CN102134594B - 检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光pcr的引物、探针序列及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，该引物、探针序列包括炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌引物探针序列集；该方法的步骤包括选取引物对和探针、制备目标基因的质粒标准品、建立反应体系和选择荧光检测通道。本发明设计的各引物对和探针特异性和工作性能良好，可建立检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的多重实时荧光PCR方法，具有结果可靠和准确灵敏、操作简便、省时省力、成本低、效率高等优点。

Description

检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法

技术领域

本发明涉及一种检测病原微生物的PCR引物、探针序列及方法，尤其是一种同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，属于生物技术领域。

背景技术

炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众财产、健康和生命安全。鼠疫耶尔森菌可引起烈性传染病鼠疫，疾病传播快，病死率高(70％-100％)，历史上发生过多次毁灭性的流行，也是经典的致死性细菌。嗜肺军团菌可由气溶胶介导引起军团菌病，流行致死率可高达30％以上，我国自1982年在南京首次证实军团菌病例以来，全国已有多起散发与暴发流行的报道。炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌均可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件。快速有效的病原检测技术在炭疽、鼠疫、军团菌病疫情的预防、控制及应急反应决策中起着极其关键的作用，对保障公众的生命财产安全具有重要意义。

目前对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的检测方法，主要基于对病原体的培养、毒素检测、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应疫情控制的需要。虽然近年来也发展了常规PCR及DNA探针杂交技术、胶体金技术、基因芯片技术等，但常规PCR及DNA探针杂交技术存在特异性和敏感性的问题；胶体金技术敏感性较差，假阳性和假阴性偏高；基因芯片技术的检测成本及硬件要求均较高，并且重复性较差(一般一个样品需重复3次才能做出综合评价)，难于推广，目前仅适合学术性科研。此外，这些检测方法均属开放式方法，检测烈性传染病病原体时均存在严重的生物安全与传播隐患，而且对实验仪器和环境造成交叉污染的危险性较大，易导致假阳性结果等。目前文献所报道的这些方法，除基因芯片外均为单重检测方法，所需设备、试剂、反应参数迥异，难于整合，不能同时检测和预警上述三种病原体，耗时较长。

实时荧光定量PCR是一种封闭快速检测技术，由光电倍增管(PMT)扫描扩增产物，经计算机数据处理后得出结果，反应在全封闭的条件下进行，扩增过程中可避免由于以前基因扩增产物如PCR产物气溶胶等的污染而可能引起的假阳性结果，还可避免病原体核酸片断对人体产生的潜在危害，无须开盖PCR后处理，具有实时、直观、准确的特点，尤其在烈性传染病病原体的检测上，有着明显的优势，有示范推广价值。实时荧光PCR技术检测病毒或细菌，其灵敏度比常规PCR高出10～100倍以上，整个检测时间缩短至3～4小时内，探针的应用使假阳性达到了最小化。

多重实时荧光PCR是在同一反应体系中加入多组引物对和多个探针，同时检测多个目的基因的方法。该方法在具有实时荧光定量PCR快速、敏感的特性同时，可以实现一管多检，达到省时省力的目的，提高了检测速度和效率，尤其适合疫情早期预警、排除所必须的同时筛查检测的需要。

目前，还没有一种能同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，而这种引物、探针序列及方法对于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测等具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列，其特征是，包括由capa引物对和capa探针、及pa引物对和pa探针构成的炭疽杆菌引物探针序列集；

