CN111334605B

CN111334605B - 用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111334605B
Application number: CN202010279857.7A
Authority: CN
Inventors: 邓婷婷; 黄文胜; 刘凤轩
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111334605A

Abstract

本发明提供了一种用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法，基于甘蔗的ITS基因、rbcl基因、nsLTP基因、NDR1/HIN1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物和探针，使用上述引物和探针对待测样品中甘蔗成分进行检测，能将甘蔗与其他物种准确的分开，检测绝对灵敏度达0.4copies/μL，相对灵敏度可达0.01％，鉴定结果准确、稳定、可靠。

Description

用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

随着转基因产品的大量研究及其在日常生活中的广泛应用，转基因产品对人类健康以及生存环境所带来的安全性问题已经引起世人的广泛关注及争论。因此，世界各国在积极研究转基因技术的同时，也对各种转基因食品的检测分析方法进行了大量研究。但由于转基因种类多，数量大，尤其是很多转基因食品经过深加工和各种条件处理保存后，转基因成分大量降解，检测难度加大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新和发展各种转基因食品的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理，减少其商品化可能带来的风险，同时保护公众健康、保护广大消费者知情权和选择权。

特异性基因检测在转基因检测、食品成分检测方法非常重要，食品转基因检测的第一步骤即为食品成分检测。在转基因定性检测中，特异性基因作为质量分数的分母使用。国家标准-转基因产品通用检测方法包括了玉米zSSIIb和Adh1、大豆Lectin、油菜CruA和PEP、水稻SPS和PLD、苜蓿ACC基因、甜菜GluA3、马铃薯UGPase，共7大作物的11个特异性基因实时PCR检测方法。而甘蔗是禾本科、甘蔗属的一个多年生高大实心草木。甘蔗广泛分布于热带及亚热带地区，是制造蔗糖的原料，而且可以提纯乙醇作为能源的替代品。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质。甘蔗含有的水分是相当丰富的，还有一定的润肺止咳的作用。甘蔗性寒，味甘，含有丰富的纤维素，能够帮助身体促进身体的消化，有助于缓解便秘的发生，促进胃健康。由于甘蔗具有良好的转基因商业化前景，需要根据科学技术的发展不断更新和发展开展甘蔗的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理。但甘蔗等重要的禾本科作物都没有成熟的特异性基因检测方法。例如，中国专利文献CN106636424A中一种基于甘蔗基因组序列开发的SSR核心引物，SSR核心引物含有28对引物，采用普通PCR结合毛细管电泳技术，主要用于甘蔗遗传多样性分析、品种鉴定和保护、DNA指纹图谱及遗传连锁图谱的构建。然而，上述专利的技术只能用于鉴定甘蔗这一物种内部不同样本的亲缘关系，无法区分甘蔗与其他物种。因甘蔗、小麦、黑麦、燕麦、黍等禾本科作物同源性较高，导致植物及其加工品中甘蔗成分的鉴别难度很大。

因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、结果准确可靠且快速简便的用于检测甘蔗成分的方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，采用所述引物检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的探针，采用所述探针检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的试剂盒，采用所述试剂盒检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第四个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的方法，采用所述方法检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。

为此，本发明提供了一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，其特征在于，所述引物包括

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

本发明还提供了一种用于检测甘蔗成分的探针，其特征在于，所述探针具有如下序列：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。

进一步地，所述探针的3′端标记有荧光淬灭基团，5′端标记有荧光报告基团。

进一步地，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和MGB；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE和HEX。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物和上述任一项所述的探针。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物或上述任一项所述的探针。

进一步地，试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。优选地，阴性对照可以但不局限于为无菌双蒸水、大米、小麦。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。

