CN110268064A - 同源染色体之间的靶向重组及其用途 - Google Patents

Abstract

本文描述了体细胞植物细胞基因组中同源染色体之间靶向重组的方法，其中靶位点可位于常染色质区域或异染色质区域内。这些方法利用同源染色体之间的靶向重组，可用于诱导体细胞植物细胞，导致靶向交叉或基因转换。所描述的方法利用在同源染色体上具有多态性等位基因的基因座处的预选内源靶位点。公开的靶位点基因座包括常染色质和异染色质中的那些基因座。

Description

同源染色体之间的靶向重组及其用途

技术领域

描述了靶向体细胞植物细胞中同源染色体之间DNA重组的方法，其中这些植物细胞可以是分离的细胞，分离的植物组织的一部分，整株植物的一部分或整株植物，其中靶序列可以对应常染色质或异染色质。

背景技术

DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)是塑造植物基因组的强大力量之一。这些DSB可以在整个植物生命周期中，在体细胞或减数分裂细胞中于复制叉运动期间自发发生或在第一次减数分裂的早期阶段发育控制。它们还可以通过电离辐射、基因毒性药物或通过内切核酸酶的活化来诱导。未修复的DNA DSB可能导致极端类型的损伤，包括染色体丢失、导致配子不育或细胞死亡。DSB的修复也可能与插入/缺失(indels)突变有关。因此，DSB修复机制对于维持基因组完整性完全必需的。理解这些机制对于精确设计基因组的能力至关重要，例如用于定向诱变、基因打靶或用于其他类型的靶向染色体重组。

DNA DSB修复机制已在包括植物的许多生物中广泛研究。植物研究通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)表征了参与DSB修复的基因，并测试了体细胞和减数分裂组织中DSB修复的结果。NHEJ已经被广泛的物种和组织(主要是体细胞)所表征，使用多种DSB诱导剂，包括位点特异性大范围核酸酶、转座子切除和定制设计的核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活剂样效应物核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复相关蛋白Cas9(CRISPR-Cas)。这些工作的新兴景象表明，NHEJ是植物体细胞中的重要修复途径。这种容易出错的机制涉及在DSB位点从数个碱基对(bp)到数千bp的indel，并且通常与微同源(microhomologies)相关。此外，基于CRISPR-Cas的系统被证明在包括番茄在内的广泛植物物种中具有高效率。

当考虑特定基因座处的体细胞重组时，体细胞植物细胞(somatic plant cell)中天然存在的同源重组非常低并且接近无效。这种低频率的同源重组被认为对维持大型和重复植物基因组的稳定性很重要。通过测试修复机制如染色体内重组和不等交换的转基因测定，在拟南芥中进行了几项解决通过HR在体细胞组织中修复DSB的机制的研究。在所有情况下，DSB诱导增强了HR修复率。来自不等交换测定的重组率远低于染色体内重组。使用等位基因序列对同源染色体进行体细胞DSB修复也在转基因烟草植物中进行了研究，使用转座因子诱导的断裂：切除转座子后发生HR修复；但没有检测到不动的元素。DSB诱导还可以使用异位基因组序列模板触发HR介导的修复，尽管频率非常低。

在切除活化剂(Ac)或Mutator元件后，在玉米中显示内源(非转基因)重组配偶体之间的HR的DSB诱导。在两种情况下，重组以顺式(cis)发生，在体细胞组织中位于转座子侧翼的重复之间。相反，生发Ac活性不会刺激玉米bronze基因座上同源染色体之间减数分裂重组的速率。这一结果可能是由于Ac切除与减数分裂重组之间缺乏协调，减数分裂HR对Spo11诱导的断裂的偏好，或其他未知原因。在特定基因组位置诱导同源染色体之间的HR的能力将为遗传学家和育种者提供用于靶向诱导交叉或基因转换的有力工具。

因此，需要能够在同源染色体之间提供靶向HR以便精确繁殖作物的方法。靶向HR的一种应用是靶向基因转换，即基因从一条染色体转移到其同源物。此类方法还应考虑通常可用于实现该目标的植物种群大小。同样，重复回交以获得同基因系的过程也可能将所需基因侧翼的大部分不需要的DNA拖入后代植物中。本文公开了同源染色体之间的靶向重组的方法，其可以用相对较小的植物群体进行并且不回收大的不需要的DNA片段。

植物染色体具有高度浓缩的异染色质，在着丝粒区中突出并且对应于减数分裂重组冷点和大部分去浓缩的常染色区域，通常对应于远端、亚端粒区域和减数分裂重组热点。虽然异染色质通常与转录不活动和抑制的遗传重组相关，但它仍含有转录活性基因。异染色质区域中同源染色体之间的靶向诱导重组在植物育种中是有利的，因为在没有这种重组的情况下，有害基因可能不会从有益基因中分离出来。本文公开了靶向体细胞植物细胞中同源染色体之间DNA重组的方法，其中显示靶向DSB诱导的重组发生在常染色和异染色靶位点。

DSB诱导的体细胞HR的另一个潜在应用是“靶向交叉”，即在精确位点处的大染色体区段的相互交换。目前的育种方法依赖于随机交叉和寻找罕见的重组事件，在连锁基因的情况下，可能需要数万株植物获得，其中天然存在的非靶向HR中的同源重组百分比在任何特定位点内。基因组接近0％(在每10⁵-10⁶天然HR事件中发生少于1)。

本文公开了可用于靶向体细胞HR中以结合来自亲本的所需性状并使用小植物群体在不期望的遗传连锁之间分离的方法。

发明内容

在一个方面，本文描述了靶向体细胞植物细胞中同源染色体之间DNA重组的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，所述多态性等位基因中的至少一个DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；

(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；和

(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代。

在一个方面，本文公开的方法产生包含有益性状或品质的组合的植物，该方法包括杂交体细胞植物细胞中同源染色体之间的靶向DNA重组，所述方法包括以下步骤：

(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，所述多态性等位基因中的至少一个DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；

(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；

(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；

(d)繁殖所述植物细胞或其植物组织或其植物或其植物后代以产生包含所述靶向同源重组的植物，其中所述植物包含杂交体细胞起源的任一亲本植物中不存在的有益品质或性状的组合。

在一个方面，本文公开了产生包含有益性状或品质的组合的后代植物的方法，其中所述组合不存在于任一亲本植物中，所述方法包括：

选择亲本植物，其中每个所述亲本包含至少一种有益性状，其中所述有益性状不相同，并且其中所述亲本对于至少一种所述有益性状是多态性的；

交叉所述亲本植物以建立杂交植物；

收集杂交植物的体细胞；

在所述体细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选内源靶位点，其中在表达所述核酸酶系统时，所述多态性等位基因的至少一个DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂，其中在所述靶向预选的内源靶位点处的同源交叉或基因转换(非交叉)导致表达或调节至少一种所述有益性状或品质的表达的DNA交换；

分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述交叉或基因转换(非交换)事件，其中所述性状组合被表达；

选择其中表达性状组合的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；和

繁殖所述植物细胞、其植物组织、其植物，以产生包含所述有益性状或品质组合的后代植物。

在相关方面，核酸酶系统包含锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统、或成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统。

另一方面，核酸酶系统包含锌指核酸酶(ZFN)，其包含锌指DNA结合结构域和DNA核酸酶切割结构域，其中所述锌指DNA结合结构域结合在所述预选的内源靶位点内，从而靶向DNA核酸酶切割结构域，以在所述预选的内源靶位点内切割DNA。另一方面，核酸酶系统包含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统，其包含TAL效应物DNA结合结构域和DNA切割结构域，其中所述TAL效应物DNA结合结构域结合在所述预选的内源靶位点内，从而靶向DNA切割结构域，以在所述预选的内源靶位点内切割DNA。在另一方面，核酸酶系统包含CRISPR/Cas核酸酶系统，其包含CRISPR相关内切核酸酶和gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述CRISPR相关内切核酸酶切割所述预选的内源性靶位点内的DNA。另一方面，CRISPR相关内切核酸酶(Cas核酸酶)选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、C2c1、CasX、NgAgo、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4，其同源物或其修饰形式。

在相关方面，体细胞植物细胞源自在所述预选位点具有多态性等位基因的现有杂合或杂合植物细胞。另一方面，现有的杂交或杂合植物细胞来源于野生型植物。

在相关方面，本文公开的方法产生体细胞植物细胞，其包含预选的内源靶位点内的靶向同源重组，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其子代植物的种子，或其任何组合，具有亲本性状的组合，所述组合不存在于任一亲本。在另一个方面，亲本性状包括增加的抗旱性、增加的对害虫的抗性、对病原体的抗性增加、改善的营养物含量、或改善的生长参数、或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子任何其它有益的性状。

在相关方面，体细胞植物细胞源自来自两株植物杂交后代的细胞，其中所述亲本植物细胞各自包含与所述预选位点处的所述配偶(mate)相比的多态性等位基因。

在相关方面，本文公开的方法产生体细胞植物细胞，其包含预选内源靶位点内的靶向同源重组，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，或来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或衍生自包含所述体细胞植物细胞的植物或其子代植物或其任何组合的种子，所述植物具有所述亲本性状的组合，所述组合不存在于所述组合中亲本。另一方面，通过所述靶向同源重组而重组的亲本性状包括增加的抗旱性、增加的对害虫的抗性、对病原体的增加的抗性、改善的营养物含量、或改善的生长参数、或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状。

在一个相关方面，所述亲本体细胞植物细胞之一包含所述核酸酶系统，并且其中所述核酸酶系统的DNA裂解活性靶向存在于不包含所述核酸酶系统的另一亲本植物细胞中的多态性等位基因。

在另一个相关方面，所述亲本体细胞植物细胞之一包含Cas核酸酶，并且所述亲本体细胞植物细胞中的另一个包含gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas核酸酶在所述预选的内源靶位点内切割DNA。

在另一个相关方面，体细胞植物细胞包含来自两个多态亲本系之间杂交的植物后代的细胞，其产生杂交植物，其中所述亲本植物系各自包含所述预选内源靶位点处的多态性等位基因，并且其中只有一条亲本系包含所述核酸酶系统。

在另一个相关方面，本文公开的方法产生体细胞植物细胞，其包含预选内源靶位点内的靶向同源重组，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，或来源于包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或衍生自包含所述体细胞植物细胞的植物或其子代植物或其任何组合的种子，其具有亲本性状的组合，所述组合不存在于任一亲本中。在另一个方面，亲本性状包括增加的抗旱性、增加的对害虫的抗性、对病原体的增加的抗性、改善的营养物含量、或改善的生长参数、或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状。

在另一个相关方面，核酸酶系统包含Cas核酸酶和gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas核酸酶切割所述预选的内源靶位点内的DNA，并且其中DNA裂解所述核酸酶系统仅在野生型亲本植物细胞中存在的异源等位基因上发生的活性。

在另一个相关方面，体细胞植物细胞包含在植物组织或整株植物中。在另一个相关方面，体细胞植物细胞包含原生质体。在另一个相关方面，体细胞植物细胞包含作物植物细胞。

在另一个相关方面，预选的内源靶位点包含含有基因、基因的一部分或基因的调节上游或下游序列或其任何组合的DNA，并且其中所述基因的表达或缺乏影响生长、抗旱性、对害虫的抗性、对病原体的抗性或营养成分、或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子或其任何组合有益的任何其他性状。在另一个相关方面，预选的内源靶位点包含常染色质或异染色质的区域。

在另一个相关方面，表达包括组成型表达诱导、诱导型表达诱导、组织特异性表达诱导、或条件特异性表达诱导，或其任何组合。

在相关方面，分析所述植物包括分析所述植物或其后代的一部分，所述植物或其后代包含叶、茎、芽、果实、种子。

在相关方面，选择后代的步骤包括F₁，F₂或F₃世代、或任何后续世代、或1至3代的回交、或任何后续的回交世代。

在相关方面，本文公开的方法产生在所述预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组体细胞植物细胞，或在预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的植物组织，或在预选的内源靶位点包含所述靶向同源重组的植物或其后代植物，或来自在预选的内源靶位点处包含靶向同源重组的植物或其后代植物的果实，或来自在预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的植物或其子代植物或其任何组合的种子，与对照植物细胞、植物或其后代、果实或种子相比，所述细胞、组织、植物或其子代、果实或种子包含增加的抗旱性、增加的对害虫的抗性、增加的对病原体的抗性、改善的营养含量、改善的生长参数或基因的基因、或任何其他对植物细胞、植物组织、植物或其后代、果实或种子、或其任何组合有益的特征。在相关方面，预选的内源靶位点包含常染色质或异染色质的区域。

另一方面，本文公开了一种植物，其包含通过包含杂合体细胞植物细胞中同源染色体之间的靶向DNA重组的方法产生的有益性状或品质的组合，所述方法包括以下步骤：(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达后，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；

(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或所述植物的后代，用于同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；

(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、植物或其植物后代；

(d)繁殖所述植物细胞、或其植物组织、或其植物、或其植物后代，以产生包含所述靶向同源重组的植物，其中所述植物包含任何杂交体细胞起源的亲本植物中不存在的有益品质或性状的组合。在相关方面，预选的内源靶位点包含常染色质或异染色质的区域。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开的某些实施例，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本文描述的方法。

图1显示了双链断裂(DSB)修复的示意图，其可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)发生。

图2显示了通过同源重组(HR)修复靶向DSB的示意性实施方案。

图3显示了包含诱导同源染色体之间重组的一些实施方案的示意流程图。DNA双链断裂的诱导显示为黄色闪电。

图4A-E显示了番茄果实颜色测定和DNA双链断裂(DSB)修复事件结果的分子分析。图4A：黄色果肉^e375635S:Cas9和双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNA的交叉：预期Ps#1-sgRNA使Fxplants具有苍白的双色果实表型。选择表达Cas9和gRNA的F₁植物。gRNA被设计用于黄色果肉^e3756和双色^cc383突变(*)之间的两个等位基因中的靶向DSB诱导(显示为黑色闪电)。在双色^cc383等位基因的非同源末端连接(NHEJ)修复的情况下，在容易出错的修复之后预期果实颜色为黄色，留下插入缺失(插入/缺失)足迹(蓝线)。在非交叉或交叉的情况下，预期果实颜色为红色或双色，在晚期事件的情况下具有红色斑点。图4B：F1植物和对照中的果实表型分布：双色果实显示为橙色框；黄色水果如黄色的盒子；具有红色部分的水果(假定的体细胞HR)显示为红色交叉阴影框。每个条形代表源自F₁植物的果实群，其源自Cas9的独立转基因系和给定的u6-26：Ps#1-sgRNA系之间的杂交。每个交叉中分析的水果数量在黑色条上显示。图4C：NHEJ DSB修复足迹的序列显示在右侧，它们的相对频率显示在饼图中。来自PSY1的CRISPR-Cas靶序列显示在顶部。DSB位置显示为黑色闪电；PSY1起始密码子显示为红色，PAM-原型间隔子相邻基序显示为蓝色。顶部饼图表示来自22个不同的F₁植物的Illumina Hiseq读数的平均值：黄色果肉^e375635S:Cas9和双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNA。在该杂交中，88％的序列偏离WT序列。下饼代表来自2株对照F₁群的植物的平均ilummina Hiseq读数(黄色果肉^e3756x双色^cc383，没有CRISPR-Cas组分)。橙色CTTG缺失是NHEJ的优势足迹。图4D：用于鉴定重组DNA片段的反向PCR方案。(1)首先用Apal(A)和HindIII(H)消化来自单独叶子样品的DNA，然后钝化。(2)每个样品都是自我连接的。(3)通过两种不同的引物组(绿色和黄色)扩增每个样品。Blue-Bicolor等位基因；红色-黄色肉体等位基因；虚线蓝色-双色删除，*-黄色肉体突变，闪电-DSB位点。图4E：单个植物中亲本(P)与重组(R)类型(如从图C获得)的比例。植物1-15-F₁黄色果肉^e3756 35S:Cas9和双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNA的交叉的植物；植物16-合成交叉对照；植物17-18-黄色果肉×双色(Cas9-)F₁植物。

图5显示了体细胞中的NHEJ修复。通过对CRISPR-Cas9诱导的DSB(闪电)周围扩增的PCR产物进行测序而获得的NHEJ足迹分布在单个F 1植物和对照植物中(黄色果肉^e3756x双色^cc383)，引物显示为红色箭头。每个饼图表示单株植物的总体ilummina Hiseq读数(每株植物250,000-850,000个读数)。

图6A-6B显示了用于分析生发DNA双链断裂(DSB)修复事件的番茄SNP测定。图6A：将表达35S:Cas9和u6-26:Ps#2-sgRNA的纯合子M82CRISPR突变体(+A，+A)与醋栗番茄^LA1578杂交。如果通过NHEJ，非交叉或交叉修复断裂，预计F₁将产生没有DNA DSB和黄色果实的红色果实。SNP模式允许区分修复机制。三角形用于SNP；闪电标记DSB位点；蓝线适用于NHEJindels。图6B：F2和F3植株DNA DSB侧翼标记分析。用于醋栗番茄SNP的红色纯合子；用于M82SNP的黄色纯合子(包括+A CRISPR-Cas9突变体)；橙色杂合子；空单元格用于丢失数据；闪电-DSB位点。

图7显示了等位基因特异性DNA DSB修复的番茄SNP测定。从M82 35S的4片叶子中提取M8235S:Cas9u6-26:Ps#2-sgRNA psy1^+A/psy1^+A，醋栗番茄^LA1578和他们的F₁近交系的5株植物，Illumina测序为预先形成，每个饼代表每株植物600,000-900,000个读数的摘要。

图8显示了使用Illumina测序从果实果皮组织开始和测序DNA DSB修复足迹的果实颜色表型的示意图。显示了植物#1的实例，其是M82 35S:Cas9u6-26:Ps#2-sgRNA psy1^+A/psy1^+A x醋栗番茄^LA1578的F₁植物。果实颜色表型从红色到红色变化，小的或大的黄色部分变成黄色。每个饼图是由每个果实15,000-50,000个Illumina测序读数构建的。

图9A和9B显示了等位基因依赖性修复的定量。图9A：在M82背景中培养两种植物种群：一种用于PSY1/PSY1的纯合子和另一种用于PSY1/psy^+A基因型的杂合子。这些植物的子代可以在断裂位点(闪电)或任何其他突变(*)产生+A SNP。从两个群体的4周龄植物的叶子中提取DNA，并用Illumina测序。在PSY1/PSY1植物中，可以靶向两个等位基因，而在PSY1/psy^+A植物中，仅靶向WT PSY1等位基因。图9B：PSY1/PSY1植物中每个WT等位基因的+A突变百分比作为等位基因非依赖性+A突变的预期值。它通过以下等式计算：预期值＝(％(+A读数)_{T＝4周(wt,wt)})/2。为了估计当第二等位基因具有+A突变(在M82-WT PSY1/M82psy1^+A杂合子植物中)时观察到的+A突变的发生，如图9A所示，使用的等式是：观测值＝％(+Areads)_{T＝4周,(wt,+A)}-50％。条形对应于22种PSY1/PSY1植物和14种PSY1/psy^+A植物的标准误差。平均值之间的差异是显著的(p值(Wilcoxon秩和检验)＝0.009)。

图10显示了DNA DSB修复事件，其后是果实表型和果皮特异性Illumina测序-植物#2。所有细节与图8类似。该植物显示出高水平的psy1^+A。图6B中的转化产物是该植物的后代。

图11显示了表10，其列出了拟南芥3号染色体上的CRISPR DSB靶标。

图12A-12C显示了在重组热点和冷点处体细胞DNA DSB诱导的拟南芥系统。(图12A)在被认为是GFP和RFP种子标记之间的热点或冷点的区域中的十二个减数分裂重组靶标。热(红色)和冷(蓝色)靶分别具有常染色质或异染色质特征的热点或重组冷点的特征。显示了靶标的坐标及其在GFP和RFP标记之间的染色体3上的分布。图12B显示了实验方案：表达35Sx2的12个纯合子哥伦比亚测试株系：潮霉素，u6-26:gRNA盒，每个编码靶向特定热/冷序列的gRNA，与表达nos:nptII:nos Ubi:spCas9的WT Columbia系杂交。基于F2自受精种子计算重组率，所述F2自受精种子用于计算GFP和RFP标记物左侧之间的交叉率(结果显示在图12C中)。另外，将F1植物与野生型Landsberg植物杂交，并提取来自体细胞组织的DNA，以通过PacBio测序确定体细胞速率和DSB周围DNA DSB修复的机制(结果显示在图13A-13Q中)。(图12C)在X轴上显示的靶上具有热(红色)或冷(蓝色)位点的坐标编号后，在CRISPR-Cas9DSB诱导后GFP和RFP标记之间的CentiMorgan(Y轴)的交叉速率。没有DSB诱导的对照以黑色显示。大红色菱形代表每群的平均交叉率。

图13A-13Q显示了使用Pacbio测序在Hot Target-chr3：1854159处进行DSB修复的分子分析。从幼芽(在减数分裂阶段)，Columbia测试者x Landsberg的回交群体的每株植物的茎和上部叶组织中纯化DNA。通过PCR扩增DNA DSB位点侧翼的5kb片段，并使用PacBio测序。使用PacBio Long Amplicon Analysis将行读数聚类到共有序列，然后使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件与拟南芥基因组比对，并作图。红色条纹代表哥伦比亚(Col)单核苷酸多态性(SNP)，蓝色条带代表Landsberg(Ler)SNP。染色体3上目标#1854179处的DSB位点显示为虚线。黄线表示DSB位点的NHEJ足迹。绿线表示不属于任何父母的序列。对于每种植物(图13A-13Q，其中每个盒子是不同的植物，图13O-13Q是对照植物)，提取的DNA被条形码化(具有指示的条形码的单独的正方形)数百或数千个单个分子被测序和聚类，根据序列(包括SNPs模式)。该方法允许区分每个分子的亲本来源。在一些植物中(例如左上方的条形码89)，没有任何变化的证据，并且亲本等位基因或多或少地具有相同的比例。在其他植物中(例如条形码90-第二植物顶部，从左侧开始)，有证据表明断裂位于断裂侧翼，如10-12％的分子中红色到蓝色SNP的转变所示。还对F₁Ler x Col测试仪的三个对照植物进行测序并以相同方式分析，并且未显示任何交叉或基因转换事件。

