CN107574255A - 一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法 - Google Patents

一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一利快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，涉及一种实时荧光PCR法检测草贝母和轮叶贝母成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，可用于草贝母和轮叶贝母成分的鉴定，对于加强中药质量的管理，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

Description

一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法
技术领域：
本发明属生物检测技术领域，涉及中药成分的检测方法，具体涉及检测草贝母和轮叶贝母成分的引物、探针以及检测方法。
背景技术
贝母为多年生草本植物，其鳞茎供药用，因其形状得名，《本草经集注》说：“形似聚贝子”，故名贝母，能止咳化痰、清热散结之功。川贝母(Fritillaria cirrhosa)是贝母中的珍品，是百合科多年生草本植物乌花贝母、卷叶贝母、罗氏贝母、甘肃贝母、梭砂贝母等贝母的地下鳞茎。因主产于四川而得名，但在西藏、甘肃、新疆、华北、东北均有出产。川贝母性微寒而味甘苦，止咳化痰之效较强，入心肺经，功能润肺，临床常与沙参、麦冬、天冬、桑叶、菊花等配伍用于热痰、燥痰、肺虚劳嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中带血以及心胸郁结、肺痿、肺痈等病症的治疗。现代药理研究证实，川贝母含有川贝母碱等多种生物碱，川贝母碱有降低血压，兴奋子宫等多种药理作用。
因为川贝母在贝母中药效最好且无法人工种植，导致川贝价格一直居高不下，而贝母类药材来源较多，致使一些人用其他与川贝母外观相似的贝母冒充川贝母销售，导致市场上出现了众多的混淆品和伪品，其中主要以浙贝母(Fritillaria thunbergii)、草贝母(Iphigenia indica)和轮叶贝母(Fritillaria maximowiczii)为主。
草贝母为百合科科植物山慈姑的鳞茎，含秋水仙碱、异秋水仙碱等多种生物碱。因秋水仙碱可在人体内被氧化为二秋水仙碱，有剧毒，对消化系统、泌尿系统均可产生严重的刺激症状，误食可产生严重的腹痛、频繁的恶心、呕吐和腹泻等不良影响，同时也对神经系统有抑制作用，能降低体温，使触觉迟钝，并发生上行性麻痹，如累及膈肌，则可引起呼吸运动障碍，可因呼吸衰竭而死亡。有报道误食草贝母死亡的案例(昆明医学院学报，2007，(2B)：274-274)。轮叶贝母，又名一轮贝母，其植株通常具一轮叶，顶端具一朵花，果实与川贝母相似，也具有一定毒性。
对川贝母的鉴别，目前主要还是通过品种外观进行区分，但是贝母间很多品种外观非常相似，利用常规的外观鉴定方法很难将它们进行区分，当药材加工成粉末或其他产品时就更加难以鉴定。利用PCR从基因水平对品种进行鉴定可以解决这个难题，但是现在仅个别贝母品种有PCR鉴别的方法。《中国药典》中川贝母鉴定使用了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法(《中国药典2015年版》一部上册第37页)，通过使用川贝母鉴定引物对供试品进行常规PCR检测，然后将PCR产物经Sma I酶切后进行电泳检测，在供试品凝胶电泳图谱中，与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp有两条DNA条带可证明样品为川贝母。专利“浙贝母PCR鉴定试剂盒及鉴定方法”(申请号：CN201210350761.0)则提供了一种使用常规PCR对浙贝母成分进行检测的方法。
目前，对于川贝母中易掺假且有毒性的草贝母和轮叶贝母还没有快速准确的检测方法，本领域迫切需要开发新的快速简便地检测草贝母和轮叶贝母成分的技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供了一种实时荧光PCR检测草贝母和轮叶贝母成分的引物探针及检测方法。
根据草贝母rbcl基因和轮叶贝母ITS2基因的设计特异检测引物和探针。
实时荧光PCR检测草贝母源性成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG
下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG
带有荧光染料的探针序列为：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA
所述的荧光染料，5‘端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。
实时荧光PCR检测轮叶贝母成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CTACTCGGGACCTCGCAAT
下游引物P2：CACCGCAGAGGCATCGAC
带有荧光染料的探针序列为：TCCTCGGACACTATTT。
所述的荧光染料，5‘端为VIC标记，3’端为MGB标记。
实时荧光PCR检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其步骤如下：
1、提取待检样品基因组DNA
2、将检测草贝母和轮叶贝母的上游引物、下游引物和探针稀释至10μmol/L，然后等体积合并为混合引物(探针)，以所提取的DNA作为模板，加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值；
所述的实时荧光PCR反应体系为：
3、所述的实时荧光PCR反应条件为95℃ 10rnin，1个循环；95℃ 15s，58℃ 30s，40个循环，在每次循环的58℃ 30s时收集荧光，设立FAM和VIC通道。
所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：
空白对照：以ddH2O为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阴性对照：以非草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阳性对照：以含有草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分。
本发明提供了一种实时荧光PCR法检测草贝母和轮叶贝母成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，可用于草贝母和轮叶贝母成分的鉴定，对于加强中药质量的管理，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
附图说明
图1是本发明实施例1检测草贝母和轮叶贝母成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，1为草贝母；2为轮叶贝母；
图2是本发明实施例2检测草贝母、轮叶贝母、川贝母、浙贝母、平贝母样品的荧光PCR扩增图；其中，1为草贝母；2为轮叶贝母；3为川贝母；4为浙贝母；5为平贝母。
具体实施方式：
下面对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1.所用引物和探针：
利用GenBank数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找草贝母(Iphigenia indica)rbcL基因和轮叶贝母(Fritillaria maximowiczii)的ITS2基因，其GenBank Accession登录号分别为AJ417893和KP712000.1，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
实时荧光PCR检测草贝母源性成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG
下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG
