CN103627699A - 一种适用于dna扩增技术的中药材基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于扩增技术的基因组DNA快速提取方法，仅采用氢氧化钠溶液和Tris-HCl溶液，极为简单经济。本发明采用的提取方法，15min就可以完成样品DNA提取的全过程，该法通用性强，对于植物药、动物药的饮片及其炮制品均具有良好的提取效果。所提取的DNA质量满足了下游PCR扩增的需要，解决了目前中药材普通PCR反应模板DNA提取时间长、工作量大的问题，适用于科研和生产过程中快速提取DNA的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速提取中药材基因组DNA的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
1985年问世的PCR反应(聚合酶链式反应)是一种体外核酸扩增技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简便、重复性好，易于自动化的特点，已被广泛用于生命科学、医学、药学的各个领域，成为医药研究不可或缺的手段。除此之外，等温扩增技术包括Q复制酶反应(QBRA)、链置换扩增技术(SDA)、切口酶恒温扩增技术(NEMA)、转录依赖的扩增技术(TASTMA、3SR、NASBA)、解旋酶扩增技术(HAD)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、单引物等温扩增技术(SPIA)等简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间，在中药鉴定领域具有很好的发展前景。(Walker GT，Fraiser MS，Schram JL，et al.Stranddisplacement amplification「is othermal，in vitro DNA amplification technique.Nucleic Acids Research，1992，20(7)：1691-1696；Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，ct al.Loop「mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research，2000，28(12)：63.)
DNA扩增技术的第一步是模板DNA的制备，即样品中DNA的提取。长期以来DNA的提取一直是PCR检测过程中最耗时，繁琐的步骤，严重影响了检测的速度。对于中药研究来说，中药材品种繁多，各品种差异大，基因组DNA提取的工作量非常巨大。传统的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法或SDS(十二烷基硫酸钠)法通过使用CTAB或SDS裂解细胞，酚/氯仿抽提蛋白质，异丙醇沉淀DNA，乙醇洗涤，适用于大多数中药材基因组DNA的提取。然而，CTAB法或SDS法流程繁琐、操作复杂，一般需要5小时以上才能提取出DNA。并且操作过程中使用了大量的酚/氯仿、β-巯基乙醇、异丙醇的有机溶剂，有损于操作人员的身体健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种可大规模、简单快速的中药材基因组DNA提取方法，用于DNA扩增技术鉴别中药材及研究遗传多样性。本发明通过以下技术方案实现：
(1)取供试品中药材20-50mg，置于粉碎机中研磨至可过40目筛，放入2.0mL的微量离心管内。
(2)加入200-400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液，混匀2-3min。
(3)加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)，温和混匀。
(4)12000rpm下离心2min。
(5)取50μL上清至一新的1.5mL离心管，加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)。取1μL上清，加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本方法具有简单、快速、节约试剂及耗材、污染小等特点，可用于规模化提取。(2)本方法通用性强，对于植物药、动物药的饮片及炮制品均具有良好的提取效果。
为了能更清晰地说明本发明的提取方法，下面结合具体实施案例，对本发明的提取方法进行进一步阐述。
附图说明
图1：植物类中药材PsbA-trnH片段PCR扩增电泳图
1，金银花；2，红花；3，辛夷；4，藿香；5，人参；6，苍耳子；7，枸杞子；8，车前子；9，葶苈子；10，菟丝子；11，石楠叶；12，紫苏叶；13，苦参；14，葛根；15，当归；16，预知子；17，白芍；18，厚朴(发汗)；19，竹叶；20，黄芩；21，丹皮；22，龙胆；23，大黄(酒制)；24，吴茱萸(甘草制)；25，大血藤；26，黄连；27，鸭趾草；28，草乌(煮制)；29，苦参；30，山药(蒸制)；31，槐米；33，草豆蔻；34，甘草(炙)；35，姜黄；36，决明子。
图2：动物类中药材COI片段PCR扩增电泳图
M，DL2000DNA marker；N，阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，土鳖虫；4，地龙；
图3：乌梢蛇特异性鉴别引物PCR扩增电泳图
M，DL2000DNA marker；N，阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，地龙；4，全蝎；5，全蝎。
具体实施例1
1.材料和方法
1.1材料
所用材料如表1所示，包括：
表1 中药材相关样品基本情况
1.2实验仪器
台式高速离心机(Eppendorf公司)、9700基因扩增仪(ABI公司)、电泳仪、紫外凝胶成像仪。
1.3方法
模板DNA的提取：取供试品中药材20-50mg，置于粉碎机中研磨至可过40目筛，放入2.0mL的微量离心管内；加入400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液，混匀2-3min；加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)，温和混匀；12000rpm下离心2min；取50μL上清至一新的1.5mL离心管，加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)；取1μL上清，加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
PCR扩增：PCR反应体系25μL含2.5μL10×Ex taq缓冲液、2μL0.25mmol/L dNTPs；植物类中药材使用上游引物PsbA：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，下游引物trnH：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATC-3’，动物类中药材使用上游引物COI.F：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物COI.R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCAG-3’各0.25pmol；0.8U Ex Taq DNA聚合酶，1μL上述DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸7min；反应结束后4℃保存。
产物鉴定：扩增产物在加入了EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳；电压180V，电泳时间15min，于凝胶成像系统下观察。
2.结果
植物类中药材通用引物PsbA-trnH的PCR扩增结果见图1，动物类中药材通用引物COI的PCR扩增结果见图2。植物类中药材和动物类中药材均可获得单一，良好的扩增结果。
具体实施例2
1.材料
