BR112020010655A2 - gene de milho krn2 e usos do mesmo - Google Patents

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Jiansheng Li
Wenkang Chen
Xuan Zhang
Lichun Cai
Yirong Zhang
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Abstract

São fornecidos aqui o gene KRN2 que controla o número de linha do kernel na planta, marcadores moleculares intimamente ligados ao KRN2 e sua aplicação no melhoramento molecular.

Description

GENE DE MILHO KRN2 E USOS DO MESMO Campo de Invenção
[001] A presente invenção refere-se ao campo da genética de plantas e melhoramento molecular. Em particular, o presente pedido refere-se ao gene KRN2 que controla o número de linha do núcleo (KRN) na planta, marcadores moleculares intimamente ligados ao KRN2 e sua aplicação no melhoramento molecular. Estado da Técnica
[002] O milho é útil como alimento ou ração e é a maior colheita de alimentos do mundo. Nos últimos anos, a produção total de grãos da China alcançou "doze aumentos consecutivos" e o milho teve um papel importante. O aumento da produção de milho tem um significado estratégico importante para salvaguardar a segurança alimentar da China. No entanto, com o ajuste da estrutura de plantio, a área de plantio de milho da China mostrará uma tendência de queda, enquanto a demanda de milho continuará mantendo uma tendência de crescimento rígido com o rápido desenvolvimento da economia nacional e a melhoria contínua do padrão de vida das pessoas. Portanto, aumentar a produção de milho é uma maneira importante de aumentar a produção total de grãos na China. É de grande importância estudar a base genética da característica de produção de milho para aumentar a produção de milho.
[003] O rendimento do milho é uma característica quantitativa extremamente complexa. Entre os muitos fatores que contribuem para o rendimento do milho, o peso de 100 grãos, o número de linhas do grão e o número de grãos por linha estão os fatores decisivos que afetam o rendimento do milho. O número de linha do núcleo (KRN) refere-se ao número de linhas do núcleo da espiga, que é um dos fatores mais importantes que contribuem para a característica de produção de milho e está significativamente correlacionado positivamente com a produção. KRN é uma característica controlada por múltiplos genes ou loci. No processo de domesticação e melhoramento genético do milho, o KRN é fortemente selecionado. Portanto, a clonagem dos loci de características quantitativas maiores e menores (QTL) que afetam a variação quantitativa do KRN e, posteriormente, a compreensão da base genética do KRN têm grande significado para a compreensão do mecanismo de formação da característica de produção de milho e do modo de seleção de alelos excelentes no melhoramento genético. Enquanto isso, também fornece orientações teóricas importantes para o melhoramento molecular e o melhoramento genético de características como a produção de milho.
[004] No entanto, o genoma do milho é muito complicado e é muito difícil realizar a clonagem baseada em mapas de locais quantitativos de características. O principal princípio da clonagem baseada em mapas é clonar genes com base em suas posições relativas no mapa genético. Em primeiro lugar, uma população primária de QTL é usada para realizar o mapeamento preliminar das características quantitativas estudadas e, em seguida, combinada com retrocruzamento e seleção assistida por marcadores moleculares, o QTL alvo é selecionado em primeiro plano quando a seleção negativa do fundo é realizada. Linhas próximas isogênicas, linhas de substituição de fragmentos cromossômicos ou linhas de progressão do QTL alvo são desenvolvidas e usadas para produzir populações isoladas maiores. Então, iniciadores específicos são projetados contra a região alvo, para localizar finamente o QTL e restringir o QTL alvo a uma pequena região genômica. Nesta base, o método de caminhada cromossômica é usado para construir contigs que cobrem a região alvo e para identificar os genes candidatos do local. Finalmente, os genes candidatos são analisados e previstos por suas características de sequência e produtos de codificação, cujas funções são ainda verificadas por análise de expressão ou ensaio complementar. Atualmente, o intervalo de confiança de QTL geralmente é superior a 10cM, o que pode incluir um QTL principal ou vários QTLs de micro- efeitos, em que a clonagem de vários QTLs de micro-efeitos aumenta ainda mais a dificuldade.
[005] Atualmente, o melhoramento molecular é uma rota importante para o aprimoramento genético do milho, e a clonagem de genes-alvo é um pré- requisito para a obtenção de novas variedades com características-alvo ideais por meio de técnicas de melhoramento molecular. O KRN é um dos principais fatores que contribuem para o rendimento do milho. Aumentar o KRN do milho tem um papel importante no aumento do rendimento. Portanto, a clonagem de genes relacionados ao KRN do milho pode fornecer novos genes para a criação de variedades de alto rendimento, que desempenham um papel importante no aprimoramento genético da produção de milho. Além disso, o estudo de genes relacionados ao KRN de milho também fornece informações importantes para o estudo de características semelhantes ao KRN ou genes homólogos em outras culturas, como arroz, trigo, cevada e sorgo. Descrição
[006] Um objetivo da invenção é fornecer a proteína KRN2 e seu gene codificador relacionado ao número de linhas do núcleo nas plantas.
[007] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma proteína isolada ou purificada, que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste em: (1) uma sequência de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 1; e (2) uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 e tem a atividade de regular o número de linhas do núcleo em plantas.
[008] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que regula o número de linhas do núcleo nas plantas. De preferência, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo que consiste em: (1) uma sequência de ácido nucleico como estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3, ou uma sequência complementar à mesma; (2) uma sequência de ácido nucleico como estabelecido nas posições 310- 2400 da SEQ ID NO: 3, ou uma sequência complementar à mesma;
(3) uma sequência de ácido nucleico que possui pelo menos 70% de identidade com a sequência de ácido nucleico, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou nas posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3 e tem a atividade de regular o número de linhas do núcleo em plantas ou uma sequência complementar; e (4) uma sequência de ácido nucleico que hibrida com as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3 sob condições rigorosas e tem a atividade de regular o número de linhas de kernel em plantas ou um sequência complementar à mesma.
[009] Como aqui utilizado, o termo "condição rigorosa" geralmente se refere à condição descrita em Sambrook et al., 1989 e Haymes et al., Hibridização de ácido nucleico, Uma abordagem prática, IRO Press, Washington, DC (1985). As condições rigorosas adequadas para a hibridação do DNA são conhecidas dos especialistas na técnica, como lavagem com 6,0 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 45 ℃, seguida de lavagem com 2,0 X SSC a 50 ℃ ou pode ser encontrada em Current Protocolos em Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode variar de uma condição rigorosa baixa de cerca de 2,0 X SSC a 50 ℃ a uma condição rigorosa alta de cerca de 0,2 X SSC a 50 ℃. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode aumentar de uma condição estrita baixa de temperatura ambiente (cerca de 22 ℃) para uma condição estrita alta de cerca de 65 ℃. A temperatura e o sal podem mudar, ou um deles permanece o mesmo enquanto o outro muda. Por exemplo, uma condição rigorosa média pode ser uma concentração de sal de 2,0 X SSC e uma temperatura de 65 ℃, e uma condição rigorosa alta pode ser uma concentração de sal de 0,2 X SSC e uma temperatura de 65 ℃. Em uma modalidade, a condição rigorosa usada para hibridação de ácido nucleico no presente pedido refere-se a uma hibridação a 65 ℃ em solução de SDS a 0,5%, em que o filme é lavado uma vez sucessivamente com 2 X SSC + 0,1% SDS e 1 X SSC + 0,1 % De SDS a 65 ℃.
[010] Um técnico no assunto sabe que "número de kernel por orelha" ou "KRN" é uma característica quantitativa que mede o número de núcleos em uma orelha. Com base em diferentes formas de orelhas, o número de grãos por orelha em plantas diferentes pode consistir em diferentes fatores. Por exemplo, no milho, trigo e cevada, o número de grãos por espiga geralmente consiste em KRN e número de grãos por linha; enquanto no arroz e sorgo, esse parâmetro consiste no número de filial e no número de grãos por filial. Em Arabidopsis, o número de grãos depende do número de inflorescência. Assim, o termo "número de linha do kernel" ou "KRN" usado aqui não inclui apenas a característica "número da linha do kernel" no milho, trigo e cevada, mas também inclui características semelhantes ao "número da linha do kernel" em arroz e sorgo, como “Número da filial”, bem como características semelhantes em outras plantas, como o número de inflorescência em Arabidopsis. De fato, o mecanismo genético interno que regula a característica "número de linha do kernel" em diferentes plantas compartilha certas propriedades comuns, por exemplo, todas envolvem a regulação do desenvolvimento da inflorescência nas plantas (ver, por exemplo, Junko Kyozuka, Hiroki Tokunaga e Akiko Yoshida. Controle da grama opinião atual em Plant Biology 2014, 17: 110–115). Por conseguinte, um especialista na técnica pode razoavelmente esperar que o gene KRN2 de acordo com a presente invenção possa não apenas regular o número de linha do kernel no milho, mas também pode regular características semelhantes ao "número da linha do kernel" em outras plantas, como o núcleo acima mencionado número de linha em culturas como trigo, número de ramificação do arroz e número de inflorescência de Arabidopsis.
[011] Como aqui utilizado, o termo "identidade de sequência" refere-se à extensão em que duas sequências polinucleotídicas alinhadas de maneira ideal ou duas sequências polipeptídicas de alinhamento ideal são idênticas. O alinhamento ideal da sequência é estabelecido pelo alinhamento manual de duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência de DNA, de modo a maximizar a correspondência de nucleotídeos nos alinhamentos de sequências com inserções, deleções ou lacunas internas apropriadas. Como aqui utilizado, o termo "sequência de referência" refere-se à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou à sequência de ácidos nucleicos estabelecida nas SEQ ID NOs: 2 e 3 e nas posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3.
