CN102747144B - 三种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明利用三重实时荧光PCR方法，将沙门氏菌的aceA基因用于检测不同血清型沙门氏菌，肠炎沙门氏菌的特异序列用于检测肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列用于特异性检测鼠伤寒沙门氏菌，优化反应条件，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌的污染，检测快速，可在30h完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为沙门氏菌进行流行病学调查提供了有利工具。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重要的食源性致病菌沙门氏菌（Salmonella）、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
沙门氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，在世界各国细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。沙门氏菌的血清型有2500多种，均有致病性，但宿主感染范围可分为宿主适应血清型和非宿主适应血清型，前者包括马流产沙门氏菌、羊流产沙门氏菌、鸡沙门氏菌等，它们只能在相适应的宿主才有致病性，然而肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、则能使多种宿主致病。英国的一项调查表明，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染占到人类沙门氏菌感染病例的75％以上。食品中沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法（可参见国标GBT4789.4-2010），该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，操作复杂，费时费力，通常要5~6天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。随着分子生物学的发展，已有针对沙门氏菌不同基因进行PCR扩增的报道，目前用作PCR试验的引物主要有编码抗原的基因和其它基因，rfbs基因（编码D群和A群的O抗原），rfbj基因（编码B群和C2群的O抗原），rbfE基因（编码伤寒菌的O抗原）；ViaB基因（编码Vi抗原）；fliC-a基因（编码H：a抗原）；fliC-d基因（编码H:d抗原）；毒力基因invA、spvC、invE等，但上述序列做目的片段的普通PCR法或荧光PCR法，只能检测到部分沙门氏菌血清型或其毒力基因。在肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性基因检测上，Wood等用肠炎沙门氏菌特异性血清型质粒的2Kb Pst I/BgⅢDNA片段作为靶序列建立PCR检测方法，但许多肠炎沙门氏菌分离株无特异血清型质粒，该方法只能检测特异血清型的肠炎沙门氏菌；Edel O'Regan等用flic、sefa、sdf、acek为目的基因，用荧光PCR方法检测沙门氏菌，但该方法无法准确区分鼠伤寒沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和鸡沙门氏菌。
发明内容：
本发明的目的是提供一种简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性强的沙门氏菌（Sa）、肠炎沙门氏菌（SE）、鼠伤寒沙门氏菌（ST）三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次实时荧光PCR扩增就能判断样品是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的污染。
本发明根据沙门氏菌菌属共有的aceA基因（GenBank:U43344.1）的保守区域、肠炎沙门氏菌特异序列（GenBank:AF370707.1）的保守区域、鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）的保守区域，分别设计检测引物和检测探针，沙门氏菌的aceA基因用于检测不同血清型沙门氏菌，肠炎沙门氏菌的特异序列用于检测肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列用于特异性检测鼠伤寒沙门氏菌，利用基于Taqman探针的三重实时荧光PCR方法，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌的污染，达到简便、快速、可靠、灵敏度高和特异性强的目的，从而实现了本发明的目的。
本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物，其特 征在于，所述的检测引物如下所示：
针对aceA基因：
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；（如SEQ ID NO.1所示）
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；（如SEQ ID NO.2所示）
针对肠炎沙门氏菌特异序列：
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；（如SEQ ID NO.3所示）
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；（如SEQ ID NO.4所示）
针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列：
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`。（如SEQ ID NO.6所示）
本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
aceA基因的探针：
5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`；（如SEQ ID NO.7所示）
肠炎沙门氏菌特异序列的探针：
5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的探针：
5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`；（如SEQ ID NO.9所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
所述的荧光报告基因优选为FAM、VIC或cy5，所述的荧光淬灭基团优选为TAMARA或BHQ2。
本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括三对：
（1）针对aceA基因：
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；（如SEQ ID NO.1所示）