带有荧光染料的探针序列为：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA
所述的荧光染料，5‘端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。
实时荧光PCR检测轮叶贝母成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CTACTCGGGACCTCGCAAT
下游引物P2：CACCGCAGAGGCATCGAC
带有荧光染料的探针序列为：TCCTCGGACACTATTT。
所述的荧光染料，5‘端为VIC标记，3’端为MGB标记。
2.样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行：
(1)分别称取0.5g草贝母和轮叶贝母粉碎后材料放入同一个50mL离心管中；
(2)加入预热的10mLCTAB抽提裂解缓冲液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巯基乙醇)，振荡悬浮后65℃温浴1h，期间不断晃动，冷却至室温后，5000g离心10min；
(3)取上清950μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；
(4)取上清750μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；
(5)取上清500μL加入1.5mL离心管中，加入300μL异丙醇，50μL乙酸钾溶液，轻轻颠倒混匀，室温静置30min，12000rpm离心15min，弃上清；
(6)加入1.0mL70％乙醇溶液，将沉淀悬浮浸泡，并将离心管倾斜，轻轻转动数圈后室温静置2min，12000rpm离心10min，弃上清，如沉淀多重复此步骤一次；
(7)小心弃去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100μL ddH2O，65℃溶解DNA。
也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
将检测草贝母和轮叶贝母的上游引物、下游引物和探针稀释至10μmol/L，然后等体积合并为混合引物(探针)，所述的实时荧光PCR反应体系为：
在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5s-10s。
将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：95℃ 10min，1个循环；95C 15s，58℃ 30s，40个循环，设立FAM和VIC双通道，在每次循环的58℃ 30s时收集荧光，检测完毕后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
4.所述确定质量控制指标
空白对照：以ddH2O为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阴性对照：以草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阳性对照：以含有草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36；
5.结果判定：
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分。
6.检测结果：
本发明实施例1将待检草贝母和轮叶贝母样品混合提取DNA后，进行实时荧光PCR检测，含有草贝母和轮叶贝母的样品显示如图1所示的阳性扩增曲线，表明该引物探针能对草贝母和轮叶贝母成分进行良好扩增。
实施例2
1.所用引物和探针：
选择草贝母和轮叶贝母rbcl基因作为对象，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
实时荧光PCR检测草贝母源性成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG
下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG
带有荧光染料的探针序列为：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA
所述的荧光染料，5‘端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。
实时荧光PCR检测轮叶贝母成分的引物探针，分别为：
上游引物P1：CTACTCGGGACCTCGCAAT
下游引物P2：CACCGCAGAGGCATCGAC
带有荧光染料的探针序列为：TCCTCGGACACTATTT。
所述的荧光染料，5‘端为VIC标记，3’端为MGB标记。
2.样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行：
(1)分别称取0.5g草贝母、轮叶贝母、川贝母、浙贝母和平贝母等样品粉碎后材料放入不同50mL离心管中；
(2)加入预热的10mLCTAB抽提裂解缓冲液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巯基乙醇)，振荡悬浮后65℃温浴1h，期间不断晃动，冷却至室温后，5000g离心10min；
(3)取上清950μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；
(4)取上清750μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；
(5)取上清500μL加入1.5mL离心管中，加入300μL异丙醇，50μL乙酸钾溶液，轻轻颠倒混匀，室温静置30min，12000rpm离心15min，弃上清；
(6)加入1.0mL70％乙醇溶液，将沉淀悬浮浸泡，并将离心管倾斜，轻轻转动数圈后室温静置2min，12000rpm离心10min，弃上清，如沉淀多重复此步骤一次；
(7)小心弃去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100μL ddH2O，65℃溶解DNA。
也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
将检测草贝母和轮叶贝母的上游引物、下游引物和探针稀释至10μmol/L，然后等体积合并为混合引物(探针)，所述的实时荧光PCR反应体系为：
在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5s-10s。
将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：95℃ 10min，1个循环；95℃ 15s，58℃ 30s，40个循环，设立FAM和VIC双通道，在每次循环的58℃ 30s时收集荧光，检测完毕后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
4.所述确定质量控制指标
空白对照：以ddH2O为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阴性对照：以草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阳性对照：以含有草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36；
5.结果判定：
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品基因FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分。
6.检测结果：
本发明实施例2将草贝母和轮叶贝母成分检测引物和探针分别对草贝母、轮叶贝母、川贝母、浙贝母和平贝母等DNA进行实时荧光PCR检测，结果显示样品川贝母、浙贝母和平贝母无扩增信号，只有草贝母和轮叶贝母有扩增信号，实施例2表明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。

