CN107779513A - 一种鉴定全蝎的pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定全蝎的PCR方法及其特异引物。使用此方法鉴别全蝎的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。主要用于全蝎药材、全蝎水提物、全蝎醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件全蝎提取物、中药制剂(多种同类动物药材)、混合水提物、混合醇提物以及极限(高温、高压、长时间)条件处理的中药制剂、混合水提物、混合醇提物的快速鉴定。

Description

一种鉴定全蝎的PCR方法
技术领域
本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的PCR方法及其特异引物。主要用于全蝎药材、全蝎提取物、极限条件提取物，含有全蝎的制剂以及极限条件处理的全蝎制剂快速鉴定。
背景技术
全蝎又名蝎子、全虫，是钳蝎科动物东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)的干燥体。具有息风镇痉、通络解毒、攻毒散结的作用。用于治疗惊风、抽搐痉挛、中风口眼歪斜、半身不遂、破伤风、淋巴结结核、疮疡肿毒等症，是一味常用的名贵中药，随着市场价格不断持续走高，市售全蝎掺假情况比较严重。全蝎作为动物药材临床功效确切，但商品来源复杂、药材形态鉴别困难，而且仅根据形态特征很难进行准确地鉴别。因此就要求快速、稳定、准确的鉴定方法。
PCR方法：PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增物十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用最多的方法。
国内虽已有PCR方法鉴定全蝎药材的报道，但鉴定极限条件处理后的药物制剂中全蝎的PCR方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中，存在粉碎、混合等环节，水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节，甚至是高温高压等条件处理，这些条件要么使全蝎粉末变为混合物，要么使全蝎因提取过程而被破坏掉大量有机成分，使得制剂中全蝎的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种动物类药材，或者使用多种动物类药材，使得其它几味动物类药材也存在干扰鉴定的可能，因而使制剂中全蝎的鉴定变得十分困难。
发明内容
本发明提供了一种用于鉴定全蝎药材、全蝎提取物、极限提取物以及含全蝎制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单，能快速准确的鉴定全蝎粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。
一对鉴定全蝎的特异引物：上游引物、下游引物，其序列为：
上游引物：5’-CATGATATGCTAGTGGCTATGACTG-3’
下游引物：5’-TTTTCCTAGCCATCCACTACC-3’
一种全蝎的PCR鉴定方法，包括以下步骤：分为以下四个步骤：
1、制备样品：制备全蝎粉末、采用加热冷凝回流装置制备全蝎水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物，混合得到全蝎制剂并高压制备极限条件处理后的全蝎制剂。
2、样品DNA提取：从以上样品中提取DNA。
3、PCR反应：采用PCR方法得到PCR产物，95℃ 5min，35个循环(95℃ 30s，58℃30s，72℃ 30s)，72℃ 5min，得到扩增产物。
4、以电泳鉴定扩增产物大小，以此鉴定全蝎真伪，通过实验验证方法的稳定性。方法：1.5％凝胶、130V电泳25min，在230bp处有单一条带，则确定所检材料为全蝎。
附图说明
图1为全蝎粉末和其他动物药材粉末的PCR鉴定结果，结果如图1所示，全蝎在230bp处有均一条带，而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分全蝎粉末与易混淆品。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为全蝎对照药材，2～3为全蝎粉末，4～5为蜈蚣粉末，6～7为地龙粉末，8～9为土鳖虫粉末。
图2为全蝎水提物和醇提物的PCR鉴定结果。全蝎水提物、醇提物提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定全蝎的提取物。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1～2为全蝎水提物，3～4为全蝎醇提物，5为蜈蚣水提物，6为蜈蚣醇提物，7为地龙水提物，8为地龙醇提物，9为土鳖虫水提物，10为土鳖虫醇提物。
图3为极限(高温、高压、长时间)条件下全蝎提取物的PCR鉴定结果。全蝎极限提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定全蝎的提取物。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1～2为全蝎对照药材，3为全蝎极限水提物，4为全蝎极限醇提物，5为蜈蚣极限条件水提物，6为蜈蚣极限条件醇提物，7为地龙极限条件水提物，8为地龙极限条件醇提物，9为土鳖虫极限条件水提物，10为土鳖虫极限条件醇提物。
图4为多种同类动物类药材混合制剂、混合水提物、混合醇提物、极限条件处理的混合制剂、混合水提物、混合醇提物的鉴定结果。含有全蝎的制剂有条带，说明可以区分全蝎的真伪。M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为全蝎对照药材，2为多种药材混合粉末，3为混合水提物，4为混合醇提物，5为极限条件处理混合粉末，6为极限条件下混合水提物，7为极限条件下混合醇提物，8为蜈蚣地龙土鳖虫混合粉末，9为蜈蚣地龙土鳖虫混合水提物，10为蜈蚣地龙土鳖虫混合醇提物，11为极限条件下蜈蚣地龙土鳖虫为混合粉末，12为极限条件下蜈蚣地龙土鳖虫混合水提物，13为极限条件下蜈蚣地龙土鳖虫混合醇提物。
具体实施方法：
1材料
全蝎粉末、蜈蚣粉末、地龙粉末、土鳖虫粉末均由通化金马公司提供；全蝎对照药材，购自中国食品药品检定研究所
2特异引物
上游引物：5’-CATGATATGCTAGTGGCTATGACTG-3’
下游引物：5’-TTTTCCTAGCCATCCACTACC-3’
3样品DNA提取
本发明采用的DNA提取方法为：取全蝎样品约0.1g至1.5mL离心管中，加入275μL消化液(细胞核裂解液200μL，0.5mol/L EDTA 50μL，蛋白酶K(20mg/mL)20μL，RNA酶溶液5μL)，55℃温育1h，加入250μLWizard SV Lysis Buffer混匀，加到离心管柱中，10000r/min离心2分钟；弃掉过滤液，加入800μL洗脱液(醋酸钾162.8mmol/L，Tris-HCl(pH7.5)22.6mmol/L，EDTA(pH8.0)0.019mmol/L，60％乙醇)，10000r/min离心1min；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min离心1分钟；弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μL ddH2O，室温放置2min后，10000r/min离心2min，滤液-20℃保存备用。
4PCR反应
表1 PCR反应体系(25μL)
反应条件：95℃ 5min，35个循环(95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 5min。
5电泳检测
配制含Gel Red的1.5％琼脂糖凝胶，130V电泳25min，在凝胶在紫外透射仪上观察，产物应在230bp处有单一条带。