[012] Conforme usado neste documento, o termo "% de identidade de sequência" ou "% de identidade" refere-se à taxa de identidade multiplicada por
100. Por "porcentagem de identidade" de uma sequência alinhada otimamente a uma sequência de referência, significa o número de nucleotídeos correspondentes em um ambiente ideal alinhamento dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, como o número total de nucleotídeos em toda a sequência de referência completa. Assim, uma modalidade da presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% de identidade com uma sequência de referência quando alinhado otimamente com a referida sequência de referência, isto é, a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1 ou a sequência de ácido nucleico apresentada nas SEQ ID NOs: 2 e 3 ou nas posições 310-2400 da SEQ ID NO:
3.
[013] O gene de acordo com a presente invenção também inclui sequências variantes derivadas de deleção, substituição, inserção ou adição em um ou mais nucleotídeos do gene KRN2, que mantém a atividade reguladora do gene
KRN2. A mutação genética é um fenômeno variável súbito herdável ocorrido na molécula de DNA genômico. No nível molecular, a mutação genética refere-se a alteração na composição do par de bases ou na sequência de arranjos ocorridas na estrutura do gene. A mutação genética pode ser espontânea ou induzível, e os métodos de mutagênese artificial incluem mutagênese física (como raios gama, raios-x, luz ultravioleta e fluxo de nêutrons), mutagênese química (como agentes alquilantes, análogos de base e antibióticos) e biológicos mutagênese (como certos vírus e bactérias, etc.). Além disso, a mutagênese direcionada pode ser alcançada usando técnicas de DNA recombinante para fazer alterações específicas nas moléculas de DNA em locais específicos. Qualquer um desses métodos de mutagênese bem conhecidos pode ser usado para obter sequências variantes do gene KRN2 compreendendo mutação, exclusão, substituição, inserção ou adição em um ou mais nucleotídeos.
[014] De preferência, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está operacionalmente ligada a um promotor heterólogo, para formar uma molécula de DNA recombinante.
[015] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um cassete de expressão compreendendo a molécula de DNA recombinante da presente invenção, um vetor recombinante compreendendo a referida cassete de expressão, uma célula hospedeira compreendendo o referido vetor recombinante e uma célula vegetal transgênica, a planta transgênica e partes vegetais compreendendo referida molécula de DNA recombinante.
[016] Conforme usado neste documento, "parte da planta" inclui, entre outras, folhas, caule, raiz, tubérculo, sementes, endosperma, óvulo e pólen. A parte da planta da invenção pode ser viável, não viável, regenerável e/ou não regenerável. A presente invenção também abrange e fornece células vegetais transformadas compreendendo a molécula de DNA da invenção. A célula vegetal transformada ou célula vegetal transgênica da invenção compreendendo células vegetais regeneráveis e/ou não regeneráveis.
[017] A planta da invenção inclui monocotiledôneas e dicotiledôneas. Especificamente, as plantas nas quais a expressão do gene KRN2 é inibida para aumentar o rendimento podem ser selecionadas a partir das plantas da colheita, como milho (milho; Zea mays), soja (Glycine max), algodão (Gossypium hirsutum; Gossypium sp.), Amendoim (Arachis hypogaea), cevada (Hordeum vulgare); aveia (Avena sativa); grama de pomar (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sativa, incluindo as variedades indica e japonica); sorgo (Sorghum bicolor); cana-de-açúcar (Saccharum sp.); festuca alta (Festuca arundinacea); espécies de relva (por exemplo, espécies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); trigo (Triticum aestivum); alfafa (Medicago sativa); Arabidopsis (Arabidopsis thaliana); membros do gênero Brassica, incluindo brócolis, couve, cenoura, couve-flor, couve chinesa; pepino, feijão seco, berinjela, tabaco, erva-doce, feijão, cabaça, alho-porro, alface, melão, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, milho doce, tomate, melancia, plantas ornamentais e outras culturas de frutas, vegetais, tubérculos, sementes oleaginosas e raízes, em que as culturas oleaginosas incluem soja, canola, colza, dendê, girassol, oliva, milho, algodão, amendoim, linhaça, açafrão e coco.
[018] Os inventores mostraram que a expressão do gene KRN2 está negativamente relacionada ao número da linha do kernel. Assim, inibindo a expressão do gene KRN2, podem ser obtidas plantas com número de linha de núcleo aumentado, assim um rendimento aumentado. Por conseguinte, outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir uma planta transgênica com maior número de linhas do núcleo ou maior rendimento, compreendendo a obtenção de uma célula vegetal transgênica com expressão inibida do gene KRN2 ou seus produtos genéticos em comparação com um tipo selvagem planta e regeneração de uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal transgênica Os métodos de inibição da expressão de um gene alvo ou produto gênico do mesmo, são conhecidos na técnica, como inserção de transposição, mutagênese, inibição mediada por RNA, edição de genes e similares. No contexto do presente pedido, o termo "gene KRN2" refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos capaz de produzir a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferencial, o gene KRN2 aqui refere-se à sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3.
[019] Em uma modalidade do método, a planta transgênica com número de linha do núcleo aumentado ou rendimento aumentado é produzida através da introdução de uma mutação genética no gene KRN2 que resulta em uma expressão inibida do gene KRN2 em uma planta. Exemplos de mutação genética incluem, sem limitação, mutação knock-out, uma mutação truncada, uma mutação pontual, uma mutação, uma mutação de substituição, uma mutação de frameshift, uma mutação de inserção, uma mutação de duplicação, uma mutação de amplificação, uma mutação de translocação ou uma mutação de inversão e qualquer outra mutação genética que resulte em uma redução ou inativação na atividade genética correspondente. Os métodos para gerar pelo menos uma mutação em um gene alvo são bem conhecidos na arte e incluem, sem limitação, mutagênese e rastreamento aleatórios, mutagênese direcionada ao local, mutagênese por PCR, mutagênese insercional, mutagênese física, mutagênese química e irradiação. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico físico ou químico adequado, uso de um oligonucleotídeo adequado, sujeitando a sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de agentes mutagênicos físicos e químicos incluem, sem limitação, irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), N-metil-N'-nitrosoguanidina (NTG) O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metanossulfonato de etila (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeos. Quando tais agentes são utilizados, a mutagênese é tipicamente realizada incubando as células ou tecidos vegetais a serem mutagenizados na presença do agente mutagênico de escolha sob condições adequadas e, em seguida, selecionando os mutantes que exibem expressão reduzida ou inexistente do gene alvo.
[020] Em uma modalidade do método, a planta transgênica com número de linha do núcleo aumentado ou rendimento aumentado é produzida pela inibição mediada por RNA da expressão do gene KRN2 em uma planta. Em particular, a referida inibição mediada por RNA da expressão do gene KRN2 é alcançada introduzindo em uma célula vegetal um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA compreendendo uma sequência que é essencialmente complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contínuos do gene KRN2 ou fragmentos dos mesmos, em que o a expressão do polinucleotídeo resulta na expressão inibida do gene KRN2 na referida planta. Uma construção compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA compreendendo uma sequência que é essencialmente complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contínuos do gene KRN2 ou seus fragmentos, em que a expressão da construção resulta em expressão inibida do gene KRN2 na referida planta também abrangidos no âmbito da invenção.
[021] Em uma modalidade, o polinucleotídeo acima que codifica uma molécula de RNA abrange oligonucleotídeos com um comprimento de 15-25 nucleotídeos (15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22 mers, 23 mers, 24 mers ou 25 mers) ou seus fragmentos, ou polinucleotídeos de comprimento médio com um comprimento de 26 ou mais nucleotídeos (polinucleotídeos de 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 280, cerca de 290 ou cerca de 300 nucleotídeos) ou seus fragmentos ou polinucleotídeos longos tendo um comprimento maior que cerca de 300 nucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos entre cerca de 300 a cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 400 t o cerca de 500 nucleotídeos, entre cerca de 500 a cerca de 600 nucleotídeos, entre cerca de 600 a cerca de 700 nucleotídeos, entre cerca de 700 a cerca de 800 nucleotídeos, entre cerca de 800 a cerca de 900 nucleotídeos, entre cerca de 900 a cerca de 1000 nucleotídeos, entre cerca de 900 a cerca de 1000 nucleotídeos, entre cerca de 300 a cerca de 500 nucleotídeos, entre cerca de 300 a cerca de 600 nucleotídeos, entre cerca de 300 a cerca de 700 nucleotídeos, entre cerca de 300 a cerca de 800 nucleotídeos, entre cerca de 300 a cerca de 900 nucleotídeos, ou cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, ou até mais de 1000 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, até todo o comprimento de um gene alvo, incluindo porções codificadoras ou não codificantes ou ambas codificantes e não codificadoras do gene alvo), em que os polinucleotídeos ou seus fragmentos são homólogos ou complementares ao gene KRN2 alvo, e suprime a expressão do gene KRN2 alvo quando expresso em uma célula vegetal.
