BR112019014420A2 - recombinação direcionada entre cromossomos homólogos e usos dos mesmos - Google Patents

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    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Abstract

recombinação direcionada entre cromossomos homólogos e usos dos mesmos são aqui descritos métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos no genoma de uma célula de planta somática, em que o sítio alvo pode ser localizado dentro de uma região de eucromatina ou uma região de heterocromatina. estes métodos podem ser utilizados para induzir uma célula de planta somática para a utilização da recombinação direcionada entre os cromossomos homólogos que conduzem à passagem do direcionamento ou de conversão de genes. os métodos descritos utilizam um sítio alvo endógeno pré-selecionado em um locus tendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos. os loci do sítio alvo divulgados incluem aqueles dentro da eucromatina e heterocromatina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: RECOMBINAÇÃO DIRECIONADA ENTRE CROMOSSOMOS HOMÓLOGOS E USOS DOS MESMOS
CAMPO DE INTERESSE [001] São descritos métodos de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos em células de plantas somáticas, em que essas células de plantas podem ser células isoladas, uma parte de um tecido de planta isolado, uma parte de uma planta inteira, ou uma planta inteira, em que a sequência alvo pode corresponder a eucromatina ou heterocrornatina .
ANTECEDENTES [002] Quebras de fita dupla de DNA (DSBs) são uma das forças poderosas que moldam os genomas das plantas. Estes DSBs podem ocorrer ao longo do ciclo de vida da planta, em células somáticas ou meióticas, espontaneamente durante o movimento dos garfos de replicação ou controlados no desenvolvimento, como nos estágios iniciais da primeira meiose. Eles também podem ser induzidos através de radiação ionizante, drogas genotóxicas ou através da ativação de endonucleases. O DSB de DNA não reparado pode causar tipos extremos de danos, incluindo perda de cromossomos, levando à esterilidade dos gametas ou morte celular. O reparo de DSBs também pode estar associado a mutações de inserção/deleção (indels). Os mecanismos de reparo de DSBs
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2/124 são, portanto, essenciais para a manutenção da integridade do genoma. Entender estes mecanismos é crítico para a capacidade de projetar precisamente genomas, por exemplo, para mutagênese direcionada, direcionamento de genes ou para outros tipos de reaproximação de cromossomos direcionado.
[003] Os mecanismos de reparo de DNA DSB têm sido amplamente estudados em muitos organismos, incluindo plantas. Estudos em plantas caracterizaram os genes envolvidos no reparo de DSB através de junção não homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga (RH) e testaram o resultado do reparo de DSB em ambos os tecidos somáticos e meióticos. O NHEJ foi caracterizado em uma ampla gama de espécies e tecidos (principalmente somáticos), usando múltiplos agentes indutores de DSB, incluindo meganucleases sítio específicas, excisão do transposon, e nucleases customizadas, tais como as nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativadoras de transcrição (TALENs), e proteína Cas9 associada à Repetição Palindrômica Curta Intervalada Regulatória Agrupada (CRISPR-Cas). O quadro emergente desses trabalhos sugere que o NHEJ é uma via de reparo proeminente em células somáticas de plantas. Esse mecanismo propenso a erros envolve indels variando de alguns pares de bases (bp) a vários Kbps no sítio do DSB e é frequentemente associado a micro homologias. Além disso, os sistemas baseados em
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CRISPR-Cas demonstram ser altamente eficientes em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo tomate.
[004] A recombinação homóloga que ocorre naturalmente em células de plantas somáticas é muito baixa e quase nula quando se considera a recombinação somática em um local específico. Esta baixa frequência de recombinação homóloga é considerada importante na manutenção da estabilidade dos genomas de plantas grandes e repetitivos. Diversos estudos que abordaram o mecanismo de reparo de DSB através de RH em tecidos somáticos foram realizados em Arabidopsis, utilizando ensaios transgênicos que testaram mecanismos de reparo tais como recombinação intracromossômica e cruzamento desigual. Em todos os casos, a indução de DSB aumentou as taxas de reparo de RH. As taxas de recombinação do ensaio de cruzamento desigual foram muito inferiores às da recombinação intracromossômica. O reparo de DSB somático por um cromossomo homólogo, usando uma sequência alélica, também foi estudado em plantas de tabaco transgênicas, usando quebras induzidas por elementos transponíveis: o reparo de RH ocorreu na excisão do transposon; mas não foi detectado com um elemento imóvel. A indução de DSB também pode desencadear o reparo mediado por RH usando um modelo de sequência genômica ectópica, embora em frequências muito baixas.
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4/124 [005] A indução de RH por DSB entre parceiros de recombinação endógena (não transgênica) foi mostrada em milho após excisão do At ivador (Ac) ou dos elementos Mutadores. Em ambos os casos a recombinação ocorreu em cis, entre repetições flanqueando o transposon em tecidos somáticos. Por outro lado, a atividade germinal de Ac não estimulou a taxa de recombinação meiótica entre cromossomos homólogos no local de bronze de milho. Esse resultado pode ser devido à falta de coordenação entre a excisão de Ac e a recombinação meiótica, uma preferência da RH meiótica por quebras induzidas por Spoil ou por outra razão desconhecida. A capacidade de induzir a RH entre os cromossomos homólogos em uma localização genômica específica fornecería aos geneticistas e criadores uma ferramenta poderosa para a indução direcionada de conversão cruzada ou gênica.
[006] Assim, há uma necessidade de métodos que irão fornecer RH direcionada entre cromossomos homólogos para a reprodução precisa de culturas. Uma aplicação da RH direcionada é a conversão de gene direcionada, nomeadamente a transferência de um gene de um cromossomo para o seu homólogo. Tais métodos também devem levar em conta o tamanho da população de plantas que normalmente pode ser usada para atingir esse objetivo. Além disso, o processo de retrocruzamento repetido para alcançar linhagens isogênicas também pode arrastar grandes segmentos de DNA indesejável
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5/124 flanqueando o gene desejável na planta progenitora. São aqui divulgados métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos que podem ser realizados com populações de plantas relativamente pequenas e sem recuperação de grandes segmentos de DNA não desejados.
[007] Os cromossomos de plantas possuem tanto heterocromatina altamente condensada, proeminente em regiões pericentroméricas e correspondendo a pontos frios de recombinação meiótica e regiões eucromáticas amplamente descondensadas, muitas vezes correspondendo a regiões subteloméricas distais e a pontos quentes de recombinação meiótica. Embora a heterocromatina esteja frequentemente associada à inatividade transcricional e à recombinação genética suprimida, ela ainda contém genes transcricionalmente ativos. A recombinação direcionada induzida entre cromossomos homólogos em regiões de heterocromatina seria uma vantagem no melhoramento de plantas, já que na ausência de tal recombinação, os genes deletérios podem não ser segregados de genes benéficos. São aqui descritos métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos em uma célula de planta somática, em que recombinação direcionada induzida por DSB foi demonstrada ocorrer em ambos os locais alvo eucromáticos e heterocromático.
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6/124 [008] Outra aplicação potencial de RH somática induzida por DSB é cruzamento direcionado, isto é, a troca recíproca de grandes segmentos cromossômicos em um local preciso. Os métodos atuais de reprodução baseiam-se no cruzamento aleatório e na busca por eventos raros de recombinação, no caso de genes ligados, que poderíam levar dezenas de milhares de plantas para obter, onde a porcentagem de recombinação homóloga em RH não direcionada que ocorre naturalmente em qualquer sítio específico dentro do genoma está próximo de 0% (ocorrendo menos de 1 em cada 105-106 eventos naturais de RH).
[009] São aqui divulgados métodos que podem ser usados em RH somática direcionada para combinar características desejáveis das plantas progenitoras e segregar entre ligações genéticas indesejáveis usando populações de plantas pequenas.
RESUMO [0010] Em um aspecto, é aqui descrito um método de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática, o referido método compreendendo as etapas de:
(a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos,
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7/124 em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um do referido alelo polimórfico é clivado no interior do referido sitio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de, pelo menos, um dos referidos alelos polimórficos;
(b) analisar o progenitor da referida célula de planta, ou em um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou de um progenitor da referida planta da mesma, para a recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento); e (c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta do mesmo, ou progenitor destas plantas em que recombinação homóloga direcionada ocorreu.
[0011] Em um aspecto, os métodos aqui divulgados produzem uma planta compreendendo uma combinação de características ou qualidades benéficas, o método compreendendo recombinação de DNA direcionada entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática híbrida, o referido método compreendendo as etapas de:
(a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado
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8/124 compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um do referido alelo polimórfico é clivado no interior do referido sitio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos;
(b) analisar o progenitor da referida célula de planta, ou em um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou de um progenitor da referida planta da mesma, para a recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento);
(c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progenitor destas plantas em que a recombinação homóloga direcionada tenha ocorrido;
(d) propagar a referida célula de planta ou tecido de planta da mesma, ou planta da mesma, ou progenitor destas plantas para a produção de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada, em que a referida planta compreende uma combinação de qualidades benéficas ou características que não estão presentes em qualquer planta de origem cuja célula somática híbrida foi originada.
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9/124 [0012] Em um aspecto, é aqui divulgado um método para produzir uma planta progenitora compreendendo uma combinação de características ou qualidades benéficas, em que a referida combinação não está presente em qualquer planta de origem, compreendendo o referido método:
selecionar plantas progenitoras, em que cada um dos referidos progenitores compreende pelo menos uma característica benéfica, em que as referidas características benéficas não são idênticas e em que os referidos progenitores são polimórficos para pelo menos uma das referidas características benéficas;
cruzar as referidas plantas progenitoras para criar uma planta híbrida;
coletar as células somáticas da planta híbrida;
expressar um sistema de nuclease nas referidas células somáticas, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado a um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que, quando da expressão do referido sistema de nuclease, o DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos é clivado dentro do referido sítio alvo endógeno préselecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos, em que o cruzamento homólogo ou conversão de genes (não cruzamento) no referido sítio
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10/124 alvo endógeno pré-selecionado direcionado leva a uma troca de DNA expressando ou regulando a expressão de pelo menos uma das referidas características ou qualidades benéficas;
analisar o progenitor das referidas células de planta, ou um tecido de planta crescido a partir das referidas células de planta, ou uma planta crescida a partir das referidas células ou de um progenitor da referida planta da mesma, para o referido evento de cruzamento ou conversão de genes (não cruzamento) em que a referida combinação de características é expressa;
selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progenitor de planta da mesma, em que a combinação de características é expressa; e propagar a referida célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, para produzir uma planta progenitora que compreenda a referida combinação de características ou qualidades benéficas.
[0013] Em um aspecto relacionado, um sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetora do tipo ativadora de transcrição (TALEN), ou um sistema de proteínas (Cas) associadas (CRISPR)/ (CRISPR/Cas) de repetições curtas palindrômicas regularmente intervaladas agrupadas.
[0014] Em outro aspecto, um sistema de nuclease compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) que compreende
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11/124 um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de divagem de nuclease de DNA, em que o referido domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, assim direcionando o domínio de divagem da nuclease de DNA para clivar o DNA no interior do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outro aspecto, um sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease efetora do tipo ativadora de transcrição (TALEN) que compreende um domínio de ligação de DNA efetor TAL e um domínio de divagem de DNA, em que o referido domínio de ligação de DNA efetor TAL se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, direcionando assim o domínio de divagem de DNA para clivar o DNA no interior do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outro aspecto, um sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease CRISPR/Cas compreendendo uma endonuclease associada a CRISPR e uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga dentro do referido sítio alvo endógeno préselecionado, orientando assim a referida endonuclease associada a CRISPR para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outro aspecto, uma endonuclease associada a CRISPR (Cas nuclease) é selecionada
do grupo que compreende Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5,
Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, CaslO , Cpfl, Csyl, Csy2, Csy3, Csel,
Cse2, Cscl, Csc2, Cs5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6,
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Cmr 1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr 6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4,
CsxlO , Csxl6, CsaX, Cs: k3, Cs: xl , Csxl5, C2cl, CasX, NgAgo,
Csf 1, Csf2, Csf3 e Csf 4, seus homólogos, ou versões
modificadas dos mesmos.
[0015] Em um aspecto relacionado, uma célula de planta somática se origina de uma célula de planta híbrida ou heterozigótica existente que possui alelos polimórficos no referido sítio pré-selecionado. Em outro aspecto, uma célula de planta híbrida ou heterozigótica existente se origina de uma planta do tipo selvagem.
[0016] Em um aspecto relacionado, um método aqui divulgado produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação destas, tendo uma combinação de características parentais, a referida combinação não presente em ambas as plantas progenitoras. Em outro aspecto, uma característica parental compreende resistência aumentada à seca, resistência aumentada a
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13/124 pragas, maior resistência a patógenos, conteúdo de nutrientes melhorado, ou parâmetros de crescimento melhorados, ou qualquer outra característica de benefício à célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente.
[0017] Em um aspecto relacionado, uma célula de planta somática se origina de uma célulo progenitora do cruzamento de duas plantas, em que as referidas células de
plantas progenitoras compreendem, cada uma, um alelo
polimórfico comparado com o referido casal no referido local
pré-selecionado.
[0018] Em um aspecto relacionado, um método aqui
divulgado produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação das mesmas, tendo uma combinação resultante de características parentais, a referida combinação não presente em ambas as plantas progenitoras. Em outro aspecto, as características parentais recombinadas através da referida recombinação
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14/124 homóloga direcionada compreendem resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, conteúdo de nutrientes melhorado, ou parâmetros de crescimento melhorados, ou qualquer outra característica de benefício para a célula da planta, tecido da planta, planta, fruta ou semente.
[0019] Em um aspecto relacionado, uma das referidas células de plantas somáticas compreende o referido sistema de nuclease, e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease é direcionada ao alelo polimórfico presente na outra célula de planta progenitora que não compreende o referido sistema de nuclease.
[0020] Em outro aspecto relacionado, uma das referidas células de plantas somáticas progenitoras compreende uma nuclease Cas e a outra das referidas células de plantas somáticas progenitoras compreende uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga ao referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, orientando assim a referida nuclease Cas para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado.
[0021] Em outro aspecto relacionado, uma célula de planta somática compreende uma célula de um progenitor de planta de um cruzamento entre duas linhagens parentais polimórf icas, o que cria uma planta híbrida, em que as referidas linhagens de plantas parentais compreendem, cada
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15/124 uma, um alelo polimórfico no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, e em que apenas uma das linhagens parentais compreende o referido sistema de nuclease.
[0022] Em outro aspecto relacionado, um método aqui divulgado produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada dentro do sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação das mesmas, tendo uma combinação de características parentais, a referida combinação não presente em ambos os progenitores. Em outro aspecto, as características parentais compreendem aumento da resistência à seca, aumento da resistência a pragas, aumento da resistência a patógenos, melhoria no teor de nutrientes, ou melhores parâmetros de crescimento, ou qualquer outra característica de benefício à célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente.
[0023] Em outro aspecto relacionado, um sistema de nuclease compreende uma nuclease Cas e uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga dentro do referido
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16/124 sítio alvo endógeno pré-selecionado, guiando desse modo a referida nuclease Cas para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease ocorre apenas no alelo heterólogo presente na célula de planta progenitora do tipo selvagem.
[0024] Em outro aspecto relacionado, uma célula de planta somática é compreendida dentro de um tecido de planta ou de uma planta inteira. Em outro aspecto relacionado, uma célula de planta somática compreende um protoplasto. Em outro aspecto relacionado, uma célula de planta somática compreende uma célula de planta de cultura.
[0025] Em outro aspecto relacionado, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende DNA compreendendo um gene, uma parte de um gene, ou uma sequência reguladora a montante ou a jusante de um gene, ou qualquer combinação dos mesmos, e em que expressão ou falta dela do referido gene afeta o crescimento, resistência à seca, resistência a pragas, resistência a patógenos, ou teor de nutrientes, ou qualquer outra característica de benefício para a célula da planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto relacionado, o sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromatina.
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17/124 [0026] Em outro aspecto relacionado, a expressão compreende indução constitutiva da expressão, indução induzível da expressão, indução da expressão específica do tecido, ou indução da expressão específica da condição, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0027] Em um aspecto relacionado, a análise da referida planta compreende a análise de uma porção da referida planta ou de um progenitor da mesma compreendendo uma folha, um caule, um botão, uma fruta, uma semente.
[0028] Em um aspecto relacionado, uma etapa de seleção do progenitor compreende as gerações Fi, F2 ou F3, ou
qualquer geração subsequente, ou retrocruzamentos de 1 a 3
gerações, ou qualquer geração subsequente de
retrocruzamento.
[0029] Em um aspecto relacionado, um método aqui
divulgado produz uma célula de planta somática compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno previamente selecionado ou um progenitor da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno selecionado ou planta progenitora da mesma, ou
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18/124 sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sitio alvo endógeno pré-selecionado ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação dos mesmos, a referida célula, tecido, planta ou progenitor dos mesmos, fruto ou semente compreendendo genes para resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, teor de nutrientes melhorado, parâmetros de crescimento melhorados, ou qualquer outra característica de benefício à célula da planta, tecido da planta, planta ou progenitores das mesmas, fruto, ou semente, ou qualquer combinação destes em comparação com uma célula, planta ou progenitor da planta de controle, fruto ou semente. Em um aspecto relacionado, o sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromatina.
[0030] Em outro aspecto, divulgado aqui uma planta compreendendo uma combinação de características benéficas ou qualidades produzidas por um método compreendendo recombinação de DNA direcionada entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática híbrida, compreendendo o referido método as etapas de: (a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a
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19/124 expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos é clivado dentro da referida pré-seleção. sítio alvo endógeno, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma quebra de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos;
(b) analisar o progenitor da referida célula de planta ou um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta ou uma planta crescida a partir da referida célula ou um progenitor da referida planta, para recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento);
(c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progenitor de planta da mesma em que a recombinação homóloga direcionada tenha ocorrido;
(d) propagar a referida célula de planta ou tecido de planta da mesma, ou planta da mesma, ou progenitor das plantas da mesma para a produção de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada, em que a referida planta compreende uma combinação de qualidades benéficas ou características que não estão presentes em ambas as plantas progenitoras a partir da qual a célula somática híbrida se originou. Em um aspecto relacionado, o sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromatina.
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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0031] Os desenhos que se seguem fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar adicionalmente certas modalidades da presente divulgação, os métodos aqui descritos podem ser mais bem compreendidos por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui .
[0032] A Figura 1 apresenta um esquema de reparo de ruptura de fita dupla (DSB), que pode ocorrer por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga (RH) .
[0033] A Figura 2 apresenta uma modalidade esquemática de reparo de um DSB direcionado por recombinação homóloga (RH).
[0034] A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxograma esquemático compreendendo algumas modalidades de indução da recombinação entre cromossomos homólogos. A indução de quebras de fita dupla de DNA é mostrada como um raio amarelo.