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；（如SEQ ID NO.2所示）
（2）针对肠炎沙门氏菌特异序列：
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；（如SEQ ID NO.3所示）
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；（如SEQ ID NO.4所示）
（3）针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列：
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`；（如SEQ ID NO.6所示）
所述的检测探针包括：
（1）aceA基因的探针：
5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`；（如SEQ ID NO.7所示）
（2）肠炎沙门氏菌特异序列的探针：
5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
（3）鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的探针：
5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`；（如SEQ ID NO.9所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，用于检测食品或海产品，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用上述针对aceA基因、肠炎沙门氏菌特异序列和鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测引物及检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct）；
（4）根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌。
所述的步骤（2）的扩增反应体系优选为：模版DNA 3μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/L MgCl2 2μl，2.5mmol/L dNTPs 3μl，三种20μmol/L TaqMan检测探针各1μl，共3μl，六条20μmol/L检测引物各1μl，共6μl，0.55U UNG酶0.2μl，2.5U/μl Taq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。
所述步骤（3）的进行实时荧光PCR反应，其反应参数优选为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。结果判断标准：以荧光PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct<37为阳 件判定原则，如果扩增曲线指数期明显且Ct<35可直接判定为阳性，如果Ct值在35～37之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。
本发明根据沙门氏菌菌属共有的aceA基因（GenBank:U43344.1）的保守区域、肠炎沙门氏菌特异序列（GenBank:AF370707.1）的保守区域、鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）的保守区域，分别设计检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，用沙门氏菌的aceA基因检测不同血清型沙门氏菌，用肠炎沙门氏菌的特异序列检测肠炎沙门氏菌，用鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列特异性检测鼠伤寒沙门氏菌，在一次实时荧光PCR扩增反应中完成对沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的检测，从而简便、快速、可靠地判断样品是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的污染。以本发明的检测引物及检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，检测快速，可在30h完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为沙门氏菌进行流行病学调查提供了有利工具。适用于食品以及海产品的检验检疫，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
附图说明
图1是沙门氏菌特异性试验实时荧光PCR扩增结果；
图2是肠炎沙门氏菌特异性试验实时荧光PCR扩增结果；
图3是鼠伤寒沙门氏菌特异性试验实时荧光PCR扩增结果；
图4是沙门氏菌梯度稀释实时荧光PCR扩增结果；
图5是肠炎沙门氏菌梯度稀释实时荧光PCR扩增结果；
图6是鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释实时荧光PCR扩增结果；
图7是沙门氏菌单重实时荧光PCR的标准曲线；
图8是肠炎沙门氏菌单重实时荧光PCR的标准曲线；
图9是鼠伤寒沙门氏菌单重实时荧光PCR的标准曲线；
图10是沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR扩增结果；
图11是沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释三重实时荧光PCR扩增结果；
图12是沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR的标准曲线；
图13是加沙门氏菌的模拟样品实时荧光PCR扩增结果；
图14是加鼠伤寒沙门氏菌的模拟样品实时荧光PCR扩增结果；
图15是加肠炎沙门氏菌的模拟样品实时荧光PCR扩增结果；
图16是加肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的模拟样品实时荧光PCR扩增结果；
图17是只加肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌检测引物和检测探针的模拟样品实时荧光PCR扩增结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1菌株的选取及检测引物、检测探针的设计
选取肠炎沙门氏菌共15株，其中，1株为标准株ATCC13076，13株为人源分离株，1株为冻鸡样品分离株；选取鼠伤寒沙门氏菌共11株，其中，1株为标准株ATCC14028，10株为食品分离株（如表1所示）；选取食品中分离的非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌的不 同血清型沙门氏菌共21株（如表2所示）；选取1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042；选取阴性对照菌株共11株，分别为单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、鲍氏志贺氏菌CMCC51582、宋内氏志贺氏菌CMCC51334、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、假结核耶尔森氏菌CMCC53510、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、广东省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条进行确证。