具体实施方式

在以下详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本文提出的方法的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实施这些靶向体细胞植物细胞或其组织或植物中的同源染色体之间的DNA重组的方法。在其他情况下，没有详细描述公知的方法，程序和组分，以免模糊包含靶向同源重组的DNA的方法和由此产生的植物细胞及其植物，如本文所公开的。

在一个实施方案中，本文公开了一种在体细胞植物细胞中的同源染色体之间靶向DNA重组的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含所述同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在表达所述核酸酶系统时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物、或其植物后代。

在一个实施方案中，本文公开的方法产生一种植物，其包含通过包括在杂交体细胞植物细胞中的同源染色体之间的靶向DNA重组的方法产生的有益性状或品质的组合，所述方法包括以下步骤：(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA从而在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；(b)分析所述植物细胞的后代、或从所述植物细胞生长的植物组织、或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；(d)繁殖所述植物细胞或其植物组织或其植物或其植物后代以产生包含所述靶向同源重组的植物，其中所述植物包含任一所述杂交体细胞起源的亲本植物中不存在的有益品质或性状的组合。

在一个实施方案中，本文公开产生包含有益性状或品质组合的后代植物的方法，其中所述组合不存在于任一亲本植物中，所述方法包括：(a)选择亲本植物，其中每个所述亲本包含至少一种有益性状，其中所述有益性状不相同，并且其中所述亲本对于一种所述至少有益的性状是多态性的；(b)杂交所述亲本植物以建立杂交植物；(c)从所述杂交植物中收集体细胞；(d)在所述体细胞性细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内切割，其中所述核酸酶切割DNA从而在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂，其中在所述靶向预选的内源靶标处的同源交叉或基因转换(非交叉)位点导致表达或调节至少一种所述有益性状或品质的表达的DNA交换；(e)分析所述植物细胞的后代、或从所述植物细胞生长的植物组织、或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述交叉或基因转换(非交叉)事件，其中表达所述性状组合；(f)选择其中表达所述性状组合的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；(g)繁殖所述植物细胞、其植物组织、其植物，以产生包含所述有益性状或品质组合的后代植物。

在一个实施方案中，植物细胞是分离的植物细胞。在另一个实施方案中，植物细胞包含在植物组织中。在另一个实施方案中，植物细胞包含在整株植物中。本领域普通技术人员将理解，在整个术语“植物细胞”中的使用在不同的实施方案中包括分离的植物细胞，植物组织中包含的植物细胞，或包含在整株植物中的植物细胞，或其组合。

在一些实施方案中，本文描述的植物细胞的来源来自野生型植物。在一些实施方案中，植物细胞的来源来自栽培植物，所述栽培植物已被选择用于可通过繁殖维持的所需特征。栽培植物也可称为栽培种，尽管一些栽培种在野外出现。

本领域普通技术人员将理解，靶向同源染色体之间DNA重组的方法是体细胞植物细胞，如本文所述，可包括用于精确育种作物的用途。

在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致特定等位基因或其部分的缺失。在一些实施方案中，等位基因编码多肽，其表达提供对植物或植物产品有益的性状或品质，例如水果或花。在一些实施方案中，等位基因编码多肽，其表达增强植物中的有益性状或品质。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致添加特定等位基因或其部分。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致在等位基因内引入DNA突变。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致一个等位基因取代另一个等位基因。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致缺失等位基因的调节上游基因序列。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间的DNA重组的方法导致等位基因的下游基因序列的缺失。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间的DNA重组的方法导致添加等位基因的调节上游基因序列。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间的DNA重组的方法导致等位基因的下游基因序列。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致调节上游基因序列的突变。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法产生下游基因序列。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间的DNA重组的方法导致特定等位基因或其部分的缺失或特定等位基因或其部分的添加或等位基因内的DNA突变的引入或一个等位基因的替换以用于另一个等位基因或缺失。等位基因的调节上游基因序列或等位基因的下游基因序列的缺失或等位基因的调节上游基因序列或等位基因的调节下游基因序列或调节突变的添加上游基因序列或调节性下游基因序列，或其等位基因的任意组合。

在一些实施方案中，同源染色体之间靶向DNA重组的方法导致等位基因置换。在一个实施方案中，等位基因替换包括用内源基因座处的突变等位基因替换野生型基因。在另一个实施方案中，等位基因置换包括用内源基因座处的野生型等位基因替换突变等位基因。在另一个实施方案中，等位基因置换包括用内源基因座处的不同突变等位基因替换突变等位基因。在一些实施方案中，等位基因置换导致植物细胞，其组织，植物或其子代的有益性状或品质的表达。本文公开的用于等位基因置换的方法的优点是不需要开发包含置换等位基因的外源核酸序列，例如包含置换等位基因的载体。等位基因材料的交换在细胞中的同源染色体之间，其中染色体包含多态性等位基因。

在一些实施方案中，同源染色体之间靶向DNA重组的方法导致单核苷酸多态性(SNP)置换。在一个实施方案中，SNP替代包括在基因中产生错义突变。在另一个实施方案中，SNP替换包括将错义突变与野生型核苷酸置于一起。在另一个实施方案中，SNP置换包括在基因中产生错义突变，其增强编码的多肽的功能。在另一个实施方案中，SNP替代包括在基因中产生错义突变，其降低编码的多肽的功能。在另一个实施方案中，SNP替代包括在基因中产生错义突变，其增强编码的多肽的表达。在另一个实施方案中，SNP置换包括在基因中产生错义突变，其降低编码的多肽的表达。在一些实施方案中，SNP置换导致植物细胞，其组织，植物或其子代的有益性状或质量的表达。本文公开的用于SNP替换的方法的优点在于不需要开发包含替代SNP的外源核酸序列，例如包含替代SNP的载体。包含SNP的核酸序列的交换在细胞中的同源染色体之间，其中染色体包含多态性等位基因。

在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致单个基因座通过同源重组(HR)从一个染色体转移至其同源物，其中在后代植物细胞中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致单个基因座通过同源重组(HR)从一个染色体转移至其同源物，其中在后代植物组织中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，靶向同源染色体之间DNA重组的方法导致单个基因座通过同源重组(HR)从一个染色体转移至其同源物，其中在后代植物中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，单个基因座的转移包括通过同源重组(HR)将染色体片段从一条染色体重组为其同源物，其中在后代植物细胞中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，单个基因座的转移包括通过同源重组(HR)将染色体片段从一条染色体重新洗脱至其同源物，其中在后代植物组织中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，单个基因座的转移包括通过同源重组(HR)将染色体片段从一个染色体重组为其同源物，其中在后代植物中产生新的所需性状组合。在一些实施方案中，性状的组合不存在于任一亲本中。

在一些实施方案中，基因座包含等位基因。在一些实施方案中，基因座包含等位基因的一部分。在一些实施方案中，基因座包含等位基因的上游序列。在一些实施方案中，基因座包含等位基因的下游序列。在一些实施方案中，基因座包含等位基因内的单个SNP。在一些实施方案中，基因座包含等位基因内的多个SNP。在一些实施方案中，基因座包含连续核酸序列，其包含等位基因，等位基因的上游序列，等位基因的下游序列，等位基因的调节序列，或等位基因内的SNP，或其任何组合。

通过自然重组难以获得新的期望性状或性状组合的产生，例如在植物培养期间，其中重组不针对特定基因座，并且在特定基因座处的重组发生小于10⁵-10⁶每自然重组事件。

在一个实施方案中，单个基因座包含基因。在一个实施方案中，单个基因座包含等位基因。在一个实施方案中，单个基因座包含基因的一部分。在一个实施方案中，单个基因座包含等位基因的一部分。在一个实施方案中，单个基因座包含基因启动子。在一个实施方案中，单个基因座包含基因外显子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少一个基因的外显子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少两个基因外显子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少三个基因外显子。在一个实施方案中，单个基因座包含基因内含子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少一个基因的内含子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少两个基因内含子。在一个实施方案中，单个基因座包含至少三个基因内含子。在一个实施方案中，单个基因座包含基因的至少一个外显子和一个内含子。在一个实施方案中，单个基因座包含基因的外显子和内含子的任何组合。在一个实施方案中，单个基因座包含编码小RNA的DNA序列。在一个实施方案中，单个基因座包含编码微RNA的DNA序列。在一个实施方案中，单个基因座包含编码tRNA的DNA序列。在一个实施方案中，单个基因座包含编码基因调控序列或调控序列的DNA序列。

在一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致特定等位基因或其部分的缺失。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致添加特定等位基因或其部分。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致在等位基因内引入DNA突变。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致一个等位基因取代另一个等位基因。在另一个实施方案中，同源染色体之间的靶向重组的方法导致缺失等位基因的调节上游或下游基因序列。在另一个实施方案中，同源染色体之间的靶向重组的方法导致添加等位基因的调节上游或下游基因序列。在另一个实施方案中，同源染色体之间的靶向重组的方法导致调节上游或下游基因序列的突变。

在另一个实施方案中，突变包括点突变、缺失突变、取代突变或插入突变，或其任何组合。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致点突变。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致缺失突变。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致取代突变。在另一个实施方案中，同源染色体之间靶向重组的方法导致插入突变。

在一些实施方案中，本文公开的方法“敲除”基因，其中技术人员将理解“敲除”基因包括使植物基因组内的基因失效。在一些实施方案中，基因敲除导致在植物中表达有益的品质或性状。在一些实施方案中，基因敲除导致植物中有益品质或性状的表达增加。在一些实施方案中，基因敲除导致植物中负质量或性状的表达降低。在一些实施方案中，基因敲除导致植物中缺乏非有益品质或性状的表达。在一些实施方案中，敲除交换基因的多态性等位基因。

在一些实施方案中，本文公开的方法“敲入”基因，其中技术人员将理解，“敲入”基因包括使植物基因组内的基因在其中先前未表达。在一些实施方案中，基因敲入导致在植物中表达有益的品质或性状。在一些实施方案中，基因敲入导致植物中有益品质或性状的表达增加。在一些实施方案中，基因敲入导致植物中负质量或性状的表达降低。在一些实施方案中，基因敲入导致植物中缺乏非有益品质或性状的表达。在一些实施方案中，敲入交换基因的多态性等位基因。

技术人员会理解“同源重组”包括遗传重组的机制，其中包含相似核苷酸序列的两条DNA链交换遗传物质。细胞在减数分裂期间使用同源重组，其用于重排DNA以产生完全独特的单倍体染色体组。体细胞可以使用同源重组来修复受损的DNA，特别是用于修复双链断裂(DSB)。在一个实施方案中，如本文所述，诱导同源重组发生在包含体细胞中的多态性等位基因的同源染色体之间。同源重组事件可用于以多种方式改变内源基因。在一些实施方案中，同源重组可导致基因转换(非交换)。在一些实施方案中，同源重组可导致内源基因的失活。在一些实施方案中，同源重组可以产生衍生自两个相关基因的重组基因座，例如等位基因。在一个实施方案中，新产生的重组等位基因与衍生它的任一基因相比具有新的活性。DNA中甲基化模式的变化可能导致基因或基因表达的变化。在某些情况下，这可能是有益的，而在其他情况下，已显示甲基化模式的变化涉及疾病状态，例如癌症。在一些实施方案中，本文公开的靶向同源重组的方法可以导致表观遗传水平的甲基化改变，即甲基化模式的改变。在其他实施方案中，靶向同源重组的方法不会导致表观遗传水平的甲基化变化，即甲基化模式没有变化。

在一些实施方案中，体细胞中同源染色体之间的靶向DNA重组，其中用于重组的靶位点包含多态性等位基因，是可遗传的，其中重组事件传递给后代。因此，一旦分析并选择从细胞繁殖的植物细胞，植物组织或从细胞繁殖的植物作为包含靶向同源重组事件，就可以产生包含该靶向重组事件的后代。在一个实施方案中，重组事件可通过种子经由种子繁殖，所述植物从包含本文公开的靶向DNA重组的细胞或组织繁殖。在另一个实施方案中，重组事件可通过再生含有重组事件的营养组织而遗传。在另一个实施方案中，重组事件可通过繁殖含有遗传事件的营养组织而遗传。包含本文公开的重组事件的营养组织的繁殖的非限制性实例包括使用包含重组事件的分支来进行树木切割或用于移植到树上，以及使用包含重组事件的愈伤组织来再生香蕉植物。

DNA DSB可以作为改变和控制植物基因组的有力工具。在植物中，大多数DNA双链断裂将由NHEJ机器修复，这通常在断裂位点留下小的Indel。(图1)断裂也可以通过同源重组(HR)修复。(图1，图2和图3右侧)。在一个实施方案中，当通过合成依赖性链退火解决HR时，结果是基因转变(基因座从一条染色体转移到另一条染色体；也称为非交换事件)。在另一个实施方案中，当通过Holliday连接的形成解决HR时，结果是基因转换事件或交叉事件，这取决于Holliday连接如何被解析。技术人员会理解，同源染色体之间的同源重组“交换”事件包括DNA序列之间的链交换。在一个实施方案中，交换事件包括在包含基本相似的核苷酸组成的DNA序列之间的交换。在另一个实施方案中，交换事件包括在包含多态性等位基因的同源染色体的DNA序列之间的交换，其中交换事件包括包含多态性等位基因的DNA序列之间的链交换。换句话说，通过包含多态性等位基因的同源染色体的交换进行的同源重组可以导致DNA序列的延长交换，其中该序列包含含有不同核苷酸组成的序列。此外，在另一个实施方案中，同源重组交换事件提供了侧接DSB的DNA序列的交换。

在一些实施方案中，本文公开的内源靶位点内的靶向同源重组的方法包括连续DNA序列的交换，其中所述连续DNA序列包含约0.01KB-20KB的DNA。在一些实施方案中，本文公开的内源靶位点内靶向同源重组的方法包括连续DNA序列的交换，其中所述连续DNA序列包含约0.1KB-20KB的DNA。在一些实施方案中，本文公开的内源靶位点内靶向同源重组的方法包括连续DNA序列的交换，其中所述连续DNA序列包含约1KB-20KB的DNA。

在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括约1KB-5KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括约5KB-10KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括约10KB-15KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括约15KB-20KB的交换。

在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约1KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约2KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约3KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约4KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约5KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约6KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约7KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约8KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约9KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约10KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约11KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约12KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约13KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约14KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约15KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约16KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约17KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约18KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约19KB的交换。在一些实施方案中，靶向同源重组的方法包括至少约20KB的交换。

图2示意性地展示了如何将靶向断裂修复用作精确的育种工具。这些休息的修复产品对于育种非常有用。在一个实施方案中，同源重组用于将来自野生型植物品种的性状递送到已知栽培种中。在另一个实施方案中，同源重组用于将具有特定性状的一种已知栽培种的性状递送到缺乏特定性状的第二种已知栽培种中。在一些实施方案中，通过同源重组进行的DSB修复“打破”涉及重要性状的2个基因的非常紧密的遗传连锁。例如：当涉及抗病性的基因(图2“R”)位于参与高产量生产的基因旁边时(图2“Y”)，天然存在的减数分裂交叉可能非常低。诱导这两个基因之间的目标DSB，蓝色染色体上的Yr和红色染色体上的yR之间，然后进行同源交叉修复将在两个连锁性状之间解离，从而能够在后代中产生新的重组组合，具有高产量和对该疾病的抗性。这也可以最大限度地减少可能含有不需要的基因的野生型品种的染色体片段的长度。

在一个实施方案中，如本文所公开的同源染色体之间的靶向重组方法不同于通过同源重组进行基因靶向的方法，所述同源重组涉及通过同源重组在基因组和外源脱氧核糖核酸(DNA)分子之间交换遗传信息。在另一个实施方案中，如本文所公开的同源染色体之间的靶向重组方法不涉及或不需要或使用DNA的外源同源片段作为同源重组的模板。

与本领域已知的基因靶向方法相比，本文所述的方法是有利的，其需要外源DNA片段作为模板，用于通过同源重组在基因组和外源脱氧核糖核酸(DNA)分子之间交换遗传信息。另一个优点是可以产生后代植物组织和完整植物的所得植物细胞不是转基因的。在一个实施方案中，使用本文所述方法产生的后代植物细胞，植物组织或完整植物不包含来自核酸酶系统的外源DNA，其可以被消除，例如通过遗传分离或可以通过瞬时表达提供。本文所述的靶向同源重组模拟同源重组的自然现象，但由于靶向DSB，重组DNA事件的目标是交换例如有利的性状。使用本文所述的靶向重组方法获得包含所需事件的植物的另一个优点是需要筛选数万种植物以鉴定包含天然(非诱导/非靶向)同源的特定性状交换的植物。重组。与使用外源DNA的方法相比的另一个优点是，已经显示外源DNA可以改变插入位点处的DNA甲基化模式。在一个实施方案中，本文公开的靶向重组方法改变基因转换位点处的DNA甲基化模式。在另一个实施方案中，本文公开的靶向重组方法改变交叉位点处的DNA甲基化模式。在一个实施方案中，本文公开的靶向重组方法不改变基因转换位点处的DNA甲基化模式。在另一个实施方案中，本文公开的靶向重组方法不改变交叉位点处的DNA甲基化模式。

在一个实施方案中，本文公开的方法与体细胞植物细胞一起使用。技术人员会理解，体细胞植物细胞包括除生殖细胞外的任何植物细胞。在另一个实施方案中，体细胞植物细胞选自根细胞，根状细胞，鳞茎细胞，干细胞，叶细胞，芽细胞，种子荚细胞或果实细胞。在一些实施方案中，通过本文公开的方法制备的体细胞植物细胞可以在本领域已知的适当条件下生长，以产生包含含有靶向HR事件的DNA的植物组织，例如基因转换或交换事件。在一个实施方案中，植物组织包含根组织，根状茎组织，鳞茎组织，茎组织，叶组织，芽组织，块茎组织，树木切割，植物愈伤组织，种子或种子荚。或水果组织，或其任何组合。在另一个实施方案中，从通过本文公开的方法制备的植物细胞生长的植物组织可用于产生后代植物，例如，在嫁接的情况下，切割可用于产生树或树的一部分。

在一些实施方案中，使用本文公开的方法包含靶向DNA重组的体细胞植物细胞可以在本领域已知的适当条件下生长，以产生完整植物，其中所述植物包含所得的靶向DNA重组。

在另一个实施方案中，包含所得靶向DNA重组的完整植物包含整个植物组织中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物在植物的仅一部分中的组织中包含重组DNA。例如，在另一个实施方案中，整个植物在果实中包含重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含种子中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含种子荚中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含花粉中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含叶中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含根组织中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含在根状组织中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含球茎组织中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含茎中的重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物在芽中包含重组DNA。在另一个实施方案中，整个植物包含水果，种子，种子荚，叶，根组织，根状茎组织，鳞茎组织，茎或芽或其任何组合中的重组DNA。

在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含原生质体。本领域技术人员将理解，原生质体包括已经部分或完全除去其保护性细胞壁的植物细胞，例如通过酶处理，产生可以再生细胞壁并进一步生长成活细胞壁的完整生物化学感受态单位。在适当的生长条件下的整株植物。植物的细胞壁也可以使用机械处理部分或完全除去，其中活植物的完整生化活性单位是能够在适当的生长条件下再生细胞壁并进一步生长成完整植物的产物。

在一些实施方案中，本文公开的制备包含DNA的体细胞植物细胞的方法，其包含本文公开的靶向同源重组事件，其中所述植物细胞包含原生质体，可通过在已知的适当生长条件下培养原生质体来用于制备植物组织。在本领域中，为了再生细胞壁然后生长植物组织。在一些实施方案中，本文公开的制备包含DNA的体细胞植物细胞，其包含本文公开的靶向同源重组事件，其中所述植物细胞包含原生质体，可通过在已知的适当生长条件下培养原生质体来用于制备整株植物。在本领域中，为了再生细胞壁然后使整个植物生长。

在一些实施方案中，本文描述的方法使用同源染色体之间的靶向重组。本领域技术人员将理解，术语同源染色体包括染色体，其含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同的基因但可能是这些基因的不同等位基因。在一些实施方案中，同源染色体包含染色体，所述染色体含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同基因但对这些基因具有不同的甲基化模式，这可能影响基因的表达水平。

技术人员会理解，术语“等位基因”可以包括特定基因座处的基因的一种或多种替代形式中的任何一种。在植物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座(基因座复数)。在该对同源染色体的每条染色体上存在一个等位基因。在一个实施方案中，多态性等位基因包含在相应的染色体基因座处不相似的等位基因。术语“多态性等位基因”可与具有所有相同含义和质量的“异源等位基因”或“杂合等位基因”互换使用。

此外，技术人员将理解，术语“基因座”(基因座复数)包括染色体上的特定位置或位点，例如发现基因或遗传标记。在一些实施方案中，基因座包含在常染色体DNA的区域内。在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含异染色DNA区域。在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含常染色体DNA或异染色质DNA的区域。

在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含染色体上发现基因或遗传标记的基因座。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含基因的外显子。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含基因的内含子。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含基因的多个外显子和内含子。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含含有至少一个外显子和一个内含子之间的边界的区域。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含上游调节序列。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含下游调节序列。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含位于基因座内的调节序列。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含上游序列。在另一个实施方案中，预选的内源靶位点包含下游序列。

在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含常染DNA区域。在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含异染色DNA区域。在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含常染色体DNA或异染色质DNA的区域。

本领域技术人员会理解，植物染色体具有高度浓缩的，即着丝粒异染色质和大部分去浓缩的常染色臂。异染色质通常与转录不活动和抑制的遗传重组有关。然而，虽然异染色质与常染色质相比可能是基因差的，但它仍含有转录活性基因。在植物中，除了位于着丝粒和着丝粒区域的异染色质外，异染色质位于核仁组织器，瘤节和玉米(Zea mays)B染色体上。在植物基因组内，已经在异染色质中鉴定了潜在活性基因的位置，例如结构结构和在着丝粒区域。然而，虽然异染色质与常染色质相比可能是基因差的，但它仍含有转录活性基因。以下实施例5中给出的令人惊讶的结果表明，本文公开的用于在体细胞植物细胞中同源染色体之间的位点特异性靶向DNA重组的方法，对于常染色质和意外的异染色质都起作用，其中通常抑制重组。