[0035] As Figuras 4A—E apresentam o ensaio da cor do fruto do tomate e a análise molecular para os resultados dos eventos de reparo da quebra da fita dupla do DNA (DSB) . Figura 4A: Espera-se que o cruzamento de yellow fleshe3756 35S: Cas9 e bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA forneça plantas Ei com um fenótipo de fruta Bicolor pálido. Foram
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21/124 selecionadas plantas Fi que expressam Cas9 e gRNA. 0 gRNA foi projetado para indução de DSB direcionado (mostrado como raio preto) em ambos os alelos entre as mutações yellow fleshe3756 e bioolorcc383 (*) . No caso do reparo do alelo bicolorcc383 não homólogo de junção terminal (NHEJ) , esperouse que a cor do fruto fosse amarelo após o reparo sujeito a erros deixando as pegadas de indel (inserção/deleção) (linha azul). Nos casos de não cruzamento ou cruzamento, esperavase que a cor dos frutos fosse vermelho ou bicolor com manchas vermelhas em caso de evento tardio. Figura 4B: Distribuição do fenótipo da fruta em plantas Fi e controle: Frutas bicolores são mostradas em caixas laranja; Frutas amarelas como caixas amarelas; Frutas com setores vermelhos (RH somática putativa) são mostradas como caixas vermelhas cruzadas. Cada barra representa uma população de frutos derivada de plantas Fi originárias de cruzamentos entre linhagens transgênicas independentes de Cas9 e uma dada linhagem u6-26: Ps # 1-sgRNA. 0 número de frutos analisados em cada cruzamento é mostrado na barra em preto. Figura 4C: As sequências das pegadas de reparo de DSE do NHEJ são mostradas no lado direito e sua frequência relativa é mostrada no gráfico de pizza. A sequência alvo CRISPR-Cas do PSY1 é mostrada no topo. A localização do DSB é mostrada como um raio preto; o códon de início de PSY1 é mostrado em vermelho e o motivo adjacente de PAM-protoespaçador é
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22/124 mostrado em azul. A parte de cima representa uma média de illumina Hiseq lida de 22 plantas Fi diferentes do cruzamento de yellow fleshe3356 35S: Cas9 x bicolorcc383 u6-26: Ps # 1sgRNA. Neste cruzamento, 88% das sequências desviam da sequência WT. A parte de baixo representa uma média de ilummina Hiseq lida de 2 plantas de controle de população Fi (plantas Fi yellow fleshe3756 x bicolorcc383 sem componentes CRISPR-Cas). A eliminação do CTTG laranja é uma pegada preferencial do NHEJ. Figura 4D: Esquema de PCR inverso para identificação de fragmentos de DNA recombinante. (1) 0 DNA de amostras de folhas separadas foi primeiro digerido com Apal (A) e HindIII (H) e depois embotado. (2) Cada amostra foi autoligada. (3) Cada amostra foi amplificada por dois conjuntos de iniciadores diferentes (em verde e amarelo) . Alelo Azul-Bicol or; Alelo vermelho yellow flesh; Linha azul tracejada - Deleção Bicolor, * - Mutação da yellow flesh, local do DSB relâmpago. Figura 4E. Relação dos tipos parentais (P) versus recombinantes (R) (obtidos a partir do painel C) em plantas individuais. Plantas 1-15- Ei plantas do cruzamento de yellow fleshe3156 35S: Cas9 x bioolorcc383 u626: Ps # 1-sgRNA; Planta 16 - controle cruzado sintético; Plantas17-18-Yellow flesh x Plantas Ei Bicolores (Cas9-).
[0036] A Figura 5 apresenta reparo do NHEJ em células somáticas. Distribuição das pegadas NHEJ em plantas Ei individuais e em plantas controle (yellow fleshe333e x
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23/124 bicolorcc383 ) obtidas por sequenciamento dos produtos de PCR amplificados em torno do DSB induzido por CRISPR-Cas9 (relâmpago) com iniciadores mostrados como setas vermelhas. Cada parte representa o total que o ilummina Hiseq lê para uma única planta (250.000 a 850.000 leituras por planta).
[0037] As Figuras 6A-6B apresentam o ensaio de SNPs de tomate para a análise de eventos de reparo de ruptura de fita dupla de DNA germinativo (DSB). Figura 6A. Um homozigoto M82 CRISPR mutante (+A, +A) expressando 35S: Cas9 e u6-26: Ps # 2-sgRNA foi cruzado com S. pimpinelli foliunM1578 . Esperase que a Fi dê frutos vermelhos sem DNA DSB e fruta amarela caso a quebra seja reparada por NHEJ, não cruzada ou cruzada. O padrão de SNPs permite diferenciar entre mecanismos de reparo. Triângulos são para SNPs; relâmpago marca o sítio do DSB; linha azul é para indels NHEJ. Figura 6B. Análise de marcadores flanqueantes de DNA DSB em plantas F2 e F3. Homozigoto vermelho para SNPs de S.pimpinelli foliunM1578; homozigoto amarelo para SNPs M82 (incluindo o mutante +A CRISPR-Cas9) ; heterozigoto laranja; as células vazias são para dados ausentes; relâmpago - sitio do DSB.
[0038] A Figura 7 apresenta o ensaio de SNPs de tomate para reparo de DSB de DNA especifico de alelo. O DNA foi extraído de 4 folhas de M82 35S: Cas9 u6-26: Ps # 2sgRNA psyl +A/psyl +A, S. pimpinellifoliunM1578 e 5 plantas de sua linhagem Fi. o sequenciamento de illumina foi pré-formado
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24/124 e cada parte representa um resumo de 600.000-900.000 leituras por planta.
[0039] A Figura 8 apresenta um mapa esquemático de fenótipos de cores de frutos ao longo do desenvolvimento e sequenciamento de pegadas de reparo de DNA DSB de tecidos de pericarpo de frutas usando sequenciamento de illumina. Um exemplo é mostrado para a planta # 1, que é uma planta Fi de M82 35S: Cas9 u6-26: Ps # 2-sgRNA psyl +A/psyl +A x S. pimpinelli folium^1578 . O fenótipo da cor dos frutos foi variável de vermelho a vermelho, com setores amarelos pequenos ou grandes. Cada parte foi construída a partir de 15.000 a 50.000 leituras de sequenciamento de illumina por fruta.
[0040] As Figuras 9A e 9B apresentam a quantificação do reparo dependente de alelo. Figura 9A. Duas populações de plantas foram cultivadas, tanto no contexto M82: um homozigoto para PSY1/PSY1 e outro heterozigoto para o genótipo PSY1/psy+A. O progenitor dessas plantas podería fornecer um SNP +A no local da ruptura (raio) ou qualquer outra mutação (*). O DNA foi extraído de folhas de plantas com 4 semanas de idade de ambas as populações e sequenciadas por illumina. Nas plantas PSY1/PSY1, ambos os alelos podem ser direcionados, enquanto nas plantas PSYl/psy +A, apenas o alelo WT PSY1 é direcionado. Figura 9B. A percentagem de mutação +A por alelo WT nas plantas PSY1/PSY1 serviu como
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25/124 valor esperado para mutação +A independente de alelo. Foi calculado pelas seguintes equações: Esperado = (% (leitura +A) t = 4 semanas (em peso, em peso))/2. Estimar a ocorrência observada da mutação +A quando o segundo alelo tem uma mutação +A (em plantas heterozigotas M82-WT PSY1/M82 psyl+A) como mostrado na Figura 9A, a equação utilizada foi: Observada = % (leitura +A) τ = 4 semanas, (peso, +A) -50%. As barras correspondem ao erro padrão para 22 plantas PSY1/PSY1 e 14 plantas PSY1 /psy +A. A diferença entre as médias foi significativa (valor de p (Wilcoxon rank sum test) = 0,009).
[0041] A Figura 10 mostra um evento de reparação de DNA DSB seguido por fenótipo de frutas e planta de sequenciamento de iluminação específica pericarpo # 2. Todos os detalhes são semelhantes aos da Figura 8. Esta planta mostrou alto nível de psyl+A. Os produtos de conversão na Figura 6B são o progenitor desta planta.
[0042] A Figura 11 apresenta a Tabela 10, que tabula os alvos CRISPR DSB no cromossomo 3 de Arabidopsis.
[0043] A Figuras 12A-12C mostram o sistema de Arabidopsis para indução de DSB de DNA somático em pontos quentes e frios de recombinação. (Figura 12A) Doze alvos de recombinação meiótica em regiões consideradas pontos quentes ou frios entre os marcadores de sementes GFP e RFP. Alvos quentes (em vermelho) e frios (em azul) tinham características de eucromatina ou heterocromatina,
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26/124 características de pontos quentes ou pontos frios de recombinação, respectivamente. As coordenadas dos alvos e sua distribuição no cromossomo 3 entre os marcadores GFP e RFP são mostradas. A Figura 12B mostra o esquema experimental: doze linhas de teste de homozigoto Columbia expressando 35Sx2: Higromicina, cassete u6-26: gRNA, cada uma codificando para o gRNA direcionando sequência específica quente/frio foram cruzadas com linhas Columbia WT expressando nos: nptll: nos Ubi: spCas9. As taxas de recombinação foram calculadas com base nas sementes autofertilizadas F2 que foram utilizadas para calcular a taxa de cruzamento entre o lado esquerdo dos marcadores GFP e RFP (Resultados mostrados na Figura 12C). Além disso, plantas F1 foram cruzadas com plantas de Landsberg do tipo selvagem e DNA de tecidos somáticos foram extraídos para determinar a taxa somática e o mecanismo de reparo de DSB de DNA em torno do DSB pelo sequenciamento de PacBio (Resultados mostrados nas Figuras 13A-13Q). (Figura 12C) Taxa de cruzamento em CentiMorgan (eixo Y) entre os marcadores GFP e RFP após a indução CRISPR-Cas9 DSB nos alvos mostrados no eixo X com o número de coordenadas para os locais quente (vermelho) ou frio (azul) . Controles na ausência de indução DSB são mostrados em preto. 0 grande diamante vermelho representa a taxa média de cruzamento para cada população.
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27/124 [0044] As Figuras 13A-13Q apresentam a análise molecular do reparo de DSB no Alvo quente -chr3: 1854159 usando sequenciação de Pacbio. O DNA foi purificado de brotos jovens (no estágio de pré-meiose), caules e tecido de folhas superiores de cada planta de populações retrocruzadas de Columbia testador x Landsberg. Fragmentos de 5kb flanqueando o local do DNA DSB foram amplificados por PCR e sequenciados usando PacBio. As leituras de filas foram agrupadas em sequências de consenso utilizando a Análise de Amplicon de PacBio Longo e depois alinhadas com o genoma de Arabidopsis utilizando o software Burrows-Wheeler Aligner (BWA) e representadas graficamente. Listras vermelhas representam os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de Columbia (Col) e as Listras Azuis representam os SNPs de Landsberg (Ler) . O sítio do DSB no alvo # 1854179 no Cromossomo 3 é mostrado como a linha tracejada. A linha amarela indica pegadas do NHEJ no sítio do DSB. Linhas verdes representam sequências que não pertencem a nenhuma das plantas progenitoras. Para cada planta (Figuras 13A—13Q, em que cada caixa é uma planta diferente e as Figuras 13O-13Q são plantas de controle), o DNA extraído foi colocado em código de barras (quadrados separados com código de barras indicado), centenas ou milhares de moléculas individuais foram sequenciadas e agrupadas de acordo com sequência (incluindo padrões de SNPs) . Este método permite distinguir entre a origem parental
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28/124 de cada molécula. Em algumas plantas (por exemplo, código de barras 89 no quadrado superior esquerdo) não houve evidência de qualquer alteração e os alelos parentais estavam mais ou menos em igual proporção. Em outras plantas (por exemplo, código de barras 90 - segundo topo de planta, a partir do lado esquerdo), houve evidência de cruzamento flanqueando a ruptura como sugerido a partir da transição de SNPs vermelhos para azuis em 10-12% das moléculas. Três plantas de controle do testador F1 Ler x Col foram também sequenciadas e analisadas da mesma maneira, e não apresentaram nenhum evento de conversão cruzada ou de gene.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0045] Na descrição detalhada seguinte, numerosos detalhes específicos são estabelecidos a fim de fornecer uma compreensão completa dos métodos aqui apresentados. Contudo, será entendido pelos especialistas na técnica que estes métodos de direcionamento da recombinação de DNA entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática ou em tecido ou planta das mesmas podem ser praticados sem estes detalhes específicos. Em outros casos, os métodos, procedimentos e componentes bem conhecidos não foram descritos em pormenor de modo a não obscurecer os métodos e as células de plantas e plantas resultantes que compreendem DNA compreendendo a recombinação homóloga direcionada, como aqui divulgado.
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29/124 [0046] Em uma modalidade, é aqui divulgado um método de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos em células de plantas somáticas, compreendendo o referido método as etapas de: (a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado a um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos clivados no referido sítio alvo endógeno previamente selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma quebra de cadeia dupla o DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos; (b) analisar o progenitor da referida célula de planta, ou em um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou de um progenitor da referida planta da mesma, para a recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento); e (c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta do mesmo, ou progenitor destas plantas em que a recombinação homóloga ocorreu.
[0047] Em uma modalidade, os métodos aqui divulgados produzem uma planta que compreende uma combinação de
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30/124 características benéficas ou qualidades, compreendendo o referido método de recombinação de DNA direcionado entre os cromossomos homólogos em uma célula de planta somática híbrida compreendendo alelos polimórficos nos referidos cromossomos homólogos, o referido método compreendendo as etapas de: (a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado a um sítio alvo endógeno préselecionado compreendendo os alelos polimórficos, em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um dos alelos polimórficos é clivado dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de, pelo menos, um dos referidos alelos polimórficos; (b) analisar o progenitor da referida célula de planta, ou em um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou de um progenitor da referida planta do mesmo, para a recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento);
(c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta do mesmo, ou progenitor destas plantas em que a recombinação homóloga direcionada tenha ocorrido; (d) propagar a referida célula de planta ou tecido de planta da
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31/124 mesma, ou planta da mesma, ou progenitor destas plantas para a produção de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada, em que a referida planta compreende uma combinação de qualidades benéficas ou características que não estão presentes em qualquer planta de origem cuja célula somática híbrida foi originada.
[0048] Em uma modalidade, um método aqui divulgado compreende a produção de uma planta progenitora compreendendo uma combinação de características ou qualidades benéficas, em que a referida combinação não está presente em nenhuma das plantas progenitoras do progenitor, compreendendo o referido método: (a) selecionar plantas progenitoras, em que cada um dos referidos progenitores compreende pelo menos uma característica benéfica, em que as referidas pelo menos uma das características benéficas não são idênticas e em que os referidos progenitores são polimórficos para uma das referidas pelo menos uma característica benéfica; (b) atravessar as referidas plantas progenitoras para criar uma planta híbrida; (c) coletar células somáticas da planta híbrida; (d) expressar um sistema de nuclease nas referidas células somáticas, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos
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32/124 um dos referidos alelos polimórficos é clivado no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma quebra de cadeia dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos, em que o cruzamento homólogo ou conversão gênica (não cruzamento) no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado o conduz a uma troca de DNA que expressa ou regula a expressão de pelo menos uma das referidas características ou qualidades benéficas; (e) analisar o progenitor das referidas células de plantas, ou um tecido de plantas crescido a partir das referidas células de plantas, ou uma planta crescida a partir das referidas células ou de um progenitor da referida planta do mesmo, para o referido cruzamento ou conversão de genes (não cruzamento) caso em que a referida combinação de traços é expressa; (f) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta do mesmo, ou progenitor destas plantas, em que a combinação de características é expressa; e (g) propagar a referida célula de planta, o seu tecido de planta, a sua planta, para produzir uma planta progenitora que compreende a referida combinação de características ou qualidades benéficas.
[0049] Em uma modalidade, uma célula de planta é uma célula de planta isolada. Em outra modalidade, uma célula de planta é compreendida dentro de um tecido de planta. Em outra modalidade, uma célula de planta é compreendida dentro de
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33/124 uma planta inteira. Um especialista na técnica apreciará que a utilização ao longo do termo célula de planta compreende em diferentes modalidades uma célula de planta isolada, uma célula de planta compreendida dentro de um tecido de planta, ou uma célula de planta compreendida em uma planta inteira, ou combinação dos mesmos.
[0050] Em algumas modalidades, a origem de uma célula de planta aqui descrita é de uma planta do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a origem de uma célula de planta é de uma planta cultivada que foi selecionada para características desejáveis que podem ser mantidas por propagação. Plantas cultivadas também podem ser conhecidas como cultivares, embora algumas cultivares tenham surgido na natureza.
[0051] Um especialista comum na técnica apreciará que os métodos de direcionar a recombinação de DNA entre cromossomos homólogos são células de plantas somáticas, como aqui descrito, podem abranger utilizações para a reprodução precisa de culturas.
[0052] Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na eliminação de um alelo específico ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, um alelo codifica um polipeptídeo cuja expressão fornece uma característica ou a qualidade benéfica de uma planta ou de
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34/124 um produto de planta, por exemplo um fruto ou um flor. Em algumas modalidades, um alelo codifica um polipeptídeo cuja expressão aumenta um traço benéfico ou a qualidade de uma planta. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na adição de um alelo específico ou de uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resultam na introdução de uma mutação de DNA dentro de um alelo. Em algumas modalidades, os métodos de direcionamento da recombinação de DNA entre cromossomos homólogos resultam na substituição de um alelo por outro alelo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na eliminação de uma sequência de genes reguladores a montante de um alelo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na eliminação da sequência de genes a jusante de um alelo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na adição de uma sequência gênica reguladora a montante de um alelo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta em sequência de genes a jusante de um alelo. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta em
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35/124 mutação de uma sequência de genes reguladores a montante. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos resulta na sequência do gene a jusante. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos resultam em deleção de um alelo específico ou porção dele ou adição de um alelo específico ou porção dele ou introdução de uma mutação de DNA dentro de um alelo ou substituição de um alelo por outro alelo ou deleção de uma sequência do gene a montante regulador de um alelo ou a supressão de sequência de genes a jusante de um alelo ou a adição de uma sequência de gene a montante regulador de um alelo ou sequência de genes a jusante regulador de um alelo ou mutação de um regulador sequência de genes a montante ou de uma sequência genética reguladora a jusante, ou qualquer combinação destes de um alelo.
[0053] Em algumas modalidades, os métodos de recombinação de DNA direcionada entre cromossomos homólogos resultam na substituição do alelo. Em uma modalidade, a substituição alelo compreende a substituição de um gene de tipo selvagem com um alelo mutante no local endógeno. Em outra modalidade, a substituição alelo compreende a substituição de um alelo mutante com um alelo de tipo selvagem no local endógeno. Em outra modalidade, a substituição alelo compreende a substituição de um alelo
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36/124 mutante com um alelo mutante diferente no local endógeno. Em algumas modalidades, os resultados de substituição de alelos na expressão de um traço benéfico ou de qualidade para a célula de planta, tecido da mesma, da mesma planta ou progenitor da mesma. Uma vantagem dos métodos aqui descritos para substituição de alelo é que não há necessidade de desenvolver sequência de ácido nucleico exógeno compreendendo o alelo de substituição, por exemplo, vetores que compreendem os alelos de substituição. A troca de material alélico é entre cromossomos homólogos em uma célula, onde os cromossomos compreendem alelos polimórficos.
[0054] Em algumas modalidades, métodos de recombinação de DNA direcionada entre cromossomos homólogos resultam em substituição de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) . Em uma modalidade, uma substituição de SNP compreende a criação de uma mutação missense em um gene. Em outra modalidade, uma substituição SNP compreende a colocação de uma mutação de sentido errado com o de tipo selvagem nucleotídeos. Em outra modalidade, uma substituição de SNP compreende a criação de uma mutação missense em um gene que aumenta a função do polipeptídeo codificado. Em outra modalidade, uma substituição de SNP compreende a criação de uma mutação missense em um gene que diminui a função do polipeptídeo codificado. Em outra modalidade, uma substituição de SNP, compreendendo a criação de uma mutação
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37/124 sem sentido em um gene que aumenta a expressão do polipeptideo codificado. Em outra modalidade, uma substituição de SNP compreende a criação de uma mutação missense em um gene que diminui a expressão do polipeptideo codificado. Em algumas modalidades, os resultados de substituição SNP na expressão de um traço benéfico ou de qualidade para a célula de planta, tecido da mesma, da mesma planta ou progenitor da mesma. Uma vantagem dos métodos aqui divulgados para a substituição de SNP é que não há necessidade de desenvolver uma sequência de ácido nucleico exógena compreendendo o SNP de substituição, por exemplo, vetores compreendendo o SNP de substituição. A troca de sequência de ácido nucleico compreendendo um SNP é entre cromossomos homólogos em uma célula, em que os cromossomos compreendem alelos polimórficos.
