CN105274245B - 一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对 - Google Patents

一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对。本发明所提供的引物对，由引物DH‑1F和引物DH‑2R组成，引物DH‑1F和引物DH‑2R均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。利用引物DH‑1F和引物DH‑2R对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有多花黄精。实验证明，利用本发明提供的鉴定多花黄精的方法能够快捷而简便的鉴定多花黄精，以保障多花黄精临床用药的安全，具有重大的推广前景和应用价值。

Description

一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对。
背景技术
多花黄精(Polygonatum cyrtonema)是百合科黄精属的植物，是中国的特有植物，作为常用补益药，其药用历史已达2000余年之久，多花黄精主产于四川、贵州、湖南、湖北等地生长于海拔500米至2100米的地区，一般生于灌丛、林下和山坡阴处其味甘性平，入肺、脾、肾三经，有补气润肺、养阴、健脾益肾的功效。临床上用于脾胃气虚，营养不良、肺虚燥咳，精血不足等症。
2010年版《中国药典(一部)》规定作为黄精药用的有3种基源植物，分别为黄精(Polygonatum sibiricum Red)、多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)和滇黄精(Polygonatum ingianum Coll.et Hemsl.)。为保证用药安全，人们使用过多种方法对多花黄精进行真实性鉴定，然而多花黄精及其伪品的形态和化学成分高度相似，且传统形态学和化学鉴别常受到人为或环境因素的影响。但目前已报导的多花黄精的分子鉴别方法往往表现为重现性差、操作复杂、周期长等缺陷，不能满足实际需要，因此迫切需要建立快捷而简便的真伪品鉴定方法，以保障多花黄精临床用药的安全。
发明内容
本发明所要解决的技术问题如何快速、简便的鉴定多花黄精。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于鉴定多花黄精的引物对。
本发明所提供的用于鉴定多花黄精的引物对，可由引物DH-1F和引物DH-2R组成，所述引物DH-1F和所述引物DH-2R均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。
上述用于鉴定多花黄精的引物对中，所述引物DH-1F和所述引物DH-2R的摩尔比可为1:1。
上述用于鉴定多花黄精的引物对的应用，可为如下a1)-a6)中任一种：
a1)制备用于检测或辅助检测多花黄精的试剂盒；
a2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
a3)制备用于鉴定或辅助鉴定多花黄精的试剂盒；
a4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
a5)制备用于鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性的试剂盒；
a6)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
本发明还提供了用于鉴定多花黄精的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定多花黄精的试剂盒含有上述用于鉴定多花黄精的引物对。
本发明还保护上述用于鉴定多花黄精的试剂盒的制备方法，可包括将上述用于鉴定多花黄精的引物对的各引物分别单独包装的步骤。
上述用于鉴定多花黄精的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用于鉴定多花黄精的试剂盒的应用可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
b3)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有多花黄精的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的总DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有多花黄精。所述待测样品可为中药材，或，所述中药材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为多花黄精。所述待测样品可为中药材，或，所述中药材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
本发明还提供了一种鉴定市售多花黄精的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售多花黄精的基因组DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为伪品。
上述任一所述方法中，所述“能够实现有效扩增”可为PCR扩增产物中含有300-400bp的DNA片段。
上述任一所述方法中，所述“不能实现有效扩增”可为PCR扩增产物中不含有300-400bp的DNA片段。
所述300-400bp的DNA片段可为330bp的DNA片段。
所述330bp的DNA片段具体可为序列表中序列3所示的DNA片段。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度可为58℃～62℃。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度具体可为58℃。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃5min；94℃45s，58℃1min，30个～40个循环；72℃7min。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃5min；94℃45s，58℃1min，35个循环；72℃7min。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的待测样品的基因组DNA的浓度可为10ng～200ng。
上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的待测样品的基因组DNA的浓度具体可为100ng。
上述任一所述中药材可为多花黄精(Polygonatum cyrtonema)和/或玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)和/或小黄精(Polygonatum uncinatum Diels)和/或苦黄精和/或马铃薯(Solanum tuberosum)和/或红薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)和/或山药(Dioscorea opposita Thunb.)和/或生姜(Zingiber officinale Roscoe)和/或芋头(Colocasia esculenta(L.)Schoot)。
利用本发明提供的鉴定多花黄精的方法及其专用引物对能够快捷而简便的鉴定多花黄精，以保障多花黄精临床用药的安全，具有重大的推广前景和应用价值。
附图说明
图1为多花黄精及混淆品的基因组DNA。
图2为通用引物对PCR扩增凝胶电泳图。
图3为特异性PCR引物对的特异性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本实施例中的多花黄精(Polygonatum cyrtonema)、玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)、小黄精(Polygonatum uncinatum Diels)、苦黄精、马铃薯(Solanumtuberosum)、红薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)、山药(Dioscorea opposita Thunb.)、生姜(Zingiber officinale Roscoe)以及芋头(Colocasia esculenta(L.)Schoot)均为在采集地采集。采集信息见表1。各中药材均符合中国药典(2010年版)一部正文各药材项下的有关规定，通过鉴定，各位中药材实物与名称相符，质量符合标准。