[022] Muitos métodos de inibição mediados por RNA são conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de moléculas de RNA usadas nos métodos de inibição mediada por RNA incluem, mas não estão limitados a, RNAs anti- sentido, miRNAs, siRNAs e RNAs não codificantes longos. O RNA anti-sentido é um RNA de fita simples que é complementar a uma fita de RNA mensageiro (mRNA) transcrita em uma célula. Quando o RNA antisense é expresso em uma célula, ele se liga a uma molécula de RNA mensageiro específica e a inativa. Um siRNA é uma molécula de RNA de fita dupla, com 20 a 25 pares de bases. Após a separação em cadeias simples e a integração em um complexo RISC ativo, ele emparelha-se em base ao seu mRNA alvo e induz a clivagem do mRNA alvo, impedindo, assim, que seja usado como modelo de tradução. Um miRNA é um RNA pequeno, tipicamente cerca de 21 nucleotídeos, que tem a capacidade de modular a expressão de um gene alvo, ligando-se ao mRNA da proteína alvo, levando à desestabilização ou inibição da tradução do mRNA da proteína alvo, resultando finalmente na redução de a proteína alvo. Os métodos para selecionar e projetar siRNAs e miRNAs para inibição de genes são bem conhecidos na técnica. RNAs não codificadores longos (ncRNA longo ou IncRNA) são transcritos não codificadores de proteínas com mais de 200 nucleotídeos (Perkel, BioTechniques, 54 (6): 301-304 (2013)). Em contraste com muitos pequenos RNAs que exibem forte conservação em diversas espécies, os ncRNAs longos geralmente não possuem uma forte conservação. Os ncRNAs longos podem ser classificados, de acordo com a proximidade com os genes codificadores de proteínas no genoma, em cinco categorias; sentido, antisense, bidirecional, intrônico e intergênico e regula a expressão gênica por meio de um grupo diverso de mecanismos, como transcrição gênica (por exemplo, através da regulação de transcrição específica por gene e regulação de máquinas de transcrição basal), regulação pós-transcricional (por exemplo , por emenda de mRNA, tradução e regulação de genes direcionados a siRNA) ou por regulação epigenética. O efeito de um siRNA, um miRNA ou um RNA longo não codificante na inibição do gene alvo pode ser avaliado por uma comparação da expressão do repórter beto-glucuronidase ou uidA (GUS).
[023] O polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA da presente invenção pode ser RNA de fita simples ou dupla ou DNA de fita simples ou dupla ou híbridos de DNA/RNA de fita dupla ou híbridos de DNA/RNA de fita dupla ou seus análogos modificados e pode ter comprimentos de oligonucleotídeo ou mais. Em modalidades mais específicas da invenção, os polinucleotídeos que fornecem molécula de RNA da invenção na célula vegetal são selecionados do grupo que consiste em (a) uma molécula de RNA de fita simples (ssRNA), (b) uma molécula de RNA de fita simples que se auto-hibrida para formar uma molécula de RNA de fita dupla, (c) uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA), (d) uma molécula de DNA de fita simples (ssDNA), (e) uma molécula de DNA de fita simples que se auto - hibrida para formar uma molécula de DNA de fita dupla e (f) uma molécula de DNA de fita simples, incluindo um gene Pol III modificado que é transcrito para uma molécula de RNA, (g) uma molécula de
DNA de fita dupla (dsDNA), (h) uma molécula de DNA de fita dupla incluindo um gene Pol III modificado que é transcrito para uma molécula de RNA, (i) uma molécula de RNA/DNA hibridizada de fita dupla ou suas combinações. Em algumas modalidades, esses polinucleotídeos incluem nucleotídeos quimicamente modificados ou nucleotídeos não canônicos. Em modalidades do método, os polinucleotídeos incluem DNA de fita dupla formado por hibridação intramolecular, DNA de fita dupla formado por hibridação intermolecular, RNA de fita dupla, formado por hibridação intramolecular ou RNA de fita dupla, formado por hibridização intermolecular. Em uma modalidade, os polinucleotídeos incluem DNA de fita simples ou RNA de fita simples que se auto-hibridam para formar uma estrutura em gancho de cabelo tendo uma estrutura em pelo menos parcialmente de fita dupla incluindo pelo menos um segmento que hibridará com o RNA transcrito a partir do gene direcionado para supressão. Não pretendendo estar ligado a nenhum mecanismo, acredita-se que esses polinucleotídeos sejam ou produzam RNA de fita simples com pelo menos um segmento que hibridará com o RNA transcrito a partir do gene direcionado para inibição. Em certas outras modalidades, os polinucleotídeos incluem ainda um promotor, geralmente um promotor funcional em uma planta, por exemplo, um promotor de pol II, um promotor de pol III, um promotor de pol IV, ou um promotor de pol V.
[024] Um técnico no assunto está ciente de que os polinucleotídeos de acordo com a invenção têm complementaridade de sequência que não precisa ser de 100%, mas é pelo menos suficiente para fornecer uma molécula de RNA que permita a hibridização com o RNA transcrito a partir do gene alvo ou DNA do gene alvo para formar um duplex para permitir um mecanismo de silenciamento de genes. Assim, nas modalidades, um fragmento de polinucleotídeo é projetado para ser essencialmente idêntico ou essencialmente complementar a uma sequência de 15 ou mais nucleotídeos contíguos na sequência do gene KRN2 alvo ou no RNA mensageiro transcrito a partir do gene alvo. Por "essencialmente idêntico" significa ter 100% de identidade de sequência ou pelo menos cerca de 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência quando comparado à sequência de pelo menos 15 ou mais nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contíguos) no gene alvo ou no RNA transcrito a partir do gene alvo; por "essencialmente complementar" significa ter 100% de complementaridade de sequência ou pelo menos cerca de 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, Complementaridade de sequência de 95, 96, 97, 98 ou 99% quando comparada à sequência de pelo menos 15 ou mais nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contíguos) no gene alvo ou no RNA transcrito a partir do gene alvo. Em algumas modalidades, as moléculas de polinucleotídeo são projetadas para ter 100% de identidade de sequência ou complementaridade com um alelo ou um membro da família de um determinado gene alvo.
[025] Os métodos para identificar ou projetar os polinucleotídeos da invenção são conhecidos na técnica. Por exemplo, os referidos polinucleotídeos podem ser identificados por "lado a lado" os alvos genéticos com sondas parcialmente sobrepostas ou sondas não sobrepostas de polinucleotídeos antisense ou sensorial que são essencialmente idênticas ou essencialmente complementares à sequência nucleotídica de um gene endógeno. Eles também podem ser agrupados em alguns tratamentos para investigar moléculas de polinucleotídeo que cobrem uma porção de uma sequência de genes (por exemplo, uma porção de uma codificação versus uma porção de uma região não codificante ou uma porção 5 'versus 3' de um gene) ou uma sequência de genes inteira incluindo regiões codificantes e não codificadoras de um gene alvo. As moléculas de polinucleotídeo reunidas podem ser divididas em conjuntos menores ou moléculas únicas, a fim de identificar moléculas de polinucleotídeo eficazes que proporcionam o efeito desejado.
[026] Numa modalidade do método, a planta transgênica com número de linha do núcleo aumentado ou rendimento aumentado é produzida editando o gene do gene KRN2 em uma planta, inibindo assim a expressão do gene KRN2 na referida planta.
[027] Como usado aqui, o termo "edição de genes" refere-se à mutagênese direcionada de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 , ou pelo menos 10 nucleotídeos de uma sequência de ácido nucleico do genoma da planta endógena ou remoção ou substituição de uma sequência de ácido nucleico do genoma da planta endógena. Em um aspecto, uma sequência de ácido nucleico editada aqui fornecida tem pelo menos 99,9%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 94%, pelo menos 93%, pelo menos 92%, pelo menos 91%, pelo menos 90% , pelo menos 85%, pelo menos 80% ou pelo menos 75% de identidade de sequência com o ácido nucleico endógeno de interesse.
[028] Numa concretização preferida, a edição do gene é conseguida fornecendo uma endonuclease selecionada de uma meganuclease, uma endonuclease de dedo de zinco, uma endonuclease TALEN ou uma endonuclease CRISPR. Numa modalidade específica, a endonuclease CRISPR é uma endonuclease CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, CRISPR/CasX ou CRISPR/CasY.
[029] As meganucleases, comumente encontradas em espécies microbianas, têm a propriedade única de ter sequências de reconhecimento muito longas (> 14pb), tornando-as naturalmente muito específicas. No entanto, não há praticamente nenhuma chance de encontrar a meganuclease exata necessária para atuar em uma sequência de DNA específica. Para superar esse desafio, métodos de rastreio de mutagênese e alta produtividade foram usados para criar variantes de meganucleases que reconhecem seqüências únicas. Outros foram capazes de fundir várias meganucleases e criar enzimas híbridas que reconhecem uma nova sequência. Ainda outros tentaram alterar os aminoácidos que interagem com o DNA da meganuclease para projetar meganucelases específicas de sequência em um método chamado meganuclease racionalmente projetado.
[030] As endonucleases “de dedo” de zinco (ZFNs) reconhecem o DNA alvo de maneira modular: cada endonuclease consiste em pelo menos três domínios de dedo de zinco e um único domínio de dedo de zinco interage com uma sequência de 3 bp, tornando-as proteínas de ligação a DNA programáveis específicas da sequência ideais.
[031] Os TALENs surgiram como uma alternativa competitiva aos ZFNs em
2011. Ao contrário “dos dedos” de zinco, cada domínio repetido nas proteínas TALE reconhece uma única base. Quatro domínios de repetição diferentes podem ser misturados e combinados para criar novas proteínas de ligação ao DNA, que podem ser ligadas ao domínio FokI para criar uma nova classe de nucleases de DNA alvo programáveis. Essas moléculas permitem direcionamento e corte precisos em um locus genômico específico para gerar quebras de fita dupla (DSBs) seguidas de junção final não homóloga (NHEJ) ou reparo mediado por reparo dirigido por homologia (HDR), permitindo assim uma edição precisa do genoma.
