如此处所具体公开的。植物细胞可源自例如二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体、八倍体、十倍体、十二倍体或异源二倍体植物。

根据此处的公开，并考虑此处讨论的所有偏好和改变，以及技术人员所掌握的，还提供了一种用于提供获自植物P2的植物P1的方法，其中所述植物P2特征在于在第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间存在遗传连锁，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的，

以及其中所述植物P1特征在于缺失所述遗传连锁，所述方法包括：

(b)在所述第一染色体中引入双链断裂，其中所述第一染色体中的双链断裂引入至所述第一基因座A和所述第二基因座B之间，从而提供包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分、以及包含所述第二基因座B的第一染色体的第二部分；

以及

在第二染色体中引入双链断裂，从而提供第二染色体的第一部分和第二染色体的第二部分，以及；

(c)任选地，采用步骤b)获得的至少一个植物细胞，鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分，

并且其中通过至少一种位点特异性核酸酶引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

再次，优选进行步骤(c)。

根据另一方面，提供位点特异性核酸酶用于去除第一染色体上存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的用途，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统，其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的。优选，提供了一种用途，其中所述第一基因座A连锁至第一特征的期望性状，并且所述第二基因座B连锁至所述第一特征或第二特征的不期望性状。

还提供了位点特异性核酸酶用于去除连锁累赘的用途，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统。

最后一个方面，提供了根据本发明的方法或用途可获得的或者获得的植物、植物的部分、果实或种子。在优选的实施方式中，提供了植物、植物的部分、果实或种子中的至少2种的一组。

总之，非限定性的实施方式中，所公开的发明涉及通过使用位点特异性核酸酶在植物体细胞原生质体中诱导同源或部分同源亲本染色体之间的交叉，其中所述位点特异性核酸酶能够在两个染色体的相同序列上诱导特异性DNA DSB。这可以通过分离植物原生质体，然后通过化学处理向原生质体中引入存在于质粒上的位点特异性核酸酶而实现。然后在原生质体中生产位点特异性核酸酶蛋白，并诱导DNA DSB。认为NHEJ系统可通过将来自不同染色体的游离DNA末端连接在一起来修复这些DSB，导致染色体臂的交换，也称为相互易位。位点特异性核酸酶可以经设计而用于在任何期望的序列上诱导DSB，因此可以在沿着同源亲本染色体的任何点上诱导相互易位。优于减数分裂重组的一个巨大优势是，使用根据本发明的方法进行的DNA末端连接是序列非依赖性的，因此使用这种方法对可靶向的或交换的区域没有限制。因此，这种方法对于打破例如基因渗入中的连锁累赘是理想的，由于序列的差异，基因渗入在减数分裂期间不发生重组(是被抑制的)。在商业上重要的作物物种中有很多重要性状的实例，比如番茄中的病毒TMV和TYLCV抗性，其位于带有连锁累赘的大的基因渗入片段中，对植物产量具有负面影响。因为这些抗性是有价值的，这种产量损失是可接受的，而且对于植物育种者和栽培者打破这种连锁累赘来进一步提高植物产量都将是非常有利的。

通常，产生含有确定尺寸基因渗入的植物的能力，对于植物育种者也很有用。可以生产这样的植物群体，其各含有来自野生未曾改变过的植物物种的特定基因渗入，并将这种植物群体用于作物改善和发现基因。通过在基因渗入所处位置上将基因渗入分成更小的部分，如此重复直至确定兴趣基因的位置，可以更加高效地图位(mapped)负责新性状的基因。由于靶向易位的产生是序列非依赖性的，可更快并更精确地产生植物基因渗入文库，所有基因组区域可以等同地得到体现。这降低了对筛选大F2群体中的期望交叉的需求，意味着需要更少的设施，比如温室空间。这种方法还能应用于异源多倍体物种(比如烟草、油菜或小麦)的育种。异源多倍体植物物种通常是两种或更多二倍体物种之间古老的杂交事件所致，从而分开的不同基因组在减数分裂过程中不发生重组。例如，欧洲油菜(Brassicanapus)由A和C基因组组成，A和C基因组在减数分裂过程中不发生混合。因此，在各基因组的特定染色体区域不能通过自交实现完全纯合。欧洲油菜的原生质体可以被分离，并转染有携带位点特异性核酸酶的质粒构建体，其中位点特异性核酸酶在A和C染色体相同的位置上诱导DSB。然后该细胞可以产生A和C基因组之间的相互易位，而这是通过减数分裂重组所不可能实现的。然后，随后再生的植物可以进行自交，鉴定出对于两个基因组中易位是完全纯合的任何植物。靶向易位对于在基因水平操纵DNA序列也是非常有用的。如果鉴定某特定启动子在野生未曾改变的植物物种中比在栽培物种中更加活跃，那么靶向易位可用于将活性启动子转移到栽培物种的基因组。这可以通过两个物种之间进行杂交而实现，来产生F1品系，从中分离原生质体，然后在这些原生质体中表达位点特异性核酸酶，其中位点特异性核酸酶在两个同源染色体中在刚好兴趣基因转录起始之前的位置上诱导DSB。由此产生的靶向易位将包含活性启动子的上游序列结合到兴趣基因，这改变了它的转录模式和水平。同样地，位点特异性核酸酶可被设计用来在不同同源染色体上基因的内含子上引入DSB。这些DSB之间的靶向易位会造成同源染色体之间基因结构域的交换以及含有来自各染色体的结构域的嵌合基因的形成。在这种情况下，由NHEJ系统所产生的小的缺失位于内含子本身，因此不太可能抑制基因功能。

