ES2731638T3 - Plantas con rasgos útiles y métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

Una planta que presenta un rasgo útil obtenido mediante un método que comprende las etapas de a. suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1 en una primera planta o célula vegetal parental en las que se consigue dicha supresión: (I) transformando la planta o célula vegetal con un transgén que puede suprimir la expresión de MSH1; (II) introduciendo una mutación de pérdida de función en un gen MSH1 endógeno mediante: (i) la recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (ii) la unión de extremos no homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (iii) una combinación de unión de extremos no homólogos y recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; o (iv) la introducción de una mutación en un gen MSH1 endógeno con una meganucleasa o nucleasa con dedos de cinc; (III) mutagénesis química seguida de examen de alto rendimiento para identificar plantas que comprenden mutaciones puntuales u otras mutaciones en un gen MSH1 endógeno; o (IV) introduciendo un ácido nucleico que proporciona supresión de MSH1 en la célula vegetal; b. recuperar plantas de progenie de la planta o célula vegetal parental de la etapa (a) en la que está restaurada la función MSH1; y c. seleccionar una línea de plantas de progenie que presenta uno o más rasgos útiles de las plantas de progenie recuperadas de la etapa (b), o un cruce de las mismas, siendo dichos rasgos hereditarios, reversibles y provocados por uno o más loci cromosómicos alterados en el núcleo de las células vegetales de progenie, habiendo experimentado dichos loci cromosómicos alterados un cambio epigenético, habiéndose inducido dichos loci cromosómicos alterados mediante la supresión de MSH1, y seleccionándose dichos rasgos del grupo que consiste en rendimiento mejorado, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico, siendo en particular dicho rasgo un rendimiento vegetal mejorado; presentando dicha planta de la línea de plantas de progenie seleccionada una mejora en dicho rasgo en relación con una planta parental que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1 sino que era isogénica de otro modo con respecto a dicha primera planta o célula vegetal parental, y comprendiendo la planta los loci cromosómicos alterados asociados con el rasgo.

Description

DESCRIPCIÓN
Plantas con rasgos útiles y métodos relacionados
Antecedentes de la invención
El gen MSH1 representa un homólogo de MutS que ha experimentado al menos dos cambios importantes en la estructura génica dentro de plantas terrestres (Abdelnoor et al. 2003). MutS es un gen procariota que participa en la reparación de apareamientos erróneos y la supresión de recombinación de homólogos. De manera consistente con un modelo de interacción proteína-ADN directa, MSH1 codifica para no solo los dominios de unión a ADN (dominio I) y ATPasa (dominio V), sino que ha experimentado fusión génica de manera prematura en su evolución para adquirir un dominio de tipo GIY-YIG carboxiterminal (dominio VI) (Abdelnoor et al. 2006). La proteína también ha adquirido los dominios II, III y IV, que aparecen bien conservados entre todas las plantas terrestres. Esta complejidad de estructura génica sugiere que MSH1 ha adquirido nuevas funciones en las plantas. Aunque numerosos homólogos de MutS están caracterizados en linajes eucariotas, no se ha encontrado ningún gen fuera de plantas terrestres que presente las características inusuales de MSH1.
Se ha estudiado la función MSH1 en Arabidopsis con mutantes nulos para MSH1 (inserción de ADN-T y EMS) (es decir mutantes msh1) y en otras especies vegetales mediante la supresión de ARNi de MSH1 (Sandhu et al. 2007; Xu et al. 2011). Lo que resultó de estos estudios es que las consecuencias fenotípicas de la supresión de ARNi son bastante similares entre especies, incluyendo la variegación de las hojas, la esterilidad masculina citoplasmática (CMS), un fenotipo de tasa de crecimiento reducida, un fenotipo de floración retardada o sin floración, y una susceptibilidad aumentada a patógenos. La exposición al calor (Shedge et al. 2010), un alto estrés por luz (Xu et al.
2011) y otras condiciones de estrés medioambiental (Hruz et al. 2008) dan como resultado niveles de transcrito de MSH1 reducidos notablemente.
Investigaciones de MSH1 iniciales sugirieron su influencia directa sobre la estabilidad del genoma mitocondrial de la planta. Los mutantes nulos para msh1 en Arabidopsis muestran una actividad de recombinación aumentada a 47 repeticiones mitocondriales que, a lo largo de múltiples generaciones, crea una reorganización genómica significativa. Una consecuencia genómica de alteración de MSH1 es el proceso de desplazamiento subestequiométrico (SSS) (Arrieta-Montiel et al. 2009). La actividad SSS produce cambios drásticos en el número de copias relativas de partes del genoma mitocondrial, provocando la amplificación o supresión selectiva de genes que residen en los subgenomas afectados. Hay consecuencias fenotípicas para estos cambios genómicos; el proceso de SSS participa en la expresión de esterilidad masculina citoplasmática (Sandhu et al. 2007), así como su reversión espontánea a fertilidad en poblaciones naturales (Janska et al. 1998; Bellaoui et al. 1998; Davila et al. 2011; Mackenzie, 2011). De hecho, MSH1 puede haber desempeñado un papel en la evolución de ginodioecia como estrategia reproductiva en plantas (McCauley y Olson, 2008).
Antes de su clonación e identificación como homólogo de MutS, el gen MSH1 se denominó en primer lugar mutador de cloroplastos (CHM) por G. Redei, debido a que su mutación daba como resultado variegación y un crecimiento alterado que parecían derivar de la disfunción de cloroplastos (Redei 1973). De hecho, MSH1 codifica para una proteína seleccionada como diana de manera doble. Una proteína de transfusión génica MSH1-GFP se localiza en nucleoides tanto mitocondriales como de plástido (Xu et al. 2011). El nucleoide es un complejo de proteína-ARN-ADN denso, pequeño, que envuelve los genomas organulares. Sin embargo, a diferencia de la mitocondria en la que prevale la recombinación, no se observa ninguna evidencia de recombinación mediada por repeticiones de cloroplastos potenciada en el mutante msh1. Es posible que la alteración de MSH1 afecte a las características de replicación del genoma de plástido.
En resumen, los efectos de la supresión de MSH1 que se han dado a conocer en las referencias mencionadas anteriormente están limitados a efectos sobre mitocondrias y plástidos vegetales.
Existe evidencia que respalda una relación entre la sensibilidad medioambiental y cambios epigenéticos tanto en plantas como en animales (Bonasio et al., Science 330, 612, 2010). La heredabilidad transgeneracional de estos cambios sigue siendo objeto de investigación activa (Youngson et al. Annu. Rev. Genom. Human Genet. 9, 233, 2008). Estudios previos han mostrado que los patrones de metilación alterados son altamente hereditarios a lo largo de múltiples generaciones y pueden incorporarse en un análisis de variación cuantitativo (Vaughn et al. 2007; Zhang et al. 2008; Johannes et al. 2009). Estudios tempranos de cambios de metilación en Arabidopsis sugieren la disposición del epigenoma a una selección recurrente y también sugieren que es factible establecer estados epigenéticos nuevos y estables (F. Johannes et al. PLoS Genet. 5, e1000530 (2009); F. Roux et al. Genetics 188, 1015 (2011). La manipulación de los mutantes metí y ddmt de Arabidopsis ha permitido la creación de poblaciones epi-RIL que muestran tanto heredabilidad de una formación de patrones de metilación novedosa como una segregación epialélica, enfatizando la probable influencia de la variación epigenómica en la adaptación de las plantas (F. Roux et al. Genetics 188, 1015 (2011)). En poblaciones naturales, una gran proporción de la variación epialélica detectada en Arabidopsis se encuentra como metilación de CpG dentro de regiones ricas en genes del genoma (C. Becker et al. Nature 480, 245 (2011), R.J. Schmitz et al. Science 334, 369 (2011).
Sumario de la invención
En el presente documento se proporcionan métodos para producir una planta que presenta rasgos útiles, métodos para identificar uno o más loci cromosómicos alterados en una planta que pueden conferir un rasgo útil, métodos para obtener plantas que comprenden loci cromosómicos modificados que pueden conferir un rasgo útil, plantas que presentan los rasgos útiles, partes de esas plantas que incluyen células, hojas, tallos, flores y simientes, métodos de uso de las plantas y partes de plantas, y productos de esas plantas y partes de plantas, incluyendo productos procesados tales como un pienso o una comida.
Se dan a conocer métodos para producir una planta que presenta un rasgo útil que comprende las etapas de: a). suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1 en una primera planta o célula vegetal parental; b). cruzar la planta parental de la etapa (a), progenie de la planta parental de la etapa (a), una planta obtenida de la célula vegetal de la etapa (a), o progenie de una planta obtenida de la célula vegetal de la etapa (a) con una segunda planta en la que no se ha suprimido MSH1; c). examinar una población de plantas de progenie obtenidas del cruce de la etapa (b) para determinar al menos un rasgo útil, en la que una parte de la población de plantas de progenie expresa MSH1; y, d). Seleccionar una planta de progenie que comprende el rasgo que expresa MSH1, en la que el rasgo es hereditario y reversible. En ciertos métodos dados a conocer, el rasgo está asociado con uno o más loci cromosómicos alterados. En ciertos aspectos dados a conocer, tales loci cromosómicos alterados pueden comprender loci que están metilados. En ciertos aspectos dados a conocer, se proporcionan métodos para producir una planta que presenta un rasgo útil que comprende las etapas de: a). suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1 en una primera planta o célula vegetal parental; b). cruzar la planta parental de la etapa (a), progenie de la planta parental de la etapa (a), una planta obtenida de la célula vegetal de la etapa (a), o progenie de una planta obtenida de la célula vegetal de la etapa (a) con una segunda planta en la que no se ha suprimido MSH1; c). examinar una población de plantas de progenie obtenidas del cruce de la etapa (b) para determinar al menos un rasgo útil, en la que una parte de la población de plantas de progenie expresan MSH1; y, d). Seleccionar una planta de progenie que comprende el rasgo que expresa MSH1, en la que el rasgo está asociado con uno o más loci cromosómicos mutados. En ciertos aspectos dados a conocer, los loci cromosómicos mutados comprenden inversiones, inserciones, deleciones, sustituciones o combinaciones de nucleótidos. En ciertos aspectos dados a conocer, los loci cromosómicos comprenden mutaciones que son reversibles. En ciertos aspectos dados a conocer, los loci cromosómicos comprenden mutaciones que son irreversibles. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el método comprende además la etapa de producir simiente a partir de: i) una planta de progenie autofecundada de la etapa (d), ii) una planta de progenie cruzada de la etapa (d), o, iii) a partir de una planta de progenie autofecundada y cruzada de la etapa (d). En ciertos aspectos dados a conocer, los métodos pueden comprender además la etapa de someter a ensayo simiente o plantas que se hacen crecer a partir de la simiente para determinar la presencia del rasgo. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la primera planta o célula vegetal parental comprende un transgén que puede suprimir la expresión de MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos, el transgén se selecciona del grupo de transgenes que suprimen la expresión de MSH1 produciendo un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la primera planta o célula vegetal parental puede obtenerse cruzando una planta hembra con una planta macho distinta, comprendiendo al menos una de las plantas hembra o macho un transgén que suprime la expresión del gen endógeno MSH1 de la(s) planta(s) parental(es), y siendo las plantas líneas consanguíneas isogénicas antes de la introducción del transgén. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la primera planta o célula vegetal parental era isogénica con respecto a la segunda planta parental antes de la supresión de MSH1 en la primera planta o célula vegetal parental. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el rasgo se selecciona del grupo que consiste en rendimiento, esterilidad masculina, ausencia de floración, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico. En ciertos aspectos dados a conocer, el estrés abiótico puede seleccionarse del grupo que consiste en estrés por sequía, estrés osmótico, estrés por nitrógeno, estrés por fósforo, estrés por minerales, estrés por calor, estrés por frío y/o estrés por luz. En ciertos aspectos dados a conocer, la resistencia al estrés abiótico puede incluir tolerancia a la sequía, alta tolerancia a la luz, tolerancia al calor, tolerancia al frío y tolerancia a las sales. En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos, el estrés biótico puede seleccionarse del grupo que consiste en patógenos fúngicos de plantas, patógenos bacterianos de plantas, patógenos virales de plantas, insectos, nematodos y herbívoros, y cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el rasgo no está provocado por desplazamiento subestequiométrico (SSS) en mitocondrias de la planta de progenie. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el rasgo es esterilidad masculina y no está provocado por desplazamiento subestequiométrico (SSS) en mitocondrias de la planta de progenie. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la planta de progenie en la etapa (d) o progenie de la misma presentan una mejora en el rasgo en comparación con una planta que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1, sino que era isogénica de otro modo con respecto a la primera planta o célula vegetal parental, plantas parentales. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la planta es una planta de cultivo. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la planta de cultivo se selecciona del grupo que consiste en algodón, colza, trigo, cebada, lino, avena, centeno, hierba de césped, caña de azúcar, alfalfa, banana, brócoli, repollo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cítrico, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, algodón, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, cucurbitáceas, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, tabaco, Jatropha, Camelina y Agave. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, la planta de cultivo se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, colza, trigo, arroz, tomate, tabaco, mijo y sorgo. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el cultivo es sorgo. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el cultivo es sorgo y el rasgo se selecciona del grupo que consiste en longitud de panícula, peso de panícula, biomasa seca, y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se proporcionan plantas, partes de plantas que son simientes, que presentan rasgos útiles provocados por alteraciones y/o mutaciones en loci cromosómicos que resultan de la supresión de MSH1. En determinadas realizaciones, la simiente de planta, que presenta rasgos útiles provocados por alteraciones y/o mutaciones en loci cromosómicos que resultan de la supresión de MSH1 presenta una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con una planta, partes de plantas que incluyen simientes, o productos de las plantas o simientes, que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1 sino que era isogénica de otro modo con respecto a la primera planta o célula vegetal parental. En determinadas realizaciones, tales plantas, simientes de la invención que presentan rasgos útiles provocados por alteraciones y/o mutaciones en loci cromosómicos que resultan de la supresión de MSH1 pueden comprender una o más alteraciones y/o mutaciones en uno o más loci cromosómicos que se indujeron mediante la supresión de MSH1. En determinadas realizaciones, se proporciona una planta o una planta de cultivo producida mediante cualquiera de los métodos anteriores, presentando la planta de cultivo una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con una planta que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1 sino que era isogénica de otro modo con respecto a la primera planta o célula vegetal parental. En ciertos aspectos dados a conocer, cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente es consanguínea y presenta una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con la planta parental o plantas parentales. También se proporciona en el presente documento simiente obtenida de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente. También se dan a conocer en el presente documento productos procesados a partir de cualquiera de las plantas, plantas de cultivo o simientes mencionadas anteriormente, comprendiendo el producto una cantidad detectable de un ADN cromosómico, un ADN mitocondrial, un ADN de plástido, ADN de plástico y mitocondrial, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer, el producto puede comprender una cantidad detectable de un ADN cromosómico que comprende una o más alteraciones y/o mutaciones en uno o más loci cromosómicos que se indujeron mediante la supresión de MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquier de los productos procesados mencionados anteriormente, el producto puede ser aceite, comida, pelusa, cáscaras o una torta prensada.
También se dan a conocer en el presente documento métodos para producir simiente que comprenden recoger simiente de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención. En ciertos aspectos dados a conocer, se proporcionan métodos para producir mucha simiente que comprenden las etapas de autofecundar una población de plantas o plantas de cultivo de la invención, hacer crecer las plantas autofecundadas y recoger la simiente de las mismas. En ciertos aspectos dados a conocer, la simiente recogida o una planta obtenida a partir de la misma presenta la mejora en al menos un rasgo útil.
También se dan a conocer por la presente métodos de uso de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención que comprenden cualquiera de los rasgos mejorados, comprendiendo los métodos hacer crecer, propagar o cultivar las plantas o plantas de cultivo de la invención que presentan el rasgo mejorado. También se proporcionan métodos de obtención de rendimientos mejorados que comprenden recoger cualquier parte de planta incluyendo una simiente de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención. En ciertos aspectos dados a conocer, la simiente recogida o una planta obtenida a partir de la misma presenta la mejora en al menos un rasgo útil.
En ciertos aspectos dados a conocer, se proporcionan métodos para identificar uno o más loci cromosómicos alterados en una planta que pueden conferir un rasgo útil. En un aspecto dado a conocer, se proporcionan métodos que comprenden las etapas de: a. comparar una o más regiones cromosómicas en una planta de referencia que no presenta el rasgo útil con una o más regiones cromosómicas correspondientes en una planta de prueba que sí presenta el rasgo útil, expresando la planta de prueba MSH1 y obteniéndose a partir de una planta o célula vegetal parental en la que se había suprimido MSH1; y, b. seleccionar uno o más loci cromosómicos alterados presentes en la planta de prueba que están ausentes en la planta de referencia y que están asociados con el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, un locus cromosómico alterado comprende un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer, la selección comprende aislar una planta o planta de progenie que comprende el locus cromosómico alterado u obtener un ácido nucleico asociado con el locus cromosómico alterado. En ciertos aspectos dados a conocer, tanto la planta de referencia como la planta de prueba se obtienen de una población de plantas de progenie obtenidas de una planta o célula vegetal parental en la que se había suprimido MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer, tanto la planta de referencia como la planta o célula vegetal parental eran isogénicas antes de la supresión de MSH1 en la planta o célula vegetal parental. En ciertos aspectos dados a conocer, el rasgo útil se selecciona del grupo que consiste en rendimiento, esterilidad masculina, ausencia de floración, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico. En ciertos aspectos dados a conocer, el estrés abiótico puede seleccionarse del grupo que consiste en estrés por sequía, estrés osmótico, estrés por nitrógeno, estrés por fósforo, estrés por minerales, estrés por calor, estrés por frío y/o estrés por luz. En ciertos aspectos dados a conocer, la resistencia al estrés abiótico puede incluir tolerancia a la sequía, alta tolerancia a la luz, tolerancia al calor, tolerancia al frío y tolerancia a las sales. En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos, la resistencia al estrés biótico puede seleccionarse del grupo que consiste en resistencia a patógenos fúngicos de plantas, resistencia a patógenos bacterianos de plantas, resistencia a patógenos virales de plantas, resistencia a insectos, resistencia a nematodos y resistencia a herbívoros, y cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer, el rasgo útil se selecciona del grupo que consiste en resistencia al encamado potenciada, tasa de crecimiento potenciada, biomasa potenciada, macollamiento potenciado, ramificación potenciada, tiempo de floración retardado y senescencia retardada. También se dan a conocer en el presente documento loci cromosómicos alterados identificados mediante cualquiera de los métodos anteriores. Tales loci cromosómicos alterados pueden comprender un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos.
También se dan a conocer en el presente documento plantas que comprenden cualquiera de los loci cromosómicos alterados identificados mediante cualquiera de los métodos anteriores.
