CN114540346B - 一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量pcr检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述探针引物是由SEQ ID NO：28‑39所示的DNA序列组成。所述检测方法可有效检出平贝母，专属性强，灵敏度高，可用于药材、饮片或成方制剂中是否存在平贝母的定性或定量检测，具有重要的实用价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。
背景技术
贝母类药材是常用大宗药材，具有止咳化痰功效，其中川贝母、伊犁贝母和平贝母均收录于《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)，传统认为川贝母效果最佳，且以野生为主，价格在各种贝母药材中居首位；而伊犁贝母和平贝母为种植品，产量较大，价格较低。《中国药典》川贝母的基原来源收录了百合科植物的6个物种，即川贝母Fritillariacirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂贝母F.delavayi Franch.、太白贝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen，按性状差异又可分为松贝、青贝、炉贝及栽培品。
川贝母市场需求量较大，但野生资源有限，伪品屡见不鲜。常见伪品来源主要有伊犁贝母和平贝母等。川贝母掺伪现象严重扰乱了公平竞争的市场秩序，影响着用药的安全性和有效性，最终侵害了消费者的经济和健康利益。
发明内容
本发明提供了一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述检测方法可有效检出平贝母，专属性强，灵敏度高，可用于药材、饮片或成方制剂中是否存在平贝母的定性或定量检测，具有重要的实用价值和应用前景。
一方面，本发明提供了一种探针引物。所述探针引物其由SEQ ID NO：28-39所示的DNA序列组成。
另一方面，本发明提供了一种用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法。所述方法包括下述步骤：
称取贝母样品及样品前处理；
从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及
选择探针引物；
优化反应条件；
根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的CT值临界点(如CT<35)判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(P)和内参探针(C)；供试品中目的探针(P)和内参探针(C)的定量检测比值可表示为△CT(T)，相应的标准品可表示为△CT(S)，△△CT＝△CT(T)-△CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母或者平贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(T)/标准品(S)％＝2-△△CT绝对值×100％；
其中，所述方法能够用于检测所述样品中是否含有平贝母；所述探针引物为序列号为SEQ ID NO28-39的探针引物。
在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
在一些实施方式中，所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
在一些实施方式中，所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。
在一些实施方式中，所述反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30～60s，60℃收集荧光。根据所选反应预混液性质的不同，反应条件可进行调整。
另一方面，本发明提供了所述探针引物的用途，其中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO：28-39所示的探针引物；所述探针引物通过荧光定量PCR检测方法实现平贝母专属性检测。
在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
在一些实施方式中，检测的所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒。所述试剂盒含有上述探针引物，并且所述试剂盒用于平贝母专属性检测。
附图说明
图1为探针引物的专属性测试。只有在检测平贝母时出现阳性扩增，其他贝母未检出；
图2为方法检出限测试，从1-5DNA浓度分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；DNA浓度在0.01ng时仍能检出，表明方法具有较高的灵敏度；
图3为平贝母掺伪检出限测试，两组曲线分别为100％平贝母和0.1％平贝母掺伪样品的检测情况，1和2分别为总贝母探针引物和平贝母专属性探针引物。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的描述，这些实施例仅仅是说明性的，因此不应将其解释为对本发明范围的限制。
一、仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪(AB 7500FAST)，分析天平(Mettler AB135-S)，纯水仪(Millipore公司)，球磨仪(M400，Retsch)，微量紫外分光光度计，高速离心机，金属加热器。植物基因组提取试剂盒(DP321，天根生化科技有限公司)，Universal MasterMix II。
二、样品收集
收集准确来源的川贝母6个基原样品、平贝母、伊犁贝母及其他常见药用贝母、市售样品共计100余批。具体信息见附件1药材样品信息表。
三、样品处理与DNA提取
1.样品处理及DNA提取
将供试品研成极细粉，精密称定20mg，使用植物基因组提取试剂盒提取DNA，得到供试品溶液。伊犁贝母对照药材制成极细粉，精密称定20mg，同法制成阳性对照溶液。如为成方制剂，可酌情加大取样量在50～200mg。
2.DNA提取具体步骤：
加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中；重复上述步骤。向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，(例如500μl的上清液加350μl异丙醇)，充分颠倒混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清，保留沉淀。加入600μl 70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清；重复上述步骤。开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。加入洗脱缓冲液TE 100μl，65℃水浴10-30min溶解DNA，最终得到DNA溶液，置于4℃或-20℃备用。
对于成方制剂的DNA提取，可采用优化的CTAB提取方法等，以获得足够纯度的DNA模板溶液(一般要求OD260/280在1.7～1.9之间)。
四、荧光定量PCR检测方法的建立
1.探针引物设计与筛选
根据ITS和psbA-trnH区域的DNA序列分析比对，在种内保守、种间差异区域设计探针引物，其中探针5’端标记荧光素基团FAM或者VIC，3’端标记非荧光素淬灭基团BHQ1。每个靶标物种设计2组以上的探针引物。
本发明的探针引物序列信息如附件2所示。
2.PCR反应体系及反应条件
反应体系：体积为20μL，包括荧光PCR反应混合液(2×)10μL，上下游引物及探针(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA 1μL，高压灭菌超纯水至总体积8.1μL。按照以上体系配制待测样品及阳性对照的反应溶液。空白对照为不含模板DNA的反应体系，并用等体积高压灭菌超纯水代替模板DNA。样品及对照均设三个重复，CT值取三个重复的平均值作为最终结果。
反应条件：50℃2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。
