CN102260743B

CN102260743B - 肠出血性大肠杆菌o104:h4多重荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN102260743B
Application number: CN2011101972083A
Authority: CN
Inventors: 金大智; 罗芸; 张政; 梅玲玲; 程苏云
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-07-13
Also published as: CN102260743A

Abstract

本发明提供了一种肠出血性大肠杆菌O104:H4的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，通过对志贺样毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻转酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)进行PCR检测，若Stx2、wzx和flicH4均呈阳性，则判断待测细菌为肠出血性大肠杆菌O104:H4。本发明针对肠出血性大肠杆菌O104:H4提供了一种快速、准确、有效的多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒，为及时采取有效措施对肠出血性大肠杆菌O104:H4病原菌导致的大规模疫情进行防控提供了基础。

Description

肠出血性大肠杆菌O104:H4多重荧光PCR检测试剂盒

(一)技术领域

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O104:H4的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

2011年5月在德国爆发肠出血性大肠杆菌O104:H4病原菌导致的大规模疫情，致病性大肠杆菌主要分为5类，分别为肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)，致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)，肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)和凝聚性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)，已知常见肠出血性大肠杆菌(EHEC)血清型有3个：O157、O26、O111；不常见的血清型有40多种。最近在德国引起暴发疫情的O104:H4是EHEC家族中的一种罕见的血清型，据研究表明这种致病菌含有志贺毒素2型(vtx2a)基因和肠积聚性黏附大肠杆菌毒力质粒上的3个基因：aatA，aggR，aap；不含有紧密黏附素基因(eae)，而且该致病菌出现了多重耐药现象。目前，奥地利、丹麦、德国、法国、新西兰、挪威、瑞典、瑞士及英国均报道出现溶血性尿毒综合症病例。据美联社发自柏林的报道，2011年6月1日止，报道发病病例3255例，其中773人出现溶血性尿毒综合症及其他严重并发症及致肾功能衰竭，已导致35人死亡。截止2011年5月30日，德国境内，肠出血性大肠杆菌O104:H4感染者中61％为女性，88％的感染者年龄在20岁以上，约88％感染者出现溶血性尿毒综合症。由此可见本次流行的病原菌肠出血性大肠杆菌O104:H4致病性较强，临床症状明显且严重，应及时采取有效措施进行防控。准确和快速的明确病原是有效预防传染病大面积发生和传播的前提和基础，但是目前针对肠出血性大肠杆菌O104:H4的诊断仍停留在培养、生化鉴定阶段，分离的菌株多以血清学和普通PCR为主，仍然没有针对肠出血性大肠杆菌O104:H4快速、准确、有效的多重荧光定量PCR方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够对肠出血性大肠杆菌O104:H4进行快速、准确鉴定的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

肠出血性大肠杆菌O104:H4的多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针由志贺样毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻转酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)的特异性引物和探针组成：

Stx2上游引物：5′-CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3′，

Stx2下游引物：5′-CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3′，

Stx2荧光探针：5′-FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1-3′；

flicH4上游引物：5′-GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3′，

flicH4下游引物：5′-CAGAATCAACGACCGCATATT-3′，

flicH4荧光探针：5′-VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1-3′；

wzxO104上游引物：5′-AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3′，

wzxO104下游引物：5′-GGTATAACCACGGCTTTCGA-3′，

wzxO104荧光探针：5′-ROX-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3′，

其中FAM、VIC和ROX为不同波长的荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括志贺样毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻转酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)标准品，所述Stx2标准品序列如下：ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgttcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcag；所述wzx标准品序列如下：aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc；所述flicH4标准品序列如下：gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。

本发明还涉及所述的多重荧光PCR检测试剂盒在肠出血性大肠杆菌O104:H4检测中的应用。

本发明还涉及一种肠出血性大肠杆菌O104:H4荧光PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取细菌基因组DNA；