所述capa引物对包括两组序列：

(1)capa-F：SEQ ID No：1和capa-R：SEQ ID No：2；

(2)capa-Fc：SEQ ID No：19和capa-Rc：SEQ ID No：20；

所述capa探针包括两个序列：

(3)capa-probe：SEQ ID No：3；

(4)capa-probec：SEQ ID No：21；

所述pa引物对包括两组序列：

(5)pa-F：SEQ ID No：4和pa-R：SEQ ID No：5；

(6)pa-Fc：SEQ ID No：22和pa-Rc：SEQ ID No：23；

所述pa探针包括两个序列：

(7)pa-probe：SEQ ID No：6；

(8)pa-probec：SEQ ID No：24。

进一步地，还包括由pla引物对和pla探针、及f1引物对和f1探针构成的鼠疫耶尔森菌引物探针序列集；

所述pla引物对包括两组序列：

(9)pla-F：SEQ ID No：7和pla-R：SEQ ID No：8；

(10)pla-Fc：SEQ ID No：25和pla-Rc：SEQ ID No：26；

所述pla探针包括两个序列：

(11)pla-probe：SEQ ID No：9；

(12)pla-probec：SEQ ID No：27；

所述f1引物对包括两组序列：

(13)f1-F：SEQ ID No：10和f1-R：SEQ ID No：11；

(14)f1-Fc：SEQ ID No：28和f1-Rc：SEQ ID No：29；

所述f1探针包括两个序列：

(15)f1-probe：SEQ ID No：12；

(16)f1-probec：SEQ ID No：30。

更进一步地，还包括由mip引物对和mip探针、pile引物对和pile探针构成的嗜肺军团菌引物探针序列集；

所述mip引物对包括两组序列：

(17)mip-F：SEQ ID No：13和mip-R：SEQ ID No：14；

(18)mip-Fc：SEQ ID No：31和mip-Rc：SEQ ID No：32；

所述mip探针包括两个序列：

(19)mip-probe：SEQ ID No：15；

(20)mip-probec：SEQ ID No：33；

所述pile引物对包括两组序列：

(21)pile-F：SEQ ID No：16和pile-R：SEQ ID No：17；

(22)pile-Fc：SEQ ID No：34和pile-Rc：SEQ ID No：35；

所述pile探针包括两个序列：

(23)pile-probe：SEQ ID No：18；

(24)pile-probec：SEQ ID No：36。

再进一步地，所述capa探针、pla探针、f1探针、及mip探针序列中的第3位碱基、所述pa探针序列中的第4位碱基、所述pile探针序列中的第5位碱基均为RNA碱基。

本发明还提供一种用于检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR方法，其特征是，包括如下步骤：

①选取引物对和探针：从由SEQ ID No：1-SEQ ID No：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；

②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQ ID No：1-SEQ ID No：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-T easy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；

③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNase H酶——Tli RNase H II用量的优化；D.Taq DNA聚合酶——ExTaq HS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；

④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。

本技术方案的进一步改进如下：

1.所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：

一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。

2.所述步骤①中，选取的引物对和探针由三组引物对和三个探针构成：

一组capa引物对和一个capa探针、或一组pa引物对和一个pa探针；

以及，一组pla引物对和一个pla探针、或一组f1引物对和一个f1探针；

以及，一组mip引物对和一个mip探针、或一组pile引物对和一个pile探针。

3.所述步骤①中，选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成：

一组capa引物对和一个capa探针、及一组pa引物对和一个pa探针；

或者，一组pla引物对和一个pla探针、及一组f1引物对和一个f1探针；

或者，一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。

4.所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的Tli RNase HII，反应体系终浓度为1.25U/25μl的Ex Taq HS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为10¹～10⁸copy/每反应体系，Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl。

5.还包括以下步骤：⑤检测待测样品：提取待测样品的基因组DNA，得到待测液；按步骤③的反应体系加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl所述待测液；进行实时荧光定量PCR反应程序：

