CN105331711A - 一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光pcr引物和探针及其应用 - Google Patents

一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光pcr引物和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开<b>一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光</b><b>PCR</b><b>引物和探针及其应用</b>。所述引物包手上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，上游引物Culex-F的序列为SEQ？ID？NO.1所示的序列，下游引物Culex-R的序列为SEQ？ID？NO.2所示的序列；所述探针为Tritaeniorhynchus-P，MGB探针Tritaeniorhynchus-P的序列为SEQ？ID？NO.3所示的序列。利用上述引物和探针建立的实时荧光PCR检测方法能够快速、准确、特异的从海滨库蚊亚组蚊种中鉴定出三带喙库蚊，需要时可取单只蚊腿提取DNA进行鉴定，且可对蚊生活史各个阶段标本进行鉴定，对残缺标本也可进行鉴定。对实际工作而言，媒介鉴定工作无需媒介专家在场，可由一般实验人员进行，具有较好的推广应用价值。

Description

一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光 PCR 引物和探针及其应用
技术领域
本发明属于昆虫鉴定技术领域。更具体地，涉及一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的实时荧光PCR引物和探针及其应用。
背景技术
三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）属双翅目蚊科库蚊属库蚊亚属海滨库蚊组海滨库蚊亚组，兼吸人和动物血，是流行性乙型脑炎的主要传播媒介。主要分布：国内除新疆、西藏未见记录，分布于全国各地；国外分布于巴基斯坦、印度、孟加拉国、斯里兰卡、缅甸、泰国、柬埔寨、越南、马来西亚、新加坡、印度尼西亚、菲律宾、日本、朝鲜、原苏联、中东、东非等。
海滨库蚊亚组蚊种包括：海滨库蚊、三带喙库蚊、白霜库蚊、环带库蚊、伪杂鳞库蚊等，主要鉴定特征是翅无显著的黑白斑，但雄蚊尾器结构复杂，同一亚组形态特征极为接近，鉴定难度大。三带喙库蚊是该亚组中具有重要医学意义的蚊种，主要鉴别特征：头顶竖鳞暗而平齐；盾鳞暗棕呈花椒色；雄蚊触须第3节腹面有一行垂毛；雌蚊食窦甲齿纤维状；后股末端黑环很窄；幼虫7-Ⅰ分2芒枝；栉齿末端圆而有繸。但受限于鉴定人员的经验积累，仅凭形态学鉴定将三带喙库蚊与同一亚属蚊种进行鉴别需要有丰富经验；同时在捕获不同发育阶段蚊种时，需培养至成虫进行鉴定，耗时较长；因采集工具等原因破坏标本的完整性，给形态学鉴定带来更大困难。
传统媒介蚊种形态学鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，随着分子生物学技术发展，基于DNA序列的物种分子鉴定技术应运而生，该技术不受蚊虫发育阶段和性别限制，且只需一部分组织提取到足够量的核酸也可进行分类鉴定，成为传统形态学鉴定的重要补充。蚊类分子鉴定技术主要包括以下几种方法：1、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），结果稳定可靠，重复性好，但灵敏度不高，不易自动化；2、随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），技术简单，检测速度快，但实验的稳定性和重复性差；3、基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段（amplified fragment length polymorphism），兼具RAPD与RFLP的优点，有较高稳定性，但对基因组制备纯度要求较高；4、DNA芯片技术，用于多种分子标记检测，但设备和检测成本较高；5、DNA测序技术，结果直观可靠，可对传统分类有疑问的类群或形态分类不能解决的问题进行分析探讨，也可对传统分类系统进行验证，但也存在成本较高，耗时较长问题；6、PCR和荧光PCR技术，通过扩增特异性片段进行物种鉴定，操作简便，成本较低，但找到适用的物种特异性DNA片段是难点。
Lydia A. Hill等建立快速鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊和盾蚊伊蚊实时荧光PCR方法，适用于蚊发育各个阶段的鉴定。与普通PCR相比，荧光PCR具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短等优点。同时荧光PCR的扩增和产物分析都在一封闭的管中进行，较之传统的PCR方法大大减少了污染的几率，也具有较好的生物安全性。对于三带喙库蚊的荧光PCR鉴定方法还未有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服形态学鉴定海滨库蚊亚组蚊种鉴定难题，提供一种一种快速、准确、特异性高、敏感性强的鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR方法和试剂盒。