材料为乌梢蛇、金钱白花蛇、地龙、全蝎；方法同实施案例1，本实施案例与实施案例1的不同点在于使用乌梢蛇特异性鉴别引物WSS-1：5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’，和WSS-2：5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’；PCR反应体系：PCR反应体系25μL含2.5μL10×ExTaq缓冲液、2μL0.25mmol/L dNTPs；上游引物和下游引物各0.25pmol；0.8U Ex taq DNA聚合酶，1μL上述DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃延伸30s，38个循环；72℃延伸7min；反应结束后4℃保存。
2.结果
针对本发明所使用方法提取乌梢蛇、金钱白花蛇、地龙、全蝎基因组DNA，使用乌梢蛇特异性引物WSS-1和WSS-2进行扩增，结果见图3，仅乌梢蛇可扩增出330bp条带。
在详述具体实施案例后可知，本发明与现有技术相比，具有(1)本发明操作过程简单，整个提取过程在两个微量离心管内进行，避免使用了有毒的酚/氯仿等有机试剂，所使用提取溶液无毒害性，对人体和环境不会造成污染。(2)本发明操作过程快速，与常规需要4-5小时提取来说，采用本法仅需要15min即可完成DNA提取的全过程。(3)本发明所示方法适应性广，对植物类，动物类中药材及其炮制品均具有良好的提取效果，可用于中药材鉴定及遗传多样性分析等各个领域。
Claims (4)
1.一种快速提取中药材基因组DNA的方法，其特征包括以下步骤：
(1)取供试品中药材20-50mg，置于粉碎机中研磨至可过40目筛，放入2.0mL的微量离心管内；(2)加入200-400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液，混匀2-3min；(3)加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)，温和混匀；(4)12000rpm下离心2min；(5)取50μL上清至一新的1.5mL离心管，加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)。取1μL上清，加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
2.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法，其中所述的供试品中药材包括动物类中药材和植物类中药材。
3.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法，其中所述的供试品中药材包括无霉变的新鲜植物药材，干性粉末，愈伤组织，饮片及炮制后的动植物药材。
4.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法，其中所述的氢氧化钠溶液浓度为0.25-0.6mol/L，Tris-HCl溶液的浓度为100mmol/L，pH为8.0。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104000857A (zh) * | 2014-06-13 | 2014-08-27 | 江南大学 | 一种从中药材中提取常用中药并用maldi-tof-ms鉴定的方法 |
| CN104164493A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 南方医科大学 | 基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 |
| CN104962656A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-10-07 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法 |
| CN107012230A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-04 | 北京康仁堂药业有限公司 | 采用特异性引物鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法 |
| CN107663542A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 周亚伟 | 一种鉴定乌梢蛇的pcr方法 |
| CN109439770A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-08 | 暨南大学 | 一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1608780A1 (en) * | 2003-03-31 | 2005-12-28 | McMASTER UNIVERSITY | Aptamer selection method |
| CN101967473A (zh) * | 2010-10-15 | 2011-02-09 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种提取鱼类基因组dna的方法 |
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2012
- 2012-08-21 CN CN201210296810.7A patent/CN103627699A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1608780A1 (en) * | 2003-03-31 | 2005-12-28 | McMASTER UNIVERSITY | Aptamer selection method |
| CN101967473A (zh) * | 2010-10-15 | 2011-02-09 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种提取鱼类基因组dna的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 孙利萍 等: "碱裂解法快速提取番茄DNA的研究", 《河南农业大学学报》, 30 April 2012 (2012-04-30) * |
| 郭国华: "《临床中药辞典》", 31 December 2007, 湖南科学技术出版社, article "番茄", pages: 591 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104000857A (zh) * | 2014-06-13 | 2014-08-27 | 江南大学 | 一种从中药材中提取常用中药并用maldi-tof-ms鉴定的方法 |
| CN104164493A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 南方医科大学 | 基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 |
| CN104962656A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-10-07 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种快速鉴别金钱白花蛇的TaqMan探针引物混合物、试剂盒和荧光定量PCR检测方法 |
| CN107663542A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 周亚伟 | 一种鉴定乌梢蛇的pcr方法 |
| CN107012230A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-04 | 北京康仁堂药业有限公司 | 采用特异性引物鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法 |
| CN109439770A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-08 | 暨南大学 | 一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法 |
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