第一阶段：初期变性，85-104℃8-12秒；

第二阶段：PCR反应，为85-104℃变性4-6秒，45-65℃退火8-12秒，然后55-85℃20-30秒延伸同时监测荧光曲线；重复40-60个循环；

判断阳性的标准是：CT值在35个循环内，且所述荧光曲线呈S形。

炭疽杆菌致病性与其产生的外毒素和多肽荚膜有关，二者分别由2个质粒(pX01及pX02)编码。pX01质粒含有编码保护性抗原的PA基因，PA结合于细胞表面受体，是形成主要致病性的水肿毒素(ET)的关键因子。pX02含荚膜合成相关基因capA，编码的荚膜有抗吞噬作用，capA缺失的菌株不能形成荚膜，易被白细胞吞噬并杀死，因而没有致病作用。炭疽杆菌同时具有pX01质粒和pX02质粒时才显示病原性，如果只有其中一种质粒，即为弱毒株或无毒株。鼠疫耶尔森菌的基因组中，pla基因和caf1基因是相当稳定和非常特异的分子生物学特征，不论是典型的或是非典型的鼠疫菌均具有这两种特征。pla基因表达的含312个氨基酸的纤维蛋白溶酶原活性因子是一种多功能蛋白，可介导鼠疫菌对宿主上皮细胞、内皮细胞及胞外基质的黏附和侵袭，是一种关键的毒力因子，肺鼠疫引起的侵袭性肺炎和快速死亡依赖于其活性。caf1基因表达的F1荚膜抗原，为一种糖蛋白，有高度免疫原性和特异性，是最重要的鼠疫保护性抗原。嗜肺军团菌基因组中pilE基因编码的IV型菌毛蛋白，参与细菌的黏附、活动力以及对特异性靶细胞的识别等多种生物功能活动，且与军团菌的毒力紧密相关，为嗜肺军团菌1～15血清型所共有，具有种属特异性和高度保守性；此外，国外相关研究表明，某些嗜肺军团菌含有的巨噬细胞感染增强因子(mip)基因可调控24～27kD外膜蛋白的形成，这种蛋白介导气溶胶进入肺泡巨噬细胞，可以使正常身强体壮的人患病，这使过去认为军团菌为条件致病菌的理论受到了极大冲击。

由此可见，在疫情和突发公共卫生事件(例如：疫区空气、水源污染，公众收到装有不明粉末的信件，研究机构中病原菌的意外散播等等)中，因预警、控制及应急反应决策的需要，对于炭疽杆菌，需同时检测PA和capA，以区分是否存在强毒株或弱毒、无毒株；对于鼠疫耶尔森菌，因涉及国家法定甲类传染病(最高级别)，应尽可能准确可靠定性，所以宜同时检测pla基因和caf1基因，这样即可双重复核又可避免漏诊；对于嗜肺军团菌，因亚型较多，如能同时检测其特异性结构分子pilE基因和主要毒力因子Mip基因，将提高检出率和增强预警水平。

本发明采用实时荧光CycleavePCR方法，其中包括由RNA和DNA构成的杂合Cycling探针、及核糖核酸酶H(RNase H)，本方法灵敏度高，能够高效率地检出目的基因。当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。如果探针的RNA部分或与其相邻的2-3个碱基部分，与模板间有一个碱基不互补，RNase H就不能在RNA部分将探针切断。

与实时荧光PCR的常规标记方法如SYBR、Taqman探针法相比，本发明方法的荧光背景更低，信噪比更高，稳定性更好，特异性非常强(可识别一个碱基的差异)，非常适合炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、及嗜肺军团菌的快速侦检。

本发明充分利用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对一个样品仅需进行一个批次的检测操作，就可以完成对样品中炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的检测，并同时确定强毒株、弱毒株等信息，具有结果可靠和准确灵敏、操作简便、省时省力、成本低、效率高等优点。

附图说明

图1为本发明多重实时荧光PCR方法的检测原理图。

图2为本发明实施例1第一反应体系的荧光曲线图。

图3为图2实施例第二反应体系的荧光曲线图。

图4为本发明实施例2反应体系的荧光曲线图。

图5为本发明实施例3反应体系的荧光曲线图。

图6为本发明实施例4反应体系的荧光曲线图。

具体实施方式

1.引物对、探针序列的设计

通过分析NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank数据库中炭疽杆菌的PA和capA基因序列，鼠疫耶尔森菌的pla和caf1基因序列，嗜肺军团菌的pilE和Mip基因序列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右。探针的长度一般为11个碱基，内嵌合一个RNA碱基，其余为DNA碱基。引物间和引物内无互补序列，而且应分别特异性地针对各靶基因，相互间不存在交叉反应，可以在同一套反应体系中同时应用于检测和区分炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌。具体的引物对、探针序列见表1。

表1引物对、探针序列

注：1.各引物名称中，含F表示上游引物，含R表示下游引物，含c表示互补序列。

2.各探针序列中带下划线的碱基是RNA碱基。

用荧光染料在RNA嵌合核苷酸探针(Cycling探针)的5′端标记报告荧光基团(Reporter，R)，用非荧光染料在RNA嵌合核苷酸探针(Cycling探针)的3′端标记淬灭荧光基团(Quencher，Q)。荧光基团和淬灭荧光基团构成能量转移结构：报告荧光基团所发射的荧光可被淬灭荧光基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量，从而进行炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的各靶基因的检测。检测反应原理见图1。