También se dan a conocer en el presente documento métodos para producir una planta que presenta un rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, estos métodos pueden comprender las etapas de: a. introducir una modificación cromosómica asociada con un rasgo útil en una planta, comprendiendo la modificación cromosómica un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, un transgén que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, o una mutación cromosómica que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil; y, b. seleccionar una planta que comprende la modificación cromosómica y presenta el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, los métodos pueden comprender además la etapa de producir simiente a partir de: i) una planta de progenie autofecundada de la planta seleccionada de la etapa (b), ii) una planta de progenie cruzada de la planta seleccionada de la etapa (b), o, iii) a partir de una planta de progenie autofecundada y cruzada de la planta seleccionada de la etapa (b). En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos, la modificación cromosómica puede comprender un locus cromosómico alterado y la planta se selecciona sometiendo a ensayo la presencia de un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos, que está asociado con el locus cromosómico alterado. En ciertos aspectos dados a conocer, la modificación cromosómica comprende el transgén o la mutación cromosómica y la planta se selecciona sometiendo a ensayo la presencia del transgén o la mutación cromosómica. En otros aspectos dados a conocer, la planta se selecciona sometiendo a ensayo la presencia del rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, la modificación cromosómica comprende un locus cromosómico alterado y el locus cromosómico alterado comprende un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer, el locus cromosómico alterado tiene un efecto genético que comprende una reducción en la expresión de un gen y la modificación cromosómica comprende un transgén o una mutación cromosómica que proporciona una reducción en la expresión del gen. En ciertos aspectos dados a conocer, cuando el locus cromosómico alterado tiene un efecto genético que comprende una reducción en la expresión de un gen y la modificación cromosómica comprende un transgén, el transgén reduce la expresión del gen produciendo un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido dirigido al gen. En ciertos aspectos dados a conocer, el locus cromosómico alterado tiene un efecto genético que comprende un aumento en la expresión de un gen y la modificación cromosómica comprende un transgén o una mutación cromosómica que proporciona un aumento en la expresión del gen. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquiera de los métodos anteriores, el rasgo útil se selecciona del grupo que consiste en rendimiento, esterilidad masculina, ausencia de floración, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico. En ciertos aspectos dados a conocer, el estrés abiótico puede seleccionarse del grupo que consiste en estrés por sequía, estrés osmótico, estrés por nitrógeno, estrés por fósforo, estrés por minerales, estrés por calor, estrés por frío y/o estrés por luz. En ciertos aspectos dados a conocer, la resistencia al estrés abiótico puede incluir tolerancia a la sequía, alta tolerancia a la luz, tolerancia al calor, tolerancia al frío y tolerancia a las sales. En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos, el estrés biótico puede seleccionarse del grupo que consiste en patógenos fúngicos de plantas, patógenos bacterianos de plantas, patógenos virales de plantas, insectos, nematodos y herbívoros, y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones de los métodos, el rasgo útil se selecciona del grupo que consiste en resistencia al encamado potenciada, tasa de crecimiento potenciada, biomasa potenciada, macollamiento potenciado, ramificación potenciada, tiempo de floración retardado y senescencia retardada. También se dan a conocer en el presente documento plantas preparadas mediante cualquiera de los métodos anteriores. Las plantas dentro del alcance de la invención son plantas que presentan un rasgo útil obtenidas mediante un método que comprende las etapas de
a. suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1 en una primera planta o célula vegetal parental en las que se consigue dicha supresión: (I) transformando la planta o célula vegetal con un transgén que puede suprimir la expresión de MSH1; (II) introduciendo una mutación de pérdida de función en un gen MSH1 endógeno mediante: (i) la recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (ii) unión de extremos no homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (iii) una combinación de unión de extremos no homólogos y recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; o (iv) la introducción de una mutación en un gen MSH1 endógeno con una meganucleasa o nucleasa con dedos de cinc; (III) mutagénesis química seguida de examen de alto rendimiento para identificar plantas que comprenden mutaciones puntuales u otras mutaciones en un gen MSH1 endógeno; o (IV) la introducción de un ácido nucleico que proporciona supresión de MSH1 en la célula vegetal;
b. recuperar plantas de progenie de la planta o célula vegetal parental de la etapa (a) en la que está restaurada la función MSH1; y
c. seleccionar una línea de plantas de progenie que presenta uno o más rasgos útiles de las plantas de progenie recuperadas de la etapa (b), o un cruce de las mismas, siendo dichos rasgos hereditarios, reversibles y provocados por uno o más loci cromosómicos alterados en el núcleo de las células vegetales de progenie, habiendo experimentado dichos loci cromosómicos alterados un cambio epigenético, habiéndose inducido dichos loci cromosómicos alterados mediante la supresión de MSH1, y seleccionándose dichos rasgos del grupo que consiste en rendimiento, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico mejorados, en particular siendo dicho rasgo un rendimiento vegetal mejorado;
presentando dicha planta de la línea de plantas de progenie seleccionada una mejora en dicho rasgo en relación con una planta parental que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1 sino que era isogénica de otro modo con respecto a dicha primera planta o célula vegetal parental, y comprendiendo la planta los loci cromosómicos alterados asociados con el rasgo. En determinadas realizaciones, la planta es una planta de cultivo. En ciertos aspectos dados a conocer, la planta de cultivo se selecciona del grupo que consiste en algodón, colza, trigo, cebada, lino, avena, centeno, hierba de césped, caña de azúcar, alfalfa, banana, brócoli, repollo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cítrico, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, algodón, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, cucurbitáceas, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, tabaco, Jatropha, Camelina y Agave. En determinadas realizaciones de la invención, la planta de cultivo se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, colza, trigo, arroz, tomate, tabaco, mijo y sorgo. En determinadas realizaciones de cualquiera de los métodos anteriores, el cultivo es sorgo. En determinadas realizaciones, el cultivo es sorgo.
También se dan a conocer en el presente documento plantas, partes de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, simientes, hojas, tallos, raíces y flores, o productos de las plantas o partes de plantas que incluyen, pero no se limitan a, simientes, que comprende una modificación cromosómica asociada con un rasgo útil o una alteración cromosómica asociada con un rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, la parte de planta puede comprender una parte de planta no regenerable o porción no regenerable de una parte de planta. En ciertos aspectos dados a conocer, los productos pueden ser productos procesados que incluyen, pero no se limitan a, un pienso o una comida obtenido de una parte de planta. En determinadas realizaciones, la simiente de las plantas, o productos de las mismas que presentan rasgos útiles provocados por una modificación cromosómica, presenta una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con una planta, partes de plantas que incluyen simientes, o productos de las plantas o simientes, que no comprenden la modificación cromosómica. En determinadas realizaciones, tales plantas, simientes o productos que presentan rasgos útiles, pueden comprender una modificación cromosómica que comprende un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, un transgén que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, o una mutación cromosómica que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, tales plantas, partes de plantas, simientes o productos que presentan rasgos útiles pueden comprender un locus cromosómico alterado que comprende un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos dados a conocer, el locus cromosómico alterado que comprende un estado de metilación de ADN cromosómico puede comprender una porción diferenciadora del locus cromosómico alterado que no se encuentra en plantas, partes de plantas o productos de plantas que no se han sometido a supresión de MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer, la porción diferenciadora del locus cromosómico alterado puede comprender una molécula de ADN metilada de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 500 nucleótidos o más. En ciertos aspectos dados a conocer, se proporciona una planta, célula vegetal o producto de planta producido mediante cualquiera de los métodos anteriores, presentando la planta una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con una planta que no comprende la alteración cromosómica sino que era isogénica de otro modo con respecto a la primera planta o célula vegetal parental. En ciertos aspectos dados a conocer, cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente es consanguínea y presenta una mejora en al menos un rasgo útil en comparación con la planta parental o plantas parentales. También se proporciona en el presente documento simiente obtenida de cualquiera de las plantas, células vegetales o plantas de cultivo mencionadas anteriormente. También se dan a conocer en el presente documento productos procesados a partir de cualquiera de las plantas, plantas de cultivo o partes de plantas mencionadas anteriormente que incluyen, pero no se limitan a, simientes, comprendiendo el producto una cantidad detectable de un ADN cromosómico que comprende cualquiera de las modificaciones cromosómicas mencionadas anteriormente que incluyen, pero no se limitan a, un locus cromosómico alterado, un transgén que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, o una mutación cromosómica que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer de cualquier de los productos procesados mencionados anteriormente, el producto puede ser aceite, comida, pelusa, cáscaras o una torta prensada.
También se dan a conocer en el presente documento métodos para producir simiente que comprenden recoger simiente de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención. En ciertos aspectos dados a conocer, se proporcionan métodos para producir mucha simiente que comprende las etapas de autofecundar una población de plantas o plantas de cultivo de la invención, hacer crecer las plantas autofecundadas, y recoger la simiente de las mismas.
También se dan a conocer por la presente métodos de uso de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención que comprenden cualquiera de los rasgos mejorados, comprendiendo los métodos hacer crecer, propagar o cultivar las plantas o plantas de cultivo de la invención que presentan el rasgo mejorado. También se proporcionan métodos de obtención de rendimientos mejorados que comprenden recoger cualquier parte de planta, incluyendo una simiente, de cualquiera de las plantas o plantas de cultivo mencionadas anteriormente de la invención.
También se proporciona en el presente documento el uso en cualquier proceso de cualquiera de las plantas, partes de plantas o porciones de las mismas que incluyen, pero no se limitan a, células vegetales, partes de plantas no regenerables o porciones de las mismas que incluyen, pero no se limitan a, células vegetales, o productos de plantas procesados. Los procesos para los que pueden usarse las plantas, partes de plantas o porciones de las mismas, partes de plantas no regenerables o porciones de las mismas, o productos de plantas procesados proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, el uso en cultivo, uso como biocombustible, uso como pienso animal, uso en productos alimenticios humanos y uso en cualquier proceso de fabricación industrial, de alimento o de pienso.
También se proporciona en el presente documento simiente que presenta el/los rasgo(s) útil(es) y plantas obtenidas a partir de la simiente que presentan la mejora en el/los rasgo(s) útil(es). En determinadas realizaciones, la simiente puede comprender un locus cromosómico alterado que está asociado con el/los rasgo(s) útil(es) o que confiere el/los rasgo(s) útil(es).
En ciertos aspectos dados a conocer, las plantas, partes de plantas, partes de plantas no regenerables, células vegetales, células vegetales no regenerables, productos de plantas o producto de planta procesado proporcionados en el presente documento pueden comprender una cantidad detectable de un ADN cromosómico que comprende un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, un transgén que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil, o una mutación cromosómica que proporciona el mismo efecto genético que un locus cromosómico alterado inducido mediante la supresión de MSH1 asociada con el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer, el locus cromosómico alterado que comprende un estado de metilación de ADN cromosómico puede comprender una porción diferenciadora del locus cromosómico alterado que no se encuentra en plantas, células vegetales, células vegetales no regenerables, partes de plantas, partes de plantas no regenerables, productos de plantas o productos de plantas procesados que no se han sometido a supresión de MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer, la porción diferenciadora del locus cromosómico alterado puede comprender una molécula de ADN metilada de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 500 nucleótidos o más. Los productos procesados dados a conocer en el presente documento que comprenden el ADN cromosómico o porciones diferenciadoras del mismo incluyen, pero no se limitan a, productos que comprenden aceite, comida, pelusa, cáscaras o una torta prensada.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan a y forman parte de la memoria descriptiva, ilustran determinadas realizaciones de la presente invención. En los dibujos:
La Figura 1 ilustra diversos fenotipos que se observan en diversas plantas sometidas a supresión de MSH1 tal como esterilidad masculina citoplasmática, variegación y desarrollo de cloroplastos alterado, tasa de crecimiento reducida y enanismo, tiempo de floración alterado o ausencia de floración, biosíntesis de flavonoides reducida y ausencia de antocianinas, susceptibilidad a patógenos potenciada, morfologías de hoja alteradas y alta tolerancia a la luz.
La Figura 2 ilustra la variegación de las hojas en plantas de Arabidopsis (arriba), tomate (centro) y sorgo (panel inferior) que se habían sometido a supresión de MSH1.
La Figura 3 ilustra el enanismo en plantas de Sorghum (arriba) y tomate (panel inferior) que se habían sometido a supresión de MSH1.
La Figura 4 ilustra reorganizaciones de ADN mitocondrial en Arabidopsis que se habían sometido a supresión de MSH1.
La Figura 5 ilustra aumentos en especies de oxígeno reactivas (ROS) que se observan en plantas de tomate, tabaco y mijo sometidas a supresión de MSH1.
La Figura 6 ilustra un esquema a modo de ejemplo y no limitativo para obtener plantas que presentan diversos tipos de variación fenotípica hereditaria denominada en el presente documento “variación discreta” (Vd) como resultado de haberse sometido a supresión de MSH1 y para obtener líneas de plantas que pueden presentar “variación cuantitativa” o “Vq” y diversos rasgos útiles.
La Figura 7 ilustra una línea de plantas de Arabidopsis (msh1 x Col-0 F3) que presenta aumentos de biomasa en relación con una planta parental isogénica de otro modo que no se había sometido a supresión de MSH1 (Col-0).
La Figura 8 ilustra la distribución de alturas de planta (en cM) que se obtienen en distintas líneas de sorgo GAII-11 (cuadrados), GAII-15 (triángulos), GAII-22 (corchetes opuestos), GAII-24 y GAII-28 (círculos) derivadas de cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1. La línea de referencia de tipo silvestre es fx WT (diamantes).
La Figura 9 ilustra la distribución de pesos de panícula (en gramos) que se obtienen en distintas líneas de sorgo GAII-11 (cuadrados), GAII-15 (triángulos), GAII-22 (corchetes opuestos), GAII-24 y GAII-28 (círculos) derivadas de cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1. La línea de referencia de tipo silvestre es fx WT (diamantes).
La Figura 10 ilustra la distribución de rendimiento de grano (en gramos) que se obtiene en distintas líneas de sorgo GAII-11 (cuadrados), GAII-15 (triángulos), GAII-22 (corchetes opuestos), GAII-24 y GAII-28 (círculos) derivadas de cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1. La línea de referencia de tipo silvestre es fx WT (diamantes).
La Figura 11 A-H ilustra el fenotipo de crecimiento potenciado de líneas MSH1-epi en Arabidopsis y sorgo. Se indican los procedimientos transgénicos y de cruce usados para derivar epi-poblaciones de sorgo y Arabidopsis. (A) El fenotipo de la progenie F1 derivada de cruzar Tx430 x MSH1-dr. (B) Líneas de sorgo epiF2, F3 y F4 que se hacen crecer en campo muestran una variación en la arquitectura y altura de planta. (C) Panículas de Tx430 (a la izquierda, 66 g, tallo de 8 mm) frente a individuos epi-F2 (a la derecha, 112 g, tallo de 11 mm). (D) Rendimiento de simiente de las panículas mostradas en C. (E) El fenotipo de sorgo MSH1-dr en condiciones de campo. (F) Evidencia de crecimiento de roseta potenciado en una línea epi-F4 de Arabidopsis. (G) Plantas epi-F4 de Arabidopsis muestran biomasa de planta, diámetro de roseta y diámetro de tallo de flor potenciados en relación con Col-0. Datos mostrados como media ± DE > 6. (H) El fenotipo epiF4 de Arabidopsis en floración.
La Figura 12 ilustra una variación fenotípica potenciada en líneas MSH1-epiF2 de sorgo. Se muestran distribuciones fenotípicas para altura de planta y rendimiento de grano de tres poblaciones epiF2 de sorgo independientes que se han hecho crecer en dos plantaciones en campo. Se muestran medias de población mediante líneas verticales discontinuas.
Las Figuras 13 A, B ilustran una variación fenotípica en líneas MSH1-epiF2, F3 y F4 de sorgo. (A) Líneas MSH1-epiF4 seleccionadas para altura de planta y rendimiento de grano por panícula. Para altura de planta, se seleccionaron las líneas 4b-10, 10.3 y 3a.2 para altura de planta baja, todas las demás se seleccionaron para alta. Para el rendimiento de grano, se seleccionó la línea 15.2 para rendimiento bajo, todas las demás se seleccionaron para alto. (B) Gráficos de cajas que muestran la respuesta de población individual a la selección para cuatro poblaciones independientes. La línea discontinua horizontal representa la media para el tipo silvestre Tx430. En el caso de rendimiento de grano, la selección de F3 se llevó a cabo en invernadero.
La Figura 14 A-E ilustra que el crecimiento potenciado por MSH1-epi en Arabidopsis está asociado con efectos de cloroplastos. (A) Línea de hemicomplementación mitocondrial AOX-MSH1 x Col-0 F1; (B) SSU-MSH1 x Col-0 F2 complementada por plástido parece ser idéntico al tipo silvestre Col-0, (C) Diámetro de roseta y biomasa fresca de líneas F2 derivadas de SSU-MSH1 en relación con Col-0; (D) AOX-MSH1 x Col-0 F2 complementada por mitocondria que muestra un crecimiento potenciado; (E) Diámetro de roseta y biomasa fresca de líneas F2 derivadas de AOX-MSH1 es significativamente mayor (P<0,05) que Col-0. (F) Fenotipo de crecimiento potenciado en la generación F4 de A0X-MSH1 x Col-0.
La Figura 15 A-C ilustra patrones de 5-metil-citosina por todo el genoma en líneas de tipo silvestre Col-0 y MSH1-epiF3 de Arabidopsis. (A) Contribuciones relativas de metilación de CG, CHG y CHH a la metilación diferencial y no diferencial del genoma. Obsérvese que la región intergénica está en la parte superior de la barra, seguido en orden por gen TE, pseudogenes, ARNnc, 3’-UTR, 5’-UTR, intrón y CDS. (B) Distribución de CG-DMP y CG-N-DMP a lo largo de cada cromosoma, con datos normalizados para el valor más alto para cada cromosoma en paralelo al procedimiento de análisis usado por Becker et al. Nature 480, 245 (2011). (C) Análisis de metilación de Col-0 tomado de la Figura 1c en Becker et al. (Ibid) para demostrar la similitud de patrones de NDMP y la disimilitud de DMP.
La Figura 16 ilustra plantas F1 de Arabidopsis que resultan de cruces de la línea de hemicomplementación de cloroplastos mshl x tipo silvestre Col-0. La hemicomplementación de cloroplastos mediada por transgenes de mshl restaura el fenotipo de tipo silvestre. Sin embargo, cruces de estas líneas hemicomplementadas con Col-0 da como resultado que aproximadamente el 25% de las plantas muestren rizadura de las hojas a intensidades variables en la F1. La causa de este fenotipo todavía no se conoce, pero ya no es visible en poblaciones F2 derivadas.
La Figura 17 ilustra la distribución del tiempo de floración en líneas Col-0, epiF4 y epiF5 de Arabidopsis. Cada distribución se dibuja en base a un mínimo de 50 plantas.
La Figura 18 A, B, C ilustra la validación de regiones metiladas de manera diferencial entre las líneas de Arabidopsis col-0 y msh1-epif3 usando secuenciación por bisulfito. La alineación de la región DMR dentro de AT3G27150 (gen diana de MIR2111 -5p). Se predice que las G destacadas (es decir subrayadas en la figura) están no metiladas en Col-0 y metiladas en MSH1-epiF3. Las secuencias de la figura 18A, B, y C se proporcionan en la lista de secuencias tal como sigue: AT3G27150 (SEQ ID NO:27), Col0-MIR2-2 (SEQ ID NO:28), Col0-MIR2-3 (SEQ ID NO:29), Col0-MIR2-4 (SEQ ID NO:30), Col0-MIR2-5 (SEQ ID NO:31), Col0-MIR2-6 (SEQ ID NO:32), Col0-MIR2-10 (SEQ ID NO:33), Col0-MIR2-11 (SEQ ID NO:34), Col0-MIR2-12 (SEQ ID NO:35), Col0-MIR2-26 (SEQ ID NO:36), Col0-MIR2-27 (SEQ ID NO:37), Col0-MIR2-28 (SEQ ID NO:38), Col0-MIR2-29 (SEQ ID NO:39), F3-Mir2-1 (SEQ ID NO:40), F3-Mir2-2 (SEQ ID NO:41), F3-Mir2-4 (SEQ ID NO:42), F3-Mir2-5 (SEQ ID NO:43), F3-Mir2-7 (SEQ ID NO:44), F3-Mir2-11 (SEQ ID NO:45), F3-Mir2-12 (SEQ ID NO:46), F3-Mir2-15 (SEQ ID NO:47), F3-Mir2-16 (SEQ ID NO:48), F3-Mir2-27 (SEQ ID NO:49) y F3-Mir2-28 (SEQ ID NO:50).
Descripción detallada
I. Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, la frase “modificación cromosómica” se refiere a cualquiera de: a) “loci cromosómicos alterados” y un “locus cromosómico alterado”; b) “loci cromosómicos mutados”, un “locus cromosómico mutado”, “mutaciones cromosómicas” y una “mutación cromosómica”; o c) un transgén.
Tal como se usa en el presente documento, las frases “loci cromosómicos alterados” (plural) o “locus cromosómico alterado (singular) se refieren a porciones de un cromosoma que han experimentado un cambio epigenético hereditario y reversible en relación con los loci cromosómicos parentales correspondientes. Los cambios epigenéticos hereditarios y reversibles en loci cromosómicos alterados incluyen, pero no se limitan a, metilación de ADN cromosómico, y en particular, metilación de residuos de citosina para dar residuos de 5-metilcitosina, y/o modificación postraduccional de proteínas histona, y en particular, modificaciones de histona que incluyen, pero no se limitan a, acetilación, metilación, ubiquitinilación, fosforilación y sumoilación (unión covalente de proteínas modificadoras de tipo ubiquitina pequeñas). Tal como se usa en el presente documento, “loci cromosómicos” se refieren a loci en cromosomas ubicados en el núcleo de una célula.
Tal como se usa en el presente documento, el término “que comprenden” significa “que incluyen, pero no se limitan a”.
