CN103627699A - 一种适用于dna扩增技术的中药材基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于扩增技术的基因组DNA快速提取方法,仅采用氢氧化钠溶液和Tris-HCl溶液,极为简单经济。本发明采用的提取方法,15min就可以完成样品DNA提取的全过程,该法通用性强,对于植物药、动物药的饮片及其炮制品均具有良好的提取效果。所提取的DNA质量满足了下游PCR扩增的需要,解决了目前中药材普通PCR反应模板DNA提取时间长、工作量大的问题,适用于科研和生产过程中快速提取DNA的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速提取中药材基因组DNA的方法,属于分子生物学技术领域。
背景技术
1985年问世的PCR反应(聚合酶链式反应)是一种体外核酸扩增技术,因其具有敏感性高、特异性强、操作简便、重复性好,易于自动化的特点,已被广泛用于生命科学、医学、药学的各个领域,成为医药研究不可或缺的手段。除此之外,等温扩增技术包括Q复制酶反应(QBRA)、链置换扩增技术(SDA)、切口酶恒温扩增技术(NEMA)、转录依赖的扩增技术(TASTMA、3SR、NASBA)、解旋酶扩增技术(HAD)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、单引物等温扩增技术(SPIA)等简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间,在中药鉴定领域具有很好的发展前景。(Walker GT,Fraiser MS,Schram JL,et al.Stranddisplacement amplification「is othermal,in vitro DNA amplification technique.Nucleic Acids Research,1992,20(7):1691-1696;Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,ct al.Loop「mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,2000,28(12):63.)
DNA扩增技术的第一步是模板DNA的制备,即样品中DNA的提取。长期以来DNA的提取一直是PCR检测过程中最耗时,繁琐的步骤,严重影响了检测的速度。对于中药研究来说,中药材品种繁多,各品种差异大,基因组DNA提取的工作量非常巨大。传统的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法或SDS(十二烷基硫酸钠)法通过使用CTAB或SDS裂解细胞,酚/氯仿抽提蛋白质,异丙醇沉淀DNA,乙醇洗涤,适用于大多数中药材基因组DNA的提取。然而,CTAB法或SDS法流程繁琐、操作复杂,一般需要5小时以上才能提取出DNA。并且操作过程中使用了大量的酚/氯仿、β-巯基乙醇、异丙醇的有机溶剂,有损于操作人员的身体健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种可大规模、简单快速的中药材基因组DNA提取方法,用于DNA扩增技术鉴别中药材及研究遗传多样性。本发明通过以下技术方案实现:
(1)取供试品中药材20-50mg,置于粉碎机中研磨至可过40目筛,放入2.0mL的微量离心管内。
(2)加入200-400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液,混匀2-3min。
(3)加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0),温和混匀。
(4)12000rpm下离心2min。
(5)取50μL上清至一新的1.5mL离心管,加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0)。取1μL上清,加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
本发明的有益效果主要体现在:(1)本方法具有简单、快速、节约试剂及耗材、污染小等特点,可用于规模化提取。(2)本方法通用性强,对于植物药、动物药的饮片及炮制品均具有良好的提取效果。
为了能更清晰地说明本发明的提取方法,下面结合具体实施案例,对本发明的提取方法进行进一步阐述。
附图说明
图1:植物类中药材PsbA-trnH片段PCR扩增电泳图
1,金银花;2,红花;3,辛夷;4,藿香;5,人参;6,苍耳子;7,枸杞子;8,车前子;9,葶苈子;10,菟丝子;11,石楠叶;12,紫苏叶;13,苦参;14,葛根;15,当归;16,预知子;17,白芍;18,厚朴(发汗);19,竹叶;20,黄芩;21,丹皮;22,龙胆;23,大黄(酒制);24,吴茱萸(甘草制);25,大血藤;26,黄连;27,鸭趾草;28,草乌(煮制);29,苦参;30,山药(蒸制);31,槐米;33,草豆蔻;34,甘草(炙);35,姜黄;36,决明子。
图2:动物类中药材COI片段PCR扩增电泳图
M,DL2000DNA marker;N,阴性对照;1,乌梢蛇;2,金钱白花蛇;3,土鳖虫;4,地龙;
图3:乌梢蛇特异性鉴别引物PCR扩增电泳图
M,DL2000DNA marker;N,阴性对照;1,乌梢蛇;2,金钱白花蛇;3,地龙;4,全蝎;5,全蝎。
具体实施例1
1.材料和方法
1.1材料
所用材料如表1所示,包括:
表1 中药材相关样品基本情况
1.2实验仪器
台式高速离心机(Eppendorf公司)、9700基因扩增仪(ABI公司)、电泳仪、紫外凝胶成像仪。
