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Abstract

本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定乌梢蛇的PCR方法及其特异引物。使用此方法鉴别乌梢蛇的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。主要用于乌梢蛇药材、乌梢蛇水提物、乌梢蛇醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件下乌梢蛇提取物、中药制剂(多种同类提取物)以及极限(高温、高压、长时间)条件处理中药制剂(多种同类提取物)的快速鉴定。

Description

一种鉴定乌梢蛇的PCR方法
技术领域
本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的PCR方法及其特异引物。主要用于乌梢蛇药材、乌梢蛇提取物、极限条件提取物，含有乌梢蛇的制剂以及极限条件处理的乌梢蛇制剂快速鉴定。
背景技术
乌梢蛇(Zaocys dhumnades(Cantor))为游蛇科动物，其干燥体可作为中药材，性甘，平，归肝经。具有祛风，通络，止痉等作用，应用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽取痉挛，破伤风，麻风等症。
乌梢蛇多于夏、秋二季捕捉，剖开其腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥。中药乌梢蛇多盘径约16cm，表面黑褐色或绿色，密被菱形鳞片，被鳞行数成双，背中央2～4行鳞片强烈起棱，形成两条纵贯全体的黑线。头盘在中间，扁圆形，眼大而下凹陷，有光泽。成品则为黄色粉末。
PCR方法：PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增物十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用最多的方法。
《中国药典》中已有PCR方法鉴定乌梢蛇药材的报道，但鉴定极限条件处理后的药物制剂中乌梢蛇的PCR方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中，存在粉碎、混合等环节，水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节，甚至是高温高压等条件处理，这些条件要么使乌梢蛇粉末变为混合物，要么使乌梢蛇因提取过程而被破坏掉大量有机成分，使得制剂中乌梢蛇的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种蛇类药材，或者使用多种蛇类和非蛇类动物药材，使得其它几味蛇类药材或非蛇类动物药材也存在干扰鉴定的可能，因而使制剂中乌梢蛇的鉴定变得十分困难。
发明内容
本发明提供了一种用于鉴定乌梢蛇药材、乌梢蛇提取物、极限提取物以及含乌梢蛇制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单，能快速准确的鉴定乌梢蛇粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。
一对鉴定乌梢蛇的特异引物：上游引物、下游引物，其序列为：
上游引物：5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’
下游引物：5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’
一种乌梢蛇的PCR鉴定方法，包括以下步骤：分为以下四个步骤：
1、制备样品：制备乌梢蛇粉末、采用加热冷凝回流装置制备乌梢蛇水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物，混合得到几种同类药材粉末并采用加热冷凝装置制备混合水提物、醇提物，高压条件下制备极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物。
2、样品DNA提取：从以上样品中提取DNA。
3、PCR反应：采用PCR方法得到PCR产物，95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃ 45s)，72℃ 5min，得到扩增产物。
4、以电泳鉴定扩增产物大小，以此鉴定乌梢蛇真伪，通过实验验证方法的稳定性。方法：1.5％凝胶、130V电泳25min，在370bp处有单一条带，则确定所检材料为乌梢蛇。
附图说明
图1为乌梢蛇粉末和其他蛇类药材粉末的PCR鉴定结果，结果如图1所示，乌梢蛇在370bp处有均一条带，而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分乌梢蛇粉末与易混淆品。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2～3为乌梢蛇粉末，4～6为蕲蛇粉末。
图2为金钱白花水提物和醇提物的PCR鉴定结果。金钱白花蛇水提物、醇提物提取物均在370bp处有均一条带，说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为乌梢蛇水提物，3为乌梢蛇醇提物，4为蕲蛇水提物，5为蕲蛇醇提物，6金钱白花蛇水提物，7为金钱白花蛇醇提物。
图3为极限(高温、高压、长时间)条件下金钱白花蛇水提物和醇提物的PCR鉴定结果。金钱白花蛇极限提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为乌梢蛇极限条件水醇提物，3为乌梢蛇极限条件醇提物，4为蕲蛇极限条件水提物，5为蕲蛇极限条件醇提物，6金钱白花蛇极限条件水提物，7为金钱白花蛇极限条件醇提物。
图4为几种同类药材混合粉末、混合水提物、混合醇提物、极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物鉴定结果。含有金钱白花蛇的制剂有条带，说明可以区分金钱白花蛇的真伪。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为乌梢蛇对照药材，2为多种同类药材混合粉末，3为混合水提物，4为混合醇提物，5为极限条件处理混合粉末，6为极限条件混合水提物，7为极限条件混合醇提物，8为金钱白花蛇和蕲蛇混合粉末，8为金钱白花蛇和蕲蛇混合水提物，9为金钱白花蛇和蕲蛇混合醇提物，10为极限条件下金钱白花蛇和蕲蛇混合粉末，11为极限条件金钱白花蛇和蕲蛇混合水提物， 12为极限条件金钱白花蛇和蕲蛇混合醇提物。
具体实施方法：
1材料
金钱白花蛇粉末、乌梢蛇粉末、蕲蛇粉末均由通化金马公司提供，乌梢蛇对照药材购自中国食品药品检查所。
2特异引物
上游引物：5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’
下游引物：5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’
3样品DNA提取
本发明采用的DNA提取方法为：取金钱白花蛇样品约0.1g至1.5mL离心管中，加入275μL消化液(细胞核裂解液200μL，0.5mol/L EDTA 50μL，蛋白酶K(20mg/mL)20μL，RNA酶溶液5μL)，55℃温育1h，加入250μLWizard SV Lysis Buffer混匀，加到离心管柱中，10000r/min离心2分钟；弃掉过滤液，加入800μL洗脱液(醋酸钾162.8mmol/L，Tris-HCl(pH7.5)22.6mmol/L，EDTA(pH8.0)0.019mmol/L，60％乙醇)，10000r/min离心1min；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min离心1分钟；弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μL ddH2O，室温放置2min后，10000r/min离心2min，滤液-20℃保存备用。
4 PCR反应
表1 PCR反应体系(25μL)
反应条件：95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃ 45s)，72℃ 5min。
5电泳检测
配制含Gel Red的1.5％琼脂糖凝胶，130V电泳25min，在凝胶在紫外透射仪上观察，产物应在370bp处有单一条带。