五、方法学考察
1.专属性考察
对筛选得到的探针引物进行种属特异性考察。针对伊犁贝母的探针引物在检测川贝母6个基原物种和其他贝母时均为阴性，针对平贝母的探针引物在检测川贝母6个基原物种和其他贝母时也均为阴性结果(表1，图1)。
表1.探针引物专属性考察
2.适用性考察
采用筛选得到的探针引物对不同产地和来源平贝母进行测试，每份样品均得到阳性结果，不同样品的CT均值为23.40(表2)。
我们以暗紫贝母栽培品为例考察了该方法在栽培品中的适用性。DNA提取结果及定量PCR结果均显示，栽培品的DNA含量较野生品没有显著区别，因此该方法同样适用于栽培品的情况(表3)。
表2.不同产地和来源的平贝母检测结果
表3.暗紫贝母野生品与栽培品比较
3.重复性
采用筛选得到的探针引物对相同的平贝母和川贝母6个基原样品进行三次重复检测。检测结果平贝母均为阳性，川贝母6个基原的样品均为阴性(表4)。
表4.平贝母探针引物检测重复三次结果
4.精密度
在同一次试验中同一样品设置三个平行组，根据每组的CT值计算标准误差(SD)，平贝母为0.69(表5)。
表5.平贝母检测方法精密度考察
5.回收率
采用筛选得到的探针引物，分别对伊犁贝母/太白贝母、平贝母/暗紫贝母不同混合比例的样品进行检测，通过CT差值的方法计算掺伪比例，计算值与预期值比例的百分数作为回收率。平贝母掺伪定量检测的回收率在89.00％～120.58％(表6)。
表6.平贝母掺伪定量检测情况
6.检出限考察对平贝母DNA原溶液进行梯度稀释，DNA浓度在0.01ng情况下仍可检出(图2)；对平贝母和暗紫贝母不同比例的混合样品进行检测，在平贝母占比0.1％时仍能稳定检出(图3)。
7.计算或判定方法
1)对于定性检测，可将CT值临界点设置在35，CT<35视为检出；
2)对于半定量检测，需设置标准品(根据检测靶标不同选择平贝母药材或者标准制剂)作为参照，鉴于聚合酶链式反应呈指数扩增，达到阈值时的扩增轮数为CT值；标准品(S)与供试品(T)的CT值之差用△CT表示，则供试品中的目的DNA所占比例可表示为：供试品(T)/标准品(S)％＝2-△CT绝对值×100％。理论上当△CT绝对值为4时，掺伪比例为6.25％，当△CT绝对值为5时，掺伪比例为3.125％(表7)。实际检测中，掺伪比例5％的样品，其△CT绝对值在4～5之间。鉴于药材饮片允许有3％以内的杂质，以及充分考虑检测中的误差情况，通常将△CT绝对值≤4作为检出判定依据。可以通过调整该值的大小，控制检测标准的严格程度，数值越大，检出限度设置的越低，标准越严格。
3)对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括专属探针(P)和通用探针(C)。供试品中目的探针(P)和内参探针(C)的定量检测比值可表示为△CT(T)，相应的标准品可表示为△CT(S)，△△CT＝△CT(T)-△CT(S)。则目的DNA(伊犁贝母或者平贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(T)/标准品(S)％＝2-△△CT绝对值×100％。
表7.不同掺伪比例对应的△CT绝对值
8.样品检测
检测市售川贝母样品(SSCB1～SSCB10)、贝母粉及成方制剂，结果川贝母样品中有2批检出平贝母阳性，贝母粉及应含川贝母的成方制剂中均检出平贝母(表8)。
表8.样品检测情况
六、讨论
平贝母是川贝母主要的伪品来源之一。本研究建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR技术的平贝母掺伪检测方法，合理设置了检测的阈值限度，从而既能够有效检出伪品的存在，又避免了技术本身过高的灵敏度带来的误判。该方法为通用型方法，适用于药材、饮片(如川贝母粉)及成方制剂中的平贝母的定性或定量检测。
附件：
附件1.药材样品信息表
附件2.探针引物序列信息
本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本申请所要求保护的发明范围。
SEQUENCE LISTING
<110>中国食品药品检定研究院
<120>一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途
<130> P227601CN1
<160>39
<170>PatentIn Version 3.5
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213> 贝母（Fritillaria）
<220>
<221> psbA-trnH
<222>
<223>BMTY96_P探针
<400>1
ctttagctag ataaggggcg gatgtagc 28
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> psbA-trnH
<222>
<223>BMTY96_F上游引物
<400>2
gtaagaataa atacaataat gatgaatgga 30
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> psbA-trnH
<222>
<223>BMTY96_R下游引物
<400>3
actgccttga tccacttg 18
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_69_P探针
<400>4
cagaatcccg tgaaccatcg agtctttga 29
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_69_F
<400>5
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_69_R
<400>6
ctcgggcgca acttg 15
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_71_P探针
<400>7
tgccgtctcg caatgcgacc 20
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_71_F上游引物
<400>8
ccgtgctccg tacga 15
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>贝母（Fritillaria）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>BMG_71_R下游引物
<400>9
actcagcggg tgtcc 15
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
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<400>10
acctcgcatc gtgcctctcc 20
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A86_F上游引物
<400>11
gtaaacggat gacaccgtg 19
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A86_R下游引物
<400>12
cccgcaaatc gtgcc 15
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A87_P探针
<400>13
catcgtgcct ctccgggcac 20
<210>14
<211>14
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A87_F上游引物
<400>14
ctgcccggga cctc 14
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
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<223>CB_A87_R下游引物
<400>15
atatgttcct tggcgcag 18
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A80_P探针
<400>16