表1.实验材料信息表
样品名称 采集地 采集时间
多花黄精(Polygonatum cyrtonema) 云南盐津县 2015.3
玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce) 云南昆明 2015.3
苦黄精 云南昆明 2015.3
小黄精(Polygonatum uncinatum Diels) 云南昆明 2015.3
马铃薯(Solanum tuberosum) 云南昆明 2015.7
红薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.) 云南昆明 2015.7
山药(Dioscorea opposita Thunb.) 云南昆明 2015.7
生姜(Zingiber officinale Roscoe) 云南昆明 2015.7
芋头(Colocasia esculenta(L.)Schoot) 云南昆明 2015.7
实施例1、制备用于鉴定多花黄精的试剂盒及其使用方法
一、用于鉴定多花黄精的引物对的设计与合成
从GenBank查找多花黄精及混淆品的psba-trnh序列和测序结果，使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出多花黄精特有的变异位点，发现多花黄精114bp处为C，而其他混淆品为T，410bp处正品多花黄精为A，而其他混淆品为C。根据多花黄精特有的变异位点设计并合成用于多花黄精鉴定的大量PCR引物对。
对获得的大量PCR引物对依次进行筛选、效果验证、特异性验证和灵敏度验证，最终获得一对特异性、灵敏度最佳的引物对如下：
引物DH-1F：5’-TGTATTAAGAATCGTTGAAGGAGTC-3’(序列表中序列1)；
引物DH-2R：5’-AGCTAATCATTTATCGAGAAAAATT-3’(序列表中序列2)。
引物DH-1F和引物DH-2R均为单链DNA分子。
理论PCR扩增产物的长度为330bp。
二、制备用于鉴定多花黄精的试剂盒
用于鉴定多花黄精的试剂盒为将步骤一合成的引物DH-1F和引物DH-2R分别单独包装后，与分别单独包装的10×PCR Buffer、Taq DNA polymerase、MgCl2(25mM)和dNTPs等包装于同一个试剂盒中。
三、鉴定待测样品中是否含有多花黄精的方法的建立
采用步骤二的试剂盒鉴定待测样品中是否含有多花黄精，步骤如下：
1、PCR扩增
提取待测样品的基因组DNA并以其作为模板，采用步骤二的试剂盒进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。
反应体系：待测样品的基因组DNA 100ng、10×PCR Buffer(Mg2+plus 20mM)2.5μL、Taq DNA polymerase(2U/μL)0.4μL、dNTPs(10mM)0.5μL、引物DH-1F和引物DH-2R各10pmol，用去离子水补至25μL。
反应程序：94℃5min；94℃45s，58℃1min，共35个循环；72℃7min。
2、PCR扩增产物检测
采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物，具体如下：
取5μL PCR扩增产物，采用1.5％琼脂糖凝胶，在电压80—90V下电泳30min，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小进行结果判定：若PCR扩增产物中含有大小约为330bp的目的条带(序列表的序列3)，则所述待测样本中含有或候选含有多花黄精；若PCR扩增产物中不含有大小约为330bp的目的条带(序列表的序列3)，则所述待测样本中不含有或候选不含有多花黄精。
实施例2、实施例1制备的用于鉴定多花黄精的试剂盒的特异性
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
1、取约1-2g待测样本(多花黄精(Polygonatum cyrtonema)、玉竹(Polygonatumodoratum(Mill.)Druce)、小黄精(Polygonatum uncinatum Diels)、苦黄精、马铃薯(Solanum tuberosum)、红薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)、山药(Dioscorea oppositaThunb.)、生姜(Zingiber officinale Roscoe)或芋头(Colocasia esculenta(L.)Schoot))的植物叶片或者块茎，用CTAB法提取基因组DNA进行电泳检测(实验结果见图1，图1中泳道M为DNA分子标准，泳道1-9分别为多花黄精基因组DNA、以玉竹基因组DNA、以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯基因组DNA、以山药基因组DNA、以生姜基因组DNA和以芋头基因组DNA)，待测样本的基因组DNA的浓度均在30ng/μl-50ng/μl之间。
2、以步骤1提取的待测样本的基因组DNA为模板，以人工合成的psbA-trnH-F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’和psbA-trnH-R：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’为通用引物，进行PCR扩增，检测待测样本的基因组DNA质量。
反应总体系为25μL，包括待测样本的基因组DNA 0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL、MgCl2(25mM)1.5μL、dNTPs(10mM)0.5μL、引物psbA-trnH-F和psbA-trnH-R各10pmol，用去离子水补至25μL。
反应程序：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃7min。
按照上述步骤，提取多花黄精基因组DNA，并将待测样本的基因组DNA替换为等体积的多花黄精基因组DNA，其它步骤均不变，进行PCR扩增反应，作为阳性对照。
按照上述步骤，将待测样本的基因组DNA替换为等体积的灭菌超纯水，其它步骤均不变，进行PCR扩增反应，作为空白对照。
实验结果见图2(泳道M为DNA分子标准，泳道1-9分别为以多花黄精基因组DNA、以玉竹基因组DNA、以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯基因组DNA、以山药基因组DNA、以生姜基因组DNA、以芋头基因组DNA和以灭菌超纯水为模板)，结果表明阳性对照和待测样本均能实现有效扩增，电泳显示含有大小约为330bp的目的条带；空白对照不能实现有效扩增，电泳显示不含有大小约为330bp的目的条带。将大小约为330bp的目的条带回收测序，其序列如序列表中序列3所示。可见待测样本的基因组DNA质量均满足要求。
3、以步骤1提取的待测样本的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一合成的引物DH-1F和引物DH-2R组成的引物对，进行PCR扩增。具体的反应体系和反应程序同实施例1步骤三1。实验同时设置以灭菌超纯水为模板的阴性对照。反应结束后，按照实施例1步骤三2的方法对待测样本进行结果判定。
实验结果见图3(泳道M为DNA分子标准，泳道1-9分别为以多花黄精基因组DNA、以玉竹基因组DNA、以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯基因组DNA、以山药基因组DNA、以生姜基因组DNA、以芋头基因组DNA和以灭菌超纯水为模板)。结果表明，仅多花黄精能够扩增出大小约为330bp的目的条带。将大小约为330bp的目的条带回收测序，其序列如序列表中序列3所示。这表明实施例1制备的用于鉴定多花黄精的试剂盒能够准确鉴定多花黄精。

