CN103468811A

CN103468811A - 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN103468811A
Application number: CN2013104243281A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 王晓艳; 王彦威; 张志强
Original assignee: BEIJING APPLIED BIOLOGICAL TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: BEIJING APPLIED BIOLOGICAL TECHNOLOGIES Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: CN103468811B

Abstract

本发明公开一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒。其是由检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA和检测与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的粘附侵袭位点基因、耐热肠毒素A基因、粘附素基因、耐热肠毒素B基因、毒力活化因子基因以及O:3血清型抗原编码基因的引物对组成。本发明建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法，利用分析设计得到的所述引物对，对待测增菌液或平板分离菌落提取的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析以确定样品中是否是小肠结肠炎耶尔森氏菌的同时，确定其含有的与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的毒力基因和判定是否为O:3血清型。

Description

小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种新发肠道传染病，自20世纪80年代逐渐引起全球的广泛重视，是欧美等国家感染性腹泻的主要病原体之一。该细菌普遍存在于自然环境中，水、土壤和食物中均有发现，在家畜、家禽中广泛携带。小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种重要的食源性致病菌，它可以在低温条件下生长，通过污染食品可以导致以肠道症状为主的食物中毒，严重时病患可产生呼吸系统、心血管系统、骨骼结绨组织等疾患，甚至引起败血症，造成死亡。

对小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定，通常采用种内保守种间差异大的基因作为检测目标。16S rRNA具有高度的保守性和特异性，是理想的鉴别小肠结肠炎耶尔森氏菌的目标序列。小肠结肠炎耶尔森氏菌存在多种血清型，但并不是每个血清型都能引起人类致病，而且是否引起人类致病是由菌株所携带的毒力基因决定的。不同国家和地区主要致病血清型存在差异，比如美国O:8型占优势，其次是O:5,27；日本以O:3型为主，其次是O:6血清型；比利时以O:3型为主，其次是O:9型。在中国，存在多达58个血清型，但引起人类致病的以O:3型和O:9型为主，O:8血清型在国外具有很强的毒力，而国内的O:8血清型分离株均缺乏毒力因子。

已证实小肠结肠炎耶尔森氏菌的致病因子是染色体DNA上的粘附侵袭位点基因（ail）、耐热肠毒素A基因(ystA)、质粒上的粘附素基因（yadA）和毒力活化因子基因（virF）的表达与调控的结果。另外生物1A型还携带与ystA同族的肠毒素基因——ystB，其作用目前尚不清楚。

目前经典的细菌学检查方法是细菌分离培养和生化鉴定，一般在25℃培养24小时，采用特定性质的培养基，比如按照国际标准ISO10273:2003使用PSB和ITC培养基分离；然后采用赖氨酸脱羟酶试验、蔗糖试验、海藻糖试验、木糖试验、脂肪酶试验和柠檬酸盐试验等分析和确证小肠结肠炎耶尔森氏菌。通过传统方法分析可以获得小肠结肠炎耶尔森氏菌种属鉴定特征，但无法获得其致病性的数据和信息。

在生化鉴定的基础上，应用血清凝集原理可以鉴定出菌株不同的血清型别，但是不同血清型别与菌株致病性没有必然联系，比如中国的O:8血清型通常不对人致病，但美国的O:8血清型具有很强的毒力，原因是中国的O:8血清型缺乏毒力因子。因此，血清型别鉴定方法无法获得毒力因子分析数据。