Claims (6)

1.一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其特征为，实时荧光PCR检测草贝母和轮叶贝母成分的引物探针，分别为：
实时荧光PCR检测草贝母源性成分的引物探针，分别为：上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG，下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG，带有荧光染料的探针序列为：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA；
实时荧光PCR检测轮叶贝母成分的引物探针，分别为：上游引物P1：CTACTCGGGACCTCGCAAT，下游引物P2：CACCGCAGAGGCATCGAC，带有荧光染料的探针序列为：TCCTCGGACACTATTT。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其特征在于：检测草贝母成分探针的荧光染料为：5‘端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；检测轮叶贝母成分探针的荧光染料为：5‘端为VIC标记，3’端为MGB标记。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其特征在于如下步骤：
1)提取待检样品基因组DNA；
2)以所提取的DNA作为模板，加入权利要求1所述的引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方 法，其特征在于：将检测草贝母和轮叶贝母的上游引物、下游引物和探针稀释至10μmol/L，然后等体积合并为混合引物(探针)，所述的实时荧光PCR反应体系为：
。
5.根据权利要求4所述的一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR反应条件为95℃10min，1个循环；95℃15s，58℃30s，40个循环。
6.根据权利要求3、4和5所述的一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：
空白对照：以ddH2O为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阴性对照：以非草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40；
阳性对照：以含有草贝母和轮叶贝母基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct 值大于或等于40检测Ct值小于或等于36；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出草贝母和(或)轮叶贝母成分；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出草贝母和(或)轮叶贝母成分。
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