实施例

实施例1

在番茄原生质体中染色体VII上诱导靶向易位

用于在番茄细胞中产生靶向易位的实验设置显示于图1。该方法使用在两个同源染色体相同或相应的基因组位置上诱导DNA双链断裂(DSB)的位点特异性核酸酶，在本实施例中是锌指核酸酶。当这两个DSB通过将DNA末端连接在一起而从另一染色体当中被修复时，然后可形成染色体之间的易位，从而交换染色体臂。为了检测易位的形成，设计PCR引物来特异性扩增每个染色体上的ZFN切割位点。一旦形成易位，可以通过使用这些正向和反向引物的不同组合来特异性地扩增这些连接(junction)。对于特异性引物的设计，序列差异必须存在于每个染色体上ZFN切割位点的两侧。这通过使用染色体VII上携带来自野生番茄物种潘那利番茄(Solanum pennellii)的基因渗入的番茄品系而实现。这种基因渗入区域包含潘那利番茄ALS2基因(SpALS2)中的ZFN靶位点以及区别于野生型ALS2(WT ALS2)足够的序列差异，从而使得能够进行特异性引物的设计。通过WT番茄(M82)和潘那利番茄染色体VII基因渗入品系IL7-3进行杂交，针对ALS基因座产生F1杂种杂合子来进行试验。然后，从这个F1杂种产生原生质体，并用表达ZFN的质粒构建体进行转染，ZFN在WT ALS2和SpALS2基因座上诱导DSB。使用我们的PCR方法，我们能够检测在其中发生相互易位的细胞。令人惊奇的是，这样的事件以相对高的频率(0.8％)是可检测的，这是出乎意料的，因为DNA DSB位于不同的染色体上。这是首次报道的证据，其表明位点特异性核酸酶能够在植物细胞中诱导相互易位，并表明这样的事件以相对高的频率发生。然后，我们将个体植物原生质体继续培养为愈伤组织，并利用PCR对这些愈伤组织进行基因分型来鉴定带有期望易位的那些。这种愈伤组织可再生为植物，并显示出位于基因渗入片段侧翼的标记物之间失去的连锁。以不依赖于同源性的方式，这种方法可以用来降低植物体细胞原生质体中基因渗入片段的大小。

锌指核酸酶构建体

对于我们的实验，使用质粒pKG7402。这种质粒含有2个被设计用于在番茄乙酰乳酸合酶(ALS)基因(ALS1和ALS2)上结合并诱导DNA双链断裂的锌指核酸酶基因。ALS1位于染色体III的短臂上，ALS2位于染色体VII的长臂上。

植物材料

采用了在染色体VII上含有来自番茄野生物种野生番茄(Solanumlycopersicum)的基因渗入的潘那利番茄品系(IL7-3)。这种基因渗入片段的大小约56cM，并构成了该染色体长臂的大部分(Eshed,Y&Zamir,D.(1995)Genetics141:1147-1162)并且包含潘那利番茄的ALS2基因。对于这种基因渗入片段纯合的植物回交亲本系(M82)，收集F1种子。然后，将这些进行灭菌，并于高罐中以2000lux 16/8h的光周期在25℃和60-70％RH中在合成介质上(MS20：MS介质+维生素(Duchefa)4.4g/L、蔗糖20g/L、微藻8g/L)萌发。也以相同的方式处理亲本M82和纯合IL7-3品系，并在组织培养中保持为无菌植物。3-4周后，收获成熟的叶用于生产原生质体。

原生质体分离和转染

番茄叶原生质体的分离和再生已如前所述(Shahin(1985)Theor.Appl.Genet.69:235-240；Tan(1987)Theor.Appl.Genet.75:105-108；Tan(1987)Plant Cell Rep.6:172-175)，在这些出版物中可以找到所需的溶液。简言之，将1g新鲜收获的叶置于含有5ml CPW9M的皿中，并使用手术刀片垂直于主茎每mm进行一次切割。这些被转移至25ml酶溶液的新鲜平板上(含2％纤维素酶onozuka RS、0.4％离析酶(macerozyme)onozuka R10、2.4-D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)的CPW9M，pH为5.8)，并在黑暗中于25℃进行过夜消化。然后，通过将原生质体置于定轨振荡器上(40-50rpm)1小时，使其游离(freed)。通过使它们通过50μm的筛，从细胞碎片中分离原生质体，并用CPW9M洗涤两次(2×)筛。以85g离心原生质体，弃去上清液，然后在一半体积的CPW9M中被取出。最终，在3ml CPW9M中取出原生质体，然后小心地加入3ml CPW18S以避免两种溶液混合。于85g下将原生质体旋转10分钟，使用长巴斯德吸管收集漂浮在界面层的活原生质体。通过添加CPW9M将原生质体的体积增加至10ml，在血球计中确定回收的原生质体数目。为了用质粒构建体进行转染，在5℃下于85×g将原生质体悬浮液离心10分钟。弃去上清液，并且将原生质体沉淀以106.mL-1的最终浓度重悬浮于KCl洗涤介质中。在10mL管中，250μL的原生质体悬浮液+/-40μg的纯质粒DNA和250μl PEG溶液(40％PEG4000(Fluka#81240)、0.1M Ca(NO3)2、0.4M甘露醇)轻轻但充分混合。20分钟后，在室温下孵育，逐滴加入5mL冷的0.275MCa(NO3)2。在4℃于85×g将原生质体悬浮液离心10分钟，弃去上清液。PEG处理后，将番茄原生质体嵌入海藻酸盐溶液中以便再生。加入2ml海藻酸盐溶液(甘露醇90g/l、CaCl2.2H2O 140mg/l、海藻酸钠20g/l(Sigma A0602))，并通过颠倒充分混合。在Ca-琼脂平板上(72.5g/l甘露糖醇、7.35g/l CaCl2.2H2O、8g/l琼脂)1ml此溶液均匀分层，并使其聚合。然后，将海藻酸盐盘转移到含有4ml K8p培养基的4cm平皿，在30℃下黑暗中孵育7天。然后，将海藻酸盐盘切成5mm厚的条，在固体再生介质TM-DB(TM2基础2.5g/l(Duchefa)、Nitsch维生素110mg/l、蔗糖50g/l、微藻8g/l、2,4-D 0.2mg/l、BAP 0.5mg/l，pH为5.8)分层3周。然后用镊子拿起再生的愈伤组织，并单独置于GM-ZG介质上(MS大量+微量粉(Duchefa)4.3g/l、Nitsch维生素110mg/l、甘露醇36.4g/l、蔗糖2.5g/l、微藻8g/l、玉米素1mg/l、GA31mg/l，pH5.8)。然后，当它们达到约7mm时，对这些进行取样用于DNA分离。芽再生时，愈伤组织转移到MS-ZI介质上(MS+维生素(Duchefa)4.4g/l、蔗糖20g/l、微藻8g/l、玉米素2mg/l、IAA 0.1mg/l，pH5.8)。2-3周后，切下苗，并转移至生根介质(MS+维生素(Duchefa)4.4g/l、蔗糖20g/l、微藻8g/l、IBA 0.5mg/ml，pH5.8)，随后转移至温室。