按常规方法获得所设计的引物对、探针后，将各引物对分别制成引物对工作液，并将各探针分别制成探针工作液。

2.目标基因质粒标准品的制备

从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌中提取基因组DNA；按常规方法，分别以一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物(依次为capA基因片段、PA基因片段、pla基因片段、caf1基因片段、Mip基因片段、pilE基因片段)；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-T easy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得各目标基因的质粒标准品；测定各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用。

其中，提取基因组DNA的方法包括：DNA提取液提取、PCR反应液裂解提取、或DNA提取试剂盒提取，均属常规方法。

测定各目标基因的质粒标准品的浓度的方法是：用紫外分光光度计定量，利用公式(6.02×10²³)×(ng/μl×10^-9)/(DNA length×660)＝copies/μl计算浓度。

3.反应体系的建立

A.dNTPs浓度的优化：通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选定0.3mmol/L作为反应体系中dNTPs的终浓度；

B.镁离子浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂(氯化镁)的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5mmol/L为反应体系中镁离子的终浓度；

C.耐热性RNase H酶——Tli RNase H II用量的优化：经过使用不同浓度RNase H的试验结果比较，选定4U/μl作为反应体系中RNase H的终浓度；

D.Taq DNA聚合酶——Ex Taq HS用量的优化：通过比较Ex Taq HS酶用量的优化实验结果，选定1.25U/25μl作为反应体系中Ex Taq HS酶的终浓度；

E.引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将与炭疽杆菌的PA基因和capA基因、鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因、嗜肺军团菌的pi lE基因和Mip基因相对应的各引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，互相组合后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定引物终浓度均为0.4μmol/L时，各种组合都有良好的扩增效果；

F.探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将与炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌相对应的各探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。

G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定：在反应体系中其它条件相同的情况下，将各目标基因质粒标准品的拷贝数分别从10¹copy/每反应体系至10⁹copy/每反应体系作梯度连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定目标基因的质粒标准品拷贝数线性范围为10¹～10⁸copy/每反应体系。

经上述各个条件的优化，最终确定所用多重实时荧光定量PCR反应体系为25ul体系，所需各组分及相应终浓度见表2。

表2多重实时荧光定量PCR反应体系组分表

注：1.当多重实时荧光定量PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

2.根据使用的仪器不同，应将反应参数和体系作适当调整。

3.根据检测样本来源不同，应适当调整样本待测液的添加量。

4.当采用四组以上的引物对和四个以上的探针时，应适当提高各引物对工作液和各探针工作液的浓度，并减少各引物对工作液和各探针工作液的用量，在保证各引物和各探针终浓度不变的前提下，保证反应体系总体积为25μl。

4.荧光检测通道的选择

根据标记在反应体系所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。

5.待测样品的检测

提取待测样品的基因组DNA，得到待测液；按表2加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl待测液；进行实时荧光定量PCR反应程序：(可根据使用的仪器不同，将下列反应参数作适当调整)：

第一阶段：初期变性，85-104℃8-12秒；

第二阶段：PCR反应，为85-104℃变性4-6秒，45-65℃退火8-12秒，然后55-85℃20-30秒延伸同时监测荧光曲线；重复40-60个循环；

判断阳性的标准是：CT值在35个循环内，且荧光曲线呈S形。

其中，提取待测样品的基因组DNA的方法根据样品来源不同而有所差别，时间由10分钟至1.5小时。

来源一：培养分离的细菌

a.液体培养基：直接吸取0.2μl液体至PCR反应液中。预变性采用95℃，2～5分钟以充分裂解细菌释放模板DNA。

b.平皿细菌：10μl小枪头或接种环挑取单个菌落，在分装好的PCR反应液中轻轻搅动几次。预变性采用95℃，2～5分钟以充分裂解细菌释放模板DNA。

c.以上培养分离的细菌，也可以用等量DNA提取液(或者加PBS或ddH₂O)混合，充分混匀后100℃保温10min，12000rpm离心5min，取上清4ul作模板。

注：DNA提取液由25mM NaOH、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1％Triton X-100、1％NP-40、0.1mM EDTA(pH8.0)、2％Chelex-100组成。