当前分子生物学检测方法为毒力基因的检测提供了良好的检测工具，如中国专利申请号为201110275661.1的发明专利公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的检测试剂盒，试剂盒由前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX液、纯水和阳性标准液等成分组成，使用实时荧光PCR仪，由前后引物和TaqMan探针与ail基因特异性结合、扩增，从而实现对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测与分析。再如中国专利申请号为201210448992.5的发明专利公开了一种基于核酸恒温扩增技术的检测试剂盒；再如文献“Real-Time PCRMethod for Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica in Food”（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Oct.2008,p.6060–6067）公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的检测方法，该方法采用针对ail基因的引物探针序列，扩增出特异性的基因片段——163bp的扩增子，以分析和检测致病性的小肠结肠炎耶尔森氏菌株；再如文献“O:3和O:9小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布调查”（中国媒介生物学及控制杂志，2004年8月第15卷第4期）提供了一种分析O:3和O:9血清型菌株毒力基因的检测方法，该方法设计了一整套针对ail基因、ystA基因、ystB基因、yadA基因、virF基因的引物对，使用普通单重PCR反应体系，包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、特异性引物对，MgCl₂，dNTP等成分，对小肠结肠炎耶尔森氏菌的常见毒力基因进行逐一检测。

普通单重PCR方法、实时荧光PCR方法和等温扩增PCR方法可以对小肠结肠炎耶尔森氏菌种属鉴定基因、毒力基因和血清型基因逐个进行检测。7对引物的退火温度和浓度不尽相同，需要7轮PCR反应逐一检测，这种方法操作繁琐，耗费时间和人力，需要分别做好每个反应体系的质量控制，比如内部质控。目前尚未有采用多重PCR对与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的毒力基因进行全面检测的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测的引物组和试剂盒，可快速鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌，筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因和确定血清型，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案：

1、设计阳性内对照(IAC)扩增引物和基因

以pET28a质粒为IAC模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a的碱基序列如SEQ IDNo.17所示。

2、设计特异性引物

本发明主要目的是鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌和检测其毒力基因，同时筛查所检测菌株是否为中国主要流行的O:3血清型，设计的目标基因详见表1。

在Genbank中查找表1所列举基因的全长序列，把每种基因的若干全长序列导入Mega4软件中，比对分析获得7个目标基因的保守序列区段。把每种基因的序列区段分别输入primer premier6软件中，设计3套引物对备用方案。设计过程中充分考虑不同目标基因的引物对在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物对设计时要考虑到Tm值、GC含量，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，以保证后期不同引物对同时扩增的概率。

表1小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测目标基因

4、对扩增目标基因的引物备用方案进行Blast分析；

在Genbank中对所有引物备用方案进行Blast分析，获得特异性好的引物备用方案作为实验验证用方案。

5、对每一个可用实验验证方案进行单重PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。

6、将所有扩增目标基因的引物对混合进行多重PCR，验证全部引物对共同扩增时的可用性，对不能工作的引物对需要按照步骤2-4重复设计新的引物对进行替换。最终获得本发明提供的一套特异的引物序列（详见表2）。

表2小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR引物汇总表

*注：1.虽然所选检测目标的基因或者DNA片段为保守区域，但仍有个别碱基插入或缺失的可能型，PCR产物的大小也会随之增加或减少几个bp，不影响结果的判断。

2.粘附素基因上下游引物扩增产物，可为847bp的产物或759bp的产物，其中，759bp是小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型O:8粘附素基因yadA扩增产物的长度;小肠结肠炎耶尔森氏菌其他血清型致病株粘附素基因yadA扩增产物的长度是847bp。

基于上述技术方案，本发明提供了一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组，其是由检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16SrRNA及其毒力基因和血清型的引物对组成；

其中，检测小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因和血清型的引物对是由检测粘附侵袭位点基因、耐热肠毒素A基因、粘附素基因、耐热肠毒素B基因、毒力活化因子基因、O:3血清型抗原编码基因的6个引物对组成；

所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

所述检测粘附侵袭位点基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

所述检测耐热肠毒素A基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

所述检测粘附素基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；

所述检测耐热肠毒素B基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；

所述检测毒力活化因子基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；

所述的检测O:3血清型抗原编码基因引物对上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供了一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测的方法，将所述引物组与待测模板进行多重PCR反应，反应结束后对扩增产物进行电泳分析以确定样品中是否含有小肠结肠炎耶尔森氏菌及其毒力基因和血清型。