[0055] Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos resultam na transferência de um único local de um cromossomo para seu homólogo via recombinação homóloga (RH), onde uma nova combinação desejada de características é gerada em uma célula de planta progenitors. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos resulta na transferência de um único local de um cromossomo para seu homólogo via recombinação homóloga (RH) , em que uma nova combinação desejada de características é
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38/124 gerada em um tecido de planta progenitora. Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada de DNA entre cromossomos homólogos resulta na transferência de um único local de um cromossomo para seu homólogo via recombinação homóloga (RH) , em que uma nova combinação desejada de características é gerada em uma planta progenitora. Em algumas modalidades, a transferência de um único local compreende rearranjo de fragmentos cromossômicos de um cromossomo ao seu homólogo através de recombinação homóloga (RH), em que uma nova combinação desejada de características é gerada em uma célula de planta descendente. Em algumas modalidades, a transferência de um único local compreende rearranjo de fragmentos cromossômicos de um cromossomo ao seu homólogo através de recombinação homóloga (RH), em que uma nova combinação desejada de características é gerada em um tecido de planta progenitora. Em algumas modalidades, a transferência de um único local compreende rearranjo de fragmentos cromossômicos de um cromossomo ao seu homólogo através de recombinação homóloga (RH) , em que uma nova combinação desejada de características é gerada em uma unidade de progenitor. Em algumas modalidades, a combinação de características não está presente em nenhuma das plantas progenitoras.
[0056] Em algumas modalidades, um local compreende um alelo. Em algumas modalidades, um local compreende uma
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39/124 parte de um alelo. Em algumas modalidades, urn local compreende a sequência a montante de um alelo. Em algumas modalidades, um local compreende a sequência a jusante de um alelo. Em algumas modalidades, um local compreende um único SNP dentro de um alelo. Em algumas modalidades, um local compreende vários SNPs dentro de um alelo. Em algumas modalidades, um local compreende uma sequência de ácido nucleico contígua compreendendo um alelo, uma sequência a montante do alelo, uma sequência a jusante do alelo, uma sequência reguladora do alelo ou um SNP dentro do alelo ou qualquer combinação destes.
[0057] A criação de uma nova característica desejada ou combinação de características é difícil de obter por recombinação natural, por exemplo durante o cultivo de plantas, em que a recombinação não é direcionada a um local específico, e onde a recombinação em um local específico
ocorre menos que 105 -106 vezes/por evento de recombinação
natural.
[0058] Em uma modalidade, um único local compreende
um gene. Em uma modalidade, um único local compreende um
alelo. Em uma modalidade, um único local compreende uma porção de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende uma porção de um alelo. Em uma modalidade, um único local compreende um promotor de gene. Em uma modalidade, um único local compreende um gene exon. Em uma
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40/124 modalidade, um único local compreende pelo menos um exon de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende pelo menos dois exons de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende pelo menos três exons de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende um gene intron. Em uma modalidade, um único local compreende pelo menos um intron de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende pelo menos dois introns de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende pelo menos três introns de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende, pelo menos, um exon e um intron de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende qualquer combinação de exon (s) e intron (s) de um gene. Em uma modalidade, um único local compreende uma sequência de DNA que codifica um RNA pequeno. Em uma modalidade, um único local compreende uma sequência de DNA que codifica um microRNA. Em uma modalidade, um único local compreende uma sequência de DNA que codifica um RNAt. Em uma modalidade, um único local compreende uma sequência de DNA que codifica uma sequência reguladora de genes ou sequências reguladoras.
[0059] Em uma modalidade, os métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos resultam na deleção de um alelo específico ou porção deste. Em outra modalidade, os métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos resultam na adição de um alelo específico ou porção
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41/124 deste. Em outra modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar na introdução de uma mutação de DNA dentro de um alelo. Em outra modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar na substituição de um alelo por outro alelo. Em outra de modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos
resultar na eliminação de uma sequência de gene regulador a
montante ou a jusante de um alelo. Em outra modalidade,
métodos de recombinação específicas entre cromossomos
homólogos resultar na adição de um a montante reguladora ou sequência de genes a jusante de um alelo. Em outra modalidade, os métodos de recombinação específicos entre cromossomos homólogos podem resultar em mutação de um regulador a montante ou sequência do gene a jusante.
[0060] Em outra modalidade, compreende uma mutação uma mutação pontual, uma mutação por deleção, uma mutação de substituição ou uma mutação de inserção, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar em uma mutação pontual. Em outra modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar em uma mutação de deleção. Em outra modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar em uma mutação de substituição. Em outra
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42/124 modalidade, métodos de recombinação específicas entre cromossomos homólogos resultar em uma mutação de inserção.
[0061] Em algumas modalidades, os métodos divulgados aqui knock-out um gene, em que um especialista habilidoso apreciaria que knocking out um gene abrange tornar inoperante um gene dentro do genoma da planta. Em algumas modalidades, um gene knock-out leva à expressão de uma qualidade ou característica benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-out leva a uma expressão aumentada de uma qualidade ou característica benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-out leva à redução da expressão de uma qualidade ou traço negativo em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-out leva à falta de expressão de uma qualidade ou característica não benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, as alças polimórficas de trocas knock-out de um gene.
[0062] Em algumas modalidades, métodos divulgados aqui knock-in um gene, em que um especialista apreciaria que knock-in um gene engloba tornando operacional um gene dentro do genoma da planta que não foi previamente expresso lá. Em algumas modalidades, um gene knock-in leva à expressão de uma qualidade ou característica benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-in leva a uma expressão aumentada de uma qualidade ou característica benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-in conduz à
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43/124 redução da expressão de uma qualidade ou característica negativa em uma planta. Em algumas modalidades, um gene knock-in leva à falta de expressão de uma qualidade ou característica não benéfica em uma planta. Em algumas modalidades, as alças polimórficas de troca de knock-in de um gene.
[0063] Um especialista na técnica apreciaria que a recombinação homóloga engloba um mecanismo de recombinação genética em que duas cadeias de DNA compreendendo sequências de nucleotídeos semelhantes trocam material genético. As células usam recombinação homóloga durante a meiose, onde ela serve para rearranjar o DNA e criar um conjunto único de cromossomos haploides. Células somáticas podem usar recombinação homóloga para o reparo de DNA danificado, em particular para o reparo de quebras de fita dupla (DSB). Em uma modalidade, tal como aqui descrito, a recombinação homóloga é induzida a ocorrer entre cromossomos homólogos compreendendo alelos polimórficos em uma célula somática. O evento de recombinação homóloga pode ser usado para alterar um gene endógeno de várias maneiras. Em algumas modalidades, a recombinação homóloga pode resultar na conversão do gene (não cruzamento) . Em algumas modalidades, a recombinação homóloga pode levar à inativação de um gene endógeno. Em algumas modalidades, a recombinação homóloga pode produzir um local recombinante, por exemplo um alelo, derivado de
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44/124 dois genes relacionados. 0 alelo recombinante recém-criado pode, em uma modalidade, ter uma nova atividade em comparação com qualquer um dos genes a partir dos quais foi derivado. Mudanças nos padrões de metilação no DNA podem levar a mudanças na expressão de um gene ou genes. Em alguns casos, isso pode ser benéfico, enquanto em outros casos, mudanças nos padrões de metilação mostraram estar envolvidas em estados de doença, como o câncer. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada aqui divulgados podem conduzir a alterações de metilação ao nível epigenético, isto é, uma alteração no padrão de metilação. Em outras modalidades, métodos de recombinação homóloga direcionada não levam a alterações de metilação no nível epigenético, isto é, não há variação no padrão de metilação.
[0064] Em algumas modalidades, uma recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos em uma célula somática, em que o local alvo para recombinação compreende alelos polimórficos, é hereditário, em que o evento de recombinação é transmitido à progenitor. Assim, uma vez que uma célula de planta, tecido de planta propagado a partir de uma célula, ou de uma planta propagado a partir de uma célula é analisada e selecionada como compreendendo um evento de recombinação homóloga direcionada, progenitor compreendendo este evento de recombinação direcionada pode ser gerado. Em uma modalidade, o evento recombinante é
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45/124 hereditário através sementes através da linhagem germinal de uma planta propagado a partir de uma célula ou tecido que compreende uma recombinação de DNA direcionada, tal como aqui divulgado. Em outra modalidade, o evento recombinante é hereditário através da regeneração de tecido vegetativo contendo o evento recombinante. Em outra modalidade, o evento recombinante é hereditário através da propagação de tecidos vegetativos contendo o evento hereditário. Exemplos não limitativos de propagação de tecido vegetativo compreendendo os eventos de recombinação aqui divulgados incluem a utilização de um ramo compreendendo o evento recombinante para fazer um corte de árvore ou para enxertar em uma árvore, e utilização de um calo compreendendo um evento recombinante para regenerar uma bananeira.
[0065] O DNA DSB pode servir como uma ferramenta poderosa para alterar e controlar os genomas das plantas. Nas plantas, a maioria das quebras de fita dupla do DNA será reparada pela maquinaria do NHEJ, que normalmente deixa pequenos Indels no local da quebra. (Figura 1) A quebra também pode ser reparada por Recombinação Homóloga (RH) . (Figura 1, Figura 2 e Figura 3 - lado direito) . Em uma modalidade, quando a RH é resolvida por recozimento da cadeia dependente da síntese, o resultado é a conversão do gene (transferência de um local de um cromossomo para o outro cromossomo; também conhecido como um evento não cruzado). Em
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46/124 outra modalidade, quando a RH é resolvida pela formação de junções Holliday, o resultado é um evento de conversão de genes ou um evento de cruzamento, dependendo de como a junção Holliday foi resolvida. Um especialista na técnica apreciará que uma recombinação homóloga de eventos cruzamento entre os cromossomos homólogos engloba troca de cadeias entre sequências de DNA. Em uma modalidade, um evento de cruzamento compreende a troca entre sequências de DNA compreendendo uma composição de nucleotídeos substancialmente semelhante. Em outra modalidade, um evento de cruzamento compreende a troca entre sequências de DNA de cromossomos homólogos compreendendo alelos polimórficos, em que o evento de cruzamento engloba troca de cadeia entre sequências de DNA compreendendo um alelo polimórfico. Por outras palavras, a recombinação homóloga por cruzamento de cromossomos homólogos compreendendo um alelo polimórfico pode resultar em uma troca prolongada da sequência de DNA em que a sequência compreende uma sequência compreendendo uma composição nucleotídica diferente. Além disso, os eventos de cruzamento de recombinação homóloga, em uma outra modalidade, fornecem a troca da sequência de DNA que flanqueia um DSB.
[0066] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados de recombinação homóloga direcionada dentro de um sítio alvo endógeno compreendem uma troca de sequência de
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DNA contígua em que a referida sequência de DNA contígua compreende cerca de 0,01KB-20KB DNA. Em algumas modalidades, os métodos aqui de recombinação homóloga direcionada divulgadas dentro de um sítio alvo endógeno compreendem uma troca de sequência de DNA contígua em que a referida sequência de DNA contígua compreende cerca de DNA 0.1KB20KB. Em algumas modalidades, os métodos aqui de recombinação homóloga direcionada divulgadas dentro de um sítio alvo endógeno compreendem uma troca de sequência de DNA contígua em que a referida sequência de DNA contígua compreende cerca de DNA 1 kb-20KB.
[0067] Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de cerca de 1 KB-5KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de cerca de 5 KB-10KB. Em algumas modalidades, métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de cerca de 10 KB-15KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de cerca de 15 KB-20KB.
[0068] Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 1 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 2 KB. Em algumas modalidades, os
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48/124 métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 3 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 4 KB. Em algumas modalidades, métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 5 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 6 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 7 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 8 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 9 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 10 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 11 KB. Em algumas modalidades, métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 12 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 13 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 14 KB. Em algumas modalidades, os métodos
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49/124 de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 15KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 16 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 17 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 18 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 19 KB. Em algumas modalidades, os métodos de recombinação homóloga direcionada compreendem uma troca de pelo menos cerca de 20 KB.
[0069] A Figura 2 demonstra esquematicamente como o reparo de quebras direcionadas pode ser usado como uma ferramenta de reprodução precisa. Os produtos de reparo dessas quebras podem ser muito úteis para reprodução. Em uma modalidade, a recombinação homóloga é usada para fornecer as características de uma variedade de plantas de tipo selvagem em uma cultivar conhecida. Em outra modalidade, a recombinação homóloga é usada para fornecer as características de uma cultivar conhecida possuindo uma característica específica para uma segunda cultivar conhecida falta a característica específica. Em algumas modalidades, o reparo de DSB por recombinação homóloga
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50/124 quebra uma ligação genética muito forte de 2 genes envolvidos em características importantes. Por exemplo: quando um gene envolvido na resistência a doenças (Figura 2 R) está localizado próximo a um gene envolvido na produção de alto rendimento (Figura 2 Y) , o cruzamento meiótico natural pode ser muito baixo. A indução de um DSB alvo entre esses dois genes, entre Yr no cromossomo azul e yR no cromossomo vermelho, seguida de reparo de cruzamento homólogo dissociará entre os dois traços ligados permitindo gerar a nova combinação recombinante em um progenitor com alto rendimento e resistência à doença. Isso também permite minimizar o comprimento dos segmentos cromossômicos de variedades selvagens que podem conter genes indesejáveis.
[0070] Em uma modalidade, os métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos, como aqui divulgados, diferem dos métodos de direcionamento de genes por recombinação homóloga que envolvem a troca de informação genética entre moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) genômicas e exógenas por recombinação homóloga. Em outra modalidade, um modo de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos, tal como aqui divulgado, não envolve ou requer ou utiliza um fragmento homólogo exógeno de DNA como molde para recombinação homóloga.
[0071] Os métodos aqui descritos são vantajosos em comparação com métodos de direcionamento de genes conhecidos
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51/124 na técnica que requerem fragmentos de DNA exógenos como modelos para troca de informação genética entre moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) genômicas e exógenas via recombinação homóloga. Outra vantagem é que a célula da planta resultante da qual o tecido da planta do progenitor e plantas inteiras podem ser geradas não é transgênica. Em uma modalidade, uma célula de planta descendente, tecido de planta, ou planta inteira produzidos utilizando os métodos aqui descritos não compreendem DNA estranho a partir do sistema de nuclease que pode ser eliminado, por exemplo, por segregação genética ou que pode ser fornecida pela expressão transiente. A recombinação homóloga direcionada aqui descrita mimetiza o fenômeno natural da recombinação homóloga, mas porque o DSB é alvo, o evento de DNA recombinante é direcionado para trocar, por exemplo, características vantajosas. Outra vantagem da utilização de métodos de recombinação direcionada aqui descritos que a obtenção de uma planta compreendendo o evento desejado implicaria rastreio de dezenas de milhares de plantas, a fim de identificar uma planta que compreende a troca específica de características por recombinação homóloga natural (nãoinduzida/ não-direcionada). Outra vantagem adicional sobre os métodos que utilizam DNA exógeno é que se demonstrou que o DNA exógeno pode alterar o padrão de metilação do DNA no local de inserção. Em uma modalidade, métodos de recombinação
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52/124 direcionada aqui divulgado alterar o padrão de metilação de DNA no local da conversão do gene. Em outra modalidade, métodos de recombinação direcionada aqui divulgado alterar o padrão de metilação do DNA em um local de passagem. Em uma modalidade, métodos de recombinação direcionada aqui descritos não alterar o padrão de metilação de DNA no local da conversão do gene. Em outra modalidade, métodos de recombinação direcionado aqui divulgados não alterar o padrão de metilação do DNA em um local de passagem.
[0072] Em uma modalidade, os métodos aqui divulgados são utilizados com células de plantas somáticas. Um especialista na matéria apreciaria que uma célula de planta somática abrange qualquer célula de planta, exceto as células da linhagem germinativa. Em outra modalidade, as células de plantas somáticas são selecionadas a partir do grupo que compreende células da raiz, células rizoides, células do bulbo, células, as células de folhas, células de broto, células de vagem de sementes, ou células-tronco de fruta. Em algumas modalidades, uma célula de planta somáticas feita pelos métodos aqui divulgados pode ser cultivada sob as condições apropriadas conhecidas na técnica, a fim de gerar um DNA que compreende tecido de planta compreendendo o evento de RH direcionada, por exemplo, a conversão do gene ou evento de cruzamento. Em uma modalidade, um tecido de planta compreende um tecido de raiz, um tecido rizoide, um tecido
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53/124 de bulbo, um tecido de haste, um tecido de folha, um tecido de gema, um tecido de tubérculo, um corte de árvore, um calo de planta, uma semente ou uma vagem de semente ou um tecido de fruta, ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, um tecido de plantas cultivadas a partir de uma célula de planta produzidos através de métodos aqui divulgados podem ser utilizados para produzir uma planta descendente, por exemplo, um corte pode ser utilizado para produzir uma árvore ou uma parte de uma árvore no caso de enxerto.
[0073] Em algumas modalidades, uma célula de planta que compreende uma recombinação somática de DNA alvo utilizando os métodos aqui divulgados, pode ser cultivada sob as condições apropriadas conhecidas na técnica, a fim de gerar uma planta inteira, em que a referida planta compreende a recombinação direcionada de DNA resultante.
[0074] Em outra modalidade, uma planta completa compreendendo a recombinação de DNA direcionada resultante compreende o DNA recombinante em tecidos ao longo da planta. Em outra modalidade, a planta inteira compreende o DNA recombinante em tecidos em apenas uma porção da planta. Por exemplo, em outra modalidade, a planta inteira compreende o DNA recombinante em uma fruta. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante em sementes. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante em vagens de sementes. Em outra modalidade, toda a planta
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54/124 compreende o DNA recombinante no pólen. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante nas folhas. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante no tecido da raiz. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante em tecido rizoide. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante em tecido de bulbo. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante nas hastes. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante nos gomos. Em outra modalidade, toda a planta compreende o DNA recombinante em frutas, sementes, vagens de sementes, folhas, tecidos da raiz, tecido rizoide, tecido de bulbo, hastes, ou gomos, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0075] Em algumas modalidades, uma célula de planta somática compreende um protoplasto. Um especialista apreciará que um protoplasto abrange uma célula de planta que teve sua parede celular protetora parcialmente ou totalmente removida, por exemplo, por tratamento enzimático resultando em uma unidade bioquímica competente intacta de planta viva que pode regenerar a parede celular e crescer ainda mais uma planta inteira sob condições adequadas de crescimento. A parede celular de uma planta pode também ser parcial ou totalmente removida utilizando tratamentos mecânicos, em que uma unidade bioquímica competente intacta de planta viva é um produto que pode regenerar a parede
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55/124 celular e um crescimento adicional em uma planta inteira sob condições de crescimento apropriadas.
[0076] Em algumas modalidades, métodos divulgados aqui fazendo uma célula de planta somática compreendendo DNA compreendendo um evento de recombinação homóloga direcionada como aqui divulgado, em que a referida célula de planta compreende um protoplasto, pode ser usado para fazer um tecido de planta crescendo o protoplasto sob o próprio condições de crescimento conhecidas na técnica para regenerar a parede celular e depois o tecido de planta em crescimento. Em algumas modalidades, o método aqui descrito, fazendo uma célula de planta somática compreendendo DNA que compreende um evento de recombinação homóloga direcionada, tal como aqui descrito, em que a referida célula de planta compreende um protoplasto, pode ser usado para fazer uma planta inteira através de cultura dos protoplastos nas condições adequadas de crescimento conhecidos na técnica, a fim de regenerar a parede celular e, em seguida, o crescimento da planta inteira.