来源二：粉末

a.向标本管中加入适量(示样本量而定，应超过样本的5倍体积)无菌生理盐水或PBS浸泡，然后剧烈振荡搅拌使其充分混匀，自然沉淀除去粗大颗粒物质后，吸取上清转移至1.5ml EP管内，12000rpm离心10分钟；

b.去上清，沉淀中加入50μl前述DNA提取液充分混匀，100℃保温(沸水浴)10分钟。

c.12000rpm离心5分钟，取上清4μl作为模板。

来源三：液体

a.取1.5ml水样或悬液转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心10分钟；

b.去上清，沉淀中加入50μl前述DNA提取液混匀，100℃保温10分钟；

c.12000rpm离心5分钟，取上清4ul作为模板。

亦可使用商品化的通用试剂盒(细菌DNA提取试剂盒)来抽提待测模板中的细菌DNA，参照厂家的试剂盒说明书进行。

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌三重实时荧光定量PCR检测。

(1)将炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌分别灭活后，混合作为模拟阳性样品。提取模拟阳性样品的基因组DNA，得到待测液。

(2)采用相同反应条件下的两个25μl的三重实时荧光定量PCR反应体系：第一反应体系针对炭疽杆菌的capA基因、鼠疫耶尔森菌的pla基因、及嗜肺军团菌的Mip基因；第二反应体系针对炭疽杆菌的PA基因、鼠疫耶尔森菌的caf1基因、及嗜肺军团菌的pilE基因。

第一、第二反应体系均从表1中选取与各个基因相对应的引物对、探针，它们选取的引物对和探针均由三组引物对和三个探针构成：第一反应体系：一组capa引物对和一个capa探针、一组pla引物对和一个pla探针、及一组mip引物对和一个mip探针；第二反应体系：一组pa引物对和一个pa探针、一组f1引物对和一个f1探针、及一组pile引物对和一个pile探针。

例如：第一反应体系选取引物对：capa-F和capa-R、pla-F和pla-R、及mip-F和mip-R；选取探针：capa-probe、pla-probe、及mip-probe。第二反应体系选取引物对：pa-Fc和pa-Rc、f1-Fc和f1-Rc、及pile-Fc和pile-Rc；选取探针：pa-probec、f1-probec、及pile-probec。需要指出的是，第一、第二反应体系所选取的引物对和探针可以是针对前述各基因的任一组引物对和任一个探针。

第一反应体系中探针的标记：capa-probe的5′端以FAM标记，pla-probe的5′端以JOE标记，mip-probe的5′端以TRAMA标记。第二反应体系中探针的标记：pa-probec的5′端以TRAMA标记，f1-probec的5′端以FAM标记，pile-probec的5′端以JOE标记。上述探针的3′端均以ECLIPSE标记。

制备上述各引物对的工作液(引物浓度为10μM)和各探针的工作液(探针浓度为5μM)。

(3)分别向第一、第二反应体系中，按前述表2加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl待测液；进行如前所述的实时荧光定量PCR反应程序，并监测荧光曲线。

(4)第一反应体系的荧光曲线见图2，第二反应体系的荧光曲线见图3。各CT值分别为：18.844(capA)、18.146(Mip)、19.693(pla)；18.039(pilE)、19.011(caf1)、19.007(PA)；而且，各基因的荧光曲线均呈S形，即各基因的检测结果均为阳性。

上述步骤可完成定性检测。

另外，与第一、第二反应体系一起，可设置由不同浓度质粒标准品组成的工作曲线反应孔，反应结束后，计算数据以获得工作曲线，将第一、第二反应体系反应孔的数据代入，即可完成对第一、第二反应体系的定量检测。

该试验结果表明，本发明设计的各引物对和各探针特异性和工作性能良好，可建立炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌三重实时荧光定量PCR检测方法。

本实施例将六组引物对及六个探针根据针对的具体基因分成两个反应体系，分置两个反应孔，反应条件相同，使用一台荧光PCR检测仪同时进行实时荧光定量PCR反应，每个体系均为可独立检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的三重实时荧光PCR反应体系，且两个体系占用的荧光检测通道完全相同。

本实施例的优点在于：

A.两孔具有相同的反应参数(如变性、退火温度和延伸时间等)，可在同一定量PCR仪器中同时进行反应；

B.每孔都能对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的致病株进行侦检并作出独立的诊断，两孔同时进行，分别针对主要毒力因子基因和特异性结构蛋白基因检测，相当于复核和“双保险”，还能鉴定出弱毒株甚至重组的生物战剂；