进一步地，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对，与检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA、鉴定毒力基因和血清型的引物对组成引物混合物。

所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

该方法通过检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA和相关毒力基因和O:3血清型中的保守序列，能在快速筛检小肠结肠炎耶尔森氏菌的同时，对其含有的常见毒力基因ail、ystA、ystB、yadA、virF和中国主要流行O：3血清型抗原编码基因rfbF进行同步检测，其实现的技术方案如下：

1、引物合成

按照表2中的引物序列，在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。

2、DNA模板提取

使用煮沸法或者商品化试剂盒提取待检目标菌DNA作为检测样品。

3、使用普通PCR平台构建多重PCR检测体系

在确定多重PCR反应体系中的引物序列后，还需要从引物浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。

多重PCR反应体系的配置如下：

Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，10mm的dNTP0.5-1.5μL，25mM的MgCl₂1-5μL，10x引物混合物2.5μL(包括阳性内对照在内的每个待测目标的引物浓度1um-8um)，pET28a0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超纯水补至25μL。

多重PCR反应的反应条件如下：

a：95℃4min；

b：95℃15-60s，

c：55-65℃15-60s，

d：72℃30-120s，b-d循环30-35个反应；

e：72℃5-10min。

4、多重PCR产物分析和结果判定

将5μL多重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳或者使用全自动凝胶电泳分析PCR产物片段大小，根据片段大小对照表2判定菌株是否是小肠结肠炎耶尔森氏菌和其携带毒力基因的情况以及血清型。

5、检测体系的验证

针对已经建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测方法进行特异性验证和敏感性验证。

特异性验证：选择假结核耶尔森氏菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌作为特异性评估用菌株，进行核酸提取，采用前期建立和优化的反应条件进行检测，结果表明在阳性内对照成立的条件下，除假结核耶尔森氏菌以外的其他致病菌均无条带扩增，假结核耶尔森氏菌有yadA和virF这两个毒力基因的扩增条带，包括16S rRNA以内的其他五对基因均无扩增；重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标基因有效区分开。

敏感性验证：对初始浓度为10⁸CFU/mL的小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3血清型致病株和生物1A型菌株稀释到10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL。采用前期建立和优化的反应条件进行检测，待检目标的检测限在10⁵CFU/mL，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有高度的敏感性和重复性。

本发明还提供了一种含有前述多重PCR检测引物组的试剂盒。

本发明的有益效果在于：

本发明建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测方法，能够实现血清学、病原培养学、免疫学所无法完成的毒力基因鉴定工作，克服其他分子生物学技术手段鉴定毒力基因的不足之处，达到如下的检测效果：

（一）多重检测

本发明所建立的检测方法能够在一次PCR反应中鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌的同时，可筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力基因ail、ystA、yadA、ystB、virF和O:3血清型抗原编码基因rfbF。检测方法快速确定样品是否为小肠结肠炎耶尔森氏菌及其含有的毒力基因种类和血清型，判定其是否为致病株，快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。

（二）特异性高

本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套特异性引物的特异性，所有引物都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性试验验证能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括假结核耶尔森氏菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。

（三）灵敏度高

本发明所建立的检测方法能够实现7个基因的同时检测，在每一个反应体系中每个检测目标的检测灵敏度可达到10⁵CFU/mL。

（四）成本较低

本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要7次人工和7倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1个反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50%的试剂成本。

（五）预防假阴性结果

体系中添加的IAC，可以有效的提示假阴性检测结果。

本发明为小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因的快速筛查提供了完备的解决方案，能实现食物中毒事件发生后和疫情暴发后的小肠结肠炎耶尔森氏菌筛检和致病性的快速鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。