Tal como se usa en el presente documento, las frases “loci cromosómicos mutados” (plural) (plural), “locus cromosómico mutado” (singular), “mutaciones cromosómicas” y “mutación cromosómica” se refieren a porciones de un cromosoma que han experimentado un cambio genético hereditario en una secuencia de nucleótidos en relación con la secuencia de nucleótidos en los loci cromosómicos parentales correspondientes. Los loci cromosómicos mutados comprenden mutaciones que incluyen, pero no se limitan a, inversiones, inserciones, deleciones, sustituciones de secuencias de nucleótidos, o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, los loci cromosómicos mutados pueden comprender mutaciones que son reversibles. En este contexto, las mutaciones reversibles en el cromosoma pueden incluir, pero no se limitan a, inserciones de elementos transponibles, elementos transponibles defectuosos y ciertas inversiones. En determinadas realizaciones, los loci cromosómicos comprenden mutaciones que son irreversibles. En este contexto, las mutaciones irreversibles en el cromosoma pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones.
Tal como se usa en el presente documento, el término “variación discreta” o “VD” se refiere a una variación fenotípica hereditaria distinta, que incluye rasgos de esterilidad masculina, enanismo, variegación y/o tiempo de floración retardado que pueden observarse o bien en cualquier combinación o bien en aislamiento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “MSH-dr” se refiere a cambios en macollamiento de la planta, altura, elongación internodal y densidad estomática que se observan en plantas sometidas a supresión de MSH1.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “variación cuantitativa” o “Vq” se refiere a la variación fenotípica que se observa en líneas de progenie individuales derivadas de cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 y que presentan variación discreta con respecto a otras plantas.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “microRNA” o “miARN” se refieren tanto a un miARN que es sustancialmente similar a un miARN nativo que está en una planta como a un miARN artificial. En determinadas realizaciones, un transgén puede usarse para producir o bien un miARN que es sustancialmente similar a un miARN nativo que está en una planta o bien un miARN artificial.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “obtener un ácido nucleico asociado con el locus cromosómico alterado” se refiere a cualquier método que proporciona la separación física o el enriquecimiento del ácido nucleico asociado con el locus cromosómico alterado de nucleico unido covalentemente que no se ha alterado. En este contexto, el ácido nucleico no comprende necesariamente la alteración (es decir tal como metilación) pero comprende al menos comprende uno o más de la base o bases nucleotídicas que se alteran. Por tanto, pueden obtenerse ácidos nucleicos asociados con un locus cromosómico alterado mediante métodos que incluyen, pero no están limitados a, clonación molecular, PCR o síntesis directa basada en datos de secuencia.
La frase “unido operativamente” tal como se usa en el presente documento se refiere a la unión de secuencias de ácido nucleico de modo que una secuencia puede proporcionar una función requerida a una secuencia unida. En el contexto de un promotor, “unido operativamente” significa que el promotor está conectado a una secuencia de interés de modo que la transcripción de esa secuencia de interés se controla y regula mediante ese promotor. Cuando la secuencia de interés codifica para una proteína y cuando se desea la expresión de esa proteína, “unido operativamente” significa que el promotor está unido a la secuencia de tal manera que el transcrito resultante se traducirá eficientemente. Si la unión del promotor a la secuencia codificante es una fusión transcripcional y se desea la expresión de la proteína codificada, la unión se hace de modo que el primer codón de iniciación traduccional en el transcrito resultante es el codón de iniciación de la secuencia codificante. Alternativamente, si la unión del promotor a la secuencia codificante es una fusión traduccional y se desea la expresión de la proteína codificada, la unión se hace de modo que el primer codón de iniciación traduccional contenido en la secuencia no traducida en 5’ asociada con el promotor se une de modo que el producto de traducción resultante está en marco con el marco de lectura abierto traduccional que codifica para la proteína deseada. Las secuencias de ácido nucleico que pueden unirse operativamente incluyen, pero no se limitan a, secuencias que proporcionan funciones de expresión génica (es decir, elementos de expresión génica tales como promotores, regiones sin traducir en 5’, intrones, regiones que codifican para proteínas, regiones sin traducir en 3’, sitios de poliadenilación y/o terminadores transcripcionales), secuencias que proporcionan funciones de transferencia y/o integración de ADN (es decir, sitios de reconocimiento de recombinasa específico del sitio, sitios de reconocimiento de integrasa), secuencias que proporcionan funciones selectivas (es decir, marcadores de resistencia a antibióticos, genes biosintéticos), secuencias que proporcionan funciones de marcador puntuables (es decir, genes indicadores), secuencias que facilitan manipulaciones in vitro o in vivo de las secuencias (es decir, secuencias de poliligador, secuencias de recombinación específica del sitio, secuencias de recombinación de homólogos), y secuencias que proporcionan funciones de replicación (es decir, orígenes de replicación bacterianos, secuencias de replicación autónomas, secuencias centroméricas).
Tal como se usa en el presente documento, la frase “suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1” se refiere a cualquier manipulación genética o ambiental que proporciona niveles disminuidos de actividad MSH1 funcional en una planta o célula vegetal en relación con los niveles de actividad MSH1 funcional que está en una planta o célula vegetal isogénica de otro modo que no se había sometido a esta manipulación genética o ambiental.
Tal como se usa en el presente documento, el término “transgén”, en el contexto de una modificación cromosómica, se refiere a cualquier ADN de una fuente heteróloga que se ha integrado en un cromosoma que se mantiene de manera estable en una célula huésped. En este contexto, las fuentes heterólogas para el ADN incluyen, pero no se limitan a, ADN de un organismo distinto del organismo de célula huésped, especies distintas de las especies de célula huésped, variedades de la misma especie que son o bien variedades distintas o bien variedades idénticas, ADN que se ha sometido a cualquier modificación in vitro, ADN recombinante, y cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “no regenerable” se refiere a una parte de planta o célula vegetal que no puede dar lugar a una planta completa.
II. Descripción general
Métodos para introducir variación hereditaria y epigenética y/o genética que dan como resultado plantas que presentan rasgos útiles se proporcionan por la presente junto con plantas, simientes de plantas, partes de plantas, células vegetales y productos de plantas procesados que pueden obtenerse mediante estos métodos. En ciertos aspectos dados a conocer, los métodos proporcionados por la presente pueden usarse para introducir variación epigenética y/o genética en plantas varietales o no híbridas que dan como resultado rasgos útiles así como plantas, partes de plantas útiles que incluyen, pero no se limitan a, simientes, células vegetales y productos de plantas procesados que presentan, portan o reflejan de otro modo beneficios conferidos por los rasgos útiles. En otros aspectos, los métodos proporcionados por la presente pueden usarse para introducir variación epigenética y/o genética en plantas que también son susceptibles de hibridación.
En la mayoría de las realizaciones, los métodos para obtener plantas proporcionadas por la presente implican suprimir la expresión del gen MSH1 de la planta, restaurar la expresión de un gen MSH1 de la planta funcional, y seleccionar plantas de progenie que presentan uno o más rasgos útiles. En determinadas realizaciones, estos rasgos útiles están asociados con cualquiera de uno o más loci cromosómicos alterados que han experimentado un cambio epigenético hereditario y reversible, con uno o más loci cromosómicos mutados que han experimentado un cambio genético hereditario, o combinaciones de los mismos.
III. Supresión de la expresión de MSH1 en plantas o células vegetales.
En general, los métodos para obtener plantas proporcionadas por la presente para introducir plantas de variación epigenética y/o genética requieren simplemente que la expresión de MSH1 se suprima durante un tiempo suficiente para introducir la variación. Como tal, una amplia variedad de métodos de supresión de MSH1 pueden emplearse para poner en práctica los métodos proporcionados por la presente y los métodos no están limitados a una técnica de supresión particular.
Dado que tanto el gen MSH1 como los efectos de la depleción del gen MSH1 parecen estar altamente conservados en plantas, se anticipa adicionalmente que los métodos proporcionados en el presente documento pueden aplicarse a una variedad de diferentes plantas o células vegetales. Por la presente se proporcionan secuencias de genes MSH1 o fragmentos de los mismos de Arabidopsis, soja, Zea mays, Sorghum, arroz, Brachipodium, Vitis vinifera, algodón y pepino. En determinadas realizaciones, tales genes pueden usarse directamente en o bien la especie vegetal homóloga o bien una especie vegetal heteróloga para proporcionar la supresión del gen endógeno MSH1 en la especie vegetal o bien homóloga o bien heteróloga. Una demostrado a modo de ejemplo, no limitativa, en la que un gen MSH1 de una especie mostró ser eficaz en la supresión del gen endógeno MSH1 en una especie tanto homóloga como heteróloga se proporciona por Sandhu et al. 2007, donde un transgén que proporciona un ARN inhibidor de MSH1 (ARNi) con secuencias MSH1 de tomate mostró que inhibía los genes MSH1 endógenos tanto de tomate como de tabaco. Un transgén que proporciona un ARN inhibidor de MSH1 (ARNi) con secuencias MSH1 de maíz puede inhibir los genes MSH1 endógenos de mijo, sorgo y maíz. Los genes MSH1 de otras plantas que incluyen, pero no se limitan a, algodón, colza, trigo, cebada, lino, avena, centeno, hierba de césped, caña de azúcar, alfalfa, banana, brócoli, repollo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cítrico, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, algodón, una cucurbitácea, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, patata, álamo, pino, girasol, cártamo, fresa, remolacha azucarera, batata, tabaco, yuca, coliflor, apio, cítrico, cucurbitáceas, eucalipto, ajo, uva, cebolla, lechuga, guisante, cacahuete, pimiento, álamo, pino, girasol, cártamo, soja, fresa, remolacha azucarera, tabaco, Jatropha, Camelina y Agave pueden obtenerse mediante una variedad de técnicas y usarse para suprimir la expresión de cualquier gen MSH1 correspondiente en esas plantas o el gen MSH1 en una planta distinta. Los métodos para obtener genes MSH1 para diversas plantas incluyen, pero no se limitan a, técnicas tales como: i) buscar bases de datos de secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos que comprenden secuencias de la especie vegetal para identificar el gen MSH1 mediante comparaciones de identidad de secuencias; ii) clonar el gen MSH1 mediante o bien PCR de secuencias genómicas o bien RT-PCR de ARN expresado; iii) clonar el gen MSH1 de una biblioteca genómica o de ADNc usando técnicas a base de PCR y/o hibridación; iv) clonar el gen MSH1 de una biblioteca de expresión, usando un anticuerpo dirigido a la proteína MSH1 para identificar el clon que contiene MSH1; v) clonar el gen MSH1 mediante la complementación de una planta deficiente en MSH1 o mutante msh1 o; o vi) cualquier combinación de (i), (ii), (iii), (iv) y/o (v). La recuperación del gen MSH1 de la planta puede determinarse o confirmarse fácilmente construyendo una vector de transformación de planta que proporciona la supresión del gen, transformando las plantas con el vector, y determinando si las plantas transformadas con el vector presentan las respuestas características que se observan normalmente en diversas especies vegetales cuando se suprime la expresión de MSH1, que incluyen variegación de las hojas, esterilidad masculina citoplasmática (CMS), un fenotipo de tasa de crecimiento reducida, fenotipo de floración retardada o sin floración, y susceptibilidad aumentada a patógenos.
En ciertos aspectos, los genes MSH1 o fragmentos de los mismos usados en los métodos proporcionados en el presente documento tendrán secuencias de nucleótidos con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencias de nucleótidos con uno o más de los genes MSH1 o fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento que incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3­ 10 y SEQ ID NO:14. En ciertos aspectos dados a conocer, los genes MSH1 o fragmentos de los mismos usados en los métodos proporcionados en el presente documento codifican para proteínas MSH1 o porciones de las mismas tendrán secuencias de aminoácidos con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencias de aminoácidos con una o más de las proteínas MSH1 proporcionadas en el presente documento que incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID NO:2, y las proteínas MSH1 codificadas por SEQ ID NO: 310. En ciertos aspectos dados a conocer, los genes MSH1 o fragmentos de los mismos usados en los métodos proporcionados en el presente documento tendrán secuencias de nucleótidos con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencias de nucleótidos con uno o más de los genes MSH1 fragmentos de los mismos, ortólogos de los mismos u homólogos de los mismos, proporcionados en el presente documento que incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52. En determinadas realizaciones, los genes MSH1 o fragmentos de los mismos usados en los métodos proporcionados en el presente documento que codifican para proteínas MSH1 o porciones de las mismas tendrán secuencias de aminoácidos con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencias de aminoácidos con una o más de las proteínas MSH1 u homólogos de MSH1 proporcionados en el presente documento que incluyen, pero no se limitan a, las proteínas codificadas por SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52. Los genes MSH1 de plantas distintas de las proporcionadas en el presente documento también pueden identificarse mediante los dominios de unión a ADN (dominio I), ATPasa (dominio V) y endonucleasa de tipo GIY-YIG carboxiterminal (dominio VI) codificados que caracterizan muchos genes MSH1 (Abdelnoor et al. 2006). A este respecto, se anticipa que fragmentos de ácido nucleico de MSH1 de 18 a 20 nucleótidos, peor más preferiblemente 21 nucleótidos o más, pueden usarse para efectuar la supresión del gen MSH1 endógeno. En ciertos aspectos dados a conocer, pueden usarse fragmentos de ácido nucleico de MSH1 de desde al menos 18, 19, 20 o 21 nucleótidos hasta aproximadamente 50, 100, 200, 500 o más nucleótidos para efectuar la supresión del gen MSH1 endógeno.
En determinadas realizaciones, la supresión de MSH1 en una planta se efectúa con un transgén. Los transgenes que pueden usarse para suprimir la expresión de MSH1 incluyen, pero no se limitan a, transgenes que producen mutantes negativos dominantes de MSH1, un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido que proporcionan inhibición del gen MSH1 endógeno. Las patentes estadounidenses que describen la supresión de genes vegetales endógenos mediante transgenes incluyen US 7.109.393, US 5.231.020 y US 5.283.184 (métodos de cosupresión); y US 5.107.065 y US 5.759.829 (métodos antisentido). En ciertos aspectos dados a conocer, pueden usarse transgenes diseñados específicamente para producir moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) con homología con el gen MSH1 para reducir la expresión del gen MSH1 endógeno. En tales aspectos dados a conocer, las secuencias de hebra sentido del ARNbc pueden separarse de las secuencias antisentido mediante una secuencia espaciadora, preferiblemente una que promueve la formación de una molécula de ARNbc (ARN bicatenario). Ejemplos de tales secuencias espaciadoras incluyen, pero no se limitan a, aquellas expuestas en Wesley et al., Plant J., 27(6):581-90 (2001), y Hamilton et al., Plant J., 15:737-746 (1998). Un vector a modo de ejemplo y no limitativo que ha mostrado que proporciona la supresión de MSH1 en tabaco y tomate se ha descrito por Sandhu et al., 2007, en el que una secuencia de intrón separa las hebras sentido y antisentido de la secuencia MSH1.
En ciertos aspectos dados a conocer, los transgenes que proporcionan la supresión de MSH1 pueden comprender promotores regulados que proporcionan o bien la inducción o bien la regulación por disminución de secuencias inhibidoras de MSH1 unidas operativamente. En este contexto, las secuencias inhibidoras de MSH1 pueden incluir, pero no se limitan a, mutantes negativos dominantes de MSH1, un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido que proporcionan inhibición del gen endógeno MSH1 de una planta. Tales promotores pueden proporcionar la supresión de MSH1 durante periodos de tiempo controlados o bien proporcionando o bien reteniendo el inductor o regulación por disminución. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor PR-1a (publicación de solicitud de patente estadounidense número 20020062502) o un promotor GsT II (documento w O 1990/008826 A1). En otros aspectos dados a conocer, se proporcionan tanto un factor de transcripción que puede inducirse o reprimirse así como un promotor reconocido por ese factor de transcripción y unido operativamente a las secuencias inhibidoras de MSH1. Tales sistemas de factor de transcripción/promotor incluyen, pero no se limitan a: i) factores de transcripción de receptor de ecdisoma de dominio ácido RF2a/promotores semejantes que pueden inducirse mediante metoxifenozida, tebufenozida y otros compuestos (publicación de solicitud de patente estadounidense número 20070298499); ii) factores de transcripción de represor de tetraciclina quiméricos/promotores quiméricos semejantes que pueden reprimirse o desreprimirse con tetraciclina (Gatz, C., et al. (1992). Plant J. 2, 397-404), y similares.
En todavía otros aspectos dados a conocer, se proporcionan plantas transgénicas en las que el transgén que proporciona la supresión de MSH1 está flanqueado por secuencias que proporcionan la eliminación para el transgén. Tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias de elementos transponibles sobre las que se actúa mediante una transposasa semejante. Los ejemplos no limitativos de tales sistemas que se han usado en plantas transgénicas incluyen los sistemas cre-lox y FLP-FRT.
La supresión de MSH1 puede identificarse o monitorizarse fácilmente mediante técnicas moleculares. En ciertos aspectos dados a conocer, en los que el MSH1 endógeno está intacto, pero su expresión está inhibida, pueden monitorizarse la producción o acumulación del ARN que codifica para MSH1. Los métodos moleculares para monitorizar los niveles de expresión de ARN de MSH1 incluyen, pero no se limitan a, el uso de técnicas de reacción en cadena de la transcriptasa inversa semicuantitativas o cuantitativas (qRT-PCR). El uso de técnica de PCR semicuantitativas para monitorizar la supresión de MSH1 que resulta de la supresión mediada por ARNi de MSH1 se ha descrito (Sandhu et al. 2007). Pueden usarse diversos procedimientos de RT-PCR cuantitativos que incluyen, pero no se limitan a, reacciones TaqMan.TM. (Applied Biosystems, Foster City, Calif. EE. UU.), el uso de sondas Scorpion.TM. o Molecular Beacon.TM., o cualquiera de los métodos dados a conocer en Bustin, S. A. (Journal of Molecular Endocrinology (2002) 29, 23-39). También es posible usar otras técnicas de cuantificación de ARN tales como amplificación a base de secuencias de ácido nucleico cuantitativa (Q-NASBA.TM.) o la tecnología Invader.TM. (Third Wave Technologies, Madison, Wis.).
En determinadas realizaciones en la que la supresión de MSH1 se consigue mediante el uso de una mutación en el gen endógeno MSH1 de una planta, la presencia o ausencia de esta mutación en el ADN genómico puede determinarse fácilmente mediante una variedad de técnicas. También pueden usarse ciertas técnicas que proporcionan la identificación de la mutación en un estado hemicigótico (es decir en el que un cromosoma porta el gen msh1 mutado y el otro cromosoma porta el gen MSH1 de tipo silvestre). Las mutaciones en secuencias de ADN de MSH1 que incluyen inserciones, deleciones, sustituciones de nucleótidos, y combinaciones de las mismas pueden detectarse mediante una variedad de métodos eficaces que incluyen, pero no se limitan a, los dados a conocer en las patentes estadounidenses n.os 5.468.613. 5.217.863; 5.210.015; 5.876.930; 6.030.787; 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; 5.945.283; 5.468.613; 6.090.558; 5.800.944; 5.616.464; 7.312.039; 7.238.476; 7.297.485; 7.282.355; 7.270.981 y 7.250.252. Por ejemplo, pueden detectarse mutaciones mediante hibridación con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) tal como se da a conocer en las patentes estadounidenses 5.468.613 y 5.217.863. La patente estadounidense 5.210.015 da a conocer la detección de oligonucleótidos apareados, en la que un nucleótido marcado en 5’ que no está apareado se libera mediante la actividad exonucleasa 5’-3’. La patente estadounidense 6.004.744 da a conocer la detección de la presencia o ausencia de mutaciones en ADN a través de una reacción de extensión de cebador de ADN. La patente estadounidense 5.468.613 da a conocer hibridaciones de oligonucleótidos específicos de alelo en las que pueden detectarse variaciones de nucleótidos simples o múltiples en la secuencia de ácido nucleico mediante un proceso en el que la secuencia que contiene la variación de nucleótido se amplifica, se fija a un soporte y se expone a una sonda de oligonucleótidos específicos de secuencia marcada. También pueden detectarse mutaciones mediante métodos de ligado de sondas tal como se da a conocer en la patente estadounidense 5.800.944, en la que la secuencia de interés se amplifica y se hibrida con sondas seguido de ligación para detectar una parte marcada de la sonda. Las patentes estadounidenses 6.613.509 y 6.503.710, y referencias que se encuentran en las mismas proporcionan métodos para identificar mutaciones con espectroscopia de masas. Estos diversos métodos de identificación de mutaciones pretenden ser a modo de ejemplo en vez de limitativos ya que los métodos dados a conocer en la presente invención pueden usarse junto con cualquier método de tipificación de polimorfismos para identificar la presencia o ausencia de mutaciones en un gen MSH1 en muestras de ADN genómico. Además, las muestras de ADN genómico usadas pueden incluir, pero no se limitan a, ADN genómico aislado directamente de una planta, ADN genómico clonado o ADN genómico amplificado.