本发明还提供了一种所述的特异性引物或上述任一项所述的探针或所述的试剂盒在检测样品中甘蔗成分的的应用；

进一步地，所述样品为植物或者植物加工品。

所述植物加工品为动物食品、植物食品、饮料、保健品、营养补充剂中的至少一种。

本发明还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；

(2)使用所述的特异性引物进行扩增和/或使用上述任一所述的探针进行特异性杂交，以检测所述DNA模板。

进一步地，所述检测为PCR检测，优选为实时荧光PCR检测。

本发明还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；

(2)使用所述的引物对步骤(1)获得的DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有80～100bp的DNA片段，则所述待测样品中存在甘蔗成分；反之，则所述待测样品中不存在甘蔗成分。

所述步骤(3)中所述80～100bp的DNA片段为91bp的DNA片段。

所述的91bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：4所示，具体为GATCGCCACAGCAAGCTGCATGCGAGCCATGTCGATCGATGTTCTGGG TGCTGAGTGCCTGGGTGTGTGTGACGACCGTGTGCTAGTGCTA(全称：NDR1/HIN1-like protein，简称NDR1/HIN1基因I)

本发明还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；

(2)使用所述的引物和上述任一所述的探针对步骤(1)提取的DNA模板进行实时荧光PCR扩增；

(3)收集荧光信号，得出检测结果。

进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，PCR反应体系包括：

DNA模板，30～60ng；

上游引物，10μM，0.5～1.5μL；

下游引物，10μM，0.5～1.5μL；

探针，10μM，0.25～1μL；

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；

无菌超纯水补至25μL；

进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，按照如下PCR扩增程序进行：95℃，5min；94℃，15s，48～68℃，1min，进行40～60个循环；然后继续98℃，8～12min。

优选的，所述的PCR扩增条件为95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s；60℃，1min(1℃/s)，共50个循环；98℃，10min(1℃/s)。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明所述的用于检测甘蔗成分的特异性引物，本发明人是在前期研究中通过对多个检测基因片段进行筛选分析后，创新性地选择NDR1/HIN1基因I作为检测基因。发明人首先选取了甘蔗和其他物种的internal transcribed spacers(ITS)基因、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(rbcl)基因、非特异性脂转移蛋白(nsLTP)基因、NHL(NDR1/HIN1)基因，进行比对分析，选取种内基因序列同源性高且种间基因序列具有差异的nsLTP及NDR1/HIN1两个基因，并对两个基因的两个片段(nsLTP基因I、nsLTP基因II、NDR1/HIN1基因I和NDR1/HIN1基因II)分别设计了引物，且通过对这些引物的筛选研究，筛选出了本发明的具有高种属特异性的引物，使用本发明提供的引物对样品中的甘蔗成分进行鉴定，具有结果准确、灵敏度高(绝对灵敏度为0.4copies/μL，相对灵敏度为0.01％)、结果稳定可靠且假阳性率低的优点，并能将甘蔗成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高。

(2)本发明所述的用于检测甘蔗成分的特异性引物，其中优选采用引物及探针1，扩增得到的PCR扩增产物仅为91bp，分子量小，扩增效率更高，保证了其在短时间内进行大量的食品中甘蔗成分鉴定。

(3)本发明所述的用于检测甘蔗成分的试剂盒，本发明人通过比对了大量禾本科的众多基因序列(如ITS基因、rbcl基因、nsLTP基因、NDR1/HIN1基因)，选取到了种内基因序列同源性高而种间基因序列具有差异的nsLTP及NDR1/HIN1两个基因，并通过软件加手动设计的方法优化引物探针的位置，设计出合适的引物探针并进行了筛选，最终选取了NDR1/HIN1基因I引物及探针，建立了甘蔗特异性的检测方法，并通过实际样品对已建立的方法进行了验证，该检测方法具有结果准确、稳定、可靠、特异性强、灵敏度高、时间短的优点。

(4)本发明所述的检测甘蔗成分的方法，采用80～100bp的DNA片段为目的基因的引物进行PCR扩增，保证了其在短时间内进行大量的样品中甘蔗成分鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，很显然下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实验例1中采用实施例5和对比例1-3的检测方法检测黄皮甘蔗成分的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实验例2中采用实施例6和对比例4的检测方法检测黄皮甘蔗的实时荧光PCR扩增曲线，曲线1为实施例6，曲线2为对比例4；