[032] O sistema de repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas em cluster (CRISPRs) constitui um sistema imune adaptativo em procariontes que visa a clivagem endonucleolítica de fagos invasores. Os sistemas CRISPR contam com pequenos RNAs para detecção específica da sequência e direcionamento de ácidos nucleicos estranhos para destruição. Os componentes dos sistemas bacterianos de CRISPR são genes associados a CRISPR (Cas) e matriz (s) CRISPR consistindo em sequências genoma-alvo (protospacers) intercaladas com pequenas repetições palindrômicas. A transcrição dos elementos protospacer/repeat em moléculas precursoras de RNA CRISPR (pré-crRNA) é seguida por clivagem enzimática desencadeada por hibridação entre uma molécula de RNA trans-CRISPR (tracrRNA) de ação trans e uma repetição palindrômica pré-crRNA. As moléculas de crRNA: tracrRNA resultantes, consistindo em uma cópia do espaçador e uma repetição, complexam com uma nuclease de Cas. O complexo CRISPR / Cas é então direcionado para seqüências de DNA (protospacer) complementares à sequência espaçadora de crRNA, onde esse complexo de proteína RNA-Cas silencia o DNA alvo por meio de clivagem enzimática de ambas as cadeias.
[033] O sistema CRISPR bacteriano nativo do tipo II requer quatro componentes moleculares para a clivagem direcionada de DNAs exógenos: uma endonuclease Cas (por exemplo, Cas9), a RNaseIII de manutenção da casa, o RNA CRISPR (crRNA) e o RNA CRISPR de ação trans (tracrRNA). Os dois últimos componentes formam um complexo dsRNA e se ligam a Cas9, resultando em um complexo de endonuclease de DNA guiado por RNA. Para modificações direcionadas do genoma em eucariotos, esse sistema foi simplificado para dois componentes: a endonuclease Cas9 e um crRNA- tracrRNA quimérico, chamado RNA-guia (gRNA) ou, alternativamente, RNA de guia único (sgRNA). Experiências conduzidas inicialmente em sistemas eucarióticos determinaram que o componente RNaseIII não era necessário para alcançar a clivagem direcionada do DNA. O sistema mínimo de dois componentes do Cas9 com o sgRNA, como o único componente exclusivo, permite que este sistema CRISPR de modificação do genoma direcionado seja mais econômico e flexível do que outras plataformas de direcionamento, como meganucleases, nucleases de dedo de Zn ou nucleases de TALE que requerem engenharia de proteínas para modificação em cada local de DNA alvo. Além disso, a facilidade de design e produção de sgRNAs fornece ao sistema CRISPR várias vantagens para a aplicação da modificação do genoma direcionado. Por exemplo, os componentes do complexo CRISPR/Cas (endonuclease Cas, sgRNA e, opcionalmente, DNA exógeno para integração no genoma) projetados para um ou mais locais de destino genômicos podem ser multiplexados em uma transformação ou na introdução do CRISPR/Cas componentes complexos podem ser separados espacial e / ou temporalmente.
[034] Além do CRISPR do tipo II, um novo CRISPR do tipo V foi descoberto nos últimos anos. Até o momento, os sistemas CRISPR do tipo V testados experimentalmente incluem o uso das seguintes proteínas efetoras que foram redesenhadas como Cas12a – e: Cas12a (também conhecida como Cpf1; subtipo VA), Cas12b (também conhecida como C2c1; subtipo VB), Cas12c (também conhecido como C2c3; subtipo VC), Cas12d (também conhecido como CasY; subtipo VD) e Cas12e (também conhecido como CasX; subtipo VE), todos evolutivamente distintos do Cas9.
[035] Assim, uma construção compreendendo uma sequência que codifica um único RNA guia projetado para atingir o gene KRN2, em que a expressão da construção em uma planta juntamente com a expressão de um gene associado a Cas resulta na expressão inibida do gene KRN2 também está englobada em o escopo da presente invenção. O gene associado ao Cas pode ser clonado na mesma construção com o RNA guia único ou em uma construção separada para expressão. Os métodos para entrega da referida construção em uma célula vegetal são conhecidos na técnica.
[036] A construção que codifica um gene associado a Cas pode compreender um promotor. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido, um promotor regulado pelo desenvolvimento ou um promotor regulado do ciclo celular. Certos promotores contemplados incluem aqueles que se expressam apenas na linha germinativa ou nas células reprodutivas, entre outros. Tais promotores regulados pelo desenvolvimento têm a vantagem de limitar a expressão do sistema CRISPR apenas àquelas células nas quais o DNA é herdado nas gerações subsequentes. Portanto, uma modificação genética mediada por CRISPR (isto é, clivagem cromossômica ou epissomal de dsDNA) é limitada apenas às células envolvidas na transmissão de seu genoma de uma geração para a seguinte. Isso pode ser útil se a expressão mais ampla do sistema CRISPR for genotóxica ou tiver outros efeitos indesejados. Exemplos de tais promotores incluem os promotores de genes que codificam DNA ligases, recombinases, replicases e assim por diante. A presente invenção também fornece às plantas transgênicas um número maior de filas de kernel ou maior rendimento produzido de acordo com o método da invenção. A presente invenção também fornece um produto de base feito a partir da planta transgênica ou de partes da planta preparada de acordo com o método da invenção. Numa modalidade, a mercadoria é concentrada de proteína, isolada de proteína, cereal, amido, sementes, farinha, farinha, biomassa ou óleo de semente.
[037] Além disso, após o mapeamento primário de qKRN2, os inventores desenvolveram novos marcadores moleculares intimamente ligados ao KRN2 e aos iniciadores correspondentes, o que é útil na triagem da característica do número de linha do kernel e abre caminho para um mapeamento mais fino do qKRN2 e seleção assistida por marcadores para acelerar o progresso da criação de milho de alto rendimento. Por conseguinte, a presente invenção fornece marcadores moleculares e iniciadores correspondentes úteis na identificação ou identificação assistencial da característica do número de linha do kernel no milho, em que os referidos marcadores moleculares estão localizados de 16,37Mb a 17,56Mb no cromossomo 2. Em uma modalidade preferencial, os marcadores moleculares são Fragmentos de DNA amplificados por PCR usando o DNA genômico de milho como modelo com pelo menos um par de iniciadores selecionados a partir de SEQ ID NOs: 4-17. A presente invenção também fornece um kit para identificar ou identificar de maneira assistencial a característica de número de linha do kernel no milho, compreendendo pelo menos um par de iniciadores correspondentes aos marcadores moleculares localizados de 16,37Mb a 17,56Mb no cromossomo 2, preferencialmente iniciadores com sequências selecionadas de SEQ ID NOs: 4-17. Em ainda outra modalidade, o kit de acordo com a presente invenção compreende ainda pelo menos um selecionado dentre dNTP, polimerase de DNA e tampão de amplificação por PCR. Além disso, a presente invenção fornece o uso dos referidos marcadores moleculares e dos iniciadores correspondentes, bem como o kit na identificação ou identificação auxiliar da característica do número de linha do caroço no milho ou na criação de milho.
[038] Figuras Figura 1: Comparação de KRN entre B73 e MT-6. a e b. Desempenho das orelhas de B73 e MT-6; c. KRN de B73 e MT-6. Figura 2: Mapa genético da população B73/MT-6 F2, em que as três caixas em cinza claro, cinza escuro e preto representam as posições QTL mapeadas usando dados de três ambientes, Hainan, Pequim e Henan, respectivamente. Figura 3: perfil de LOD do qKRN2. Figura 4: a. mapeamento fino primário de qKRN2 usando plantas recombinantes BC4F2 e BC5F1, em que qKRN2 foi reduzido a uma região entre os marcadores M8 e IDP1612; b. mapeamento fino adicional de qKRN2 usando plantas recombinantes BC4F3, BC5F2, BC5F1 e BC6F1, em que qKRN2 foi reduzido a uma região entre os marcadores M31 e MIL. Nas Figuras 4a e 4b, o genótipo de diferentes plantas recombinantes foi mostrado no painel esquerdo, em que B73/B73 homozigoto foi mostrado em caixa branca, MT-6/B73 heterozigoto em caixa preta; o fenótipo de progênie homozigótica de plantas recombinantes heterozigotas auto-mostradas foi mostrado no painel claro, em que B73/B73 homozigoto foi mostrado em cinza claro (A), MT-6/MT-6 homozigoto foi mostrado em cinza escuro (B). NA/NB denota o número do fenótipo A/B. O valor P representa a significância da diferença entre os fenótipos A e B na descendência da mesma planta recombinante. ** denota diferença estatisticamente significativa. Figura 5: a. Orelhas representativas das linhas quase isogênicas NILB73 e NIL MT-6 ; b. resultados estatísticos de KRN de NILB73 e NILMT-6; c. níveis de expressão de KRN2 na orelha imatura de NILB73 e NILMT-6. NILB73 é uma linha quase isogênica na qual o segmento alvo é o alelo B73; NILMT-6 é uma linha quase isogênica na qual o segmento alvo é o alelo MT-6. * denota diferença significativa estatisticamente; ** denota diferença estatisticamente significativa.
Figura 6: a. estrutura gênica de KRN2 e o local de inserção do transposon Mu no mutante krn2-1; b. genótipo do tipo selvagem (WT) e mutante krn2-1, em que M1 representa o resultado da amplificação por PCR usando iniciadores específicos a montante e a jusante do gene KRN2, M2 representa o resultado da amplificação por PCR usando o iniciador a jusante específico do gene KRN2 e o iniciador TIR8- 1 específico para o transposão; c.