本发明的目的是提供上述实时荧光PCR的引物、MGB探针和检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，上游引物Culex-F由SEQ ID NO.1所示的序列，下游引物Culex-R由SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针为Tritaeniorhynchus-P探针，探针Tritaeniorhynchus-P由SEQ ID NO.3所示的序列。荧光PCR上游引物Culex-F为SEQ ID NO.1所述的序列：5’-TTCAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3’；荧光PCR下游引物Culex-R为SEQ ID NO.2所述的序列：5’- TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG -3’；荧光PCR探针Tritaeniorhynchus-P为SEQ ID NO.3所述的序列：FAM-5'-ACAGTTTATCCACCTCT-3'-MGB。
所述探针Tritaeniorhynchus-P的5’端标记有FAM，3’端标记有非荧光淬灭基团NFQ和MGB。
本发明所述三带喙库蚊实时荧光PCR引物和探针在鉴定三带喙库蚊方面的应用。
本发明所述三带喙库蚊实时荧光PCR引物和探针在制备三带喙库蚊鉴定试剂或试剂盒中的应用。
本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的荧光PCR检测方法，其PCR反应所用的引物和探针为权利要求1所述的引物和探针。
本发明所述的PCR反应体系为：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F 0.625μL，10μmol/L下游引物Culex-R 0.5μL，10μ℃ mol/L荧光探针Tritaeniorhynchus-P 1.25μL，2×实时荧光PCR预混试剂和余量ddH2O，共25μL；
PCR反应程序为：预变性94℃ 2min；94℃5s，58℃ 45s，共40个循环；58℃收集荧光信号；根据扩增曲线、Ct值确定检测结果的阴性和阳性；
其中，实时荧光PCR预混试剂包含有实时荧光PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。
本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的试剂盒，包括：权利要求 1 或 2 所述的上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，以及Tritaeniorhynchus-P探针，实时荧光PCR反应体系中的DNA聚合酶、荧光PCR预混试剂，其中荧光PCR预混试剂包含有实时荧光PCR反应所需要的缓冲液和dNTP。
上述的单份25μL的实时荧光PCR反应体系使用的DNA聚合酶量为0.5~1U；单份25μL的实时荧光PCR反应体系中各dNTP的终浓度为0.2mmol/L。
本发明公开一组用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针，所述引物包手上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，上游引物Culex-F的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物Culex-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针为Tritaeniorhynchus-P，MGB探针Tritaeniorhynchus-P的序列如SEQ ID NO.3所示。
其中所述探针Tritaeniorhynchus-P的5’端有报告荧光基团FAM，3’端为非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
上述鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针在鉴定三带喙库蚊方面的应用也在本发明的保护范围之内。
上述鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针在制备鉴定三带喙库蚊试剂或试剂盒方面的应用也在本发明的保护范围之内。
应用时，所述引物的优选退火温度为58℃。
本发明还以上述引物和探针建立了一种鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR方法。
PCR反应体系为：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F 0.625μL，10μmol/L下游引物Culex-R 0.5μL，10μmol/L荧光探针Tritaeniorhynchus-P 1.25μL，2×实时荧光PCR预混试剂和余量ddH2O，共25μL。
PCR反应程序：预变性95℃ 30s；95℃5s，58℃ 45s，共40个循环。
其中，所述实时荧光PCR预混试剂为商品化的宝生物（大连）有限公司的Premix Ex Taq™ （Probe qPCR）试剂，包含有实时荧光PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。PCR反应程序根据所选用试剂不同可进行调整。
另外，上述引物和探针构建的三带喙库蚊鉴定试剂盒也在本发明保护范围之内。
在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物和探针鉴定三带喙库蚊，大致工作流程如下：首先提取待测样品DNA，再利用本发明设计的引物和探针或本发明建立的实时荧光PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方法提取到的样品DNA均可用于检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一组鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针，能快速、准确地从海滨库蚊亚组蚊种中鉴定出重要医学媒介--三带喙库蚊，具有良好地特异性和敏感性。