Claims (8)

1.建立一种鉴定全蝎的方法：提取全蝎样品的DNA，通过PCR扩增、电泳检测等过程，鉴定全蝎及其提取物、极限条件提取物和制剂的真伪。
2.权利1的特征在于可以鉴定混合制剂中全蝎的真伪，过程包括下列步骤：
1)制备样品：全蝎粉末，全蝎水提物和醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件提取的全蝎水提物和醇提物，全蝎与其他蛇类药材的混合制剂和极限(高温、高压、长时间)条件处理的全蝎与其他动物类药材的混合制剂。
2)样品DNA提取：从样品中提取DNA。
3)PCR反应：采用PCR方法得到PCR产物，93～95℃5min，30～40个循环(95℃30～45s，55～65℃30～45s，72℃30～45s)，72℃5min，得到扩增产物。
4)电泳鉴定：根据扩增产物大小，鉴定全蝎真伪。
3.权利2中样品：全蝎粉末，全蝎水提物和醇提物，极限条件提取的全蝎水提物和醇提物，全蝎混合制剂，极限条件处理的全蝎制剂：
1)全蝎粉碎，得全蝎细粉。
2)采用加热冷凝回流法提取，温度为100℃，料水比为1∶10，时间为2h，提取三次得全蝎水提物和醇提物。
3)将全蝎水提物和醇提物，121℃高压30min，得极限条件提取全蝎水提物和醇提物。
4)将几种动物类药材混合得到混合制剂，将混合制剂采用加热冷凝回流法提取，得到混合水提物和混合醇提物，利用121℃高压30min得到极限条件处理的制剂、混合水提物、混合醇提物。
4.权利2中全蝎DNA提取：采用消化、离心、纯化的方法制备。
5.权利2中特异引物，其序列为：
上游引物：5’-CATGATATGCTAGTGGCTATGACTG-3’
下游引物：5’-TTTTCCTAGCCATCCACTACC-3’
6.权利1中PCR反应体系采用25μL，包括：模板1μL，引物0.5μL，PCR Mix 12.5μL，ddH2O10.5μL。
7.PCR反应条件：采用PCR方法得到PCR产物，95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30s，58℃30s，72℃30s)，72℃延伸5min，得到扩增产物。
8.权利2中电泳：1.5％凝胶、130V电泳30min，230bp处有单一条带，则确定所检材料为全蝎。
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