在另一个实施方案中，将本文公开的核酸酶引导至预选的内源靶位点内的区域，其中所述靶向区域长度包含约20bp。在另一个实施方案中，靶向区域长度包含约30bp。在另一个实施方案中，靶向区域长度包含小于20bp。在另一个实施方案中，DSB的靶向区长度包含大于20bp。在一些实施方案中，将本文公开的核酸酶引导至靶区域以产生DSB。

在一些实施方案中，预选的内源靶位点包含多态性等位基因。在一些实施方案中，预选的内源靶位点与多态性等位基因相邻。在一些实施方案中，预选的内源靶位点位于多态性等位基因的上游。在一些实施方案中，预选的内源靶位点位于多态性等位基因的下游。

在一些实施方案中，同源染色体之间的靶向同源重组包括由存在于植物细胞基因组中的同源染色体上存在的同源序列引导的DNA交换，并通过细胞的酶促机制起作用(图3；图4A；图6A)。在一个实施方案中，DNA的交换包括在预选的内源靶位点内的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括但不限于预选的内源靶位点内的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括预选的内源靶位点内的DNA和与预选的内源靶位点相邻的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括含有整个预选的内源靶位点的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括含有整个预选的内源靶位点的DNA和与预选的内源靶位点相邻的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括仅包含预选的内源靶位点的一部分的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括仅包含预选的内源靶位点的一部分和与预选的内源靶位点相邻DNA的DNA。在另一个实施方案中，DNA的交换包括DSB的DNA 3'。在另一个实施方案中，DNA的交换包括DNA5'到DSB。

在一些实施方案中，本文所述方法中使用的植物细胞具有基因和/或其调节元件的突变，这是DSB后非同源末端连接(NHEJ)途径所需的。同源DNA修复。例如，在一些实施方案中，植物细胞可具有ku基因突变(例如，ku70和/或ku80)。在一些实施方案中，植物细胞可具有lig4中的突变。在一些实施方案中，植物细胞可以在任何基因或调节元件中具有突变，其中该突变将导致DSB后NHEJ修复的减少。

图3示意性地显示了诱导同源染色体之间同源重组的方法的一些实施方案，所述同源染色体例如植物细胞，植物组织或整株植物中的同源染色体。在体细胞(例如植物细胞)的基因组中同源染色体之间靶向重组的方法包括三个步骤：(1)在植物细胞中表达核酸酶系统；(2)在预选位点的一个或两个等位基因中诱导DNA双链断裂；(3)通过同源染色体之间的重组修复DNA。在一个实施方案中，本文公开了靶向体细胞植物细胞中同源染色体之间DNA重组的方法，该方法包括以下步骤：(a)在植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向预选的包含同源染色体上的多态性等位基因的内源靶位点，其中在核酸酶系统表达时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割DNA产生双链断裂(DSB)在至少一个多态性等位基因的DNA中；(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞或其所述植物的后代生长的植物的后代，用于同源染色体之间的同源重组，其中同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；(c)选择包含含有所述靶向同源重组事件的DNA的植物细胞，其植物组织，其植物或其植物后代。

图3-步骤1：核酸酶系统的表达。待表达的核酸酶系统可包含能够将双链切割活性靶向同源染色体的至少一个等位基因的DNA中的预选位点的任何核酸酶系统。

例如，在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的核酸酶系统包含锌指核酸酶(ZFN)系统，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统，或簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统。在其他实施方案中，本文公开的方法中使用的核酸酶系统包含能够靶向能够将DNA双链切割至DNA上的预选位点的核酸酶的任何核酸酶系统。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含细菌Argonaut和DNA指导。在另一个实施方案中，双链核酸酶切割DNA以产生平末端。在另一个实施方案中，双链核酸酶切割DNA以产生锯齿状切割末端。

在另一个实施方案中，双链核酸酶切割多态性等位基因内的DNA。在另一个实施方案中，双链核酸酶切割多态性等位基因上游的DNA。在另一个实施方案中，双链核酸酶切割多态性等位基因下游的DNA。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含锌指核酸酶(ZFN)，其中ZFN可以是本领域已知的或新产生的以切割预选位点。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中TALEN可以是本领域已知的或新产生的以切割预选位点。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统(CRISPR/Cas)，其中sgRNA和/或Cas可以是本领域已知的或新产生的在预选的位点上用于切割。

技术人员将理解，术语“单指导RNA”，“sgRNA”和“gRNA”是可互换的，具有所有相同的品质和含义，其中sgRNA可以包含由CRISPR RNA组成的嵌合RNA分子(crRNA)和反式编码的CRISPR RNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，crRNA与至少一个同源染色体上的预选内源靶位点内的DNA区域互补，其中crRNA将CRISPR相关多肽(Cas)核酸酶蛋白“靶向”预选的内源靶位点。

在一个实施方案中，crRNA序列互补的长度为19-22个核苷酸长，例如与靶标互补的19-22个连续核苷酸。在另一个实施方案中，与DNA区域互补的crRNA序列的长度为约15-30个核苷酸长。在另一个实施方案中，与DNA区域互补的crRNA序列的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。在另一个实施方案中，与DNA区域互补的crRNA序列的长度为20个核苷酸长。在一个实施方案中，crRNA位于sgRNA分子的5'末端。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含100％互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少80％的互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少85％的互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少90％的互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少95％的互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少97％的互补。在另一个实施方案中，crRNA在预选的靶序列内包含至少99％的互补。

在另一个实施方案中，tracrRNA长100-300个核糖核苷酸，并提供Cas核酸酶的结合位点，例如形成CRISPR/Cas9复合物的Cas9蛋白。

在一个实施方案中，核酸酶系统包含锌指核酸酶(ZFN)，其包含锌指DNA结合结构域和DNA核酸酶切割结构域，其中所述锌指DNA结合结构域结合在所述预选的内源靶位点内，从而靶向DNA核酸酶切割结构域在所述预选的内源靶位点内切割DNA。

本领域技术人员将理解，术语“锌指核酸酶”或“ZFN”是可互换的，具有所有相同的含义和质量，其中ZFN包含嵌合蛋白分子，其包含至少一个与至少一个可操作地连接的锌指DNA结合结构域。能够双链切割DNA的核酸酶。在一个实施方案中，锌指核酸酶在预选的内源靶位点处产生双链断裂。在另一个实施方案中，锌指核酸酶包含DNA结合结构域和DNA切割结构域，其中DNA结合结构域包含至少一个锌指并且与DNA切割结构域可操作地连接。在另一个实施方案中，锌指DNA结合结构域位于嵌合蛋白分子的N-末端，DNA-切割结构域位于分子的C-末端。在另一个实施方案中，锌指DNA结合结构域位于嵌合蛋白分子的C-末端，DNA-切割结构域位于分子的N-末端。在另一个实施方案中，锌指结合结构域包括锌指核酸酶中能够结合靶基因座的区域，例如本文公开的预选的内源靶位点。在另一个实施方案中，锌指DNA结合结构域包含与至少一个同源染色体上的预选内源靶位点结合的蛋白结构域。在另一个实施方案中，锌手指DNA结合结构域包含与至少一个同源染色体上的多态性等位基因结合的蛋白质结构域。在另一个实施方案中，锌指DNA结合结构域包含与两个同源染色体上的预选内源靶位点结合的蛋白结构域。在另一个实施方案中，锌指DNA结合结构域包含与两条同源染色体上的多态性等位基因结合的蛋白结构域。

技术人员会理解，术语“嵌合蛋白”用于描述已经通过可操作地连接两个或多个DNA片段而产生的DNA分子表达的蛋白质。DNA片段可以来自相同的物种，或者它们可以来自不同的物种。DNA片段可以来自相同或不同的基因。

技术人员将理解，ZFN的术语“DNA切割结构域”包括锌指核酸酶中能够分解核苷酸链中核酸之间的化学键的区域。含有切割结构域的蛋白质的实例包括限制酶、拓扑异构酶、重组酶、整合酶和DNA酶

在一个实施方案中，核酸酶系统包含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统，其包含TAL效应物DNA结合结构域和DNA切割结构域，其中所述TAL效应物DNA结合结构域结合在所述预选的内源靶位点内，从而靶向DNA切割结构域在所述预选的内源靶位点内切割DNA。

本领域技术人员将理解，术语“转录激活因子样效应物核酸酶”，“TALEN”和“TAL效应物核酸酶”可以互换使用，具有所有相同的含义和质量，其中TALEN包含能够识别和切割的核酸酶。其靶位点，例如本文公开的预选的内源靶位点。在另一个实施方案中，TALEN包含融合蛋白，所述融合蛋白包含TALE结构域和核苷酸切割结构域。在另一个实施方案中，TALE结构域包含通过一个或多个TALE-重复模块以序列特异性方式结合核苷酸的蛋白质结构域。在另一个实施方案中，TALE结构域包含与至少一个同源染色体上的预选内源靶位点结合的蛋白质结构域。在另一个实施方案中，TALE结构域包含与至少一个同源染色体上的多态性等位基因结合的蛋白质结构域。在另一个实施方案中，TALE结构域包含与两条同源染色体上的预选内源靶位点结合的蛋白质结构域。在另一个实施方案中，TALE结构域包含与两条同源染色体上的多态性等位基因结合的蛋白质结构域。

在一个实施方案中，TALE结构域包含至少一个TALE-重复模块。在另一个实施方案中，TALE结构域包含一至三十个TALE-重复模块。在另一个实施方案中，TALE结构域包含超过30个重复模块。

在另一个实施方案中，TALEN融合蛋白包含N-末端结构域，一个或多个TALE-重复模块，接着是半重复模块，接头和核苷酸切割结构域。

在一个实施方案中，核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。在另一个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶和gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas核酸酶在所述预选的内源靶位点内切割DNA。

在一些实施方案中，CRISPR Cas系统包含酶系统，其包括指导RNA序列(“gRNA”或“sgRNA”)，其含有与靶多核苷酸的区域互补或基本上互补的核苷酸序列，例如预选的内源靶位点。和具有核酸酶活性的蛋白质。

在另一个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含I型CRISPR-Cas系统，或II型CRISPR-Cas系统，或III型CRISPR-Cas系统，或其衍生物。在另一个实施方案中，CRISPR-Cas系统包含衍生自天然存在的CRISPR-Cas系统的工程化和/或程序化的核酸酶系统。在另一个实施方案中，CRISPR-Cas系统包含工程化和/或突变的Cas蛋白。在另一个实施方案中，CRISPR-Cas系统包含工程化和/或编程的指导RNA。

技术人员会理解，术语“指导RNA”包括含有与靶DNA序列区域互补或基本上互补的序列的RNA。指导RNA可含有除与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的区域之外的核苷酸序列，例如预选的内源靶位点。在另一个实施方案中，指导RNA包含crRNA或其衍生物。在另一个实施方案中，指导RNA包含crRNA：tracrRNA嵌合体。

在另一个实施方案中，gRNA分子包含与至少一个同源染色体上的预选内源靶位点互补并结合的结构域。在另一个实施方案中，gRNA分子包含与至少一个同源染色体上的多态性等位基因互补并结合的结构域。在另一个实施方案中，gRNA分子包含与两条同源染色体上的预选内源靶位点互补并结合的结构域。在另一个实施方案中，gRNA分子包含与两条同源染色体上的多态性等位基因互补并结合的结构域。

Cas酶包含能够在DNA中产生双链断裂(DSB)的RNA引导的DNA核酸内切酶。术语“Cas酶”可与具有所有相同品质和含义的术语“CRISPR相关核酸内切酶”或“CRISPR相关多肽”互换使用。在一个实施方案中，Cas酶选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、C2c1、CasX、NgAgo、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4，或其同源物，或其修饰形式。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas9。在另一个实施方案中，Cas酶包含CasI。在另一个实施方案中，Cas酶包含CaslB。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas4。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas5。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas6。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas7。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas8。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cas10。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cpf1。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cyl基。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csy2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csy3。在另一个实施方案中，Cas酶包含CseI。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cse2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cscl。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csc2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csa5。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csn2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csm2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csm3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csm4。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csm5。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csm6。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cmr1。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cmr3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cmr4。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cmr5。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cmr6。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csbl。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csb2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csb3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx17。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx14。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx10。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx16，CsaX。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csx1，Csx15，Csf1。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csf2。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csf3。在另一个实施方案中，Cas酶包含Csf4。在另一个实施方案中，Cas酶包含Cpf1。在另一个实施方案中，Cas酶包含C2cl。在另一个实施方案中，Cas酶包含CasX。在另一个实施方案中，Cas酶包含NgAgo。在另一个实施方案中，Cas酶是Cas同系物。在另一个实施方案中，Cas酶是Cas直系同源物。在另一个实施方案中，Cas酶是修饰的Cas酶。在另一个实施方案中，Cas酶是本领域已知的任何CRISPR相关内切核酸酶。

在一个实施方案中，转化体细胞植物细胞以表达核酸酶系统或其组分。在另一个实施方案中，转化体细胞植物细胞的至少一个亲本细胞以表达核酸酶系统或其组分。在另一个实施方案中，转化体细胞植物细胞的一个亲本以表达核酸酶系统或其组分。在另一个实施方案中，转化体细胞植物细胞的每个亲本以表达核酸酶系统的组分。在另一个实施方案中，转化一个亲本以表达核酸酶系统的两个组分。

在一些实施方案中，在同源重组事件后，后代细胞，组织和/或植物不再含有核酸酶系统的靶标。(例如，参见图6A，其中不存在额外的DSB，因为预选的内源靶位点不长。DNA的测序表明没有额外的DSB事件。在一些实施方案中，在内源靶位点处由DSB诱导的同源重组后，内源靶位点的序列已被HR改变。在一些实施方案中，在由DSB诱导的同源重组后，核酸酶系统缺乏功能性。在一些实施方案中，在由DSB诱导的同源重组后，核酸酶系统缺乏将核酸酶活性靶向内源靶位点的能力。

在另一个实施方案中，体细胞植物细胞包含在杂交植物内或杂合植物内，其中所述细胞包含多态性等位基因。在另一个实施方案中，体细胞植物细胞包含：在预选内源靶位点具有多态性等位基因的现有杂合或杂合植物细胞。在另一个实施方案中，转化包含多态性等位基因的体细胞植物细胞以表达核酸酶系统。

在一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的DNA转化体细胞。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的DNA转化植物的分离组织。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的DNA转化亲本细胞。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的DNA转化两种亲本细胞。

在一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的RNA转化体细胞。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的RNA转化植物的分离组织。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的RNA转化亲本细胞。在另一个实施方案中，用编码核酸酶系统或其组分的RNA转化两种亲本细胞。

在一个实施方案中，用包含核酸酶系统或其组分的多肽转化体细胞。在另一个实施方案中，用包含核酸酶系统或其组分的多肽转化植物的分离组织。在另一个实施方案中，用包含核酸酶系统或其组分的多肽转化亲本细胞。在另一个实施方案中，用包含核酸酶系统或其组分的多肽转化两种亲本细胞。

在一些实施方案中，植物细胞或分离的植物组织的转化是通过本领域已知的任何方法。在另一个实施方案中，转化导致瞬时表达。在另一个实施方案中，转化导致稳定表达。在另一个实施方案中，通过土壤杆菌的方法进行稳定转化。在另一实施方案中，转化包括直接转化。在另一个实施方案中，直接转化包括使用聚乙二醇(PEG)。在另一个实施方案中，直接转化包括通过轰击使用电穿孔。

在一些实施方案中，可以通过遗传分离从植物基因组中消除引入植物细胞的DNA，例如编码核酸酶系统的DNA。或者，在一些实施方案中，DNA瞬时表达，因此不保留在植物细胞中。

图3框a说明了转化可以是两个亲本，其中例如，它们中的每一个用核酸酶的一种组分转化，例如CRISPR/Cas核酸酶，其在杂交时变得有活性。两种核酸酶组分都可以在一种亲本中引入(图3方框b)。在图3框b中所示的实施方案中，核酸酶应该是“沉默的”并且在杂交体中被激活(使用诱导型系统)。在图3方框b中所示的另一个实施方案中，核酸酶系统可以靶向第二亲本的等位基因，而它不切割转化的亲本植物细胞的等位基因，因此它在杂交中以等位基因特异性方式变得活跃。。在另一个实施方案中，可以在具有所有核酸酶组分的现有杂交或杂合子植物(图3框c)上进行转化。

在一些实施方案中，核酸酶系统的活性或活化是可诱导的。在另一个实施方案中，诱导型核酸酶系统可以利用诱导型启动子。在另一个实施方案中，诱导型启动子可以是组织特异性的。在另一个实施方案中，可以在对植物细胞或组织有压力的条件下诱导(开启)诱导型启动子。在一些实施方案中，核酸酶系统的活性或活化是组成型的。在另一个实施方案中，活性或活化可以是组织特异性的。在另一个实施方案中，调节核酸酶系统或其部分的表达。在另一个实施方案中，组成型启动子用于表达本文公开的核酸酶系统的所有组分。在另一个实施方案中，本领域已知的任何可调节的植物启动子用于表达本文公开的核酸酶系统的所有组分。在另一个实施方案中，本领域已知的任何可调节的植物启动子用于表达本文公开的核酸酶系统的至少一种组分。在另一个实施方案中，本领域已知的并且在植物细胞中有功能的任何可调节的启动子用于表达本文公开的核酸酶系统的所有组分。在另一个实施方案中，本领域已知的和在植物细胞中有功能的任何可调节启动子用于表达本文公开的核酸酶系统的至少一种组分。

在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含来自杂交两个栽培种植物细胞或植物的后代的细胞，其中所述亲本植物细胞各自包含与所述预选内源靶位点处的所述配偶相比的多态性等位基因。在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含来自两个多态亲本系之间杂交的植物后代的细胞，其产生杂交植物，其中所述亲本植物系各自包含所述预选内源靶位点处的多态性等位基因，并且其中仅一条亲本系包含所述核酸酶系统。在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含来自两个多态亲本系之间杂交的植物后代的细胞，其产生杂交植物，其中所述亲本植物系各自包含所述预选内源靶位点处的多态性等位基因，并且其中每个亲本系的一部分包含核酸酶系统的组分。

本领域技术人员将理解，如本文所用，术语“后代”包括自交或交叉的后代，并且包括直接的第一代后代(例如，F₁)，以及后代(例如，F₂，F₃等)，以及回交世代，例如1-3代。在一个实施方案中，后代包含源自植物的任何一代植物或植物细胞，其中已发生如本文所公开的诱导的靶向同源重组。

在另一个实施方案中，后代包含F₁代。在另一个实施方案中，后代包含F₂代。在另一个实施方案中，后代包含F₃代。在另一个实施方案中，后代包含F₄代。在另一个实施方案中，后代包含选自F₁代-F₄代的多代。在另一个实施方案中，后代包含第一代回交世代。在另一个实施方案中，后代包含第二代回交世代。在另一个实施方案中，后代包含第三代回交世代。在另一个实施方案中，后代包含第四代回交世代。在另一个实施方案中，后代包含选自第1代-4代回交世代的多个回交世代。

在另一个实施方案中，所述亲本体细胞植物细胞之一包含所述核酸酶系统，并且其中所述核酸酶系统的DNA裂解活性靶向存在于不包含所述核酸酶系统的另一亲本植物细胞中的多态性等位基因。在另一个实施方案中，所述亲本体细胞植物细胞之一包含Cas核酸酶，并且所述亲本体细胞植物细胞中的另一个包含gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas核酸酶切割所述DNA内的DNA。所述预选的内源性靶位点。在另一个实施方案中，所述亲本体细胞植物细胞之一包含Cas9核酸酶，并且所述亲本体细胞植物细胞中的另一个包含gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas9核酸酶切割所述DNA内的DNA。所述预选的内源性靶位点。

在另一个实施方案中，体细胞植物细胞包含来自具有野生型植物细胞的栽培种的植物细胞后代的细胞，其中所述亲本植物细胞各自包含与所述预选的内源靶位点处的所述配偶相比的多态性等位基因。，并且其中来自栽培种的所述植物细胞包含所述核酸酶系统。在另一个实施方案中，其中体细胞植物细胞包含来自与来自具有野生型植物细胞的栽培种的植物细胞的后代的细胞，所述核酸酶系统的DNA裂解活性仅发生在野生型中存在的多态性等位基因上。亲本植物细胞。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含ZFN，并且其中所述核酸酶系统的DNA切割活性仅发生在野生型亲本植物细胞中存在的多态性等位基因上。在另一个实施方案中，核酸酶系统包含TALEN，其中所述核酸酶系统的DNA切割活性仅发生在野生型亲本植物细胞中存在的多态性等位基因上。

在另一个实施方案中，通过本领域已知的任何方法产生具有多态性等位基因的体细胞植物细胞。在另一个实施方案中，具有多态性等位基因的体细胞植物细胞是从栽培种获得的植物细胞。

图3-步骤2：DNA双链断裂(DSB)的诱导，表示为黄色闪电。在一些实施方案中，DSB发生在所述多态性等位基因的一个等位基因中。在一些实施方案中，在二倍体的情况下，DSB出现在所述多态性等位基因的两个等位基因中。在一些实施方案中，在二倍体或具有更高倍性的细胞(例如三倍体)的情况下，DSB仅在所述多态性等位基因的一个等位基因中发生。在一些实施方案中，在二倍体或具有较高倍性的细胞(例如三倍体)的情况下，DSB出现在所述多态性等位基因的两个等位基因中。在一些实施方案中，DSB发生在所述多态性等位基因的每个等位基因中，例如两个DSB是二倍体，三个DSB是三倍体等。

虽然下面提供的实施例和图1，使用CRISPR/Cas系统说明了DSB切割，但是本领域技术人员将理解这些实施例不是限制性的，并且可以使用任何其他位点特异性核酸酶，例如ZFN或TALEN。在另一个实施例中，DSB的诱导是使用ZFN系统。在另一个实施方案中，DSB的诱导是使用TALEN系统。在另一个实施方案中，DSB的诱导是用CRISPR/Cas系统进行的。在另一个实施方案中，DSB的诱导是使用任何核酸酶系统，其可以靶向预选的内源靶位点并且可以在DNA中产生DSB。