Orelhas representativas de WT e krn2-1; d. resultados estatísticos de KRN de WT e krn2-1. ** denota diferença estatisticamente significativa.
Figura 7: Esquema do vetor pBCXUN-Myc usado para superexpressão.
Figura 8: Nível de expressão relativa do gene KRN2 (a) e os resultados estatísticos de KRN (b) em linhas de milho com excesso de KRN2 (OE) e WT. ** denota diferença estatisticamente significativa.
Figura 9: Dois locais alvos projetados para a edição de genes mediada por CRISPR/Cas9; b. resultados de sequenciação de novas linhas CR-krn2-1 e CR-krn2-2 produzidas por edição de genes mediada por CRISPR /Cas9; c. os resultados estatísticos de KRN de CR-krn2-1 e CR-krn2-2. ** denota diferença estatisticamente significativa.
Figura 10: Panículas representativas de plantas descendentes positivas de linhas transgênicas (OE) superexpressoras em arroz e Nipponbare (WT); b. níveis de expressão relativa do gene OsKRN2 nas linhas transgênicas superexpressoras (OE) em arroz e Nipponbare (WT); c-e. os resultados estatísticos dos ramos primários (c), ramos secundários (d) e número de grãos por panícula (e) nas linhas transgênicas superexpressoras (OE) no arroz e Nipponbare (WT). ** denota diferença estatisticamente significativa.
Figura 11: a.
Um site de destino único projetado para a edição de genes mediada por CRISPR/Cas9; b. resultados de sequenciação de novas linhas CR-oskrn2-1, CR-oskrn2-2 e CR-oskrn2-3 produzidas por edição de genes mediada por CRISPR/Cas9; c. panículas de arroz representativas de três linhas editadas por genes e o WT correspondente; d-f. os resultados estatísticos dos ramos primários (d), ramos secundários (e) e número de grãos por panícula (f)
nas três novas linhas editadas por genes e no WT correspondente. ** denota diferença estatisticamente significativa. Figura 12: resultados estatísticos de múltiplas características agrícolas nas linhas quase isogênicas NILB73 e NILMT-6: KRN (a), número de grãos por orelha (b), peso de grãos por orelha (c), peso de 100 grãos (d), grãos rendimento (e), peso da espiga (f), diâmetro da espiga (g), diâmetro da espiga (h), peso da espiga (i), comprimento da espiga (j), número de grãos por linha (k), altura da planta (l), espiga altura (m), dias para antese (n), dias para sedimentação (o), ângulo foliar (p), comprimento foliar (q), largura foliar (r), comprimento (s) da borla e número de ramificação da borla (t). * denota diferença significativa estatisticamente; ** denota diferença estatisticamente significativa. Exemplos
[039] A invenção será descrita em detalhes abaixo com referência às figuras e exemplos. Deverá ser entendido que as figuras e exemplos da presente invenção são apenas ilustrativos e não limitam o escopo da presente invenção de forma alguma. Os exemplos do presente pedido e as características nos exemplos podem ser combinados entre si sem contradição.
[040] Exemplo 1: Mapeamento de QTL para KRN em milho
[041] 1. Desenvolvimento de uma linhagem de milho MT-6
[042] A linhagem de milho Mo17 (187-2 × C103, América), como progenitor do sexo feminino, foi cruzada com o progenitor do sexo masculino, X26-4 (nº de acesso PI566686; Zea mays ssp. mexicana) para obter plantas de geração e progênie F1 com menos KRN foi selecionado e auto-continuamente, resultando em um material com um KRN de 6 que pode ser herdado de forma estável. O referido material é designado MT-6. A Figura 1 mostra a comparação de KRN entre B73 (BSSS, América) e MT-6.
[043] 2. Construção das populações F2 e F2:3
[044] A linhagem B73 do milho foi cruzada com MT-6 para obter F1, uma planta foi selecionada e cultivada para obter 266 plantas progênies F2, que formam a população F2. Enquanto isso, cada planta F2 foi autônoma, resultando em 266 famílias que constituem a população F 2:3.
[045] 3. Investigação de KRN nas populações F2 e F2:3
[046] 266 plantas F2 foram cultivadas em Hainan em 2010. Além disso, 266 famílias F2:3 foram cultivadas em Pequim e Henan em 2011 usando um delineamento de blocos completos casualizados. Cada família F2:3 foi cultivada em uma única linha (cada linha é de 3m, com distância de 0,67m entre as linhas) a uma densidade de 45.000 plantas/hectare. Em seguida, foi medido o KRN de cada planta na população F2 e de 8 plantas em cada família F2:3 (mostrada como um valor médio). O número da linha do kernel por orelha significa o número da linha de grãos na orelha. Os resultados são mostrados na tabela 1 a seguir. Tabela 1. KRN nas populações F2 e F2:3 Média ± Desvio População/Condição Faixa de variação Padrão F2/Hainan 11.0 ± 1.5 8.0–16.0 F2:3/Beijing 10.6 ± 1.3 8.0–14.7 F2:3/Henan 10.1 ± 1.4 8.0–14.0
[047] 4. Rastreio de marcadores polimórficos
[048] Marcadores polimórficos foram selecionados em todo o genoma de um banco de dados público de milho (http://www.maziegdb.org). Os iniciadores foram projetados contra cada marcador polimórfico e foram utilizados para amplificação por PCR com o DNA genômico de B73 e MT-6 como molde. O sistema e o procedimento para amplificação por PCR são mostrados nas seguintes Tabelas 2 e 3, respectivamente: Tabela 2. Sistema de amplificação por PCR DNA (10ng/μL) 3μL 10×buffer 1.0μL dNTP (2.5mM) 0.8μL Forward primer (10μM) 0.3μL Reverse primer (10μM) 0.3μL Taq enzyme (2.5U/μL) 0.1μL ddH2O 4.5μL Total 10μL Tabela 3. Procedimento de amplificação por PCR Temperatura Tempo Ciclos Step 1 95℃ 5 min 1 Step 2 95℃ 30 sec 36 56-62℃ 30 sec 72℃ 60 sec Step 3 72℃ 10 min 1 Step 4 15℃ keep
[049] Os marcadores moleculares polimórficos entre B73 e MT-6 foram selecionados para mapear QTL para KRN no exemplo. Finalmente, foram obtidos 192 marcadores polimórficos distribuídos em 10 cromossomos, como mostra a Figura 2.
[050] 5. Construção de um mapa de ligação e mapeamento primário de QTL para KRN
[051] Como mostrado na Figura 2, o comprimento do mapa genético da população B73/MT-6 F2, construído por 192 marcadores polimórficos, é de 1230,5 cM e a distância média entre os marcadores é de 6,4cM. Juntamente com os fenótipos (ou seja, o KRN observado), o mapeamento de QTL foi realizado para o KRN usando o mapeamento de intervalo composto (CIM)
apresentado no software Windows QTL Cartographer 2.5. O QTL que controla o KRN foi detectado no cromossomo 2, designado como qKRN2. Como mostrado na Figura 3, o valor de LOD de qKRN2 é sempre significativamente maior que o valor limite de 3,4 em diferentes gerações ou ambientes, indicando a presença de um QTL nessa região (ou seja, o resultado detectado é verdadeiro positivo). Além disso, como suportado na Tabela 4 a seguir, o qKRN2 está localizado em torno de 55,0 cM no genoma e o intervalo de confiança é de 18,2 cM (isto é, a distância genética entre o marcador umc2193 e umc1259). Esse qKRN2 explica 9,4% -16,1% da variação fenotípica e é um importante QTL que controla o KRN no milho. Tabela 4. Efeitos do qKRN2 em diferentes gerações ou ambientes Posição Contribuição Marcadores de pico geração/ Efeito Efeito Valores
QTL flanqueados do LOD condição Aditivo Dominante LOD máximo
55.0cM F2/Hainan 0.76 -0.02 8.1 9.4% umc2193- qKRN2 51.0cM F2:3/Beijing 0.82 0.1 16.9 16.1% umc1259
55.0cM F2:3/Henan 0.74 0.12 14.2 14.0%
[052] Exemplo 2. Mapeamento fino primário de qKRN2
[053] B73 foi cruzado com MT-6 para obter F1, que foi cruzado com B73 para obter BC1F1. Plantas com alelos heterozigotos no intervalo de QTL-qKRN2 foram selecionadas da população BC1F1 usando 8 marcadores entre umc2193 e umc1259 (dentre eles 7 marcadores são conhecidos: TIDP3276, IDP8454, IDP1612, IDP4525, IDP7742, IDP7551 e IDP1415; 1 marcador é recentemente desenvolvido pelos inventores: M8 entre IDP8454 e IDP1612, cujas sequências iniciadoras são mostradas como SEQ ID NOs: 4 e 5) e continuamente cruzadas com B73 até obter BC4F1. A população de BC4F1 foi autodidata, resultando em duas linhas homozigotas com QTL-qKRN2 sendo alelos B73 e MT-6, respectivamente (isto é, NILB73 e NILMT-6), que são designados como linhas isogênicas próximas.
[054] Enquanto isso, BC4F1 foi criado para obter uma população de BC4F2, e BC4F1 foi cruzado com B73 para obter uma população de BC5F1. As plantas recombinantes foram rastreadas usando os 8 marcadores moleculares acima, de cerca de 10.000 plantas BC4F2 e BC5F1, nas quais a região QTL compreende múltiplos marcadores e um ou mais marcadores são heterozigotos. As plantas recombinantes em que o local de recombinação está entre dois marcadores adjacentes diferentes foram criadas para produzir novas linhas quase isogênicas.