(2)以志贺样毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻转酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)的特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，以细菌DNA为模板进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测细菌荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性；若Stx2、wzx和flicH4均呈阳性，则判断待测细菌为肠出血性大肠杆菌O104:H4；所述特异性引物和探针序列如下：

Stx2上游引物：5′-CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3′，

Stx2下游引物：5′-CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3′，

Stx2荧光探针：5′-FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1-3′；

flicH4上游引物：5′-GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3′，

flicH4下游引物：5′-CAGAATCAACGACCGCATATT-3′，

flicH4荧光探针：5′-VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1-3′；

wzxO104上游引物：5′-AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3′，

wzxO104下游引物：5′-GGTATAACCACGGCTTTCGA-3′，

wzxO104荧光探针：5′-ROX-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3′，

所述PCR扩扩增在常规条件下进行，本发明中PCR扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃20秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。

为达到定量检测的效果，所述方法可同时以肠出血性大肠杆菌O104:H4志贺样毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻转酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得细菌DNA的Ct值后，对照标准曲线获得待检细菌DNA中相应基因的拷贝浓度；所述Stx2、wzx和flicH4标准品序列如前所述。

本发明针对肠出血性大肠杆菌O104:H4提供了一种快速、准确、有效的多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒，为及时采取有效措施对肠出血性大肠杆菌O104:H4病原菌导致的大规模疫情进行防控提供了基础。

(四)附图说明

图1标准品检测结果，1～5分别为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL标准品；

图2为标准曲线；a为Stx2基因标准曲线：Y＝-3.282×lgX+39.297，b为wzxO104基因标准曲线：Y＝-3.344×lgX+38.373，c为flicH4基因标准曲线：Y＝-3.275×lgX+39.662；Y：对应的CT值；X：基因的copies；图3为双盲阳性质粒DNA检测结果；1和2：Stx2基因质粒DNA，CT值为19.74和26.10，拷贝数为9.12×10⁵copies/μL和1.05×10⁴copies/μL；3：wzxO104基因质粒DNA，CT值为30.59，拷贝数为2.09×10²copies/μL；4：flicH4基因质粒DNA，CT值为33.46，拷贝数为7.76×10copies/μL；其中1、3、4为同一个模拟双盲质粒DNA，2为另外一个双盲质粒DNA，其余双盲均为阴性结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：标准品的获得

1、材料：

pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，377型测序仪(ABI公司)、Bio-Rad icycler PCR仪(Bio-Rad公司)、ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)。

2、引物及探针设计与合成：

以肠出血性大肠杆菌O104:H4志贺样毒素2型基因(Stx2)(注册号为X07865)、O抗原翻转酶基因(wzx)(注册号为AF361371)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)序列(注册号为AY249989)为模板，使用Primer ExpressTM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。

3、阳性参考品的制备：

采用ABI 394寡核苷酸合成仪根据肠出血性大肠杆菌O104:H4志贺样毒素2型基因、O抗原翻转酶基因和H4鞭毛抗原基因序列中标准品PCR序列的位置，基因合成长度分别为77bp、95bp和79bp的寡核苷酸片段。用上下游引物在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增：

PCR反应液组成如下：

PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃20秒、58℃20秒、72℃20秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

Stx2上游引物：5′-CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3′，

Stx2下游引物：5′-CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3′，

flicH4上游引物：5′-GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3′，

flicH4下游引物：5′-CAGAATCAACGACCGCATATT-3′，

wzxO104上游引物：5′-AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3′，

wzxO104下游引物：5′-GGTATAACCACGGCTTTCGA-3′，

PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。回收分别为77bp、95bp和79bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。

4、结果：

经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下：志贺样毒素2型基因(Stx2)标准品序列：ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcag。O抗原翻转酶基因(wzx)标准品序列：aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc。H4鞭毛抗原基因(flicH4)标准品序列：gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。