潘那利番茄ALS2基因座的测序

按制造商的说明，从纯合IL7-3品系中分离染色体DNA(DNeasy试剂盒，Qiagen)，基因组Walker试剂盒(Clontech)用于确定潘那利番茄ALS2基因座的序列。简言之，用限制性酶(DraI、EcoRV、PvuII或StuI)将500ng基因组DNA消化过夜，连接基因组Walker接头。在野生番茄(S.lycopersicum)ALS2的ORF保守序列上所设计的ALS2特异性巢式引物11_11533(5'-TGGGAATGGTGGTTCAGT GGGAGGA-3')和11_11534(5'-GGTGGTTCAGTGGGAGGATCGATTCT-3')，被用于扩增潘那利番茄ALS2基因座的3'端。相应地，巢式引物对11_11536(5'-CGTAGCTCCCGGACCAGATGTAGCA-3')和11_11537(5'-ATGTAGCAATACAAACACCAGGGAACCCA-3')用于扩增ALS基因座的5'端。从凝胶中切下PCR产物，并进行测序。基于这些序列，设计其它引物(11_13680(TCACCCCTTCACCTTACC)和11_13681(CCTTCACATTTAACCAAAGC))来扩增干扰区域并用于完成基因座的测序(图2)。通过这种方式证明ALS2中的ZFN靶位点在M82和IL7-3品系中是保守的。

ALS2基因座特异性引物的设计

潘那利番茄和M82ALS2序列的比对，使我们能够鉴定可被利用来进行特异性引物设计的序列差异，其中所述特异性引物设计仅仅选择性扩增一个等位基因，并且扩增包含ZFN靶位点的PCR产物。为了扩增潘那利番茄ALS2基因座，我们使用引物11_13680+11_13681，对于M82ALS2基因座而言使用引物09Q136(GAAAGGGAAGGGGTTAAGG)和12_07231(CTTCAGTAGAGCCCTTGC)。结果示于图2a，并显示这些引物扩增出亲本品系IL7-3和M82中正确大小的条带，并且两个基因座均存在于源自这两个亲本杂交的F1品系(品系BC)中。

在潘那利番茄ALS2基因座上诱导INDEL

从IL7-3品系和M82植物中分离原生质体，并用质粒pKG7402或携带35S::GFP盒的质粒(pKG7381)进行转染。12小时后，转染有pKG7381的原生质体在荧光显微镜下观察以评价GFP表达。这在IL7-3和M82原生质体(数据未示出)中是等同的，这表明在品系IL7-3中潘那利番茄的基因渗入没有影响转化。48小时后，通过离心收获原生质体，并使用DNeasy试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。然后使用引物09Q132(CTTGTGGAGGCACTTGAA)和09Q133(CCGGACCAGATGTAGCAATA)在这个DNA上进行PCR反应，所述引物扩增包含ZFN靶位点的ALS2基因座的205bp片段。然后纯化PCR产物，并克隆到载体(pCR2.1：Blunt，Invitrogen)中，并按照制造商的说明转化到One Shot化学感受态大肠杆菌细胞中(Invitrogen)，涂布在补充有50μg/ml卡那霉素的LB介质上(Duchefa)。随后在单个96个菌落上使用相同的引物进行PCR，在Roche Light Cycler装置上通过高分辨率熔融曲线分析所得的PCR产物来鉴定具有异常熔融特性的PCR产物。然后这样的克隆进行测序，结果示于图3。对于IL7-3和M82品系，源自转染的原生质体群体约10％的PCR产物在ZFN靶位点含有INDEL。两个品系中的这些INDEL的尺寸也是相当的，因此我们可以得出结论，可以像M82ALS2基因座一样高效地靶向潘那利番茄ALS2基因座。作为对照，我们也分析了源自pKG7381转染的96个PCR产物。所有这些都没有显示异常的熔融特性，当两个被进行测序时，它们没有表现出任何序列变化(数据未显示)。