在一些实施方案中，可以在任何植物组织或细胞和细胞周期的任何阶段诱导DSB。例如，在一个实施方案中，组成型启动子可用于激活核酸酶，使得DSB诱导可以早在杂交的受精卵中发生。在另一个实施方案中，DSB发生在体细胞组织的植物发育的早期部分。在另一个实施方案中，DSB发生在体细胞组织发育的晚期。在另一个实施方案中，DSB发生在体细胞组织发育的早期和晚期之间。

在另一个实施方案中，在单组分核酸酶系统(例如ZFN或TALEN)的情况下，通过DNA或RNA载体或通过纯化的蛋白质和gRNA的复合物或通过纯化的蛋白质转化原生质体。

在一个实施方案中，诱导包括组成型诱导。在另一个实施方案中，诱导包括非组成型诱导。在另一个实施方案中，诱导包括组织特异性诱导。在另一个实施方案中，诱导包括条件特异性诱导。在另一个实施方案中，诱导包括细胞周期依赖性诱导。在另一个实施方案中，诱导包括组成型诱导、非组成型诱导、组织特异性诱导或细胞周期特异性诱导，或其任何组合。

图3-步骤3在细胞内，诱导的DSB可以通过非同源末端连接(图1)或通过同源染色体之间的同源重组(HR)修复(内源修复模板图1，图2和图3)。在一些实施方案中，通过非同源末端连接(NHEJ)修复DSB。在其他实施方案中，通过同源重组(HR)修复DSB。出乎意料的是，如下文实施例中所示，在不存在DSB诱导的情况下，使用如本文所公开的同源染色体之间的靶向重组方法导致HR修复的频率显著高于预期天然存在的频率。

在一个实施方案中，DSB修复的结果包括基因转换(也称为非交换)。在另一个实施方案中，DSB修复的结果包括交叉。DSB修复HR产品可通过不同分析鉴定，例如通过遗传标记，SNP模式的变化，DNA测序方法，杂合性缺失(LOH)表型，或通过表型，或通过任何其他标记，或通过它们的组合。

为了确定和选择其中已发生HR的植物细胞，可以分析所述细胞的后代。在一个实施方案中，分析可包括子代细胞的分析。在另一个实施方案中，分析包括分析从所述体细胞或后代植物或其植物组织产生的植物细胞。在另一个实施方案中，分析包括分析从所述体细胞或后代植物或其植物组织产生的植物组织。在另一个实施方案中，分析包括分析植物组织。在另一个实施方案中，分析包括分析所述体细胞或其组织或细胞的植物后代。可以筛选任何类型的细胞，这取决于植物系统和所需的应用。例如，在有性繁殖的植物中，可以筛选种子，谷物，果实甚至花粉粒以鉴定已经遗传给下一代的HR修复的等位基因。在树木或营养繁殖植物中，可以筛选原生质体、愈伤组织、叶子，茎等，然后再生。在一些实施方案中，分析所述植物包括分析所述植物或其后代的一部分，所述植物或其后代包含叶、茎、芽、果实、种子或花粉，或其任何组合。因此，该方法适用于任何植物物种。

在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含在植物组织或植物中。本领域技术人员将理解，术语“植物”包括任何种类的木本、草本、多年生或一年生植物。在一个实施方案中，本文公开的体细胞植物细胞来自包含任何种类的木本、草本、多年生或一年生植物的植物。术语“植物”还可以包括多个植物细胞，其大部分分化成存在于能够产生作物的植物发育阶段的结构。

在一个实施方案中，本文公开的体细胞来自作物植物。在一些实施方案中，体细胞植物细胞包含作物植物细胞。本领域技术人员将理解，术语“作物植物”包括具有至少一个具有商业价值的部分的植物。在一个实施方案中，作物植物包括产生可食用水果(包括蔬菜)的植物，产生谷物的植物(作为食物、饲料和用于产油)，产生花和观赏植物的植物、豆科植物、块根作物、块茎作物或绿叶作物等等。

在一个实施方案中，植物包括苜蓿、苹果、杏、拟南芥、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、哈密瓜、胡萝卜、木薯。、蓖麻、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、香菜、柑橘、Clementines、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、莴苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜露、豆薯、猕猴桃、生菜、韭菜、柠檬、石灰、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄、洋葱、橙色、观赏植物、棕榈、木瓜、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松、菠萝、车前草、李子、石榴、杨树、土豆、南瓜、木瓜、辐射松、菊苣、萝卜、油菜、覆盆子、大米、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、柳枝稷、橘子、茶、烟草、番茄、小黑麦、草皮、萝卜、葡萄、西瓜、小麦、山药和西葫芦。

在一些实施方案中，体细胞植物细胞的同源染色体之间的靶向重组方法包括用于精确育种作物的方法。在一些实施方案中，使用同源染色体之间的靶向重组制备包含含有靶向HR事件(例如，基因转换或交换事件)的DNA的体细胞植物细胞的方法包括用于精确育种作物的方法。本文公开的方法可以精确地引入先前未呈现的体细胞植物细胞、其组织、植物或其后代的品质和/或性状。这些特性存在于例如所述体细胞的一个亲本细胞中。例如，使用本文公开的方法，农民或植物育种者可以产生更强壮的植物或抗自然危害的植物，例如害虫、病原体、干旱或贫瘠的土壤条件，或其任何组合。在其他实施方案中，本文公开的方法可以生产作物，例如具有增加的营养特性，或增加对害虫或病原体的抗性的水果或蔬菜，或者随着时间的推移更稳定以改善从一个地方运输到另一个地方的农产品的质量。在一些实施方案中，所需的品质或性状存在于植物的野生型群体中。在一些实施方案中，存在期望的品质或性状是植物的栽培种群。在一些实施方案中，期望的品质或性状存在于植物的野生型物种中，但不存在相应的栽培种。在一些实施方案中，期望的品质或性状存在于植物物种的一个栽培种中，但不存在相应的栽培种。

在一些实施方案中，包含含有所述HR事件的DNA的植物细胞，或包含所述细胞的植物组织，所述植物组织包含含有所述HR事件的DNA，或包含所述细胞的植物或其后代植物，所述植物包含含有所述HR事件的DNA或衍生的果实。来自包含所述细胞或其后代植物的植物，其包含含有所述HR事件的DNA，或来自包含所述细胞的植物或其后代植物的种子，所述植物包含含有所述HR事件的DNA或其任何组合，具有增加的抗旱性，增加的抗虫性与对照植物细胞，植物或其后代相比，对病原体的抗性增加，营养物含量改善，生长参数改善或其任何组合。在一个实施方案中，对照植物细胞，植物或其后代是其亲本细胞，植物或后代。在另一个实施方案中，对照植物细胞，植物或其子代是体细胞，植物或其后代，其中所述DSB不发生或不发生。

在一些实施方案中，本文公开的方法中靶向的预选内源靶位点包含含有基因座、基因座的一部分、基因、基因的一部分、基因的调节上游序列、基因的调节下游序列的DNA、基因的上游序列、基因的下游序列或其任何组合，并且与对照植物细胞或其后代，植物组织，植物或其后代相比较，其中所述基因的表达或缺乏影响生长、抗旱性、对害虫的抗性、对病原体的抗性或营养物含量、或任何组合所述植物细胞包含含有靶向HR事件的DNA或其后代。

在一些实施方案中，步骤(e)的选定后代选自包括F₁、F₂、F₃、F₄、回交第1代、回交第2代、回交第3代和回交第4代。

在一些实施方案中，本文公开的方法产生包含靶向HR事件的DNA的体细胞植物细胞，或包含所述细胞的植物组织，所述植物组织包含含有靶向HR事件的DNA，或包含所述细胞的植物，所述细胞包含含有靶向HR事件的DNA或包含靶向HR事件的DNA的后代植物，或包含所述细胞的植物的果实，所述植物包含含有包含靶向HR事件的DNA的所述细胞或包含靶向HR事件的DNA的子代植物，或源自包含所述细胞的植物的种子包含靶向HR事件或其后代植物的DNA，其包含含有靶向HR事件或其任何组合的DNA，其中所述细胞，组织，植物或其子代具有与对照相比增加的抗旱性、增加的对害虫的抗性、对病原体的抗性增加、改善的营养含量、改善的生长参数或其任何组合植物细胞、植物组织、其植物或其后代、果实或种子。

实施例

材料和方法–针对实施例1-4

植物材料

所有番茄植物都在温室条件下生长，温度范围在18至25℃之间。黄色果肉e³⁷⁵⁶、双色^cc383、M82和醋栗番茄^LA1578的番茄(S.lycopersicum)突变系由耶路撒冷希伯来大学的Joseph Hirschberg教授和Daniel Zamir教授的实验室友情提供(Kachanovsky,D.E.,Filler,S.,Isaacson,T.&Hirschberg,J.Epistasis in tomato color mutationsinvolves regulation of phytoene synthase 1expression by cis-carotenoids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,19021–6(2012))。

质粒和植物转化

35s:Cas9和u6-26:sgRNA构建体先前通过Ross A.Johnson(Johnson,R.A.,Gurevich,V.,Filler,S.,Samach,A.&Levy,A.A.Comparative assessments of CRISPR-Cas nucleases’cleavage efficiency in planta.Plant Mol.Biol.87,143–56(2015))克隆。用于构建ps#1sgRNA ps#2f靶标的引物在Johnson等人(2015)(同上)中详述并在此处表1中列出。

表1：sgRNA靶标的引物

编码实施例中使用的sgRNA的DNA序列列于表2中。

表2：

根据McCormick(McCormick,S.in Plant Tissue Culture Manual 311–319(Springer Netherlands,1991).doi:10.1007/978-94-009-0103-2_17)，通过具有子叶转化的根癌农杆菌GV3101转化所有番茄品系。

用于同源重组(HR)检测的反向PCR

使用DNA纯化试剂盒(MACHEREY-)提取用于反向PCR测定的DNA样品。对于每种植物，分别处理来自叶子样品或对照质粒的300ng DNA：首先，将它们与10xFD缓冲液、ApaLI(ThermoFisher scientific)和HindIII-HF(New England)一起温育过夜。在80℃灭活20分钟后，将150ng消化的片段用T4DNA聚合酶(New England)在室温下平端2小时。将T4DNA聚合酶在75℃下灭活10分钟，并将线性DNA用Quick T4DNA连接酶(New England)在室温下自连接30分钟。用DDW将对照质粒以1：10,000稀释并混合在一起以模拟“杂合性”。然后用Phusion高保真DNA聚合酶(New England)通过18个PCR循环扩增所有样品(对于引物，参见表3)。

表3：用于反向PCR同源重组检测的引物

设计用于该测定的引物用于等位基因特异性扩增。合并样品并通过高通量测序测序。

为了克隆合成的交叉-对照质粒，使用高保真DNA聚合酶(New England)从黄色果肉³⁷⁵⁶和双色^cc383DNA样品中扩增出两个PCR片段(用于引物序列参见表4)，然后使用GoldenBraid克隆系统(Sarrion-Perdigones,A等,GoldenBraid:AnIterative Cloning System for Standardized Assembly of Reusable GeneticModules.PLoS One 6,e21622(2011))进行克隆。

表4：合成交叉-对照质粒的引物

首先，将四个扩增子中的每一个克隆到pUPD质粒中。然后将具有来自黄色果肉e³⁷⁵⁶的“ps”片段的pUPD2质粒用含有来自双色^cc383的“yl”片段的pUPD2质粒克隆到pDGB3_αl质粒中。平行地，将具有来自双色^cc383的“ps”片段的pUPD2质粒用具有来自黄色果肉e³⁷⁵⁶的“yl”片段的pUPD2质粒克隆到pDGB3_αl质粒中。将这两个“合成等位基因”质粒合并在一起，并进行反向PCR过程和测序。这些“合成等位基因”质粒的DNA序列示于表5中。

表5：合成交叉对照的质粒

DNA扩增和测序

使用High-Fidelity DNA聚合酶(New England)和18个PCR循环(对于每个实验的特异性引物，参见表6)扩增用于高通量测序的DNA样品。

表6：高通量测序的引物

*n代表A、T、C或G。

如Blecher-Gonen等(Blecher-Gonen,R.等,High-throughput chromatinimmunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNAinteractions and epigenomic states.Nat.Protoc.8,(2013))所述制备文库。高通量测序在Weizmann Institute of Science的G-INCPM单元进行，且Illumina HiSeq 2500平台用于2x125配对末端读数。

使用RED(SIGMA-ALDRICH)以35个PCR循环扩增用于Sanger测序的DNA样品(对于引物，参见表7)。

表7：Sanger测序的引物

PCR后，用外切核酸酶I和虾碱性磷酸酶(rSAP)(New England)“清洗”DNA。测序在Weizmann Institute of Science的Biological服务单元用Applied Biosystems3730DNA Analyzer进行。

实施例1：用于分析DNA双链断裂(DSB)修复的番茄果实颜色测定

目的：估计体内非同源末端连接(NHEJ)与基于同源重组(HR)的内源植物基因座双链断裂(DSB)修复的比率。

方法：为了估计在内源植物基因座上体细胞NHEJ与基于HR的DSB修复的比率，设计了果实颜色测定法。使用两个番茄突变体系，每个突变体在八氢番茄红素合成酶1(Phytoene synthase1，PSY1)基因中具有不同的突变。黄色果肉e³⁷⁵⁶等位基因是EMS突变体，其在PSY1中具有过早终止密码子，导致黄色果实表型(Kachanovsky,D.E.,Filler,S.,Isaacson,T.&Hirschberg,J.Epistasis in tomato color mutations involvesregulation of phytoene synthase 1expression by cis-carotenoids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,19021–6(2012))。双色^cc383等位基因是在PSY1的启动子中具有3.7Kb缺失的突变体，导致黄红色脱毛果实表型(图4A)。

为了监测整个植物发育过程中CRISPR-Cas诱导的突变，从受精开始，产生表达35S:Cas9(SEQ ID NO:59)的转基因黄色果肉e³⁷⁵⁶和表达PSY1单指导RNA(u6-26:Ps#1-sgRNA；质粒序列为SEQ ID NO:60；PS#1-sgRNA为SEQ ID NO:68)的转基因双色^cc383系。设计该u6-26:Ps#1-sgRNA以在两个等位基因上诱导双色^cc383和黄色果肉e³⁷⁵⁶突变之间的DNADSB(图4A)。黄色果肉e³⁷⁵⁶：35S:Cas9和双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNA之间的杂交预期产生具有显性双色^cc383果实表型的F1植物。对于不表达35S:Cas9或u6-26:Ps#1-sgRNA的对照植物，预期相同。由于在一个或两个等位基因上诱导DSB，随后易于错误的DNA修复，预期在表达Cas9和Ps#1-sgRNA的植物中与该表型的偏差。双色^cc383等位基因的NHEJ修复应产生黄色果实表型(部分或整个果实)。基于HR的机制(交叉或非交叉事件)修复DSB的结果，如果在发育早期发生HR事件应该是红色果实，或者如果在发育晚期发生HR事件应该是具有红色斑点或部分的黄色果实(图4A)。

结果：在DSB诱导后，50个黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNA F₁植物的群体产生双色、黄色以及具有红色斑点的黄色的果实。当使用不同的黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9转基因系时，果实表型的分布变化(图4B)。如所预期的，在没有DSB诱导的情况下，6个黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383F₁植物的对照群体仅显示双色果实(图4B)。果实颜色测定的一个优点是它能够预测下一代修复产品的遗传。实际上，预计从完全黄色的果实中提取的F₂种子将产生发芽突变。

为了证实黄色果实指示NHEJ生发事件，生长来自黄色果实的F₂植物。使用黄色果肉e³⁷⁵⁶和双色^cc383等位基因的等位基因特异性PCR扩增和PCR产物的测序，显示在所有测试的情况下，来自黄色果实的种子在双色^cc383等位基因的DSB位点(表9)处产生携带发芽突变的种子。表8列出了所用的PCR引物。

表8：NHEJ生发事件的引物

表9：NHEJ生发事件

通过Sanger测序对表9的来自F₁的黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNAPs#1-sgRNA的F₂植物的等位基因特异性PCR产物进行测序。所有植物在双色等位基因处具有插入缺失(插入和/或缺失)。13个中有4个在黄色果肉等位基因中也有插入缺失。

来自黄色果实的一些后代也在黄色果肉e³⁷⁵⁶等位基因中显示突变(表9)。尽管发现许多具有小红色部分的黄色水果(图4B)，但在F₁植物中未检测到完全红色的果实。此外，种植了来自具有红色斑点的果实的F₂植物400株，提示体细胞同源重组(HR)，但没有检测到完全红色果实，这表明发芽的HR事件。

实施例2：通过体细胞非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)的高速率CRISPR-Cas9DNA DSB诱导导致修复

目的：识别、表征和量化F₁中的体细胞NHEJ事件。

方法：为了鉴定、表征和量化F₁中的体细胞NHEJ事件，使用了22株黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNAPs#1-sgRNA群体，以及将黄色果肉e³⁷⁵⁶x双色^cc383的2株植物用作对照。使用来自植物的不同分支的四(4)片叶子。然后，提取它们的DNA，通过PCR扩增两个等位基因的诱导DSB侧翼的区域，并使用高通量测序Illumina HiSeq 2500平台对所得产物进行测序。

为了测量HR修复，设计了一种反向PCR方法，该方法允许对相距1.7Kb的两个等位基因特异性突变进行测序(黄色果肉e³⁷⁵⁶和双色^cc383)，使得能够区分亲本和重组分子(图4D)并最小化假阳性PCR产物的形成。用于体细胞NHEJ测序的相同DNA样品(图4C)用于反向PCR。另外，克隆了两个合成阳性对照(重组样克隆)，其也通过相同的反向PCR方法处理。通过Illumina HiSeq 2500配对末端测序对来自每个反应的反向PCR产物(如图4D中所示)进行测序。

结果：在每株植物250,000-850,000个读数(PCR样品)中，平均88％的黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNAPs#1-sgRNA植物的读数包含在CRISPR DSB位点处的突变，而只有2％的黄色果肉e³⁷⁵⁶x双色^cc383植物的读数偏离WT序列，可能是由于PCR和测序错误(图4C)。由于不同的NHEJ修复事件，系统中CRISPR-Cas DSB诱导的高速率导致广谱突变。此外，发现一些NHEJ标记，例如4bp CTTG缺失，优于该基因座处的其他标记(图4C，图5)。

在测量HR修复的测定中，每株植物获得5,000-50,000个读数。黄色果肉e³⁷⁵⁶x双色^cc383的阴性对照仅在没有DSB诱导的情况下显示亲本等位基因，而阳性合成对照显示重组等位基因(图4E)。黄色果肉e³⁷⁵⁶35S:Cas9x双色^cc383u6-26:Ps#1-sgRNAPs#1-sgRNA的大多数F₁植物仅显示亲本等位基因，但其中一些显示重组等位基因之一，表明基于体细胞HR的修复。

实施例3：等位基因特异性DSB诱导和修复产物的高分辨率分析

目的：创建一种区分破损染色体和修复模板的方法。

黄色果肉e³⁷⁵⁶x双色^cc383之间的上述交叉不能提供足够的SNP来详细分析HR修复产物。此外，它不能进行等位基因特异性断裂，这是进行精确实验所必需的，其中可以区分断裂的染色体和修复模板。

方法：因此，设计了一种新的DSB修复试验，通过使用醋栗番茄^LA1578，一种带有小红色果实的野生番茄种质和一个测序的基因组显示与可食用番茄(Solanum lycopersicum)相比，在断裂位点和远端区域提供了多个SNP的存在和位置。为了确保等位基因特异性断裂，在可食用番茄M82栽培品种背景中制备了等位基因，其对u6-26:Ps#2-sgRNA免疫。为此目的，红色水果cv.M82用35S:Cas9转化(质粒序列是SEQ ID NO：59；编码Cas9的序列是SEQID NO：65)和u6-26:Ps#2-sgRNA(质粒序列是SEQ ID NO：60；编码sgRNA序列是SEQ ID NO：68)。然后，选择T₀中的黄色果实并且从它的T₁群体生长它们的T₁种子，在CRISPR-Cas9DSB位点用腺嘌呤插入(+A)分离纯合子植物，其与野生番茄种质杂交。

用于等位基因特异性DSB诱导和等位基因依赖性修复的gRNA分子的序列在SEQ IDNO：61中列出。

在该测定中，醋栗番茄^LA1578是DNA DSB的唯一靶标，因为+A插入，在M82psyl等位基因中破坏原型间隔区相邻基序(PAM)并阻止Cas9切割。M82等位基因的+A突变是隐性的，因此预期F₁植物具有小的红色果实。由NHEJ或HR(交叉或非交叉)在PSY1中进行的DSB修复导致黄色果实或具有黄色部分的红色果实，这取决于修复发生时的发育果实阶段。预计NHEJ修复事件会在DSB位点留下小插入缺失，而交叉和非交换事件可通过DNA DSB两侧SNP模式的差异来识别(图6A)。

对于体细胞DSB修复的分析，来自双亲的叶子(M82 35S:Cas9,U6-26:gRNA，+A纯合子和醋栗番茄^LA1578)和来自五种F₁植物的DSB DNA区域被PCR扩增。并通过Illumina HiSeq2500配对末端测序进行测序(图7)。该测序产量为每株600,000-900,000个读数。

此处显示M82psy1^+A等位基因对DSB诱导免疫，在M82(M82 35S:Cas9和u6-26:Ps#2-sgRNA，+A纯合子)亲本中几乎没有DSB足迹，支持设计的等位基因特异性gRNA(图7)。此外，至少50％的读数给出+A插入，而醋栗番茄等位基因突变(图7的饼图中的红色)。发现只有7-18％的F₁植物读数是WT，其余的给出了各种插入缺失模式(图7)。为了估计生发事件的比率，不同分支上的果实颜色是文件，并且用Illumina对果实果皮组织进行测序(图8)。