1. 结果可靠，敏感性高：本方法与三带喙库蚊形态学鉴定结果完全一致，对海滨库蚊复合组其它蚊种无交叉反应，结果稳定可靠；可取单只蚊腿提取DNA进行检测，具有较高的敏感性。
2. 操作简单、节省时间：本发明应用实时荧光PCR对蚊基因进行鉴定，操作简单，整个实验过程在2h内完成，适用于蚊生活史各个阶段鉴定，无需培养至成虫，节省时间。
3. 实验可由一般技术人员操作，无需媒介鉴定专家在场，可以快速地从海滨库蚊亚组中鉴定出三带喙库蚊，解决海滨库蚊复合组蚊种鉴定难题，对残缺标本也可进行鉴定，具有良好地应用前景。
附图说明
图1是1~7号样本实时荧光PCR灵敏度试验结果图，图中：1－7依次为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL；8：阴性对照；9：阳性对照。
图2是实时荧光PCR重复性试验结果图，图中：1为阳性对照，2-9为1×106copies/μL质粒重复性试验，10为阴性对照。
图3是实时荧光PCR特异性试验结果图。
图4是海滨库蚊复合组蚊种DNA实时荧光PCR试验结果图，图中：1为阳性对照，2-4为不同地理株三带喙库蚊，5-8为海滨库蚊、环带库蚊、伪杂鳞库蚊和阴性对照。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但具体实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用的试剂和材料均为市购。
实施例1 引物设计：
根据GenBank中三带喙库蚊COⅠ（cytochrome oxidase I）基因序列（基因登录号AB690857、AB738091、HM638220、HQ398885、JQ728031、KC970299、KF407833、KM502254）设计引物Culex-F和Culex-R，以及特异性探针Tritaeniorhynchus-P。
荧光PCR上游引物Culex-F：5’-TTCAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3’（如SEQ ID NO.1所示）
荧光PCR下游引物Culex-R：5’- TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG -3’（如SEQ ID NO.2所示）
荧光PCR探针Tritaeniorhynchus-P：FAM-5'-ACAGTTTATCCACCTCT-3'-MGB（如SEQ ID NO.3所示）
实施例2 蚊DNA提取：
采用商品化Insect DNA Kit（OMEGA）提取蚊DNA。提取DNA直接上机检测或保存于-20℃。
实施例3 标准质粒的制备
参照文献DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates（Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. Mol Mar Biol Biotechnol. 1994, 3(5):294-299）合成扩增COⅠ基因上、下游引物LCO1490和HCO2198。
按Insect DNA Kit（OMEGA）说明书操作步骤提取三带喙库蚊DNA。
PCR反应采用商品化的宝生物（大连）有限公司的Ex Taq。在PCR反应管内加入10×Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，20μmol/L上下游引物LCO1490和HCO2198各1μL，Ex Taq 0.25μL，DNA模板5μL，补dH2O至50μL。反应程序为：预变性94℃ 3min；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，51℃1min s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。PCR产物用Gel Extraction Kit（QIAGEN）回收。
将回收纯化PCR产物连接到pMD19-T载体，转化感受态DH5α，挑选单菌落接种LB液体培养基，摇菌过液，提取质粒，经PCR鉴定带有目的基因后，将重组质粒测序鉴定，鉴定正确的质粒做为阳性标准质粒，计算质粒浓度，制备为5×107copies/μL溶液作为阳性对照，-20℃保存备用。
实施例4 实时荧光PCR试验
荧光定量PCR反应试剂采用商品化的宝生物（大连）有限公司的Premix Ex Taq™ （Probe qPCR）。PCR反应体系为：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F 0.625μL，10μmol/L下游引物Culex-R 0.5μL，10μ℃ mol/L荧光探针Tritaeniorhynchus-P 1.25μL，2×实时荧光PCR预混试剂和余量ddH2O，共25μL。阳性对照为实施例4制备质粒，阴性对照为dH2O。
PCR反应程序为：预变性95℃ 30s；95℃5s，58℃ 45s，共40个循环。58℃收集荧光信号。
实施例5 灵敏度试验
将实施例3所得质粒用dH2O进行5倍稀释为1×107copies/μL ，再按10倍梯度倍比稀释。以10~1×107copies/μL 7个稀释度的质粒溶液为模板，按实施例4的反应体系和反应条件，应用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增检测，出现扩增曲线最大模板浓度为该方法的检测灵敏度。反应结果如图1所示，1~7号样本依次为： 1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL，各样本均有明显扩增曲线且可见明显梯度效应，阳性对照有明显扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线。本例中方法敏感性可到10copies/μL。