番茄原生质体中在ALS2基因座上的靶向易位

原生质体分离自体外生长的F1植物(源自M82×IL7-3杂交)。此外，我们还从体外生长的M82和IL7-3植物分离原生质体。用40μg的质粒pKG7402(或作为对照40μg的pKG7381)转染原生质体，并在液体介质中保持48小时。然后，通过离心(800rpm，10分钟)收获来自每个转染的原生质体，然后使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从这些原生质体群体中分离基因组DNA。为了检测原生质体群体中存在易位，使用基因座特异性引物的组合。例如，潘那利番茄ALS2引物(11_13680)和M82引物(12_07231)的组合应该只扩增经历过易位的染色体，并将产生在ZFN靶位点的位置包含易位连接(junction)的PCR产物。采用这些引物在所有原生质体DNA样本上，使用以下循环条件{95℃2'；[95℃30”、60℃30”、72℃2']×40；72℃5'}，在由1μl基因组原生质体DNA、5μl 5×Herculase融合缓冲液(Agilent)、0.3μl 100mM dNTP、1.25μl引物11_13680、1.25μl引物12_07231、0.25μl Herculase II融合酶(Agilent)和15.95μl水组成的反应中进行PCR反应。在1％琼脂糖凝胶上进行的PCR产物的电泳显示，所有样本产生预期大小的带，但是带的强度比pK7402处理的F1植物样本中的强(数据未显示)。由于我们在对照样本中观察到PCR产物，这表明11_13680+12_07231的引物组合能够从未曾改变的潘那利番茄和M82ALS2基因座中产生非特异性PCR产物，但来自处理过的F1原生质体的PCR产物可能更强，因为它还含有产生自易位连接的PCR产物。从凝胶上切下来自处理和对照的2.2kbps的PCR产物，并使用Qiagen凝胶分离试剂盒纯化。然后，使用Zero Blunt PCR连接试剂盒(Invitrogen)按照制造商的说明克隆PCR产物，从大肠杆菌TOP10细胞中纯化含有克隆产物的所得质粒，完整的2.2kbps PCR产物进行测序。结果示于图4。引物确实能够从对照样本中扩增ALS2PCR产物，但测序表明这总是源自WT ALS2基因座(M82)或源自SpALS2基因座(IL7-3)。对源自转染有对照质粒(pKG7381)的F1原生质体的两个PCR产物的分析表明，两个基因座在这种PCR反应中得以扩增。来自对照的所有PCR产物显示预期的序列。源自用pKG7402处理过的F1杂种原生质体的PCR产物在ZFN结合位点都显示出小的INDEL，类似于当来自亲本品系的原生质体用pKG7402处理时我们早先所观察到的。然而，对于每个这些2.2kbp的PCR产物，ZFN结合位点的SNP上游表示，这是潘那利番茄ALS2的序列，而ZFN结合位点的SNP下游源自M82ALS2序列，这正如我们对易位连接片段所期望的。因此，这种提供了良好的证据，原生质体细胞的群体中，存在着在潘那利番茄基因渗入和WT M82染色体VII之间ALS2基因座的位置上经历了靶向易位的细胞，导致染色体臂的交换，破坏基因渗入片段中的连锁。

为了定量在处理的群体中多少原生质体包含靶向易位，我们试图对具有这种特征性的潘那利番茄/M82ALS2嵌合结构的PCR产物数目进行定量。我们在基因组DNA上使用引物12_11216(CTTCCACCCTTCTTCCCAAATC)和12_11217(TGCCAACTCCTGCACATTCA)进行PCR。这些引物不是特异性的，因此扩增了来自WT ALS2和SpALS2基因座的1.3kbp的产物。从而，这样的PCR反应由SpALS2、WT ALS2和靶向易位产物组成。为了确定每个这些产物在PCR反应中的相对量，以及靶向易位过程本身的效率，对来自PCR反应的产物进行克隆和基因分型。1.3kbp的PCR产物包含ZFN结合位点和位于两侧的两个诊断限制性位点。ZFN结合位点上游，潘那利番茄ALS2序列中A→G的变化产生了HindIII限制性位点。ZFN结合位点的下游潘那利番茄ALS2序列中C→A的变化产生MseI位点。这些位点被用作CAPS分析的基础以便对PCR产物的ZFN结合位点两侧的ALS2序列进行基因分型。使用Zero Blunt PCR连接试剂盒按照制造商的说明将1.3kbp的PCR产物进行克隆。个体细菌菌落重新悬浮于50μl的水中，在95℃下加热5分钟，然后用引物09Q132+09Q133或用09R037+09R040将1μl的这种个体细菌菌落用于巢式PCR，其随后分别用HindIII或MseI消化。存在或不存在HindIII和MseI位点指示着未曾改变的ALS2基因座(SpALS2或WT ALS2)，而仅具有这些PCR产物之一的克隆的PCR产物可源自靶向易位事件。对总共249个细菌菌落进行基因分型，确定是否仅仅存在这些限制性位点中的一个，最终鉴定了5个。为了确认，这五个克隆的1.3kbp的PCR产物进行测序。五个PCR产物，我们发现两个具有预期的组织结构(图4)。第一，克隆#1，显示出ZFN结合位点上游的潘那利番茄ALS2序列和M82ALS2序列下游。对于克隆#2，这刚好相反。因此，我们可以得出这样的结论，在我们的实验设置中靶向易位形成的效率是大约249个中的2个(0.8％)。这表明，仅需要筛选有限数目的原生质体以分离具有靶向易位的细胞。