表1：10株鼠伤寒沙门氏菌（ST）分离株信息
表2：沙门氏菌（Sa）分离株信息
根据GenBank公布的沙门氏菌aceA基因（GenBank:U43344.1）的保守区域、肠炎沙门氏菌特异序列（GenBank:AF370707.1）的保守区域及鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）的保守区域，用Oligo软件设计检测引物和检测探针，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
所设计的检测引物和检测探针序列如表3所示：
表3：实时荧光PCR检测引物和检测探针序列
具体为：
针对aceA基因的检测引物：
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；（如SEQ ID NO.1所示）
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；（如SEQ ID NO.2所示）针对肠炎沙门氏菌特异序列的检测引物：
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；（如SEQ ID NO.3所示）
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；（如SEQ ID NO.4所示）针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测引物：
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`；（如SEQ ID NO.6所示）所设计的检测探针如下：
aceA基因的探针：
5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`；（如SEQ ID NO.7所示）
荧光报告基团FAM标记在5`端，而淬灭基团TAMARA标记在3`端。
肠炎沙门氏菌特异序列的探针：
5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
荧光报告基团VIC标记在5`端，而淬灭基团TAMARA标记在3`端。
鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的探针：
5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`；（如SEQ ID NO.9所示）
荧光报告基团cy5标记在5`端，而淬灭基团BHQ2标记在3`端。
实施例2：模板DNA的制备
将上述21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌的不同血清型沙门氏菌菌株（表2所示）、15株肠炎沙门氏菌菌株、11株鼠伤寒沙门氏菌、1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042和11株阴性对照菌株均用缓冲蛋白胨水（BP）37℃培养10h，然后分别取1ml上述培养的菌液接种于TTB增菌液中，44.5℃培养18h，再分别取1ml上述培养的菌悬液移入离心管，12000r/min离心8min去上清，用1ml去离子水漂浮沉淀，再12000r/min离心5min去上清，重复两次，最后加200μl去离子水，在核酸提取仪上提取DNA用于实时荧光PCR扩增。
实施例3：检测引物和检测探针特异性试验
单重实时荧光PCR反应体系30μl，包括：模板DNA1μl，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/L MgCl22μl，2.5mmol/L dNTPs 3μl，20μmol/l TaqMan检测探针1μl，20μmol/l检测引物各1μl(共2μl)，0.55U UNG酶0.2μl，2.5U/μl Taq聚合酶3μl，去离子水13.8μl。荧光PCR反应 参数为95℃30s、95℃5s、60℃34s，40个循环。
1、特异性试验1：沙门氏菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照实施例2所述的方法提取21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌的不同血清型沙门氏菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌标准株ATCC14028、肠炎沙门氏菌标准株ATCC 13076、都柏林沙门氏菌CMCC 50042及11株阴性对照菌株的DNA，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对aceA基因的检测引物和检测探针）。其检测结果如图1所示，从图1中可以看出，21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌的不同血清型沙门氏菌分离株、1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042、1株肠炎沙门氏菌标准株ATCC13076、1株鼠伤寒沙门氏菌标准株ATCC14028共24株菌株的实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，Ct值在10~20之间，为阳性，而11株阴性对照菌扩增曲线平滑，未出现Ct值，为阴性。
2、特异性试验2：肠炎沙门氏菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照实施例2所述的方法提取15株肠炎沙门氏菌菌株、21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌分离株、鼠伤寒沙门氏菌标准株ATCC14028、都柏林沙门氏菌CMCC 50042及11株阴性对照菌株的DNA，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对肠炎沙门氏菌特异序列的检测引物和检测探针）。其检测结果如图2所示，从图2中可以看出，15株肠炎沙门氏菌菌株扩增曲线指数期明显，Ct值在10~30之间，为阳性，而21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌分离株、1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042、1株鼠伤寒沙门氏菌标准株ATCC13076及11株阴性对照菌株，扩增曲线均平滑，未出现Ct值，为阴性。
3、特异性试验3：鼠伤寒沙门氏菌的检测引物和检测探针的特异性试验