图3为实验例3中检测甘蔗成分的特异性实验结果，曲线1为黄皮甘蔗，曲线2为玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯与空白对照；

图4为实验例4不同品种甘蔗的种内包容性检测实验结果；曲线1为黑甘蔗；曲线2为白玉蔗，曲线3为青皮糖甘蔗，曲线4为黄皮甘蔗，基线下方为阴性对照品和空白对照；

图5为实验例5中检测甘蔗成分的绝对灵敏度实验结果，曲线1为含1000copies/μL的DNA的原液，曲线2为100copies/μL的DNA的稀释液，曲线3为含10copies/μL的DNA的稀释液，曲线4为2copies/μL的DNA，曲线5为含0.4copies/μL的DNA的稀释液，基线下方为阴性对照品和空白对照；

图6为实验例6中检测甘蔗成分的相对灵敏度实验结果。曲线1为含甘蔗成分含量50％的样品，曲线2为含甘蔗成分含量5％的样品，曲线3为含甘蔗成分含量0.5％的样品，曲线4为含甘蔗成分含量0.05％的样品，曲线5为含甘蔗成分含量0.01％的样品，基线下方为阴性对照品和空白对照。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。其中，黑甘蔗、白玉蔗、青皮糖甘蔗、黄皮甘蔗、大麦、玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、甘蔗、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯，均为市购。

空白对照：为无菌双蒸水。

本发明所使用的主要设备如下：

eppendorf微量移液器、AB7500荧光定性PCR仪、高速台式离心机、DYY22C型电泳仪。

实施例1引物

本实施例提供了一种于检测甘蔗成分的特异性引物，针对甘蔗的ACPS基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQ ID NO：1-2所示：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATGA-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

实施例2探针

本实施例提供了一种于检测甘蔗成分的探针，针对甘蔗的ACPS基因设计的探针如下，参见序列表中SEQ ID NO：3所示，所述探针的序列为：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。

实施例3普通PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种用于检测甘蔗成分的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液部分为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：

上游引物(10μM)1.0μL；

下游引物(10μM)1.0μL；

Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.4μL；

dNTPs，10mM，0.5μL；

10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含10mmol/L Mg²⁺),2.5μL；

无菌超纯水补至25μL；

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

实施例4实时荧光PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种用于检测甘蔗成分的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液部分为含所述实施例1中的所述特异性引物和实施例2所述的探针；所述PCR反应液部分含有dNTPs、Taq DNA聚合酶的2×TaqManUniversal PCR Master Mix以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；

上游引物(10μM)1.0μL；

下游引物(10μM)1.0μL；

探针(10μM)0.5μL；

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

实施例5检测方法

本实施例提供了一种利用实施例1的特异性引物或实施例3的试剂盒检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品的处理与DNA提取

待测样品的处理步骤：取30-40g待测样品，经粉碎仪或研磨机进行研磨至样品粉末颗粒约为0.2mm-0.3mm左右大小，得到样品粉末。

DNA提取步骤：然后取200mg样品粉末置于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，振荡均匀，65℃振荡孵育60min。然后于12000rpm离心10min，小心转移上清液至新的2mL离心管中；加入750μL三氯甲烷后涡旋混匀，12000rpm离心10min。吸取上清至2mL离心管，加入2倍体积的CTAB沉淀液并均匀，室温静置1h后，12000rpm离心10min。弃上清液后向沉淀中加入350μL 1.2mol/L NaCl溶液将沉淀充分溶解，再加入350μL三氯甲烷，涡旋混匀，12000rpm离心10min。吸上清液至1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，-20℃静置过夜，12000rpm离心10min。弃上清后用70％乙醇溶液洗涤沉淀2至3次后，12000rpm离心10min。弃上清液后充分晾干；加100μL TE溶液溶解沉淀DNA，立即使用或-20℃保存备用。