C.分成两个体系后，已上市的绝大多数定量PCR仪(3～5个荧光通道)均和此方法兼容。

需要指出的是，对于含有6个及以上荧光通道的高端PCR仪器，可以将本实施例的两个反应体系合并在一个反应体系中进行反应，因此，以下这种情况也落入本发明的保护范围：采用一个反应体系，该体系选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。

需要说明的是，本实施例也可以试剂盒的形式出现：按常规方法制备合成相应引物和探针后，与实时荧光定量PCR所需试剂及稀释的阳性对照(质粒标准品)、阴性对照组装成炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，内含两套检测体系。实施例2炭疽杆菌的PA基因和capA基因二重实时荧光定量PCR检测。

(1)将炭疽杆菌灭活后作为模拟阳性样品。提取模拟阳性样品的基因组DNA，得到待测液。

(2)采用一个反应体系：该反应体系针对炭疽杆菌的PA基因和capA基因。该反应体系从表1中选取与各个基因相对应的引物对、探针，它选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、及一组pa引物对和一个pa探针。例如：选取引物对：capa-Fc和capa-Rc、及pa-F和pa-R；选取探针：capa-probe、及pa-probec。需要指出的是，该反应体系所选取的引物对和探针可以是针对前述各基因的任一组引物对和任一个探针。

探针的标记：capa-probe的5′端以TET标记，pa-probec的5′端以ROX标记，两探针的3′端均以BHQ标记。

制备上述各引物对的工作液(引物浓度为10μM)和各探针的工作液(探针浓度为5μM)。

(3)向该反应体系中，按前述表2加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl待测液；进行如前所述的实时荧光定量PCR反应程序，并监测荧光曲线。

(4)该反应体系的荧光曲线见图4。各CT值分别为：17.071(capA)、20.595(PA)；而且，各基因的荧光曲线均呈S形，即各基因的检测结果均为阳性。

上述步骤可完成定性检测。

另外，与该反应体系一起，可设置由不同浓度质粒标准品组成的工作曲线反应孔，反应结束后，计算数据以获得工作曲线，将该反应体系反应孔的数据代入，即可完成对该反应体系的定量检测。

该试验结果表明，本发明设计的各引物对和探针特异性和工作性能良好，可建立炭疽杆菌的PA基因和capA基因二重实时荧光定量PCR检测方法。

需要说明的是，本实施例也可以试剂盒的形式出现：按常规方法制备合成相应引物和探针后，与实时荧光定量PCR所需试剂及稀释的阳性对照(质粒标准品)、阴性对照组装成炭疽杆菌的PA基因和capA基因二重实时荧光定量PCR检测试剂盒。

实施例3鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因二重实时荧光定量PCR检测。

(1)将鼠疫耶尔森菌灭活后作为模拟阳性样品。提取模拟阳性样品的基因组DNA，得到待测液。

(2)采用一个反应体系：该反应体系针对鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因。该反应体系从表1中选取与各个基因相对应的引物对、探针，它选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成：一组pla引物对和一个pla探针、及一组f1引物对和一个f1探针。例如：选取引物对：pla-F和pla-R、及f1-F和f1-R；选取探针：pla-probe、及f1-probe。需要指出的是，该反应体系所选取的引物对和探针可以是针对前述各基因的任一组引物对和任一个探针。

探针的标记：pla-probe的5′端以HEX标记，f1-probe的5′端以FAM标记，两探针的3′端均以ECLIPSE标记。

制备上述各引物对的工作液(引物浓度为10μM)和各探针的工作液(探针浓度为5μM)。

(3)向该反应体系中，按前述表2加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl待测液；进行如前所述的实时荧光定量PCR反应程序，并监测荧光曲线。

(4)该反应体系的荧光曲线见图5。各CT值分别为：18.813(caf1)、19.702(pla)；而且，各基因的荧光曲线均呈S形，即各基因的检测结果均为阳性。

上述步骤可完成定性检测。

另外，与该反应体系一起，可设置由不同浓度质粒标准品组成的工作曲线反应孔，反应结束后，计算数据以获得工作曲线，将该反应体系反应孔的数据代入，即可完成对该反应体系的定量检测。

该试验结果表明，本发明设计的各引物对和探针特异性和工作性能良好，可建立鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因二重实时荧光定量PCR检测方法。