Claims (8)

1.建立一种鉴定乌梢蛇的方法：提取乌梢蛇样品的DNA，通过PCR扩增、电泳检测等过程，鉴定乌梢蛇及其提取物、极限条件提取物和制剂的真伪。
2.权利1的特征在于可以鉴定混合制剂中乌梢蛇的真伪，过程包括下列步骤：
1)制备样品：乌梢蛇粉末，乌梢蛇水提物和醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件提取的乌梢蛇水提物和醇提物，乌梢蛇与其他蛇类药材的混合制剂和极限(高温、高压、长时间)条件处理的乌梢蛇与其他蛇类药材的混合制剂。
2)样品DNA提取：从样品中提取DNA。
3)PCR反应：采用PCR方法得到PCR产物，93～95℃5min，30～40个循环(95℃30～45s，55～65℃30～45s，72℃30～45s)，72℃5min，得到扩增产物。
4)电泳鉴定：根据扩增产物大小，鉴定乌梢蛇真伪。
3.权利2中样品：乌梢蛇粉末，乌梢蛇水提物和醇提物，极限条件提取的乌梢蛇水提物和醇提物，乌梢蛇混合制剂，极限条件处理的乌梢蛇制剂：
1)乌梢蛇粉碎，得乌梢蛇细粉。
2)采用加热冷凝回流法提取，温度为100℃，料水比为1∶10，时间为2h，提取三次得乌梢蛇水提物和醇提物。
3)将乌梢蛇水提物和醇提物，121℃高压30min，制备限条件下乌梢蛇水提物和醇提物。
4)将几种蛇类药材混合得到混合制剂，采用加热冷凝回流提取混合水提物和醇提物，121℃高压30min得到极限条件下混合粉末和提取物。
4.权利2中乌梢蛇DNA提取：采用消化、离心、纯化的方法制备。
5.权利2中特异引物，其序列为：
上游引物：5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’
下游引物：5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’。
6.权利1中PCR反应体系采用25μL，包括：模板1μL，引物0.5μL，PCR Mix 12.5μL，ddH2O10.5μL。
7.PCR反应条件：采用PCR方法得到PCR产物，95℃预变性5min，30个循环(95℃变性30s，64℃45s)，72℃延伸5min，得到扩增产物。
8.权利2中电泳：1.5％凝胶、130V电泳30min，370bp处有单一条带，则确定所检材料为乌梢蛇。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439770A (zh) * 2018-12-13 2019-03-08 暨南大学 一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
CN109439660A (zh) * 2018-12-13 2019-03-08 暨南大学 一种特异性引物及中药材乌梢蛇的pcr鉴别方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560272A (zh) * 2004-03-01 2005-01-05 中国中医研究院中药研究所 高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
CN102827920A (zh) * 2011-06-14 2012-12-19 中国中医科学院中药研究所 一种乌梢蛇pcr检测试剂盒
CN103627699A (zh) * 2012-08-21 2014-03-12 中国中医科学院中药研究所 一种适用于dna扩增技术的中药材基因组dna提取方法
CN105624287A (zh) * 2015-12-22 2016-06-01 安徽安科余良卿药业有限公司 蛇胆汁的鉴别方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560272A (zh) * 2004-03-01 2005-01-05 中国中医研究院中药研究所 高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
CN102827920A (zh) * 2011-06-14 2012-12-19 中国中医科学院中药研究所 一种乌梢蛇pcr检测试剂盒
CN103627699A (zh) * 2012-08-21 2014-03-12 中国中医科学院中药研究所 一种适用于dna扩增技术的中药材基因组dna提取方法
CN105624287A (zh) * 2015-12-22 2016-06-01 安徽安科余良卿药业有限公司 蛇胆汁的鉴别方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO JIANG ET AL.: "Homogeneous fluorescent specific PCR for the authentication of medicinal snakes using cationic conjugated polymers", 《SCI REP》 *
孙立新主编: "《药物分析实验》", 30 November 2012, 中国医药科技出版社 *
崔占虎: "中成药中原料药材的分子鉴别研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
黄璐琦主编: "《分子生药学》", 30 June 2000, 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社 *
黄璐琦著: "《中药分子鉴定操作指南》", 30 April 2014, 上海科学技术出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439770A (zh) * 2018-12-13 2019-03-08 暨南大学 一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
CN109439660A (zh) * 2018-12-13 2019-03-08 暨南大学 一种特异性引物及中药材乌梢蛇的pcr鉴别方法

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