附图说明

图1为本发明所述实施例2中特异性分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；

其中：M:100bp DNA marker；1.ail-1；2.ail-2；3.ail-3；4.阳性对照。

图2为本发明所述实施例2中敏感性评估的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。

其中：M:100bp DNA marker；1.ail-1；2.ail-2；3.ail-3。

图3为本发明所述小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多种PCR检测结果；

其中：M:100bp DNA marker；1.小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3血清型致病株；2.小肠结肠炎耶尔森氏菌1A型；3.1和2的混合模板；4.空白对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1粘附侵袭位点基因（ail）的引物设计与合成

在Genbank中查找小肠结肠炎耶尔森氏菌粘附侵袭位点基因ail的全长序列18条，把18条ail基因全长序列导入Mega4软件中，使用alignment功能比对分析ail基因的保守序列，获得保守序列区段，碱基序列如SEQ ID No.18所示：

把ail基因序列输入primer premier6软件中，自动分析获得多种引物设计方案。在此基础上手动调节引物位置和序列长度，将Tm值设定为50±5℃，GC含量35%-60%，尽可能不产生发夹结构和引物二聚体，无错误引发产生。将上述手动调节获得的引物设计方案在NCBI网站上进行Blast分析，如果其中任何引物对存在交叉反应，需要重新调整引物的位置和序列长度，直至获得高特异性的ail基因引物序列。最终获得如表3的三种ail基因引物备选方案。

表3ail基因引物备选方案

其他基因的引物设计方法与ail基因相同。获得的引物备选方案均在invitrogen公司合成。

实施例2粘附侵袭位点基因（ail）引物筛选试验

对表4中ail基因引物备选方案进行筛选，主要评估引物的特异性和敏感性。

特异性评估：采用假结核耶尔森氏菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等细菌作为特异性评估菌株。对上述细菌采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA模板。每种细菌取10μL提取液，混合成一个综合DNA模板，作为特异性评估模板，使用Nanodrop测定其DNA含量为269.32ng/μL。

用TE（pH8.0）溶液将引物分别稀释成100uM的贮存液后，再配制成相应的使用液。按照如下操作配置反应体系：Taq DNA聚合酶0.2μL（5U/μL），5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，dNTP0.75μL（10mM），MgCl₂4μL（25mM），每对引物1μL（10uM）；DNA模板2μL，超纯水补至25μL。按照如下反应条件进行PCR扩增：

a：95℃4min；

b：95℃30s，

c：62℃30s，

d：72℃90s，b-d循环30个反应；

e：72℃5min。

PCR扩增产物5μL使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1所示。

由图1可以看出，在阳性对照成立（加入ail的引物和模板）的前提下，三条引物ail-1、ail-2和ail-3与所用特异性评估的细菌无交叉反应，具有较好的特异性。

敏感性评估：选择ail基因阳性的小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3血清型致病株，其初始浓度大约为10⁸CFU/mL，梯度稀释到10⁵CFU/mL，作为ail引物敏感性评估的模板。体系配置和PCR反应条件同上。

PCR扩增产物5μL使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示。

由图2可以看出，三对引物均可以检测到10⁵CFU/mL的模板，其中引物ail-2亮度最高。

根据综合敏感性和特异性评估结果，选择ail-2作为ail基因扩增的最终引物。

其他基因的评估方法与ail基因相同。

实施例3小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测试剂盒的组建

该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer（Tris·HCl40Mm(PH8.3)，KCl100mM，tween-200.08%，0.0006ng/μL pet28a，1mm dNTP、8mm MgCl₂）；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液（包括IAC在内的特异性引物各2um）；阳性对照（小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3致病株和生物1A型的混合模板，每种均为10⁶CFU/ml）。

试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板2μL，超纯水7μL。

实施例4试剂盒的操作和结果判断

1、基因组的提取

取增菌液或划线培养的菌落溶于水中，用浊度计调整细菌悬液浓度至10⁸CFU/ml，取1ml细菌悬液，沸水浴10min后冰浴，13000rpm离心10min，取上清作为试剂盒检测用模板。