需要说明的是，本实施例也可以试剂盒的形式出现：按常规方法制备合成相应引物和探针后，与实时荧光定量PCR所需试剂及稀释的阳性对照(质粒标准品)、阴性对照组装成鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因二重实时荧光定量PCR检测试剂盒。

实施例4嗜肺军团菌的Mip基因和pilE基因二重实时荧光定量PCR检测。

(1)将嗜肺军团菌灭活后作为模拟阳性样品。提取模拟阳性样品的基因组DNA，得到待测液。

(2)采用一个反应体系：该反应体系针对嗜肺军团菌的Mip基因和pilE基因。该反应体系从表1中选取与各个基因相对应的引物对、探针，它选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成：一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。例如：选取引物对：mip-Fc和mip-Rc、及pile-Fc和pile-Rc；选取探针：mip-probe、及pile-probe。需要指出的是，该反应体系所选取的引物对和探针可以是针对前述各基因的任一组引物对和任一个探针。

探针的标记：mip-probe的5′端以JOE标记，pile-probe的5′端以TRAMA标记，两探针的3′端均以BHQ标记。

制备上述各引物对的工作液(引物浓度为10μM)和各探针的工作液(探针浓度为5μM)。

(3)向该反应体系中，按前述表2加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μl待测液；进行如前所述的实时荧光定量PCR反应程序，并监测荧光曲线。

(4)该反应体系的荧光曲线见图6。各CT值分别为：15.693(Mip)、17.014(pilE)；而且，各基因的荧光曲线均呈S形，即各基因的检测结果均为阳性。

上述步骤可完成定性检测。

另外，与该反应体系一起，可设置由不同浓度质粒标准品组成的工作曲线反应孔，反应结束后，计算数据以获得工作曲线，将该反应体系反应孔的数据代入，即可完成对该反应体系的定量检测。

该试验结果表明，本发明设计的各引物对和探针特异性和工作性能良好，可建立嗜肺军团菌的Mip基因和pilE基因二重实时荧光定量PCR检测方法。

需要说明的是，本实施例也可以试剂盒的形式出现：按常规方法制备合成相应引物和探针后，与实时荧光定量PCR所需试剂及稀释的阳性对照(质粒标准品)、阴性对照组装成嗜肺军团菌的Mip基因和pilE基因二重实时荧光定量PCR检测试剂盒。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式，比如炭疽杆菌的PA基因和capA基因、及鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因的四重实时荧光定量PCR检测；炭疽杆菌的PA基因和capA基因、鼠疫耶尔森菌的pla基因和caf1基因、及嗜肺军团菌的Mip基因的五重实时荧光定量PCR检测；炭疽杆菌的PA基因和capA基因、及鼠疫耶尔森菌的pla基因的三重实时荧光定量PCR检测等等。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军南京军区军事医学研究所

<120> 检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法

<160> 36

 

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacggatt atggtgctaa gg 22

 

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtgcgtatt tactacgaca aga 23

 

<210> 3

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgctggtga a 11

 

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacaggctcg aactggagtg 20

 

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctatccgcc tttctaccag 20

 

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caactgcacg 10

 

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcgctatcc tgaaaggtga 20

 

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattggcatg attaacattt g 21

 

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgagtggaca ga 12

 

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagcccgcat cactcttaca 20

 

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggttctcacc gtttacctta g 21

 

<210> 12

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tagcacatct g 11

 

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accgaacagc aaatgaaaga c 21

 

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtttaacac catttccagc a 21

 

<210> 15

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acaagccagg 10

 

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tggtttcaat tgcctatcca 20

 

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatcttgtgt caatgtggca t 21

 

<210> 18

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgtcgtgccg a 11

 

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tactgcctaa taccacgatt cc 22

 

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcacgcataa atgatgctgt tct 23

 

<210> 21

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cacgaccact t 11

 

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atgtccgagc ttgacctcac 20

 

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgataggcgg aaagatggtc 20

 

<210> 24

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gttgacgtgc 10

 

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cagcgatagg actttccact 20

 

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtaaccgtac taattgtaaa c 21

 

<210> 27

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

actcacctgt ct 12

 

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtcgggcgta gtgagaatgt 20

 

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccaagagtgg caaatggaat c 21

 

<210> 30

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atcgtgtaga c 11

 