按照实施例2所述的方法提取11株鼠伤寒沙门氏菌菌株、1株肠炎沙门氏菌标准株ATCC13076、1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042、21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌分离株及11株阴性对照菌株的DNA，按照上述单重实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测引物和检测探针）。其检测结果如图3所示，从图3中可以看出，11株鼠伤寒沙门氏菌菌株扩增曲线指数期明显，Ct值在10~20之间，为阳性，而21株非肠炎沙门氏菌非鼠伤寒沙门氏菌分离株、1株都柏林沙门氏菌CMCC 50042、1株肠炎沙门氏菌标准株ATCC14028及11株阴性对照菌扩增曲线均平滑，未出现Ct值，为阴性。
结合特异性试验1、特异性试验2及特异性试验3的结果，说明本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤害沙门氏菌的检测引物和检测探针具有高度的特异性，分别适合对沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌进行特异性检测。
实施例4：敏感性试验及标准曲线的制作
将经过平板菌落计数原始浓度分别为2.8×106cfu/ml、2.6×106cfu/ml、3.0×106cfu/ml的都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌标准株ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌标准株ATCC14028的培养液，进行10倍梯度稀释，按照实施例2所述的方法提取DNA，按照实施例3所述的单重实时荧光PCR方法进行扩增，检测最低检测浓度，制作标准曲线。
都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028梯度稀释荧光PCR扩增结果分别如图4、图5、图6所示，都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028单重实时荧光PCR扩增标准曲线分别如图 7、图8、图9所示，其中，在图4、图5、图6中，都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028菌液浓度从右到左依次为106、105、104、103、102和101cfu/ml。结果表明：梯度稀释都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028后进行单重实时荧光PCR扩增，Ct值与初始模板浓度之间出现良好的线性关系，都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028线性相关系数分别为0.998、0.997和0.997，扩增效率依次为98.3%、97.2%和112%，最低检测浓度分别为28cfu/ml、26cfu/ml和30cfu/ml。由此可见，本发明的检测引物和检测探针灵敏度高。
实施例5：三重实时荧光PCR扩增方法的建立、敏感性试验及标准曲线制作
在单重实时荧光PCR扩增的基础上优化PCR反应体系，得到三重实时荧光PCR反应体系。三重实时荧光PCR反应体系30μl，包括：模版DNA3μL{都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的DNA各1μL（共3μl）}，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/L MgCl22μl，2.5mmol/L dNTPs 3μl，20μmol/l TaqMan检测探针各1μl（包括针对aceA基因的检测探针1μl、针对肠炎沙门氏菌特异序列的检测探针1μl和针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测探针1μl，共3μl），20μmol/l检测引物各1μl（包括针对aceA基因的2条检测引物各1μl、针对肠炎沙门氏菌特异序列的2条检测引物各1μl和针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的2条检测引物各1μl，共6μl），0.55U UNG酶0.2μl，2.5U/μl Taq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。三重实时荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃34s，40个循环。
原始浓度分别为2.8×106cfu/ml、2.6×106cfu/ml、3.0×106cfu/ml的都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的培养液，进行10倍梯度稀释，在每个稀释度中按实施例2所述的方法提取DNA，按照上述三重实时荧光PCR体系进行实时荧光PCR扩增，评价三重荧光PCR体系的最低检测浓度。在荧光PCR仪上选择标准品模式，仪器配套软件自动绘制标准曲线。
结果表明：都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的三个实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，而且三个实时荧光PCR扩增曲线相互之间互不干扰（如图10所示）。梯度稀释后三重实时荧光PCR扩增结果显示上述3株菌的模板浓度与Ct值之间也出现良好的线性关系，都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的的线性系数为别为0.992、0.993和0.988，最低检测浓度分别达到28cfu/ml、26cfu/ml和30cfu/ml（如图11所示）。从标准曲线的斜率计算三重荧光PCR扩增效率，都柏林沙门氏菌CMCC 50042为89%、肠炎沙门氏菌ATCC13076为87%、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为90%。三重实时荧光PCR标准曲线如图12所示。
实施例6：模拟样品的检测
用均质袋分别秤取25g冻鸡肉、罗非鱼、鱼粉和冻虾，每份样品中分别添加1ml已知浓度的都柏林沙门氏菌CMCC50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028及混合的肠炎沙门氏菌ATCC13076和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，制成16份模拟样品。再向每份样品中加入225ml缓冲蛋白胨水（BP），用拍打器拍打20min，37℃培养10h，然后分别取10ml移入90ml TTB增菌液，44.5℃培养18h，然后取一部分按照实施例2所述的方法提取DNA，用于三重实时荧光PCR扩增，同时取一部分按GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》继续进行检测。样品中加入的都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏 菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的浓度依次为28cfu/ml、26cfu/ml、30cfu/ml。