[0077] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente uso de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos. Um especialista na técnica apreciará que o termo engloba cromossomos homólogos cromossomos que contêm informação para as mesmas características biológicas e contêm os mesmos genes no mesmo local, mas, possivelmente,
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56/124 de diferentes alelos esses genes. Em algumas modalidades, os cromossomos homólogos abrangem cromossomos que contêm informações para as mesmas características biológicas e contêm os mesmos genes nos mesmos loci, mas possuem diferentes padrões de metilação para esses genes, o que pode afetar os níveis de expressão dos genes.
[0078] Um especialista na técnica apreciará que o termo alelo (s) pode abranger qualquer uma de uma ou mais formas alternativas de um gene em um local particular. Em uma célula diploide (ou anfidiploide) de uma planta, os alelos de um determinado gene estão localizados em um local específico ou local (loci plural) em um cromossomo. Um alelo está presente em cada cromossomo do par de cromossomos homólogos. Em uma modalidade, os alelos polimórficos compreendem alelos os quais são diferentes nos loci cromossômico correspondente. O termo alelos polimórficos pode ser usado de maneira intercambiável com alelos heterólogos ou alelos heterozigotos, tendo todos os mesmos significados e qualidades.
[0079] Além disso, o especialista apreciará que o termo locus (loci plural) abrange um local ou locais específicos ou um sítio em um cromossomo onde, por exemplo, se encontra um gene ou marcador genético. Em algumas modalidades, um local é compreendido dentro de uma região de DNA eucromático. Em algumas modalidades, um sítio alvo
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57/124 endógeno pré-selecionado compreende uma região de DNA heterocromático. Em algumas modalidades, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de DNA eucromático ou DNA heterocromático.
[0080] Em algumas modalidades, um sítio-alvo endógeno pré-selecionado compreende um local em um cromossomo onde um gene ou um marcador genético é encontrado. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende um exon de um gene. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende um intron de um gene. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno préselecionado compreende múltiplos exons e introns de um gene. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região incluindo o limite entre pelo menos um exon e um intron. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende sequências reguladoras a montante. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno préselecionado compreende sequências reguladoras a jusante. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende sequências reguladoras localizadas dentro do local gênico. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende sequências de fluxo ascendente. Em outra modalidade, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende sequências a jusante.
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58/124 [0081] Em algumas modalidades, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de DNA eucromático. Em algumas modalidades, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de DNA heterocromático. Em algumas modalidades, um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de DNA eucromático ou DNA heterocromático.
[0082] Um técnico habilitado apreciaria que o cromossomo de planta possuísse heterocromátina pericentromérica altamente condensada e braços eucromáticos amplamente descondensados. A heterocromátina é frequentemente associada à inatividade transcricional e à recombinação genética suprimida. No entanto, enquanto a heterocromátina pode ser pobre em genes em comparação com a eucromatina, ela ainda contém genes transcricionalmente ativos. Nas plantas, além da heterocromátina localizada nas regiões centromérica e pericentromérica, a heterocromátina localiza-se no organizador nucleolar, nos botões e ao longo dos cromossomos B do milho (Zea mays). Dentro dos genomas das plantas, a localização de genes potencialmente ativos foi identificada na heterocromátina, por exemplo, nas estruturas dos botões e na região pericentromérica. No entanto, enquanto a heterocromátina pode ser pobre em genes em comparação com a eucromatina, ela ainda contém genes transcricionalmente ativos. Os resultados surpreendentes
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59/124 apresentados abaixo no Exemplo 5, demonstram que os métodos divulgados aqui para recombinação de DNA direcionada específica para o local entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática, funcionam tanto para a eucromatina como inesperadamente, heterocromatina onde a recombinação é geralmente suprimida.
[0083] Em outra modalidade, uma nuclease aqui divulgada é guiada para uma região dentro de um sítio alvo endógeno pré-selecionado, em que o referido comprimento da região de direcionamento compreende cerca de 20 pb. Em outra modalidade, o comprimento da região de direcionamento compreende cerca de 30 pb. Em outra modalidade, o comprimento região de direcionamento compreende menos de 20 pb. Em outra modalidade, o comprimento da região de direcionamento para DSB compreende mais de 20 pb. Em algumas modalidades, uma nuclease aqui divulgada é guiada para uma região alvo, a fim de criar um DSB.
[0084] Em algumas modalidades, o sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende o alelo polimórfico. Em algumas modalidades, o sítio alvo endógeno pré-selecionado é adjacente ao alelo polimórfico. Em algumas modalidades, o sítio alvo endógeno pré-selecionado está a montante do alelo polimórfico. Em algumas modalidades, o sítio alvo endógeno pré-selecionado está a jusante do alelo polimórfico
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60/124 [0085] Em algumas modalidades, a recombinação homóloga direcionada entre cromossomos homólogos abrange trocas de DNA guiadas por sequências homólogas presentes nos cromossomos homólogos presentes no genoma das células de plantas e atuadas por maquinaria enzimática da célula (Figura 3; Figura 4A; Figura 6A). Em uma modalidade, a troca de DNA inclui DNA dentro do sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui, mas não está limitado a DNA dentro do sítio alvo endógeno pré-selecionada. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA no sítio alvo endógeno e pré-selecionada de DNA adjacente ao sítio alvo endógeno pré-selecionada. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA compreendendo todo o sítio alvo endógeno préselecionado. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA que compreende todo o sítio alvo endógeno e pré-selecionada de DNA adjacente ao sítio alvo endógeno pré-selecionada. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA compreendendo apenas uma porção do sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA que compreende apenas uma parte do sítio alvo endógeno e pré-selecionada de DNA adjacente ao sítio alvo endógeno pré-selecionada. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA 3' para o DSB. Em outra modalidade, a troca de DNA inclui DNA5 'para o DSB.
[0086] Em algumas modalidades, uma célula de planta utilizada nos métodos aqui descritos tem mutações em genes
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61/124 e ou elementos reguladores dos mesmos, que são necessários para a via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) após um DSB. de reparo de DNA homólogo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula de planta pode ter uma mutação em um gene ku (por exemplo, ku70 e ou ku80). Em algumas modalidades, uma célula de planta pode ter uma mutação em lig4. Em algumas modalidades, uma célula de planta pode ter uma mutação em qualquer gene ou elemento regulador, em que a mutação levaria a uma redução do reparo de NHEJ após um DSB.
[0087] A Figura 3 apresenta esquematicamente algumas modalidades de um método de indução de recombinação homóloga entre cromossomos homólogos, por exemplo, cromossomos homólogos em uma célula de planta, em um tecido de planta ou em uma planta completa. Um método de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos no genoma de uma célula somática, por exemplo uma célula de planta, compreende três passos:
(1) Expressão de um sistema de nuclease na célula de planta;
(2) Induzir uma quebra de fita dupla de DNA em um ou ambos os alelos de um local pré-selecionado; e (3) reparar o DNA via recombinação entre cromossomos homólogos. Em uma modalidade, aqui divulgado um método de recombinação direcionada de DNA entre os cromossomos homólogos em uma célula de planta somática, o método compreendendo as etapas de (a) expressar um sistema de nuclease na célula da planta,
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62/124 do sistema da nuclease em que a referida expresso é direcionado a um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a expressão do sistema de nuclease o DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos clivado no referido sítio alvo endógeno previamente selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma quebra de cadeia dupla (DSB) no DNA de pelo menos um dos alelos polimórficos;
(b) analisar o progenitor da referida célula de planta, ou em um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou de um progenitor da referida planta do mesmo, para a recombinação homóloga entre os cromossomos homólogos, em que a recombinação homóloga compreende cruzamento ou conversão gênica (não cruzamento); e (c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta do mesmo, ou progenitor da mesma planta, compreendendo o DNA compreendendo o referido evento recombinação direcionada homóloga.
[0088] Figura 3 - Etapa 1: Expressão do sistema de nuclease. O sistema de nuclease a ser expresso pode compreender qualquer sistema de nuclease capaz de direcionar uma atividade de divagem de cadeia dupla para um sítio préselecionado no DNA de pelo menos um alelo dos cromossomos homólogos.
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63/124 [0089] Por exemplo, em algumas modalidades, um sistema de nuclease utilizado em um método aqui descrito compreende um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN) ou repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR)/sistema de proteínas associadas CRISPR (Cas). Em outras modalidades, um sistema de nuclease utilizado em um método aqui divulgado compreende qualquer sistema de nuclease capaz de atingir uma nuclease capaz de divagem de cadeia dupla de DNA para um local préselecionado no DNA. Em outra modalidade, um sistema de nuclease compreende um Argonauta bacteriano e um guia de DNA. Em outra modalidade, a nuclease de cadeia dupla cliva o DNA para produzir extremidades cegas. Em outra modalidade, a nuclease de cadeia dupla cliva o DNA para produzir extremidades de corte recortadas.
[0090] Em outra modalidade, a nuclease de cadeia dupla cliva o DNA dentro do alelo polimórfico. Em outra modalidade, a nuclease de cadeia dupla cliva o DNA a montante do alelo polimórfico. Em outra modalidade, a nuclease de cadeia dupla cliva o DNA a jusante do alelo polimórfico. Em outra modalidade, um sistema de nuclease compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), em que o ZFN podem ser conhecidos na técnica ou recém-criado para clivar um sítio pré-selecionado. Em outra modalidade, um sistema de nuclease
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64/124 compreende uma nuclease efetora do tipo ativadora de transcrição (TALEN), em que o TALEN pode ser conhecido na técnica ou recém-criado para clivar um sitio préselecionado. Em outra modalidade, um sistema de nuclease compreende um agrupado de repetições curtas palindrômicas regularmente intervaladas (CRISPR)/proteínas CRISPR associada ao sistema (Cas) (CRISPR/Cas), em que o sgRNA e ou o Cas podem ser conhecidos na técnica ou recém-criados para clivar em um sítio pré-selecionado.
[0091] O especialista apreciará que os termos RNA de guia único, sgRNA e gRNA são intercambiáveis com todas as mesmas qualidades e significados, em que um sgRNA pode abranger uma molécula de RNA quimérica que é composta de um RNA de CRISPR (crRNA) e RNA de CRISPR trans-codifiçado (tracRRNA). Em algumas modalidades, um crRNA é complementar a uma região de DNA dentro de um sítio alvo endógeno préselecionado em pelo menos um dos cromossomos homólogos, em que o crRNA direciona a proteína nuclease de polipeptídeo associado a CRISPR (Cas) ao sítio alvo endógeno préselecionado .
[0092] Em uma modalidade, o comprimento da sequência de crRNA complementar é 19-22 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 19-22 nucleotídeos consecutivos complementares ao alvo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de crRNA complementar à região de DNA é de cerca de 15-30
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65/124 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de crRNA complementar à região do DNA é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de crRNA complementar à região de DNA é de 20 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, o crRNA está localizado na extremidade 5' da molécula de sgRNA. Em outra modalidade, o crRNA compreende 100% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 80% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 85% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 90% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 95% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 97% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada. Em outra modalidade, o crRNA compreende pelo menos 99% de complementação dentro da sequência alvo préselecionada.
[0093] Em outra modalidade, um tracrRNA tem 100-300 ribonucleotídeos de comprimento e fornece um local de ligação
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66/124 para a nuclease Cas, por exemplo, uma proteína Cas9 formando o complexo CRISPR/Cas9.
[0094] Em uma modalidade, o sistema de nuclease compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) compreendendo um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco e um domínio de divagem de nuclease de DNA, em que o referido domínio de ligação de DNA de dedo de zinco se liga no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. direcionando o domínio de divagem da nuclease de DNA para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno previamente selecionado.
[0095] Um especialista na técnica apreciará que os
termos nuclease do dedo de zinco ou ZFN são
intercambiáveis com todos os mesmos significados e
qualidades, em que uma ZFN abrange uma molécula de proteína quimérica compreendendo pelo menos um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco operativamente ligado a pelo menos uma nuclease capaz de clivar o DNA em cadeia dupla. Em uma modalidade, uma nuclease de dedo de zinco cria uma quebra de cadeia dupla em um sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outra modalidade, uma nuclease de dedo de zinco compreende um domínio de ligação a DNA e um domínio de divagem de DNA, em que o domínio de ligação ao DNA é constituído por pelo menos um dedo de zinco e está operativamente ligado a um domínio de divagem de DNA. Em outra modalidade, um dedo de zinco domínio de ligação ao DNA está no N-terminal da
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67/124 molécula da proteína quimérica e o domínio de divagem de DNA está localizado na extremidade C-terminal da molécula. Em outra modalidade, um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco é na extremidade C-terminal da molécula da proteína quimérica e o domínio de divagem de DNA está localizado na extremidade N-terminal da molécula. Em outra modalidade, um domínio de ligação de dedo de zinco engloba a região de uma nuclease de dedo de zinco que é capaz de se ligar a um local de destino, por exemplo, um sítio alvo endógeno préselecionado tal como aqui divulgado. Em outra modalidade, um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA compreende um domínio de proteína que se liga a um sítio alvo endógeno pré-selecionado em, pelo menos, um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA compreende um domínio de proteína que se liga a um alelo polimórfico em, pelo menos, um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA compreende um domínio de proteína que se liga a um sítio alvo endógeno pré-selecionado em ambos os cromossomos homólogos. Em outra modalidade, um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA compreende um domínio de proteína que se liga a alelos polimórficos em ambos os cromossomos homólogos.
[0096] O especialista apreciará que o termo proteína quimérica é usado para descrever uma proteína que foi expressa a partir de uma molécula de DNA que foi criada
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68/124 unindo operativamente dois ou mais fragmentos de DNA. Os fragmentos de DNA podem ser da mesma espécie, ou podem ser de uma espécie diferente. Os fragmentos de DNA podem ser do mesmo gene ou de um gene diferente.
[0097] O especialista apreciará que o termo domínio de divagem do DNA de uma ZFN abrange a região na nuclease do dedo de zinco que é capaz de quebrar as ligações químicas entre os ácidos nucleicos em uma cadeia nucleotídica. Exemplos de proteínas contendo domínios de divagem incluem enzimas de restrição, topoisomerases, recombinases, integrases e DNAses.
[0098] Em uma modalidade, um sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease efetor do tipo ativador de transcrição (TALEN) compreendendo um domínio de ligação de DNA efetor TAL e um domínio de divagem de DNA, em que o referido domínio de ligação de DNA efetor TAL se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, direcionando assim o domínio de divagem do DNA para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno previamente selecionado.
[0099] Um especialista na técnica apreciará que os termos nuclease efetora do tipo ativadora de transcrição, TALEN e nuclease efetora TAL podem ser utilizados indistintamente tendo todos os mesmos significados e qualidades, em que um TALEN abrange uma nuclease capaz de
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69/124 reconhecer e clivar o seu local alvo, por exemplo, um sítio alvo endógeno pré-selecionado tal como aqui divulgado. Em outra modalidade, um TALEN compreende uma proteína de fusão compreendendo um domínio TALE e um domínio de divagem de nucleotídeos. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende um domínio proteico que se liga a um nucleotídeo de um modo específico da sequência através de um ou mais módulos de repetição TALE. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende um domínio de proteína que se liga a um sítio alvo endógeno pré-selecionado em pelo menos um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende um domínio proteico que se liga a um alelo polimórfico em pelo menos um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende um domínio proteico que se liga a um sítio alvo endógeno previamente selecionado em ambos os cromossomos homólogos. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende um domínio proteico que se liga a alelos polimórficos em ambos os cromossomos homólogos.
[00100] Em uma modalidade, um domínio TALE compreende pelo menos um dos módulos de repetição de TALE. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende de um a trinta módulos de repetição TALE. Em outra modalidade, um domínio TALE compreende mais de trinta módulos de repetição.
[00101] Em outra modalidade, uma proteína de fusão TALEN compreende um domínio N-terminal, um ou mais módulos
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70/124 de repetição TALE seguidos por um módulo de meia repetição, um ligante e um domínio de divagem de nucleotídeos.
[00102] Em uma modalidade, um sistema de nuclease compreende um sistema CRISPR/Cas. Em outra modalidade, um CRISPR/Cas sistema compreende uma nuclease Cas e uma molécula gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, desse modo guiar o referido Cas nuclease para clivar o DNA no interior do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado.
[00103] Em algumas modalidades, um sistema CRISPR/Cas compreende um sistema enzimático incluindo uma sequência guia de RNA (gRNA ou sgRNA) que contém uma sequência nucleotídica complementar ou substancialmente complementar a uma região de um polinucleotideo alvo, por exemplo sítio alvo endógeno pré-selecionado e uma proteína com atividade de nuclease.
[00104] Em outra modalidade, um sistema CRISPR/Cas compreende um sistema CRISPR-Cas Tipo I, ou um sistema CRISPR-Cas Tipo II, ou um sistema CRISPR-Cas Tipo III, ou derivados dos mesmos. Em outra modalidade, um sistema de CRISPR-Cas compreende sistemas de nuclease modificados e/ou programados derivados de sistemas CRISPR-Cas que ocorrem naturalmente. Em outra modalidade, um sistema CRISPR-Cas compreende proteínas Cas modificadas e/ou mutadas. Em outra
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71/124 modalidade, um sistema CRISPR-Cas compreende RNA guia modificado e/ou programado.
[00105] Um termo RNA guia especialista na técnica apreciará que o englobe um RNA contendo uma sequência que é complementar ou substancialmente complementar a uma região de uma sequência de DNA alvo. Um
RNA guia pode conter sequências nucleotidicas diferentes da região complementar ou substancialmente complementar a uma região de uma sequência de DNA alvo, por exemplo um sitio alvo endógeno previamente selecionado.
Em outra modalidade, um
RNA guia compreende um crRNA ou um derivado do mesmo.
Em outra modalidade um RNA guia compreende uma quimera de crRNA:
tracrRNA.
[00106] Em outra modalidade, uma molécula de gRNA compreende um domínio que é complementar e se liga a um sítio alvo endógeno pré-selecionado em pelo menos um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, uma molécula de gRNA compreende um domínio que é complementar e se liga a um alelo polimórfico em pelo menos um cromossomo homólogo. Em outra modalidade, uma molécula de gRNA compreende um domínio que é complementar e se liga a um sítio alvo endógeno préselecionado em ambos os cromossomos homólogos. Em outra modalidade, uma molécula de gRNA compreende um domínio que é complementar e se liga a alelos polimórficos em ambos os cromossomos homólogos.
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72/124 [00107]
As enzimas
Cas compreendem endonuclease de
DNA guiada por
RNA capaz de fazer quebras duplas (DSB) no
DNA. O termo enzima
Cas pode usado de forma intercambiável com os termos endonucleases associadas a
CRISPR ou polipeptideos associados a CRISPR tendo todas as mesmas qualidades e significados. Em uma modalidade, uma enzima Cas é selecionada do grupo que compreende Casl, CaslB,
Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, CaslO, C2cl,
CasX, NgAgo , Cpfl, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2,
Cs5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr 1, Cmr 3, Cmr 4,
Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3 , Csxl7, Csx :14, Cs xlO, Csxl6,
CsaX, Csx3, Csxl , Csx 15, i Csfl, Csf2, Csf3 e Csf4, ou
homólogos dos mesmos, ou suas versões modificadas. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas9 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Casl. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende CaslB. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas4 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas5 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas6 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas7 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cas8 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende CaslO. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cpfl. Em outra
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73/124
modalidade, uma enzima Cas compreende Csyl. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csy2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csy3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csel. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cse2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cscl. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csc2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csa5 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csn2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csm2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csm3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csm4 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csm5 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csm6 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cmr 1 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cmr3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cmr 4 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cmr 5 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cmr 6 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csbl . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csb2 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csb3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csxl7. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csxl4. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende CsxlO. Em outra
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74/124 modalidade, uma enzima Cas compreende Csxl6, CsaX. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csx3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csxl , Csxl5, Csf1. Em
outra modalidade, uma enzima Cas compreende Csf2. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csf 3 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Csf 4 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende Cpf 1 . Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende C2cl. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende CasX. Em outra
modalidade, uma enzima Cas compreende NgAgo. Em outra
modalidade, uma enzima Cas é homóloga Cas . Em outra
modalidade, uma enzima Cas é um ortólogo Cas. Em outra
modalidade, uma enzima Cas é uma enzima Cas modificada. Em outra modalidade, uma enzima Cas é qualquer endonuclease associada a CRISPR conhecida na técnica.