分离具有靶向易位的番茄植物

原生质体分离自F1杂种品系的叶，并用40μg质粒pKG7402转染。为了进一步发育，然后将它们包埋在海藻酸盐盘中，然后将其在4ml K8p介质中孵育7天。然后将盘切成5mm的条，其随后放置在固体TM-DB介质中(2-4D，BAP)以便微愈伤组织的进一步发育。经过3周的生长，用镊子取800个愈伤组织，并转移到新鲜TM-DB介质中。我们已经表明，在ZFN切割位点处易位连接总是含有少量INDEL，所以我们针对这一方面首先筛选所有的愈伤组织。对于基因分型，用塑料移液管的尖端从各发育的愈伤组织上剥离小块组织，然后重新悬浮在20μlPhire Plant Direct PCR试剂盒(Thermo Scientific)的稀释缓冲液中。对于在这种材料上的直接PCR，取1μl的稀释液并混合上10μl 2×反应缓冲液、2μl引物12_11216和12_11217(5pmol)0.2μl的Phire聚合酶和水直至20μl的最终反应体积。所用的PCR条件是98℃5分钟，{98℃5秒，62℃5秒，72℃1.5分钟}×40，72℃5分钟。然后，这些PCR产物以200×稀释在水中，将1μl的这个用于巢式PCR以扩增ZFN切割位点(1μl PCR产物、5μl 10×反应缓冲液、0.5μl dNTP(20mM)、1μl 09Q132(5pmol)、1μl 09Q133(5pmol)、0.2μl AmpliTaq(5U/μl)和41.3μl水，循环条件是：94℃2分钟，{94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒}×30，72℃5分钟。这产生一个包括ZFN切割位点的200bp PCR片段，可以对其进行筛选是否存在INDEL。还在来自F1品系的材料上进行了这些PCR反应以产生对照PCR产物。为了检测在ZFN切割位点带有INDEL的愈伤组织，4μl各200bp的PCR产物与4μl对照PCR产物以及1μl TE和LC Green混合。使用Roche Light Cycler的基因扫描规程确定这种混合物的熔融特性。我们确定了53个样本具有异常的熔融特性，这指示着ZFN切割位点的INDEL。然后，使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆来自这53个愈伤组织的1.3kbp产物。随后，来自每个连接的4个细菌菌落进行基因分型确定是否存在如上所述的HindⅢ和MseI位点。根据单个的愈伤组织TT1和TT2，我们能够表明所有测试的细菌克隆缺乏限制位点中的一个，这表明该细胞已经历了相互靶向易位。对这些克隆进行测序，和源自原生质体的序列类似，我们能够表明靶向易位发生在这些愈伤组织中。鉴定这些愈伤组织的频率(0.25％)和之前所确定的范围相同，并保持出乎意料的高频率。

潘那利番茄基因渗入两侧RFPL的标记物分析

然后，愈伤组织TT1和TT2可转移至发芽介质中，芽随后被诱导而形成根。然后将植物转移到温室中用于进一步的基因分型。从植物TT1收集种子并在土壤中萌发。从苗收获叶材料并分离DNA。为了证明在子代中标记物TG20和TG143不再连锁，分析苗是否存在这些标记物。F1植物进行自交，其中两个标记物存在于同一染色体上位于基因渗入的两侧，并预期将传给子代，其中25％缺乏标记物而75％对两种标记物呈现阳性。在含有靶向易位的植物中，在原生质体中标记物之间的连锁已经被打破。当分析这种植物的子代时，我们预期50％具有两个标记物(在此情况下，位于不同染色体上)，25％只包含标记物TG20以及25％只包含标记物TG143。可以在TT1和TT2植物的子代中进行标记物分离分析。因此，在番茄原生质体中位点特异性核酸酶如ZFN的瞬时表达，可以诱导提供活植物的相互靶向易位，并能够传递给下一代。这种方法可以按照不依赖于序列的方式用来打破两个DNA序列之间任何形式的连锁。

实施例2

打破TYLCV基因座的连锁累赘

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)是由双生病毒(begamovirus)病毒引起并由粉虱传播的毁灭性番茄病。TYLCV感染常见于温暖的(亚)热带地区，在这些区域这限制了番茄的生长。对TYLCV感染的抗性见于若干野生番茄物种(Ji等人(2007)在Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease(Czosnek,H.,ed).Netherlands:Springer,343–362页)。目前，五种抗性基因座用于育种，Ty1到Ty5。来自智利番茄(S.chilense)LA1969的Ty1基因座是第一个待图位的抗性基因座并且在6号染色体上连锁至Ty3基因座，并已被并入几种市售品种中。然而，Ty1抗性基因座困于连锁累赘，因为它伴随着不期望的性状如自发坏死(autonecrosis)。Ty1基因座位于6号染色体的着丝粒周(pericentromeric)的区域，并且位于17MB的基因渗入片段中，该基因渗入片段遭受严重的重组抑制。Verlaan等人(2011,Plant J 68:1096-1103)在3000个F2植物中研究了Ty1基因座的重组，但在其群体中在大部分基因渗入片段中无法检测到任何重组事件。这似乎是由于智利番茄LA1969中几个染色体重排而在减数分裂过程中抑制这一区域的重组。由于靶向易位的产生不依赖于同源性，这可以用来降低Ty1基因座的大小，以打破连锁累赘和简化Ty1基因座的精细图位。

已经鉴定了来自野生番茄的几个BAC，其存在于Ty1基因渗入片段中(Verlaan等人,2011,Plant J 68:1096-1103)。我们使用这些当中的一个的序列(H208D24，获自http://solgenomics.net/maps/physical/clone_info.pl？id＝77280)来鉴定有可能在番茄基因组中代表单拷贝序列的基因。这个BAC携带拟南芥基因PRH75的番茄同源物(植物RNA解旋酶75，At5g62190)，其被注释为Unigene SGN U268902。虽然这种BAC是任意选择的，但都存在于两个染色体上的基因渗入区域的任何其它序列也可用于进行这些实验。用于鉴定野生番茄和智利番茄LA1969之间的这种基因座的核苷酸差异，在两个物种中该基因座上进行基因组步移(GenomeWalking)。这允许设计特异于两个SGN U268902基因座的PCR引物。随后，可以设计结合并切割引物位点之间的TALEN构建体以验证其活性。