1.3方法
模板DNA的提取:取供试品中药材20-50mg,置于粉碎机中研磨至可过40目筛,放入2.0mL的微量离心管内;加入400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液,混匀2-3min;加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0),温和混匀;12000rpm下离心2min;取50μL上清至一新的1.5mL离心管,加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0);取1μL上清,加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
PCR扩增:PCR反应体系25μL含2.5μL10×Ex taq缓冲液、2μL0.25mmol/L dNTPs;植物类中药材使用上游引物PsbA:5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’,下游引物trnH:5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATC-3’,动物类中药材使用上游引物COI.F:5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物COI.R:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCAG-3’各0.25pmol;0.8U Ex Taq DNA聚合酶,1μL上述DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增,循环参数为94℃预变性5min;94℃变性30s,50-60℃退火30s,72℃延伸30s,38个循环;72℃延伸7min;反应结束后4℃保存。
产物鉴定:扩增产物在加入了EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳;电压180V,电泳时间15min,于凝胶成像系统下观察。
2.结果
植物类中药材通用引物PsbA-trnH的PCR扩增结果见图1,动物类中药材通用引物COI的PCR扩增结果见图2。植物类中药材和动物类中药材均可获得单一,良好的扩增结果。
具体实施例2
1.材料
材料为乌梢蛇、金钱白花蛇、地龙、全蝎;方法同实施案例1,本实施案例与实施案例1的不同点在于使用乌梢蛇特异性鉴别引物WSS-1:5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’,和WSS-2:5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’;PCR反应体系:PCR反应体系25μL含2.5μL10×ExTaq缓冲液、2μL0.25mmol/L dNTPs;上游引物和下游引物各0.25pmol;0.8U Ex taq DNA聚合酶,1μL上述DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增,循环参数为94℃预变性5min;94℃变性30s,63℃延伸30s,38个循环;72℃延伸7min;反应结束后4℃保存。
2.结果
针对本发明所使用方法提取乌梢蛇、金钱白花蛇、地龙、全蝎基因组DNA,使用乌梢蛇特异性引物WSS-1和WSS-2进行扩增,结果见图3,仅乌梢蛇可扩增出330bp条带。
在详述具体实施案例后可知,本发明与现有技术相比,具有(1)本发明操作过程简单,整个提取过程在两个微量离心管内进行,避免使用了有毒的酚/氯仿等有机试剂,所使用提取溶液无毒害性,对人体和环境不会造成污染。(2)本发明操作过程快速,与常规需要4-5小时提取来说,采用本法仅需要15min即可完成DNA提取的全过程。(3)本发明所示方法适应性广,对植物类,动物类中药材及其炮制品均具有良好的提取效果,可用于中药材鉴定及遗传多样性分析等各个领域。
Claims (4)
1.一种快速提取中药材基因组DNA的方法,其特征包括以下步骤:
(1)取供试品中药材20-50mg,置于粉碎机中研磨至可过40目筛,放入2.0mL的微量离心管内;(2)加入200-400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液,混匀2-3min;(3)加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0),温和混匀;(4)12000rpm下离心2min;(5)取50μL上清至一新的1.5mL离心管,加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=8.0)。取1μL上清,加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
2.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法,其中所述的供试品中药材包括动物类中药材和植物类中药材。
3.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法,其中所述的供试品中药材包括无霉变的新鲜植物药材,干性粉末,愈伤组织,饮片及炮制后的动植物药材。
4.如权利要求书1所述中药材基因组DNA快速提取方法,其中所述的氢氧化钠溶液浓度为0.25-0.6mol/L,Tris-HCl溶液的浓度为100mmol/L,pH为8.0。
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