[00108] Em uma modalidade, uma célula de planta somática é transformada, a fim de expressar um sistema de nuclease ou um componente do mesmo. Em outra modalidade, pelo menos uma célula parental de uma célula de planta somática é transformada de modo a expressar um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, um dos progenitores da célula de planta somática é transformado para expressar um sistema de nuclease ou um seu componente. Em uma outra modalidade, cada um dos progenitores da célula de planta somática é transformado para expressar um
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75/124 componente de um sistema de nuclease. Em outra modalidade, um dos progenitores é transformado para expressar ambos os componentes de um sistema de nuclease.
[00109] Em algumas modalidades, após um evento de recombinação homóloga as células do progenitor, tecido e ou plantas já não contém um alvo para o sistema de nuclease. (Por exemplo, ver Figura 6A, em que DSB adicionais não ocorrem como o sítio alvo endógeno previamente selecionado. A sequência do DNA mostrou que não existem eventos DSB adicionais.) Em algumas modalidades, a seguir recombinação homóloga induzida por um DSB em o sítio alvo endógeno, a sequência do sítio alvo endógeno foi alterada pela RH. Em algumas modalidades, após recombinação homóloga induzida pelo DSB, o sistema de nuclease não tem funcionalidade. Em algumas modalidades, após recombinação homóloga induzida pelo DSB, o sistema de nuclease não tem a capacidade de direcionar uma atividade de nuclease para o sítio alvo endógeno.
[00110] Em outra modalidade, uma célula de planta somática é compreendida dentro de uma planta híbrida ou dentro de uma planta heterozigótica, em que a referida célula compreende alelos polimórficos. Em outra modalidade, uma célula de planta compreende uma somática híbrida existente ou célula de planta heterozigótica ter alelos polimórficos no sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outra modalidade,
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76/124 uma célula de planta somática compreendendo alelos polimórficos transformada para expressar um sistema de nuclease.
[00111] Em uma modalidade, uma célula somática é transformada com um DNA que codifica um sistema de nuclease ou um componente do mesmo. Em outra modalidade, um tecido isolado de uma planta é transformado com um DNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, uma célula parental é transformada com um DNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, ambas as células progenitoras são transformadas com um DNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente.
[00112] Em uma modalidade, uma célula somática é transformada com um RNA que codifica um sistema de nuclease ou um componente do mesmo. Em outra modalidade, um tecido isolado de uma planta é transformado com um RNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, uma célula parental é transformada com um RNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, ambas as células progenitoras são transformadas com um RNA que codifica um sistema de nuclease ou um seu componente.
[00113] Em uma modalidade, uma célula somática é transformada com um polipeptídeo compreendendo um sistema de
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77/124 nuclease ou um componente do mesmo. Em outra modalidade, um tecido isolado de uma planta é transformado com um polipeptídeo compreendendo um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, uma célula parental é transformada com um polipeptídeo compreendendo um sistema de nuclease ou um seu componente. Em outra modalidade, ambas as células progenitoras são transformadas com um polipeptídeo compreendendo um sistema de nuclease ou um seu componente.
[00114] Em algumas modalidades, a transformação de uma célula de planta ou de um tecido de planta isolado é por qualquer método conhecido na técnica. Em outra modalidade, a transformação resulta em expressão transitória. Em outra modalidade, a transformação resulta em expressão estável. Em outra modalidade, a transformação estável é pelo método de Agrobacterium. Em outra modalidade, a transformação compreende transformação direta. Em outra modalidade, a transformação direta compreende o uso de polietilenoglicol (PEG) . Em outra modalidade, a transformação direta compreende o uso de eletroporação através de bombardeamento.
[00115] Em algumas modalidades, o DNA introduzido em uma célula de planta, por exemplo, DNA que codifica um sistema de nuclease pode ser eliminado do genoma da planta por segregação genética. Alternativamente, em algumas modalidades, o DNA é expresso transitoriamente e assim não permanece na célula da planta.
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78/124 [00116] Figura 3, caixa a ilustra que a transformação pode ser para ambas as plantas progenitoras, em que, por exemplo, cada um deles sendo transformado com um componente da nuclease, por exemplo, uma nuclease CRISPR/Cas, que se torna ativo após a hibridação. Ambos os componentes da nuclease podem ser introduzidos em uma das plantas progenitoras (Figura 3, caixa b). Na modalidade ilustrada na Figura 3, caixa b, a nuclease deve ser silenciosa e tornarse ativada no híbrido (utilizando um sistema induzível). Em outra modalidade ilustrada na Figura 3, caixa b, o sistema de nuclease pode ser direcionado para o alelo do segundo progenitor enquanto não cliva o alelo da célula de planta progenitora transformada, tornando-se assim ativo de um modo específico para o alelo no híbrido. Em ainda outra modalidade, a transformação pode ser realizada sobre um híbrido existente ou uma planta heterozigótica (Figura 3 caixa c) com todos os componentes de nuclease.
[00117] Em algumas modalidades, a atividade ou ativação de um sistema de nuclease é induzível. Em outra modalidade, um sistema de nuclease induzível pode utilizar promotores induzíveis. Em outra modalidade, um promotor induzível pode ser específico de tecido. Em outra modalidade, um promotor induzível pode ser induzido (ligado) sob condições estressantes para uma célula ou tecido de planta. Em algumas modalidades, a atividade ou ativação de um sistema
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79/124 de nuclease é constitutiva. Em outra modalidade, a atividade ou ativação pode ser específica do tecido. Em outra modalidade, a expressão do sistema de nuclease ou uma porção deste é regulada. Em outra modalidade, um promotor constitutivo é utilizado para expressar todos os componentes de um sistema de nuclease aqui divulgado. Em outra modalidade, qualquer promotor de planta regulável conhecido na técnica é utilizado para expressar todos os componentes de um sistema de nuclease aqui divulgado. Em outra modalidade, qualquer promotor de planta regulável conhecido na técnica é utilizado para expressar pelo menos um componente de um sistema de nuclease aqui divulgado. Em outra modalidade, qualquer promotor regulável conhecido na técnica e funcional na célula de planta é utilizado para expressar todos os componentes de um sistema de nuclease aqui divulgado. Em outra modalidade, qualquer promotor regulável conhecido na técnica e funcional na célula de planta é utilizado para expressar pelo menos um componente de um sistema de nuclease aqui divulgado.
[00118] Em algumas modalidades, uma célula de planta somática compreende uma célula do progenitor de cruzamento de duas células de plantas ou plantas cultivadas, em que as células de plantas parentais cada um compreende um alelo polimórfico em comparação com o referido mate no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em algumas modalidades,
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80/124 uma célula de planta somática compreende uma célula de um progenitor de planta de um cruzamento entre duas linhagens parentais polimórficas, que cria uma planta híbrida, em que as referidas linhagens de plantas parentais compreendem, cada uma, um alelo polimórfico no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado e uma das linhagens parentais compreende o referido sistema de nuclease. Em algumas modalidades, uma célula de planta somática compreende uma célula de um progenitor de planta de um cruzamento entre duas linhagens parentais polimórficas, que cria uma planta híbrida, em que as referidas linhagens de plantas parentais compreendem, cada uma, um alelo polimórfico no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado e das linhagens parentais compreende um componente do sistema de nuclease.
[00119] Um especialista na técnica apreciará que o termo progenitor, tal como usado aqui, engloba o progenitor de autofecundação ou um cruzamento e inclui o progenitor direto de primeira geração (por exemplo, El), bem como de gerações posteriores (por exemplo, F2, F3, etc), bem como de gerações de retrocruzamento, por exemplo, por 1-3 gerações. Em uma modalidade, o progenitor compreende qualquer geração de célula de planta ou de planta derivada da planta, em que a recombinação homóloga direcionada induzida, como aqui divulgada, ocorreu.
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81/124 [00120] Em outra modalidade, progenitor compreendem
uma geração F1 . Em outra modalidade, o progenitor compreende
uma geração F2 . Em outra modalidade, o progenitor compreende
uma geração F3 . Em outra modalidade, o progenitor compreende
uma geração F4. Em outra modalidade, o progenitor compreender múltiplas gerações selecionados de gerações geração F1-F4. Em outra modalidade, o progenitor compreende uma primeira geração de retrocruzamento. Em outra modalidade, o progenitor compreende uma segunda geração de retrocruzamento. Em outra modalidade, o progenitor compreende uma terceira geração de retrocruzamento. Em outra modalidade, o progenitor compreende uma quarta geração de retrocruzamento. Em outra modalidade, o progenitor compreende múltiplas gerações de retrocruzamento selecionadas entre as gerações de retrocruzamento do quarto ao quarto ciclo.
[00121] Em outra modalidade, uma das referidas células de plantas somáticas de plantas compreende o referido sistema de nuclease e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease é direcionada ao alelo polimórfico presente na outra célula de planta progenitora que não compreende o referido sistema de nuclease. Em outra modalidade, uma das referidas células de plantas somáticas compreende uma nuclease Cas e a outra das referidas células de plantas somáticas compreende uma molécula de gRNA, em que
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82/124 a referida molécula de gRNA se liga ao referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, guiando assim a referida nuclease Cas para clivar o DNA dentro de o referido sítio alvo endógeno pré-selecionado. Em outra modalidade, uma das referidas células de plantas somáticas compreende uma nuclease Cas9 e a outra das referidas células de plantas somáticas compreende uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga ao referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, guiando assim a referida nuclease Cas9 para clivar o DNA dentro de o referido sítio alvo endógeno préselecionado .
[00122] Em outra modalidade, uma célula de planta somática compreende uma célula do progenitor de cruzamento de uma célula de planta de uma cultivar com uma célula de planta do tipo selvagem, em que as referidas células de plantas parentais compreendem, cada uma, um alelo polimórfico em comparação com o referido parceiro no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, e em que a referida célula de planta da cultivar compreende o referido sistema de nuclease. Em outra modalidade, em que a célula de planta somática compreende uma célula do progenitor de cruzamento de uma célula de planta de uma cultivar com uma célula de planta de tipo selvagem, a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease ocorre apenas no alelo polimórfico presente na célula de planta progenitora do tipo
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83/124 selvagem. Em outra modalidade, o sistema de nuclease compreende um ZFN, e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease ocorre apenas no alelo polimórfico presente na célula de planta progenitora do tipo selvagem. Em outra modalidade, o sistema de nuclease compreende TALEN em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease ocorre apenas no alelo polimórfico presente na célula de planta progenitora do tipo selvagem.
[00123] Em outra modalidade, uma célula de planta somática tendo alelos polimórficos é criada por qualquer meio conhecido na técnica. Em outra modalidade, uma célula de planta somática possuindo alelos polimórficos é uma célula de planta obtida a partir de uma cultivar.
[00124] Figura 3 - Etapa 2: Indução de quebra de fita dupla de DNA (DSB), que é representada como um raio amarelo. Em algumas modalidades, um DSB ocorre em um alelo dos referidos alelos polimórficos. Em algumas modalidades, ocorre um DSB em ambos os alelos dos referidos alelos polimórficos no caso de um diploide. Em algumas modalidades, um DSB ocorre em apenas um alelo dos referidos alelos polimórficos no caso de um diploide ou célula com ploidia superior, por exemplo, um triploide. Em algumas modalidades, um DSB ocorre em dois alelos dos referidos alelos polimórficos no caso de um diploide ou célula com ploidia
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84/124 superior, por exemplo, um triploide. Em algumas modalidades, ocorre um DSB em cada alelo dos referidos alelos polimórficos, por exemplo, dois DSBs em um diploide, três DSB são um triploide, etc.
[00125] Embora os Exemplos fornecidos abaixo e a Figura 1, a divagem de DSB ilustrada utilizando o sistema CRISPR/Cas, um especialista na matéria apreciaria que estes exemplos não são limitantes e que qualquer outra nuclease específica do local pode ser utilizada, por exemplo ZFN ou um TALEN. Em outra modalidade, a indução de um DSB é com um sistema ZFN. Em outra modalidade, a indução de um DSB é com um sistema TALEN. Em outra modalidade, a indução de um DSB é com um sistema CRISPR/Cas. Em outra modalidade, a indução de um DSB é com qualquer sistema de nuclease que possa ser direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado e que possa produzir um DSB no DNA.
[00126] Em algumas modalidades, um DSB pode ser induzido em quaisquer tecidos de plantas ou células e quaisquer fases do ciclo celular. Por exemplo, em uma modalidade, um promotor constitutivo pode ser utilizado para ativar a nuclease de modo a que a indução de DSB possa ocorrer já no zigoto do híbrido. Em outra modalidade, um DSB ocorre em uma parte inicial do desenvolvimento da planta de um tecido somático. Em outra modalidade, um DSB ocorre em uma parte tardia do desenvolvimento de um tecido somático.
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Em uma outra modalidade, um DSB ocorre entre uma parte inicial e uma parte tardia do desenvolvimento de um tecido somático.
[00127] Em outra modalidade, um protoplasto é transformado por um vetor de DNA ou RNA ou por um complexo de proteína purificada e gRNA ou por uma proteína purificada no caso de um sistema de nuclease de componente único, por exemplo, ZFN ou TALEN.
[00128] Em uma modalidade, indução compreende indução constitutiva. Em outra modalidade, a indução compreende indução não constitutiva. Em outra modalidade, a indução compreende indução específica de tecido. Em outra modalidade, a indução compreende indução específica da condição. Em outra modalidade, a indução compreende indução dependente do ciclo celular. Em outra modalidade, a indução compreende indução constitutiva, indução não constitutiva, indução específica de tecido, ou indução específica de ciclo celular, ou qualquer combinação destas.
[00129] Figura 3 - Etapa 3 Dentro da célula, um DSB induzido pode ser reparado via união de extremidade não homóloga (Figura 1) ou via recombinação homóloga (RH) entre cromossomos homólogos (modelo de reparo endógeno Figura 1, Figura 2 e Figura 3) . Em algumas modalidades, um DSB é reparado através de junção de extremidade não homóloga (NHEJ). Em outras modalidades, um DSB é reparado através de
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86/124 recombinação homóloga (RH). Inesperadamente, como mostrado nos Exemplos abaixo, a utilização de um método de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos tal como aqui divulgado resulta em uma frequência significativamente maior de reparação de RH do que seria de esperar que ocorresse naturalmente, na ausência de indução de DSB.
[00130] Em uma modalidade, o resultado do reparo DSB compreende Conversão de Gene (também conhecido como nãocruzamento). Em outra modalidade, o resultado do reparo DSB compreende o Cruzamento. Os produtos RH de reparo DSB podem ser identificados por diferentes análises, por exemplo, por marcadores genéticos, pela mudança no padrão de SNPs, por métodos de sequenciamento de DNA, por fenótipos de perda de heterozigosidade (LOH) ou por fenótipos, ou por qualquer outro marcador, ou por uma combinação destes.
[00131] De modo a determinar e selecionar células de plantas em que a RH ocorreu, o progenitor das referidas células pode ser analisada. A análise pode, em uma modalidade, compreender a análise de células progenitoras. Em outra modalidade, a análise compreende células de plantas de análise gerados a partir da referida célula somática ou planta descendente ou tecido de planta da mesma. Em outra modalidade, a análise compreende analisar um tecido da planta gerada a partir da referida célula somática ou progenitor de
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87/124 planta ou tecido de planta da mesma. Em outra modalidade, a análise compreende a análise de um tecido de planta. Em outra modalidade, a análise compreende analisar um progenitor de planta que a referida célula somática, ou um tecido ou célula do mesmo. Qualquer tipo de célula pode ser rastreado, dependendo do sistema da planta e da aplicação desejada. Por exemplo, em plantas sexualmente reprodutoras, sementes, grãos, frutas ou até mesmo grãos de pólen podem ser rastreados para a identificação de alelos reparados pela RH que foram herdados para a próxima geração. Em árvores ou plantas de reprodução vegetativa, protoplastos, calos, folhas, caules etc. podem ser rastreados e depois regenerados. Em algumas modalidades, a análise da referida planta compreende a análise de uma parte da referida planta ou de um progenitor da mesma, compreendendo uma folha, um caule, uma gema, um fruto, uma semente ou pólen ou qualquer combinação dos mesmos. Como resultado, o método é aplicável a qualquer espécie de planta.
[00132] Em algumas modalidades, uma célula de planta somática é compreendida dentro de um tecido de planta ou uma planta. Um especialista habilidoso apreciaria que o termo planta abrange qualquer espécie de planta lenhosa, herbácea, perene ou anual. Em uma modalidade, uma célula de planta somática aqui divulgada provém de uma planta compreendendo qualquer espécie de planta lenhosa, herbácea,
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88/124 perene ou anual. 0 termo planta também pode abranger uma pluralidade de células de plantas que são amplamente diferenciadas em uma estrutura que está presente em um estágio do desenvolvimento da planta capaz de produzir a cultura.
[00133] Em uma modalidade, uma célula somática divulgada aqui vem de uma planta de cultura. Em algumas modalidades, uma célula de planta somática compreende uma célula de planta de cultura. Um especialista na matéria apreciará que o termo planta de cultura engloba uma planta com pelo menos uma parte com valor comercial. Em uma modalidade, uma planta de cultura compreende plantas que produzem frutos comestíveis (incluindo de plantas), plantas que produzem grãos (como alimentos, rações e produção de óleo), plantas que produzem flores e plantas ornamentais, legumes, tubérculos, tubérculos ou culturas arborizadas e similares.
[00134] Em uma modalidade, uma planta compreende uma alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, rúcula, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, amora, mirtilo, brócolis, couve de bruxelas, repolho, canola, melão, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, cereja, chicória, coentro, cítrico, Clementinas, trevo, coco, café, milho, algodão, amora, pepino, Douglas fir, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, erva-doce, figos, alho
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89/124 abóbora, uva, toranja, mel orvalho, jicama, kiwis, alface, alho-poró, limão, lima, pinho Loblolly, linhaça, manga, melão, cogumelo, nectarina, noz, aveia, óleo de palma, colza, quiabo, oliva, cebola, laranja, uma planta ornamental, palma, mamão, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pera, pimenta, pinho, abacaxi, banana, ameixa, romã, choupo, batata, abóbora, marmelo, pinheiro radiata, radicchio rabanete, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinho do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, açúcar [00135] Cana, girassol, batata-doce, sweetgum, switchgrass, tangerina, chá, tabaco, tomate, triticale, turfa, nabo, vinha, melancia, trigo, inhame e abobrinha.