Pueden obtenerse mutaciones en genes vegetales endógenos MSH1 de una variedad de fuentes y mediante una variedad de técnicas. Una secuencia de sustitución homóloga que contiene una o más mutaciones de pérdida de función en el gen MSH1 y secuencias homólogas en ambos extremos de la rotura bicatenaria pueden proporcionar la recombinación de homólogos y la sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función. Tales mutaciones de pérdida de función incluyen, pero no se limitan a, inserciones, deleciones y sustituciones de secuencias dentro de un gen MSH1 que dan como resultado o bien una pérdida completa de la función MSH1 o bien una pérdida de la función MSH1 suficiente para provocar alteraciones (es decir cambios epigenéticos hereditarios y reversibles) en otros loci cromosómicos o mutaciones en otros loci cromosómicos. Las mutaciones de pérdida de función en MSH1 incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de desplazamiento de marco, inserciones de codones de parada traduccionales prematuros, deleciones de uno o más dominios funcionales que incluyen, pero no se limitan a, un dominio de unión a ADN (dominio I), uno de ATPasa (dominio V) y/o un dominio de endonucleasa de tipo GIY-YIG carboxiterminal, y similares. También se proporcionan en el presente documento mutaciones análogas a la mutación msh1 de Arabidopsis que producen mediante ingeniería genética en el gen de planta MSH1 endógeno para obtener efectos similares. Se han notificado métodos para sustituir secuencias cromosómicas endógenas mediante la reparación de roturas bicatenarias homólogas en tabaco y maíz (Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005; D’Halluin, et al., Plant Biotech. J. 6:93, 2008). También puede introducirse una secuencia msh1 de sustitución de homólogos (es decir que proporciona una mutación de pérdida de función en una secuencia MSH1) en un sitio de escisión de nucleasa seleccionado como diana mediante la unión de extremos no homólogos o una combinación de unión de extremos no homólogos y recombinación de homólogos (revisado en Puchta, J. Exp. Bot. 56, 1, 2005; Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005). En determinadas realizaciones, puede introducirse al menos una rotura bicatenaria específica del sitio en el gen endógeno MSH1 mediante una meganucleasa. La modificación genética de meganucleasas puede proporcionar meganucleasas que se cortan dentro de una secuencia de reconocimiento que coincide exactamente o está relacionada estrechamente con la secuencia diana MSH1 endógena específica (documentos WO/06097853A1, WO/06097784A1, WO/04067736A2, U.S. 20070117128A1). Por tanto, se anticipa que puede seleccionarse o diseñarse una nucleasa que se cortará dentro de una secuencia MSH1 diana. En otros aspectos dados a conocer, puede introducirse al menos una rotura bicatenaria específica del sitio en la secuencia diana MSH1 endógena con una nucleasa con dedos de cinc. También se ha dado a conocer el uso de nucleasa con dedos de cinc modificada por ingeniería genética para proporcionar la recombinación de homólogos en plantas (documentos WO 03/080809, WO 05/014791, WO 07014275, WO 08/021207). En todavía otros aspectos dados a conocer, pueden identificase mutaciones en genes MSH1 endógenos a través del uso de la tecnología TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) tal como se describe por Henikoff et al. en el que la mutagénesis química tradicional irá seguida de examen de alto rendimiento para identificar plantas que comprenden mutaciones puntuales u otras mutaciones en el gen endógeno MSH1 (Henikoff et al., Plant Physiol. 2004, 135:630-636).
En ciertos aspectos dados a conocer, la supresión de MSH1 puede efectuarse exponiendo plantas completas, o estructuras reproductivas de plantas, a condiciones de estrés que dan como resultado la supresión del gen MSH1 endógeno. Tales condiciones de estrés incluyen, pero no se limitan a, estrés por luz alta y estrés por calor. Las condiciones de estrés por luz alta a modo de ejemplo y no limitativas incluyen la exposición continua a de aproximadamente 300 a aproximadamente 1200 pmol de fotones/m2.s durante de aproximadamente 24 a aproximadamente 120 horas. Las condiciones de estrés por calor a modo de ejemplo y no limitativas incluyen la exposición continua a temperaturas de aproximadamente 32°C a aproximadamente 37°C durante de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas. También se dan a conocer condiciones de estrés por calor, luz y ambientales de otro tipo a modo de ejemplo y no limitativas que también pueden proporcionar la supresión de MSH1, para calor (Shedge et al. 2010), estrés por luz alta (Xu et al. 2011) y otras condiciones de estrés ambientales (Hruz et al. 2008).
En el presente documento también se proporcionan métodos en los que la supresión de MSH1 se efectúa en células vegetales cultivadas. En ciertos aspectos dados a conocer, la supresión de MSH1 puede efectuarse cultivando células vegetales en condiciones de estrés que dan como resultado la supresión del gen MSH1 endógeno. Tales condiciones de estrés incluyen, pero no se limitan a, estrés por luz alta. Las condiciones de estrés por luz alta a modo de ejemplo y no limitativas incluyen la exposición continua a de aproximadamente 300 a aproximadamente 1200 pmol de fotones/m2.s durante de aproximadamente 24 a aproximadamente 120 horas. Las condiciones de estrés por calor a modo de ejemplo y no limitativas incluyen la exposición continua a temperaturas de aproximadamente 32°C a aproximadamente 37°C durante de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas. También se dan a conocer condiciones de estrés por calor, luz y otras condiciones de estrés ambientales a modo de ejemplo y no limitativas que también pueden proporcionar la supresión de MSH1, para calor (Shedge et al.
2010), estrés por luz alta (Xu et al. 2011) y otras condiciones de estrés ambientales (Hruz et al. 2008). En determinadas realizaciones, la supresión de MSH1 se efectúa en células vegetales cultivadas introduciendo un ácido nucleico que proporciona tal supresión en las células vegetales. Los ácidos nucleicos que pueden usarse para proporcionar la supresión de MSH1 en células vegetales cultivadas incluyen, pero no se limitan a, transgenes que producen un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido dirigido al gen MSH1. Los ácidos nucleicos que pueden usarse para proporcionar la supresión de MSH1 en células vegetales cultivadas incluyen, pero no se limitan a, un ARN inhibidor pequeño (ARNip) o un microARN (miARN) dirigido contra el gen MSH1 endógeno. Las moléculas de ARN que proporcionan la inhibición de MSH1 pueden introducirse mediante electroporación. La introducción de ARN inhibidores en células vegetales cultivadas para inhibir genes diana puede llevarse a cabo en determinadas realizaciones tal como se da a conocer en Vanitharani et al. (Proc Natl Acad Sci U S A., 2003, 100(16):9632-6), Qi et al. (Nucleic Acids Res. 2004 Dec 15;32(22):e179), o J. Cheon et al. (Microbiol. Biotechnol. (2009), 19(8), 781-786).
La supresión de MSH1 también puede identificarse o monitorizarse fácilmente mediante métodos tradicionales en los que se observan fenotipos de plantas. Por ejemplo, la supresión de MSH1 puede identificarse o monitorizarse observando efectos organulares que incluyen variegación de las hojas, esterilidad masculina citoplasmática (CMS), un fenotipo de tasa de crecimiento reducida, fenotipo de floración retardada o sin floración, y/o susceptibilidad aumentada a patógenos. Fenotipos indicativos de supresión de MSH1 en diversas plantas se muestran en las Figuras 1, 2, y 3. Estos fenotipos que están asociados con la supresión de MSH1 se denominan en el presente documento “variación discreta” (VD). La supresión de MSH1 también puede producir cambios en el macollamiento de la planta, altura, elongación internodal y densidad estomática (denominada en el presente documento “MSH1-dr”) que pueden usarse para identificar o monitorizar la supresión de MSH1 en plantas. También pueden usarse otros rasgos bioquímicos y moleculares para identificar o monitorizar la supresión de MSH1 en plantas, supresión de MSH1. Tales rasgos moleculares pueden incluir, pero no se limitan a, cambios en la expresión de genes implicados en la regulación del ciclo celular, el catabolismo del ácido giberélico, la biosíntesis de auxina, la expresión del receptor de auxina, reguladores de floración y vernalización (es decir expresión de FLC aumentada y de SOC1 reducida), así como niveles de miR156 aumentados y de miR172 reducidos. Tales rasgos bioquímicos pueden incluir, pero no se limitan a, regulación por incremento de la mayoría de los compuestos de las rutas metabólicas de TCA, NAD y carbohidratos, regulación por disminución de biosíntesis de aminoácidos, depleción de sacarosa en ciertas plantas, aumentos en azúcares o alcoholes sacáricos en ciertas plantas, así como aumentos en ascorbato, alfatocoferoles, y flavonas sensibles al estrés, apigenina y apigenina-7-oglucósido, isovitexina, alcanferol 3-O-betaglucósido, luteolina-7-O-glucósido y vitexina. Se contempla adicionalmente que en determinadas realizaciones pueda usarse una combinación de métodos tanto moleculares, bioquímicos, como métodos tradicionales para identificar o monitorizar la supresión de MSH1 en plantas.
IV. Recuperación, autofecundación y cruce de progenie de plantas con supresión de MSH1
En el presente documento se proporcionan una variedad de métodos que proporcionan la supresión de MSH1 en una planta seguida de recuperación de plantas de progenie en las que está restaurada la función MSH1. En ciertos aspectos dados a conocer, tales plantas de progenie pueden recuperarse regulando por disminución la expresión de un transgén que inhibe MSH1 o eliminando el transgén que inhibe MSH1 con una transposasa. En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos proporcionados en el presente documento, se suprime MSH1 en una planta o célula vegetal diana y se recuperan plantas de progenie que expresan MSH1 mediante técnicas genéticas tradicionales. En un aspecto dado a conocer a modo de ejemplo y no limitativo, pueden obtenerse plantas de progenie autofecundando una planta que es heterocigótica para el transgén que proporciona segregación de MSH1. La autofecundación de tales plantas heterocigóticas (o autofecundación de plantas heterocigóticas regeneradas a partir de células vegetales) proporciona el transgén para segregar un subconjunto de la población de planta de progenie. Cuando se suprime MSH1 mediante el uso de una mutación recesiva en un gen MSH1 endógeno (es decir una planta msh1), plantas msh1/msh1 pueden, en aún otra realización a modo de ejemplo y no limitativa, cruzarse con plantas MSH1 y entonces autofecundarse para obtener plantas de progenie que son homocigóticas para un alelo MSH1 de tipo silvestre, funcional. En otros aspectos dados a conocer, se suprime MSH1 en una planta o célula vegetal diana y se recuperan plantas de progenie que expresan MSH1 mediante técnicas genéticas moleculares. Realizaciones no limitativas y a modo de ejemplo de tales técnicas genéticas moleculares incluyen: i) la regulación por disminución de un transgén que suprime MSH1 bajo el control de un promotor regulado mediante la retirada de un inductor requerido para la actividad de ese promotor o la introducción de un represor de ese promotor; o, ii) la exposición de un transgén que suprime MSH1 flanqueado por sitios de reconocimiento de transposasa a la transposasa semejante que proporciona la eliminación de ese transgén.
En ciertos aspectos dados a conocer de los métodos proporcionados en el presente documento, plantas de progenie derivadas de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 que presentan esterilidad masculina, enanismo, variegación, y/o tiempo de floración retardado y expresan MSH1 funcional se obtienen y se mantienen como líneas de cultivo independientes. Se ha encontrado que tales fenotipos parecen clasificarse, de modo que es factible seleccionar una planta estéril macho citoplasmática que presenta una tasa de crecimiento normal y no variegación, por ejemplo, o una planta fértil macho, raquítica, que está altamente variegada. Se hace referencia a este fenómeno en el presente documento como variación discreta (Vd). Una ilustración a modo de ejemplo y no limitativa de este fenómeno tal como se produce en poblaciones de plantas autofecundadas que han perdido un transgén que inhibe MSH1 mediante segregación se proporciona en la Figura 6. Se contempla adicionalmente que tales líneas individuales que presentan variación discreta (VD) puede obtenerse mediante cualquier de técnicas genéticas tradicionales mencionadas anteriormente, técnicas genéticas moleculares, o combinaciones de las mismas.
Líneas individuales obtenidas de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 que presentan variación discreta (VD) pueden cruzarse con respecto a otras plantas para obtener plantas de progenie que carecen de los fenotipos asociados con variación discreta (Vd) (es decir esterilidad masculina, enanismo, variegación y/o tiempo de floración retardado). Se ha encontrado sorprendentemente que la progenie de tales cruces puede autofecundarse para obtener líneas de progenie individuales que presentan una variación fenotípica significativa. Tal variación fenotípica que se observa en estas líneas de progenie individuales derivadas de cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 y que presentan variación discreta con respecto a otras plantas se denomina en el presente documento “variación cuantitativa” (Vq). Ciertas líneas de plantas de progenie individuales obtenidas de los cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 con respecto a otras plantas pueden presentar una variación fenotípica útil en la que uno o más rasgos están mejorados en relación con cualquier línea parental y pueden seleccionarse. La variación fenotípica útil que puede seleccionarse en tales líneas de progenie individuales incluye, pero no se limita a, aumentos en la biomasa fresca y en peso seco en relación con cualquier línea parental. Una ilustración a modo de ejemplo y no limitativa de este fenómeno tal como se produce en la progenie F2 de cruces de plantas que presentan variación discreta con respecto a plantas que no presentan variación discreta se proporciona en la Figura 6.
En ciertos aspectos dados a conocer, un cruce de una línea individual que presenta variabilidad discreta puede ser con una planta que no se ha sometido a supresión de MSH1 pero es isogénica de otro modo con la línea individual que presenta variación discreta. En ciertos aspectos a modo de ejemplo dados a conocer, una línea que presenta variación discreta se obtiene suprimiendo MSH1 en un germoplasma dado y puede cruzarse con una planta que tiene el mismo germoplasma que no se sometió a supresión de MSH1. En otros aspectos dados a conocer, un cruce de una línea individual que presenta variabilidad discreta puede ser con una planta que no se ha sometido a supresión de MSH1 pero no es isogénica con la línea individual que presenta variación discreta. Por tanto, en ciertos aspectos dados a conocer, un cruce de una línea individual que presenta variabilidad discreta también puede ser con una planta que comprende uno o más polimorfismos cromosómicos que no se producen en la línea individual que presenta variabilidad discreta, con una planta derivada de germoplasma parcial o completamente diferente, o con una planta de un grupo heterótico diferente (en casos en los que tales grupos heteróticos distintos existen). También se reconoce que un cruce de este tipo puede hacerse en cualquier dirección. Por tanto, una línea individual que presenta variabilidad discreta puede usarse o bien como donador de polen o bien como receptor de polen con respecto a una planta que no se ha sometido a supresión de MSH1 en tales cruces. En ciertos aspectos dados a conocer, la progenie del cruce se autofecunda entonces para establecer líneas individuales que pueden examinarse por separado para identificar líneas con rasgos mejorados en relación con líneas parentales. Tales líneas individuales que presentan los rasgos mejorados se seleccionan entonces y pueden propagarse mediante autofecundación adicional. Una ilustración a modo de ejemplo y no limitativa de este procedimiento en el que se obtiene la progenie F2 de cruces de plantas que presentan variación discreta con plantas que no presentan variación discreta se proporciona en la Figura 6. Tales líneas de progenie F2 se examinan para determinas las mejoras de rasgo deseadas en relación con las plantas parentales y se seleccionan líneas que presentan tales mejoras.
V. Comparación y selección de loci cromosómicos alterados en plantas que pueden conferir un rasgo útil
También pueden identificarse y seleccionarse loci cromosómicos alterados que pueden conferir rasgos útiles realizando análisis comparativos apropiados de plantas de referencia que no presentan los rasgos útiles y plantas de prueba obtenidas a partir de una planta o célula vegetal parental que se habían sometido a supresión de MSH1 y obtener o bien los loci alterados o bien plantas que comprenden los loci alterados. Se anticipa que puede usarse una variedad de plantas de referencia y plantas de prueba en tales comparaciones y selecciones. En ciertos aspectos dados a conocer, las plantas de referencia que no presentan el rasgo útil incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de: a) una planta de tipo silvestre; b) una subpoblación distinta de plantas dentro de una población F2 de plantas dada de una línea de planta dada (en la que la población F2 es cualquier tipo o variedad de planta aplicable obtenido de la manera mostrada en la Figura 6); c) una población F1 que presenta un fenotipo de tipo silvestre (en la que la población F1 es cualquier tipo o variedad de planta aplicable obtenido de la manera mostrada en la Figura 6); y/o, d) una planta que es isogénica con las plantas parentales o células parentales de las plantas de prueba antes de la supresión de MSH1 en aquellas plantas parentales o células vegetales (es decir la planta de referencia es isogénica con las plantas o células vegetales que se sometieron posteriormente a supresión de MSH1 para obtener las plantas de prueba). En ciertos aspectos dados a conocer, las plantas de prueba que presentan el rasgo útil incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de: a) cualquier segregante no transgénico que presente el rasgo útil y que se derive de plantas o células vegetales parentales que se habían sometido una supresión de MSH1 mediada por transgén, b) una subpoblación distinta de plantas dentro de una población F2 de plantas dada de una línea de planta dada que presentan el rasgo útil (en la que la población F2 es cualquier tipo o variedad de planta aplicable obtenido de la manera mostrada en la Figura 6); (c) cualquier planta de progenie obtenida de las plantas de (a) o (b) que presentan el rasgo útil; o d) una planta o célula vegetal que se había sometido a supresión de MSH1 que presentan el rasgo útil.
En general, un objetivo de estas comparaciones es identificar diferencias en los perfiles de ARN pequeños y/o la metilación de ciertos loci cromosómicos de ADN entre plantas de prueba que presentan los rasgos útiles y plantas de referencia que no presentan los rasgos útiles. Los loci alterados así identificados pueden entonces aislarse o seleccionarse en plantas para obtener plantas que presentan los rasgos útiles.
En ciertos aspectos dados a conocer, pueden identificarse loci cromosómicos alterados identificando ARN pequeños que están regulados por incremento o por disminución en las plantas de prueba (en comparación con plantas de referencia). Este método se basa en parte en la identificación de loci cromosómicos alterados en los que ARN interferentes pequeños dirigen la metilación de dianas génicas específicas mediante metilación de ADN dirigida por ARN (RdDM). El proceso de metilación de ADN dirigida por ARN (RdDM) se ha descrito (Chinnusamy V et al. Sci China Ser C-Life Sci. (2009) 52(4): 331-343). Puede usarse cualquier plataforma de tecnología aplicable para comparar ARN pequeños en las plantas de prueba y de referencia, que incluyen, pero no se limitan a, métodos a base de micromatriz (Franco-Zorilla et al. Plant J. 2009 59(5):840-50), métodos a base de secuenciación profunda (Wang et al. The Plant Cell 21:1053-1069 (2009)), y similares.
En ciertos aspectos dados a conocer, pueden identificarse loci cromosómicos alterados identificando proteínas histona asociadas con un locus y que están metiladas o aciladas en las plantas de prueba (en comparación con plantas de referencia). El análisis de loci cromosómicos asociados con histonas metiladas o aciladas puede llevarse a cabo enriqueciendo y secuenciando aquellos loci usando anticuerpos que reconocen histonas metiladas o aciladas. La identificación de regiones cromosómicas asociadas con la metilación o acetilación de residuos lisina específicos de histona H3 usando anticuerpos específicos para H3K4me3, H3K9ac, H3K27me3 y H3K36me3 se ha descrito (Li et al., Plant Cell 20:259-276, 2008; Wang et al. The Plant Cell 21:1053-1069 (2009).