然后，在体外培养对于Ty1基因渗入是杂合的植物品系，分离原生质体并用TALEN质粒DNA转染。然后，番茄原生质体再生为愈伤组织，使用SGN U268902基因座特异性引物的组合进行筛选，以鉴定含有易位连接的愈伤组织。然后，这些再生为植物并进行自交，并确定SGN U268902基因座两侧的标记物的隔离(segregation)。然后，有可能证明，降低了Ty1基因渗入片段的大小，以及可以进一步分析这些植物是否丢失了连锁累赘，并且在缩短的基因渗入片段上评估重组频率。

实施例3

番茄育种材料中产生确定大小的基因渗入和负责果实早期成熟的基因的精细图位

可以鉴定番茄品系ER43，其在染色体I上携带负责果实早期成熟的基因座。通过标记物分析，可以确定该基因座位于AFLP标记物MM101和MM107之间，其间隔开527kbp。可以获得这个区域的完整序列，因此基于BLAST分析，可以选择一系列的间隔100kbp的靶序列，其是番茄基因组中单的拷贝序列。设计位于这些靶序列两侧的引物，并用于扩增番茄品系Moneymaker中的相应基因座(获自http://www.seedaholic.com/tomato-cherry-fox-organic-seeds-1.html)从而首先确认两个品系中的靶序列是相同的，其次鉴定两个番茄品系中围绕这些靶序列的序列差异，其可被开发用于特异性引物的设计。随后，五个TALEN构建体被设计用于在这些靶序列上产生DSB。然后，合成TALEN序列并克隆到质粒构建体中，将TALEN融合至在番茄原生质体中有活性的启动子序列，比如番茄AA6启动子。ER43和Moneymaker品系的原生质体转染有各个TALEN质粒，在合适的液体介质中孵育24小时，然后通过离心收获。然后从转染的原生质体的各群体中分离基因组DNA，然后用染色体特异性引物扩增五个靶序列的每一个。然后分析PCR产物在靶序列上是否存在INDEL，在每批处理的原生质体中INDEL以大约10％存在。这将表明，TALEN构建体在细胞中有活性，能够在两个番茄品系的靶序列上诱导DSB。然后，品系ER43和Moneymaker杂交以产生F1品系，在无菌条件下在组织培中维持F1品系并用于生产原生质体。然后用TALEN构建体转染这些原生质体，培养源自各转染的1000个愈伤组织，然后使用染色体特异性PCR引物的不同组合进行基因分型确定是否在靶序列存在易位。随后，含有这些靶向易位的愈伤组织再生为植物，然后自交以产生F2植物，F2植物对于每个易位而言是纯合的。然后，对这些进行表型分型来鉴定携带早期成熟基因座的染色体片段。然后构建这个区域的物理图谱，并可以鉴定负责早期成熟表型的基因。

实施例4

欧洲油菜中的靶向易位

油菜，或芸苔(canola)(欧洲油菜)是芜菁(Brassica rapa)(基因组A)和甘蓝(Brassica oleraceae)(基因组C)种间杂交形成的双二倍体物种。选择性谱系育种已被广泛用于提高这种作物的产量和种子质量。谱系育种涉及优越F2的选择和同系繁殖，以及随后产生获自多对所建立的载体品种之间杂交的个体。然而，由于筛选的F2植物数目有限，育种过程的最终产物往往含有大量亲本基因组，这对农艺性状有负面影响。在欧洲油菜“Tapidor”型中已证明，即使经过多代回交之后，仍含有29％的亲本基因组中的一个(Sharpe&Lydiate,2001,Genome 46:461-468)。可以计算出假设的F2个体源自携带不同供体的F1的概率，在所有的基因组单元中优质(elite)等位基因不含任何固定的供体基因型。估计这大约在81825个F2植物中发生一次(Sedcole,T.R.(1977)Crop Sci.17:667-668)。与此相反，在油菜中谱系育种程序一般只从1000至2000个F2植物之间选择，导致选择含有大量未连锁的供体基因型的个体。结合上产生双单倍体的实践来增加育种速度，即使和兴趣基因座不连锁，亲本基因型也可以非常快速变得纯合并得以固定。

由于欧洲油菜的双二倍体性质，防止了减数分裂过程中A和C基因组之间的减数分裂重组。对于其它双二倍体物种也是这种情况，如烟草(Nicotiana tabacum)、硬粒小麦(Triticum durum)、普通小麦(Triticum aestivum)和棉花(Gossypiumhirsutum)。考虑在欧洲油菜中的实施例，通过育种程序将来自亲本品系农业上重要的性状引入到商业品系，这导致通常处于纯合状态的亲本基因座存在于基因组中的一个(例如在基因组A上)。然而，由于限制减数分裂过程中基因组之间的重组，基因组C上对应的基因座不变。如果这个区域也恰好携带一些不利的表型，或降低亲本基因座在A基因组上所赋予的表型的有效性，那么通过常规育种不能轻易地得以解决。通过使用靶向位点的核酸酶而诱导A和C基因组之间的靶向易位，可能产生在A和C基因组上针对亲本基因座是纯合的植物(示意性地显示在图5中)。这种技术在多倍体中的另一种可行的应用是诱导基因组之间突变的诱变剂进行转移来产生完全纯合的品系。突变育种是改进植物的常用方法。它涉及到用诱变剂如乙基甲烷磺酸(EMS)处理植物(通常是种子)，在整个基因组产生C至T的变化。突变的植物群体随后进行生长、自交，并且在随后的世代(M2)中筛选植物改变的表型(正向筛选)，或当序列已知时基于兴趣基因中诱导的突变进行选择(反向筛选)。在许多情况下，需要赋予(完全)丧失功能的表型的突变，这需要鉴定两个植物品系，其各携带基因组之一中兴趣基因中的无效突变。然后，这些植物可以是杂交的、自交的F1、以及在两个基因组上对于无效突变是纯合的所鉴定的F2植物。这是非常耗时且昂贵的方法，当处理三个基因组时，对于物种如六倍体小麦变得更难。为避免对各基因组中独立的突变进行分离和随后进行杂交，我们公开可以诱导靶向易位来转移基因组之间诱导的(无效)突变并快速达到纯合状态(图5)。