通过该测定，完全黄色的果实可能含有通过NHEJ或HR进行修复的生发事件的种子(图6A)。此外，交叉或非交换事件应给出+A，+A纯合子植物，因为模板修复是M82psy1^+A等位基因(图9A)。在一种F₁植物中，发现黄色果实显示出高+A，通过Illumina和Sanger测序得到+A含量(图10)。通过Sanger方法培养这些植物的F₂后代并测序。测序揭示F₂植物具有对应于生发HR事件的SNP模式(图6B)。植物#2和#7看起来像非交叉的清晰情况，两者都具有至少5Kb的转换轨迹。植物#11看起来像一个交叉的情况(图6B)，然而，由于植物，对植物#11中DSB位点两侧超过20kb的侧翼标记(Indels和SNP)的分析无法进行因此死亡，所以这个案子被称为假定的交叉。

为了鉴定纯合子基因转换产物，并更好地表征转化轨迹的边界，对来自植物F₂#7后代的F₃植物进行测序。F₂#7s的F3后代之一(显示于图6B的底部)是基因转换修复的纯合子产物，具有5-6kb长度的确认转化轨迹。

实施例4：等位基因依赖性修复速率的定量

目的：测试等位基因依赖性修复。由于以上在等位基因特异性DSB诱导的实施例3中开发的系统(其是HR的标志)，能够测试等位基因依赖性修复。在醋栗番茄^LA1578等位基因上的DNA DSB的诱导显示在许多水果和叶子的破碎位点处类似于M82psy1^+A等位基因的+A标记(图7和8)。这种过量的+A修复可能是由于优选的NHEJ修复模式或由HR介导的等位基因依赖性修复。

方法：为了区分这两种可能性，培育了M82品种的几种植物，它们都是相同35S:Cas9 u6-26:Ps#2-sgRNA的后代。在该群体中，22种植物最初是PSY1的M82WT等位基因的纯合子，而14种植物最初是杂合子M82-WT PSY1/M82psy1^+A。使植物生长至4周龄，从它们各自收集4片叶子。然后，通过PCR扩增DSB周围的DNA，并用Illumina HiSeq 2500平台对PCR产物进行测序。对于每种植物，计算每个插入物中读数总数的百分比。如果+A突变在每个染色体中独立发生，则WT中具有新的+A突变(其具有两个潜在靶标)的读数应该是仅有一个靶标可用的杂合子中的两倍(图9A)。

为了测量预期的等位基因非依赖性+A NHEJ足迹，使用WT纯合子的22株植物并计算+A读数除以2的百分比以获得每个等位基因出现+A突变的值。使用以下等式：预期＝(％(+A reads)_{T＝4周(wt,wt)})/2。当第二个等位基因含有+A突变(在M82-WT PSY1/M82psy1^+A杂合子植物中)时，通过取M82-WT PSY1/M82psy1^+A植物中+A读数的％来计算在WT等位基因中出现新的+A突变，并推断为50％(来自M82psy1^+A等位基因的读数的初始百分比)。以下等式用于在杂合子M82-WT PSY1/M82psy1^+A植物中观察到的+A突变率：观测值＝％(+A读数)_{T＝4周,(wt,+A)}-50％。

结果：当比较观察到的+A足迹的预期时，发现杂合子群体中新颖+A突变的比率显著高于预期(p＝0.009)。考虑到两个群体是同基因的，这表明DSB位点的修复依赖于其同源等位基因的序列(图9B)。a+A足迹的等位基因非依赖性频率在M82-WT中为每个等位基因4％，而M82-WT PSY1/M82psy1^+A杂合子中M82-WT PSY1等位基因的+A足迹频率为18％(图9B)。这表明18-4＝～14％的DSB修复事件是等位基因依赖性的(同源修复重组事件)，其余的通过NHEJ以等位基因非依赖性方式发生。

实施例1-4的总结

体细胞DSB修复

早期关于体细胞DSB诱导的HR修复的研究主要通过染色体内重组或染色单体不等交换的转基因测定进行。值得注意的是，本文公开和示例的方法在内源基因组环境中进行，其中可以在同源染色体上跟踪修复模板起点。实施例1-4的结果表明，可以使用同源染色体作为模板，通过体细胞同源重组修复靶向DSB。这与使用外源模板的基因靶向显著不同。

此外，还证明了这些修复事件中的一些可以生发地传播给下一代。在一组杂交中，显示WT等位基因可以通过两个缺陷的psyl亲本等位基因(双色^cc383和黄色果肉e³⁷⁵⁶)之间的基因内重组来恢复，该事件被视为红色斑点(实施例1，图4A)并通过序列分析表征(实施例2，图4C)。在这个交叉中没有恢复完全红色的果实，这将对应于早期的生发事件。这可能是由于双色等位基因中大的缺失的基因组背景，或者“固化的”重组WT等位基因在发育期间经历了第二轮NHEJ(目标位点在HR期间未被破坏)，这将导致损失功能(黄色)等位基因通过NHEJ。考虑到NHEJ的高效率，这是一个看似合理的方案。此外，在醋栗番茄X可食用番茄F₁杂交中的等位基因特异性DSB诱导的测定中，发现三个HR-依赖性修复的情况，其发芽传递至F₂和F₃代。两种情况对应于具有5-6Kb的转换轨迹的非交叉事件(示例3，图6B)。第三种情况(F2植物#11)是一种生发性HR事件，可能是交叉事件或非交叉事件-由于植物死亡而无法证明这一点。最后，尝试量化HR与NHEJ的比率，设计sgRNA用于番茄背景中的等位基因特异性DSB诱导。该实验设置使得能够测量源自同源等位基因的过量修复足迹与预期相比，表明在所有可检测的DSB修复事件中，14％是等位基因依赖性的，其余是非同源的。14％的等位基因依赖性HR修复是出乎意料的，其中令人惊讶的是，所使用的方法产生的HR显著高于预期。

体细胞与减数分裂HR

比较体细胞与减数分裂细胞中HR介导的修复是感兴趣的。总体上对于体细胞组织中的同源物重组知之甚少，这可能是由于此类事件的频率低，缺乏表型标志物以及难以检索生发事件。在没有DSB的情况下未检测到红色区段，并且基因内重组分子的存在无效或可忽略不计。这与早期的烟草研究结果一致，表明在缺乏DSB诱导的互惠和非互惠HR事件中，体细胞HR的发生率非常低。同源染色体之间的低体细胞HR率可能表明存在瓶颈，例如缺乏控制同源物配对，联会复合物形成等的减数分裂中发现的HR机制。结果显示，基于案例研究和定量评估的意外相对较高的HR修复率表明DSB是一个主要瓶颈，令人惊讶地诱导体细胞HR从0％(在没有断裂时)到-14％每个等位基因(在实施例4中测量的等位基因依赖性修复，图9B)并且在缺乏减数分裂HR机制的情况下，同源物之间的DSB诱导的HR可以发生。

此处报告的HR DSB修复率(每个等位基因约为14％)似乎高于减数分裂过程中报告的值。实际上，只有一小部分减数分裂(～3-5％)演变成交叉，类似的部分被修复为非交叉。

同样，提供了关于DSB介导的HR修复发生的证据，然而在大多数测定中，不可能区分交叉修复机制和非交叉修复机制。对多态背景中的3个生发事件的分析能够实现这种区分，但样本(2次转换和1次推定交叉)太小而无法得出结论。

与早期减数分裂报告相比的显著差异在于，与减数分裂HR事件报告的552bp的平均区域相比，此处表征的非交换体细胞事件中的转化区长度为～5Kb。这些长转换轨迹可能反映了物种(番茄与拟南芥)之间或减数分裂与体细胞之间的差异。也可能的是，Spoi11与DSB末端的结合在保护末端免于降解和减少转换轨道长度方面比Cas9更有效。最后，这是内源性同源染色体之间的靶向HR的第一份报告，而没有关于靶向减数分裂重组的早期报道。

体细胞交叉确实发生在植物中，并且甚至可以在一些突变体中达到高水平，表明同源物交叉机制可用于体细胞组织并且靶向交叉是可行的。有趣的是，尽管减数分裂交叉机器在进化过程中得到了优化，但在减数分裂期间针对特定DSB的诱导必须与数百个自然发生的其他突破竞争作为交叉的基质并与直觉相反，对于目标交叉诱导而言，效率低于体细胞HR。

利用体细胞HR进行精确育种

结果显示定制设计的核酸酶，例如CRISPR-Cas，可用于精确重组体细胞中同源染色体之间的染色体区段。例如，有可能从相对于作物的野生植物转移抗病基因，而不需要长时间的回交过程，这不仅需要几代才能获得同基因系，而且还会拖曳大部分不需要的DNA侧翼理想的基因。因此，使用本文公开的方法有利于在具有靶向HR事件(交叉或基因转换)的植物中产生定制重组，其中与未经历靶HR事件的亲本植物相比，从所产生的植物中添加或去除质量或性状。此外，与筛选天然重组事件相比，植物在缩短的时间范围内产生并且具有显著更小的种群大小，并且更精确地产生感兴趣的植物中的重组事件，而不添加不期望的DNA。在一些实施方案中，HR交换或基因转换事件引入由于基因或基因元件之间的紧密连接而不易由天然存在的HR引入的基因或调节元件。换句话说，本文描述和举例说明的方法证明体细胞HR可用于等位基因置换。

实施例5：拟南芥中常染色质和异染色质区域中体细胞组织中的靶向DSB诱导的交叉

目的：上述实施例1-4的结果，在番茄中，在体细胞DNA DSB下显示出高水平的基于HR的修复。这些结果局限于位于染色体3的亚端粒区域中的单个基因座(PSY1)的研究，其通常对应于常染色质(开放染色质)区域。此外，观察到的同源依赖性修复可能通过交叉或基因转换发生，因为实验系统无法区分这两种机制。最后，研究了单个物种中的单一基因座，不知道该现象有多普遍，以及在常染色体和异染色质(紧密包装的染色质)区域中是否会观察到体细胞组织中DSB的HR诱导效应。这里的目的是检测在另一物种的体细胞DNA DSB下以及常染色质和异染色质区域中基于HR的修复。

已知异染色质区域在DNA重组中受到抑制。在一些物种中，异染色质代表80％的基因组(例如玉米和小麦)。异染色质在着丝粒周围占主导地位，可能含有高达25％的基因。在这些区域缺乏重组是植物育种的障碍，因为有害基因不能从有益基因中分离出来。

本文描述了在几个遗传基因座上的靶向HR(交换和基因转换)的实例，包括具有对应于常染色质的染色质修饰的基因座(低胞嘧啶甲基化，低核小体占据，组蛋白3-赖氨酸4二甲基化或三甲基化(H3K4me2/3))和具有异染色特征的基因座(高胞嘧啶甲基化，高核小体占据，H3K9me2/3，H3K27me3，如本领域中已知的)。这些常染色质和异染色质区域分别对应于减数分裂热点或冷点)(Shilo等,2015“DNA Crossover Motifs Associated withEpigenetic Modifications Delineate Open Chromatin Regions in Arabidopsis”Plant Cell,Sep；27(9):2427-36)。

方法：为了测试具有常染色和异染色特征的区域中DNA DSB修复的性质，使用交叉测试系(Melamed-Bessudo等，2005“A new seed-based assay for meioticrecombination in Arabidopsis thaliana”Plant J.43(3):458-66)，哥伦比亚生态型拟南芥系，GFP和RFP标记在染色体3上以5Mega bp的距离分开，在种子特异性Napine启动子下表达，产生红色和绿色荧光的种子(亲本类型)或仅红色或仅绿色(交叉重组类型)。

基于遗传基序和表观遗传学特征，选择了用于GFP和RFP标记之间的DSB诱导的12种不同靶标(表10显示在图11中)；“寒冷地区”中的四个位点(具有典型的重组冷点的异色特征)和“热区域中的八个目标”(重组热点典型的常见特征)(图12A)。

首先，转化12个哥伦比亚重组测试系，其包括12个不同的靶，以表达对应于DSB靶的小指导RNA(35Sx2：潮霉素，u6-26:gRNA构建体)。此外，WT Columbia系被工程化以在体细胞组织中活化的组成型遍在蛋白启动子下表达Cas9(nos:nptII:nos Ubi:spCas9)。然后将表达12种gRNA的细胞系与表达Cas9和WT的WT哥伦比亚系杂交，使对潮霉素和卡那霉素(即含有gRNA和Cas9)均具有抗性的植物种群与哥伦比亚测试系和Landsberg生态型不含gRNA和F₁的对照F₁群体一起生长和收获(图12B)。在该测定中，DSB断裂已经在体细胞组织中诱导，并且在种子中测量结果。因此，将测量传递到种系的早期体细胞交叉事件。对于每种F₁植物，将其300-500个F₂种子计数为仅红色(重组型)、仅绿色(重组型)、红色和绿色(亲本型)和非荧光种子(亲本型)。基于这些计数，计算GFP和RFP标记之间的重组频率(以cM计)。

结果：出乎意料的是，该测试的结果(图12C)显示，对于所有计数的热和冷目标，相对于F_l Columbia Ubi的对照群体，发现相当或增加的交叉率：cas9x Columbia测试系控制。在该测定中，亲本都处于Columbia背景中，并且只有标记是多态的。

为了表征重组断裂点，将F₁植物与多态性WT Landsberg生态型进行回交，使F₂回交群体(潮霉素和卡那霉素抗性植物)生长，从这些植物的体细胞组织中提取DNA，并收集它们的F₃种子(图12B)。使用PacBio对位于哥伦比亚测试者x Landsberg的这些回交植物的靶区域侧翼的5Kb片段进行测序，以进行DNA DSB修复事件的高分辨率表征(图13)。总之，这些结果为常染色质和异染色质修复位点上的靶向DSB诱导的重组提供了支持。

虽然本文已经说明和描述了本文公开的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、改变和等同物。因此，应理解，所附权利要求旨在涵盖落入本文公开的遗传修饰的植物和方法的真正精神内的所有这些修饰和变化。

序列表

<110> 耶达研究与发展有限公司

LEVY, Avraham A.

MELAMED-BESSUDO, Cathy

FILLER-HAYUT, Shdema

<120> 同源染色体之间的靶向重组及其用途

<130> P-80701-PC

<150> 62/444,827

<151> 2017-01-11

<160> 80

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ps#1sgRNA F

<400> 1

attggaatgt ctgttgcctt gtta 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ps#1 sgRNA R

<400> 2

aaactaacaa ggcaacagac att 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ps#2 sgRNA F

<400> 3

attggagcgt atataatgct gctt 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ps#2 sgRNA R

<400> 4

aaacaagcag cattatatac gct 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a 3756 bic hr f

<400> 5

tcagctatgc taatgactcc cgag 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a bic hr r

<400> 6

agtccattct ctattccgca tagtga 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a 3756 r

<400> 7

tgacaaccga cctaaatcga tccg 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> b bic hr r

<400> 8

actgcattct ctattccgca tagtga 26

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> b 3756 r

<400> 9

gactactgaa ccgacctaaa tcgatccg 28

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pupd_y1_f

<400> 10

gcgccgtctc gctcgtactc gaacgagggt catc 34

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pupd_y1_r

<400> 11

gcgccgtctc gctcgagcgc cataattgga acactcatca a 41

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pupd_ps_f

<400> 12

gcgccgtctc gctcgggagc aaccttattt tgtactt 37

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pupd_ps_r

<400> 13

gcgccgtctc gctcgagtac aacatatcaa aataggtat 39

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp f

<400> 14

ggtttgcctg tctgtggtct 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp r1

<400> 15

agtcccatga aacttgtccc atttg 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp r2

<400> 16

tcagccatga aacttgtccc atttg 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp r3

<400> 17

actgccatga aacttgtccc atttg 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp r4

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tgacccatga aacttgtccc atttg 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gactccatga aacttgtccc atttg 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 t1 htp r6

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ctgaccatga aacttgtccc atttg 25

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nhej_psy1_t2_r

<400> 21

gcctaaatac ggcacttcca 20

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a_nhej_psy1_t2_f

<400> 22

agtcgtatcg cccctgaatc aaag 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> b_nhej_psy1_t2_f

<400> 23

tcaggtatcg cccctgaatc aaag 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c_nhej_psy1_t2_f

<400> 24

tgacgtatcg cccctgaatc aaag 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> d_nhej_psy1_t2_f

<400> 25

actggtatcg cccctgaatc aaag 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> e_nhej_psy1_t2_f

<400> 26

gactgtatcg cccctgaatc aaag 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> f_nhej_psy1_t2_f

<400> 27

ctgagtatcg cccctgaatc aaag 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nnn_a_nhej_psy1_t2_f

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

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<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nnn_b_nhej_psy1_t2_f

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 29

nnnnnntcag gtatcgcccc tgaatcaaag 30

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nnn_nhej_psy1_t2_r

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 30

nnnnnngcct aaatacggca cttcca 26

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1_1_F

<400> 31

tttgcagaag tcaagaaaca gg 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1_t4_ident_R

<400> 32

gatgtcatcg tccgttctcc 20

<210> 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1 psnps F

<400> 33

acggtatctt cccaccttca 20

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1 psnps R2

<400> 34

atagtgttaa ttgtgtaggc tcctt 25

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1 psnps F2

<400> 35

cgacgaggag taaggtttgc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1 psnps R

<400> 36

tcagtccatt tcgttttcgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1_t123_f

<400> 37

atgttgcagc cattcagaga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1_t123_r

<400> 38

tgatcatggc tcgtcactgt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 term f

<400> 39

acaagtaccc tgggttggag 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1_term_r2

<400> 40

gcagtttttg taggaggcac a 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1_term_f2

<400> 41

tgtgcctcct acaaaaactg c 21

<210> 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> psy1 term r

<400> 42

tggattgaat cgaatttgga taa 23

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pimpixm82_co_f

<400> 43

ctttgcactt ggttactcag a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pb_psy1_r

<400> 44

agcctacggc ccaaactatt 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 14036_f

<400> 45

tgctaatggg gcaggaaata 20

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 14036_r

<400> 46

tcaagtaacg taaaacacgt tgaaa 25

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5kb_up_t2_F

<400> 47

ttcatttgac gagcgatctg 20

<210> 48

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5kb_up_t2_R

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ttggctgctt tgaccttacc 20

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<212> DNA

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<220>

<223> 40kb_down_t2_f

<400> 49

cattatccta agagtgcagt cagc 24

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<212> DNA

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<220>

<223> 40kb_down_t2_r

<400> 50

tggtttctcg attacctctt tca 23

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20kb_down_t2_f

<400> 51

tgacaccaat ccatccaatc 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20kb_down_t2_r

<400> 52

ctgctacctg cactggctct 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20kb_up_t2_f

<400> 53

tacgtccccg aagaaatcac 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20kb_up_t2_r

<400> 54

cccttaggct ccgaagttgt 20

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 40kb_up_t2_f

<400> 55

cacataagag gacacgttta ttca 24

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 40kb_up_t2_r

<400> 56

gccacggaga aaatagttga 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JF_F

<400> 57

tgcaaagtgc tacgtgtcct 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSY1_1_R

<400> 58

aatgtgaaca gcaacgcaaa 20

<210> 59

<211> 18063

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35S:Cas9 质粒

<400> 59

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggatccccg ggatcatcta cttctgaaga 60

ctcagactca gactaagcag gtgacgaacg tcaccaatcc caattcgatc tacatcgata 120

agaagtactc tatcggactc gatatcggaa ctaactctgt gggatgggct gtgatcaccg 180

atgagtacaa ggtgccatct aagaagttca aggttctcgg aaacaccgat aggcactcta 240

tcaagaaaaa ccttatcggt gctctcctct tcgattctgg tgaaactgct gaggctacca 300

gactcaagag aaccgctaga agaaggtaca ccagaagaaa gaacaggatc tgctacctcc 360

aagagatctt ctctaacgag atggctaaag tggatgattc attcttccac aggctcgaag 420

agtcattcct cgtggaagaa gataagaagc acgagaggca ccctatcttc ggaaacatcg 480

ttgatgaggt ggcataccac gagaagtacc ctactatcta ccacctcaga aagaagctcg 540

ttgattctac tgataaggct gatctcaggc tcatctacct cgctctcgct cacatgatca 600

agttcagagg acacttcctc atcgagggtg atctcaaccc tgataactct gatgtggata 660

agttgttcat ccagctcgtg cagacctaca accagctttt cgaagagaac cctatcaacg 720

cttcaggtgt ggatgctaag gctatcctct ctgctaggct ctctaagtca agaaggcttg 780

agaacctcat tgctcagctc cctggtgaga agaagaacgg acttttcgga aacttgatcg 840

ctctctctct cggactcacc cctaacttca agtctaactt cgatctcgct gaggatgcaa 900

agctccagct ctcaaaggat acctacgatg atgatctcga taacctcctc gctcagatcg 960

gagatcagta cgctgatttg ttcctcgctg ctaagaacct ctctgatgct atcctcctca 1020

gtgatatcct cagagtgaac accgagatca ccaaggctcc actctcagct tctatgatca 1080

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tcccagagaa gtacaaagag attttcttcg atcagtctaa gaacggatac gctggttaca 1200