En ciertos aspectos dados a conocer, pueden identificarse loci cromosómicos alterados identificando regiones cromosómicas (ADN genómico) que tienen un estado de metilación alterado en las plantas de prueba (en comparación con plantas de referencia). Un estado de metilación alterado puede comprender o bien la presencia o bien la ausencia de metilación en uno o más loci cromosómicos de una planta de prueba en comparación con una planta de referencia. Puede usarse cualquier plataforma de tecnología aplicable para comparar el estado de metilación de loci cromosómicos en las plantas de prueba y de referencia. Las tecnologías aplicables para identificar loci cromosómicos con cambios en su estado de metilación incluyen, pero no se limitan a, métodos basados en la inmunoprecipitación de ADN con anticuerpos que reconocen 5-metilcitidina, métodos basados en el uso de endonucleasas de restricción dependientes de metilación y PCR tal como métodos de McrBC-PCR (Rabinowicz, et al. Genome Res. 13: 2658-2664 2003; Li et al., Plant Cell 20:259-276, 2008), la secuenciación de AdN convertido por bisulfito (Frommer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (5): 1827-31; Tost et al. BioTechniques 35 (1): 152-156, 2003), análisis de PCR específico de metilación de ADN tratado con bisulfito (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18): 9821 -6, 1996), métodos a base de secuenciación profunda (Wang et al. The Plant Cell 21:1053-1069 (2009)), extensión de cebador de nucleótido simple sensible a la metilación (MsSnuPE; Gonzalgo y Jones Nucleic Acids Res. 25 (12): 2529-2531, 1997), espectroscopía de correlación de fluorescencia (Umezu et al. Anal Biochem.
415(2):145-50, 2011), métodos de secuenciación en tiempo real de moléculas simples (Flusberg et al. Nature Methods 7, 461-465), análisis de fusión de alta resolución (Wojdacz y Dobrovic (2007) Nucleic Acids Res. 35 (6): e41), y similares.
VI. introducción de una modificación cromosómica asociada con un rasgo útil en una planta
También se proporcionan en el presente documento métodos para introducir diversas modificaciones cromosómicas que pueden conferir un rasgo útil a una planta, así como las plantas, partes de plantas, y productos de esas partes de plantas. Pueden identificarse alteraciones cromosómicas y/o mutaciones cromosómicas inducidas mediante la supresión de MSH1 tal como se describe en el presente documento. Una vez identificadas, las modificaciones cromosómicas que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones cromosómicas, mutaciones cromosómicas, o transgenes que proporcionan el mismo efecto genético que las alteraciones cromosómicas y/o mutaciones cromosómicas inducidas mediante la supresión de MSH1 pueden introducirse en plantas huésped para obtener plantas que presentan el rasgo deseado. En este contexto, el “mismo efecto genético” significa que la modificación cromosómica introducida proporciona un aumento y/o una reducción en la expresión de uno o más genes vegetales endógenos que es similar al observado en una planta que se ha sometido a supresión de MSH1 y presenta el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer en los que un gen endógeno está metilado en una planta sometida a supresión de MSH1 y presenta tanto una expresión reducida de ese gen como un rasgo útil, se proporcionan modificaciones cromosómicas en otras plantas que también dan como resultado una expresión reducida de ese gen y el rasgo útil. En ciertos aspectos dados a conocer en los que un gen endógeno está desmetilado en una planta sometida a supresión de MSH1 y presenta tanto expresión aumentada de ese gen como un rasgo útil, se proporcionan modificaciones cromosómicas en otras plantas que también dan como resultado la expresión aumentada de ese gen y ese rasgo útil.
En ciertos aspectos dados a conocer, la modificación cromosómica que se introduce es una alteración cromosómica. Pueden introducirse alteraciones cromosómicas que incluyen, pero no se limitan a, una diferencia en un estado de metilación cruzando una planta que comprende la alteración cromosómica con una planta que carece de la alteración cromosómica y seleccionando para determinar la presencia de la alteración en F1, F2, o cualquier planta de progenie de generación posterior del cruce. En todavía otras realizaciones, las alteraciones cromosómicas en genes diana específicos pueden introducirse mediante la expresión de un ARNip o ARN en horquilla dirigido como diana a ese gen mediante metilación de ADN dirigida por ARN (Chinnusamy V et al. Sci China Ser C-Life Sci. (2009) 52(4): 331-343; Cigan et al. Plant J 43929-940, 2005; Heilersig et al. (2006) Mol Genet Genomics 275437-449; Miki y Shimamoto, Plant Journal 56(4):539-49; Okano et al. Plant Journal 53(1):65-77, 2008).
En determinadas realizaciones, la modificación cromosómica es una mutación cromosómica. Las mutaciones cromosómicas que proporcionan reducciones o aumentos en la expresión de un gen endógeno de un locus cromosómico pueden incluir, pero no se limitan a, inserciones, deleciones y/o sustituciones de secuencias de nucleótidos en un gen. Las mutaciones cromosómicas pueden dar como resultado una expresión reducida de un gen mediante una variedad de mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de codones de cambio de sentido, mutaciones de desplazamiento de marco, codones de parada traduccionales prematuros, deleciones de promotor, mutaciones que alteran el procesamiento de ARNm, y similares. Las mutaciones cromosómicas que dan como resultado una expresión aumentada de un gen incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de promotor, la eliminación de elementos reguladores negativos del gen, y similares. Las mutaciones cromosómicas pueden introducirse en loci específicos de una planta mediante cualquier método aplicable. Los métodos aplicables para introducir mutaciones cromosómicas en loci cromosómicos de planta endógenos incluyen, pero no se limitan a, la reparación de la rotura bicatenaria homóloga (Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005; D’Halluin, et al., Plant Biotech. J.
6:93, 2008), la unión de extremos no homólogos o una combinación de unión de extremos no homólogos y recombinación de homólogos (revisado en Puchta, J. Exp. Bot. 56, 1, 2005; Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005), la reparación de la rotura bicatenaria específica del sitio inducida por meganucleasa (documentos WO/06097853A1, WO/06097784A1, WO/04067736A2, U.S. 20070117128A1), y recombinación de homólogos mediada por nucleasa con dedos de cinc (documentos w O 03/080809, WO 05/014791, WO 07014275, WO 08/021207). En todavía otros aspectos dados a conocer, pueden identificarse mutaciones deseadas en loci cromosómicos de planta endógenos a través del uso de la tecnología TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) tal como se describe (Henikoff et al., Plant Physiol. 2004, 135:630-636).
En otras realizaciones, las modificaciones cromosómicas que proporcionan el efecto genético deseado pueden comprender un transgén. Los transgenes que pueden dar como resultado la expresión reducida de un gen mediante una variedad de mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, mutantes negativos dominantes, un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido y similares. Las patentes estadounidenses que describen la supresión de genes vegetales endógenos mediante transgenes incluyen US 7.109.393, US 5.231.020 y US 5.283.184 (métodos de cosupresión); y US 5.107.065 y US 5.759.829 (métodos antisentido). En ciertos aspectos dados a conocer, pueden usarse transgenes diseñados específicamente para producir moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) con homología con el gen endógeno de un locus cromosómico para reducir la expresión de ese gen endógeno. En tales aspectos dados a conocer, las secuencias de hebra sentido del ARNbc pueden separarse de las secuencias antisentido mediante una secuencia espaciadora, preferiblemente una que promueve la formación de una molécula de ARNbc (ARN bicatenario). Los ejemplos de tales secuencias espaciadoras incluyen, pero no se limitan a, aquellas expuestas en Wesley et al., Plant J., 27(6):581-90 (2001), y Hamilton et al., Plant J., 15:737-746 (1998). Vectores para inhibir genes vegetales endógenos con la expresión medida por transgén de ARN de horquilla se dan a conocer en las solicitudes de patente estadounidense n.os 20050164394, 20050160490 y 20040231016, cada una de las cuales se incorpora mediante referencia en su totalidad al presente documento.
Los transgenes que dan como resultado la expresión aumentada de un gen de un locus cromosómico incluyen, pero no se limitan a, un gen recombinante fusionado con promotores heterólogos que son más fuertes que el promotor nativo, un gen recombinante que comprende elementos tales como intrones heterólogos, regiones sin traducir en 5’, regiones sin traducir en 3’ que proporcionan expresión aumentada, y combinaciones de los mismos. Tal promotor, intrón, regiones sin traducir en 5’, regiones sin traducir en 3’, y cualquier región de poliadenilación necesaria pueden unirse operativamente al ADN de interés en moléculas de ADN recombinante que comprenden partes de transgenes útiles para hacer modificaciones cromosómicas tal como se proporciona en el presente documento.
Los promotores a modo de ejemplo útiles para la expresión de transgenes incluyen, pero no se limitan a, versiones potenciadas o duplicadas de los viral CaMV35S y FMV35S transgenes útiles (patente estadounidense n o 5.378.619, incorporada mediante referencia en su totalidad al presente documento), promotores 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor Actl de arroz y el promotor 35S del virus del mosaico de la celidonia (FMV) (patente estadounidense n.° 5.463.175; incorporada mediante referencia en su totalidad al presente documento). Los intrones a modo de ejemplo útiles para la expresión de transgenes incluyen, pero no se limitan a, el intrón hsp70 de maíz (patente estadounidense n.° 5.424.412), el intrón Actl de arroz (McElroy et al., 1990, The Plant Cell, Vol. 2, 163-171), el intrón CAT-1 (Cazzonnelli y Velten, Plant Molecular Biology Reporter 21: 271-280, septiembre de 2003), el intrón pKANNIBAL (Wesley et al., Plant J. 2001 27(6):581-90; Collier et al., 2005, Plant J 43: 449-457), el intrón PIV2 (Mankin et al. (1997) Plant Mol. Biol. Rep. 15(2): 186-196) y el intrón “super-ubiquitina” (patente estadounidense n.° 6.596.925; Collier et al., 2005, Plant J 43: 449-457). Las secuencias de poliadenilación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el gen de nopalina sintasa (NOS) de plástico inducido por tumor (Ti) de Agrobacterium y las secuencias de poliadenilación del ssRUBISCO E9 de guisante.
VII. Examen y selección de progenie cruzada de plantas en las que se ha suprimido MSH1 o plantas que comprenden loci cromosómicos modificados que presentan rasgos mejorados o útiles
Las líneas de plantas obtenidas mediante los métodos proporcionados en el presente documento pueden examinarse y seleccionarse para una variedad de rasgos útiles usando una amplia variedad de técnicas. En realizaciones particulares proporcionados en el presente documento, líneas de plantas de progenie individuales obtenidas de los cruces de plantas en las que se suprimió la expresión de MSH1 con respecto a otras plantas se examinan y se seleccionan para los rasgos útiles deseados.
En determinadas realizaciones, el rasgo examinado y seleccionado es el rendimiento vegetal mejorado. En determinadas realizaciones, tales mejoras de rendimiento son mejoras en el rendimiento de una línea de planta en relación con una o más línea(s) parental(es) en condiciones de no estrés. Las condiciones de no estrés comprenden condiciones en las que el agua, la temperatura, los nutrientes, los minerales y la luz caen dentro de intervalos típicos para el cultivo de la especie vegetal. Tales intervalos típicos para el cultivo comprenden cantidades o valores de agua, temperatura, nutrientes, minerales y/o luz que no son insuficientes ni excesivos. En determinadas realizaciones, tales mejoras de rendimiento son mejoras en el rendimiento de una línea de planta en relación con la(s) línea(s) parental(es) en condiciones de estrés abiótico. Tales condiciones de estrés abiótico incluyen, pero no se limitan a, condiciones en las que el agua, la temperatura, los nutrientes, los minerales y/o la luz no son insuficientes ni excesivos. Por tanto, las condiciones estrés abiótico incluyen, pero no se limitan a, estrés por sequía, estrés osmótico, estrés por nitrógeno, estrés por fósforo, estrés por minerales, estrés por calor, estrés por frío y/o estrés por luz. En este contexto, el estrés por minerales incluye, pero no se limita a, estrés debido a potasio, calcio, magnesio, hierro, manganeso, cobre, cinc, boro, aluminio o silicio insuficiente o excesivo. En este contexto, el estrés por minerales incluye, pero no se limita a, estrés debido a cantidades excesivas de metales pesados que incluyen, pero no se limitan a, cadmio, cobre, níquel, cinc, plomo y cromo.
Pueden identificarse mejoras en el rendimiento en líneas de plantas obtenidas mediante los métodos proporcionados en el presente documento mediante mediciones directas de biomasa húmeda o seca que incluye, pero no se limita a, grano, pelusa, hojas, tallos o simiente. También pueden evaluarse las mejoras en el rendimiento midiendo el rendimiento de rasgos relacionados que incluyen, pero no se limitan a, el peso de 100 simientes, un índice de recogida y el peso de la simiente. En determinadas realizaciones, tales mejoras del rendimiento son mejoras en el rendimiento de una línea de planta en relación con una o más línea(s) parental(es) y pueden determinarse fácilmente haciendo crecer líneas de plantas obtenidas mediante los métodos proporcionados en el presente documento en paralelo con las plantas parentales. En determinadas realizaciones, pueden emplearse ensayos de campo para determinar diferencias en el rendimiento, en los que se replican, aleatorizan y controlar gráficos de plantas de prueba y control para determinar la variación (Giesbrecht FG y Gumpertz ML. 2004. Planning, Construction, and Statistical Analysis of Comparative Experiments. Wiley. Nueva York; Mead, R. 1997. Design of plant breeding trials. En Statistical Methods for Plant Variety Evaluation. eds. Kempton y Fox. Chapman y Hall. Londres). Los métodos para espaciar las plantas de prueba (es decir plantas obtenidas con los métodos de esta invención) con plantas de comprobación (parentales u otros controles) para obtener datos de rendimiento adecuados para comparaciones se proporcionan en referencias que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de Cullis, B. et al. J. Agric. Biol. Env. Stat.11:381 -393; y Besag, J. y Kempton, rA. 1986. Biometrics 42: 231 -251.).
En determinadas realizaciones, el rasgo examinado y seleccionado es la resistencia mejorada a estrés vegetal biótico en relación con las líneas parentales. El estrés vegetal biótico incluye, pero no se limita a, estrés impuesto mediante patógenos fúngicos de plantas, patógenos bacterianos de plantas, patógenos virales de plantas, insectos, nematodos y herbívoros. En determinadas realizaciones, se proporciona un examen y una selección de líneas de plantas que presentan resistencia a patógenos fúngicos que incluyen, pero no se limitan a, Alternaría sp., Ascochyta sp., Botrytís sp.; Cercospora sp., Colletotríchum sp., Díaporthe sp., Díplodía sp., Erysíphe sp., Fusaríum sp., Gaeumanomyces sp., Helmínthosporíum sp., Macrophomína sp., Nectria sp., Peronospora sp., Phakopsora sp., Phíalophora sp., Phoma sp., Phymatotrichum sp., Phytophthora sp., Plasmopara sp., Puccinia sp., Podosphaera sp., Pyrenophora sp., Piricularia sp, Pythium sp., Rhizoctonia sp., Scerotium sp., Sclerotinia sp., Septoria sp., Thielaviopsis sp., Uncinula sp, Venturia sp. y Verticillium sp. En determinadas realizaciones, se proporciona un examen y una selección de líneas de plantas que presentan resistencia a patógenos bacterianos que incluyen, pero no se limitan a, Erwinia sp., Pseudomonas sp. y Xanthamonas sp. En determinadas realizaciones, se proporciona un examen y una selección de líneas de plantas que presentan resistencia a insectos que incluyen, pero no se limitan a, pulgones y otros insectos perforadores/succionadores tales como Lygus sp., insectos lepidópteros tales como Armigera sp., Helicoverpa sp., Heliothis sp. y Pseudoplusia sp., e insectos coleópteros tales como Diabroticus sp. En determinadas realizaciones, se proporciona una examen y una selección de líneas de plantas que presentan resistencia a nematodos que incluyen, pero no se limitan a, Meloidogyne sp., Heterodera sp., Belonolaimus sp., Ditylenchus sp., Globodera sp., Naccobbus sp. y Xiphinema sp.
Otros rasgos útiles que pueden obtenerse mediante los métodos proporcionados en el presente documento incluyen diversos rasgos de calidad de simiente que incluyen, pero no se limitan a, mejoras en cualquiera de las composiciones o cantidades de aceite, proteína o almidón en la simiente. Todavía otros rasgos útiles que pueden obtenerse mediante los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, biomasa aumentada, ausencia de floración, esterilidad masculina, digestabilidad, periodo de llenado de simiente, madurez (ya sea antes o después, según se desee), encamado reducido y altura de planta (ya sea aumentada o reducida según se desee).
Además de cualquiera de los rasgos mencionados anteriormente, los rasgos particularmente útiles para sorgo que pueden obtenerse mediante los métodos proporcionados en el presente documento también incluyen, pero no se limitan a: i) rasgos agronómicos (tiempo de floración, días hasta la floración, días hasta la floración tras lluvia, días hasta la floración con lluvia; ii) resistencia a enfermedad fúngica (resistencia al mildiú de sorgo - invernadero, campo de resistencia al mildiú de sorgo, molde de grano de sorgo, resistencia al chanco de hojas de sorgo, resistencia a la roya del sorgo; iii) rasgo relacionado con el grano: (peso seco de grano, número de granos, número de granos por metro cuadrado, peso de grano con respecto a la panícula, color de simiente, lustre de simiente, tamaño de simiente); iv) rasgos relacionados con la fase de crecimiento y de desarrollo (número de arados basales, días hasta la recogida, días hasta la madurez, macollamiento nodal, altura de planta, altura de planta tras la lluvia); v) rasgo de morfología y anatomía de inflorescencia (capacidad de desgranado); vi) resistencia al daño por insectos (resistencia a la mosca de los brotes de sorgo tras la lluvia, resistencia a la mosca de los brotes de sorgo durante la lluvia, resistencia a barrenadores del tallo de sorgo); vii) rasgos relacionados con las hojas (color de hoja, color de nervio central de la hoja, color de la vena de la hoja, peso de hoja bandera, peso de la hoja, peso del resto de hojas); viii) rasgos relacionados con el contenido en mineral e iones (contenido de potasio en los brotes, contenido de sodio en los brotes); ix) rasgos relacionados con la panícula (número de panículas, compacidad y forma de la panícula, esfuerzo de panícula, índice de recogida de panícula, longitud de panícula, peso de panícula, peso de panícula sin grano, anchura de panícula); x) contenido en compuesto fitoquímico (pigmentación vegetal); xii) rasgos de morfología y de anatomía en espiguilla (color de gluma, cobertura de gluma); xiii) rasgo relacionado con el tallo (peso de tallo con respecto a hoja, peso de tallo); y xiv) rasgos misceláneos (rasgos relacionados con el rastrojo, energía metabolizada, capacidad de digestión de nitrógeno, digestibilidad de materia orgánica, rastrojo por peso).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberán apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberán apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y todavía obtenerse un resultado idéntico o similar sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.
Ejemplo 1. Construcción de plantas transgénicas que proporcionan supresión de MSH1
Se construyó un vector que proporciona la supresión de MSH1 en tomate y tabaco tal como sigue. Se derivó un segmento que codifica para aminoácidos 651-870 de la proteína MSH1 de una secuencia EST de tomate (SEQ ID NO:5) usando las secuencias cebadoras TOM-CD1F (5_-CGCAGGTATCACGAGGCAAGTGCTAAGG-3; SEQ ID NO:11) y TOM-CD1R (5_-ATCCCCAAACAGCCAATTTCGTCCAGGATCCCCAAACAGCCAATTTCGTCCAGG-3; SEQ ID NO:12) y se clonó en orientación directa e inversa, separado por una secuencia de intrón. El vector de base, pUCRNAi-intrón, alberga el segundo intrón de la riboproteína nuclear pequeña de Arabidopsis (At4g02840; SEQ ID NO: 13). El promotor CaMV35S y el terminador de la transcripción regulan la expresión de la construcción y el gen indicador de neomicina fosfotransferasa II (npíII), y el inserto está flanqueado por secuencias de integración de borde izquierdo y borde derecho. Se usó la cepa C58C1/pMP90 (28) de Agrobacterium tumefaciens para su transformación en tabaco (Horsch RB, et al. (1985) Science 227:1229-1231) y tomate (McCormick et al. 1986) Plant Cell Rep 5:81-84).
Se derivaron líneas de ARNi de mijo y sorgo mediante procedimientos y materiales similares, llevándose a cabo transformaciones y regeneración de plantas según los procedimientos de Howe et al. (Plant Cell Rep 25:784-91, 2006). El vector de ARNi para el mijo se dirigió contra el gen MSH1 de mijo, mientras que el vector de ARNi para sorgo se dirigió contra el gen del sorgo MSH1 (SEQ ID NO: 6). Se amplificaron segmentos que codifican para 157 aminoácidos del extremo C-terminal de MSH1 a partir de ADNc total de mijo perla y sorgo usando cebadores: zmmsf8 (5'-GGTTGAGGAGCCTGAATCTCTGAAGAAC-3'; SEQ ID NO:15) y zm-msr8 (5'-CTCGCCAGAGATTCGAGATATACCGAAG-3'; SEQ ID NO:16). Se clonaron productos de PCR en orientación directa e inversa, separados por una secuencia de intrón. El vector de base, pUCRNAi-intrón, que alberga el segundo intrón de la riboproteína nuclear pequeña de Arabidopsis (At4g02840; SEQ ID NO: 13), se proporcionó por H. Cerutti (University of Nebraska, Lincoln, NE). El vector pPTN290, un derivado de pPZP212 (Hajdukiewicz et al.