(2)PCR扩增

以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

所述PCR反应体系包括：

Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；

10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含10-20mmol/L Mg²⁺),2.5μL；

dNTPs，2.5mM，0.25～1μL；

上游引物(10μM)1.0μL；

下游引物(10μM)1.0μL；

模板DNA 50ng，1μL。

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s，进行40个循环；然后继续72℃延伸7min，降温至4℃。

(3)取步骤(2)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸染料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为5μL，DNA分子量标记(DNA Marker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。若所述PCR扩增产物中含有91bp的DNA片段，则所述待测样品存在甘蔗成分；反之，则所述待测样品中不存在甘蔗成分。

实施例6检测方法

本实施例提供了一种利用实施例1的特异性引物和实施例2的引物或实施例3的试剂盒检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品的处理、纯化与DNA提取，步骤同实施例5。

(2)实时荧光PCR扩增

以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物和探针进行PCR扩增：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

所述探针的序列为：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。

所述PCR反应体系包括：

DNA模板，50ng，1μL；

上游引物，10μM，1μL；

下游引物，10μM，1μL；

2×TaqMan Universal PCR Master Mix，12.5μL；

无菌超纯水补至25μL。

扩增反应在实时荧光PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：

95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s；60℃，1min(1℃/s)；共50个循环；98℃，10min(1℃/s)。

(3)结果判定：若待测样品Ct值≤35并出现特定的扩增曲线说明其含有甘蔗成分，若待测样品Ct值≥40，说明其不含甘蔗成分，若Ct值在35～40之间，则重新进行实时荧光PCR扩增，如再次扩增后Ct值≥40，则说明其不含甘蔗成分，如再次扩增后Ct值<40，则说明其含甘蔗成分。

对比例1检测方法

本对比例提供了一种用于检测甘蔗成分的方法，采用nsLTP基因I为目的基因片段，设计用于检测甘蔗的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-GCTCGGACACCTGACGACAC-3′(SEQ ID No：5)；

下游引物：5′-ACGATCCGGCGATGAAGG-3′(SEQ ID No：6)。

参见序列表中SEQ ID NO：7所示，上述nsLTP基因I的序列为：GCTCGGACACCTGACGACACTTGGGATGATCCGGGCTAGCCGTTAAAGCTAGCGCGCATGCGTAGCTGACGTCAGCACGAGCAGCGCAGCAGCAGCCTTCATCGCCGGATCGT，长度为113bp。

对比例2检测方法

本对比例提供了一种用于检测甘蔗成分的方法，采用nsLTP基因II为目的基因片段，设计用于检测甘蔗的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-GCCACAGAATAGGCCTGAAAGG-3′(SEQ ID No：8)；

下游引物：5′-GCTCGGACATCTCCTCAAACTCC-3′(SEQ ID No：9)。

参见序列表中SEQ ID NO：10所示，所述nsLTP基因II的序列为GCCACAGAATAGGCCTGAAAGGATTGCGCCTAGCTAGCTAGCTAGCGTAGCTTGCTGTAGCTGCGCTAGCTAGGGAGTTTGAGGAGATGTCCGAGC，长度为96bp。

对比例3检测方法

本对比例提供了一种用于检测甘蔗成分的方法，采用NDR1/HIN1基因II为目的基因片段，设计用于检测甘蔗的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-GCAGCATTATATGATGCATTCGCA-3′(SEQ ID No：11)；

下游引物：5′-GAGACATCTCCCTAGCTAAGCTAAGC-3′(SEQ ID No：12)。

参见序列表中SEQ ID NO：13所示，所述NDR1/HIN1基因II的序列GCAGCATTATATGATGCATTCGCAGATCGCCACAGCAAGCTGCATGCGAGCCATGTCGATCGATGTCTGGGTAGTGCTAGCTTAGCTTAGCTAGGGAGATGTCTC，长度为105bp。