实施例2：荧光定量PCR法检测肠出血性大肠杆菌O104:H4方法的建立

1、质粒DNA及其他细菌DNA提取：

采用基因组DNA提取试剂提取细菌基因组DNA，采用质粒DNA提取试剂盒提取实施例1构建的阳性质粒DNA，共制备20例双盲模板，分别取1.0μL做模板，用检测用上下游引物在ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

PCR反应条件为：95℃预变性2分钟，95℃20秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。

以非靶细菌沙门氏菌(CICC21490)为阴性对照于相同条件下进行 PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测模板荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。对于肠出血性大肠杆菌O104:H4的判定依据是Stx2、flicH4、wzxO104三个基因荧光PCR扩增均为阳性，即出现荧光信号。

以肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7(ATCC43889)，致病性大肠杆菌(EPEC)(ATCC 43887)，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)(ATCC35401)，肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)(ATCC 43893)，创伤弧菌(CICC 10383)、副溶血性弧菌(CMCC20022)、志贺菌(ACCC04121)等按照上述方法进行检测，结果均为部分菌株出现stx2基因阳性、flicH4、wzxO104基因阴性或全部为阴性，根据本方法阳性结果的判定标准，说明上述阴性菌均为阴性结果，同时也证明本发明方法特异性好。

同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测DNA的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测肠出血性大肠杆菌含有Stx2、H4、wzxO104基因的数量。

2、检测结果

标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2，双盲质粒DNA检测结果见图3，1和2：Stx2基因质粒DNA，CT值为19.74和26.10，拷贝数为9.12×10⁵copies/μL和1.05×10⁴copies/μL；3：wzxO104基因质粒DNA，CT值为30.59，拷贝数为2.09×10²copies/μL；4：flicH4基因质粒DNA，CT值为33.46，拷贝数为7.76×10copies/μL。其中1、3、4为同一个模拟双盲质粒DNA，2为另外一个双盲质粒DNA，其余双盲均为阴性结果

上述的荧光定量PCR阳性结果，与双盲阳性质粒结果一致。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 肠出血性大肠杆菌O104：H4多重荧光PCR检测试剂盒及方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

ccgttatact gaattgccat catc 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

ctgacattct ggttgactct cttcat 26

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

cgcgttctgt tcgcgccgt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

gctgggggta aacaagtcaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

cagaatcaac gaccgcatat t 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

tgtcttacac tgacaccgcg tctaaca 27

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

aggagtaaac aatgtcaaag caac 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工系列

<400> 8

ggtataacca cggctttcga 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

tcggcgtagt cggtatggca gtg 23

<210> 10

<211> 77

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga 60

gtcaaccaga atgtcag 77

<210> 11

<211> 95

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcg gcgtagtcgg tatggcagtg atggggcgca 60

accttgcgct caacatcgaa agccgtggtt atacc 95

<210> 12

<211> 79

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa 60

tatgcggtcg ttgattctg 79

Claims

1.肠出血性大肠杆菌O104：H4的多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针由志贺样毒素2型基因（Stx2）、O抗原翻转酶基因（wzx）和H4鞭毛抗原基因（flicH4）的特异性引物和探针组成：

Stx2上游引物：5′-CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3′，

Stx2下游引物：5′- CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3′，

Stx2荧光探针：5′-FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1-3′；

flicH4上游引物: 5′-GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3 ′，

flicH4下游引物: 5′-CAGAATCAACGACCGCATATT-3 ′，

flicH4荧光探针: 5′-VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA- BHQ1-3 ′ ；

wzxO104上游引物：5′-AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3 ′，

wzxO104下游引物：5′-GGTATAACCACGGCTTTCGA-3 ′，

wzxO104荧光探针：5′-ROX-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG- BHQ2-3 ′，

2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括志贺样毒素2型基因（Stx2）、O抗原翻转酶基因（wzx）和H4鞭毛抗原基因（flicH4）标准品，所述Stx2标准品序列如下：ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccagaatgtcag；所述wzx标准品序列如下：aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc；所述flicH4标准品序列如下：gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。