[00136] Em algumas modalidades, métodos de recombinação direcionada entre cromossomos homólogos de uma célula de planta somática compreendem métodos para reprodução precisa de culturas. Em algumas modalidades, métodos de preparação de um DNA compreendendo somática célula de planta que compreende um evento de RH direcionada (por exemplo, uma conversão do gene ou evento de cruzamento), utilizando recombinação direcionada entre os cromossomos homólogos compreende métodos para reprodução exata das culturas. Os métodos aqui divulgados podem apresentar precisamente qualidades e características ou não previamente apresentar a célula somática planta, tecidos dos mesmos, plantas dos mesmos, ou progenitor da mesma. Tais qualidades
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90/124 estão presentes, por exemplo, em uma das células progenitoras da referida célula somática. Por exemplo, utilizando métodos aqui descritos, um agricultor ou criador de plantas podería criar uma planta mais resistente ou uma planta resistente a riscos naturais tais como pragas, patogênicos, seca ou condições de solo pobres, ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, os modos aqui divulgados podem produzir uma cultura, por exemplo, uma fruta ou de planta com propriedades nutricionais aumentadas ou resistência aumentada a pragas ou patógenos, ou mais estável ao longo do tempo, para melhorar a qualidade do produto transportado de um lugar para outro. Em algumas modalidades, uma qualidade ou característica desejada está presente em uma população de tipo selvagem da planta. Em algumas modalidades, uma qualidade ou característica desejada está presente é uma população de cultivar da planta. Em algumas modalidades, uma qualidade ou característica desejada está presente em uma espécie selvagem da planta, mas não em uma cultivar correspondente. Em algumas modalidades, uma qualidade ou característica desejada está presente em uma cultivar de uma espécie da planta, mas não em uma cultivar correspondente.
[00137] Em algumas modalidades, uma célula de planta somática compreendendo DNA compreendendo o referido evento de RH, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula compreendendo DNA compreendendo o referido evento de RH, ou
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91/124 uma planta compreendendo a referida célula ou um progenitor da planta compreendendo DNA compreendendo referido evento de RH, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula ou planta progenitora desta compreendendo DNA compreendendo o referido evento de RH, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula ou planta progenitora desta compreendendo DNA compreendendo o referido evento de RH, ou qualquer combinação dos mesmos, tem resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, teor de nutrientes melhorado, parâmetros de crescimento melhorados ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com uma célula de planta de controle, planta ou progenitor das mesmas. Em uma modalidade, uma célula de planta de controle, planta ou progenitor das mesmas é uma célula parental, planta ou progenitor da mesma. Em outra modalidade, uma célula de planta de controle, planta ou progenitor das mesmas é uma célula somática, planta ou progenitor das mesmas em que a referida DSB não ocorre ou não ocorreu.
[00138] Em algumas modalidades, um sítio alvo endógeno pré-selecionado direcionado nos métodos aqui descritos compreende DNA compreendendo um local, uma parte de um local, um gene, uma parte de um gene, uma sequência reguladora a montante de um gene, sequências regulatórias a jusante de um gene, uma sequência a montante de um gene, uma
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92/124 sequência a jusante de um gene ou qualquer combinação dos mesmos e em que a expressão ou ausência do referido gene afeta o crescimento, resistência a seca, resistência a pragas, resistência a agentes patológicos ou teor de nutrientes, ou qualquer combinação dos mesmos da referida célula de planta compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada, ou um progenitor da mesma em comparação com uma célula de planta de controle ou progenitor da mesma, tecido de planta, planta ou progenitor da mesma.
[00139] Em algumas modalidades, o progenitor
selecionada da etapa (e) é selecionada do grupo que
compreende F 1, F2, Fs, F4, retrocruzamento de Ia geração,
retrocruzamento de 2a geração, retrocruzamento de 3a geração e retrocruzamento de 4a geração.
[00140] Em algumas modalidades, um método divulgado aqui produz uma célula de planta somática compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada, ou uma planta compreendendo a referida célula compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada ou uma planta progenitora deste compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada, ou fruto derivado de uma planta compreendendo a referida célula compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada ou planta
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93/124 progenitora do mesmo compreendendo DNA compreendendo ο evento de RH direcionada, ou sementes derivadas de uma planta a referida célula compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada ou suo progenitor de planta compreendendo DNA compreendendo o evento de RH direcionada, ou qualquer combinação dos mesmos, em que a célula, tecido, planta ou progenitor do mesmo tem resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, melhor conteúdo de nutrientes, melhores parâmetros de crescimento, ou qualquer combinação dos mesmos, uma célula de planta de controle, tecido de planta, planta ou progenitor do mesmo, fruto ou semente.
EXEMPLOS [00141] Materiais e Métodos - para os Exemplos 1-4 [00142] Material de planta [00143] Todos os tomateiros foram cultivados em casa de vegetação com temperatura variando entre 18 e 25 °C. A linhagem mutante de tomate (S. lycopersicum) de yellow flesh e3756, Bioolorcc383, M82 e Solanum pimpinellifoliumLA1578 foram gentilmente cedidas pelos laboratórios do Prof. Joseph Hirschberg e do Prof. Daniel Zamir da Universidade Hebraica de Jerusalém (Kachanovsky, DE, Filler, S Isaacson, T. & Hirschberg, J. A epistasia em mutações de cor de tomate envolve a regulação da expressão de fitoeno sintetase 1 por
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94/124 cis-carotenóides (Proc. Natl. Acad. Sci . USA 109, 19021-6 (2012) ) .
[00144] Plasmideos e transformação de plantas [00145] Os construtos 35s:Cas9 e u6-26:sgRNA foram previamente clonados por Ross A. Johnson (Johnson, RA, Gurevich, V., Filler, S., Samach, A. & Levy, A. A. Avaliações comparativas de eficiência de divagem de nucleases CRISPRCas em planta. Plant Mol. Biol. 87, 143-56 (2015) ) . Os iniciadores utilizados para a construção de alvos ps # 1 sgRNA ps # 2f estão especificados na lista de iniciadores em Johnson et al. , (2015) (ibid) e são apresentados na Tabela 1.
[00146] Tabela 1: Iniciadores para Alvos de sgRNA
Iniciadores para sgRNA alvos:
Ps#l sgRNA F attgGAATGTCTGTTGCCTTGTTA SEQ ID NO. 1
Ps#l sgRNA R aaacTAACAAGGCAACAGACATT SEQ ID NO. 2
Ps#2 sgRNA F attgGAGCGTATATAATGCTGCTT SEQ ID NO. 3
Ps#2 sgRNA R aaa cAAG CAG CATTATATAC GOT SEQ ID NO. 4
[00147] As sequências de DNA que codificam o sgRNA utilizado nos Exemplos são apresentadas na Tabela 2.
[00148] Tabela 2:
Sequência de DNA do s gRNA que codifica a sequência do sgRNA
Molécula de gRNA ggagcgtatat aatgctgctt gttttagagc SEQ ID NO:
para indução de DSB tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 61
especifica de alelo cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt
e reparo dependente cggtgctttt ttt
de alelo
Ps#l gRNA ggaatgtctgt tgccttgtta gttttagagc SEQ ID NO.
tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 68
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95/124 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt [00149] Todas as linhagens de tomate foram transformadas por Agrobacterium tumefaciens GV3101 com transformação de cotilédones de acordo com McCormick (McCormick, S. Em Plant Tissue Culture Manual 311-319 (Springer Netherlands, 1991). doi: 10.1007/978-94-009-01032_17).
[00150] PCR inversa para detecção de recombinação homóloga (RH) [00151] Amostras de DNA para o ensaio de PCR Inversa foram extraídas usando um kit de purificação de DNA (MACHEREY-NAGEL®) . Para cada planta, 300 ng de DNA da amostra de folhas ou do plasmídeo de controle foram tratados separadamente: primeiro, foram incubados durante a noite com tampão lOxFD, ApaLI (ThermoFisher scientific) e HindIII-HF (New England BioLabs®). Após 20 minutos de inativação a 80 °C, 150 ng dos fragmentos digeridos foram embotados com polimerase de DNA de T4 (New England BioLabs®) durante 2 horas à temperatura ambiente. A polimerase de DNA de T4 foi inativada a 75 °C durante 10 minutos e o DNA linear foi autoligado com ligase de DNA Quick T4 (New England BioLabs®) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os plasmídeos de controle foram diluídos a 1: 10000 com DDW e misturados em conjunto para imitar a heterozigosidade. Em seguida, todas
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96/124 as amostras foram amplificadas por 18 ciclos de PCR com DNA polimerase de alta-fidelidade Phusion® (New England BioLabs®) (para iniciadores, ver Tabela 3).
[00152] Tabela 3: Iniciadores para Detecção de Recombinação Homóloga de PCR inversa
Iniciadores para Detecção de RH de PCR inversa (iniciadores específicos de alelo):
a 3756 bic hr f tcagC TATG C TAATGACTCC CGAG SEQ ID NO. 5
a bic hr r agtcCATTCTCTATTCCGCATAGTGA SEQ ID NO. 6
a 3756 r tga cAAC CGACC TAAATCGATC C G SEQ ID NO. 7
b bic hr r actgCATTCTCTATTCCGCATAGTGA SEQ ID NO. 8
b3756r gactactgAAC C GACCTAAATCGATCC G SEQ ID NO. 9
[00153] Os iniciadores para este ensaio foram concebidos para amplificaçao específica de alelos. As amostras foram agrupadas e sequenciadas por sequenciamento de alto rendimento.
[00154] Para a clonagem dos plasmídeos sintéticos de controle cruzado, dois fragmentos de PCR foram amplificados a partir de amostras de DNA de yellow flesh e3756 e Bioolorcc383 usando polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion® (New England BioLabs®) (para sequências de iniciadores veja a Tabela 4) e então clonado usando o sistema de clonagem GoldenBraid (Sarrion-Perdigones, A. et al. GoldenBraid: Um Sistema de Clonagem Iterativa para Montagem Padronizada de Módulos Genéticos Reutilizáveis. PLoS One 6, e21622 (2011)).
[00155] Tabela 4: Iniciadores para Cruzamento Sintético - plasmídeos de controle
Iniciadores para Cruzamento Sintético - plasmídeos de controle
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Figure BR112019014420A2_D0001
[00156] Primeiramente, cada um dos quatro amplicons foi clonado no plasmídeo pUPD. Depois o plasmídeo pUPD2 com o segmento ps da yellow flesh e3756 foi clonado com o plasmídeo pUPD2 com o segmento yl de Bioolorcc383 no plasmídeo pDGB3_alfal. Em paralelo, o plasmídeo pUPD2 com o segmento ps de Bioolorcc383 foi clonado com o plasmídeo pUPD2 com o segmento yl da yellow flesh q3756 no plasmídeo pDGB3_alphal. Estes dois plasmídeos alelos sintéticos foram reunidos e foram submetidos a processo inverso de PCR e sequenciamento. A sequência de DNA desses plasmídeos alelos sintéticos é apresentada na Tabela 5.
[00157] Tabela 5: Plasmídeos para controle de cruzamento sintético
Plasmídeos para controle de cruzamento sintético (ensaio PCR inverso) plasmídeo RI SEQ ID NO. 62 plasmídeo R2 SEQ ID NO. 63 [00158] Amplificação e Sequenciação de DNA [00159] Amostras de DNA para sequenciamento de alto rendimento foram amplificadas usando Phusion® DNA polimerase de alta-fidelidade (New England BioLabs®) e 18 ciclos de PCR
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98/124 (para iniciadores específicos de cada experimento, ver Tabela 6).
[00160] Tabela 6: Iniciadores para sequenciamento de alto rendimento
Iniciadores para sequenciamento de alto rendimento do NHEJ
psyl tl htp f GGTTTGCCTGTCTGTGGTCT SEQ ID NO. 14
psyl tl htp rl agtcCCATGAAACTTGTC C CATTTG SEQ ID NO. 15
psyl tl htp r2 tcagC CATGAAACTTGTC C CATTTG SEQ ID NO. 16
psyl tl htp r3 actgC CATGAAACTTGTC C CATTTG SEQ ID NO. 17
psyl tl htp r4 tgacCCATGAAACTTGTCCCATTT G SEQ ID NO. 18
psyl tl htp r5 gactCCATGAAACTTGTCCCATTT G SEQ ID NO. 19
psyl tl htp r6 ctgaCCATGAAACTTGTCCCATTT G SEQ ID NO. 20
nhej_psyl_t2_r GCCTAAATACGGCACTTCCA SEQ ID NO. 21
a_nhej_psyl_t2_f agtcGTATCGCCCCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 22
b_nhej_psyl_t2_f tcagGTATCGC C CCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 23
c_nhej_psyl_t2_f tgacGTATCGCCCCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 24
d_nhej_psyl_t2_f actgGTATCGCCCCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 25
e_nhej_psyl_t2_f gactGTATCGCCCCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 26
f_nhej_psyl_t2_f ctgaGTATCGCCCCTGAATCAAAG SEQ ID NO. 27
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nnn_a_nhej_psyl_t2_ f nnnn nnagtcGTATCG CCCCTG AATCAAAG SEQ ID NO. 28
nnn_b_nhej_psyl_t2_ f nnnnn ntcagGTATCGCCCCTGAATCAAA G SEQ ID NO. 29
nnn_nhej_psyl_t2_r nnnnn ngcctAAATACGGCACTTCCA SEQ ID NO. 30
* n representa A, T, C ou G [00161] As bibliotecas foram preparadas como Blecher-Gonen et al. (Blecher-Gonen, R. et al. Imunoprecipitação de cromatina de alto rendimento para mapeamento em todo o genoma de interações de proteína-DNA in vivo e estados epigênicos. Nat. Protoc. 8, (2013)). O sequenciamento de alto rendimento foi realizado na unidade G-INCPM no Instituto de Ciência Weizmann com a plataforma Illumina HiSeq 2500 para 2x125 leituras de teminações pareadas.
[00162] As amostras de DNA para sequenciação Sanger foram amplificadas utilizando REDTaq® (SIGMA-ALDRICH) com 35 ciclos de PCR (para os iniciadores ver Tabela 7).
[00163] Tabela 7: Iniciador para sequenciamento de Sanger
Iniciadores para sequenciamento Sanger do alelo psyl (detecção de
SNPs)
PSY1_1_F SEQ ID NO. tttgcagaagtcaagaaacagg 31
PSYl_t4_ident_R SEQ ID NO. gatgtcatcgtccgttctcc 32
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PSY1 psnps F acggtatcttcccaccttca SEQ ID NO. 33
PSY1 psnps R2 atagtgttaattgtgtaggctcctt SEQ ID NO. 34
PSY1 psnps F2 cgacgaggagtaaggtttgc SEQ ID NO. 35
PSY1 psnps R tcagtccatttcgttttcgt SEQ ID NO. 36
psyl_tl23_f atgttgcagccattcagaga SEQ ID NO. 37
psyl_tl23_r tgatcatggctcgtcactgt SEQ ID NO. 38
psyl term f acaagtaccctgggttggag SEQ ID NO. 39
psyl_term_r2 gcagtttttgtaggaggcaca SEQ ID NO. 40
psyl_term_f2 tgtgcctcctacaaaaactgc SEQ ID NO. 41
psyl term r tggattgaatcgaatttggataa SEQ ID NO. 42
pimpixm82_co_f ctttgcacttggttactcaga SEQ ID NO. 43
pb_psyl_r agcctacggcccaaactatt SEQ ID NO. 44
14036_f tgctaatggggcaggaaata SEQ ID NO. 45
14036_r tcaagtaacgtaaaacacgttgaaa SEQ ID NO. 46
5kb_up_t2_F ttcatttgacgagcgatctg SEQ ID NO. 47
5kb_up_t2_R ttggctgctttgaccttacc SEQ ID NO. 48
40kb_down_t2_f cattatcctaagagtgcagtcagc SEQ ID NO. 49
40kb_down_t2_r tggtttctcgattacctctttca SEQ ID NO.
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101/124
50
20kb_down_t2_f tgacaccaatccatccaatc SEQ ID NO. 51
20kb_down_t2_r ctgctacctgcactggctct SEQ ID NO. 52
20kb_up_t2_f tacgtccccgaagaaatcac SEQ ID NO. 53
20kb_up_t2_r cccttaggctccgaagttgt SEQ ID NO. 54
40kb_up_t2_f cacataagaggacacgtttattca SEQ ID NO. 55
40kb_up_t2_r gccacggagaaaatagttga SEQ ID NO. 56
[00164] Após PCR, o DNA foi limpo com Exonuclease I e Fosfatase Alcalina de Camarão (rSAP) (New England BioLabs®). O sequenciamentο foi realizado na unidade de serviços biológicos do Instituto Weizmann de Ciências com Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer.
Exemplo 1: Ensaio de cor de frutos de tomate para análise de reparação de quebra de fita dupla de DNA (DSB) [00165] Objetivo: Estimar a taxa de reparo de ligação em fita dupla (NHEJ) somática versus junção homogênea (RH) versus recombinação homóloga (RH) em um local de planta endógeno.
[00166] Métodos: Para estimar a taxa de NHEJ somático versus reparo de DSB baseado em RH em um local de planta endógena, foi projetado um ensaio de coloração de frutos. Foram utilizadas duas linhagens mutantes de tomate, cada uma
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102/124 com uma mutação diferente no gene Phytoene synthase 1 (PSY1). O alelo e3756 da yellow flesh é um mutante EMS com um códon de parada prematuro em PSY1 levando a um fenótipo de frutos amarelos (Kachanovsky, DE, Filler, S., Isaacson, T. & Hirschberg, J. Epistasis em mutações de cor de tomate envolve a regulação da expressão de fitoeno sintase 1 por ciscarotenóides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 19021-6 (2012)) . O alelo bicolorcc383 é um mutante com uma deleção de 3,7Kb no promotor de PSY1, conduzindo a um fenótipo de frutos vermelhos-amarelados (Figura 4A).
[00167] Para monitorar as mutações induzidas por CRISPR-Cas durante o desenvolvimento das plantas, a partir da fertilização, foram produzidas linhagens transgênicas de yellow flesh e3756 que expressaram 35S: Cas9 (SEQ ID NO: 59) e bicolorcc383 transgênicas expressando uma única guia PSY1 RNA (u6-26: Ps # 1-sgRNA; a sequência do plasmideo é SEQ ID NO: 60; PS # 1-sgRNA é SEQ ID NO: 68). Este u6-26: Ps # 1sgRNA foi concebido para induzir um DNA DSB entre as mutações bicolorcc383 e yellow flesh e3756 , em ambos os alelos (Figura 4A) . Espera-se que um cruzamento entre a yellow flesh e3756 35S: Cas9 e bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA produza plantas Fi com o fenótipo de frutos bicolorcc383 dominante. O mesmo é esperado para plantas de controle que não expressam 35S: Cas9 ou u6-26: Ps # 1-sgRNA. Desvios deste fenótipo em plantas expressando Cas9 e Ps # 1-sgRNA são esperados devido
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103/124 à indução de um DSB em um ou ambos os alelos seguidos por reparo de DNA propenso a erros. Um reparo NHEJ do alelo bioolorcc383 deve produzir um fenótipo de frutos amarelos (setores ou frutos inteiros). O resultado do reparo do DSB por mecanismos baseados em RH (cruzamento ou eventos não cruzados) deve ser um fruto vermelho no caso de um evento de
RH que ocorreu no início do desenvolvimento, ou frutos
amarelos com manchas vermelhas ou setores em caso de eventos
tardios (Figura 4A) .
[00168] Resultados: Na indução de DSB, uma população de 50 plantas de e3756 e de 35S: Cas9 x bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA Fl, deu frutos bicolores, amarelos e amarelos com manchas vermelhas. A distribuição dos fenótipos de frutos variou quando diferentes linhagens transgênicas de yellow flesh e3756 35S: Cas9 foram utilizadas (Figura 4B) . Como esperado, na ausência de indução de DSB, a população controle de 6 plantas de yellow flesh e3756 x bicolorcc383 Fi, apresentou apenas frutos bicolores (Figura 4B) . Uma das vantagens do ensaio de cores de frutas é sua capacidade de prever a herança de produtos de reparo na próxima geração. De fato, esperava-se que as sementes F2 extraídas de frutas totalmente amarelas dariam origem a uma mutação germinativa.