对比例4检测方法

本对比例提供了一种用于检测甘蔗成分的方法，采用NDR1/HIN1I基因为目的基因片段，设计用于检测甘蔗的探针。本对比例按照实施例6的方法对待测样品进行检测，与实施例6的区别仅在于采用的探针不同，本对比例采用的探针为：探针：5′-GCTGAGTGCCTGGGTGTGTGTGACGACCG-3′(SEQ ID No.14)。

参见序列表中SEQ ID NO：4所示，所述NDR1/HIN1基因I的序列具体为：

GATCGCCACAGCAAGCTGCATGCGAGCCATGTCGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCCTGGGTGTGTGTGACGACCGTGTGCTAGTGCTA，长度为91bp。

实验例1

分别按照实施例5和对比例1-3的检测方法检测同一批黄皮甘蔗，琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图1所示，其中M为DNA Marker(50bp)，条带1-4分别是按照对比例1(nsLTP基因I)、对比例2(nsLTP基因II)、对比例3(NDR1/HIN1基因II)和实施例5(NDR1/HIN1基因I)的检测方法检测黄皮甘蔗得到的扩增产物，条带5为空白对照。从图1中可以看出，实施例5中NDR1/HIN1基因I对应的引物扩增出清晰唯一的目的条带且长度与预期一致(分别为91bp)，证明相对于对比例1-3，采用本发明的引物检测甘蔗具有更加准确、稳定、可靠，因此选取实施例5的引物用于后续分析。

实验例2

采用实施例6和对比例4的检测方法检测黄皮甘蔗，结果见图2所示，从图2中可以看出实施例6的引物及探针的扩增效率明显高于对比例4，证明相对于对比例4，采用本发明的实施例6的引物及探针检测甘蔗具有更高的扩增效率，缩短时间。

实施例3特异性考察实验

为保证分子鉴别结果的可靠性，以对本实验方法进行适用性验证，确认本方法准确、可靠，本实验还收集了玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、甘蔗、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯，与黄皮甘蔗样品分别作为待测样品，并以无菌双蒸水为空白对照，均按照实施例6的检测方法对上述待测样品分别进行DNA提取和实时荧光PCR扩增。

结果如图3所示，从图中可以看出，只有黄皮甘蔗样品可出现扩增曲线，空白对照无扩增曲线，而其他禾本科和其他常见作物如玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯等均未出现荧光曲线，以上结果充分说明该引物及探针对甘蔗成分具有很好的特异性。

实施例4不同甘蔗品种的种内包容性的检测

为保证分子鉴别结果的可靠性，分别以黑甘蔗、白玉蔗、青皮糖甘蔗、黄皮甘蔗为待测样品，以大米、小麦为阴性对照品，以无菌水为空白对照，均按照实施例6的检测方法分别进行DNA提取和实时荧光PCR扩增。

检测结果如图4所示，从图4中可以看出，利用本发明的检测方法检测常见品种甘蔗，黑甘蔗、白玉蔗、青皮糖甘蔗、黄皮甘蔗均能够成功检测出甘蔗，而阴性对照大米、小麦及空白对照均无扩增，表明该方法不仅具有特异性，且种间包容性也符合要求，即对常见品种的甘蔗均能有效检测。

实施例5绝对灵敏度实验

黄皮甘蔗样品基因组DNA采用黄皮甘蔗参照实施例5制备，甘蔗样品基因组DNA的初始拷贝数为1000copies/μL，将甘蔗样品基因组DNA的原液进行2个梯度的10倍稀释，然后再进行2个梯度的5倍稀释，具体为稀释10倍得到含100copies/μL的DNA的稀释液、稀释100倍得到含10copies/μL的DNA的稀释液、稀释500倍得到含2copies/μL的DNA的稀释液，稀释2500倍得到含0.4copies/μL的DNA的稀释液。分别取5μL的原液和不同稀释梯度的甘蔗样品基因组DNA作为DNA模板，以无菌双蒸水为空白对照，按照实施例6中的方法进行实时荧光PCR扩增，每个稀释梯度重复2次，验证该检测方法的绝对灵敏度。