实施例6 重复性试验
以实施例5中制备的1×106copies/μL质粒溶液为模板，每个样本重复检测8次，结果如图2所示，每个样本扩增曲线基本一致，Ct值无明显差异，阳性对照有明显扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线，表明本研究反应体系具有很好地重复性。
实施例7 特异性试验
为验证本发明的引物和探针，以及实时荧光PCR试验方法的有效性和特异性，本实施例以海滨库蚊亚组三带喙库蚊、海滨库蚊、环带库蚊、伪杂鳞库蚊CO I基因质粒为模板，同时根据GenBank中白霜库蚊（基因登录号DQ154167）CO I基因序列，由上海生工生物工程有限公司合成并制备质粒，并以重要医学蚊媒--白纹伊蚊、中华按蚊的CO I基因质粒为模板（CO I基因质粒制备同实施例3），进行检测。结果如图3所示，本发明所述的实时荧光PCR方法能准确鉴定出三带喙库蚊，对非靶标蚊种质粒无扩增曲线，均呈阴性。
实施例8 不同地理株海滨库蚊亚组蚊样品检测
我们收集了不同地理株海滨库蚊亚组蚊种样品，经形态学鉴定后，用Insect DNA Kit提取DNA，按上述方法配制反应体系，在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行检测，结果如图4、表1所示，阳性对照和阴性对照成立，有三份样品检测结果经判定为三带喙库蚊核酸阳性，与形态学鉴定结果一致。
表1 敏感性实验中所使用的蚊种及检测结果
种名 来源 Ct值 结果
三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus） 福建漳浦 17.92 +
三带喙库蚊（Cu. tritaeniorhynchus） 云南勐腊 16.05 +
三带喙库蚊（Cu. tritaeniorhynchus） 海南毛阳 18.24 +
海滨库蚊（Cu. sitiens） 福建诏安 undet -
环带库蚊（Cu. annulus） 云南勐腊 undet -
伪杂鳞库蚊（Cu.pseudovishnui） 福建将乐 undet -
阳性对照 - 15.16 +
阴性对照 - undet -
序列表
福建国际旅行卫生保健中心
一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针
1
27
DNA
上游引物Culex-F
TTCAAGTAGT TTAGTAGAAA ATGGAGC
2
28
DNA
下游引物Culex-R
TGTAAAGAAA AAATAGCTAA ATCAACTG
3
17
DNA
探针Tritaeniorhynchus-P
ACAGTTTATC CACCTCT

Claims (8)

1.一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，上游引物Culex-F由SEQ ID NO.1所示的序列，下游引物Culex-R由SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针为Tritaeniorhynchus-P探针，探针Tritaeniorhynchus-P由SEQ ID NO.3所示的序列。
2. 根据权利要求1所述的实时荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述探针Tritaeniorhynchus-P的5’端标记有FAM，3’端标记有非荧光淬灭基团NFQ和MGB。
3. 权利要求1所述三带喙库蚊实时荧光PCR引物和探针在鉴定三带喙库蚊方面的应用。
4. 权利要求1所述三带喙库蚊实时荧光PCR引物和探针在制备三带喙库蚊鉴定试剂或试剂盒中的应用。
5. 一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的荧光PCR检测方法，其特征在于，PCR反应所用的引物和探针为权利要求1所述的引物和探针。
6. 根据权利要求5所述的实时荧光PCR方法，其特征在于，PCR反应体系为：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F 0.625μL，10μmol/L下游引物Culex-R 0.5μL，10μ℃ mol/L荧光探针Tritaeniorhynchus-P 1.25μL，2×实时荧光PCR预混试剂和余量ddH2O，共25μL；
PCR反应程序为：预变性94℃ 2min；94℃5s，58℃ 45s，共40个循环；58℃收集荧光信号；根据扩增曲线、Ct值确定检测结果的阴性和阳性；
其中，实时荧光PCR预混试剂包含有实时荧光PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。
7.一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的试剂盒，包括：权利要求 1 或2 所述的上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，以及Tritaeniorhynchus-P探针，实时荧光PCR反应体系中的DNA聚合酶、荧光PCR预混试剂，其中荧光PCR预混试剂包含有实时荧光PCR反应所需要的缓冲液和dNTP。
8.根据权利要求7 所述的试剂盒，其特征在于，单份25μL的实时荧光PCR反应体系使用的DNA聚合酶量为0.5~1U；单份25μL的实时荧光PCR反应体系中各dNTP的终浓度为0.2mmol/L。
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