[055] O número de linhas do núcleo de 30 plantas NILB73 e NILMT-6 foi investigado, respectivamente, e os testes t de Student foram realizados no teste significativo. Se o valor de P for maior que 0,05, não há diferença significativa entre KRN de linhas próximas isogênicas e, portanto, a região diferente das linhas próximas isogênicas não compreende o alvo qKRN2; se o valor de P for menor que 0,05, há uma diferença significativa entre o KRN das linhas próximas isogênicas e, portanto, o alvo qKRN2 cai dentro da região diferente das linhas próximas isogênicas. Os resultados do teste t são mostrados na Figura 4a. Consequentemente, a região alvo foi reduzida ainda mais para um intervalo genômico de 2,4 Mb entre os marcadores M8 e IDP1612.
[056] Exemplo 3. Mapeamento fino adicional de qKRN2
[057] 1. Projeto de novos marcadores polimórficos
[058] Os primers foram projetados contra a sequência genômica entre os marcadores M8 e IDP1612 em B73 usando o software Primer5.0. A amplificação por PCR foi realizada no DNA genômico das plantas B73 e MT-6, usando os primers projetados, e os produtos amplificados foram isolados por eletroforese em gel. Marcadores (marcadores InDel) que resultam em produtos amplificados polimórficos entre B73 e MT-6 são usados para mapeamento fino adicional de qKRN2 no exemplo. Os marcadores InDel e as sequências iniciadoras correspondentes usadas para mapeamento fino adicional no exemplo são mostradas na Tabela 5.
Tabela 5. Marcadores InDel e sequências iniciadoras entre M8 e IDP1612 Nome Posição Upstream primer Downstream primer Produto Amplificad o (B73)
CACAAGACTACAAGGACGAGA GGCAGGAAGGAGGAAGAAGA M8 1260bp
16.37Mb （SEQ ID NO：4） （SEQ ID NO：5）
CCGCAAATCTCCGCACAC TGATCCACCGCCAAAATACAG M13 16.58Mb 1326bp （SEQ ID NO：6） （SEQ ID NO：7）
TAAGGGTGCGAATGGAAAG GGGGGACACGTCGTAGGT M20 16.85Mb 845bp （SEQ ID NO：8） （SEQ ID NO：9）
GCTCGTTCCGTAGTGTAGTCTG CAGAACCACGACTATTTATCCG M27 17.09Mb 736bp （SEQ ID NO：10） （SEQ ID NO：11）
ATGTCTCCCACTGCTGCTAC CCTCCGTGACCTCATCGTC M31 17.276Mb 397bp （SEQ ID NO：12） （SEQ ID NO：13）
AGTTGATCGCTCGTCCTG TGTCAGGTGACCCATCCC MIL 17.30Mb 903bp （SEQ ID NO：14） （SEQ ID NO：15）
ACGGGCGACGAGAAGAAC CAGCATCAGACCCTCACTACC M36 17.56Mb 973bp （SEQ ID NO：16） （SEQ ID NO：17）
[059] Novas plantas recombinantes foram pesquisadas em cerca de 18.000 plantas nas populações BC4F3, BC5F2, BC5F1 e BC6F1 usando os marcadores InDel acima. Especificamente, as linhas heterozigotas na região QTL alvo e com uma diferença significativa de KRN entre as linhas quase isogênicas foram selecionadas das populações BC4F2 e BC5F1 usadas para o mapeamento fino primário. As referidas linhas foram auto-identificadas, resultando nas populações BC4F3 e BC5F2, e as linhas BC5F1 selecionadas foram cruzadas com B73 para obter a população BC6F1. Os genótipos da região QTL alvo foram detectados pelos marcadores InDel, como mostrado na Tabela 5. Se os marcadores InDel exibem uma combinação de banda B73 e banda heterozigótica, é definido como uma planta recombinante. Se a referida combinação nunca aparecer nas populações BC4F2 e BC5F1 usadas para mapeamento fino primário, ela será definida como uma nova planta recombinante.
[060] As novas plantas recombinantes rastreadas foram selfied e foram realizados testes t para KRN das plantas descendentes. Se o valor de P for maior que 0,05, não há diferença significativa entre KRN de linhas próximas isogênicas e, portanto, a região diferente das linhas próximas isogênicas não compreende o alvo qKRN2; se o valor de P for menor que 0,05, há uma diferença significativa entre o KRN das linhas próximas isogênicas e, portanto, o alvo qKRN2 cai dentro da região diferente das linhas próximas isogênicas. Os resultados do teste t são mostrados na Figura 4b. Consequentemente, a região alvo foi reduzida ainda mais para um intervalo de cerca de 20,82 Kb entre os marcadores M31 e MIL.
[061] Com base nas sequências de referência do genoma do milho, existe apenas um gene que codifica uma proteína de repetição WD40 entre os marcadores M31 e MIL, e os inventores a designaram como gene KRN2 no presente pedido. Sabe-se que a família de proteínas repetidas WD40 desempenha múltiplos papéis no desenvolvimento das plantas, incluindo sinalização, montagem da cromatina, processamento de RNA e similares. No entanto, sua correlação com a característica de número de linha do kernel ainda não foi relatada.
[062] A sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene KRN2 é mostrada na SEQ ID NO: 1. Esta proteína consiste em 696 aminoácidos e compreende um domínio proteico, a sequência de repetição WD40 com função desconhecida.
[063] A sequência genômica (incluindo íntrons) do gene KRN2 é mostrada na SEQ ID NO: 2. Esta sequência consiste em 7421 nucleotídeos, em que os nucleotídeos 368-3367 representam uma sequência promotora. A sequência de cDNA do gene KRN2 é mostrada na SEQ ID NO: 3, que consiste em 2853 nucleotídeos, e em que os nucleotídeos 310-2400 são a sequência que codifica a proteína.
[064] Esse gene KRN2 ainda não foi clonado no milho e não há relatos de seus genes homólogos em outras plantas modelo, como Arabidopsis e arroz. Assim, é de importância significativa realizar uma análise profunda sobre esse gene.
[065] Exemplo 4. Análise de efeitos KRN2
[066] O número de linhas do núcleo de 27 plantas NILB73 e 25 plantas NILMT-6 foi investigado. Observou-se que o KRN do NILMT-6 é 1,3 filas menor que o do NILB73 (valor de P <0,01, veja a Figura 5 e a Tabela 6). Em termos de genótipo, NILB73 e NILMT-6 têm o mesmo histórico genético, com apenas a diferença na região adjacente ao marcador M31 (isto é, localização do gene KRN2). Em outras palavras, a diferença de KRN entre NILB73 e NILMT-6 é devida ao gene KRN2 localizado nessa região, um importante QTL que controla a característica de número de linha do kernel. Tabela 6. Análise dos efeitos do KRN2 IDP1 Média Valores Marcadores M8 M27 M31 MIL N Efeitos 612 KRN±SE P NILB73 A A A A A 16.71±0.24 27
6.1×10-4 -1.3 MT-6 NIL A A B A A 15.43±0.27 25 Notas: A indica marcadores iguais ao pai B73, B indica marcadores iguais ao pai MT-6.
[067] Os resultados da análise estatística acima indicam que, o QTL identificado no presente aplicativo, qKRN2, é um QTL principal que controla a característica de número de linha do kernel.
[068] Os inventores também mediram o nível de expressão de KRN2 no ouvido imaturo de NILB73 e NILMT-6 e descobriram que o gene KRN2 tem um nível de expressão significativamente mais alto no ouvido imaturo de NILMT-6 do que no ouvido imaturo de NILB73 (veja a Figura 5c), indicando que a característica do número de linha do kernel é regulada negativamente pelo gene KRN2. Ou seja, quanto maior o nível de expressão do gene KRN2, menor o número de linhas do kernel.
[069] Exemplo 5: Verificação dos efeitos do gene KRN2 no controle do número de linha do kernel no milho
[070] Um mutante de transposão Mu do gene KRN2, krn2-1, foi encomendado ao Maize Stock Center. O mutante krn2-1 possui um transposon Mu inserido no primeiro exon do gene KRN2, especificamente entre as posições 682 e 683 da SEQ ID NO: 3, como mostrado na Figura 6a. As plantas do tipo selvagem foram identificadas usando iniciadores específicos de genes (sequência iniciador a montante: TAGGCTGTAGGATGGAGATG (SEQ ID NO: 18), e a sequência iniciador a jusante GACCTTGACCCTTTCATACC (SEQ ID NO: 19)) e as plantas mutantes krn2-1 homozigotas foram identificadas usando o iniciador a jusante sequência mostrada na SEQ ID NO: 19 e um iniciador específico para transposão TIR8-1: CGCCTCCATTTCGTCGAATCCCCTS (SEQ ID NO: 20). Os resultados são mostrados na Figura 6b. A inserção do transposão no gene KRN2 foi confirmada nas plantas mutantes krn2-1.
[071] O fenótipo de plantas de tipo selvagem e mutantes de krn2-1 foram investigados. Como mostrado nas Figuras 6c e 6d, o tipo selvagem tem um KRN médio de 14,38, enquanto o mutante homozigoto krn2-1 tem um KRN médio de 16,76. Assim, o mutante krn2-1 tem um KRN significativamente aumentado em comparação com o tipo selvagem, e o KRN aumentado é de cerca de 2,38.
[072] Assim, foi confirmado que o gene KRN2 é capaz de controlar a característica de número de linha do kernel no milho.