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tggcttgtcg tttactttct g 21

 

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ccaaattgtg gtaaaggtcg t 21

 

<210> 33

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgttcggtcc 10

 

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

accaaagtta acggataggt 20

 

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ctagaacaca gttacaccgt a 21

 

<210> 36

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gcagcacggc t 11

 

Claims (2)

1.一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列，其特征是，包括由capa引物对和capa探针、及pa引物对和pa探针构成的炭疽杆菌引物探针序列集；

所述capa引物对包括两组序列：

（1）capa-F：SEQ ID No：1和capa-R：SEQ ID No：2；

（2）capa-Fc：SEQ ID No：19和capa-Rc：SEQ ID No：20；

所述capa探针包括两个序列：

（3）capa-probe：SEQ ID No：3；

（4）capa-probec：SEQ ID No：21；

所述pa引物对包括两组序列：

（5）pa-F：SEQ ID No：4和pa-R：SEQ ID No：5；

（6）pa-Fc：SEQ ID No：22和pa-Rc：SEQ ID No：23；

所述pa探针包括两个序列：

（7）pa-probe：SEQ ID No：6；

（8）pa-probec：SEQ ID No：24；

还包括由pla引物对和pla探针、及f1引物对和f1探针构成的鼠疫耶尔森菌引物探针序列集；

所述pla引物对包括两组序列：

（9）pla-F：SEQ ID No：7和pla-R：SEQ ID No：8；

（10）pla-Fc：SEQ ID No：25和pla-Rc：SEQ ID No：26；

所述pla探针包括两个序列：

（11）pla-probe：SEQ ID No：9；

（12）pla-probec：SEQ ID No：27；

所述f1引物对包括两组序列：

（13）f1-F：SEQ ID No：10和f1-R：SEQ ID No：11；

（14）f1-Fc：SEQ ID No：28和f1-Rc：SEQ ID No：29；

所述f1探针包括两个序列：

（15）f1-probe：SEQ ID No：12；

（16）f1-probec：SEQ ID No：30；

还包括由mip引物对和mip探针、pile引物对和pile探针构成的嗜肺军团菌引物探针序列集；

所述mip引物对包括两组序列：

（17）mip-F：SEQ ID No：13和mip-R：SEQ ID No：14；

（18）mip-Fc：SEQ ID No：31和mip-Rc：SEQ ID No：32；

所述mip探针包括两个序列：

（19）mip-probe：SEQ ID No：15；

（20）mip-probec：SEQ ID No：33；

所述pile引物对包括两组序列：

（21）pile-F：SEQ ID No：16和pile-R：SEQ ID No：17；

（22）pile-Fc：SEQ ID No：34和pile-Rc：SEQ ID No：35；

所述pile探针包括两个序列：

（23）pile-probe：SEQ ID No：18；

（24）pile-probec：SEQ ID No：36；

所述capa探针、pla探针、f1探针、及mip探针序列中的第3位碱基、所述pa探针序列中的第4位碱基、所述pile探针序列中的第5位碱基均为RNA碱基。

2.根据权利要求1所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列用于非诊断目的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR方法，其特征是，包括如下步骤：

①选取引物对和探针：从由SEQ ID No：1-SEQ ID No：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；

②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQ ID No：1-SEQ ID No：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-T easy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；

③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNase H酶用量的优化，所述耐热性RNase H酶为Tli RNase H II；D.Taq DNA聚合酶用量的优化，所述Taq DNA聚合酶为Ex Taq HS；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；

④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道；

所述步骤①中，选取的引物对和探针由三组引物对和三个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pla引物对和一个pla探针、及一组mip引物对和一个mip探针；或者，一组pa引物对和一个pa探针、一组f1引物对和一个f1探针、及一组pile引物对和一个pile探针；

所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的Tli RNase HⅡ，反应体系终浓度为1.25U/25μl的Ex Taq HS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为10¹～10⁸copy/每反应体系，

Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl；

实时荧光定量PCR反应程序为：

第一阶段：初期变性，85-104℃8-12秒；

第二阶段：PCR反应，为85-104℃变性4-6秒，45-65℃退火8-12秒，然后55-85℃20-30秒延伸同时监测荧光曲线；重复40-60个循环；

判断阳性的标准是：CT值在35个循环内，且所述荧光曲线呈S形。

Images