1994, Plant Mol Biol.; 25(6):989-94), se usó para introducir los casetes Mshl-ARNi bajo el control del promotor 1 de ubiquitina de maíz acoplado con su primer intrón, y se transcripción se termina mediante el terminador CaMV 35S. El promotor CaMV 35S y el terminador regulan la expresión del gen indicador de neomicina fosfotransferasa II (nptII), y el inserto está flanqueado por secuencias de integración de borde derecho y borde izquierdo. La cepa NTL4 de Agrobacterium tumefaciens (Luo Z-Q et al., 2001, Mol Plant Microbe Interact., 14(1 ):98-103) se usó para inocular embriones de líneas Tift23 DBE1 de mantenimiento de mijo perla y líneas Tx430 de sorgo. Los procedimientos de transformación detallados usados para mijo perla son los mismos que para el sorgo (Howe et al., 2006, Plant Cell Rep 25:784-91).
Ejemplo 2. Efecto fenotípicos de la supresión de MSH1
La expresión de MSH1 suprimida de manera transgénica mediante el uso de ARNi en cinco especies vegetales: soja (Glycine max (L.) Merr), tomate (Solanum lycopersicum L), tabaco (Nicotiana tabacum L.), mijo (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) y sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench). En cada caso se observaron cambios similares, incluyendo esterilidad masculina citoplasmática, evidencia de variegación y desarrollo de cloroplastos alterado, tasa de crecimiento reducida y enanismo, tiempo de floración alterado o ausencia de floración, ramificación potenciada, biosíntesis de flavonoides reducida y ausencia de antocianinas, susceptibilidad a patógenos potenciada, y morfologías de hoja alteradas (véase la Figura 1). También se observan variegación, enanismo y reorganizaciones de ADN mitocondrial en diversas plantas sometidas a supresión de MSH1 tal como se muestra en las Figuras 2, 3 y 4, respectivamente. Fisiológicamente, las plantas muestran niveles de ATP reducidos y de ROS potenciados, motilidad mitocondrial reducida, mitofagia potenciada, expresión de rutas de respuesta al estrés, y metabolismo de GA y citoquinina (data de ROS en la Figura 5).
Las similitudes fenotípicas notables entre especies vegetales indican que muchos de los cambios asociados a msh1 son respuestas programadas. Análisis de transcritos y metabólicos han identificado varias rutas asociadas con los fenotipos emergentes (tabla 1). Experimentos de perfilado de transcritos de Sorghum y Arabidopsis muestran una expresión reducida de genes del ciclo celular, una expresión del gen de floración alterada (FLC) y un catabolismo de GA potenciado (GA20-ox2 y GA20-ox6) en los fenotipos de crecimiento reducido. Se restaura la tasa de crecimiento y la inducción de floración en las plantas con la aplicación de ácido giberélico.
Tabla 1. Resultados del perfilado de transcrito/metabólico de muestras en Arabidopsis que muestran correspondencia en los cambios de ruta.
Perfilado de transcrito Perfilado metabólico
A. Respuesta al estrés oxidativo/redox
AGI Gen msh1* Metabolito Col-0 msh1 AT3G22370 AOX1A 2,2 Glutatiónf 22.520 33.322 AT5G20230 ATBCB 10,9 Ascorbatof 289.996 460.261 AT2G21640 Respuesta al estrés 2,9 fosfato 12,3 M 32,1 M oxidativo
AT4G20830 Proteína de dominio de 2,6
unión a FAD
B. Genes de fotosíntesis
AT5G66570 PSBO-1 -1,3 Sacarosaf 26.969,4 N.D. AT3G50820 PSBO-2 -1,4 Rafinosaf 49.427,8 N.D. AT4G02770 PSAD-1 -1,6
AT2G30790 PSBP-2 -2
C. Respuestas de GA
AT1G30040 ATGA20X2 (catabolismo 1,7 GA53 11 ng/g N.D de GA) DW
AT1G02400 ATGA20X6 (catabolismo 9,3 GA19 7 ng/g N.D de GA) DW
AT2G14900 Proteína regulada por GA -3,3
* Cambio en veces de los niveles en mshl en relación con Col-0, f los valores son recuentos de área sin procesar normalizados de análisis de espectrómetro de masas, N.D. no detectable___________________________________
Se muestra un conjunto de datos limitado. El sombreado indica regulación por disminución en m shl.
Ejemplo 3. Análisis genético de líneas de sorgo Tx430 tras la exposición a y pérdida del transgén de ARNi de MSH1 mediante segregación
Se obtuvo una planta de sorgo TX430 no transgénica, con mucho enanismo, con floración retardada y variegada de una población de segregación de plantas de progenie de una planta de sorgo Tx430 parental que era heterocigótica para un transgén que inhibe la expresión de MSH1 mediante interferencia de ARN (ARNi). Tx430 era el genotipo original usado para obtener la planta de sorgo transgénica que comprende el transgén que inhibe la expresión de MSH1. El cruce de esta planta de sorgo TX430 no transgénica, con mucho enanismo, con floración retardada y variegada mediante el tipo silvestre TX430 isogénico como planta polinífera parental, produjo un fenotipo F1 de tipo silvestre que no mostró ninguna evidencia del enanismo original, retardo en la floración o fenotipos de variegación (Figura 6). Esto era un resultado sorprendente, dado que se había asumido que los cambios inducidos por ARNi eran organulares, y se anticipó la transmisión materna de los fenotipos. La introducción del genoma de tipo silvestre neutralizó los efectos inducidos por ARNi originales. La población F2, derivada mediante autopolinización de estas plantas F1, produjo una distribución amplia de variación fenotípica, denominada variación cuantitativa (VQ), parte de la cual se describe en la Tabla 2. Se usó SAS PROC MIXED para todos los análisis en la Tabla 2. Cada rasgo se analizó con el efecto fijado de línea en el modelo y se asumieron varianzas heterogéneas entre las líneas y se estimaron, junto con errores estándar de las estimaciones. Se realizó una prueba de chi-cuadrado del modelo de varianza heterogénea frente al modelo de varianza homogénea. Un valor de chi-cuadrado significativo indica diferencias estadísticamente significativas entre las varianzas de línea. Aunque una pequeña proporción (aproximadamente 1/50 plantas) muestra el fenotipo de enanismo, variegado, y aproximadamente el 50% muestra esterilidad masculina citoplasmática como lesión genética mitocondrial probable (Hanson y Bentolila, 2004), una gran proporción de la población muestra una variación cuantitativa significativa en biomasa fresca por encima del suelo y en peso seco, peso de panícula, y otras características agronómicas útiles. Resulta particularmente intrigante en estos datos la capacidad observada dentro de la población para superar a sus padres para varios rasgos. El intervalo de diversidad no puede explicarse de manera razonable mediante variación genética nuclear, dado que el cruce original es TX430 x TX430 (hecho en invernadero con panículas embolsadas).
Tabla 2. Evaluación de la variación fenotí ica en sor o
Figure imgf000021_0001
1) N = número de observaciones en una línea
2) La prueba del chi-cuadrado es un prueba para diferencias entre varianzas de línea
3) La varianza inusualmente alta es la consecuencia de un tamaño de muestra pequeño para este rasgo.
Ejemplo 4. Análisis de progenie F3 MSH1/MSH1 F3 de Arabidopsis de un cruce msh1/msh1 xMSH1/MSH1
En estos experimentos, se eliminó la mutación msh1 recesiva mediante segregación. El padre de ecotipo Columbia msh1/msh1 recesivo se clonó en primer lugar con plantas de ecotipo Columbia de tipo silvestre como donador de polen (Col-0 msh1 x Col-0wt) para obtener una población F1 de plantas msh1/MSH1. La progenie F1 se autofecundó para obtener una población F2 que se segrega para el locus msh1. Se seleccionó la progenie F2 de MSH1/MSH1 de la población F2 y se autofecundó para obtener la progenie F3 de MSH1/MSH1 del padre F2 MSH1/MSH1 seleccionado.
Para evaluar la variación fenotípica en las líneas de Arabidopsis MSH1/MSH1 F3 seleccionadas, se promediaron mediciones de cuatro plantas cada una de la línea de progenie F3 Col-0 de tipo silvestre y la seleccionada tal como se muestra en la Tabla 3. La biomasa fresca era tejido de hojas por encima del suelo total, el diámetro de base era el diámetro de la zona de transición raíz-tallo, y el diámetro del tallo era el diámetro del tallo floral. Cada parámetro mostró un aumento del 20-24% en la línea F3 de progenie seleccionada, incluso aunque la progenie de las dos poblaciones de plantas (es decir Col-O y MSH1/MSH1 F3) deba ser genéticamente idéntica. Se seleccionaron plantas de cada grupo para representar la misma fase de desarrollo y el mismo número de hojas (promedio de 48 hojas por planta en cada grupo). Los datos de la Tabla 3 y las plantas mostradas en la Figura 7 representan una población F3 seleccionada. Otras poblaciones F3 seleccionadas (no mostradas) demostraron un crecimiento promedio mostrado uniformemente en relación con el tipo silvestre.
Un cruce de progenie F3 de MSH1/MSH1 F3 derivada del cruce Col-0 msh1 x Col-0wt mostró un crecimiento marcadamente potenciado tal como se muestra en la Figura 7 y la Tabla 3. Tal crecimiento potenciado marcado se asemeja a un vigor híbrido porque la progenie F3 del cruce presenta un crecimiento aumentado en relación con el germoplasmo parental de Col-O. Sin embargo, estos experimentos pueden distinguirse de casos en los que se obtiene vigor híbrido cruzando las líneas parentales de dos antecedentes genético heteróticos distintos dado que las dos líneas parentales usadas en este caso tenían ambas antecedentes genéticos de ecotipo Columbia y diferían solo en presencia de la mutación msh1 recesiva en uno de los padres de ecotipo Columbia.
Tabla 3. Evaluación de la variación fenotí ica en Arabido sis.
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 5. Variación de la altura de la planta, el peso de la panícula y el rendimiento de grano en plantas de sorgo individuales en una población F2 obtenida de un cruce con sorgo en el que se ha suprimido MSH1
Se sometieron a ensayo poblaciones F2 de plantas de sorgo derivadas de plantas de sorgo Tx430 parentales que se habían sometido a supresión de MSH1 tal como se describe en la Figura 6 y el Ejemplo 3 para la variación en altura de planta (Figura 8), el peso de panícula (Figura 9) y el rendimiento de grano (Figura 10) comparando los valores para plantas individual en la población.
Se observó una variación significativa entre plantas individuales dentro de la población F2. Más específicamente, ciertas líneas de sorgo presentaron distribuciones bifásicas distintivas de plantas dentro de las poblaciones F2 con respecto a estos rasgos. Por ejemplo, la población F2 de la línea de sorgo GAII-11 presentó una subpoblación de plantas con una altura de planta entre aproximadamente 105 y 125 cM y otra subpoblación de plantas con una altura de planta de entre aproximadamente 185 y 215 cM. Estas subpoblaciones se representaron mediante “picos” en el gráfico de la Figura 8. También se observaron distribuciones de subpoblaciones similares para las líneas de sorgo GAII-15, GAII-28 y GAII-24 en el gráfico de la Figura 8. Para las poblaciones F2 de GAII-11, GAII-15, GAII-28 y GAII-24, un conjunto de subpoblaciones o bien se solapó o bien tenía un valor menor que el de las alturas de planta del control TA430 de tipo silvestre, mientras que otra subpoblación tenía un valor que era claramente mayor que el de las plantas control PA430 de tipo silvestre (Figura 8). Subpoblaciones y/o plantas individuales en las poblaciones F2 de GAII-11, GAII-15, GAII-28 y GAII-24 también presentaron pesos de panícula y rendimientos de grano que o bien se solapaban o bien tenían un valor menor que el de las alturas de planta del control TA430 de tipo silvestre, mientras que otras subpoblaciones o plantas tenían un valor que era claramente mayor que el de las plantas control PA430 de tipo silvestre (Figuras 9 y 10).
Se concluye que se observan diferencias en altura de planta, peso de panícula y rendimiento de grano de sorgo entre: a) distintas subpoblaciones de plantas dentro de una población F2 dada de plantas de sorgo de una línea de sorgo dada; y/o: b) distintas subpoblaciones de plantas dentro de una población F2 dada de plantas de sorgo de una línea de sorgo dada y la línea control parental de tipo silvestre. Se contempla adicionalmente que aquellas subpoblaciones de plantas de sorgo que presentan aumentos deseables en altura de planta, número de panículas y/o rendimiento de grano pueden comprender ciertas diferencias en su estado de metilación de ADN cromosómico, su secuencia de ADN cromosómico, modificaciones postraduccionales de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos que o bien contribuyen directamente a tales rasgos útiles (es decir tiene una relación causal directa con el rasgo útil) o bien están asociados con cualquier unión genética o epigenética a loci que contribuyen directamente a tales rasgos deseables.
Ejemplo 6. Caracterización de perfiles de ARN pequeños y el estado de metilación de ADN en plantas que presentan rasgos útiles asociados con la supresión de MSH1
Puede usarse una comparación de perfiles de ARN pequeños y estados de metilación de ADN en plantas de referencia que no presentan un fenotipo útil y plantas de prueba que comprenden un locus cromosómico alterado asociado con un rasgo útil para identificar loci cromosómicos alterados. En este ejemplo se proporcionan métodos para hacer tales comparaciones que pueden generalizarse para una variedad de plantas.
En una realización a modo de ejemplo particular, se comparan los perfiles de ARN pequeños y estados de metilación de ADN de diversos loci cromosómicos en: a) distintas subpoblaciones de plantas dentro de una población F2 dada de plantas de sorgo de una línea de sorgo dada; y/o: b) distintas subpoblaciones de plantas dentro de una población F2 dada de plantas de sorgo de una línea de sorgo dada y la línea control parental de tipo silvestre. El objetivo de estas comparaciones es identificar diferencias en los perfiles de ARN pequeños y/o la metilación de ciertos loci cromosómicos de ADN entre aquellas plantas de sorgo que presentan los rasgos útiles y plantas de sorgo que no presentan los rasgos útiles. Tales diferencias pueden usarse entonces para identificar ARNp o loci cromosómicos que o bien contribuyen directamente a tales rasgos útiles o bien están asociados mediante cualquier unión genética o a través de un mecanismo epigenético con loci que contribuyen directamente a tales rasgos útiles. Las plantas de sorgo que se examinarán pueden incluir plantas de tipo silvestre, plantas de distintas subpoblaciones y/o plantas individuales en las poblaciones F2 de líneas de sorgo GAII-11, GAII-15, GAII-28 y GAII-24 u otras que presentan alturas de planta, pesos de panícula y/o rendimientos de grano que o bien se solapan o bien tienen un valor menor que el de las alturas de planta del control TA430 de tipo silvestre así como plantas de distintas subpoblaciones y/o plantas individuales en las poblaciones F2 de líneas de sorgo GAII-11, GAII-15, GAII-28 y GAII-24 u otras que presentan alturas de planta, pesos de panícula y/o rendimientos de grano que son claramente mayores que los de las plantas control TA430 de tipo silvestre. Tales plantas y tales subpoblaciones se describen a modo de ejemplo en el Ejemplo 5 anterior y en las Figuras 8, 9, y 10.
Se determinan los perfiles de ARN pequeño (ARNp) de sorgo de tipo silvestre (Tx430), sorgo F1 y plantas de sorgo F2 seleccionadas derivadas de diferentes subpoblaciones. Las subpoblaciones o plantas de sorgo que se examinarán pueden incluir plantas de tipo silvestre, y subpoblaciones y/o plantas individuales en las poblaciones F2 de sorgo GAII-11, GAII-15, GAII-28 y GAII-24 u otras tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, ciertas poblaciones de sorgo sometidas a supresión de MSH1 pueden presentar pesos de panícula y rendimientos de grano que o bien se solapan o bien tienen un valor menor que el de las altura de planta de control TA430 de tipo silvestre mientras que otras subpoblaciones o plantas de sorgo pueden tener un valor que era claramente mayor que el de las plantas control TA430 de tipo silvestre tal como se muestra en las Figuras 9 y 10 pueden someterse a secuenciación profunda para identificar los tipos (análisis cualitativo) y cantidades relativas (análisis cuantitativo) de ARNps presente en estas diversas líneas de planta. Tales análisis cualitativos y cuantitativos pueden usarse entonces para establecer correlaciones entre la presencia o ausencia de un fenotipo dado y la presencia, ausencia o abundancia relativa de un ARNp dado.
Las técnicas de secuenciación profunda para caracterizar poblaciones de ARNp pueden determinarse tal como se describe mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos por Zhou et al. PLoS One. 2010; 5(12): e15224; o Glazov et al. PLoS One. 27 de julio de 2009;4(7):e6349. En determinadas realizaciones, tres replicaciones biológicas pueden secuenciarse para cada muestra y pueden prepararse bibliotecas de ARNp y secuenciarse según un protocolo Illumina™. Resumiendo, pueden aislarse ARNps de bajo peso molecular (17-27 nt de longitud) de ARN total mediante fraccionamiento por tamaño. Tras la unión de adaptadores 3’ y 5’ a ARNps, se realizará una RT-PCR para construir la biblioteca de ARNp. La biblioteca se depurará y se validará según el protocolo Illumina™ y puede realizarse una secuenciación profunda basada en Illumina™ de la biblioteca.
Tras la eliminación de las secuencias comunes(ARNr, ARNt, ARNnp y ARNnop), las secuencias de ARNp restantes se someterán a varios análisis. El primer análisis es para evaluar la distribución de ARNps en el genoma, con la expectativa de identificar una distribución de ARNp alterada mediante la alteración de la función MSH1. El análisis del agrupamiento genómico se usará para examinar la distribución de loci que generan ARNp en el genoma. Un agrupamiento de ARNp se definirá como grupo de ARNps, en el que cada a Rn pequeño está <100 nt de su vecino más cercano tal como se describe en Johnson et al. (2009). Basándose en esta definición, los ARNps en los extremos de un agrupamiento están > 100 nt del siguiente ARN pequeño más próximo fuera del agrupamiento (Johnson et al., 2009). La expresión diferencial de firmas de ARNip entre diferentes líneas de plantas puede compararse para conocer su relación con la función MSH1 alterada. Esto se llevará a cabo comparando la abundancia relativa de miARN o ARNip en cada biblioteca derivada de cada línea de planta. Puede usarse el método SAMseq para realizar el análisis estadístico de niveles significativos de expresión diferencial. Pueden seleccionarse varios ARNps que presentan patrones de expresión diferencial en un análisis por secuenciación profunda para su validación usando un análisis de transferencia en gel de ARN.
Para obtener información sobre la relación entre alteraciones en la metilación de ADN y los niveles de ARNps en diversas muestras, pueden mapearse regiones que contienen metilación de ADN (descrito más adelante) frente al ARNps obtenido de su estudio y otras bases de datos disponibles públicamente, para identificar regiones que contienen metilación de ADN que se seleccionan potencialmente como diana por ARNp.
Pueden compararse los perfiles de metilación de ADN y ARNp obtenidos de diferentes líneas para determinar si las alteraciones en el contenido de metilación de ADN se correlacionan con cambios en la abundancia de ARNp en diversas muestras de planta que presentan diferentes fenotipos inducidos por MSH-1. Una preocupación en tales análisis es que los ARNps pueden ser demasiado cortos para detectarlos. Los ARNps se generan normalmente a partir de transcritos mucho más largos en plantas. Por tanto, pueden expandirse los análisis de metilación de ADN a 500 pb a cada lado del locus cromosómico que contiene ARNps tal como se notifica (Wang et al., 2009). Este análisis podría indicar si la metilación de ADN puede haberse inducido potencialmente por ARNps. Tales estudios pueden usarse para identificar alteraciones detectables en la población de ARNp que alteran los patrones de metilación del genoma, lo que puede resultar de la supresión de MSH1. Cualquiera de los ARNps y/o las regiones genómicas identificadas en tales estudios puede entonces suprimirse y/o regularse por incremento usando enfoques transgénico u otros a base de alteración genómica para obtener fenotipos deseables que pueden resultar de la supresión de MSH1.