[073] Exemplo 6. Efeitos do gene KRN2 controlando o KRN no milho verificado por sistemas de superexpressão
[074] 1. Construção de um vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína KRN2: um fragmento de nucleotídeos 310-2400 do cDNA, como mostrado na SEQ ID NO: 3, foi clonado no vetor de superexpressão pBCXUN-Myc (ver Figura 7) entre dois locais XcmI por digestão e ligação enzimática, e o promotor é o promotor de Ubiquitina. O vetor de expressão recombinante foi verificado por sequenciação.
[075] 2. O vetor de expressão recombinante foi transformado nas Agrobactérias EHA105 para obter Agrobacterias recombinantes compreendendo o vetor de expressão recombinante, que foi posteriormente utilizado para transfecção de células embrionárias de linhas de milho, de modo que a molécula de ácido nucleico foi integrada no genoma do milho para obter uma célula recombinante. Os métodos para transformação do vetor de expressão e transfecção das Agrobactérias envolvidas neste processo, bem como dos reagentes utilizados, são conhecidos dos especialistas na técnica.
[076] 3. A célula recombinante foi cultivada para obter uma plântula transgênica de milho, da qual foram coletadas pelo menos uma semente compreendendo a molécula de ácido nucleico acima em seu genoma.
[077] A referida semente foi plantada, o nível de expressão do gene KRN2 e o fenótipo KRN foram observados para as plantas cultivadas. A Figura 8 mostra o nível de expressão do gene KRN2 (veja a Figura 8a), bem como o fenótipo KRN (veja a Figura 8b) em três linhas representativas KRN2-OE1, KRN2-OE3 e KRN2-OE4. Verificou-se que o KRN das três linhas transgênicas com o gene KRN2 superexpresso tem 2 linhas a menos do que o tipo selvagem (P <0,01).
[078] Exemplo 7. Preparação de linhas de milho com aumento de KRN por edição de genes do gene KRN2
[079] 1. Construção de vetores CRISPR/Cas9, cada um compreendendo um alvo específico de gRNA no gene KRN2: foram selecionados dois locais alvo específicos de gRNA no gene KRN2 (ver Figura 9a, sequência de gRNA- KRN2-1: GGCCCTGCATTGCCGTGGT (SEQ ID NO: 23) , local de destino: nucleotídeos 3470-3488 da SEQ ID NO: 2; sequência de gRNA-KRN2-2: AGAGTGCTGCCCGGCTCCC (SEQ ID NO: 24), local de destino: nucleotídeos 3547-3565 de SEQ ID NO: 2) e dois pares de primers foram projetados de acordo. A amplificação por PCR foi realizada usando o vetor pCBC-MT1T2 como modelo. O produto de PCR foi recuperado e ligado ao vetor pBUE411 usando um sistema de ligação por digestão compreendendo endonuclease BsaI e ligase T4. Um vetor Cas9 recombinante foi obtido e verificado por PCR e sequenciamento.
[080] 2. O vetor Cas9 recombinante foi transformado nas Agrobactérias EHA105 para obter Agrobacterias recombinantes compreendendo o vetor Cas9 recombinante, que foi posteriormente utilizado para transfecção de células embrionárias de linhas de milho, de modo a obter uma célula recombinante.
[081] 3. A célula recombinante foi cultivada para obter uma muda de milho transgênico. A geração T0 foi sequenciada e identificada para os locais de destino. Foram obtidas novas linhas de milho CR-krn2-1 e CR-krn2-2 com deleção de 64 pb e 73 pb no gene KRN2, respectivamente (ver Figura 9b). Essas duas novas linhas têm perda de função no gene KRN2.
[082] As sementes das novas linhagens foram plantadas e o fenótipo KRN foi observado para as plantas cultivadas. Comparado com o controle de tipo selvagem, o KRN das duas novas linhas produzidas pela edição de genes aumentou em torno de 1,8, cuja diferença é estatisticamente significativa (veja a Figura 9c).
[083] Exemplo 8. Aplicação de marcadores InDel da invenção na triagem do material de melhoramento
[084] Marcadores InDel da invenção, como mostrado na Tabela 5, foram utilizados para detectar os genótipos dos materiais a serem rastreados. Materiais com as mesmas bandas de B73 foram selecionados como materiais excelentes, com aumento de KRN.
[085] Especificamente, os genótipos de várias amostras foram detectados por PCR usando marcadores InDel da invenção, como mostrado na Tabela 5, e a análise estatística foi realizada. Enquanto isso, o KRN de cada amostra foi contado. Os resultados são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7. Análise de KRN em diferentes amostras Marcadores Genótipo B73 Genótipo MT-6 Diferença Valores P
Número Número KRN Média Média de de
KRN KRN plantas plantas M8 33 17.03 54 15.3 1.73 6.06×10-6 M13 33 16.73 39 14.77 1.96 1.30×10-7 M20 31 18 27 16.52 1.48 8.91×10-4 M27 38 17.32 37 16 1.32 6.87×10-5 M31 26 16.77 33 15.09 1.68 7.89×10-7 MIL 34 16.76 23 15.13 1.63 9.93×10-5 M36 29 17.1 37 15.83 1.27 4.21×10-4
[086] Como mostrado na tabela acima, para o marcador M8, 33 plantas com o genótipo B73 exibiram um KRN médio de 17,03, enquanto 54 plantas com o genótipo MT-6 exibiram um KRN médio de 15,3. Ou seja, o KRN de materiais de milho com baixo nível de expressão de KRN2 na região principal de QTL é 1,73 mais do que aquele com alto nível de expressão de KRN2, cuja diferença é estatisticamente significativa. Assim, o marcador M8 pode ser usado para rastrear efetivamente materiais de milho com mais KRN, isto é, materiais de milho com baixo nível de expressão de KRN2. Os mesmos resultados foram observados nos demais marcadores M13, M20, M27, M31, MIL e M36.
[087] Consequentemente, os marcadores M8, M13, M20, M27, M31, MIL e M36 recém-desenvolvidos podem ser usados para peneirar efetivamente milho com mais KRN durante a fase de plântula, o que economiza o custo, melhora a eficiência da triagem para selecionar plantas com mais KRN em de maneira mais rápida, acelerando a criação de milho de alto rendimento.
[088] Assim, a presente invenção desenvolveu novos marcadores moleculares na região principal de QTL qKRN2 responsável pela característica de número de linha do núcleo, aumentou a abundância dos marcadores moleculares na região alvo e obteve um mapa de ligação dos marcadores moleculares na região alvo. Além disso, M8, M13, M20, M27, M31, MIL e M36 estreitamente ligados ao QTL alvo foram obtidos por uma análise de mapeamento adicional do QTL, que marcadores moleculares podem ser aplicados para rastrear a característica KRN do material de milho, de modo que as variedades de milho ou linhas com mais KRN podem ser selecionadas efetivamente. O presente pedido também fornece informações sobre marcadores para estudos relacionados ao rendimento QTL no milho.
[089] Exemplo 9. Efeitos do gene homólogo do KRN2 em Arabidopsis
[090] Os inventores pesquisaram o banco de dados Arabidopsis TIGR usando a sequência de aminoácidos do gene KRN2 de milho, e uma sequência de proteínas com o ID do gene nº AT5G53500 apresentou a maior semelhança com a proteína KRN2 (uma identidade de sequência de 40%). Este gene homólogo de KRN2 em Arabidopsis foi designado como AtKRN2. A região CDS deste AtKRN2 foi ligada ao vetor pCAMBIA 130 por digestão e ligação, de modo a obter um vetor de superexpressão de AtKRN2 com um promotor de CaMV35S. O vetor de expressão recombinante foi verificado por sequenciação.
[091] Enquanto isso, o gene AtKRN2 foi editado pelo CRISPR/Cas9. Especificamente, foram selecionados dois locais alvo específicos de gRNA no gene AtKRN2 e dois pares de iniciadores foram projetados de acordo. A amplificação por PCR foi realizada usando o vetor pCBC-MT1T2 como modelo. O produto de PCR foi recuperado e ligado ao vetor pHEE401e usando um sistema de ligação por digestão compreendendo endonuclease BsaI e ligase T4. Um vetor Cas9 recombinante foi obtido e verificado por PCR e sequenciamento.
[092] O vetor de expressão recombinante acima e o vetor Cas9 recombinante foram transformados nas Agrobactérias EHA105 para obter Agrobacterias recombinantes compreendendo o vetor de expressão recombinante e o vetor Cas9 recombinante, respectivamente, cuja Agrobacteria recombinante foi ainda usada para transfecção da inflorescência de Arabidopsis (ecótipo Columbia, geração T0), de modo a obter uma célula recombinante. A geração T0 foi selfied para obter sementes T1, e mudas positivas foram identificadas posteriormente.
[093] As sementes T1 foram plantadas e o nível de expressão do gene AtKRN2 e o fenótipo de inflorescência em Arabidopsis são observados.
[094] Exemplo 10. Efeitos do gene homólogo do KRN2 no arroz
[095] Os inventores pesquisaram o banco de dados NCBI usando a sequência de aminoácidos do gene KRN2 do milho, e uma sequência de proteína de arroz com o ID do gene OS04G0568400 (LOC_OS04G48010) apresentou a maior semelhança com a proteína KRN2 (uma identidade de sequência de 74%). Este gene homólogo de KRN2 no arroz foi designado como OsKRN2 (SEQ ID NO: 21). A região CDS deste OsKRN2 (SEQ ID NO: 22) foi ligada ao vetor pCUbi1390 por digestão e ligação, de modo a obter um vetor de superexpressão de OsKRN2 em arroz (fundo Nipponbare) derivado por um promotor de Ubiquitina. O vetor de expressão recombinante foi verificado por sequenciação.