如图5所示，空白对照无扩增信号，原液1000copies/μL、稀释10倍后100copies/μL的DNA、稀释100倍后10copies/μL的DNA、稀释500倍后2copies/μL的DNA、稀释2500倍后0.4copies/μL，均能出现明显的扩增曲线，表明本发明的检测方法可用于检测甘蔗特异性基因成分，准确性和灵敏度较好，可对含量低至0.4copies/μL的甘蔗品系特异性基因成分进行精准检测，当最低拷贝数为0.4copies/μL时，循环环数仍不大于40。

实施例6相对灵敏度实验

参照实施例5“待测样品的处理”步骤分别采用黄皮甘蔗样品和小麦样品制备阳性对照品与阴性对照品的样品粉末，将阳性对照品粉末与阴性对照品粉末按不同质量比例混合，得到一系列混合样品，使混合样品中的甘蔗成分的质量百分数分别为50％、5％、0.5％、0.05％和0.01％，按照实施例6的检测方法进行DNA提取和检测。

结果见图6所示，其中基线上方为不同浓度的阳性样品的扩增曲线，基线下方为相对灵敏度未达到的含量限度、阴性及空白对照。当样品中甘蔗成分含量百分数不低于0.01％时，样品的2个重复均出现典型的扩增曲线。表明该方法对于精准检测相对含量低至0.01％的甘蔗成分时方法灵敏度和重现性均较好。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

<130> HA202000361-YS

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcgccacagc aagctgcatg 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tagcactagc acacggtcgt cac 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgatcgatgt tctgggtgct gagtgcc 27

<210> 4

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gatcgccaca gcaagctgca tgcgagccat gtcgatcgat gttctgggtg ctgagtgcct 60

gggtgtgtgt gacgaccgtg tgctagtgct a 91

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctcggacac ctgacgacac 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acgatccggc gatgaagg 18

<210> 7

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gctcggacac ctgacgacac ttgggatgat ccgggctagc cgttaaagct agcgcgcatg 60

cgtagctgac gtcagcacga gcagcgcagc agcagccttc atcgccggat cgt 113

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gccacagaat aggcctgaaa gg 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gctcggacat ctcctcaaac tcc 23

<210> 10

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gccacagaat aggcctgaaa ggattgcgcc tagctagcta gctagcgtag cttgctgtag 60

ctgcgctagc tagggagttt gaggagatgt ccgagc 96

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcagcattat atgatgcatt cgca 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gagacatctc cctagctaag ctaagc 26

<210> 13

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gcagcattat atgatgcatt cgcagatcgc cacagcaagc tgcatgcgag ccatgtcgat 60

cgatgtctgg gtagtgctag cttagcttag ctagggagat gtctc 105

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gctgagtgcc tgggtgtgtg tgacgaccg 29

Claims

1.一种特异性引物在检测样品中甘蔗成分的应用，其特征在于，所述引物包括：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

2.一种特异性引物在制备检测样品中甘蔗成分的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物包括：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。

3.一种特异性引物和探针在检测样品中甘蔗成分的应用，其特征在于，所述引物包括：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′，所述探针具有如下序列：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。

4.一种特异性引物和探针在制备检测样品中甘蔗成分的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物包括：

上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述探针的3′端标记有荧光淬灭基团，所述探针的5′端标记有荧光报告基团。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和MGB；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE和HEX。

7.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于，所述样品为植物或者植物加工品。

8.一种检测甘蔗成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取样品中的核酸，获得DNA模板；

（2）使用权利要求1所述的特异性引物对所述DNA模板进行PCR检测；或者使用权利要求1所述的特异性引物和权利要求3-6中任一所述的探针对所述DNA模板进行实时荧光PCR检测。