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agcaaaagaa ggctatcgtt gatctcttgt tcaagaccaa cagaaaggtg accgtgaagc 1800

agctcaaaga ggattacttc aagaaaatcg agtgcttcga ttcagttgag atttctggtg 1860

ttgaggatag gttcaacgca tctctcggaa cctaccacga tctcctcaag atcattaagg 1920

ataaggattt cttggataac gaggaaaacg aggatatctt ggaggatatc gttcttaccc 1980

tcaccctctt tgaagataga gagatgattg aagaaaggct caagacctac gctcatctct 2040

tcgatgataa ggtgatgaag cagttgaaga gaagaagata cactggttgg ggaaggctct 2100

caagaaagct cattaacgga atcagggata agcagtctgg aaagacaatc cttgatttcc 2160

tcaagtctga tggattcgct aacagaaact tcatgcagct catccacgat gattctctca 2220

cctttaaaga ggatatccag aaggctcagg tttcaggaca gggtgatagt ctccatgagc 2280

atatcgctaa cctcgctgga tctcctgcaa tcaagaaggg aatcctccag actgtgaagg 2340

ttgtggatga gttggtgaag gtgatgggaa ggcataagcc tgagaacatc gtgatcgaaa 2400

tggctagaga gaaccagacc actcagaagg gacagaagaa ctctagggaa aggatgaaga 2460

ggatcgagga aggtatcaaa gagcttggat ctcagatcct caaagagcac cctgttgaga 2520

acactcagct ccagaatgag aagctctacc tctactacct ccagaacgga agggatatgt 2580

atgtggatca agagttggat atcaacaggc tctctgatta cgatgttgat catatcgtgc 2640

cacagtcatt cttgaaggat gattctatcg ataacaaggt gctcaccagg tctgataaga 2700

acaggggtaa gagtgataac gtgccaagtg aagaggttgt gaagaaaatg aagaactatt 2760

ggaggcagct cctcaacgct aagctcatca ctcagagaaa gttcgataac ttgactaagg 2820

ctgagagggg aggactctct gaattggata aggcaggatt catcaagagg cagcttgtgg 2880

aaaccaggca gatcactaag cacgttgcac agatcctcga ttctaggatg aacaccaagt 2940

acgatgagaa cgataagttg atcagggaag tgaaggttat caccctcaag tcaaagctcg 3000

tgtctgattt cagaaaggat ttccaattct acaaggtgag ggaaatcaac aactaccacc 3060

acgctcacga tgcttacctt aacgctgttg ttggaaccgc tctcatcaag aagtatccta 3120

agctcgagtc agagttcgtg tacggtgatt acaaggtgta cgatgtgagg aagatgatcg 3180

ctaagtctga gcaagagatc ggaaaggcta ccgctaagta tttcttctac tctaacatca 3240

tgaatttctt caagaccgag attaccctcg ctaacggtga gatcagaaag aggccactca 3300

tcgagacaaa cggtgaaaca ggtgagatcg tgtgggataa gggaagggat ttcgctaccg 3360

ttagaaaggt gctctctatg ccacaggtga acatcgttaa gaaaaccgag gtgcagaccg 3420

gtggattctc taaagagtct atcctcccta agaggaactc tgataagctc attgctagga 3480

agaaggattg ggaccctaag aaatacggtg gtttcgattc tcctaccgtg gcttactctg 3540

ttctcgttgt ggctaaggtt gagaagggaa agagtaagaa gctcaagtct gttaaggaac 3600

ttctcggaat cactatcatg gaaaggtcat ctttcgagaa gaacccaatc gatttcctcg 3660

aggctaaggg atacaaagag gttaagaagg atctcatcat caagctccca aagtactcac 3720

tcttcgaact cgagaacggt agaaagagga tgctcgcttc tgctggtgag cttcaaaagg 3780

gaaacgagct tgctctccca tctaagtacg ttaactttct ttacctcgct tctcactacg 3840

agaagttgaa gggatctcca gaagataacg agcagaagca acttttcgtt gagcagcaca 3900

agcactactt ggatgagatc atcgagcaga tctctgagtt ctctaaaagg gtgatcctcg 3960

ctgatgcaaa cctcgataag gtgttgtctg cttacaacaa gcacagagat aagcctatca 4020

gggaacaggc agagaacatc atccatctct tcacccttac caacctcggt gctcctgctg 4080

ctttcaagta cttcgataca accatcgata ggaagagata cacctctacc aaagaagtgc 4140

tcgatgctac cctcatccat cagtctatca ctggactcta cgagactagg atcgatctct 4200

cacagctcgg tggtgattca agggctgatc ctaagaagaa gaggaaggtt tgaacccagc 4260

tttcttgtac aaagtggggg ttcgaaatcg ataagcttgg atcctctaga gtcctgcttt 4320

aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca tgatatttgc tttcaattct gttgtgcacg 4380

ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag atccttaccg ccggtttcgg ttcattctaa 4440

tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt caatttactg 4500

attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt gtgctgaata 4560

ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt tttattatta 4620

caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac cggtcaaacc taaaagactg attacataaa 4680

tcttattcaa atttcaaaag gccccagggg ctagtatcta cgacacaccg agcggcgaac 4740

taataacgtt cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc gcgcatgggt gagattcctt 4800

gaagttgagt attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg gcaccattca acccggtcca 4860

gcacggcggc cgggtaaccg acttgctgcc ccgagaatta tgcagcattt ttttggtgta 4920

tgtgggcccc aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg acgacaaatc gttgggcggg 4980

tccagggcga attttgcgac aacatgtcga ggctcagcag gacctgcagg catgcaagct 5040

agcttactag tgatgcatat tctatagtgt cacctaaatc tgcggccgca ctagtgatat 5100

cccgcggcca tggcggccgg gagcatgcga cgtcgggccc aattcgccct atagtgagtc 5160

gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 5220

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 5280

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaaac 5340

gttaatgggt ttctggagtt taatgagcta agcacatacg tcagaaacca ttattgcgcg 5400

ttcaaaagtc gcctaaggtc actatcagct agcaaatatt tcttgtcaaa aatgctccac 5460

tgacgttcca taaattcccc tcggtatcca attagagtct catattcact ctcaatccaa 5520

ataatctgca atggcaatta ccttatccgc aacttcttta cctatttccg cccggatccg 5580

ggcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 5640

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 5700

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 5760

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 5820

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 5880

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 5940

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 6000

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 6060

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 6120

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 6180

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 6240

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 6300

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact 6360

ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc 6420

accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg 6480

atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccgatcc aacacttacg 6540

tttgcaacgt ccaagagcaa atagaccacg aacgccggaa ggttgccgca gcgtgtggat 6600

tgcgtctcaa ttctctcttg caggaatgca atgatgaata tgatactgac tatgaaactt 6660

tgagggaata ctgcctagca ccgtcacctc ataacgtgca tcatgcatgc cctgacaaca 6720

tggaacatcg ctatttttct gaagaattat gctcgttgga ggatgtcgcg gcaattgcag 6780

ctattgccaa catcgaacta cccctcacgc atgcattcat caatattatt catgcgggga 6840

aaggcaagat taatccaact ggcaaatcat ccagcgtgat tggtaacttc agttccagcg 6900

acttgattcg ttttggtgct acccacgttt tcaataagga cgagatggtg gagtaaagaa 6960

ggagtgcgtc gaagcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 7020

tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 7080

aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 7140

attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 7200

gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg aattaattca gtacattaaa aacgtccgca 7260

atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag 7320

ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc 7380

catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact ttgctcatgt 7440

taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg tttgaaacac ggatgatctc 7500

gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt gctgcctgtg atcaaatatc 7560

atctccctcg cagagatccg aattatcagc cttcttattc atttctcgct taaccgtgac 7620

aggctgtcga tcttgagaac tatgccgaca taataggaaa tcgctggata aagccgctga 7680

ggaagctgag tggcgctatt tctttagaag tgaacgttga cgatgtcgac ggatcttttc 7740

cgctgcataa ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt tcggtatatc catccttttt 7800

cgcacgatat acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg 7860

gcgtcagccg ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg agcgggtgtt ccttcttcac 7920

tgtcccttat tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag gctggccggc 7980

taccgccggc gtaacagatg agggcaagcg gatggctgat gaaaccaagc caaccagggg 8040

tgatgctgcc aacttactga tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt 8100

ctgtttctat cagctgtccc tcctgttcag ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa 8160

gcaccgccgg acatcagcgc tatctctgct ctcactgccg taaaacatgg caactgcagt 8220

tcacttacac cgcttctcaa cccggtacgc accagaaaat cattgatatg gccatgaatg 8280

gcgttggatg ccgggcaaca gcccgcatta tgggcgttgg cctcaacacg attttacgtc 8340

acttaaaaaa ctcaggccgc agtcggtaac ctcgcgcata cagccgggca gtgacgtcat 8400

cgtctgcgcg gaaatggacg aacagtgggg ctatgtcggg gctaaatcgc gccagcgctg 8460

gctgttttac gcgtatgaca gtctccggaa gacggttgtt gcgcacgtat tcggtgaacg 8520

cactatggcg acgctggggc gtcttatgag cctgctgtca ccctttgacg tggtgatatg 8580

gatgacggat ggctggccgc tgtatgaatc ccgcctgaag ggaaagctgc acgtaatcag 8640

caagcgatat acgcagcgaa ttgagcggca taacctgaat ctgaggcagc acctggcacg 8700

gctgggacgg aagtcgctgt cgttctcaaa atcggtggag ctgcatgaca aagtcatcgg 8760

gcattatctg aacataaaac actatcaata agttggagtc attacccaac caggaagggc 8820

agcccaccta tcaaggtgta ctgccttcca gacgaacgaa gagcgattga ggaaaaggcg 8880

gcggcggccg gcatgagcct gtcggcctac ctgctggccg tcggccaggg ctacaaaatc 8940

acgggcgtcg tggactatga gcacgtccgc gagctggccc gcatcaatgg cgacctgggc 9000

cgcctgggcg gcctgctgaa actctggctc accgacgacc cgcgcacggc gcggttcggt 9060

gatgccacga tcctcgccct gctggcgaag atcgaagaga agcaggacga gcttggcaag 9120

gtcatgatgg gcgtggtccg cccgagggca gagccatgac ttttttagcc gctaaaacgg 9180

ccggggggtg cgcgtgattg ccaagcacgt ccccatgcgc tccatcaaga agagcgactt 9240

cgcggagctg gtattcgtgc agggcaagat tcggaatacc aagtacgaga aggacggcca 9300

gacggtctac gggaccgact tcattgccga taaggtggat tatctggaca ccaaggcacc 9360

aggcgggtca aatcaggaat aagggcacat tgccccggcg tgagtcgggg caatcccgca 9420

aggagggtga atgaatcgga cgtttgaccg gaaggcatac aggcaagaac tgatcgacgc 9480

ggggttttcc gccgaggatg ccgaaaccat cgcaagccgc accgtcatgc gtgcgccccg 9540

cgaaaccttc cagtccgtcg gctcgatggt ccagcaagct acggccaaga tcgagcgcga 9600

cagcgtgcaa ctggctcccc ctgccctgcc cgcgccatcg gccgccgtgg agcgttcgcg 9660

tcgtctcgaa caggaggcgg caggtttggc gaagtcgatg accatcgaca cgcgaggaac 9720

tatgacgacc aagaagcgaa aaaccgccgg cgaggacctg gcaaaacagg tcagcgaggc 9780

caagcaggcc gcgttgctga aacacacgaa gcagcagatc aaggaaatgc agctttcctt 9840

gttcgatatt gcgccgtggc cggacacgat gcgagcgatg ccaaacgaca cggcccgctc 9900

tgccctgttc accacgcgca acaagaaaat cccgcgcgag gcgctgcaaa acaaggtcat 9960

tttccacgtc aacaaggacg tgaagatcac ctacaccggc gtcgagctgc gggccgacga 10020

tgacgaactg gtgtggcagc aggtgttgga gtacgcgaag cgcaccccta tcggcgagcc 10080

gatcaccttc acgttctacg agctttgcca ggacctgggc tggtcgatca atggccggta 10140

ttacacgaag gccgaggaat gcctgtcgcg cctacaggcg acggcgatgg gcttcacgtc 10200

cgaccgcgtt gggcacctgg aatcggtgtc gctgctgcac cgcttccgcg tcctggaccg 10260

tggcaagaaa acgtcccgtt gccaggtcct gatcgacgag gaaatcgtcg tgctgtttgc 10320

tggcgaccac tacacgaaat tcatatggga gaagtaccgc aagctgtcgc cgacggcccg 10380

acggatgttc gactatttca gctcgcaccg ggagccgtac ccgctcaagc tggaaacctt 10440

ccgcctcatg tgcggatcgg attccacccg cgtgaagaag tggcgcgagc aggtcggcga 10500

agcctgcgaa gagttgcgag gcagcggcct ggtggaacac gcctgggtca atgatgacct 10560

ggtgcattgc aaacgctagg gccttgtggg gtcagttccg gctgggggtt cagcagccag 10620

cgctttactg gcatttcagg aacaagcggg cactgctcga cgcacttgct tcgctcagta 10680

tcgctcggga cgcacggcgc gctctacgaa ctgccgataa acagaggatt aaaattgaca 10740

attgtgatta aggctcagat tcgacggctt ggagcggccg acgtgcagga tttccgcgag 10800

atccgattgt cggccctgaa gaaagctcca gagatgttcg ggtccgttta cgagcacgag 10860

gagaaaaagc ccatggaggc gttcgctgaa cggttgcgag atgccgtggc attcggcgcc 10920

tacatcgacg gcgagatcat tgggctgtcg gtcttcaaac aggaggacgg ccccaaggac 10980

gctcacaagg cgcatctgtc cggcgttttc gtggagcccg aacagcgagg ccgaggggtc 11040

gccggtatgc tgctgcgggc gttgccggcg ggtttattgc tcgtgatgat cgtccgacag 11100

attccaacgg gaatctggtg gatgcgcatc ttcatcctcg gcgcacttaa tatttcgcta 11160

ttctggagct tgttgtttat ttcggtctac cgcctgccgg gcggggtcgc ggcgacggta 11220

ggcgctgtgc agccgctgat ggtcgtgttc atctctgccg ctctgctagg tagcccgata 11280

cgattgatgg cggtcctggg ggctatttgc ggaactgcgg gcgtggcgct gttggtgttg 11340

acaccaaacg cagcgctaga tcctgtcggc gtcgcagcgg gcctggcggg ggcggtttcc 11400

atggcgttcg gaaccgtgct gacccgcaag tggcaacctc ccgtgcctct gctcaccttt 11460

accgcctggc aactggcggc cggaggactt ctgctcgttc cagtagcttt agtgtttgat 11520

ccgccaatcc cgatgcctac aggaaccaat gttctcggcc tggcgtggct cggcctgatc 11580

ggagcgggtt taacctactt cctttggttc cgggggatct cgcgactcga acctacagtt 11640

gtttccttac tgggctttct cagccgggat ggcgctaaga agctattgcc gccgatcttc 11700

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 11760

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 11820

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 11880

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 11940

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 12000

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 12060

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 12120

tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 12180

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 12240

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 12300

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 12360

actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 12420

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 12480

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atatcaagaa gatcctttga 12540

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 12600

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 12660

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 12720

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 12780

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 12840

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 12900

gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaaacaa gtggcagcaa 12960

cggattcgca aacctgtcac gccttttgtg ccaaaagccg cgccaggttt gcgatccgct 13020

gtgccaggcg ttaggcgtca tatgaagatt tcggtgatcc ctgagcaggt ggcggaaaca 13080

ttggatgctg agaaccattt cattgttcgt gaagtgttcg atgtgcacct atccgaccaa 13140

ggctttgaac tatctaccag aagtgtgagc ccctaccgga aggattacat ctcggatgat 13200

gactctgatg aagactctgc ttgctatggc gcattcatcg accaagagct tgtcgggaag 13260

attgaactca actcaacatg gaacgatcta gcctctatcg aacacattgt tgtgtcgcac 13320

acgcaccgag gcaaaggagt cgcgcacagt ctcatcgaat ttgcgaaaaa gtgggcacta 13380

agcagacagc tccttggcat acgattagag acacaaacga acaatgtacc tgcctgcaat 13440

ttgtacgcaa aatgtggctt tactctcggc ggcattgacc tgttcacgta taaaactaga 13500

cctcaagtct cgaacgaaac agcgatgtac tggtactggt tctcgggagc acaggatgac 13560

gcctaacaat tcattcaagc cgacaccgct tcgcggcgcg gcttaattca ggagttaaac 13620

atcatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc 13680

atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat 13740

ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat 13800

gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag 13860

agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg 13920

cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca 13980

ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga 14040

gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa 14100

caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg 14160

gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc 14220

ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag 14280

tatcagcccg tcatacttga agctaggcag gcttatcttg gacaagaaga tcgcttggcc 14340

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtt cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 14400

gtcggcaaat aatgtctaac aattcgttca agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaac 14460

tcaagcgtta gagagctggg gaagactatg cgcgatctgt tgaaggtggt tctaagcctc 14520

gtacttgcga tggcatcggg gcaggcactt gctgacctgc caattgtttt agtggatgaa 14580

gctcgtcttc cctatgacta ctccccatcc aactacgaca tttctccaag caactacgac 14640

aactccataa gcaattacga caatagtcca tcaaattacg acaactctga gagcaactac 14700

gataatagtt catccaatta cgacaatagt cgcaacggaa atcgtaggct tatatatagc 14760

gcaaatgggt ctcgcacttt cgccggctac tacgtcattg ccaacaatgg gacaacgaac 14820

ttcttttcca catctggcaa aaggatgttc tacaccccaa aaggggggcg cggcgtctat 14880

ggcggcaaag atgggagctt ctgcggggca ttggtcgtca taaatggcca attttcgctt 14940

gccctgacag ataacggcct gaagatcatg tatctaagca actagcctgc tctctaataa 15000

aatgttagga gcttggctgc catttttggg gtgaggccgt tcgcggccga ggggcgcagc 15060

ccctgggggg atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag ggggggcacc 15120

ccccttcggc gtgcgcggtc acgcgccagg gcgcagccct ggttaaaaac aaggtttata 15180

aatattggtt taaaagcagg ttaaaagaca ggttagcggt ggccgaaaaa cgggcggaaa 15240

cccttgcaaa tgctggattt tctgcctgtg gacagcccct caaatgtcaa taggtgcgcc 15300

cctcatctgt cagcactctg cccctcaagt gtcaaggatc gcgcccctca tctgtcagta 15360

gtcgcgcccc tcaagtgtca ataccgcagg gcacttatcc ccaggcttgt ccacatcatc 15420

tgtgggaaac tcgcgtaaaa tcaggcgttt tcgccgattt gcgaggctgg ccagctccac 15480

gtcgccggcc gaaatcgagc ctgcccctca tctgtcaacg ccgcgccggg tgagtcggcc 15540

cctcaagtgt caacgtccgc ccctcatctg tcagtgaggg ccaagttttc cgcgaggtat 15600

ccacaacgcc ggcggccggc cgcggtgtct cgcacacggc ttcgacggcg tttctggcgc 15660

gtttgcaggg ccatagacgg ccgccagccc agcggcgagg gcaaccagcc cggtgagcgt 15720

cggaaagggt cgacatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc 15780

ggattgaagg cgagatccag caactcgcgc cagatcatcc tgtgacggaa ctttggcgcg 15840

tgatgactgg ccaggacgtc ggccgaaaga gcgacaagca gatcacgatt ttcgacagcg 15900

tcggatttgc gatcgaggat ttttcggcgc tgcgctacgt ccgcgaccgc gttgagggat 15960

caagccacag cagcccactc gaccttctag ccgacccaga cgagccaagg gatctttttg 16020

gaatgctgct ccgtcgtcag gctttccgac gtttgggtgg ttgaacagaa gtcattatcg 16080

tacggaatgc cagcactccc gaggggaacc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg 16140

aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgttat tctaataaac gctcttttct 16200

cttaggttta cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa 16260

acgacaatct gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg ttatgacccc cgccgatgac 16320

gcgggacaag ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgattgaa ggagccactc 16380

agccccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 16440

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 16500

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 16560

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctatt 16620

taggtgacac tatagaatac tcaagctatg catccaacgc gttgggagct ctcccatatc 16680

gacctgcagg cggccgctcg acgaattaat tccaatccca caaaaatctg agcttaacag 16740

cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac cctcatatca actactacgt 16800

tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac 16860

aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa atttgccact attacagagg caagagcagc 16920

agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga 16980

agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc 17040

ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc cagcagtgat ccagccccaa aagagatctc 17100

ctttgccccg gagattacaa tggacgattt cctctatctt tacgatctag gaaggaagtt 17160

cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac cactgataat gagaaggtta gcctcttcaa 17220

tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt tagagaggcc tacgcagcag gtctcatcaa 17280

gacgatctac ccgagtaaca atctccagga gatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga 17340

tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat caagaacaca gagaaagaca tatttctcaa 17400

gatcagaagt actattccag tatggacgat tcaaggcttg cttcataaac caaggcaagt 17460

aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt tcctactgaa tctaaggcca tgcatggagt 17520

ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac 17580

agagtctttt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca 17640

ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga 17700

cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 17760

acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 17820

aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 17880

ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 17940

gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 18000

cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctcgagg aattcggtac 18060

ccc 18063

<210> 60

<211> 12150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6-26 启动子 Ps#1 gRNA

<400> 60

acctagggag ctctcccata tcgacctgca ggcggccgca ctagtgatat cccgcggcca 60

tggcggccgg gagcatgcga cgtcgggccc aattcgccct atagtgagtc gtattacaat 120

tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 180

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 240

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaaac gttaatgggt 300

ttctggagtt taatgagcta agcacatacg tcagaaacca ttattgcgcg ttcaaaagtc 360

gcctaaggtc actatcagct agcaaatatt tcttgtcaaa aatgctccac tgacgttcca 420

taaattcccc tcggtatcca attagagtct catattcact ctcaatccaa ataatctgca 480

atggcaatta ccttatccgc aacttcttta cctatttccg cccggatccg ggcaggttct 540

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 600

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gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 720

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ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 840

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 900

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 960

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 1020

gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1080

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1140

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1200

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1260

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 1320

aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 1380

tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 1440

gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccgatcc aacacttacg tttgcaacgt 1500

ccaagagcaa atagaccacg aacgccggaa ggttgccgca gcgtgtggat tgcgtctcaa 1560

ttctctcttg caggaatgca atgatgaata tgatactgac tatgaaactt tgagggaata 1620

ctgcctagca ccgtcacctc ataacgtgca tcatgcatgc cctgacaaca tggaacatcg 1680

ctatttttct gaagaattat gctcgttgga ggatgtcgcg gcaattgcag ctattgccaa 1740

catcgaacta cccctcacgc atgcattcat caatattatt catgcgggga aaggcaagat 1800

taatccaact ggcaaatcat ccagcgtgat tggtaacttc agttccagcg acttgattcg 1860

ttttggtgct acccacgttt tcaataagga cgagatggtg gagtaaagaa ggagtgcgtc 1920

gaagcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt 1980

cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg 2040

taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt 2100

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tcatctatgt tactagatcg aattaattca gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt 2220