También puede determinarse la asociación de fenotipos útiles inducidos mediante la supresión de MSH1 en diversas plantas y líneas de plantas con alteraciones cromosómicas mediante la detección de metilo C en experimentos de secuenciación por bisulfito de genoma completo. El método de secuenciación profunda por bisulfito genómico (Lister 2009) puede usarse para obtener una vista de genoma completo de todas las citosinas metiladas posibles en los genomas de plantas sometidas a supresión de MSH1 que incluyen, pero no se limitan a, esas plantas que presentan fenotipos deseables o fenotipos no deseables, y plantas control adecuadas que incluyen, pero no se limitan a, líneas parentales que no se han sometido a supresión de MSH1. En un método a modo de ejemplo, pueden aislarse aproximadamente cinco microgramos de ADN genómico y añadírseles de manera conocida 25 nanogramos de ADN lambda no metilado que sirve como control interno para la eficacia de conversión por bisulfito de nucleótidos de citosina no metilados a uracilos. El ADN puede sonicarse hasta una longitud promedio de aproximadamente 300 pb y puede construirse una biblioteca de ADN. Puede usarse un método a modo de ejemplo que sigue un protocolo Illumina™ Paired End que comprende modificaciones en las que el cóctel de reparación de extremos no contiene dCTP y los adaptadores contienen citosinas metiladas (Illumina™). La conversión por bisulfito del ADN ligado a adaptador puede ir seguida de ciclos limitados de PCR con una ADN polimerasa PfuTurboCx insensible al uracilo (Stratagene™). Se secuenciarán productos de 200-300 pb aislados por gel hasta una longitud de 110 bases en el sistema Illumina™ GA II. Se usarán el análisis de imágenes Illumina™ convencional, asignación de bases y un tubo de procesamiento sed para obtener las secuencias procesadas iniciales. En determinadas realizaciones, solo aquellas secuencias que pasen los filtros Illumina™ internos (pureza > 0,6) se almacenarán junto con las puntuaciones de calidad de secuencia similar a PHRED en archivos FastQ. Las lecturas de secuencias se cortarán hasta antes de la primera aparición de descripción de proyecto 12 de una base de baja calidad (puntuación PHRED <2). Cualquier base de citosina restante en las secuencias puede convertirse en timina y retenerse la posición genómica de esta en un archivo de cobertura de metilo C. En determinadas realizaciones pueden generarse dos genomas de referencia. En el primer genoma de referencia, correspondiente a la hebra “Watson”, las citosinas pueden convertirse en timinas. En el segundo, correspondiente a la hebra Crick, pueden convertirse guaninas en adeninas. La misma conversión puede realizarse para el lambda ADN de control interno, que se analizarán como genomas de referencia independientes para la eficacia de conversión de citosinas no metiladas. Las secuencias Illumina estarán alineadas con los dos genomas de referencia con Bowtie (Langmead et al., 2009). En determinadas realizaciones, solo se anotarán lecturas de secuenciación con posiciones de partida únicas (se descartará una segunda secuencia que empiece en la misma posición para minimizar una distorsión por amplificación por PCR desigual de los datos). Para el control interno Lambda se espera una tasa de conversión de citosinas no metiladas a timinas de más del 99% y se confirmará en estudios piloto y un análisis de un solo carril de cada biblioteca (antes de la secuenciación adicional de la biblioteca), tal como se determina usando las secuencias control de ADN lambda. La aparición de citosinas en el ADN lambda tratado por bisulfito puede calcularse en función de la cobertura de secuencia (cada lectura de secuencia cuenta como cobertura de 1). Se establecerán valores umbral para tener un valor <0,01 para una citosina que se produce por un error de secuenciación o una conversión incompleta a uracilo.
Pueden usarse dos replicaciones biológicas para cada tipo de genoma analizado. La cobertura puede ser de 10 x para cada hebra. Esto debería ser una cobertura suficiente para comparar las replicaciones biológicas individuales en la mayoría de las posiciones para variación individual. Los datos de secuencia combinados de los dos individuos se combinarán para una cobertura 20x, de cada hebra cuando se comparan diferentes muestras de genotipo. Las replicaciones biológicas individuales pueden usarse para establecer umbrales porcentuales de cobertura y metilación para tener una tasa de descubrimiento falso (FDR) de < 0,05 para diferencias en posición específicas. Regiones seleccionadas que muestran diferencias de metilo C pueden analizarse mediante el método de clonación por PCR por bisulfito tradicional para validar los datos de genoma completo y predicciones de FDR.
Ejemplo 7. Análisis cuantitativo de metilación y variación fenotípica en respuesta a la supresión de MSH1
Es posible aprovechar la variación fenotípica cuantitativa que surge en una población F2 derivada cruzando una variante fenotípica derivada de ARNi de MSH1 x tipo silvestre. Pueden determinarse la heredabilidad y la variación cuantitativa en diversas poblaciones de sorgo sometidas a supresión de MSH1 y plantas de sorgo control descritas en el presente documento para identificar alteraciones cromosómicas que confieren rasgos útiles. En determinadas realizaciones, estos métodos pueden conllevar el uso de polimorfismos de SNP de ADN derivado por bisulfito identificados mediante experimentos de secuenciación al azar de sorgo en el desarrollo y la detección de SNP. El genoma de sorgo tiene aproximadamente 1628 cM, y se buscará una densidad de marcador de SNP de aproximadamente 1 SNP/10 cM (centimorgans). Por tanto, se seleccionarán 163 sitios de Me-C para el análisis QTL basándose en su metilación diferencial en el análisis de genoma completo de hasta cinco tipos de muestras (es decir (1) tipo silvestre, (2) plantas inactivadas para MSH1 transgénicas que muestran una tasa de crecimiento reducida drásticamente y una floración retardada, (3) segregantes no transgénicos que conservan el fenotipo de crecimiento alterado, (4) plantas F1 (tal como se muestra en la Figura (6) y (5) y plantas F2 seleccionadas que presentan variación cuantitativa (Figura 6)), y para un espaciado de 10-cM regular por todo el genoma de sorgo.
El ADN de 200 individuos F2 puede tratarse con bisulfito para crear un C/T SNP en el producto de PCR posterior. La razón de C/T dependerá del grado de Me-C en cada sitio de metilación. Se usarán cebadores de PCR diseñados para las secuencias agotadas con respecto a C para amplificar regiones de SNP de Me-C seleccionadas como diana en el ADN tratado con bisulfito. El polimorfismo de C/T se detectará en un sistema de PCR LightCycler 480 usando Hybprobes™ (Roche, Indianápolis, IN, EE. UU.). Hybprobes™ usan transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre sondas adyacentes hibridadas con el producto de PCR y fusión diferencial para determinar la frecuencia de C/T en la posición de SNP de Me-C. Se usará el software de diseño de sondas LightCycler™ (Roche) para diseñar las HybProbes, con el polimorfismo C/T en el centro de la sonda de sensor. La razón de cebadores de PCR para obtener una PCR asimétrica óptima de la hebra de Me-C para hibridación con las HybProbes™ se determinará experimentalmente para cada SNP.
Análisis de heredabilidad. Hasta aproximadamente doscientas o más familias F3 pueden desarrollarse en sorgo. Puede extraerse ADN de cada individuo F2 dando lugar a cada familia F3. Puede realizarse un ensayo de campo replicado de las familias F3 para realizar el análisis de heredabilidad de las variación epigenética putativa generada por los efectos transgeneracionales del transgén de ARNi MSH1 (es decir supresión de MSH1). For cada especie se dispondrán filas de tres metros individuales en un diseño de bloque completo aleatorizado con dos replicaciones. Se harán crecer las poblaciones en campos experimentales.
Análisis QTL. Junto con los datos de marcador en los 200 individuos F2, se usarán los datos fenotípicos en un análisis QTL para ubicar regiones genómicas afectadas por MSH1 en generaciones previas que están generando la variación observada para el rendimiento de simiente y biomasa total. Se construirá un mapa genético usando datos de segregación sobre cambios de sitios de metilación, seguido de mapeo de intervalos compuestos convencional.
Ejemplo 8. Uso de la supresión de Msh1 para alterar el epigenoma para producir cambios drásticos y hereditarios en el crecimiento de la planta
Se usó la supresión de Msh1 para inducir una variación fenotípica y epigenética, y para seleccionar fenotipos derivados en la especie de cultivo Sorghum bicolor (L.) Moench y la planta modelo Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
La Figura 11 muestra el transgén y el proceso de cruce que se usó en este estudio tanto para Arabidopsis como para sorgo. En sorgo, todos los experimentos se realizaron con la línea consanguínea Tx430 (F.R. Miller, Crop Sci.
24, 1224, 1984), mientras que los experimentos con Arabidopsis se llevaron a cabo en el ecotipo consanguíneo Columbia-0. Las plantas de sorgo MSH1-dr que ya no contienen el transgén MSH1-ARNi se restauran a niveles de transcrito de MSH1 normales; no obstante, mantienen el fenotipo de crecimiento alterado a través de múltiples generaciones de autopolinización. Cuando se cruza recíprocamente con la línea Tx430 consanguínea de tipo silvestre, la progenie se restaura a un fenotipo normal. La progenie F1 derivada, designada como MSH1-epiF1, ya no muestra el fenotipo con enanismo, macollamiento y floración tardía. De hecho, las plantas crecen más altas y generalmente producen más simiente que el tipo silvestre (Figura 11A). La autopolinización de las plantas MSH1-epiF1 produjo una población F2 (MSH1-epiF2) que era sorprendentemente variable en el fenotipo de planta, pero no mostraba ningún fenotipo MSH1-dr (Figura 11B-D). Un proporción de familias MSH1-epiF3 que se hacen crecer en invernadero sí mostró el fenotipo MSH1-dr a una frecuencia de aproximadamente el 8% (tabla 4), y no apareció fenotipo de enanismo en las líneas epi-F4.
Tabla 4. Frecuencia del fenotipo MSH1-dr (8,4%) en familias epi-F3 derivadas de Tx430 MSH1-dr x Tx430 de sorgo y que se hacen crecer en invernadero. Las familias epi-F4 derivadas no mostraron ninguna evidencia de fenotipo MSH1-dr (no mostrado).
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Las plantas F2, y poblaciones posteriores derivadas mediante autopolinización, mostraban una variación para rasgos de rendimiento agronómicos, incluyendo arquitectura de panícula y planta, tiempo y número de macollamientos, altura de planta y biomasa por encima del suelo, y componentes de rendimiento de panícula y peso de simiente (tabla 5 para altura de planta y rendimiento de grano). De manera similar se observaron cambios drásticos en el crecimiento en poblaciones de Arabidopsis derivadas de cruzar el mutante msh1 con el tipo silvestre, seguido de selección para las plantas F2 MSH1/MSH1 homocigóticas y autopolinización en serie (Figura 11F-H).
Poblaciones MSH1-epiF2, MSH1-epiF3, y MSH1-epiF4 de sorgo que se han hecho crecer en condiciones de campo en 2010 y 2011 permitieron evaluaciones a mayor escala de cambios de crecimiento de la planta (Tablas 5, 6, 7). Se desarrollaron distribuciones fenotípicas a partir de resultados de dos experimentos de campo de sorgo, demostrando patrones en MSH1-epiF2 que se aproximan a la bimodalidad (Figura 12). Todos los rasgos mostraron patrones de variación cuantitativos. Se sometieron a prueba las progenies F3 y F4 en condiciones tanto de campo como de invernadero, mostrando heredabilidad para la altura de planta con una uniformidad creciente entre plantas de cada generación, y respuesta a la selección para rendimiento de grano, aunque este rasgo se sometió a una selección menos rigurosa durante el crecimiento en invernadero (Figura 13). Estos resultados sugieren un alto grado de heredabilidad y respuesta de selección para la variación observada.
El desarrollo de plantas alterado en líneas mutantes MSH1-dr de sorgo y msh1 de Arabidopsis, incluyendo la variación en la tasa de crecimiento, ramificación, maduración y floración, estaba condicionado por cambios de cloroplastos (véase el siguiente Ejemplo 9). Resultaba de interés evaluar la relación de la variación de MSH1-epiF2 con estas influencias organulares. Las líneas de hemicomplementación MSH1 de Arabidopsis, derivadas introduciendo un transgén MSH1 dirigido como diana a mitocondrias frente a cloroplastos en la línea mutante msh1 (Y.-Z. Xu et al. Plant Cell 239:3428, 2011) distinguen entre contribuciones de mitocondrias y cloroplastos al fenómeno. Se cruzaron líneas de hemicomplementación tanto de mitocondrias como de cloroplastos como hembras con el tipo silvestre (Col-0) para producir progenie F1 y F2. Las plantas F1 de cruces con la línea complementada con cloroplastos produjeron fenotipos similares al tipo silvestre, aunque aproximadamente el 25% de las plantas F1 mostraron una rizadura de las hojas alterada y una floración retardada (Figura16). Este fenotipo de rizadura puede ser una consecuencia de la sobreexpresión de MSH1, dado que las plantas F1 contienen tanto el alelo MSH1 de tipo silvestre como el transgén. El fenotipo se asemeja a los efectos de la regulación de la ruta de ácido salicílico alterado, un proceso regulados epigenéticamente (T.L.Stokes et al. Genes Dev 16, 171, 2002). La progenie F1 de cruces con la línea complementada con mitocondrias mostró una variación fenotípica en el crecimiento de la planta, mostrando más del 30% de las plantas un crecimiento potenciado, un diámetro de roseta mayor, tallos florales más gruesos y un tiempo de floración más temprano, similar a los fenotipos MSH1-epiF3 (Figuras 14A y 17; Tabla 8). Estos resultados se confirmaron adicionalmente en las poblaciones F2 complementadas con mitocondrias frente a cloroplastos (Figura 14B-E), y sugieren que los cambios de crecimiento potenciados por MSH1-epiF3 derivan de la restauración de la función MSH1 en plantas que han experimentado el fenómeno de reprogramación de desarrollo de MSH1-dr.
Se investigaron pantas de tipo silvestre de Arabidopsis y MSH1-epiF3, ambas con antecedentes Col-0, para determinar la evidencia de cambios de metiloma que pueden acompañar a fenotipos derivados de MSH1 hereditarios. Los experimentos usaron ADN genómico tratado con bisulfito de sodio y análisis de siguiente secuencia génica en todo el genoma (Lister et al. Cell 133, 523, 2008). Los cambios de metilación fueron extensos, implicando las posiciones metiladas de manera diferencial predominantemente sitios CpG, con más de 91.000 posiciones metiladas de manera diferencial en más de 1700 regiones (tabla 11, Figura 15A). El patrón de cambios de metilación era consistente con la heredabilidad observada de fenotipos alterados, asemejándose la gran proporción de cambios en las regiones de codificación génica del genoma a los datos de estudios de variación epigenética natural (C. Becker et al. Nature 480, 245,2011; R.J. Schmitz et al. Science 334, 369, 2011). La comparación de los patrones diferenciales de no metilación en líneas de tipo silvestre y MSH1-epiF3 en este estudio frente a patrones notificados por un estudio de Arabidopsis reciente de variación de metilación natural (C. Becker et al. Nature 480, 245,2011), mostró una correspondencia notable de patrón (Figura 15B, línea 2 de MSH1-epiF5), lo que confirma la consistencia del análisis de metilación del genoma de Col-0 entre los dos estudios. Resultaron evidentes diferencias sorprendentes entre los dos estudios para las regiones de los cromosomas enriquecidos para posiciones metiladas de manera diferencial; el análisis de Becker et al. de variación natural, mostrado con fines ilustrativos en la Figura 15C, mostró una distribución de metilación diferencial bastante uniforme que abarca cada cromosoma, mientras que las líneas MSH1-epiF3 revelaron patrones irregulares de metilación diferencial que se concentraban en regiones discretas del genoma (Figura 5B, línea roja). Se confirmaron varias DMR que muestran cambios en la metilación mediante amplificación por PCR seleccionada como diana y secuenciación de intervalos de ADN tratado con bisulfito (Figura 18, Tabla 9). A partir de estos resultados se infiere que la variación de desarrollo que acompaña a la alteración de MSH1 implica cambios pronunciados en la arquitectura de metilación de la planta. El patrón de herencia del fenotipo MSH1-dr, que muestra independencia del transgén y la implicación de numerosas rutas de desarrollo, indica también que se produce cambios epigenéticos en las líneas MSH1-dr.
Tabla 5. La mayoría de las familias de epi-línea F2 de sorgo muestran de manera consistente un aumento estadísticamente significativo en la variación (valor p < 0,05) en la altura de planta y el rendimiento de grano en comparación con el tipo silvestre Tx430. Se recogieron datos de plantas que se hicieron crecer en condiciones de campo en 2010 y 2011
Altura de la planta Rendimiento de grano por panícula Año Familia Media Error est. Varianza valor p Media Error Varianza valor p (cm) (cm) (cm2) f (g) est. (g) (g2) f 2010 Tx430 132,10 2,42 58,54 - 24,19 0,93 27,11 -2010 msh1-epi11 F2 165,77 8,40 2116,67 <0,001 51,29 3,45 368,88 <0,001 2010 msh1-epi15 F2 135,30 5,02 1182,95 <0,001 33,69 2,47 293,54 <0,001 2010 msh1-epi22 F2 155,96 8,13 1783,50 <0,001 35,84 2,77 290,84 <0,001 2010 msh1-epi24 F2 140,04 3,40 1031,38 <0,05 34,35 1,04 185,51 <0,001 2010 msh1-epi28 F2 140,87 3,61 1130,67 <0,01 23,75 1,58 141,69 <0,001 2011 Tx430 134,50 0,55 64,95 - 45,20 0,89 146,49 -2011 msh1-epi11 F2 186,57 3,93 1912,00 <0,001 53,96 1,55 272,73 <0,05 2011 msh1-epi15 F2 177,04 2,41 1532,86 <0,001 53,66 0,94 184,36 <0,05 2011 msh1-epi22 F2 180,73 10,62 1691,50 <0,001 56,62 2,59 114,08 NS 2011 msh1-epi24 F2 154,78 1,98 1196,96 <0,001 47,92 1,12 266,97 <0,001 2011 msh1-epi28 F2 156,91 3,57 1238,75 <0,001 47,49 1,27 222,84 <0,05
f valores p basados en la prueba de Levene para la homogeneidad de la varianza en comparación con el tipo silvestre Tx430.
NS = no significativo
Tabla 6. Tres de cinco familias de línea epi-F2 de sorgo medidas para la biomasa seca muestran una aumento estadísticamente significativo en la variación (valor p < 0,05) en comparación con el tipo silvestre Tx430. Se recogieron datos de plantas que se hicieron crecer en condiciones de campo en 2011.
Rendimiento de biomasa seca
Familia Media Error est. Varianza valor p f (g) (g) (g2)
Tx430 53,11 1,94 79,35 -msh1-epi11 F2 85,49 2,77 99,53 NS msh1-epi15 F2 75,08 3,24 252,04 <0,05 msh1-epi22 F2 92,33 7,90 311,83 NS msh1-epi24 F2 68,26 3,54 363,73 <0,001 msh1-epi28 F2 66,93 5,79 503,32 <0,001
f valores p basados en la prueba de Levene para la homogeneidad de la varianza en comparación con el tipo silvestre Tx430.
NS = no significativo
Tabla 7. Datos de generación F4 de sorgo que muestran diferencias significativas (valor p < 0,05) para muchas familias epi-F4 en la altura de planta (37 de 39 líneas) y el rendimiento de grano (11 de 39 líneas) en comparación con el tipo silvestre Tx430. Se recogieron datos de plantas que se hicieron crecer en condiciones de campo en 2011.