2、反应体系的配制

取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCRBuffer12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板2μL，超纯水7μL。

3、PCR反应

将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：95℃4min；95℃30s，62℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min。

4、琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

取5μL的PCR产物与1μL的6×loading buffer混匀，加入到琼脂糖凝胶的加样孔中。采用2%的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳60min，使用凝胶成像仪显示扩增目标条带的大小。

5、结果判断

根据ail248bp、ystA112bp、ystB146bp、yadA847/759bp、virF561bp、rfbF415bp、16S rRNA315bp。判定某菌株是否含有小肠结肠炎耶尔森氏菌及其所含毒力基因的种类和血清型别。

具体判定如下：扩增的结果如图3所示，由图3可知，包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照（4泳道）有IAC（1176bp）的扩增，其他检测有目标条带和（或）IAC的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。

在IAC扩增的基础上，第1泳道还出现6条PCR产物，112bp的是ystA的扩增条带，248bp的是ail的扩增条带，315bp的是小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA的扩增条带，415bp的是rfbF的扩增条带，561bp的是virF的扩增条带，847bp的是yadA的扩增条带。表明该菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌致病株，含有ystA、ail、rfbF、virF、yadA这五个毒力基因，且是O：3血清型。第2泳道出现146bp的是ystB的扩增条带，315bp的是小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA的扩增条带，表明菌是小肠结肠炎耶尔森氏菌生物1A型。第3泳道可以将所有的8个目的条带扩增出来，说明反应体系有很好的共扩增能力。

实施例6试剂盒的保存期试验

以10⁵CFU/mL的小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3血清型致病株和生物1A型的混合模板为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150和180天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表4所示：

表4保存期试验结果

保存期	目标基因阳性个数（包括IAC条带）
		第0天	8个
第10天	8个
		第15天	8个
第30天	8个
		第60天	8个
第90天	8个
		第120天	8个
第150天	8个
		第180天	8个

由表4可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的8个目标基因均为阳性，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为6个月。

实施例7试剂盒的特异性试验

选择大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌。

应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，阳性内对照均为阳性，证明检测系统成立；待检细菌均未非特异性的杂带，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。

实施例8试剂盒的敏感性试验

评估用检测样本：选择2个小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，菌株1为O:3血清型致病株，含有ail、ystA、yadA、virF四个毒力基因，菌株2为1A生物型，含有ystB毒力基因，将2个模板的菌悬液分别调整至10⁸CFU/mL，等比例混合成综合模板3后提取基因组DNA。将3个模板梯度稀释成10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL的检测样品。

使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板1、2、3。根据实例4进行操作和结果判断，试剂盒检测7个目标基因的敏感性试验结果如表5所示：

表5试剂盒检测小肠结肠炎耶尔森氏菌7个目标基因敏感性试验结果

从表5看出，试剂盒检测ail、ystA、ystB、yadA、virF、rfbF、16SrRNA基因的敏感性均为10⁵CFU/mL，试剂盒总体的检测敏感性为每个反应10⁵CFU/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组，其特征在于，其是由检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA及其毒力基因和血清型的引物对组成；

所述检测O:3血清型抗原编码基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。

2.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测的方法，其特征在于，将权利要求1所述引物组与待测增菌液或平板分离菌落提取DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有小肠结肠炎耶尔森氏菌和含有的毒力基因种类和血清型。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对，与检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA及其毒力基因和血清型的引物对组成引物混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应体系为：Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，10mm的dNTP0.5-1.5μL，25mM的MgCl₂1-5μL，10×引物混合物2.5μL，阳性内对照模板pET28a0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超纯水补至25μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，引物混合物中各引物对的引物终浓度为1-8μM。

7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应按以下步骤进行：

a：95℃4min；

b：95℃15-60s，

c：55-65℃15-60s，

d：72℃30-120s，b-d循环30-35个反应；

e：72℃5-10min。

8.一种含有权利要求1所述的多重PCR检测引物组的试剂盒。