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tggcgctatt tctttagaag tgaacgttga cgatgtcgac ggatcttttc cgctgcataa 2700

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acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg 2820

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tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag gctggccggc taccgccggc 2940

gtaacagatg agggcaagcg gatggctgat gaaaccaagc caaccagggg tgatgctgcc 3000

aacttactga tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt ctgtttctat 3060

cagctgtccc tcctgttcag ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa gcaccgccgg 3120

acatcagcgc tatctctgct ctcactgccg taaaacatgg caactgcagt tcacttacac 3180

cgcttctcaa cccggtacgc accagaaaat cattgatatg gccatgaatg gcgttggatg 3240

ccgggcaaca gcccgcatta tgggcgttgg cctcaacacg attttacgtc acttaaaaaa 3300

ctcaggccgc agtcggtaac ctcgcgcata cagccgggca gtgacgtcat cgtctgcgcg 3360

gaaatggacg aacagtgggg ctatgtcggg gctaaatcgc gccagcgctg gctgttttac 3420

gcgtatgaca gtctccggaa gacggttgtt gcgcacgtat tcggtgaacg cactatggcg 3480

acgctggggc gtcttatgag cctgctgtca ccctttgacg tggtgatatg gatgacggat 3540

ggctggccgc tgtatgaatc ccgcctgaag ggaaagctgc acgtaatcag caagcgatat 3600

acgcagcgaa ttgagcggca taacctgaat ctgaggcagc acctggcacg gctgggacgg 3660

aagtcgctgt cgttctcaaa atcggtggag ctgcatgaca aagtcatcgg gcattatctg 3720

aacataaaac actatcaata agttggagtc attacccaac caggaagggc agcccaccta 3780

tcaaggtgta ctgccttcca gacgaacgaa gagcgattga ggaaaaggcg gcggcggccg 3840

gcatgagcct gtcggcctac ctgctggccg tcggccaggg ctacaaaatc acgggcgtcg 3900

tggactatga gcacgtccgc gagctggccc gcatcaatgg cgacctgggc cgcctgggcg 3960

gcctgctgaa actctggctc accgacgacc cgcgcacggc gcggttcggt gatgccacga 4020

tcctcgccct gctggcgaag atcgaagaga agcaggacga gcttggcaag gtcatgatgg 4080

gcgtggtccg cccgagggca gagccatgac ttttttagcc gctaaaacgg ccggggggtg 4140

cgcgtgattg ccaagcacgt ccccatgcgc tccatcaaga agagcgactt cgcggagctg 4200

gtattcgtgc agggcaagat tcggaatacc aagtacgaga aggacggcca gacggtctac 4260

gggaccgact tcattgccga taaggtggat tatctggaca ccaaggcacc aggcgggtca 4320

aatcaggaat aagggcacat tgccccggcg tgagtcgggg caatcccgca aggagggtga 4380

atgaatcgga cgtttgaccg gaaggcatac aggcaagaac tgatcgacgc ggggttttcc 4440

gccgaggatg ccgaaaccat cgcaagccgc accgtcatgc gtgcgccccg cgaaaccttc 4500

cagtccgtcg gctcgatggt ccagcaagct acggccaaga tcgagcgcga cagcgtgcaa 4560

ctggctcccc ctgccctgcc cgcgccatcg gccgccgtgg agcgttcgcg tcgtctcgaa 4620

caggaggcgg caggtttggc gaagtcgatg accatcgaca cgcgaggaac tatgacgacc 4680

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gcgttgctga aacacacgaa gcagcagatc aaggaaatgc agctttcctt gttcgatatt 4800

gcgccgtggc cggacacgat gcgagcgatg ccaaacgaca cggcccgctc tgccctgttc 4860

accacgcgca acaagaaaat cccgcgcgag gcgctgcaaa acaaggtcat tttccacgtc 4920

aacaaggacg tgaagatcac ctacaccggc gtcgagctgc gggccgacga tgacgaactg 4980

gtgtggcagc aggtgttgga gtacgcgaag cgcaccccta tcggcgagcc gatcaccttc 5040

acgttctacg agctttgcca ggacctgggc tggtcgatca atggccggta ttacacgaag 5100

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gggcacctgg aatcggtgtc gctgctgcac cgcttccgcg tcctggaccg tggcaagaaa 5220

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tacacgaaat tcatatggga gaagtaccgc aagctgtcgc cgacggcccg acggatgttc 5340

gactatttca gctcgcaccg ggagccgtac ccgctcaagc tggaaacctt ccgcctcatg 5400

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gcatttcagg aacaagcggg cactgctcga cgcacttgct tcgctcagta tcgctcggga 5640

cgcacggcgc gctctacgaa ctgccgataa acagaggatt aaaattgaca attgtgatta 5700

aggctcagat tcgacggctt ggagcggccg acgtgcagga tttccgcgag atccgattgt 5760

cggccctgaa gaaagctcca gagatgttcg ggtccgttta cgagcacgag gagaaaaagc 5820

ccatggaggc gttcgctgaa cggttgcgag atgccgtggc attcggcgcc tacatcgacg 5880

gcgagatcat tgggctgtcg gtcttcaaac aggaggacgg ccccaaggac gctcacaagg 5940

cgcatctgtc cggcgttttc gtggagcccg aacagcgagg ccgaggggtc gccggtatgc 6000

tgctgcgggc gttgccggcg ggtttattgc tcgtgatgat cgtccgacag attccaacgg 6060

gaatctggtg gatgcgcatc ttcatcctcg gcgcacttaa tatttcgcta ttctggagct 6120

tgttgtttat ttcggtctac cgcctgccgg gcggggtcgc ggcgacggta ggcgctgtgc 6180

agccgctgat ggtcgtgttc atctctgccg ctctgctagg tagcccgata cgattgatgg 6240

cggtcctggg ggctatttgc ggaactgcgg gcgtggcgct gttggtgttg acaccaaacg 6300

cagcgctaga tcctgtcggc gtcgcagcgg gcctggcggg ggcggtttcc atggcgttcg 6360

gaaccgtgct gacccgcaag tggcaacctc ccgtgcctct gctcaccttt accgcctggc 6420

aactggcggc cggaggactt ctgctcgttc cagtagcttt agtgtttgat ccgccaatcc 6480

cgatgcctac aggaaccaat gttctcggcc tggcgtggct cggcctgatc ggagcgggtt 6540

taacctactt cctttggttc cgggggatct cgcgactcga acctacagtt gtttccttac 6600

tgggctttct cagccgggat ggcgctaaga agctattgcc gccgatcttc atatgcggtg 6660

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 6720

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ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 6840

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 6900

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 6960

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7020

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7080

tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7140

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7200

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7260

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7320

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7380

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 7440

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atatcaagaa gatcctttga tcttttctac 7500

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 7560

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 7620

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 7680

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 7740

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 7800

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 7860

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaaacaa gtggcagcaa cggattcgca 7920

aacctgtcac gccttttgtg ccaaaagccg cgccaggttt gcgatccgct gtgccaggcg 7980

ttaggcgtca tatgaagatt tcggtgatcc ctgagcaggt ggcggaaaca ttggatgctg 8040

agaaccattt cattgttcgt gaagtgttcg atgtgcacct atccgaccaa ggctttgaac 8100

tatctaccag aagtgtgagc ccctaccgga aggattacat ctcggatgat gactctgatg 8160

aagactctgc ttgctatggc gcattcatcg accaagagct tgtcgggaag attgaactca 8220

actcaacatg gaacgatcta gcctctatcg aacacattgt tgtgtcgcac acgcaccgag 8280

gcaaaggagt cgcgcacagt ctcatcgaat ttgcgaaaaa gtgggcacta agcagacagc 8340

tccttggcat acgattagag acacaaacga acaatgtacc tgcctgcaat ttgtacgcaa 8400

aatgtggctt tactctcggc ggcattgacc tgttcacgta taaaactaga cctcaagtct 8460

cgaacgaaac agcgatgtac tggtactggt tctcgggagc acaggatgac gcctaacaat 8520

tcattcaagc cgacaccgct tcgcggcgcg gcttaattca ggagttaaac atcatgaggg 8580

aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc 8640

atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga 8700

agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc 8760

ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc 8820

tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg cgttatccag 8880

ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg 8940

agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg 9000

ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat 9060

ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg 9120

agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg 9180

cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg 9240

tcatacttga agctaggcag gcttatcttg gacaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag 9300

atcagttgga agaatttgtt cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat 9360

aatgtctaac aattcgttca agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaac tcaagcgtta 9420

gagagctggg gaagactatg cgcgatctgt tgaaggtggt tctaagcctc gtacttgcga 9480

tggcatcggg gcaggcactt gctgacctgc caattgtttt agtggatgaa gctcgtcttc 9540

cctatgacta ctccccatcc aactacgaca tttctccaag caactacgac aactccataa 9600

gcaattacga caatagtcca tcaaattacg acaactctga gagcaactac gataatagtt 9660

catccaatta cgacaatagt cgcaacggaa atcgtaggct tatatatagc gcaaatgggt 9720

ctcgcacttt cgccggctac tacgtcattg ccaacaatgg gacaacgaac ttcttttcca 9780

catctggcaa aaggatgttc tacaccccaa aaggggggcg cggcgtctat ggcggcaaag 9840

atgggagctt ctgcggggca ttggtcgtca taaatggcca attttcgctt gccctgacag 9900

ataacggcct gaagatcatg tatctaagca actagcctgc tctctaataa aatgttagga 9960

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atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag ggggggcacc ccccttcggc 10080

gtgcgcggtc acgcgccagg gcgcagccct ggttaaaaac aaggtttata aatattggtt 10140

taaaagcagg ttaaaagaca ggttagcggt ggccgaaaaa cgggcggaaa cccttgcaaa 10200

tgctggattt tctgcctgtg gacagcccct caaatgtcaa taggtgcgcc cctcatctgt 10260

cagcactctg cccctcaagt gtcaaggatc gcgcccctca tctgtcagta gtcgcgcccc 10320

tcaagtgtca ataccgcagg gcacttatcc ccaggcttgt ccacatcatc tgtgggaaac 10380

tcgcgtaaaa tcaggcgttt tcgccgattt gcgaggctgg ccagctccac gtcgccggcc 10440

gaaatcgagc ctgcccctca tctgtcaacg ccgcgccggg tgagtcggcc cctcaagtgt 10500

caacgtccgc ccctcatctg tcagtgaggg ccaagttttc cgcgaggtat ccacaacgcc 10560

ggcggccggc cgcggtgtct cgcacacggc ttcgacggcg tttctggcgc gtttgcaggg 10620

ccatagacgg ccgccagccc agcggcgagg gcaaccagcc cggtgagcgt cggaaagggt 10680

cgacatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggattgaagg 10740

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cagcactccc gaggggaacc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg aacggataaa 11100

ccttttcacg cccttttaaa tatccgttat tctaataaac gctcttttct cttaggttta 11160

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gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 11520

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctatt taggtgacac 11580

tatagaatac tcaagctatg catccaacgc gttgggagct ccctaggctt tttttcttct 11640

tcttcgttca tacagttttt ttttgtttat cagcttacat tttcttgaac cgtagctttc 11700

gttttcttct ttttaacttt ccattcggag tttttgtatc ttgtttcata gtttgtccca 11760

ggattagaat gattaggcat cgaaccttca agaatttgat tgaataaaac atcttcattc 11820

ttaagatatg aagataatct tcaaaaggcc cctgggaatc tgaaagaaga gaagcaggcc 11880

catttatatg ggaaagaaca atagtatttc ttatataggc ccatttaagt tgaaaacaat 11940

cttcaaaagt cccacatcgc ttagataaga aaacgaagct gagtttatat acagctagag 12000

tcgaagtagt gattgaatgt ctgttgcctt gttagtttta gagctagaaa tagcaagtta 12060

aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcta 12120

gacccagctt tcttgtacaa agttggcatt 12150

<210> 61

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA分子等位基因特异性DSB +等位基因修复

<400> 61

ggagcgtata taatgctgct tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttt 104

<210> 62

<211> 13688

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R1 质粒

<400> 62

ggagcaacct tattttgtac tttaaaaaat tcattttttt tattttttcg actttaaagc 60

caaaattatc ctttatttat gaaagtggat gtatttttat ccctttaata taaggttgag 120

ttttctttaa gtttgtaatg ttaagtgggg cactttatat tagtccaatt aacagaattg 180

acttagaaat tgatggcgat tacttgaaaa aatcgctaca aaaacataat aaaataaaat 240

ttcatttgat ttttaaacca aaagaaaagt gacatgacta acgatttgat cccatcttct 300

ttttttttta agaaaaaaat taaaagaaaa atttattaaa ctggatgatt aattttaaca 360

taaaaattaa aaaaataaaa atcaatcgag ctcactattt gatattatta ttttcatctt 420

gatattgtta cttcatatca ctgaattata aaatgcgtta acggcaatta tcatagacgc 480

agactgaaag cataaaatta caactattcc atttttgttt tttttttgcc aacccaaaaa 540

aaactaataa tttatttaca taattataga aaattggaat ttattcatgt ttttggacca 600

ttcagataac cccacaataa aaaaaaagtg cacaaaagtg caaagtgcta cgtgtcctaa 660

ttatagccat actacatttg tgcataaaat tagccaccat tatttttaag attattcttt 720

ttcttgtttt aatttatatg ccacactttc ttattaatcc atcttaaaca gaatgacaca 780

ctttttattt gacaaatatt taatgacatt attaacattt tatcctcgtt agatttcact 840

tatttggtta aaggtggtgt acttttctaa tctaaaatca ttaattttag gtataatttt 900

agaacattgc aaagcctttt catatattta aacaatgtac ataattatgt aattatgtta 960

tgttatataa attgagacga aaaaaatatt atttatcagg tacgagtgtc actttacact 1020

agaggtgttt acggacagag acgaatccaa gatttgaact tcatggtgtc aagtatacac 1080

attgcttaga ttattaaatc aactttaggt ttcaattccg cacaaaatct ataaaacata 1140

acctttttaa aaataatttt actaatatta taaacatata ttattcattt ataatagttc 1200

tcgacgagtt tacatatttt caaaactgtc aattagaaca tcattactta tatttgtaaa 1260

tgtatcactt actacgtaac aaactaaaca aatcatttga atatcactca tcactcttat 1320

ttatatttta tttttttatc tacttcacca aagaaaatga taatttcaca attgcgattg 1380

ctaccagaaa aatatttact taatcaattt taaaaagatt aagtaataga aatatttttt 1440

attttattaa gaaaagagga ttttatcata tctaaatata aattaaagat gaagttacta 1500

tgatattatt taaaaagtaa atgacattat tctatttaaa ttacaaaatg agattaagaa 1560

aagtataact atttccattt ttttagctaa aaggatttca aaaaaaaaag taacaagaaa 1620

gagatttttt aaaaataata attttattag aaatatatat aaaaaattaa taatattcgt 1680

tagaaaaagt gaattttcaa aataataaag taataacacg aatactttta gggtcaaaca 1740

attaatagtg gagaatggag atatttttag tacaaattat ttatacaaaa tatctttatt 1800

caatgtgaca taattttaag ctatttttaa cacttttcca tcaaataaat aattaataac 1860

aaattattaa aaaatcaaag attaataaat taaattaatg aactataatt agttattaaa 1920

accaagccaa ctagaattaa atagaaaaaa ggaaatataa tcttcaaaat atgctttgtt 1980

gaagtataat tcctcgtcta tttaaagctt cggagattta aattggcaag cgaattacac 2040

aaagcaaatg aaactacacc ttttggttct gtgggtgtca tttgcttatt tataaacatt 2100

gtacatatat acacctatat gtatatcacg tttcgatcga agctcgtggg tggcgtggca 2160

cccataaatc gtagtagatt cgcccctgtt tacggatcga tttaggtcgg ttatagatca 2220

aaatcaaatc aatttaatta attttaccaa tcaaaccaaa tcaaatatac tatacattta 2280

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agaaataaaa gaaacaattc attttaaaga ggaacaaaag aggcaagaac tcattcaaaa 2400

tgaaaaatac ttaaaatagc cgaatttata aaacttttta ttactaaatt tactgtgaat 2460

aaaactttta aattcaccat tttagcctag aagtaagaga gaaaaacatt tccaccaaga 2520

attgtcaaga atactcatat acatgaaacc aatatgataa atgttctctt caggacggtt 2580

cataaataaa ttatgataaa catatataag atatttaaaa taaaataaaa tatatatata 2640

taaaatttat cggttcgatt atttcttcaa ctttttaaat aaaatcaaag actatcaatt 2700

cttaagaatc ttagaacaaa ctaaaccaaa taaaattaaa cgatttaatc aacttaattt 2760

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aattggttga ttttcttatc aatatatata atttagtacc caattttccc aaaactaaat 2940

aaaatataga atatccacta aggtggttac acgtgtacac tcaaccaatg acggcacttc 3000

aaattcttga taacggtatc ttcccacctt catatatttc aacattttat tgttaaaata 3060

aaatcgcacg ctctatttta tctaaatttt atttatagaa ttatattaag tatgttatta 3120

ttaattttta cgtataaata tatttcatat taaaatcata taagttgaca tcactaagtt 3180

cgttggattt gcatgtagac ccaattattc agatactcaa catgactcat ttaatattgg 3240

attattgaaa tatttgtaat acattaagaa tataattgtt aactatttta atttttaatt 3300

atacgtaaat atcaaacaaa aatattaata tgatcgctat attagatgat aactataagg 3360

agcctacaca attaacacta tttaactcta ttctttgcat ttataaaaag ttactttagt 3420

cttaggttca caatgtcaaa atctaaacaa ctaaaaacga cgaggagtaa ggtttgcaac 3480

gacgataaca aggattaggc aacaattaga gttgtgaatt gtgagtatta actatacttt 3540

tactatatta ggcagaattt ttgcactcaa tgagtaactt gatttattta ttttttattt 3600

cgccctaaat tattggacaa gtcatatatt tgttttgaaa acattctttt attggctaaa 3660

tcgaaaattg aatcgttaaa gatcaaaaat caataacaaa tatcttattg gtttaacata 3720

tttaaaaata aaaaaccaat aaatctaact aataatattt aatacgaaaa cgaaatggac 3780

tgacacacat tcctaaattt ttggtcaaaa ttttttcata atttccctaa aatctaaaat 3840

attaaatatt tgacggaaac aaaaaattca cttttaataa attatttgaa ggactaaaac 3900

agtggaagaa tatatttaag aagctaattt gaacctagtg ccaaatataa agggaccatt 3960

tttgtcattt ttcaacttga aaatctacgt gtcttaatat aacaccaaag aattaatatt 4020

tactgaaaaa atgtaaaaat gaggatatgg attctgaatc actcaattcc aatcagcaaa 4080

aataaaataa aataaaataa aataaaattt aaaaaataat aataaatgct ataaaatgac 4140

caaaatgtgt ggagcaaaaa gtgcagaaaa aaccaacaaa ttgcattctc cattcttgga 4200

agtggccatt cttgatttct tgaaacaaag gtttgtttcc cttcacttct tgatatgtaa 4260

agttgcaatc tttataactt tctattgctt tgctagtgtt tttgttatat acagggggtg 4320

gagttagagg gtaagttacg catttagtcg taactttagt caaacttcgt aataatttag 4380

taagttaaaa tatattagaa attttcagaa ttcataaact ttaaatttta aattttgact 4440

tcgctttgtg tgactataca attacagaaa ttcagagtgg ccattgttga aagagagggt 4500

ggaatttgtg taagttttgt ttcctttcag ttcttgatat ataaagttgc aatctttaac 4560

attctttgtt cactttctat aggtttgcta ggttcggtta aattcagtag ctttagttta 4620

aaccctatgc ggaatagaga atgtgtaaac tttaaacttc aaattttggc tccgcatacg 4680

actagcgact atataataat aggaattgag cacttggctt ttgtatatag cttctatgtg 4740

taccaaaatt agaaaatcag gcgattatta taatcttgtt gactaaatat agaatgcatc 4800

cattaccccc aaaaagtgtg attccactgt cataggaggt tttttttatt tcattttatt 4860

tgtgctttca ataatgtaga gtagttttac aaagatcctt tctttgtgac acatggtagg 4920

taatattgct gattttgttg tagttttggg gttataaagt ttcaaattat ttatactgga 4980

gggtaggggt gggggttgtc tataatgcag gttatggttt tacgtgaact caataattat 5040

tgtagatact aagaaatcca ctcagtgttc ttgcggtgtc ttgcttttga tttcagcatc 5100

acttgtagtt gattgtgttt agattatcac attattctgt ggctgtaact gtatccttgt 5160

tagttgcttt gtttctacac tgttgttttc cctcttttat acctattttg atatgttgta 5220

ctcgaacgag ggtcatcggg gaacaacctc tttacctccg tgaggtagag ctatggtctg 5280

tgtccactct accctcccca gatccctctt gtaggatttc actatattgt aatattaact 5340

tgaggtcact ataggagctc aaaaacttct aattttgaat caatgtctgg ttatactttt 5400

tttgtcataa ctgtatctca aatgtggtgt ttggtttatc tcattttgca gaagtcaaga 5460

aacaggttac tcctgtttga gtgaggaaaa gttggtttgc ctgtctgtgg tctttttata 5520

atctttttct acagaagaga aagtgggtaa ttttgtttga gagtggaaat attctctagt 5580

gggaatctac taggagtaat ttattttcta taaactaagt aaagtttgga aggtgacaaa 5640

aagaaagaca aaaatcttgg aattgtttta gacaaccaag gttttcttgc tcagaatgtc 5700

tgttgccttg ttatgggttg tttctccttg tgacgtctca aatgggacaa gtttcatgga 5760

atcagtccgg gagggaaacc gtttttttga ttcatcgagg cataggaatt tggtgtccaa 5820

tgagagaatc aatagaggtg gtggaaagca aactaataat ggacggaaat tttctgtacg 5880

gtctgctatt ttggctactc catctggaga acggacgatg acatcggaac agatggtcta 5940

tgatgtggtt ttgaggcagg cagccttggt gaagaggcaa ctgagatcta ccaatgagtt 6000

agaagtgaag ccggatatac ctattccggg gaatttgggc ttgttgagtg aagcatatga 6060

taggtgtggt gaagtatgtg cagagtatgc aaagacgttt aacttaggtt agcttcttca 6120

atctattcat tcgtttacca aatattattt ggtaagcact aattatgaat atatatatgt 6180

tcatgttatt gatgaagaca aaatttgatc tttgtttgtt tattcaggaa ctatgctaat 6240

gactcccgag agaagaaggg ctatctgggc aatatatggt gaggtttcta gccatttaat 6300

aacagttacg cgcacaaaca catatgatta atcggggacg agaaaaaaag aaatgaagtt 6360

tgagttttga gggtcatatg taataggtaa atccgagctt gactagcttg agatgtttat 6420

tgtcatatca tgctcaatac taaccaaaac actgaaaaag aacttgatta tatttacata 6480

ctaatatttt catttgcgtt gctgttcaca tttttaccta tggaactggt ttttgtgatt 6540

tgttatactt catattcgat gttaataaaa tatatcattc ctcccttttt ctccacttca 6600

agctttactg tagtgttgaa aggggaaact ccttttaatg attgcatata taaacgaact 6660

tcttgagttg aatagtttct cattatgatc tgtttaaaca gtatggtgca gaagaacaga 6720

tgaacttgtt gatggcccaa acgcatcata tattaccccg gcagccttag ataggtggga 6780

aaataggcta gaagatgttt tcaatgggcg gccatttgac atgctcgatg gtgctttgtc 6840

cgatacagtt tctaactttc cagttgatat tcaggttagt ctaccaattc tatggtcttt 6900

atatttgttc aatttgcgtt tgatgtcact tttgctgagg gcttttctaa tagcttactt 6960

cagcctagcg gaaatgtttg tagttgaatc tctagttctg tctcctatat ctgtttctct 7020

cgtcctagat actacacata cttcatttct gttttaacat tttattcgtc ttttggtgtt 7080

gttttgtatg tgaatcatat atttggaaca gaatcattat tagttcacat gatttcattt 7140

gctttcttca atagcgtaat tgtctaacct tccaatatat gttgcagcca ttcagagata 7200

tgattgaagg aatgcgtatg gacttgagaa aatcgagata caaaaacttc gacgaactat 7260

acctttattg ttattatgtt gctggtacgg ttgggttgat gagtgttcca attatggcgc 7320

tgtcatgaga cgaattctga caggatatat tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt 7380

tattagaata atcggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta 7440

tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc 7500

tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt catctgaaaa cgacatgtcg 7560

cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc 7620

gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga accggagaca ttacgccatg 7680

aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac 7740

ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag 7800

atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga tgcttgacca cctacgccct 7860

ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg 7920

gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg 7980

gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag 8040

ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga 8100

ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag 8160

ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc 8220

tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg 8280

cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat 8340

gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca 8400

ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc 8460

acctctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg 8520

cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg 8580

tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatccga tgagtaaata 8640

aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 8700

aggcaagacg accatcggaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 8760

tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 8820

tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 8880

cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 8940

cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 9000

ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 9060

acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 9120

cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 9180

ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 9240

tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga 9300

ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 9360

agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 9420

tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 9480

accattaccg agctgctatc tgaatagatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 9540

ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 9600

aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 9660

cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 9720

gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg 9780

tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc 9840

ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 9900

cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 9960

ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 10020

tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 10080

ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 10140

tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 10200

acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 10260

ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 10320

acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 10380

gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 10440

tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 10500

tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 10560

gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 10620

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ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 10740

tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 10800

agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaagga ctctttcctg 10860

tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 10920

ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 10980

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gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt 11220

cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 11280

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gtgacggtca cagcttgtct gtaagcggat 11340

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 11400

gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 11460

agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 11520

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 11580

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 11640

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 11700

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 11760

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 11820

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 11880

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 11940

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 12000

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 12060

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 12120

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 12180

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 12240

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 12300

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 12360

actcacgtta agggattttg gtcatgcatt ctaggtgatt agaaaaactc atcgagcatc 12420

aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt 12480

ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 12540

cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa 12600

ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 12660

agtttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa 12720

tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag tcgaaatacg 12780

cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact 12840

gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 12900

gttttccctg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc 12960

ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 13020

acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc 13080

ccatacaatc ggtagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac 13140

ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc ttgagcaaga cgtttcccgt 13200

tgaatatggc tcataacaga acttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat 13260

accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa 13320

ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt 13380

atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta 13440

caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc 13500

gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg 13560

ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc 13620

cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa cataacgaat 13680

tcgtctca 13688

<210> 63

<211> 9902

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R2 质粒

<400> 63

ggagcaacct tattttgtac tttaaaaaat tcattttttt tattttttcg actttaaagc 60

caaaattatc ctttatttat gaaagtggat gtatttttat ccctttaata taaggttgag 120

ttttctttaa gtttgtaatg ttaagtgggg cactttatat tagtccaatt aacagaattg 180

acttagaaat tgatggcgat tacttgaaaa aatcgctaca aaaacataat aaaataaaat 240

ttcatttgat ttttaaacca aaagaaaagt gacatgacta acgatttgat cccatcttct 300

ttttttttta agaaaaaaat taaaagaaaa atttattaaa ctggatgatt aattttaaca 360

taaaaattaa aaaaataaaa atcaatcgag ctcactattt gatattatta ttttcatctt 420

gatattgtta cttcatatca ctgaattata aaatgcgtta acggcaatta tcatagacgc 480

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ctactaggag taatttattt tctataaact aagtaaagtt tggaaggtga caaaaagaaa 1860

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aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac 7440

tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 7500

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aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggccttgagc aagacgtttc ccgttgaata 9420

tggctcataa cagaacttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca 9480

agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa 9540

ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac 9600

ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca 9660

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gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacataac gaattcgtct 9900

ca 9902

<210> 64

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CaMV35S

<400> 64

ctcgacgaat taattccaat cccacaaaaa tctgagctta acagcacagt tgctcctctc 60

agagcagaat cgggtattca acaccctcat atcaactact acgttgtgta taacggtcca 120

catgccggta tatacgatga ctggggttgt acaaaggcgg caacaaacgg cgttcccgga 180

gttgcacaca agaaatttgc cactattaca gaggcaagag cagcagctga cgcgtacaca 240

acaagtcagc aaacagacag gttgaacttc atccccaaag gagaagctca actcaagccc 300

aagagctttg ctaaggccct aacaagccca ccaaagcaaa aagcccactg gctcacgcta 360

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gacactatgt tcaccactga taatgagaag gttagcctct tcaatttcag aaagaatgct 540

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tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 1320

aagttcattt catttggaga ggacacg 1347

<210> 65

<211> 4224

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atCas9

<400> 65

atggatcccc gggatcatct acttctgaag actcagactc agactaagca ggtgacgaac 60

gtcaccaatc ccaattcgat ctacatcgat aagaagtact ctatcggact cgatatcgga 120

actaactctg tgggatgggc tgtgatcacc gatgagtaca aggtgccatc taagaagttc 180

aaggttctcg gaaacaccga taggcactct atcaagaaaa accttatcgg tgctctcctc 240

ttcgattctg gtgaaactgc tgaggctacc agactcaaga gaaccgctag aagaaggtac 300

accagaagaa agaacaggat ctgctacctc caagagatct tctctaacga gatggctaaa 360

gtggatgatt cattcttcca caggctcgaa gagtcattcc tcgtggaaga agataagaag 420

cacgagaggc accctatctt cggaaacatc gttgatgagg tggcatacca cgagaagtac 480

cctactatct accacctcag aaagaagctc gttgattcta ctgataaggc tgatctcagg 540

ctcatctacc tcgctctcgc tcacatgatc aagttcagag gacacttcct catcgagggt 600

gatctcaacc ctgataactc tgatgtggat aagttgttca tccagctcgt gcagacctac 660

aaccagcttt tcgaagagaa ccctatcaac gcttcaggtg tggatgctaa ggctatcctc 720

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gatgatctcg ataacctcct cgctcagatc ggagatcagt acgctgattt gttcctcgct 960

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ctcaatagag aggatcttct cagaaagcag aggaccttcg ataacggatc tatccctcat 1320

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gtttcaggac agggtgatag tctccatgag catatcgcta acctcgctgg atctcctgca 2280

atcaagaagg gaatcctcca gactgtgaag gttgtggatg agttggtgaa ggtgatggga 2340

aggcataagc ctgagaacat cgtgatcgaa atggctagag agaaccagac cactcagaag 2400

ggacagaaga actctaggga aaggatgaag aggatcgagg aaggtatcaa agagcttgga 2460

tctcagatcc tcaaagagca ccctgttgag aacactcagc tccagaatga gaagctctac 2520

ctctactacc tccagaacgg aagggatatg tatgtggatc aagagttgga tatcaacagg 2580

ctctctgatt acgatgttga tcatatcgtg ccacagtcat tcttgaagga tgattctatc 2640

gataacaagg tgctcaccag gtctgataag aacaggggta agagtgataa cgtgccaagt 2700

gaagaggttg tgaagaaaat gaagaactat tggaggcagc tcctcaacgc taagctcatc 2760

actcagagaa agttcgataa cttgactaag gctgagaggg gaggactctc tgaattggat 2820

aaggcaggat tcatcaagag gcagcttgtg gaaaccaggc agatcactaa gcacgttgca 2880

cagatcctcg attctaggat gaacaccaag tacgatgaga acgataagtt gatcagggaa 2940

gtgaaggtta tcaccctcaa gtcaaagctc gtgtctgatt tcagaaagga tttccaattc 3000

tacaaggtga gggaaatcaa caactaccac cacgctcacg atgcttacct taacgctgtt 3060

gttggaaccg ctctcatcaa gaagtatcct aagctcgagt cagagttcgt gtacggtgat 3120

tacaaggtgt acgatgtgag gaagatgatc gctaagtctg agcaagagat cggaaaggct 3180

accgctaagt atttcttcta ctctaacatc atgaatttct tcaagaccga gattaccctc 3240

gctaacggtg agatcagaaa gaggccactc atcgagacaa acggtgaaac aggtgagatc 3300

gtgtgggata agggaaggga tttcgctacc gttagaaagg tgctctctat gccacaggtg 3360

aacatcgtta agaaaaccga ggtgcagacc ggtggattct ctaaagagtc tatcctccct 3420

aagaggaact ctgataagct cattgctagg aagaaggatt gggaccctaa gaaatacggt 3480

ggtttcgatt ctcctaccgt ggcttactct gttctcgttg tggctaaggt tgagaaggga 3540

aagagtaaga agctcaagtc tgttaaggaa cttctcggaa tcactatcat ggaaaggtca 3600

tctttcgaga agaacccaat cgatttcctc gaggctaagg gatacaaaga ggttaagaag 3660

gatctcatca tcaagctccc aaagtactca ctcttcgaac tcgagaacgg tagaaagagg 3720

atgctcgctt ctgctggtga gcttcaaaag ggaaacgagc ttgctctccc atctaagtac 3780

gttaactttc tttacctcgc ttctcactac gagaagttga agggatctcc agaagataac 3840

gagcagaagc aacttttcgt tgagcagcac aagcactact tggatgagat catcgagcag 3900

atctctgagt tctctaaaag ggtgatcctc gctgatgcaa acctcgataa ggtgttgtct 3960

gcttacaaca agcacagaga taagcctatc agggaacagg cagagaacat catccatctc 4020

ttcaccctta ccaacctcgg tgctcctgct gctttcaagt acttcgatac aaccatcgat 4080

aggaagagat acacctctac caaagaagtg ctcgatgcta ccctcatcca tcagtctatc 4140

actggactct acgagactag gatcgatctc tcacagctcg gtggtgattc aagggctgat 4200

cctaagaaga agaggaaggt ttga 4224

<210> 66

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCS 终止子

<400> 66

gtcctgcttt aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca tgatatttgc tttcaattct 60

gttgtgcacg ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag atccttaccg ccggtttcgg 120

ttcattctaa tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt 180

caatttactg attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt 240

gtgctgaata ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt 300

tttattatta caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac cggtcaaacc taaaagactg 360

attacataaa tcttattcaa atttcaaaag gccccagggg ctagtatcta cgacacaccg 420

agcggcgaac taataacgtt cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc gcgcatgggt 480

gagattcctt gaagttgagt attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg gcaccattca 540

acccggtcca gcacggcggc cgggtaaccg acttgctgcc ccgagaatta tgcagcattt 600

ttttggtgta tgtgggcccc aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg acgacaaatc 660

gttgggcggg tccagggcga attttgcgac aacatgtcga ggctcagcag gacctgcagg 720

catgcaagct agcttactag tgatgcatat tctatagtgt cacctaaatc t 771

<210> 67

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6-26 启动子

<400> 67

ctttttttct tcttcttcgt tcatacagtt tttttttgtt tatcagctta cattttcttg 60

aaccgtagct ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt atcttgtttc 120

atagtttgtc ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt gattgaataa 180

aacatcttca ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga atctgaaaga 240

agagaagcag gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata ggcccattta 300

agttgaaaac aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa gctgagttta 360

tatacagcta gagtcgaagt agtgatt 387

<210> 68

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ps#1 gRNA

<400> 68

ggaatgtctg ttgccttgtt agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttt 104

<210> 69

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1228483

<400> 69

aactgctttg aatgtccata tgg 23

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1222177

<400> 70

gctggagaac cgccgtttaa cgg 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1261146

<400> 71

cgcttgaatg atgaccactg cgg 23

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1352616

<400> 72

atattgtttt tcatattttt tgg 23

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1352124

<400> 73

ccaaaaaaaa aaaatacagt cgt 23

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1854159

<400> 74

gtttccgcca ccaccgcctc cgg 23

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1843852

<400> 75

tctacaaagt cattgaaggt tgg 23

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1858597

<400> 76

agagttgatc tgtggctgtg gcgg 24

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 4684724

<400> 77

tgactgcagg tgagcttaca cgg 23

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1565357

<400> 78

ccttggaaat tttctcttcc caa 23

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 1559196

<400> 79

ccccgacatt taatgatgtt ttt 23

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟南芥染色体 3 - 4639826

<400> 80

agaagttcag aaagtcgccc agg 23

Claims (32)

1.一种在体细胞植物细胞中的同源染色体之间靶向DNA重组的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含所述同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在表达所述核酸酶系统时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA，在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；

(b)分析所述植物细胞的后代，或从所述植物细胞生长的植物组织，或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；

(c)选择其中发生了靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物、或其植物后代。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶系统包括锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统、或成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸酶系统包括锌指核酸酶(ZFN)，所述锌指核酸酶(ZFN)包含锌指DNA结合结构域和DNA核酸酶切割结构域，其中所述锌指DNA结合结构域在所述预选的内源靶位点内结合，从而靶向所述DNA核酸酶切割结构域以在所述预选的内源靶位点内切割所述DNA。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸酶系统包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统，所述转录激活因子样效应物核酸酶系统包含TAL效应物DNA结合结构域和DNA切割结构域，其中所述TAL效应物DNA结合结构域在所述预选的内源靶位点内结合，从而靶向所述DNA切割结构域以在所述预选的内源靶位点内切割所述DNA。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸酶系统包括CRISPR/Cas核酸酶系统，所述CRISPR/Cas核酸酶系统包含CRISPR相关内切核酸酶和gRNA分子，其中所述gRNA分子在所述预选的内源靶位点内结合，从而引导所述CRISPR相关内切核酸酶在所述预选的内源靶位点内切割DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述CRISPR相关内切核酸酶(Cas核酸酶)选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、C2c1、CasX、NgAgo、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4，其同源物或其修饰形式。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞来源于在所述预选的位点具有多态性等位基因的现有杂交或杂合植物细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述现有的杂交或杂合植物细胞来源于野生型植物。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法产生具有亲本性状的组合的包含所述预选的内源靶位点内的靶向同源重组的体细胞植物细胞，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的种子，或其任何组合，所述组合不存在于任一亲本中。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述亲本性状包括增加的抗旱性，增加的对害虫的抗性，增加的对病原体的抗性，改善的营养物含量，或改善的生长参数，或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞来源于来自两株植物杂交后代的细胞，其中所述亲本植物细胞各自包含与所述预选的位点处的所述配偶相比的多态性等位基因。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法产生具有亲本性状的组合的包含所述预选的内源靶位点内的靶向同源重组的体细胞植物细胞，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的种子，或其任何组合，所述组合不存在于任一亲本中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中通过所述靶向同源重组而重组的所述亲本性状包括增加的抗旱性，增加的对害虫的抗性，增加的对病原体的抗性，改善的营养含量，或改善的生长参数，或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲本体细胞植物细胞之一包含所述核酸酶系统，并且其中所述核酸酶系统的DNA裂解活性靶向存在于不包含所述核酸酶系统的另一亲本植物细胞中的多态性等位基因。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲本体细胞植物细胞之一包含Cas核酸酶，而所述亲本体细胞植物细胞中的另一个包含gRNA分子，其中所述gRNA分子结合在所述预选的内源靶位点内，从而引导所述Cas核酸酶切割所述预选的内源靶位点内的DNA。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞包含来自两个多态亲本系之间杂交的植物后代的细胞，其产生杂交植物，其中所述亲本植物系各自包含所述预选的内源靶位点处的多态性等位基因，其中只有一条亲本系包含所述核酸酶系统。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法产生具有亲本性状的组合的包含所述预选的内源靶位点内的靶向同源重组的体细胞植物细胞，或包含所述体细胞植物细胞的植物组织，或包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物，来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的果实，或来自包含所述体细胞植物细胞的植物或其后代植物的种子，或其任何组合，所述组合不存在于任一亲本中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述亲本性状包括增加的抗旱性，增加的对害虫的抗性，增加的对病原体的抗性，改善的营养物含量，或改善的生长参数，或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸酶系统包含Cas核酸酶和gRNA分子，其中所述gRNA分子在所述预选的内源靶位点内结合，从而引导所述Cas核酸酶在所述预选的内源靶位点内切割DNA，并且其中所述核酸酶系统的所述DNA切割活性仅发生在野生型亲本植物细胞中存在的异源等位基因上。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞包含在植物组织或整株植物中。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述预选的内源靶位点包括含有基因、基因的一部分、或基因的调节上游或下游序列、或其任意组合的DNA，并且其中所述基因的表达或缺乏影响生长，抗旱性，对害虫的抗性，对病原体的抗性或营养成分，或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子或其任何组合有益的任何其他性状。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述预选的内源性靶位点包含常染色质或异染色质的区域。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达包括组成型诱导表达、诱导性表达诱导、组织特异性表达诱导，或条件特异性表达诱导，或其任何组合。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞包含原生质体。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞植物细胞包括作物植物细胞。

26.根据权利要求1所述的方法，其中分析所述植物包括分析所述植物或其后代的一部分，所述植物或其后代包含叶、茎、芽、果实、种子。

27.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的所述选择的后代包含F₁、F₂或F₃代，或任何后续代，或回交1至3代，或任何后续回交代。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法产生在所述预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的体细胞植物细胞，或在预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的植物组织，或在预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的植物或其后代植物，或来自在预选的内源靶位点处包含靶向同源重组的植物或其后代植物的果实，或来自在预选的内源靶位点处包含所述靶向同源重组的植物或其后代植物的种子，或其任何组合，与对照植物细胞、植物或其后代、果实或种子相比，所述细胞、组织、植物或其后代、果实或种子包含增加的抗旱性，增加的对害虫的抗性，增加的对病原体的抗性，改善的营养含量，改善的生长参数，或对植物细胞、植物组织、植物、果实或种子有益的任何其他性状，或其任何组合。

29.一种植物，其包含通过包括在杂交体细胞植物细胞中的同源染色体之间的靶向DNA重组的方法产生的有益性状或品质的组合，所述方法包括以下步骤：

(a)在所述植物细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内被切割，其中所述核酸酶切割所述DNA从而在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂；

(b)分析所述植物细胞的后代、或从所述植物细胞生长的植物组织、或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于同源染色体之间的同源重组，其中所述同源重组包括交叉或基因转换(非交叉)；

(c)选择其中发生靶向同源重组的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；

(d)繁殖所述植物细胞或其植物组织或其植物或其植物后代以产生包含所述靶向同源重组的植物，其中所述植物包含任一所述杂交体细胞起源的亲本植物中不存在的有益品质或性状的组合。

30.根据权利要求29所述的植物，其中所述预选的内源靶位点包含常染色质或异染色质的区域。

31.一种产生包含有益性状或品质组合的后代植物的方法，其中所述组合不存在于任一亲本植物中，所述方法包括：

(a)选择亲本植物，其中每个所述亲本包含至少一种有益性状，其中所述有益性状不相同，并且其中所述亲本对于一种所述至少有益的性状是多态性的；

(b)杂交所述亲本植物以建立杂交植物；

(c)从所述杂交植物中收集体细胞；

(d)在所述体细胞性细胞中表达核酸酶系统，其中所述表达的核酸酶系统靶向包含同源染色体上的多态性等位基因的预选的内源靶位点，其中在所述核酸酶系统表达时，至少一个所述多态性等位基因的DNA在所述预选的内源靶位点内切割，其中所述核酸酶切割DNA从而在至少一个所述多态性等位基因的DNA中产生双链断裂，其中在所述靶向预选的内源靶标处的同源交叉或基因转换(非交叉)位点导致表达或调节至少一种所述有益性状或品质的表达的DNA交换；

(e)分析所述植物细胞的后代、或从所述植物细胞生长的植物组织、或从所述细胞生长的植物或其所述植物的后代，用于所述交叉或基因转换(非交叉)事件，其中表达所述性状组合；

(f)选择其中表达所述性状组合的植物细胞、其植物组织、其植物或其植物后代；

(g)繁殖所述植物细胞、其植物组织、其植物，以产生包含所述有益性状或品质组合的后代植物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述预选的内源性靶位点包含常染色质或异染色质的区域。