Altura de la planta_____________________Rendimiento de grano por panícula Línea Media Error est. Varianza valor p Media Error est. Desv. est. valor p (cm) (cm) (cm) *
(g) (g) (g)
Tx430 134,45 0,56 8,08 - 45,44 0,88 11,95 -
10,3 135,29 1,42 6,515 NS 40,71 2,17 9,71 NS
12,1 186,24 8,77 47,23 <0,001 44,33 2,73 11,60 NS
12,10 238,85 2,01 9,00 <0,001 51,84 2,68 11,99 NS
12,3 220,00 2,55 11,11 <0,001 54,86 3,15 13,72 NS
14,1 187,20 5,72 25,59 <0,001 56,59 3,50 14,87 <0,05
15,2 222,75 1,76 8,63 <0,001 33,88 1,74 8,52 <0,001
17,2 174,52 6,55 36,49 <0,001 61,25 2,54 11,05 <0,001
17,3 192,54 5,66 27,72 <0,001 47,02 1,74 8,16 NS
2a-9 216,00 4,44 19,34 <0,001 48,12 3,40 14,41 NS 2b-1 217,83 3,41 14,49 <0,001 43,88 4,29 17,69 NS 2b-3 221,24 2,10 8,67 <0,001 54,82 3,94 16,25 NS 2b-4 217,44 2,65 10,60 <0,001 44,75 3,36 12,08 NS 2b-5 231,32 3,46 15,07 <0,001 53,40 3,00 12,70 NS 2b-6 229,90 1,49 6,67 <0,001 50,52 2,43 10,87 NS 2b-8 231,21 1,61 7,89 <0,001 39,95 2,71 13,27 NS 2b-10 207,80 4,01 17,94 <0,001 66,94 3,99 17,84 <0,001 3a-1 226,79 2,74 11,93 <0,001 44,39 3,09 12,73 NS 3a-2 141,10 1,78 7,97 <0,05 46,61 2,61 11,96 NS 3a-6 233,14 1,63 7,48 <0,001 44,35 2,24 10,27 NS 3a-7 190,29 9,58 43,89 <0,001 40,30 3,91 15,15 NS 3b-1 219,44 2,51 10,68 <0,001 41,47 3,69 13,82 NS 3b-2 216,65 2,49 11,12 <0,001 52,14 1,96 8,77 <0,05 3b-3 210,28 3,34 14,17 <0,001 39,99 3,69 11,08 NS 3b-4 207,64 4,72927 22,18 <0,001 51,17 2,27 10,39 NS 3b-7 223,41 2,353125 9,70 <0,001 53,10 3,45 14,22 NS 3b-10 234,14 2,170879 8,12 <0,001 43,04 3,22 9,10 NS 4a-1 213,07 3,164821 11,84 <0,001 60,54 6,29 22,66 <0,01 4a-2 217,67 7,862307 30,45 <0,001 52,33 3,40 10,77 NS 4a-4 225,56 5,02882 21,34 <0,001 52,11 3,58 14,78 NS 4a-7 233,28 2,471809 10,49 <0,001 41,28 2,15 8,87 NS 4a-8 200,31 7,515885 38,32 <0,001 48,04 2,60 11,05 NS 4b-10 133,06 1,403771 5,62 NS 63,96 3,39 13,55 <0,001 5a-1 216,48 4,470243 17,88 <0,001 68,90 4,72 18,28 <0,001 5a-2 219,05 2,415699 11,07 <0,001 43,20 1,64 7,49 NS 5a-3 220,58 2,359566 8,17 <0,001 58,30 2,66 9,58 <0,001 5a-5 214,67 3,178769 13,49 <0,001 52,16 2,60 11,02 NS 5a-6 216,94 3,335935 13,75 <0,001 53,35 2,80 11,21 NS 5a-8 212,90 3,568814 19,55 <0,001 52,74 1,41 7,74 <0,001 5a-9 227,29 2,318808 10,63 <0,001 59,80 3,36 15,38 <0,01
* valores p basados en la prueba de la t máxima para comparación múltiples de medias (contrastes de Dunnett) usando la estimación de covarianza consistente heteroscedástica (E. Heberich etal. PLoS Onc. 5(3):e9788 (2010)), frente al tipo silvestre Tx430.
NS = no significativo
Tabla 8. Análisis de datos de fenotipo de familias F2 de Arabidopsis individuales derivadas cruzando líneas de hemicomplementación x Col-0 de tipo silvestre. SSU-MSH1 se refiere a líneas transformadas con la formada dirigida como diana a plástidos de MSH1; AOX-MSH1 se refiere a líneas que contienen la forma dirigida como diana a mitocondrias del transgén MSH1. En todos los experimentos genéticos que usan hemicomplementación, se confirmó la presencia del transgén con un ensayo a base de PCR.
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Tabla 9. Datos de metilación diferencial de muestras para cuatro DMR, derivadas mediante análisis a base de PCR de ADN tratado con bisulfito de líneas MSH1-epiF3 y Col-0 de tipo silvestre de Arabidopsis.
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Tabla 10. Cebadores usados en el estudio
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Tabla 11. Análisis de 5-metilcitosina por todo el genoma en plantas Col-0 y MSH1-epiF3 de Arabidopsis.
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Los fenotipos de planta derivados del cruce de las selecciones de MSH1-dr con el tipo silvestre no parecían asemejarse a los notificados de otros tipos de cambios de metilación inducidos, incluso aunque los cambios de metiloma eran evidentes en las poblaciones resultantes. Poblaciones EpiRIL producidas a partir de cruces que implican el mutante met1 de Arabidopsis dan lugar a una variedad de fenotipos variantes (J. Reinders et al., Genes Dev. 23, 939 (2009). Sin embargo, estos estudios anteriores no notifican el vigor potenciado, el tamaño de planta y de tallo marcadamente mayor, o una mayor producción de simiente que lo que se ve con manipulación de MSH1. Los materiales y métodos usados en este ejemplo son tal como se describen a continuación.
Materiales vegetales y condiciones de crecimiento
Se obtuvieron líneas mutantes Col-0 y msh1 de Arabidopsis del centro de reserva de Arabidopsis y se hicieron crecer una mezcla de metro con 12 h de luz solar a 22°C. Se derivaron líneas MSH1-epi cruzando líneas MSH1-dr con plantas de tipo silvestre. Se midieron la biomasa de la planta y el diámetro de roseta de Arabidopsis para plantas de 4 semanas de edad. Se midió el tiempo de floración de Arabidopsis como la fecha de la primera aparición de capullo de flor visible. Para cruces con hemicomplementación, se cruzaron líneas homocigóticas complementadas con mitocondrias (AOX-MSH1) y plástidos (SSU-MSH1) con plantas de tipo silvestre Columbia-0. Cada planta F1 se genotipó para el transgén y el alelo MSH1 de tipo silvestre y se recogieron por separado. Tres familias F2 de AOX-MSH1 x Col-0 y dos familias F2 de SSU-MSH1 x Col-0 se evaluaron para determinar parámetros de crecimiento. Todas las familias se hicieron crecer en las mismas condiciones, y se midieron la biomasa, el diámetro de roseta y el tiempo de floración. Se usó la prueba de la t de Student de dos colas para calcular los valores p.
El germoplasma de sorgo usado en estos experimentos se derivó de Tx430, una línea de sorgo consanguínea (Miller, 1984). Se derivaron varios hermanos de sorgo T3 de una única planta MSH1-dr, que se hicieron crecer en condiciones de invernadero y se designaron como GAII1-GAII30. Se confirmó que cada una de las líneas eran transgenes nulos. Seis de ellos, GAII11, GAII15, GAII22, GAII24, GAII25 y GAII28 se usaron como hembras en los cruces con Tx430 consanguíneo de tipo silvestre para derivar simiente F1. Tres plantas adicionales, GAII22, GAII23 y GAII27, se usaron como machos en cruces recíprocos. La temperatura de día en el invernadero era de 79 a 83°F, y de noche era de 69 a 73°F. Las plantas se hicieron crecer con una duración de día corta (10 h).
Se hicieron crecer progenies F1 en las mismas condiciones de invernadero, con progenies que oscilan en tamaño entre 5-19 individuos. Las progenies T4 derivadas se hicieron crecer a partir de las seis plantas msh1-dr maternas usadas para derivar F1 (GAII11, GAII15, GAII22, GAII24, GAII25, y GAII28), con poblaciones que oscilan en tamaño entre 15-19 individuos. La simiente autopolinizada de cada planta F1 se recogió individualmente para derivar las familias F2 correspondientes
Experimentos de campo
Durante los veranos de 2010 y 2011, se hicieron crecer familias F2 en dos experimentos de campo establecidos en condiciones de secano en la estación de experimentos Havelock de la Universidad de Nebraska en Lincoln. Los experimentos se dispusieron en un diseño de bloques incompletos, consistiendo el experimento de 2010 en una replicación con 15 bloques y 30 entradas por bloque (red alfa de 30 x 15). Se plantaron líneas individuales en un único plano de una panícula por fila, con un único diagrama de filas de 5 m de longitud y 0,75 m de espacio entre filas. La simiente F3 se recogió de plantas individuales.
El experimento de 2011 comprendía siete bloques de 28 entradas cada uno (red alfa de 28 x 7), con dos replicaciones fertilizadas con nitrógeno complementario a una dosificación de 100 kg/ha. Se seleccionaron cuarenta y ocho muestras del experimento de 2010 para componer la F3. Estas muestras se derivaron de los seis cruces originales e incluyeron valores de rendimiento de grano F2 altos y bajos. Además, se sección un subgrupo que se hizo crecer en invernadero de 17 F3 muestras, basado en el peso seco de panícula, para derivar la simiente F4. Por tanto, el experimento de campo de 2011 comprendía 48, 77 y 42 entradas que correspondían a las generaciones F2, F3 y F4, respectivamente, con Tx430 de tipo silvestre como control.
Evaluación fenotípica de sorgo
En los experimentos de campo de 2010 y 2011, los rasgos fenotípicos de sorgo registrados incluyeron la altura de planta (PH), en cm desde el suelo hasta la punta de la panícula, la longitud de panícula (PL), en cm desde la base de la panícula hasta la punta, el peso fresco y seco de panícula (FPW y DPW) (g), el rendimiento de biomasa fresca y seca (FBY y DBY) (g), y el rendimiento de grano neto (NGY) (g). El tamaño de muestra para PH, PL, FPW, DPW y NGY varió de cinco a diez plantas de fila interna, aleatorias, por fila. Se embolsaron cabezas bien conformadas, sanas, antes de la antesis para la autofecundación, y se recogieron tras la madurez fisiológica, cuando se midió FPW. Las muestras se secaron a 80°F durante 30 días antes de medir DPW y NGY. Las muestras de biomasa consistían en una muestra de tres plantas, embolsadas y pesadas tras el corte para obtener FBW. Las plantas eran selecciones de fila interna, aleatorias, y las muestras se secaron completamente a 160°F a lo largo de 15 días para DBW.
Ensayo de PCR para el transgén de ARNi
El ensayo de PCR para la presencia del transgén de MSH1-ARNi en materiales de sorgo usó los cebadores enumerados en la Tabla S7. Las condiciones de reacción eran: 95°C 5 min, 30 ciclos de 95°C 30 s, 55°C 1 min, 72°C 2 min; la extensión final era a 72°C 10 min. Se incluyeron controles positivos y negativos de una línea transgénica confirmada y Tx430 de tipo silvestre, respectivamente.
Construcción y secuenciación de una biblioteca genómica tratada con bisulfito
Se sonicó ADN genómico de Arabidopsis (aproximadamente 15 ug) preparado a partir de plantas Col-0 y epi-F3 hasta un intervalo de pico de 200 pb a 600 pb, se purificó con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El ADN sonicado (aproximadamente 12 ug) se trató con Mung Bean Nuclease (New England Biolabs), se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El ADN genómico tratado con Mung Bean Nuclease (aproximadamente 3 ug) se reparó en los extremos y se adeniló en el extremo 3’ con el kit de preparación de muestras de ADN genómico Illumina (illumina, San Diego CA). El fragmento de ADN adenilado se ligó entonces a adaptadores de metilación (Illumina, San Diego, CA). Entonces se purificaron en columna las muestras y fraccionaron en agarosa. Una fracción de 280 pb a 400 pb se purificó en gel con el kit de purificación en gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA). Otros 3 ug de ADN genómico tratado con Mung Bean Nuclease se usaron para repetir el proceso, y las dos fracciones se combinaron y se sometieron a tratamiento con bisulfito de sodio con el kit MethylEasy Xceed (Human Genetic Signatures Pty Ltd, North Ryde, Australia) según las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo tres enriquecimientos por PCR de bibliotecas independientes con 10 ul de un total de 30 ul ADN tratado con bisulfato como plantilla de entrada. La mezcla de reacción de PCR era 10 ul de ADN, 5 ul de tampón 10x pfuTurbo Cx, 0,7 ul de cebador PE1.0, 0,7 ul de cebador PE2.0, 0,5 ul de dNTP (25 mM), 1 ul de ADN polimerasa PfuTurbo Cx Hotstart (Stratagene, Santa Clara, CA), y agua hasta un volumen total de 50 ul. Los parámetros de PCR eran 950C durante 2 min, seguido de 12 ciclos de 950C 30 s, 650C 30 s y 720C 1 min, entonces 720C durante 5 min. El producto de PCR se purificó en columna y se combinó un volumen igual de cada reacción de PCR hasta una concentración final de 10 nM.
Las bibliotecas se sometieron a secuenciación de ADN en el Illumina Genome Analyzer II con tres kits de secuenciación TrueSeq de 36 ciclos v5 para leer 116 nucleótidos de secuencia desde un único extremo de cada inserto (protocolo V8).
Tratamiento con bisulfito de ADN para el análisis de PCR
Se trató con bisulfito ADN genómico de Arabidopsis usando el kit MethylEasy Xceed según las instrucciones del fabricante. Se realizó una PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla S7, y se clonaron los productos de PCR (kit de clonación Topo TA, Invitrogen) y se sometieron a secuenciación de ADN. La alineación de secuencias se realizó usando el servidor de alineación de múltiples secuencias T-Coffee (C Notredame, et al., J Mol Biol.
302:205-217, 2000).
Análisis de secuencias de ADN e identificación de citosinas metiladas de manera diferencial (DMC)
Se alinearon archivos Fastq con el genoma de referencia TAIR10 usando Bismark (F Krueger, SR Andrews. Bioinformatics 27:1571-1572 (2011), que también se usó para determinar el estado de metilación de citosinas. Se permitió un apareamiento incorrecto en los primeros 50 nucleótidos de la lectura. Bismark solo conserva lecturas que pueden mapearse exclusivamente en una ubicación en el genoma.
Solo se usaron las posiciones de citosina identificadas como metilados en al menos dos lecturas para al menos uno de los genotipos y secuenciadas al menos cuatro veces en cada uno de los genotipos para la identificación de DMC. Para estas posiciones de citosina se tabuló el número de lecturas indicando metilación o no metilación para cada genotipo usando R (http://www.r-project.org). La prueba exacta de Fisher se llevó a cabo para someter a prueba la metilación diferencial en cada posición. El ajuste para múltiples pruebas a lo largo de todo el genoma se realizó tal como se sugiere en Storey y Tibshirani (JD Storey, R Tibshirani. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:9440-9445 (2003) y se usó una tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,05 para identificar citosinas metiladas de manera diferencial. Se han cargado datos de secuencia de metiloma a Gene Expression Omnibus con el número de registro GSE36783. Mapeo de DMC para el contexto genómico e identificación de regiones metiladas de manera diferencial (DMR) Se usó la notación TAIR10 (disponible en el sitio ftp de Internet “ftp.arabidopsis.org/home/tair/Genes/TAIR10_genome_release/TAIR10_gff3”) para determinar los recuentos para DMC o citosinas metiladas de manera no diferencial en regiones de codificación génica, 5’-UTR, 3’-UTR, intrones, pseudogenes, ARN no codificantes, genes de elementos transponibles y regiones intergénicas. Las regiones intergénicas se definieron como regiones que no corresponden a ninguna característica anotada.
Para cada contexto de metilación (CpG, CHG, CHH), se hizo un barrido del genoma para regiones enriquecidas en DMC usando una ventana de 1 kb en incrementos de 100 pb. Se conservaron las ventanas con al menos cuatro DMC y las ventanas solapantes se fusionaron para dar regiones. Las regiones con al menos 10 DMC se conservaron con el límite cortado a las DMC más lejanas en la región. Entonces se realizó la prueba exacta de Fisher para cada región fusionando todos los recuentos de lectura metilados/no metilados en todas las posiciones de citosina en la región. Ajustando para todas las regiones sometidas a prueba, la FDR se controla a 0,1.
Ejemplo 10. Tabla resumen de secuencias de ácido nucleico y SEQ ID NO
Tabla 12. Secuencias de nucleótidos proporcionadas en la lista de secuencias
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Una planta que presenta un rasgo útil obtenido mediante un método que comprende las etapas de
    a. suprimir la expresión de un(os) gen(es) MSH1 en una primera planta o célula vegetal parental en las que se consigue dicha supresión: (I) transformando la planta o célula vegetal con un transgén que puede suprimir la expresión de MSH1; (II) introduciendo una mutación de pérdida de función en un gen MSH1 endógeno mediante: (i) la recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (ii) la unión de extremos no homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; (iii) una combinación de unión de extremos no homólogos y recombinación de homólogos y sustitución de la secuencia MSH1 de tipo silvestre residente en el cromosoma con una secuencia de sustitución msh1 con la(s) mutación/mutaciones de pérdida de función; o (iv) la introducción de una mutación en un gen MSH1 endógeno con una meganucleasa o nucleasa con dedos de cinc; (III) mutagénesis química seguida de examen de alto rendimiento para identificar plantas que comprenden mutaciones puntuales u otras mutaciones en un gen MSH1 endógeno; o (IV) introduciendo un ácido nucleico que proporciona supresión de MSH1 en la célula vegetal;
    b. recuperar plantas de progenie de la planta o célula vegetal parental de la etapa (a) en la que está restaurada la función MSH1; y
    c. seleccionar una línea de plantas de progenie que presenta uno o más rasgos útiles de las plantas de progenie recuperadas de la etapa (b), o un cruce de las mismas, siendo dichos rasgos hereditarios, reversibles y provocados por uno o más loci cromosómicos alterados en el núcleo de las células vegetales de progenie, habiendo experimentado dichos loci cromosómicos alterados un cambio epigenético, habiéndose inducido dichos loci cromosómicos alterados mediante la supresión de MSH1, y seleccionándose dichos rasgos del grupo que consiste en rendimiento mejorado, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico, siendo en particular dicho rasgo un rendimiento vegetal mejorado; presentando dicha planta de la línea de plantas de progenie seleccionada una mejora en dicho rasgo en relación con una planta parental que no se había sometido a supresión de la expresión de MSH1 sino que era isogénica de otro modo con respecto a dicha primera planta o célula vegetal parental, y comprendiendo la planta los loci cromosómicos alterados asociados con el rasgo.
  2. 2. - La planta según la reivindicación 1, en la que dicho rasgo está asociado con la metilación de ADN cromosómico de uno o más loci cromosómicos alterados en el núcleo de las células vegetales de progenie.
  3. 3. - La planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la supresión de MSH1 en dicha primera planta o célula vegetal parental se consigue con un transgén seleccionado del grupo de transgenes que suprimen la expresión de MSH1 produciendo un ARN inhibidor pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un ARN sentido cosupresor y/o un ARN antisentido.
  4. 4. - La planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha planta es una planta de cultivo, particularmente una planta de cultivo seleccionada del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, colza, trigo, arroz, tomate, tabaco, mijo, patata y sorgo.
  5. 5. - La planta según la reivindicación 4, en la que dicha planta de cultivo es sorgo.
  6. 6. - La planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho rasgo es un rendimiento vegetal mejorado.
  7. 7. - Simiente obtenida a partir de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la simiente o una planta obtenida a partir de la misma presenta la mejora en dicho rasgo y en la que la simiente comprende los loci cromosómicos alterados o mutados asociados con el rasgo.
  8. 8. - La simiente según la reivindicación 7, en la que dicho rasgo es un rendimiento vegetal mejorado.
  9. 9. - Un método para identificar en una planta uno o más loci cromosómicos alterados que han experimentado un cambio epigenético hereditario y reversible que puede conferir un rasgo útil, en el que dicho rasgo se selecciona del grupo que consiste en rendimiento mejorado, resistencia al estrés biótico y resistencia al estrés abiótico, en particular en el que dicho rasgo es un rendimiento vegetal mejorado, comprendiendo dicho método las etapas de: a) comparar una o más regiones cromosómicas en una planta de referencia que no presenta dicho rasgo útil con una o más regiones cromosómicas correspondientes en una planta de prueba que sí presenta dicho rasgo útil, expresando dicha planta de prueba MSH1 y habiéndose obtenido a partir de una planta o célula vegetal parental en la que se ha suprimido MSH1;
    b) opcionalmente aislar una planta o planta de progenie que comprende dicho locus cromosómico alterado u obtener un ácido nucleico asociado con dicho locus cromosómico alterado;
    c) y seleccionar uno o más loci cromosómicos alterados presentes en dicha planta de prueba que están ausentes en dicha planta de referencia y que están asociados con dicho rasgo útil, habiéndose inducido los loci cromosómicos alterados mediante la expresión de MSH1 y estando en el núcleo de la planta de prueba células, especialmente comprendiendo dichos loci cromosómicos alterados un estado de metilación de ADN cromosómico, una modificación postraduccional de una proteína histona asociada con un locus cromosómico, o cualquier combinación de los mismos.
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