atatgacagg acggacgcac gtcaac 26
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A80_F上游引物
<400>17
tgcgccaagg aacatatg 18
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_A80_R下游引物
<400>18
gtcgtatgga tagagagcga 20
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_B81_P探针
<400>19
ccttaagggg ctcaagagac ccgga 25
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_B81_F上游引物
<400>20
caccagcagg atgttgtg 18
<210>21
<211>17
<212>DNA
<213>川贝母（Fritillaria cirrhosa）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CB_B81_R下游引物
<400>21
ctcctcgtac ggagcac 17
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A59_P探针
<400>22
accgtgttcg cgatcgcctc a 21
<210>23
<211>15
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A59_F上游引物
<400>23
cctgctcggg acctc 15
<210>24
<211>16
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A59_R下游引物
<400>24
caaaccgtgt ccggag 16
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A170_P探针
<400>25
cgtaaacgga tgacaccgtg tcgg 24
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A170_F上游引物
<400>26
gaaggatcat tgtcgagaac c 21
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>CBWP_A170_R下游引物
<400>27
catatgttcc ttggcgcag 19
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM53MGB_P探针
<400>28
ccaatggata agacttatat tctgtcttag tgt 33
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM53MGB_F上游引物
<400>29
gctgctattg aagttccatc ta 22
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM53MGB_R下游引物
<400>30
gctccatcaa ggattcgtat 20
<210>31
<211>31
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM78/85MGB_P探针
<400>31
aagatattgc tccatcaaca aaaggatttt t 31
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM78/85MGB_F上游引物
<400>32
ggagcaatat ctttgtatct tgc 23
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM78/85MGB_R下游引物
<400>33
ccctgtgaca cgttcaataa 20
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM55_P探针
<400>34
tccgcgatcg cctccaagc 19
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM55_F上游引物
<400>35
gggacctcgc atcgt 15
<210>36
<211>16
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM55_R下游引物
<400>36
ccgcaaatcg tgtccg 16
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM59_P探针
<400>37
cctttcggtt gagggcacgc 20
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM59_F上游引物
<400>38
ctttgaacgc aagttgcg 18
<210>39
<211>14
<212>DNA
<213>平贝母（Fritillaria ussuriensis）
<220>
<221> ITS
<222>
<223>PBM59_R下游引物
<400>38
tgacgcccag gcag 14
Claims (10)
1.一种探针引物组，其特征在于，所述探针引物组为PBM53MGB、PBM78/85MGB、PBM55和PBM59中的任何一组，其中PBM53MGB、PBM78/85MGB、PBM55、PBM59分别是由SEQ ID NO：28-30、31-33、34-36、37-39所示的DNA序列组成；其中所述探针引物组用于通过荧光定量PCR检测方法实现平贝母专属性检测，并且所述检测方法运用的是荧光定量PCR中的TaqMan探针法。
2.一种用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
称取贝母样品及样品前处理；
从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及
选择探针引物组；
优化反应条件；
根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的CT值临界点判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(P)和内参探针(C)；供试品中专属探针(P)和通用探针(C)的定量检测比值可表示为△CT(T)，相应的标准品可表示为△CT(S)，△△CT＝△CT(T)-△CT(S)从而目的DNA(平贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(T)/标准品(S)％＝2-△△CT绝对值×100％；
其中，所述方法能够用于检测所述样品中是否含有平贝母；所述探针引物组为权利要求1所述的探针引物组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中每组探针引物组包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30～60s，60℃收集荧光。
7.一种探针引物组的用途，其特征在于，所述探针引物组为权利要求1所述的探针引物组；所述探针引物组通过荧光定量PCR检测方法实现平贝母专属性检测。
8.根据权利要求7所述的用途，其中每组探针引物组包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
9.根据权利要求7所述的用途，其中检测的样品为中药材、饮片或成方制剂。
10.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的探针引物组，并且所述试剂盒用于平贝母专属性检测。
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| GR01 | Patent grant | ||
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