[096] Enquanto isso, o gene LOC_OS04G48010 foi editado por CRISPR/Cas9. Especificamente, um único local alvo específico de gRNA no gene OsKRN2 foi selecionado (ver Figura 11a, sequência de gRNA-OsKRN2-1: aggttcactcgtaccggaag (SEQ ID NO: 25), local alvo: nucleotídeos 620-640 de SEQ ID NO: 21), e um par de primers foram projetados de acordo. Os iniciadores foram emparelhados para formar um dímero iniciador, que foi ligado a um CRISPR/Cas9 compreendendo o gene Cas9 utilizando um sistema de ligação por digestão compreendendo endonuclease AarI e ligase T4. Um vetor Cas9 recombinante foi obtido e verificado por PCR e sequenciamento.
[097] O vetor de expressão recombinante acima e o vetor Cas9 recombinante foram transformados nas Agrobactérias EHA105 para obter Agrobacterias recombinantes compreendendo o vetor de expressão recombinante e o vetor Cas9 recombinante respectivamente, que Agrobacteria recombinante foi ainda utilizado para transfecção de calos Nipponbare, de modo a obter uma célula recombinante. As plântulas positivas foram identificadas na geração T0 e as sementes T1 foram colhidas posteriormente.
[098] As sementes T1 foram plantadas e foram observados o nível de expressão do gene OsKRN2 e o número de grãos por panícula no arroz. Os resultados mostram que todas as três linhas de superexpressão aumentaram significativamente o nível de expressão do gene OsKRN2 (veja a Figura 10b) e diminuíram o número de grãos por panícula, ramos primários e secundários (veja a Figura 10c-e) em comparação com o controle do tipo selvagem. Além disso, um número significativamente maior de grãos por panícula, ramos primários e secundários foram observados em três linhas editadas por genes CR-oskrn2-1, CR-oskrn2-2 e CR-oskrn2-3 (veja a Figura 11).
[099] Exemplo 11. Valor potencial do gene KRN2 para melhorar o rendimento do milho
[100] As linhas quase isogênicas NILB73 e NILMT-6 foram cultivadas no mesmo ambiente de campo (cidade de Tieling, Liaoning Provence, 2017), e várias características agrícolas foram investigadas para cada planta, incluindo dias para antese, dias para sedimentação, dias para silking, altura da orelha, altura da planta, comprimento da folha, largura da folha, ângulo da folha, comprimento da borla, número de ramificação da borla e similares. Quando as orelhas foram amadurecidas e colhidas, várias características de orelhas e núcleos foram investigadas para orelhas crescidas, incluindo peso da orelha, comprimento da orelha, número de grãos por linha, número de linhas de núcleo, diâmetro da orelha, diâmetro da orelha, número de sementes por orelha, peso de semente por orelha, peso da espiga, diâmetro da espiga, peso de 100 grãos e rendimento de grãos. A experiência foi repetida duas vezes (isto é, 17TLR1 e 17TLR2).
[101] O teste t de Student foi realizado para várias características das linhas isogênicas próximas NILB73 e NILMT-6. Os resultados mostram que no NILB73, o KRN é significativamente maior que o NILMT-6, enquanto o peso de 100 kernel, o comprimento da orelha e o número de kernel por linha permanecem inalterados, resultando em um número significativamente maior de kernel por orelha, peso do kernel por orelha, obter rendimento e peso da orelha maior que o NILMT-6 (veja a Figura 12a-ce ef). Além disso, em comparação com o NILMT-6, o NILB73 também mostrou um diâmetro melhorado da orelha, diâmetro da espiga e peso da espiga (consulte a Figura 12g-i). No entanto, não houve diferença significativa nas características agrícolas medidas das plantas (ver Figura 12l-t).
[102] Estes resultados indicam que o gene KRN2 é capaz de aumentar o número de grãos por espiga, o peso do núcleo por espiga e o peso da orelha aumentando o KRN, melhorando assim o rendimento do milho, enquanto não afeta significativamente outras características agrícolas. Isso tem um valor de aplicação importante para o aprimoramento genético de novas variedades de milho de alto rendimento.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína isolada ou purificada, que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste em: (1) uma sequência de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 1; e (2) uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 e tem a atividade de regular o número de linhas do núcleo em plantas.
2. Molécula de ácido nucleico que codifica a proteína da reivindicação 1.
3. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo que consiste em: (1) uma sequência de ácido nucleico como estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3, ou uma sequência complementar à mesma; (2) uma sequência de ácido nucleico como estabelecido nas posições 310- 2400 da SEQ ID NO: 3, ou uma sequência complementar à mesma; (3) uma sequência de ácido nucleico que possui pelo menos 70% de identidade com a sequência de ácido nucleico, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou nas posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3 e tem a atividade de regular o número de linhas do núcleo em plantas ou uma sequência complementar; e (4) uma sequência de ácido nucleico que hibrida com as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou posições 310-2400 da SEQ ID NO: 3 sob condições rigorosas e tem a atividade de regular o número de linhas de kernel em plantas ou um sequência complementar à mesma.
4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as condições rigorosas são hibridação a 65 ℃ em solução 6 × SSC + 0,5% SDS, em que o filme é lavado uma vez sucessivamente com 2 X SSC + 0,1% SDS e 1 X SSC + 0,1 % De SDS a 65 ℃.
5. Método para produzir uma planta transgênica com maior número de linhas de kernel ou rendimento aumentado, compreendendo a obtenção de uma célula vegetal transgênica com expressão inibida do gene KRN2 ou seus produtos gênicos em comparação com uma planta de tipo selvagem e regenerando uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal transgênica.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transgênica é obtida por mutagênese, edição de genes ou inibição mediada por RNA do gene KRN2.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a mutagênese é selecionada do grupo que consiste em mutagênese e rastreamento aleatórios, mutagênese direcionada ao local, mutagênese por PCR, mutagênese por inserção, mutagênese insercional, mutagênese física, mutagênese química e irradiação.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a edição do gene é alcançada fornecendo uma endonuclease selecionada de uma meganuclease, uma endonuclease de dedo de zinco, uma endonuclease de TALEN ou uma endonuclease de CRISPR.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a inibição mediada por RNA consiste em introduzir em uma célula vegetal um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA que é pelo menos 70% complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contínuos do gene KRN2.
10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada de onde a planta é selecionada de milho, soja, algodão, amendoim, cevada, aveia, capim-pomar, arroz, sorgo, cana-de-açúcar, festuca alta, espécies de gramados, trigo alfafa, Arabidopsis, brócolis, couve, cenoura, couve-flor, couve chinesa, pepino, feijão seco, berinjela, tabaco, erva-doce, feijão de jardim, cabaça, alho-porro, alho-poró, alface, melão, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, milho doce, tomate, melancia, canola, colza, dendê, girassol, azeitona, linhaça, açafrão e coco.
11. Planta transgênica produzida de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 5-10.
12. Uma construção compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA compreendendo uma sequência que é pelo menos 70% complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contínuos do gene KRN2, em que a expressão da construção em uma planta resulta em expressão inibida do gene KRN2.
13. A construção, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é selecionada do grupo que consiste em um RNA antisense, miRNA, siRNA e RNA longo não codificante.
14. Uma construção compreendendo uma sequência que codifica um RNA guia único projetado para atingir o gene KRN2, em que a expressão da construção em uma planta juntamente com a expressão de um gene associado à Cas resulta na expressão inibida do gene KRN2.
15. Planta transgênica, parte da planta ou célula vegetal que compreende a construção de qualquer uma das reivindicações 12-14.
16. Planta transgênica, célula vegetal ou parte da planta, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, cevada, aveia, grama de pomar, arroz, sorgo, cana de açúcar, festuca alta espécies de grama, trigo, alfafa, Arabidopsis, brócolis, couve, cenoura, couve-flor, couve chinesa, pepino, feijão seco, berinjela, tabaco, erva-doce, tabaco, erva-doce, feijão de jardim, cabaça, alho-porro, alface, melão, quiabo, cebola, ervilha, pimenta abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, milho doce, tomate, melancia, canola, colza, dendê, girassol, azeitona, linhaça, cártamo e coco.
17. Produto de comoditty produzido a partir de planta transgênica, célula vegetal ou partes de plantas da reivindicação 15.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de base é concentrado de proteína, isolado de proteína, cereal, amido, sementes, farinhas, farinha, farinha, biomassa ou óleo de semente.
19. Marcador molecular útil na identificação ou identificação auxiliar da característica de número de linha do kernel no milho, em que o referido marcador molecular está localizado de 16,37Mb a 17,56Mb no cromossomo 2.
20. Marcador molecular da reivindicação 21, que é um fragmento de DNA amplificado por PCR usando o DNA genômico de milho como um molde com pelo menos um par de iniciadores selecionados a partir de SEQ ID NOs: 4-17.
21. Par de iniciadores para identificar ou identificar assistencialmente a característica de número de linha do kernel no milho, que corresponde ao marcador molecular da reivindicação 19 ou 20.
22. Par de iniciadores, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que cada um tem uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 4-17.
23. Kit para identificação ou identificação assistencial da característica do número de linha do kernel no milho, compreendendo pelo menos um par de iniciadores da reivindicação 21 ou 22.
24. Uso do marcador molecular da reivindicação 19 ou 20, o par de iniciadores da reivindicação 21 ou 22 ou o kit da reivindicação 23 na identificação ou identificação auxiliar da característica do número de linha do caroço no milho ou na criação de milho.
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