[00169] Para confirmar que os frutos amarelos são indicativos de eventos germinais NHEJ, plantas F2 derivadas de frutos amarelos foram cultivadas. Utilizando amplificação
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104/124 por PCR específica para alelos dos alelos e3756 e bicolorcc383 de yellow flesh e sequenciamento dos produtos de PCR, foi demonstrado que em todos os casos testados, sementes de frutos amarelos produziam sementes portadoras de uma mutação germinativa no local DSB do alelo bicolorcc383 (Tabela 9) . A Tabela 8 apresenta os iniciadores de PCR utilizados.
[00170] Tabela 8: Iniciadores para eventos germinais do NHEJ
Iniciadores para estimativa de eventos germinais do NHEJ (curvas especificas do alelo)
JF F tgcaaagtgctacgtgtcct SEQ ID NO. 57
PSY1 1 R aatgtgaacagcaacgcaaa SEQ ID NO. 58
[00171] Tabela 9: Eventos Germinal do NHEJ
F1 planta Número da fruta F2 planta Cas9 gRNA Alelo de yellow flesh Alelo bicolor
1 1 11 — + WT/4bp dei
1 1 12 — + WT/4bp dei WT/4bp dei
16 1 1 + + WT/4bp dei Inserção T
16 1 2 — — WT Inserção T
16 2 3 + — WT Inserção T
16 2 4 — + WT Inserção T
16 3 1 + — WT Inserção T
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16 3 2 + — Inserção T
18 1 1 + + 4bp dei
18 1 4 + + T inserção 4bp dei
18 2 2 + + 4bp dei
18 2 3 - + WT/4bp dei 4bp dei
45 1 1 + — WT Inserção de G
45 1 6 + — WT Inserção de G
45 3 1 + + WT Inserção de G
45 3 4 + — WT Inserção de G
45 3 5 + — WT Inserção de G
[00172] Produtos de PCR específicos de alelos de plantas F2 de frutos amarelos de yellow flesh Fi e3756 35S:
Cas9 x bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA da Tabela 9, foram sequenciados por sequenciação Sanger. Todas as plantas apresentaram indels (inserções e/ou deleções) no alelo bicolor. Quatro de 13 também tinham indels no alelo de yellow flesh .
[00173] Alguns descendentes de frutos amarelos também mostraram mutação no alelo e3756 de yellow flesh (Tabela 9) . Embora muitos frutos amarelos com pequenos setores vermelhos tenham sido encontrados (Figura 4B), nenhum fruto totalmente vermelho foi detectado entre as plantas Fi. Além disso, uma
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106/124 população de 400 plantas F2 derivadas de frutos com manchas vermelhas foi cultivada, sugerindo recombinação homóloga somática (RH), mas não foram detectados frutos totalmente vermelhos que indicassem eventos de RH transmitidos germinalmente.
Exemplo 2: alta taxa de indução CRISPR-cas9 de DSB de DNA conduz a reparar através de ambos os terminais de ligação (NHEJ) & homóloga recombinação não homóloga somática (RH) [00174] Objetivo: Identificar, caracterizar e quantificar eventos somáticos de NHEJ em Fi.
[00175] Métodos: Para identificar, caracterizar e quantificar eventos NHEJ somáticos em Fi, foram utilizadas 22 plantas de yellow flesh e3756 35S: Cas9 x bicolorcc383 u626: Ps # 1-sgRNA população, e 2 plantas de yellow flesh e3756 x bicolorcc383 foram utilizados como controle. Quatro (4) folhas de diferentes ramos das plantas foram utilizadas. Em seguida, o seu DNA foi extraído, a região que flanqueia o DSB induzido de ambos os alelos foi amplificada por PCR e os produtos resultantes foram sequenciados utilizando a plataforma Illumina HiSeq 2500 de sequenciamento de alto rendimento.
[00176] Para a medição de reparação de RH, foi projetado um método de PCR inversa que permitiu a sequenciação das duas mutações específicas do alelo que são 1,7Kb (yellow flesh e3756 e bicolorcc383 ) , permitindo
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107/124 distinguir parentais de moléculas recombinantes (Figura 4D) e minimizou a formação de produtos de PCR positivos falsos. As mesmas amostras de DNA usadas para o sequenciamento de NHEJ somático (Figura 4C) foram usadas para a PCR inversa. Adicionalmente, clonaram-se dois controles positivos sintéticos (clones semelhantes a recombinantes) que também foram tratados pelo mesmo modo de PCR inversa. Os produtos da PCR inversa de cada reação (como mostrado na Figura 4D) foram sequenciados por sequenciação de extremidades emparelhadas Illumina HiSeq 2500.
[00177] Resultados: Das 250.000-850.000 leituras por planta (amostra de PCR), uma média de 88% das leituras de yellow flesh e3756 35S: Cas9 x bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA cujas plantas continham uma mutação na Local CRISPR DSB, enquanto apenas 2% das leituras de plantas de yellow flesh e3756 x bicolorcc383 se desviaram da sequência WT, presumivelmente devido a erros de PCR e sequenciação (Figura 4C). A alta taxa de indução CRISPR-Cas DSB no sistema leva a um amplo espectro de mutações como resultado de diferentes eventos de reparo do NHEJ. Além disso, verificou-se que algumas assinaturas do NHEJ, como a deleção do CTTG de 4 pb, eram preferidas em detrimento de outras neste local (Figura 4C, Figura 5).
[00178] No ensaio de medição de reparação de RH, 5.000-50.000 leituras por planta foram obtidas. Os controles
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108/124 negativos de yellow flesh e3756 x bioolorcc383 mostraram apenas os alelos parentais na ausência de indução de DSB, enquanto o controle sintético positivo mostrou os alelos recombinantes (Figura 4E) . A maioria das plantas Fi de yellow flesh e3756 35S: Cas9 x bicolorcc383 u6-26: Ps # 1-sgRNA mostrou apenas os alelos parentais, mas alguns deles mostraram um dos alelos recombinantes, sugerindo reparo baseado em RH somática.
[00179] Exemplo 3: Indução de DSB especifica de alelo e análise de alta resolução de produtos de reparo [00180] Objetivo: Para criar um método que distinguir entre o cromossomo quebrado e o modelo de reparação.
[00181] 0 cruzamento acima entre yellow flesh e3756 x bicolorcc383 não forneceu SNPs suficientes para analisar em detalhe os produtos de reparação de RH. Além disso, não permitiu a realização de um intervalo específico de alelo, que é necessário para realizar uma experiência precisa, onde é possível distinguir entre o cromossomo quebrado e o modelo de reparo.
[00182] Método: Portanto, foi projetado um novo ensaio de reparo DSB que fornece vários SNPs em torno do local de ruptura, bem como em regiões distais, através do uso de Solanum pimpinellifoliumLA1578, um acesso de tomate selvagem com pequenos frutos vermelhos e um genoma sequenciado mostrando o presença e localização de múltiplos
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SNPs em comparação com Solanum lycopersicum, o tomate comestível. De modo a assegurar a quebra específica do alelo, urn alelo foi preparado no fundo da cultivar S. lycopersicum M82 que é imune a u6-26: Ps # 2-sgRNA. Para tanto, os frutos vermelhos cv. M82 foi transformada com 35S: cas9 (sequência de plasmídeo é a SEQ ID NO: 59; sequência que codifica cas9 é SEQ ID NO: 65) e u6-26: Ps # 2-sgRNA (sequência de plasmídeo é a SEQ ID NO: 60; sequência sgRNA é codificado por SEQ ID NO: 68) . Em seguida, frutas amarelas em TO foram selecionadas e suas sementes crescidas em Tl. A partir desta população Tl, uma planta homozigota foi isolada com uma inserção de adenina (+A) no local DSB CRISPR-Cas9, que foi cruzada com o acesso do tomateiro selvagem.
[00183] A sequência da molécula de gRNA utilizada para a indução de DSB específica de alelo e o reparo dependente de alelo é apresentada na SEQ ID NO: 61.
[00184] Neste ensaio, o S. pimpinellifoliumLA1578 é o único alvo para DNA DSB devido à inserção +A, no alelo psl M82 que perturba o motivo adjacente protoespaçador (PAM) e impede a divagem de Cas9. A mutação +A do alelo M82 é recessiva e, portanto, espera-se que as plantas Fi tenham pequenos frutos vermelhos. O reparo de DSB em PSY1 por NHEJ, ou RH (cruzado ou não-cruzado) leva a frutos amarelos ou frutos vermelhos com setores amarelos, dependendo do estágio de desenvolvimento do fruto quando o reparo ocorreu. Espera
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110/124 se que os eventos de reparo do NHEJ deixem pequenos indels no sitio do DSB, enquanto eventos de cruzamento e de não cruzamento podem ser identificados pela diferença nos padrões de SNPs em ambos os lados do DNA DSB (Figura 6A).
[00185] Para a análise do reparo somático do DSB, a área de DNA do DSB das folhas de ambos os genitores (M82 35S: Cas9, U6-26: gRNA, +A homozigoto e S. pimpinelli folium^1578) e de cinco plantas El foram amplificadas por PCR e sequenciados pelo Illumina HiSeq 2500 sequenciamento emparelhado (Figura 7) . Esse rendimento de sequenciamento foi de 600.000 a 900.000 leituras por planta.
[00186] É mostrado aqui que o alelo M82 psyl+A estava imune à indução de DSB, com virtualmente nenhuma pegada de DSB no parente M82 (M82 35S: Cas9 e u6-26: Ps # 2-sgRNA, +A homozigoto), apoiando a especificidade alelo projetada do gRNA (Figura 7) . Além disso, pelo menos 50% das leituras deram a inserção +A enquanto o alelo S.pimpinellifolium estava mutado (cor vermelha no gráfico circular da Figura 7). Verificou-se que apenas 7-18% das plantas Fl reads foram WT e o resto deu vários padrões indel (Figura 7) . Para estimar a taxa de eventos germinais, as cores dos frutos nos diferentes ramos foram documentadas e o tecido do pericarpo do fruto foi sequenciado pela illumina (Figura 8) .
[00187] Com este ensaio, os frutos totalmente amarelos podem conter sementes que são eventos germinais de
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111/124 reparação via NHEJ ou RH (Figura 6A). Além disso, os eventos cruzados ou não cruzados devem dar uma planta homozigótica +A+A+, pois o reparo do molde é o alelo M82 psyl+A (Figura 9A) . Em uma das plantas Fl, foram encontrados frutos amarelos que apresentaram alto teor de +A, +A por illumina e sequenciamento de Sanger (Figura 10). 0 progenitor F2 dessas plantas foi cultivada e sequenciada pelo método de Sanger. 0 sequenciamento revelou plantas F2 com padrões de SNPs correspondentes a eventos germinativos de RH (Figura 6B) . Plantas # 2 e # 7 parecem casos claros de cruzamento, ambos com faixas de conversão de pelo menos 5Kb. A planta 11 parece um caso de cruzamento (Figura 6B), no entanto, a análise de marcadores de flanqueamento (Indels e SNPs), a mais de 20 kb de distância de ambos os lados do local do DSB na planta 11, não pôde ser realizada devido à planta morte, portanto, este caso foi referido como um cruzamento putativo.
[00188] Para identificar produtos de conversão gênica homozigoto, e para melhor caracterizar as bordas do caminho de conversão, as plantas F3 do progenitor da planta F2 #7 foram sequenciadas. Uma das progenitors F3 de F2 # 7s (mostrada na parte inferior da Figura 6B) um produto homozigoto de reparação da conversão do gene com uma pista de conversão confirmada de 5-6 kb de comprimento.
Exemplo 4: Quantificação da taxa de reparação dependente de alelo
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112/124 [00189] Objetivo: Testar reparo dependente de alelo. Graças ao sistema desenvolvido acima no Exemplo 3 da indução de DSB específico de alelo, que é uma assinatura de RH, o reparo dependente de alelo pôde ser testado. A indução de DNA DSB no alelo S. pimpinelli folium^1578 mostrou a assinatura +A, similar ao alelo M82 psyl+A, no local quebrado em muitos dos frutos e folhas sequenciadas (Figuras 7 e 8) . Este excesso no reparo +A pode ser devido ao padrão de reparo NHEJ preferido ou ao reparo dependente de alelo mediado pela RH.
[00190] Métodos: Para distinguir entre estas duas possibilidades, várias plantas da cultivar M82 foram cultivadas, todas elas descendentes da mesma 35S: Cas9 u626: Ps # 2-sgRNA. Nesta população, 22 plantas foram inicialmente homozigotas para o alelo M82 WT de PSY1, enquanto 14 plantas foram inicialmente heterozigotas M82-WT PSY1/M82 psyl+A. As plantas foram cultivadas até a idade de 4 semanas e 4 folhas coletadas de cada uma delas. Em seguida, o DNA ao redor do DSB foi amplificado por PCR e os produtos de PCR foram sequenciados com a plataforma Illumina HiSeq 2500. Para cada usina, a porcentagem de cada indel do total de leituras foi calculada. Se a mutação +A ocorrer de forma independente em cada cromossomo, deve haver o dobro de leituras com novas mutações +A no WT (que tem dois alvos
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113/124 potenciais) do que no heterozigoto em que apenas um alvo está disponível (Figura 9A).
[00191] Para medir a pegada esperada independente de alelo +A NHEJ, as 22 plantas do homozigoto WT foram usadas e o percentual de leituras +A dividido por 2 foi calculado para obter o valor da ocorrência da mutação +A por alelo. A seguinte equação foi usada: Experado = (%(+A reads) T=4weeks(wt, wt))/2. A ocorrência de uma nova mutação +A no alelo WT, quando o segundo alelo contém a mutação +A (em plantas heterozigotas M82-WT PSY1/M82 psyl+A) foi calculada tomando as leituras de% de +A no M82- WT PSY1/M82 plantas psyl+A e deduzindo 50% (o percentual inicial de leituras originadas do alelo M82 psyl+A) . A seguinte equação foi usada para a taxa observada de + mutação no heterozigoto M82-WT PSY1/M82 plantas psyl+A: Observado =% (+A reads) TMsemanas, <Peso,+A) - 50%.
[00192] Resultados: Quando se comparou o esperado para a pegada +A observada, verificou-se que havia uma taxa significativamente superior à esperada de novas mutações +A na população heterozigótica (p = 0, 009) . Considerando que as duas populações são isogênicas, isso sugere que o reparo no local da DSB é dependente da sequência de seu alelo homólogo (Figura 9B). A frequência independente de alelo de uma pegada +A foi de 4% por alelo no M82-WT, enquanto a frequência de pegada +A no alelo M82-WT PSY1 no heterozigoto M82-WT PSY1/M82 psyl+A foi de 18% (Figura 9B). Isso sugere que 18-4
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114/124 = ~ 14% dos eventos de reparo de DSB são dependentes de alelos (eventos de recombinação de reparo homólogos) e o restante ocorre via NHEJ de maneira independente de alelos.
[00193] Resumo para o Exemplo 1—4 [00194] Reparo de DSBs somáticos [00195] Estudos anteriores em reparação de RH induzida por DSB somático foram feitos principalmente com ensaios transgênicos de recombinação intracromossômica ou de cruzamentos desiguais entre cromátides. Significativamente, os métodos divulgados e exemplificados aqui foram transportados em um contexto genômico endógeno, onde a origem do modelo de reparo podería ser rastreada no cromossomo homólogo. Os resultados dos Exemplos 1—4 mostram que os DSB alvo podem ser reparados através de recombinação homóloga somática utilizando um cromossomo homólogo como modelo. Isso difere significativamente do direcionamento de genes usando modelos exógenos.
[00196] Além disso, foi demonstrado que alguns desses eventos de reparo podem ser transmitidos germinalmente para as próximas gerações. Em um conjunto de cruzes foi mostrado que o alelo WT podería ser recuperado através de recombinação intragênica entre dois alelos parentais psl defeituosos (bicolorcc383 e yellow flesh e3756 ), um evento visto como manchas vermelhas (Exemplo 1, Figura 4A) e caracterizado através de análise sequencial. (Exemplo 2, Figura 4C). Neste
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115/124 cruzamento, os frutos não foram recuperados que eram totalmente vermelhos, e que corresponderíam a eventos germinais precoces. Isto pode ser devido ao contexto genômico da grande deleção no alelo bicolor, ou alternativamente o alelo WT recombinante curado sofreu uma segunda rodada de NHEJ durante o desenvolvimento (o local alvo não foi destruído durante RH) , o que geraria uma perda de alelo de função (amarelo) via NHEJ. Considerando a alta eficiência do NHEJ, este é um cenário plausível. Além disso, em um ensaio de indução de DSB específico de alelo em um híbrido Fi de S. pimpinellifolium X S. lycopersicum, três casos de reparo dependente de RH foram transmitidos germinalmente para as gerações F2 e F3. Dois casos corresponderam a eventos não cruzados com pistas de conversão de 5-6 Kb (Exemplo 3, Figura 6B) . 0 terceiro caso (planta F2 # 11) é um evento de RH germinativo que pode ser um evento cruzado ou um evento não cruzado - isso não pôde ser demonstrado devido à morte da planta. Finalmente, tentando quantificar a razão de RH versus NHEJ, um sgRNA foi projetado para indução de DSB específica de alelo no antecedente de S. lycopersicum. Esta configuração experimental permitiu medir um excesso de pegadas de reparo originadas do alelo homólogo em comparação com a expectativa, sugerindo que, de todos os eventos detectáveis de reparo do DSB, 14% são alelos-dependentes e o restante não é homólogo. 0 reparo da RH dependente de alelos a 14% foi inesperado, em
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116/124 que surpreendentemente o método utilizado produziu significativamente mais RH do que o esperado.
[00197] RH Somática versus Meiótica [00198] É interessante comparar o reparo mediado por RH em células somáticas vs. meióticas. No geral pouco se sabe sobre a recombinação inter-homólogas em tecidos somáticos, provavelmente devido à baixa frequência de tais eventos, à falta de marcadores fenotípicos e à dificuldade de recuperar eventos germinais. Os setores vermelhos não foram detectados na ausência de DSBs, e a presença de moléculas recombinantes intragênicas foi nula ou insignificante. Isso é consistente com estudos anteriores em tabaco mostrando que a ocorrência de RH somática é muito baixa na ausência de indução por DSB tanto para eventos de RH recíprocos como não recíprocos. As baixas taxas de RH somática entre cromossomos homólogos podem ser indicativas de gargalos, tal como a ausência da maquinaria de RH encontrada na meiose que controla o emparelhamento de homólogos, a formação de complexo sinaptonemal, etc. Os resultados, mostrando uma taxa inesperadamente alta de reparo de RH baseado em ambos os estudos de caso e em avaliações quantitativas, indicam que os DSBs são um gargalo principal, surpreendentemente induzindo RH somática de 0% (na ausência de quebras) a ~ 14% por alelo (reparo dependente de alelo medido no Exemplo 4
Figura 9B) e que a RH induzida
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117/124 por DSB entre homólogos pode ocorrer na ausência da maquinaria de RH meiótica.
[00199] A taxa de reparo de RH de DSB que é relatada aqui (de ~ 14% por alelo) parece ser maior do que a relatada durante a meiose. Na verdade, apenas uma pequena fração de quebras meióticas (~ 3-5%) evolui para cruzamento, e uma fração semelhante é reparada como não-cruzada.
[00200] Da mesma forma, a evidência é apresentada sobre a ocorrência de reparação de RH mediada por DSB, no entanto, na maioria dos ensaios, não foi possível distinguir entre mecanismos de reparação de cruzamento versus nãocruzamento. A análise de 3 eventos germinais em um fundo polimórfico permitiu realizar essa distinção, mas a amostra (de 2 conversões e um cruzamento putativo) é muito pequena para tirar conclusões.