结果表明：加入都柏林沙门氏菌CMCC 50042的样品扩增出伤寒沙门氏菌aceA基因保守区域的扩增曲线（如图13所示），加入鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的样品出现沙门氏菌aceA基因保守区域和鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的保守区域扩增曲线（如图14所示），加入肠炎沙门氏菌ATCC13076的样品出现沙门氏菌aceA基因的保守区域和肠炎沙门氏菌特异性序列的保守区域扩增曲线(如图15所示)，加入混合的肠炎沙门氏菌ATCC13076和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的样品中扩增出沙门氏菌aceA基因保守区域、肠炎沙门氏菌特异性序列的保守区域及鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的保守区域共三条扩增曲线(如图16所示，为了便于观察扩增图，图中只列出3份样品的扩增图)。加入混合的肠炎沙门氏菌ATCC13076和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的样品进行三重实时荧光PCR扩增时，只加入针对肠炎沙门氏菌特异序列和针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测引物和检测探针，出现肠炎沙门氏菌特异性序列的保守区域及鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的保守区域的扩增曲线，未出现沙门氏菌aceA基因保守区域的扩增曲线（如图17所示）。图13-17中的数字1、2、3、4，分别表示冻鸡肉、罗非鱼、鱼粉、冻虾样品。按照GB4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》检测的模拟样品，均分离出与添加的菌株相符的都柏林沙门氏菌CMCC 50042、肠炎沙门氏菌ATCC13076和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，结果与三重实时荧光PCR法相同。
综上所述，本发明的三重实时荧光PCR检测方法，其特异性高，检测的敏感性与单重实时荧光PCR检测体系相当，可应用于食品中沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌的检测。与传统检测方法相比，缓冲蛋白胨水（BP）第一次增菌10h，TTB增菌液第二次增菌18h，核酸提取和三重实时荧光PCR扩增3h，共31h可完成检测，而传统检测方法，划线分离、生化 鉴定、血清分型等，需要5d~6d才能完成检测。
Claims (6)
1.一种都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物和检测探针组合物，其特征在于，所述的检测引物和检测探针如下所示：
针对aceA基因：
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；
aceA基因的探针：5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`；
针对肠炎沙门氏菌特异序列：
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；
肠炎沙门氏菌特异序列的探针：5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`；
针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列：
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`；
鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的探针：5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物和检测探针组合物，其特征在于，所述的荧光报告基因为FAM、VIC或cy5，所述的荧光淬灭基团为TAMARA或BHQ2。
3.一种都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括三对：
（1）针对aceA基因：
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；
（2）针对肠炎沙门氏菌特异序列：
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；
（3）针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列：
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`；
所述的检测探针包括：
（1）aceA基因的探针：5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`；
（2）肠炎沙门氏菌特异序列的探针：5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`；
（3）鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的探针：
5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
4.一种都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，用 于检测食品，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用权利要求1所述的针对aceA基因、肠炎沙门氏菌特异序列和鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列的检测引物及权利要求2所述的检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct）；
（4）根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌。
5.根据权利要求4所述的都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）的扩增反应体系为：模板DNA3μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/L MgCl22μl，2.5mmol/L dNTPs3μl，三种20μmol/L TaqMan检测探针各1μl，共3μl，六条20μmol/L检测引物各1μl，共6μl，0.55U UNG酶0.2μl，2.5U/μl Taq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。
6.根据权利要求4所述的都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（3）的进行实时荧光PCR反应，其反应参数为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。
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