实验集中在诱导欧洲油菜A和C基因组染色体8之间的靶向易位。选择欧洲油菜品系“Tapidor”用于这些实验，因为其在A基因组染色体8上携带来自欧洲油菜品系“Bronowski”的大基因渗入片段，所述基因渗入片段含有区别于C基因组染色体8上对应区域的许多序列差异。然后鉴定存在于A和C基因组上的独特基因，在“Tapidor”品系中测序以鉴定序列差异。在此基础上，设计只扩增A或C基因组基因座的引物。为了在A和C基因组基因座诱导DNA DSB，设计TALEN构建体。筛选A和C基因座中和两者相同的序列，设计TALEN用于结合和切割这种序列。TALEN克隆到具有组成型植物启动子(35S)的质粒载体中，并使用PEG转染被引入欧洲油菜“Tapidor”原生质体。48小时后，从原生质体中分离DNA，基因座特异性引物用于产生PCR产物，所述PCR产物经测序以证明TALEN构建体能够在靶位点诱导INDEL。然后重复实验，个体的欧洲油菜愈伤组织进行再生，并通过使用A和C基因组基因座特异性引物的组合进行基因分型确定是否存在靶向易位。可鉴定在预期的位置上具有靶向易位以及染色体8中不同尺寸的INDEL(例如在A基因组中4bp，在C基因组中3bp)的个体愈伤组织，其中不同尺寸的INDEL代表杂种A和C染色体中易位连接上不同的INDEL。随后从这些愈伤组织中再生植物，并生长至成熟。然后筛选下一代对于这些INDEL是纯合的苗，这些对于染色体臂的其余部分也都是纯合的。

实施例5

使用靶向易位融合基因座结构域

植物品系IR3对广泛的昆虫具有强的抗性，因为在其毛状体中存在高浓度杀虫化合物。通过高表达参与这种化合物生化合成的基因(IK4)之一而实现这种高浓度。通过新型启动子实现高表达，新型启动子以毛状体特异性的方式来驱动高的转录激活。植物品系IR12还包含IK4基因，但很容易受到昆虫取食。分子分析表明，由于IR12品系中IK4基因启动子中导致IK4基因失活的核苷酸差异，IK4基因在IR12的毛状体中不表达。这些实验的目的是通过诱导品系之间的靶向易位，导致IR3启动子和来自品系IR12的IK4基因融合，来恢复IK4基因在IR12品系中的毛状体特异性高表达。靶序列被确定位于IK4ORF的上游20bp，TALEN被设计用来在这个位点产生DSB。然后，将TALEN克隆到适合用于植物表达的启动子之后，然后所得的质粒被转染到来自IR3和IR12品系的原生质体。如实施例3描述的，以这种方式我们能够确认TALEN的表达能够在两个植物品系的靶序列诱导DSB。然后，通过IR3和IR12品系杂交产生F1品系，然后用于产生原生质体，其然后转染有TALEN构建体。如其它实施例所述，扩增IR3或IR12基因座的特异性引物以不同的组合用于鉴定其中发生靶向易位的愈伤组织。随后这些愈伤组织再生为植物，然后和IR12亲本植物回交数次，在每一世代中选择靶向易位以实现这样的情况，即在其中除外期望的易位之外，所述植物和IR12亲本同基因。使用定量RT-PCR，可以证明在这种品系中IR3启动子精确融合至IR4IK4基因而恢复毛状体中IK4的高表达，随后的表型分型表明这种植物显示出对广泛昆虫强的抗性。此实施例表明，易位可用于将启动子或其它调控序列融合到另一品系的基因，因此实现给予有价值表型的新表达模式。

实施例6

使用靶向易位产生新的开放阅读框

通常，位于分布在整个植物基因组中抗性基因簇中的一类富含亮氨酸重复(LRR)的基因赋予对真菌病原体的抗性。植物品系M17包含LRR抗性基因(LRR12)，其赋予对引起疾病晚枯萎病的真菌病原体小种(race)1的特异性抗性。植物品系P15携带有位于染色体上相同位置的相似抗性基因簇。在P15中，和序列LRR12最相似的抗性基因，名为LRR63，位于簇中的相同位置，但具有不同的氨基酸序列。结果，LRR63基因赋予对真菌小种2而非小种1的抗性。这些基因都不赋予对真菌小种3的抗性。我们的假设是，通过组合LRR12和LRR63基因的结构域而实现对真菌小种3的新型抗性。这些基因的序列是已知的，对于存在于LRR12和LRR63两者上的序列分析内含子。然后设计能够在此靶序列上诱导DSB的位点特异性核酸酶。然后位点特异性核酸酶克隆到在植物原生质体中提供表达的启动子之后，然后将所得的质粒用于转染来自植物品系M17和P15的原生质体。如在此处包括的其它实施例中更详细描述的，我们能够证明位点特异性核酸酶能够在LRR12和LRR63中内含子靶序列上产生DSB。然后，通过M17和P15品系杂交产生F1品系，并在无菌条件下保持在组织培养中。然后，从F1品系中分离原生质体，并用编码位点特异性核酸酶的质粒进行转染。然后，个体原生质体再生为愈伤组织，用针对LRR12或LRR63设计的特异性引物的组合对这些进行基因分型，从而检测其中发生靶向易位的愈伤组织。由于在内含子中易位得以靶向，易位期间所产生的小INDEL仅除去部分内含子序列，从而不影响该基因的开放阅读框。易位导致LRR12基因的结构域与LRR63基因的结构域融合，产生赋予新抗性的新基因。具有易位的愈伤组织再生成植物，可以证明新的嵌合开放阅读框由LRR12和LRR63的结构域构成，其提供了对真菌小种3的新抗性。这个实施例证明靶向易位如何用于将来自不同基因的结构域连接起来以产生赋予重要新表型的新基因。