[00201] Uma diferença significativa em comparação com relatos meióticos anteriores, é que o comprimento dos tratos de conversão nos eventos somáticos não cruzados caracterizados aqui variaram ~ 5 Kb em comparação com o trato médio de 552 pb relatado para eventos de RH meióticos. Essas longas trilhas de conversão podem refletir uma diferença entre espécies (tomate versus Arabidopsis) ou entre células meióticas e somáticas. Pode ser também que a ligação do Spoil ao DSB termine seja mais eficaz que a do Cas9 em proteger os terminais da degradação e reduzir o comprimento da trilha de
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118/124 conversão. Finalmente, este é o primeiro relato de RH direcionada entre cromossomos homólogos endógenos, enquanto não há relato anterior de recombinação meiótica direcionada.
[00202] O cruzamento somático ocorre em plantas, e pode até atingir níveis altos em alguns mutantes, sugerindo que a maquinaria intervertebral inter-homóloga está disponível em tecidos somáticos e que o cruzamento direcionado é viável. Curiosamente, mesmo que o maquinário de cruzamento meiótico tenha sido otimizado durante a evolução, a indução direcionada de um dado DSB durante a meiose teria que competir com as centenas de outras quebras naturais como substrato para o cruzamento e contra a indução, pode resultar ser menos eficiente que a RH somática para indução cruzada direcionada.
[00203] Utilização da RH somática para reprodução
precisa
[00204] Os resultados mostram que nucleases
personalizadas, como CRISPR-Cas, podem ser usadas para uma remodelagem precisa de segmentos cromossômicos entre cromossomos homólogos em células somáticas. Por exemplo, pode ser possível transferir um gene de resistência a doenças de um relativo selvagem para a cultura, sem um longo processo de retrocruzamento que não só leva várias gerações a fim de alcançar linhagens isogênicas, mas também arrasta grandes segmentos de DNA indesejável flanqueando gene desejável.
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Assim, a utilização dos modos aqui divulgados vantagens para utilização para produzir recombinação personalizada em plantas com um evento de RH direcionada (cruzamento ou conversão de genes) em que uma qualidade ou característica adicionada ou removida da planta produzida comparada com uma planta progenitora que não sofre o Evento de direcionamento RH. Além disso, a planta é produzida em um período de tempo reduzido e com um tamanho populacional significativamente menor em comparação ao rastreamento de eventos de recombinação natural, e o evento de recombinação na planta de interesse é produzido mais precisamente, sem também adicionar DNA indesejável. Em algumas modalidades, o evento de cruzamento de gene ou de conversão de RH introduz um gene ou elemento regulador que não é facilmente introduzido por RH de ocorrência natural devido à forte ligação entre genes ou elementos genéticos. Por outras palavras, os métodos aqui descritos e exemplificados demonstram que a RH somática pode ser utilizada para a substituição alélica.
Exemplo 5: Cruzamento induzido por DSB em tecidos somáticos em regiões de eucromatina e heterocromatina em Arabidopsis [00205] Objetivo: Os resultados dos Exemplos 1-4 acima, em tomate, mostraram alto nível de reparo baseado em RH sob DSB de DNA somático. Esses resultados foram limitados ao estudo de um único local (PSY1) localizado em uma região
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120/124 subtelomérica do cromossomo 3, geralmente correspondente às regiões de eucromatina (cromatina aberta). Além disso, o reparo homólogo-dependente observado podería ter ocorrido por cruzamento ou por conversão gênica, já que o sistema experimental não permitia distinguir entre esses dois mecanismos. Por fim, tendo estudado um único local em uma única espécie, não se sabia quão geral era o fenômeno e se o efeito indutor de RH de um DSB em tecidos somáticos seria observado em regiões tanto eucromáticas quanto heterocromáticas (cromatina compacta). O objetivo aqui foi examinar o reparo baseado em RH sob DSB de DNA somático em outra espécie, e nas regiões de eucromatina e heterocromátina.
[00206] As regiões de heterocromátina sao conhecidas por serem suprimidas na recombinação de DNA. Em algumas espécies, a heterocromátina representa 80% do genoma (por exemplo, milho e trigo). A heterocromátina é predominante em torno do centrômero e pode conter até 25% de todos os genes. A falta de recombinação nessas regiões é um obstáculo ao melhoramento de plantas, já que os genes deletérios não podem ser separados dos bons genes.
[00207] Descrevem-se aqui exemplos de RH direcionada, tanto de conversão de cruzamento e do gene, em vários locais genéticos, incluindo os loci com modificações da cromatina correspondentes a eucromatina (metilação baixo
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121/124 citosina, baixa ocupação nucleossoma, Histona3-Lisina4 di ou tri metilação (H3K4me2/3)) e loci com características de heterocromátina (metilação da citosina alta, alta ocupação do nucleossoma, H3K9me2/3, H3K27me3, como seria conhecido na técnica). Estas regiões de eucromatina e heterocromátina foram mostrados para corresponder a pontos quentes meióticos ou pontos frios, respectivamente) (Shilo et al., 2015 DNA Crossover Motifs Associated with Epigenetic Modifications Delineate Open Chromatin Regions in Arabidopsis Plant Cell, Set; 27 (9) : 2427-36).
[00208] Métodos: Para testar as propriedades de reparo de DSB de DNA em regiões com características eucromáticas e heterocromáticas foi usada uma linhagem de teste cruzada (Melamed-Bessudo et al. 2005 A new seed-based assay for meiotic recombination in Arabidopsis thaliana Plant J 43 (3) : 458-66), uma linhagem Columbia ecotipo Arabidopsis com marcadores GFP e RFP separados por uma distância de 5 Mega pb no cromossomo 3, expressa sob o promotor de Napine específico da semente e dando origem a sementes fluorescentes vermelhas e verdes (tipos parentais) ou apenas vermelho ou verde (tipos recombinantes cruzados).
[00209] Com base em motivos genéticos e características epigenéticas, foram escolhidos 12 alvos diferentes para a indução de DSB entre os marcadores GFP e RFP (Tabela 10 apresentada na Figura 11); quatro locais em
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122/124 regiões frias (com características heterocromáticas típicas de pontos frios de recombinação) e oito alvos em regiões quentes (características eucromáticas típicas de pontos de acesso de recombinação) (Figura 12A).
[00210] Primeiramente, doze linhagens testadoras de recombinação de Columbia, que incluíam os 12 alvos diferentes, foram transformadas para expressar os pequenos RNAs guia correspondentes aos alvos de DSB (35Sx2: Higromicina, u6-26: construção de gRNA). Além disso, as linhagens WT Columbia foram projetadas para expressar Cas9 sob um promotor constitutivo de ubiquitina ativo em tecidos somáticos (nos: nptll: nos Ubi: spCas9). As doze linhagens que expressam gRNA foram então cruzadas com as linhagens WT Columbia expressando populações de plantas Cas9 e F1 resistentes tanto à higromicina quanto à canamicina (isto é, contendo tanto o gRNA quanto o Cas9) foram cultivadas e coletadas junto com populações controle de F1 sem gRNA e F1 de Linhagem de teste de Columbia e ecotipos de Landsberg (Figura 12B). Neste ensaio, a quebra de DSB é induzida já em tecidos somáticos e o resultado é medido em sementes. Portanto, eventos de cruzamento somáticos iniciais que são transmitidos para a linhagem germinativa serão medidos. Para cada planta Fl, 300-500 das suas sementes F2 foram contadas apenas para o vermelho (tipo recombinante), apenas verde (tipo recombinante), vermelho e verde (tipo parental) e
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123/124 sementes não fluorescentes (tipo parental). Com base nessas contagens, a frequência de recombinação entre os marcadores GFP e RFP (em cM) foi calculada.
[00211] Resultados: Inesperadamente, os resultados deste teste (Figura 12C) mostraram que, para todos os alvos quentes e frios que foram contados, foi encontrada uma taxa de cruzamento comparável ou aumentada, em relação à população controle de Fl Columbia Ubi: cas9 x Columbia controle de linhagem de testador. Neste ensaio, ambas as plantas
progenitoras estavam no fundo da Columbia e apenas os
marcadores eram polimórficos.
[00212] Para caracterizar o s pontos de corte de
recombinação, as plantas Fl foram cruzadas com o ecotipo
polimórfico de WT Landsberg, as populações de retrocruzamento F2 (plantas resistentes à higromicina e canamicina) foram cultivadas, o DNA foi extraído dos tecidos somáticos destas plantas e os seus grãos F3 foram coletados (Figura 12B). Utilizando o PacBio, fragmentos de 5Kb flanqueando a área alvo dessas plantas de retrocruzamento da Columbia tester x Landsberg, foram sequenciados para caracterização de alta resolução de eventos de reparo de DSB de DNA (Figura 13) . No geral, estes resultados fornecem suporte para recombinação induzida por DSB em ambos os locais de reparação de eucromatina e heterocromatina.
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124/124 [00213] Embora certas características aqui divulgadas tenham sido ilustradas e descritas aqui, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão agora para os especialistas na técnica. É, portanto, para ser entendido que as reivindicações anexas têm a intenção de cobrir todas essas modificações e mudanças que se enquadram no verdadeiro espírito das plantas geneticamente modificadas e métodos divulgados aqui.

Claims (30)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de direcionamento de recombinação de DNA entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática, o referido método caracterizado por compreender as etapas de:
    (a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um do referido alelo polimórfico é clivado no interior do referido pré-selecionado sítio alvo endógeno, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos;
    (b) analisar a progênie da referida célula de planta, ou de um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou de uma planta crescida a partir da referida célula ou de uma progênie da referida planta da mesma, para a recombinação homóloga entre os cromossomas homólogos, em que a referida recombinação homóloga compreende o cruzamento ou a conversão gênica (não cruzada); e (c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progênie destas plantas em que
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  2. 2/14 a recombinação homóloga direcionada ocorreu.
    2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetor do tipo ativador da transcrição (TALEN) ou um sistema de proteínas (Cas) associadas com repetições palíndricas curtas intervaladas regularmente agrupadas (CRISPR)/CRISPR.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido sistema de nuclease compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) compreendendo um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco e um domínio de divagem de nuclease de DNA, em que o referido domínio de ligação de DNA de dedo de zinco se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, direcionando dessa forma o domínio de divagem da nuclease de DNA para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno previamente selecionado.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo de que referido sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease efetor do tipo ativador de transcrição (TALEN) compreendendo um domínio de ligação de DNA efetor TAL e um domínio de divagem de DNA, em que o referido domínio de ligação de DNA efetor TAL se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado,
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    3/14 direcionando desse modo o domínio de divagem do DNA para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno previamente selecionado.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido sistema de nuclease compreende um sistema de nuclease CRISPR/Cas compreendendo uma endonuclease associada a CRISPR e uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, orientando assim a referida endonuclease associada a CRISPR para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida endonuclease associada a CRISPR (Cas nuclease) é selecionada do grupo compreendendo Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, CaslO, Cpfl, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, C2cl, CasX, NgAgo, CSF1, QCA 2, CSF3, e Csf4, homólogos dos mesmos, ou versões modificadas dos mesmos.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula de planta somática se origina a partir de uma célula de planta híbrida ou heterozigótica existente tendo alelos polimórficos no
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    4/14 referido local pré-selecionado.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula de planta híbrida ou heterozigótica existente é originária de uma planta do tipo selvagem.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido método produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação destas, tendo uma combinação de características parentais, a referida combinação não presente em ambos as progenitoras.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as referidas características parentais compreendem aumento da resistência à seca, aumento da resistência a pragas, aumento da resistência a patógenos, melhoria no teor de nutrientes, ou melhores parâmetros de crescimento, ou qualquer outra característica de benefício
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    5/14 à célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula de planta somática se origina de uma célula de progênie do cruzamento de duas plantas, em que as referidas células de plantas parentais compreendem, cada uma, um alelo polimórfico comparado com o referido macho/fêmea no referido sítio préselecionado .
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido método produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada dentro do sítio alvo endógeno préselecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação dos mesmos, tendo uma combinação resultante de características parentais, a referida combinação não presente em ambos as progenitoras.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as referidas características
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    6/14 parentais recombinadas através da referida recombinação homóloga direcionada compreendem aumento da resistência à seca, aumento da resistência a pragas, aumento da resistência a patógenos, melhoria no teor de nutrientes, ou melhores parâmetros de crescimento, ou qualquer outra característica de benefício à célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato que uma das referidas células de planta somáticas parentais compreende o referido sistema de nucleasse, e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease é direcionada ao alelo polimórfico presente na outra célula de planta parental que não compreende o referido sistema de nuclease.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato que uma das referidas células de planta somáticas compreende uma nuclease Cas e a outra das referidas células de planta somáticas compreende uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, orientando dessa maneira a referida nuclease Cas para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a referida célula de planta somática compreende uma célula de uma progênie de planta de
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    7/14 um cruzamento entre duas linhagens parentais polimórficas, que cria uma planta híbrida, em que as referidas linhagens de plantas parentais compreendem, cada uma, um alelo polimórfico no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, e em que apenas uma das linhagens parentais compreende o referido sistema de nuclease.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato que o referido método produz uma célula de planta somática compreendendo uma recombinação homóloga direcionada dentro do sítio alvo endógeno préselecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida célula de planta somática, ou uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida célula de planta somática ou planta progenitora da mesma, ou qualquer combinação das mesmas, tendo uma combinação de características parentais, a referida combinação não presente em ambos as progenitoras.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as referidas características parentais compreendem resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, conteúdo de nutriente melhorado, ou parâmetros de
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    8/14 crescimento melhorados, ou qualquer outra característica de benefício à célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido sistema nuclease compreende uma nuclease Cas e uma molécula de gRNA, em que a referida molécula de gRNA se liga ao referido sítio alvo endógeno pré-selecionado guiando desse modo a referida nuclease Cas para clivar o DNA dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, e em que a atividade de divagem do DNA do referido sistema de nuclease ocorre apenas no alelo
    heterólogo presente na célula de planta progenitora do tipo selvagem. 20 . Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a referida célula de planta
    somática está compreendida dentro de um tecido de planta ou de uma planta inteira.
  20. 21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende DNA compreendendo um gene, uma parte de um gene, ou uma sequência reguladora a montante ou a jusante de um gene, ou qualquer combinação dos mesmos, e em que expressão ou falta do referido gene afeta o crescimento, resistência à seca, resistência a pragas, resistência a patógenos, ou teor de nutrientes, ou qualquer
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    9/14 outra característica de benefício para a célula de planta, tecido de planta, planta, fruta ou semente, ou qualquer combinação dos mesmos.
  21. 22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo que o sítio alvo endógeno pré-selecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromatina.
  22. 23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida expressão compreende indução constitutiva da expressão, indução de expressão induzível, indução de expressão específica do tecido, ou indução de expressão específica da condição, ou qualquer combinação dos mesmos.
  23. 24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula de planta somática compreende um protoplasto.
  24. 25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula de planta somática compreende uma célula de planta de colheita.
  25. 26. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que analisar a referida planta compreende a análise de uma porção da referida planta ou de uma progênie da mesma compreendendo uma folha, um caule, um botão, uma fruta, uma semente.
  26. 27. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida progênie
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    10/14 selecionada da etapa (d) compreende gerações Fl, F2 ou F3,
    OU qualquer geraçao subsequente, ou retrocruzamentos de 1 a 3 gerações, ou qualquer geraçao subsequente de retrocruzamento. 28 . Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método produz uma
    célula de planta somática compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou um tecido de planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado, ou uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado ou uma planta progenitora da mesma, ou fruta derivada de uma planta compreendendo a recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado ou planta progenitora da mesma, ou sementes derivadas de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada no sítio alvo endógeno pré-selecionado ou planta progenitora das mesmas, ou qualquer combinação dos mesmos, a referida célula, tecido, planta ou progênie dos mesmos, fruta ou semente compreendendo genes para resistência aumentada à seca, resistência aumentada a pragas, resistência aumentada a patógenos, teor de nutrientes melhorado, parâmetros de crescimento melhorados, ou qualquer outra característica de benefício
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    11/14 para a célula de planta, tecido de planta, planta ou progênie dos mesmos, fruta, ou semente, ou qualquer combinação destes em comparação com uma célula, planta ou progênie da planta de controle, fruta ou semente.
  27. 29. Planta caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de características benéficas ou qualidades produzidas por um método compreendendo recombinação de DNA direcionada entre cromossomos homólogos em uma célula de planta somática híbrida, o referido método compreendendo as etapas de:
    (a) expressar um sistema de nuclease na referida célula de planta, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno pré-selecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomas homólogos, em que, após a expressão do referido sistema de nuclease, o DNA de pelo menos um do referido alelo polimórfico é clivado no interior do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease cliva o DNA criando uma ruptura de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos;
    (b) analisar a progênie da referida célula de planta, ou de um tecido de planta crescido a partir da referida célula de planta, ou uma planta crescida a partir da referida célula ou uma progenitors da referida planta da mesma, para a recombinação homóloga entre os cromossomas homólogos, em
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    12/14 que a referida recombinação homóloga compreende o cruzamento ou conversão gênica (não cruzada);
    (c) selecionar uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progenitor destas plantas em que a recombinação homóloga direcionada tenha ocorrido;
    (d) propagar a referida célula de planta, ou tecido de planta da mesma, ou planta da mesma, ou progenitor destas plantas para a produção de uma planta compreendendo a referida recombinação homóloga direcionada, em que a referida planta compreende uma combinação de qualidades benéficas ou características que não estão presentes em ambas as plantas progenitoras a partir da qual a célula somática híbrida foi originada.
  28. 30. Planta, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o sítio alvo endógeno préselecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromatina.
  29. 31. Método de produção de uma planta progenitors caracterizado pelo fato de compreender uma combinação de características ou qualidades benéficas, em que a referida combinação não está presente em ambas as plantas progenitoras, compreendendo o referido método:
    (a) selecionar plantas progenitoras, em que cada um dos referidos progenitores compreende pelo menos uma característica benéfica, em que as referidas características
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    13/14 benéficas não são idênticas e em que os referidos progenitores são polimórficos para pelo menos uma das características benéficas;
    (b) cruzar as referidas plantas progenitoras para criar uma planta híbrida;
    (c) coletar células somáticas da planta híbrida;
    (d) expressar um sistema de nuclease nas referidas células somáticas, em que o referido sistema de nuclease expresso é direcionado para um sítio alvo endógeno préselecionado compreendendo alelos polimórficos nos cromossomos homólogos, em que após a expressão do referido sistema de nuclease o DNA de pelo menos um do referido alelo polimórfico é clivado dentro do referido sítio alvo endógeno pré-selecionado, em que a referida nuclease oliva o DNA criando uma quebra de fita dupla no DNA de pelo menos um dos referidos alelos polimórficos, em que o cruzamento homólogo ou conversão génica (não cruzado) no referido sítio alvo endógeno pré-selecionado conduz a uma troca de DNA que expressa ou regula a expressão de pelo menos uma das referidas características ou qualidades benéficas;
    (e) analisar a progênie das referidas células de plantas, ou um tecido de plantas crescidas a partir das referidas células de planta, ou uma planta crescida a partir das referidas células ou de uma progenitora da referida planta da mesma, para o referido evento de cruzamento ou
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    14/14 conversão de genes (não cruzado) em que a referida combinação de características é expressa;
    (f) seleção de uma célula de planta, tecido de planta da mesma, planta da mesma, ou progenitora destas plantas, em que a combinação de características é expressa; e (g) propagar a referida célula de planta, o tecido de planta da mesma, a planta da mesma, para produzir uma planta progenitora que compreenda a referida combinação de características ou qualidades benéficas.
  30. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o sítio alvo endógeno préselecionado compreende uma região de eucromatina ou heterocromátina.
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