Claims (10)

1.用于鉴定多花黄精的引物对，由引物DH-1F和引物DH-2R组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。
2.权利要求1所述引物对的应用，为如下a1）-a6）中任一种：
a1）制备用于检测或辅助检测多花黄精的试剂盒；
a2）检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
a3）制备用于鉴定或辅助鉴定多花黄精的试剂盒；
a4）鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
a5）制备用于鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性的试剂盒；
a6）鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
3.含有权利要求1所述引物对的试剂盒；所述试剂盒用于鉴定多花黄精。
4.权利要求3所述的试剂盒的制备方法，包括将权利要求1中所述引物DH-1F和所述引物DH-2R分别单独包装的步骤。
5.权利要求3所述试剂盒的应用，为如下b1）或b2）或b3）：
b1）检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
b2）鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
b3）鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
6.一种检测待测样品是否含有或候选含有多花黄精的方法，包括如下步骤：
提取待测样品的总DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有多花黄精。
7.一种鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精的方法，包括如下步骤：
提取待测样品的基因组DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为多花黄精。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述待测样品为中药材，或，所述中药材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
9.一种鉴定市售多花黄精的真伪性的方法，包括如下步骤：
提取市售多花黄精的基因组DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为伪品。
10.如权利要求6或7或9所述的方法，其特征在于：
所述 “能够实现有效扩增”为PCR扩增产物中含有330bp的DNA片段；
所述“不能实现有效扩增”为PCR扩增产物中不含有330bp的DNA片段。
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