实施例7

同步诱导靶向易位和抑制减数分裂

使用位点特异性核酸酶，可在F1杂种中的部分同源染色体之间诱导靶向易位。随后再生个体愈伤组织以产生植物，所述植物随后经历导致正常F2群体的正常减数分裂，其中所述F2群体具有来自两个亲本植物的基因组片段。然后需要进行广泛回交来获得同基因品系以便进行表型分型，表型分型需要耗时多年并涉及到多轮的群体筛选。因为当初始植物中减数分裂交叉受到抑制时，允许亲本染色体在配子中随机分离，可在单一世代中获得同基因品系。由于异常的染色体数目，大多数配子不能存活，但小百分比将包含期望亲本的所有染色体，并且当用于和所需亲本进行直接回交时，将在单一世代中产生同基因品系。待产生的靶向易位可以是任何实施例1至6中所述的那些。可以从F1植物产生原生质体，并同时用两个质粒进行转染。第一质粒携带通过在植物原生质体中有活性的启动子驱动得位点特异性核酸酶，如已经描述的，所述位点特异性核酸酶产生期望的靶向易位。第二质粒携带不同的位点特异性核酸酶Dmc1，其通过在植物原生质体中有活性的第二启动子所驱动，所述位点特异性核酸酶设计用来在基因中产生DSB，Dmc1参与减数分裂过程中的交叉形成。DSB的修复将在减数分裂的基因中产生小INDEL，导致基因功能完全丧失。然后选择含有期望靶向易位的愈伤组织，然后对这些进行筛选确定在Dmc1的靶序列上是否存在额外的纯合INDEL突变。这些愈伤组织随后再生为植物，和初始的亲本植物回交。可以证明，源自这种杂交的植物包含期望的易位，但是和回交亲本是同基因的。因此，这种方法无需广泛的回交过程可应用于产生包含靶向易位的品系，否则该品系将和亲本品系之一是同基因的。

Claims

1.一种用于去除植物或植物细胞中第一植物染色体上所存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的方法，

其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的，

所述方法包括：

和

(c)任选地，采用步骤(b)获得的至少一个植物细胞鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分，

2.根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤(c)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中鉴定这样的植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分，并且其中第一染色体的第二部分被连接至第二染色体的第一部分。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二染色体不包含和所述第一基因座A相同的基因座和/或不包含和所述第二基因座B相同的基因座。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一植物染色体上存在的所述第一基因座A和所述第二基因座B之间的距离是从一个碱基对至整个染色体长之间。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过相同的位点特异性核酸酶、相同的锌指核酸酶、相同的大范围核酸酶、相同的TAL效应物核酸酶或相同的Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统，引入第一染色体中的双链断裂和/或第二染色体中的双链断裂。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一染色体中引入不超过一个双链断裂，并且第二染色体中引入不超过一个双链断裂。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

i.第一染色体包含所述第一基因座A和所述第二基因座B，其中所述第一基因座A和第一特征的期望性状连锁，以及所述第二基因座B和第一特征或第二特征的不期望性状连锁；以及

9.根据权利要求8所述的方法，其中第一或第二特征的不期望性状是选自如下的性状：对第一特征的期望性状有负面影响的性状、降低产量的性状、降低对疾病或害虫抗性的性状、降低生长的性状、降低尺寸的性状、降低种子的量的性状、降低对胁迫耐受的性状，所述胁迫包括盐、热、冷、水和干旱胁迫。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括

(d)从权利要求1步骤(b)或权利要求1或2步骤(c)之后所获得的植物细胞再生植物；

(e)通过自交或者和另一植物进行杂交，从所述再生植物中产生种子；

(f)从步骤(e)获得的种子来培养植物，以及；

(g)任选地，筛选步骤(f)获得的所述植物是否去除遗传连锁。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中权利要求1步骤(c)中的鉴定包括：对第一染色体连接的部分进行测序和/或选择性扩增、和/或子代的基因分型、和/或荧光原位杂交(FISH)。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所提供的植物细胞是植物体细胞，优选原生质体，和/或获自杂种的植物细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物是二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体、八倍体、十倍体、十二倍体或异源二倍体。

14.一种用于提供获自植物P2的植物P1的方法，其中所述植物P2特征在于在第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间存在遗传连锁，

和

(c)任选地，采用步骤(b)获得的至少一个植物细胞，鉴定至少一个植物细胞，在其中第一染色体上的第一基因座A和第二基因座B之间的遗传连锁被去除，并且其中包含所述第一基因座A的第一染色体的第一部分被连接至第二染色体的第二部分，以及

(d)再生所述植物P1，

15.根据权利要求14所述的方法，其中进行步骤(c)。

16.位点特异性核酸酶用于去除第一染色体上存在的第一基因座A和第二基因座B之间遗传连锁的用途，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNA CRISPR系统，

其中染色体上所述第一基因座A的位置和所述第二基因座B的位置及其之间的(减数分裂)重组是被抑制的。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述第一基因座A和第一特征的期望性状连锁，以及所述第二基因座B和所述第一特征或第二特征的不期望性状连锁。

18.位点特异性核酸酶用于去除连锁累赘的用途，优选地所述位点特异性核酸酶选自：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶和Cas9/crRNA/tracrRNACRISPR系统。

19.根据前述权利要求1-13中任一项所述的方法和/或根据前述权利要求16-18任一项所述的用途可获得的或者获得的植物、植物的部分、果实或种子。